KR20160138283A - 개선된 모듈러 항원 운반 분자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 적어도 하나의 전위 모듈, 적어도 하나의 표적화 모듈 및 적어도 하나의 항원 모듈을 포함하는, 또한 개선된 MAT(iMAT) 분자로도 언급되는, (분리된) 재조합 단백질에 관한 것이고, 여기서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기로 치환된다. 상기 iMAT 분자는 특히 백신으로서 유용하고, 예를 들면, 알레르기 및/또는 감염 질환의 치료 및/또는 예방 및/또는 말에서 감염 질환 전염의 예방을 위해 유용하다. 본 발명은 추가로 상기 iMAT 분자를 암호화하는 핵산, 상응하는 벡터 및 일차 세포 또는 세포주에 관한 것이다.

Description

개선된 모듈러 항원 운반 분자 및 이의 용도{IMPROVED MODULAR ANTIGEN TRANSPORTATION MOLECULES AND USES THEROF}

발명의 분야

본 발명은, 적어도 하나의 전위 모듈, 적어도 하나의 표적화 모듈 및 적어도 하나의 항원 모듈을 포함하는, 개선된 MAT(iMAT) 분자로도 언급되는, (분리된) 재조합 단백질에 관한 것이고, 여기서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기로 치환된다. iMAT 분자는 제조시 실질적으로 감소된 노력으로 제조될 수 있고, 종-특이적이고, 안전하고 면역학적으로 매우 효과적이다. 이러한 (분리된) 재조합 단백질은, 예를 들면, 말(equines)에서 알레르기 및/또는 감염의 치료 및/또는 예방 및/또는 감염 전염의 예방을 위한 백신으로서 특히 유용하다.

발명의 배경

항원-제시 세포(APCs)에 의한 항원의 처리는 2개의 상이한 경로로 일어난다. 세포 내부에서 일어나는 항원은 세포 표면 상 MHC I(주요 조직적합 복합체 I형, MHC I형) 분자에 의해 제시되는 반면, 세포외 항원은 세포 표면 상 MHC II(주요 조직적합 복합체 II형, MHC II형) 분자에 의해 제시된다. 둘 다의 기전은 항원에 대한 숙주에 의한 면역 반응을 개시한다. 세포 내로 흡수에서 MHC II-항원 복합체 형태로 세포 표면 상 제시까지 항원에 의해 통과된 경로는 다양한 세포 소기관을 통해, 그 중에서도 세포질 그물, 골지기관, 트랜스-골지 네트워크, 리소좀, 엔도솜을 통해 그리고 MHC II형 구획(MIICs)를 통해 진행된다. MIICs는 MHC II-매개된 항원 제시에서 중요한 역할을 담당한다. 이들 세포의 소기관에서, MHC II 분자는 낮은 분자량 항원으로 또는 단백질의 단백질 분해 단편으로 적재된다. 이러한 처리에서, MHC II 분자에 초기에 결합되는 불변 쇄(또한 MHC II 감마 쇄 또는 Ii로 지칭됨)는 단백질 분해를 겪고, 항원은 직접적으로 또는 간접적으로 MHC II에 결합하는 다양한 단백질의 조절하에 MHC II 분자에 결합된다. 사람에서 이들 조절 분자는 그 중에서도 HLA-DM, HLA-DO, LAMP-1, LAMP-2, CD63, CD83 등을 포함한다. 이들 단백질의 정확한 기능은 아직까지 부분적으로도 설명되지 않고, 그러나, 이들 중 다수는 리소좀으로, 엔도솜으로, 트랜스-골지 네트워크로, MIICs 등으로 이들의 운반을 촉진하는 신호 서열을 갖는다. 다수의 프로테아제는 단백질 분해 처리에서 관련되어 항원이 MHC II 분자 상에서 제시될 수 있게 한다. MIICs에 존재하는 프로테아제는 그 중에서도 카텝신 부류의 다양한 구성원, 예를 들면, 카텝신 S 및 카텝신 L을 포함한다. 사람 이외의 종에서, 상동 MHC II형 분자는 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 말 동물에서, MHC 시스템의 조직은 인접한 I형, III형, 및 II형 영역을 갖는 사람과 유사하다[참조: Kelley J et al., Immunogenetics 2005, 56: 683-695].

면역 반응을 조절하기 위한 모듈러 항원 운반(MAT) 분자를 제공하는 개념, 관련된 작제물, 이의 방법 및 용도는 WO 2004/035793(US 상응 US 2005/0281816)에 개시되어 있다. 이 문헌은 3-부분-분자의 유용성을 기술하고, 여기서, MAT 분자는 세포 내로 항원의 에피토프를 도입하여, 이에 따라, 이러한 MAT 분자에 의해 조절되는 면역 반응을 결정한다. 여기서, 다양한 전위 모듈, 표적화 모듈 뿐만 아니라 항원 모듈을 기술한다. 이러한 기술 및 이의 근본적인 방법은 먼저, 항원을 세포외 공간으로부터 표적 세포의 세포내 공간으로 효율적으로 운반하는 것을 가능하게 하고, 두번째로, 세포의 내부에 도착한 후, 항원이 효율적으로 세포 소기관에 도달하게 하여 항원 제시에 대해 후속적으로 처리되게 한다. 일반적으로, 이러한 2-단계 처리는 대상자에서 면역 반응의 표적화된, 효율적인 조절을 위해 이용될 수 있다. MAT 분자의 사용은 예를 들면, 마르티네즈-고메즈 제이엠(Martinez-Gomez JM) 등[참조: Allergy 2009, 64(1): 172-178]; Rose H (Arb Paul Ehrlich Inst Bundesinstitut Impfstoffe Biomed Arzneim Langen Hess, 2009, 96, 319-327]에서 뿐만 아니라 최근 센티 지(Senti G) 등[참조: J Allergy Clin Immunol., 2012, 129(5): 1290-1296]에서 개시되어 있다. MAT 기술을 기초로 하여, 주요 고양이 알레르겐 Fel d1을 TAT-유래된 단백질 전위 도메인에 그리고 MHC II형 경로를 표적화하는 절단된 불변 사람 쇄에 융합되었다. 면역원성은 마우스에서 평가되는 반면, 잠재성 안전성 문제는 고양이-비듬-알레르기 환자로부터 호염기구 반응성에 기초한 적합한 시험에 의해 평가되었다. 이러한 모델 화합물의 가능한 사용이 입증되었다. 여기에 기재되어 있는 바와 같이, MAT 분자가 종래의 알레르겐-특이적 면역요법(SIT)에서 재조합 알레르겐 또는 알레르겐 추출물 보다 목적하는 면역 반응, 즉, 탈감작을 유도하는데 더 안전하고 효율적이다는 것이 예상된다. 센티 지.(Senti G.) 등에 의한 최근 공보에서, 3회 주사 후 관용을 유도하는 사람에서 고양이 비듬 알레르기에 대한 림프내 면역요법이 기재되었다. 여기에는, MAT-Fel d1을 사용한 제1-사람-내 임상적 연구가 기재되고, 단지 3회 주사의 림프내 주사 후에 안전성 및 알레르겐 관용의 유도를 입증하였다.

추가의 선행 기술은 다음과 같다:

가더마이어 지(Gadermaier G) 등[참조: Molecular Immunology 2010, 47: 1292-1298]은 아르테미시아(Artemisia) 화분 알레르기의 면역요법에 대한 Art v1의 시스테인-안정화된 폴드의 표적화를 기재한다. 저자는 저알레르기성 분자의 생성을 목적으로 하는 Art v1 해독후 변형을 표적화하기 위해 유전자 조작 접근법을 사용하였다: (i) 디펜신 도메인의 디설파이드 브릿지는 위치-지시된 돌연변이 유발에 의해 방해되고, (ii) 돌연변이 작제물은 비-글리코실화된 단백질의 생성에 대해 이. 콜리(E. coli)에서 발현되었다. 그러나, 목적은 명백하게 단지 단일 시스테인 잔기를 세린으로 교환하여 IgE-결합(즉, 저알레르기성 분자를 생성함)을 폐지하기 위해 Art v1 디펜신 도메인의 3-차원 폴드를 조작하고 있다 - 온전하게(즉, 비변형됨) 유지되면서 인지된 T-세포 에피토프 (이는 시스테인 잔기를 포함하지만).

말의 알레르겐 질환에 대한 제3 하베메이어(Havemeyer) 연구의 보고[참조: Holar, Iceland, June 2007, Veterinary Immunology and Immunotherapy 2008, 126: 351-361]는 곤충 물림 과민성(IBH) 및 재발성 기도 폐쇄(RAO)의 면역학적 및 유전학적 측면에 중점을 두었다. 이러한 연구에서 IBH에 대항하는 SIT에 대한 신규한 접근법이 논의되고, 그 중에서도 바이러스 매개체의 사용 또는 모듈러 항원 전위(MAT) 분자에 커플링된 알레르겐을 사용한 단백질 예방접종이 논의된다.

문헌[참조: SIAF Annual Reports 2010 and 2011]에서 크라머리 알(Crameri R)은 IBH-발병된 말의 예방접종을 위한 MAT 기술의 사용을 보고한다.

그러나, 주요 문제는 선행 기술에서 기술된 MAT 분자를 생성 및 제조하는 경우에 일어났다. 특히 우수한 제조 실행(GMP)하에 MAT 분자의 제조를 위해 다운스트림 처리(DSP)를 개발하는데 사용된 표준 방법은 적용될 수 없었다. 이의 이례적인 물리화학적 특성으로 인해 분명히 MAT 분자의 동종 분자 종을 정제할 수 없었다.

수개의 정제 방법은 상이한 분리 원리(예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피, RP-HPLC)가 시험되지만 선행 기술에서 기술된 MAT 분자로는 적용될 수 없었다(본원의 실시예 5 참조). 재조합 단백질의 순도의 측정을 위해 적용되는 방법은 일반적으로 크로마토그래피 분리, 예를 들면, RP-HPLC 및 전기영동 분리(예를 들면, 모세관 구역 전기이동, 동전위 초점법, 환원 또는 비-환원 조건하에 SDS-PAGE)를 포함한다. 또한, 이들 분석 방법은 분자-특이적 개조 없이 MAT 분자에 적용될 수 없었다. 순도의 평가를 위해, 개조된 특이적 SDS-PAGE 시험 절차를 개발하여야 한다. 이러한 시험 절차는 환원제 및 리튬 도데실 설페이트(LDS)로 샘플을 제조하고, 75℃ 이하로 가열하고, 전기영동 분리 후 다중, 재생가능한 날카로운 대역(sharp band)를 수득함을 포함한다. 쿠마시(Coomassie) 블루 염료로 염색은 겔에서 선형 정량적 거동(밀도측정)을 야기한다. MAT 분자에서 알레르겐 모듈을 검출하게 하는 모노클로날 항체를 사용하는 것은 주요한 대역 및 수개의 소 대역을 나타내었다. 모든 대역은 제2 겔을 제1 겔의 삭제된 대역으로 재-적재(re-loading) 후에 또한 원래 겔에서처럼 동일한 위치에 재생가능하게 이동한다. 놀랍게도, 명백하게 낮거나 높은 분자량을 갖는 이들 대역의 전부에서, 전체 길이 MAT 분자는 겔 밖의 대역의 삭제, 및 이들의 트립신에 의한 소화 및 질량 분광계에 의한 후속적인 분석(nanoLC/ESI-MS-MS)에 의해 확인하였다. 이들 실험으로부터, SDS-PAGE에서 MAT 분자의 상이한 폴딩 변이의 비전형적인, 이례적인 거동을 결론내릴 수 있다("겔 이동"). 추가로, MAT 분자의 모든 배치에서 단백질의 다량체 형태는 검출될 수 있고, 이는 단량체성 형성으로부터 분리하기 어렵다.

예를 들면, 경제적 측면 때문에, 뿐만 아니라 규제 요구사항 때문에, (i) MAT 분자의 제조 방법 및 (ii) 순도 측정의 표준 분석 방법을 위한 이들의 적합성을 개선시키는 것이 필요하다. 추가로, MAT 분자를 특이적 표적 종, 예를 들면, 말로 개조하기 위해, MAT 기술 내에 면역학적 표적화의 개조가 요구된다.

추가로, MAT 분자는 공지된 주요 알레르겐(예를 들면, Fel d1에 의한 사람에서 고양이 비듬 알레르기)에 의해 유발되는 알레르기에서 용이하게 이용된다. 그러나, 임상적 상황, 예를 들면, 알레르기에서 선행 기술의 MAT 분자를 이용하는 것은 어려울 것 같고, 여기서, 예를 들면 다양한 비-가교-반응성 알레르겐은 관련되는 것으로 공지되어 있지만, 알레르기 유발에서 이러한 알레르겐의 중요성은 공지되어 있지 않다(즉, 주요 알레르겐은 공지되어 있지 않다).

본 발명의 근간을 이루는 목적은 약제학적 조성물인 활성제, 예를 들면, 백신으로서 유용한 개선된 MAT 분자를 제공하는 것이고, 이는 선행 기술의 문제를 극복한다.

발명의 개시

발명의 요지

하나의 측면에서, 본 발명의 근간을 이루는 목적은 놀랍게도,

(i) iMAT 분자가 세포외 공간에서 세포의 내부로 전위(translocation)되도록 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제1 모듈,

(ii) iMAT 분자가, 항원의 처리 및/또는 항원, 바람직하게는 처리된 항원의 MHC 분자로의 적재에 관여하는 세포 소기관으로 종-특이적 세포내 표적화되게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제2 모듈, 및

(iii) 적어도 하나의 항원, 바람직하게는 적어도 하나의 알레르겐의 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프로부터 유래된 아미노산 서열인 항원 모듈로서, 상기 iMAT 분자에 의해 조절되는 면역 반응의 특이성을 결정하는 적어도 하나의 제3 모듈을 포함하고,

적어도 항원 모듈(들)에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신 및/또는 아스파르트산으로 치환되는 것을 특징으로 하는, (분리된) 재조합 단백질, 바람직하게는 개선된 MAT(iMAT) 분자를 제공하여 해결하였다.

바람직하게는, 적어도 하나의 항원 모듈에서, 모든 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신 및/또는 아스파르트산으로 치환된다. 보다 바람직하게는 전체 iMAT 분자에서, 모든 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신 및/또는 아스파르트산으로 치환된다.

바람직하게는, 모든 시스테인 잔기가 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신 및/또는 아스파르트산으로 치환되지 않는 경우, 짝수의 시스테인 잔기가 전체 iMAT 분자에 남아있다.

바람직하게는, 상기 모듈 전부는 2개 이상의 인접한 모듈 사이에, 임의로 상기 제1, 제2 및/또는 제3 모듈 전부 사이에, 임의로 추가의 스페이서(spacer) 모듈(들)에 의해 서로 공유 결합된다.

보다 바람직하게는, 상기 모듈 전부는 서로 공유 결합되고, 어떠한 추가의 스페이서 모듈(들)도 상기 제1, 제2 및/또는 제3 모듈 중 2개 이상의 인접한 모듈 사이에 전혀 존재하지 않는다.

또다른 측면에서, 본 발명의 근간을 이루는 목적은 놀랍게도 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공하여 해결하였다.

또다른 측면에서, 본 발명의 근간을 이루는 목적은 놀랍게도 말에서 상기 하나 이상의 알레르기, 바람직하게는 곤충 물림 과민성(IBH), 두드러기 및/또는 재발성 기도 폐쇄(RAO)의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한, 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질 또는 본원에 기재되고 청구된 백신 또는 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공하여 해결하였다. 이를 필요로 하는 말의 상응하는 예방 및/또는 치료 방법 및 말의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물/의약의 제조를 위한 용도가 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

또다른 측면에서, 본 발명의 근간을 이루는 목적은 놀랍게도 말에서 매개체에 의한, 바람직하게는 흡혈 파리, 각다귀, 진드기(tick) 및/또는 모기, 보다 바람직하게는 로도코쿠스 폐렴, 선역, 아프리카 마역, 웨스트 나일 바이러스 감염, 백선증 및/또는 소화관 및/또는 다른 기관의 기생충 및/또는 와포자충증, 연충 및/또는 이의 잠복기에 의한 하나 이상의 감염 질환의 예방 및/또는 치료 및/또는 말에서 하나 이상의 감염 질환 전염의 예방 및/또는 말에서 상기 하나 이상의 감염 질환 전염의 예방 방법에서 사용하기 위한 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질 또는 본원에 기재되고 청구된 백신 또는 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공하여 해결하였다. 이를 필요로 하는 말의 상응하는 예방 및/또는 치료 방법 및 말의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물/의약의 제조를 위한 용도가 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

추가의 측면에서, 본 발명의 근간을 이루는 목적은 놀랍게도 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질을 암호화하는 핵산을 제공하여 해결하였다.

추가의 측면에서, 본 발명의 근간을 이루는 목적은 놀랍게도 본원에 기재되고 청구된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 벡터를 제공하여 해결하였다.

또한 추가의 측면에서, 본 발명의 근간을 이루는 목적은 놀랍게도 본원에 기재되고 청구된 적어도 하나의 핵산 및/또는 본원에 기재되고 청구된 적어도 하나의 벡터를 포함하는 일차 세포(primary cell) 또는 세포주를 제공하여 해결하였다.

놀랍게도, 본원에 기재되고 청구된 본 발명에 따른 iMAT 분자는, 적절한 선행 기술의 MAT 분자 보다 우수하게 만드는 하기한 물리화학적 및/또는 면역학적 특성을 갖는다:

(i) 인실리코(in silico)에서 최종 iMAT 분자의 안정성을 위태롭게 하지 않기 위해 선택된 항원 모듈(들), 바람직하게는 전체 iMAT 분자에서 적어도 하나의 시스테인 잔기, 바람직하게는 모든 시스테인 잔기의, 상이한 아미노산 잔기로의 치환은, 본 발명에 따른 iMAT 분자를 놀랍게도 생물의약(biopharmaceuticals)을 위한 뿐만 아니라 표준 분석 방법을 위한 표준 정제 절차의 적용에 적합하게 만든다.

(ii) iMAT 분자의 모듈의 바람직한 직접 공유 결합(즉, 이러한 모듈 사이에 어떠한 추가의 스페이서 모듈이 없는, 즉, 상기 제1, 제2 및/또는 제3 모듈 중 2개 이상의 인접한 모듈 사이에 추가의 스페이서 모듈이 없는 제1 전위 모듈, 제2 표적화 모듈 및 제3 항원 모듈)은, 상기 (i)에 추가하여, 본 발명에 따른 iMAT 분자의 우수한 특성에 기여하고: 3-차원 구조에서 보다 강성(rigid)인 것으로 고려되고, 이에 따라 입체형태적(conformational) IgE 에피토프를 형성할 수 없는 상기 iMAT 분자는, 훨씬 더 저알레르기성이고 - 사실상 알레르기항원성은 본원의 실시예 2에서 나타낸 바와 같이 검출할 수 없다.

(iii) (quasi) N-말단 His-tag의 바람직한 존재는 면역 및/또는 면역 기간을 모니터링하기 위한 대리 마커로서 사용될 수 있는 본 발명에 따른 iMAT 분자를 야기하는데, 이는 이러한 tag 모듈이, 임의로 전위 모듈로부터의 하나 이상의 인접한 아미노산 잔기와 함께, 표적 대상자에서 iMAT 분자의 일반 구조에 특정되는 특이적 면역학적으로 검출가능한 신호(예를 들면, 항체)를 유도하는데 사용될 수 있기 때문이다(본원의 실시예 1 참조). 추가로, 이러한 tag 모듈의 존재는 본 발명에 따른 iMAT 분자를 포함하는 샘플에서, 예를 들면, 아연- 또는 코발트-충전된 고체 지지체를 사용하여 단백질을 분리하는데 사용될 수 있고, 이에 따라, 추가로 정제 처리 동안 응집 없이 본 발명에 따른 iMAT 분자의 생산 가능성을 개선시킨다.

(iv) 본 발명에 따른 iMAT 분자에서 적어도 하나의 표적화 모듈은 바람직하게는 종-특이적이고, 즉, 말에 대한 상기 iMAT 분자의 의도된 적용의 경우에, 말 표적화 모듈, 예를 들면, 말 불변 쇄가, 선택된다. 이러한 종-특이적 표적화에 의해, 본 발명에 따른 iMAT 분자의 MHC II형 분자로의 최적화된 결합 특성이 성공적으로 성취될 수 있다.

(v) 본 발명에 따른 iMAT 분자에서 적어도 하나의 항원 모듈은 바람직하게는 알레르겐이다. 이는 곰팡이(진균류 및/또는 이들의 포자), 화분, 집먼지 또는 사료 진드기(및/또는 이들의 배설물), 바람직하게는 나무, 잔디, 풀, 돼지풀로부터의 화분 및/또는 십자화과 화분 및/또는 아스페르길루스, 알테르나리아, 보트리티스, 세르코르포라, 클라도스포리움, 쿠르불라리아, 드레크슬레라, 유로티움, 헬민토스포리움, 에피코쿰, 에리시페/오이디움, 푸사리움, 리치테이미아, 니그로스포라, 페니실리움, 페리코니아, 페로노스포라, 폴리트린시움, 사카로폴리스포라(이전에 또한 파에니아 또는 마이크로폴리스포라), 서모아크티노마이세스, 스템필리움, 토룰라 속의 진균류 및/또는 이들의 포자 및/또는 아카루스, 글리코파구스, 티로파구스, 데르마토파고이데스 속의 진드기(또는 이들의 배설물)로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 따른 iMAT 분자에서 적어도 하나의 항원 모듈은 보다 바람직하게는 쿨리코이데스(culicoides) 알레르겐이다. 알레르겐은 다음의 기준에 따라 선택되었다: 대상자에서 알레르기를 유발하는 주요 알레르겐이 공지되지 않은 경우, 본 발명에 따른 iMAT 분자에서 적어도 하나의 항원 모듈은 본원의 실시예 6 및 7에 예시적으로 및 상세하게 기재된 생물정보학 접근법에 의해 선택될 수 있다. 이러한 수단에 의해, 개선된 MAT 분자가 성취될 수 있고, 이는 특히 백신으로서, 예를 들면, 말에서 알레르기의 치료 및/또는 예방을 위해 유용하다. 본 발명에 따른 iMAT 분자에서 적어도 하나의 항원 모듈은 또한 하나 이상의 감염 질환(들)에 관련된 병원체의 항원일 수 있다. 이는 로도코쿠스, 스트렙토코쿠스, 오르비바이러스, 플라비바이러스, 트리코피톤, 마이크로스포룸, 크립토스포리디움 및/또는 스트롱길루스 속으로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 따른 iMAT 분자에서 적어도 하나의 항원 모듈은 또한 하나 이상의 감염 질환(들)의 전염에 관여하는 매개체의 항원, 예를 들면, 쿨리코이데스, 쿨렉스 및/또는 익소데스 타액 성분일 수 있다. 이러한 수단에 의해, 개선된 MAT 분자는 성취될 수 있고, 이는 특히 백신으로서, 예를 들면, 말에서 감염 질환 치료 및/또는 예방 및/또는 전염의 예방에 유용할 수 있다.

특히, 본 발명은 크로마토그래피 분리 기술에 용이하게 적용되고 개선된 안정성을 나타내는 개선된 용해도를 나타내는 (분리된) 재조합 단백질을 제공한다.

추가로, 본 발명에 따른 (분리된) 재조합 단백질은 바람직하게는 목적하는 면역학적 효과를 유도하는데 높은 활성 및 효능을 나타내고, 즉 유리하게는 대상자, 바람직하게는 말에서 알레르겐에 대항하여 면역 반응을 특이 조절하는 종. 예를 들면, 이러한 수단에 의해 IBH 발병된 말의 증상의 치료 및 완화가 실현가능하다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 양태를 추가로 상세하게 기술하기 전에, 본원에서 그리고 첨부된 청구범위에서 사용되는, 단일 형태 하나 및 상기("a", "an", 및 "the")는, 문맥에서 달리 명확하게 나타내지 않더라도, 복수 언급을 포함하는 것을 주지한다

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 일반적인 숙련가들에게 공통으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 모든 주어진 범위 및 값은, 지시되지 않거나, 당해 기술 분야의 숙련가에 의해 공지되지 않더라도, 1 내지 5% 가변적일 수 있고, 따라서, 용어 "약"은 대개 명세서 및 청구범위에서 생략되었다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가의 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치, 및 물질은 본원에서 기술된다. 본원에 언급된 모든 공보는 본 발명과 연관되어 사용될 수 있는 공보에 보고된 물질, 부형제, 담체, 및 방법론을 기술하고 개시하는 목적을 위해 본원에 참조로서 포함한다. 본원의 어떤 것도, 본 발명이 이전 발명에 의한 개시 보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 이해하여서는 안된다.

용어 "분리된 재조합 단백질", "재조합 단백질" 및/또는 "개선된 MAT(iMAT) 분자"는 본 발명 중에서 상호교환되어 사용된다. 이들 전부는 동일한 의미를 갖는다.

용어 "모듈"은 본 발명 중에서 특정한 아미노산 서열, 예를 들면, 정의된 기능을 갖는, 폴리펩타이드, 대개 짧은 아미노산/펩타이드 서열의 부분, 단위 또는 모이어티(moiety)를 언급한다.

용어 "(분리된) 재조합 단백질, 바람직하게는 개선된 MAT(iMAT) 분자가 세포외 공간에서 세포의 내부로 전위되도록 하는 아미노산 서열인 제1 모듈"은, 본원에서 또한 "전위 모듈" 또는 "전위 서열"로서 상호교환되어 언급되고, 본 발명 중에서 세포의 내부에, 특히 진핵 세포, 보다 특히, 표면상 MHC II형 분자 및/또는 표면상 MHC I형 분자를 발현하는 세포(문헌에 공지된 바와 같음)의 내부에 화물 분자의 운반을 촉진하는 특정한 아미노산 서열, 예를 들면, 아미노산 서열, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 및 다른 부류의 물질, 예를 들면, 핵산 또는 약제학적 활성 성분(API)을 언급한다.

전위 모듈의 존재에 의해, 상기 화물 분자의 세포로의 진입을 촉진할 수 있다.

전위 모듈로서 유용한 아미노산 서열은 선행 기술에 기재되어 있다. 예를 들면, US 7,653,866은 단순 헤르페스 바이러스로부터 유래된 HIV-tat 분자 또는 단백질 VP22를 포함하는 수개의 유용한 전위 서열을 개시한다. 제공된 표적 분자의 세포의 내부로의 진입을 촉진하는 이러한 원리는 다양한 연구에서 적절한 특허 및 비-특허 문헌에 다양한 연구에서 다수 기재되어 있다. 추가로, 적합한 전위 서열은 동종단백질 서열, 류신 지퍼 서열, 아르기닌-풍부(rich) 및/또는 리신-풍부 서열, 및 분비 신호 서열의 부재에도 불구하고 분비된 단백질 또는 폴리펩타이드의 다양한 다른 서열을 포함한다. 바이러스 펩타이드 서열, 예를 들면, 단백질 HIV 전사 활성자 단백질(HIV tat)이 특히 유용하다. Tat 서열 또는 Tat 펩타이드는 다양한 변형을 포함하는 선행 기술에 기재되었다. Tat의 펩타이드 서열에 대한 선행 기술에 기재된 모든 변형은 일반적으로 전위 모듈로서 적합하다. 다른 예는 VP22 펩타이드 뿐만 아니라 초파리 항상성(drosophila homeotic) 단백질 안테나페디아로부터 유래된 안테나페디아 펩타이드를 포함한다. 추가로, 다른 동종단백질을 사용할 수 있다. 적합한 동종단백질의 다양한 예는 선행 기술에 기개되어 있다. 추가로, 사람 cFos-(139-164), 또는 사람 cJun-(252-279)과 같은 류신 지퍼 단백질을, 사용할 수 있다. 또한, 아르기닌-풍부 및/또는 리신-풍부 펩타이드는 HIV-1 rev(34-50) 또는 바이러스 또는 이스트로부터 유래된 다른 펩타이드와 같은 서열을 포함하는 전위 모듈로서 적합하다. 물론, 폴리아르기닌-풍부 및/또는 폴리리신-풍부 펩타이드는 합성으로 제조될 수 있다. 상기 폴리아르기닌-풍부 및/또는 폴리리신-풍부 펩타이드는 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 적합한 예는 적절한 선행 기술에 기재된다.

바람직한 양태에서, 적어도 하나의 전위 모듈은, 그러나 여전히 기능적인, 즉, 효과적으로 세포 진입을 촉진할 수 있는 최소의 서열 대신에, 상기 예시된 바와 같이 완전한 단백질 서열로 이루어지지 않는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 이로서 이루어진다. 적합한 최소의 서열은, 예를 들면, 서열 번호 1에 따른 아미노산 서열이다.

또다른 바람직한 양태에서, 적어도 하나의 전위 모듈은 HIV-tat, VP22 및/또는 안테나페디아 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 바람직하게는 이들로서 이루어지고, 단, 이러한 적어도 하나의 전위 모듈은 세포외 공간에서 세포의 내부로의 전위를 위한 모듈로서 기능적이다.

용어 "(분리된) 재조합 단백질, 바람직하게는 개선된 MAT(iMAT) 분자가, 항원의 처리 및/또는 항원, 바람직하게는 처리된 항원의 MHC 분자로의 적재에 관여하는 세포 소기관으로 종-특이적 세포내 표적화되게 하는 아미노산 서열인 제2 모듈"은, 또한 본원에 "표적화 모듈" 또는 "표적화 서열"로서 상호교환되어 언급되고, 본 발명 중에서 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질이, 항원의 처리 및/또는 항원의 MHC 분자로의 적재에 관여하는 이러한 세포 소기관으로 세포내 운반되도록 하고/이러한 운반을 촉진하는 특정한 아미노산 서열을 언급한다.

특히, 이러한 세포 소기관은 세포질 그물, 골지기관, 트랜스-골지 네트워크, 리소좀, 엔도솜 및 MHC II 구획을 포함한다. 이들 세포내 소기관은 처리, 예를 들면, 항원의 운반 및/또는 처리, 항원 또는 처리된 항원으로 MHC II 분자의 제조 및/또는 적재, 및/또는 이러한 항원으로 적재된 MHC II 분자의 세포 표면로 운반에 관련된다.

다수의 서열은 선행 기술에 공지되어 있다. 유용한 표적화 서열의 중요한(prominent) 예는 Ii 불변 쇄 또는 MHC II 감마 쇄로서도 공지된 MHC II형 분자의 불변 쇄를 포함한다. 불변 쇄의 다양한 변이는 특허 및 비-특허 문헌에 기재되어 있다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 불변 쇄는 종으로부터 선택되고, 여기서, 면역 반응은 조절되어야 하고, 및/또는 종으로부터 선택되고, 여기서, iMAT 분자는 세포내로 표적화되어야 한다.

예를 들면, 말(equines), 예를 들면, 말(horses)에 대한, 선택된 바람직한 불변 쇄는 서열 번호 2에 따른 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 바람직하게는 이들로서 이루어지는 말 불변 쇄이고, 단, 이러한 단편은 이의 세포내 운반 기능을 유지한다. 바람직한 이러한 단편은 서열 번호 15 및/또는 16에 따른 아미노산 서열이다.

표적화 서열의 적합한 예는 표적화 모듈로서 적합한 서열을 포함하는 리소좀 막 단백질을 포함한다. 즉, 리소좀을 표적화하도록 하는 서열 모티프를 갖는 리소좀에서 일어나는 다수의 막 단백질. 이들 그룹의 단백질은 그 중에서도 lamp 1, lamp 2, lamp 3, limp II 및 lap을 포함한다. 추가로, 테트라스판 단백질은 선행 기술에서 표적화 모듈로서 공지된다. 추가의 단백질은 표적화 특성을 나타내는 엔도솜/리소좀 구획에서 발견될 수 있다. 숙련가는 이에 따른 표적화 서열을 측정하는 방법을 알고 있다.

또다른 바람직한 양태에서, 적어도 하나의 표적화 모듈은 말 불변 쇄를 포함하고, 바람직하게는 이들로서 이루어지고, 바람직하게는 서열 번호 2, 15, 및 16의 아미노산 서열 중 하나 이상으로 이루어진다.

본원의 용어 "적어도 하나의 항원, 바람직하게는 적어도 하나의 알레르겐의 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프로부터 유래된 아미노산 서열인 항원 모듈로서, 이러한 (분리된) 재조합 단백질, 바람직하게는 개선된 MAT(iMAT) 분자(대상자, 바람직하게는 말에서)에 의해 조절되는 면역 반응의 특이성을 결정하는 제3 모듈"은 또한 본원에 "항원 모듈" 또는 "항원 서열"로서 상호교환되어 언급되고, 본 발명 중에서 에피토프/항원에 대항하는 면역 반응을 조절하고, 대상자, 바람직하게는 말에서 면역 반응의 특이성을 결정하도록 하는 특정한 아미노산 서열로 언급된다.

이러한 문맥에서, 이러한 항원 모듈(들)은 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신 및/또는 아스파르트산으로 치환된 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다. 따라서, 면역 반응은 항원의 변화되지 않은 아미노산 서열에 노출된, 대상자, 바람직하게는 말의 면역 반응과 비교하여 상이하다.

상기 방법을 기준으로 하여 항원에 관련된 제한은 없다. 상기 방법은 예를 들면 병원체에 대항하여, 예를 들면, 바이러스, 박테리아, 진균류, 기생충, 원생동물 등에 대항하여 대상자의 면역 시스템을 활성화시키는데 사용될 수 있고, 즉, 매우 일반적으로 백신으로서 사용될 수 있다. 추가로, 상기 방법은 이러한 병원체에 대항하여 직접적으로 사용될 뿐만 아니라, 바이러스, 박테리아, 진균류, 기생충, 원생동물 등에 관련된 매개체-관여 질환의 전염를 예방하는 숙주 면역 시스템을 활성화시키는데 사용될 수 있다. 추가로, 상기 방법은 변성된 세포, 예를 들면, 종양 세포 등에 대항하여 면역 시스템을 활성화하는데 사용될 수 있다. 그러나, 다른 한편으로, 또한 식품, 곰팡이(진균류 및/또는 이들의 포자), 화분, 동물털, 집먼지 또는 사료 진드기(및/또는 이들의 배설물), 곤충 독성 등으로부터 유래된 알레르겐에 대항하여 대상자의 면역 시스템의 탈감작을 위해 사용될 수 있거나, 예를 들면, 관절염, 류마티즘, 당뇨병, SLE(systemic lupus erythematosus) 등과 같은 자가면역 반응이 존재하는 경우, 면역 시스템의 표적화된 억압을 위해 사용될 수 있고, 이식 거부 반응의 억압을 위해 사용될 수 있다. 명확히 언급되지 않고 너무 강하거나 너무 약한 면역 반응과 관련된 추가의 장애는 또한 본원에 개시되거나 청구된 iMAT 분자로 치료될 수 있다.

원칙적으로 면역 반응을 조절할 수 있는 항원의 모든 타입을 본 발명의 목적을 위한 항원 모듈로서 사용하는 것이 가능하다. 현재 이미 공지된 항원 및 향후에 발견될 항원 둘 다가 적합하다. 이러한 상황에서, 항원은 또한 현재의 통상의 면역 방법으로 면역 반응을 야기하지 않지만, 본 발명에 기재된 신규한 방법의 적용에서 대상자에 의한 면역 반응을 야기하는 것일 수 있다. 추가로, 용어 항원은 에피토프(들)로서도 공지된 항원결정인자/항원결정인자들을 포함하는 항원 단편을 포함한다. 따라서, 항원 모듈은 전체 분자, 예를 들면, 단백질일 수 있거나, 적어도 하나의 항원결정인자 또는 에피토프를 포함하는 펩타이드와 같은 분자의 일부, 즉 이의 단편이다. 적어도 하나의 항원결정인자 또는 에피토프는 항원에 대항하는 면역 반응을 유발할 수 있다. 에피토프는 하나 또는 하나 이상의 아미노산 또는 펩타이드 또는 면역 반응을 유발할 수 있는 다른 구조, 예를 들면, 당 구조, 인산화 아미노산 등 또는 이의 조합물을 포함할 수 있다. 항원은 연속 에피토프(즉, 입체구조에 의존되지 않음, 예를 들면, 비변성 및 변성 단백질로 존재함) 또는 불연속 에피토프(즉, 입체구조에 의존됨, 예를 들면, 단지 비변성, 폴딩으로 존재하지만, 변성 단백질으로 존재하지 않음)일 수 있다. 단백질 및 펩타이드 뿐만 아니라, 당 구조, 지질, 예를 들면, 지질폴리삭카라이드, 리포테이코산 및 박테리아 막의 다른 구성 성분(CD1b는, 예를 들면, 당 구조 및 지질을 결합한다), 핵산, 예를 들면, CpG 모티프를 포함하는 DNA, 유기 물질, 예를 들면, 라텍스 또는 본 발명의 목적을 위한 항원으로서 약제학적 활성 물질을 사용할 수 있다. 항원은 모든 가능한 생물 형태, 예를 들면, 예를 들면, 사람, 동물, 식물, 진균류, 기생충, 단세포 또는 다세포 미생물, 바이러스 및 다른 생물 형태로부터 유래될 수 있다. 항원은 생물학적 물질로부터 분리되거나, 재조합 항원으로서 제조되거나, 합성에 의해, 예를 들면, 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 합성으로 제조된 항원은 자연에서 발생하거나 자연에서 발생하지 않지만 화학적 합성으로 수득될 수 있는 물질일 수 있다. 그러나, 이러한 상황에서 항원으로서 적합한 비-자연 발생 물질의 예는, 예를 들면, 의약에 존재하는 합성으로 제조된 물질, 또는 자연 발생되지 않는 아미노산 서열을 갖는 합성 펩타이드, 또는 펩티도미메틱 등이다. 자연 발생 또는 합성 또는 재조합 항원은 분자 생물학, 효소, 화학적 및/또는 기타 방법에 의해 변형되어 특정 적용을 위해 보다 유리한 특성을 이들에 부여할 수 있다. 이들 유리한 특성은, 그 중에서도, 항원으로서의 높거나 낮은 활성, 항원으로의 광범위하거나 특이적인 작용, 친수성 또는 소수성 용매 중 우수한 용해도, 세포 막에 대한 항원 모듈의 더 큰 투과성, 혈액-뇌 장벽에 대한, 혈액-CSF 장벽 등에 대한 소기관의 막, 생체내 또는 시험관내 높거나 낮은 반감기, 낮거나 높은 독성, iMAT 분자 등 형태로 항원을 적용한 후 생체내 또는 시험관내 항원의 우수한 검출능일 수 있다. 다수의 항원을 하나의 항원 모듈로 조합하는 것이 본 발명의 목적을 위해 추가로 가능하다. 이를 위해, 동일한 항원이 항원 모듈에서 하나 초과의 카피로 존재하는 것이 가능하거나, 예를 들면 동일한 항원의 상이한 변형이 항원 모듈에서 조합되는 것이 가능하다. 항원 모듈에서 항원, 예를 들면, 항원 1, 및 다른 항원, 예를 들면, 항원 2의 조합 등이 또한 가능하다. 추가의 조합, 예를 들면, 하나 초과의 카피의 항원 1 및 단일 카피의 항원 2는 또한 항원 모듈 등으로 조합될 수 있다. 또한 추가로 하나 이상의 상이한 및/또는 하나 이상의 동일한 항원 모듈이 iMAT 분자에서 존재할 수 있다. 원칙적으로 하나 이상의 상이한 항원으로부터 유래된 단일 및 다수 존재하는 동일한 또는 변경된 카피의 항원의 모든 가능한 조합이 본 발명의 목적을 위해 조합되는 것이 가능하다.

바람직한 양태에서, 항원 모듈은 적어도 하나의 항원으로부터 유래된 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프를 포함하고, 여기서, 이러한 항원은 알레르겐이다. 적어도 하나의 에피토프는 알레르겐에 대항하는 면역 반응을 유발할 수 있고, 이에 의해 에피토프는 하나 또는 하나 이상의 구조, 예를 들면, 펩타이드를 포함할 수 있고, 면역 반응을 유발할 수 있다. 에피토프는 알레르겐의 연속 에피토프 또는 불연속 에피토프일 수 있다. 에피토프는 바람직하게는 적어도 8개의 아미노산 길이, 바람직하게는 적어도 10개의 아미노산 길이, 보다 바람직하게는 적어도 13개의 아미노산 길이이다. 항원 모듈은 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프를 포함하지만, 또한 서로 동일하거나 상이할 수 있는 2개 이상의 전체 또는 부분 에피토프를 포함할 수 있다. 추가로, 항원 모듈은 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프에 인접한 추가의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 에피토프는 자연 발생 에피토프일 수 있거나, 이의 아미노산 서열에서 변형되거나 및/또는 하나 이상의 해독후 변형에 의해 변형된 에피토프일 수 있다.

하나의 양태에서, 적어도 하나의 제3 항원 모듈은 하나 이상의 감염 질환(들)에 관련된 병원체의 적어도 하나의 항원으로부터 유래된 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프를 포함한다. 이는 로도코쿠스, 스트렙토코쿠스, 오르비바이러스, 플라비바이러스, 트리코피톤, 마이크로스포룸, 크립토스포리디움 및/또는 스트롱길루스 속으로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 따른 iMAT 분자에서 적어도 하나의 항원 모듈은 또한 하나 이상의 감염 질환(들) 전염에 관여하는 매개체의 항원, 예를 들면, 쿨리코이데스, 쿨렉스 및/또는 익소데스 타액 성분일 수 있다.

추가의 바람직한 양태에서, 적어도 하나의 제3 항원 모듈은 말에서 하나 이상의 알레르기(들)를 유발하는 적어도 하나의 알레르겐으로부터 유래된 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프를 포함한다. 이는 곰팡이(진균류 및/또는 이들의 포자), 화분, 집먼지 또는 사료 진드기(및/또는 이들의 배설물), 바람직하게는 나무, 잔디, 풀, 돼지풀로부터의 화분 및/또는 십자화과 화분 및/또는 아스페르길루스, 알테르나리아, 보트리티스, 세르코르포라, 클라도스포리움, 쿠르불라리아, 드레크슬레라, 유로티움, 헬민토스포리움, 에피코쿰, 에리시페/오이디움, 푸사리움, 리치테이미아, 니그로스포라, 페니실리움, 페리코니아, 페로노스포라, 폴리트린시움, 사카로폴리스포라(이전에 또한 파에니아 또는 마이크로폴리스포라), 서모아크티노마이세스, 스템필리움, 토룰라 속의 진균류 및/또는 이의 포자 및/또는 아카루스, 글리코파구스, 티로파구스, 데르마토파고이데스 속의 진드기(또는 이들의 배설물)로부터 유래된 적어도 하나의 알레르겐의 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프일 수 있다.

바람직한 양태에서, 이는, 바람직하게는 흡혈 곤충으로부터, 보다 바람직하게는 쿨리코이데스 속으로부터 유래된 적어도 하나의 알레르겐의 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프이다.

쿨리코이데스 속의 알레르겐의 예는 도 1에 나타나 있고, 종, 알레르겐 및 유닛프롯 등록 번호(UniProt excession number)(데이타베이스 공개는 유닛프롯 공개 2013_09이다)를 확인한다.

추가의 바람직한 양태에서, 이러한 적어도 하나의 알레르겐은 Cul n4, Cul o1, Cul o2, Cul o3, Cul o4 및/또는 Cul o7 알레르겐이다. 항원 모듈의 바람직한 특정 서열은 서열 번호 3, 4, 5, 6, 18, 19에 따르는 아미노산 서열이다.

본 발명 중에서 "(분리된) 재조합 단백질" 및/또는 "iMAT 분자"와 연관된 용어 "(…)에 의해 조절되는 면역 반응" 또는 상호교환되어 "면역조절 면역 반응"은 면역원성 및/또는 면역관용 면역 반응을 언급한다.

본 발명 중에서 용어 "알레르겐"은 비변성 형성에서 비정상적으로 격렬한 면역 반응을 생성하는 항원의 타입을 언급하고, 여기서, 면역 시스템은 그렇지 않으면 대상자에게 해로울 수 있는 모든 인지되는 위협을 없애기 위해 대항한다(fights off). 전형적으로, 이러한 종류의 반응은 알레르기로서 공지된 표현형을 야기한다. 다양한 타입의 알레르겐은 선행 기술에 기재되어 있고, 식품, 약물, 동물성 제품 또는 천연 또는 합성 물질을 포함한다. 바람직하게는, 적어도 5명의 대상자, 바람직하게는 말에서 비변성 형성에서 특이적 IgE 반응을 도출하는 경우, 단백질은 알레르겐인 것으로 고려된다. 의심할 여지를 없애기 위해, "적어도 하나의 알레르겐으로부터 유래된 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프를 포함하는 적어도 하나의 제3 항원 모듈"과 연결된 "알레르겐"은 비변성 형성에서 더 이상 존재할 필요가 없고, 이는 또한 바람직하고 - 다시 말해서, 본 발명 중에서 용어 "알레르겐"은 또한 명쾌하게 iMAT 분자의 부분으로서 본원에 기재되고 청구된 비-비변성 아미노산 서열을 언급하고, 이는 적어도 5명의 대상자, 바람직하게는 말에서 더 이상 특이적 IgE 반응을 도출하지 않는다.

또한 본원에서 용어 "에피토프"는 본 발명 중에서 "항원결정인자"로서 상호교환되어 언급되고, B-세포 또는 T-세포 중 어느 하나에 의한 면역 시스템에 의해 인지되는 항원의 부분을 언급한다. 에피토프는 이들이 결합된 MHC 분자에 의해 항원 제시 세포의 표면에 존재한다.

또한 본원에서 용어 "대상자"는 본 발명 중에서 "개체" 및/또는 "유기체"로서 상호교환되어 언급되고, 바람직하게는 말을 언급한다.

또한 본원에서 용어 "말(equine)"은 본 발명 중에서 "말(horse)"로서 상호교환되어 언급되고, 말 속(genus Equus)의 임의의 구성원을 포함한다. 이는, 예를 들면, 임의의 말, 조랑말 및/또는 당나귀, 분류학적 명칭 에쿠스 페루스(Equus ferus) 및/또는 에쿠스 카발루스(Equus caballus), 및/또는 아종 에쿠스 페루스 카발루스(Equus ferus caballus)을 포함한다. 말은, 예를 들면, 사육용 말일수 있다.

용어 "펩타이드" 및 "단백질"은 함께 본 발명 중에서 동등한 것으로 사용된다. 펩타이드 또는 단백질은 본 발명의 목적을 위해 펩타이드 결합을 통한 적어도 2개의 아미노산의 공유 결합 연결을 의미한다. 용어 "아미노산" 및 용어 "아미노산 잔기"은 본 출원에서 동등한 것으로 사용되고, 즉, 2개 용어의 의미는 동일하다. 용어 아미노산/아미노산 잔기 및 펩타이드/단백질은 본 출원에서 가장 넓은 가능한 정의의 형태로 사용된다.

이와 관련하여, 용어 "재조합 단백질"은 진핵 또는 원핵 시스템에서 유전자 조작 및 발현에 의해 수득될 수 있는 폴리펩타이드를 언급한다. 추가로, 상기 용어는 인공(예를 들면, 고체-상) 합성으로 수득된 폴리펩타이드를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "상이한 아미노산 잔기"는, 달리 언급되지 않는 한, 시스테인 이외에 공지된 아미노산 잔기를 언급한다. 예를 들면, 상기 아미노산 잔기는 자연 발생 아미노산 잔기, 예를 들면, 세린 또는 이소류신일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "선형"은 부차적인 구조가 결핍된 본 발명에 따른 단백질을 언급한다. 이러한 단백질은 종종 랜덤-코일 입체구조를 나타내는 것으로 추정되고, 여기서, 단지 고정된 상관관계는 펩타이드 결합에 의한 인접한 아미노산 잔기의 연결(joining)이다.

바람직한 양태에서, 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질은 단량체성 형성 및/또는 선형으로 존재한다.

본원에 사용된 용어 "치료"는 예방적 및/또는 치료학적 치료를 포함하는 목적하는 임상적 결과를 수득하기 위한 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질, 및/또는 상응하는 백신 및/또는 면역원성 조성물 및/또는 약제학적 조성물의 투여를 언급한다.

본원에 사용된 용어 "면역요법"은, 예를 들면, 예방적 및/또는 치료학적 예방접종에 의한 대상자의 치료학적 및/또는 예방적 치료를 언급한다.

"하나 이상의 감염 질환(들)의 전염"와 연관되어 본원에 사용된 용어 "매개체"는 살아있는 유기체를 언급하고, 본원에서 용어 "생물학적 매개체", "생물학적 보균자(carrier)" 및/또는 "질환 보균자"와 상호교환되어 사용되고, 예를 들면, 흡혈 파리, 각다귀, 진드기 및/또는 모기이다.

추가로, 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질은 추가로 적어도 하나의 tag 모듈을 포함하는 것이 가능하고 바람직하다. 즉, 하나 이상의 상이한 및/또는 동일한 tag 모듈이 본원에 개시되거나 청구된 (분리된) 재조합 단백질의 일부인 것이 가능하고 바람직하다. Tag 모듈은 종종 20 이하의 아미노산 또는 아미노산으로 구성되지 않은 관능기, 예를 들면, 비오틴 또는 디곡시게닌으로 이루어지는 짧은 펩타이드일 수 있다. 적합한 tag 모듈은 4 내지 12 이상의 히스티딘 서열, 바람직하게는 직접적으로 연속적인 히스티딘 잔기, 바람직하게는 5, 6 또는 7 연속적인 히스티딘 잔기를 포함하는 잘 공지된 바람직한 His-tag를 포함한다. 다른 적합한 tag 모듈은 HA-tag, FLAG-tag, GST-tag 또는 Strep-tag를 포함한다. tag가 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질에서 어디든 존재할 수 있지만, 바람직한 양태에서, tag 모듈은 (분리된) 재조합 단백질의 N-말단에서 및/또는 C-말단에서 존재한다.

tag 모듈은 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질을 분리하는데 유용하고, 추가로 이러한 (분리된) 재조합 단백질의 존재를 시험관내 또는 생체내에서 검출하도록 한다. 추가로, 인접한 모듈 또는 상이한 모듈을 이격하는 링커로부터 임의로 하나 이상의 인접한 아미노산 잔기와 함께 tag 모듈은 면역 및/또는 면역의 기간을 위한 대리 마커로서 사용될 수 있는 표적 대상자에서 특이적 면역학적으로 검출가능한 신호, (예를 들면, 항체)를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질을 사용하는 면역치료는, 자연적으로 존재하는 항원, 바람직하게는 알레르겐에 대한 노출 후 자연 면역 반응으로부터 질적으로 분명하지 않은 표적 대상자에서 항원-특이적, 바람직하게는 알레르겐-특이적 면역 반응을 도출한다. 따라서, 항원 모듈에 결합하는 항체는 iMAT 유도된 면역 조절 효과의 효율을 위한 대리 마커의 목적을 위해 적합하지 않다. 이러한 장애는 - 임의로 인접한 아미노산 잔기와 함께 C-말단 및/또는 N-말단 tag 모듈에 의해 수득되는 고유한, 항원-특이적 면역학적 신호를 측정하여 제거될 수 있다. 따라서, 이에 따른 적합한 대리 마커를 제공할 수 있다.

바람직한 양태에서, 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질은, 적어도 하나의 tag 모듈, 바람직하게는 적어도 하나의 His-tag를 추가로 포함하고, 여기서, 이러한 적어도 하나의 tag 모듈은 바람직하게는 (분리된) 재조합 단백질의 하나의 메티오닌 잔기 뒤의 N-말단 및/또는 C-말단, 보다 바람직하게는 N-말단에 존재한다.

또한, 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질의 모듈, 즉, 적어도 하나의 전위 모듈, 적어도 하나의 표적화 모듈 및 적어도 하나의 항원 모듈은 이러한 모듈 중 적어도 2개 사이에 위치한 하나 이상의 스페이서 모듈에 의해 임의로 이격될 수 있다.

스페이서 모듈은 특히, 펩타이드 서열 또는 유기 분자일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있는 다수의 스페이서 분자는 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 추가로, 본 발명의 목적을 위해 향후에 개발되거나 발견될 스페이서 분자를 또한 사용할 수 있다. 적합한 스페이서 모듈은, 그 중에서도, 펩타이드 스페이서, 크로스링커, 천연 또는 합성 중합체, 예를 들면, 핵산, 치환된 또는 치환되지 않은 탄화수소 등이다.

커플링은 공유 결합(바람직한) 및 비-공유 결합 둘 다에 의해 일어날 수 있다. 스페이서 모듈은 그 중에서도 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질의 다양한 모듈을, 이들의 기능에 대해 서로에 대한 유해한 효과를 갖지 않도록 서로 이격되도록 분리하는 작업을 한다. 본 발명의 목적을 위한 (분리된) 재조합 단백질의 모듈은 화학적 및/또는 효소적 반응에 의해, 예를 들면, 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 하나 이상의 스페이서 모듈에 의해 커플링될 수 있다. 따라서, 요구되는 경우 스페이서 모듈에 의해 서로 연결된 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질의 모듈을 분리할 수 있다.

바람직한 양태에서, 그러나, 특히 항원 모듈이 적어도 하나의 알레르겐인 적어도 하나의 항원의 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프로부터 유래된 아미노산 서열인 경우, 임의의 이러한 추가의 스페이서 모듈, 즉, 상기 제1, 제2 및/또는 제3 모듈 중 2개 이상의 인접한 모듈 사이에 추가의 스페이서 모듈은 전혀 존재하지 않는다.

본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질의 개체 모듈의 임의의 목적하는 배열은, 일반적으로 가능하다. 각각의 모듈은 (분리된) 재조합 단백질에서 1회 이상 존재할 수 있다. 최소의 요구조건은 적어도 하나의 전위 모듈, 적어도 하나의 표적화 모듈 및 적어도 하나의 항원 모듈의 존재이다. 추가의 모듈, 예를 들면, tag 모듈, 스페이서 모듈 등은 임의로 존재할 수 있지만, 존재할 필요가 없다. 모든 모듈은 본원에 개시되거나 청구된 (분리된) 재조합 단백질에서 1회 이상 존재할 수 있다. 모듈이 1회 이상 존재하는 경우, 이들은 동일한 카피의 형태로 존재할 수 있거나, 모듈의 상이한 버젼은 각각의 경우 단일 카피로 또는 하나 초과의 카피로 존재할 수 있다. 모듈, 예를 들면, His-tag 모듈 및 비오틴-tag 모듈의 동일한 부류의 전체적으로 상이한 모듈이, 본원에 개시되거나 청구된 (분리된) 재조합 단백질에 존재하는 것이 또한 가능한다. 모듈 둘 다가 (분리된) 재조합 단백질에서 기능적으로 동일한 작업(tag 모듈)을 실행하지만, 이들의 분자 구조의 관점에서 공통점이 있어야 할 필요는 없다.

바람직한 양태에서, 모듈 중 하나의 2개 이상의 카피가 본원에 개시되거나 청구된 (분리된) 재조합 단백질에서 존재하는 것이 가능할 수 있다. 즉, 동일한 또는 상이한 항원 모듈의 2개 이상의 카피가 존재할 수 있다. 대안적으로, (분리된) 재조합 단백질은 대상자에서 면역 반응을 조절하기 위한 2개의 상이한 항원 모듈을 포함할 수 있다.

재조합 단백질에서 항원 모듈의 2개 이상의 동일한 카피는 예를 들면 향상된 면역 반응을 이러한 관련 항원에 야기할 수 있다. 2개 이상의 상이한 항원 모듈은 예를 들면 2개 이상의 상이한 항원에 대하여 면역 반응을 동시에 조절하기 위해 하나의 (분리된) 재조합 단백질에서 조합될 수 있다. 2개 이상의 상이한 전위 모듈이 본원에 개시되거나 청구된 (분리된) 재조합 단백질에서 사용될 수 있다. 예를 들면, Tat 서열 및 VP22 서열은 전위를 보다 효율적으로 하는 역할을 하는데, 이는 이에 따른 (분리된) 재조합 단백질의 전위가 더 광범위한 스펙트럼(spectrum)의 상이한 세포 타입 또는 조직 타입에서 효율적으로 일어나기 때문이다. 또한 예를 들면 하나의 (분리된) 재조합 단백질에서 2개 이상의 tag 모듈을 사용할 수 있고, 예를 들면, His-tag 및 FLAG-tag이고, 이러한 경우에, 예를 들면 His-tag는 재조합 단백질을 분리하기 위해 사용되고, 예를 들면 FLAG-tag는 (분리된) 재조합 단백질을 검출하는 역할을 한다. 하나의 (분리된) 재조합 단백질에서 2개 이상의 상이한 표적화 모듈을 사용할 수 있고, 예를 들면, MHC II 분자의 불변 쇄로부터의 서열 및 추가의 표적화 모듈로서 만노스 6-포스페이트 그룹이다. 예를 들면 불변 쇄는 MIICs 내로 표적화 모듈로서 작용하고, 만노스 6-포스페이트 그룹은 리소좀 내로의 표적화를 매개하고, 이에 따라, 항원 제시의 효율 또는 항원-제시 세포 전체에 의해 제시된 항원의 상이한 에피토프의 수를 증가시킬 수 있다. 추가로, 본 발명의 iMAT 분자는 동일한 또는 상이한 종으로부터 유래된 2개 이상의 상이한 불변 쇄를 포함할 수 있고, 이에 따라, 따라서, 본 발명에 따른 단백질을 상이한 종에서 사용할 수 있게 한다.

본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질 내에 개체 모듈의 위치는, 또한, 적어도 하나의 전위 모듈, 적어도 하나의 표적화 모듈 및 적어도 하나의 항원 모듈이 존재하는 한, 목적하는 대로 변화될 수 있다. 또한, (분리된) 재조합 단백질의 모듈의 전부 또는 일부는, 예를 들면, 모듈의 선형 순차적 배열의 형태로 존재하지 않고, 원형으로 또는 분지화된 모듈 구조로 또는 그렇지 않으면 덴드리머 형태로, 또는 선형 및/또는 분지화된 및/또는 원형 및/또는 덴드리머 분자 부분의 조합으로 존재할 수 있다. 이들 메카니즘, 예를 들면, IMPACT^TM-TWIN 시스템(제조원: New England Biolabs, Beverly, MA, USA)에 의해 원형 융합 단백질을 제조할 수 있게 하는 특이적 벡터를 공급하는 발현 벡터의 시판 공급자가 있다. 분지화된 모듈은 예를 들면 펩타이드를 합성하여 제조될 수 있고, 여기서, 폴리 L-리신로부터 시작하여, 신규한 리신 잔기는 후속적인 리신 잔기 각각의 둘 다의 유리 아미노 그룹에 부착된다. 이러한 방식으로, 사실상 임의의 범위로 분지화된 펩타이드 구조를 생성할 수 있다. 이어서, 예를 들면, 전위 모듈 및/또는 표적화 모듈을 후속적으로 분지된 펩타이드 기본 구조 상에 합성할 수 있다. 추가의 모듈은 또한 선형, 원형 또는 분지화된 펩타이드 기본 구조 상에 단백질 결찰에 의해 커플링될 수 있다. 또한 예를 들면 비오틴 그룹을 펩타이드 기본 구조 내로 펩타이드 합성 동안 도입할 수 있고, 이어서, 모듈은 이들 비오틴 그룹에, 예를 들면, 스트렙타비딘, Strep tag 시스템을 통해 또는 PinPoint^TM 시스템을 통해 부착될 수 있다(각각 IBA GmbH, Gottingen, Germany and Promega Biosciences Inc., San Louis Obispo, CA, USA). 이어서, 이러한 방식으로 부착된 모듈은 비-공유 결합으로 펩타이드 기본 구조에 커플링된다.

바람직한 양태에서, 본원에 개시되거나 청구된 (분리된) 재조합 단백질은 서열 번호 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 20, 21, 22, 및 23에 따른 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하고, 바람직하게는 이들로서 이루어진다.

본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질은, 곤충 물림 과민성(IBH) 및/또는 두드러기를 앓는 말에서 치료 및/또는 예방을 특히 처리하는 방법에서 특히 유용하다.

곤충 물림 과민성은 대상자에서 전신 반응을 야기하는 그렇지 않으면 해로운 곤충 타액, 독, 신체 부분, 분뇨 또는 분비에 의해 유도될 수 있다. 실제로, IBH는 말의 고통스러운 흔한 알레르기 피부 질환이고, 전세계 다양한 지역에서 발견되는 쿨리코이데스 속의 곤충의 물림에 의해 종종 야기되는 만성 재발성 계절성 알레르기 피부염으로서 나타난다. IBH는 상이한 명칭으로, 예를 들면, 스위트 옴(sweet itch), 여름 옴, 여름 습진, 카센(Kasen), 퀸즐랜드 옴, 계절성 피부염 또는 쿨리코이데스 과민성으로 전세계적으로 보고되었다. 발병된 대상자는 매우 가렵고 고통받고, 스스로를 집중적으로 문지르고 문다. 전형적인 임상적 징후는 가려움증, 파리 물림 형태 수포이고, 이는 진물이 흐를 수 있고, 크러스팅(crusting), 딱지 및 스케일링(scaling)을 야기한다. 장기간의 쓸림 및 물림은, 무엇보다도, 털 손실 및 피부에 손상을 야기하고, 때때로 아물지 않은 상처에서 출혈이 일어난다. 가끔, 이차적인 박테리아 감염이 일어날 수 있다. 또한 말이 그들의 갈기 및 상부 꼬리 털을 문질러 벗기는 것(rub off)은 드문 일은 아니다. 장기간 동안, 피부 비대 및 털 손실 색소침착이 일어날 수 있다. 갈기 및 꼬리는 가장 공통되게 발병되고; 그러나, 심각한 징후를 갖는 말은 전신의 넓은 면적으로 병소를 가질 수 있다. 진단은 임상적 검사를 기초로 하고, 전형적인, 계절성 발생 징후이다.

말에서 IBH의 병리생리학은 거의 공지되어 있지 않다. 다른 종과 비교하여 피부에서 나타나는 알레르기에 있어서 상당한 차이가 있는 것 같다. 따라서, 또한 이들의 치료에 대한 반응은 상이하고 - 예를 들면, 히스타민 수용체 길항제는 임상적 증상을 완화시킬 수 없다[참조: Olsen et al. Vet.J. 2011, 187: 347-351]. 또한 알레르겐-특이적 면역요법(SIT)은 과거에 말에서 IBH에 이용되어 성공적이지 못했다[참조: Ginel et al., Vet. Derm. 2014, 25: 29-e10].

이러한 의학적 문제를 해결하기 위해, 본원에 개시되거나 청구된 IBH 특정된 (분리된) 재조합 단백질에서 적어도 하나의 항원 모듈은 쿨리코이데스 속(Diptera: Ceratopogonidae)의 상이한 종의 각다귀로부터 분리된 최근 발견된 알레르겐의 그룹으로부터 선택된다.

추가로, IBH-발병된 말은 또한 두드러기를 앓는 것 보다 7.1-배 증가된 위험을 갖는다[참조: Kehrli D et al, J Vet Intern Med 2015, 29(1): 320-326]. '두드러기(hives)' 또는 '담마진(nettle rash)'으로서 또한 공지된 두드러기(urticaria)는 피부에 나타나는 별개의 붓기를 특징으로 한다. 이들은 원형 부스럼(patches), 환-형 병소이거나, 편자를 모방하거나, 다른 특이한 형태를 가질 수 있다. 케이스의 대부분은 재발성이고, 두드러기가 갑작스럽게 개시되고, 24 내지 48시간 또는 수일 내에 자발적으로 해결된다.

두드러기에 관련된 IgE 매개된 알레르기 성분이 있다는 충분한 증거이다. 그러나, 병리생리학은 여전히 불충분하게 이해된다. 즉시 촉발은 소인성(predisposed) 대상자, 예를 들면, IBH를 앓는 말 및/또는 그렇지 않으면 환경 알레르겐에 대한 피부 과민성 소인성인 대상자에서 곤충 찌름 또는 물림, 식이, 약물 반응, 잠자리, 화학물질 등일 수 있다. 따라서, 예를 들면, IBH에 대항하여 성공적인 면역요법은 이러한 대상자에서 재발성 두드러기의 발생이 감소시킬 수 있다.

추가의 양태에서, 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질은, 특히 재발성 기도 폐쇄(RAO)를 앓고 있는 말에서 치료 및/또는 예방을 특히 처리하는 방법에서 유용하다.

말에서 재발성 기도 폐쇄(RAO)는, 사람 천식과 유사한 호흡기 질환으로서, 전세계적으로 중년 및 고령 말의 폐에서 발병되는 가장 흔히 진단되는 상태 중 하나이다. 이는 또한 히브(heaves), 또는 만성 기관지염/세기관지염, 또는 이전에는 만성 폐쇄성 폐 질환으로 언급된다. 여름 동안에 나타난 경우, 예를 들면, 말이 목초지에 있는 경우, 용어 여름 목초지 연관된 폐쇄성 폐 질환 또는 여름 목초지 연관된 RAO이 사용된다.

RAO는, 함께 작용하여 기도 염증 및 가역적 기도 폐쇄를 유도하는 히스타민 및 다른 화학적 매개체의 생성을 유도하는, 레아진 항체, 주로 비만 세포 탈과립을 야기하는 IgE로 시작하는 전형적인 일련의 사건을 포함하는 1형 즉시 과민성 알레르기 질환이다. 악화 동안 관찰되는 임상적 신호는 중증일 수 있고, 운동 불내성, 기침, 비루 및 휴식시 증가된 호흡 노력(respiratory effort)을 포함한다. 진단적 절차, 예를 들면, 폐 기능 측정, 혈액 가스 또는 기관지폐포 세척의 분석은 질환에 대한 추가의 정보를 제공할 수 있다. 전형적인 치료는 단지 예방적 치료(예를 들면, 기관지확장제 및/또는 코르티코스테로이드)를 포함하지만, 원인 치료는 이용가능하지 않다[참조: Leclere et al. Respirology 2011, 16: 1027-1046, Pirie, Equine Vet J 2014, 46: 276-288].

클라라 세포(Clara Cell) 10 kDa 단백질(CC10)을 사용한 최근 치료는 보호에 효과적이거나 RAO을 앓고 있는 말에서 수동 면역요법으로서 유용한 것으로 주장되었다. CC10은 사람 및 동물의 기도 상피에서 대부분 생성되는 소염성 방어 단백질의 부류의 구성원 중 하나이다. 당해 발명은 US 2014/0105906에 기재되어 있다.

RAO는 복합체 질환이지만, 분명하게는 공기매개 알레르겐으로의 노출은 병인론에서 중심 역할을 한다. 임상적 완화는 대개 공기 알레르겐으로의 노출을 제거하여 성취된다. 그렇지만, RAO 촉발에 연관된 주요 항원은 지금까지 명백하게 확인되지 않았다. 다수의 잠재적 제제는, 예를 들면, 안정된 말에서 주로 안정하게 존재하는 - 유기물 분진 또는 목초지에 풀어놓은 말에서 추가로 화분을 포함하는 건초 분진에서 존재한다[참조: Leclere et al. Respirology 2011, 16: 1027-1046, Pirie, Equine Vet J 2014, 46: 276-288].

본 발명에 따른 iMAT 분자의 항원 모듈은 본원의 실시예 6 및 7에 예시적으로 상세하게 기술된 생물정보학 접근법으로 선택될 수 있다. 이러한 수단에 의해 iMAT 분자를 특히 백신으로서, 예를 들면, 대상자, 바람직하게는 말에서 RAO의 치료 및/또는 예방을 위해 유용하게 만들 수 있다.

추가의 양태에서, 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질은 박테리아에 의해 야기된 감염 질환을 앓고 있는 말에서 특히 치료 및/또는 예방을 처리하는 방법에서 특히 유용하다.

로도코쿠스 에퀴(Rhodococcus equi)는 폐 및 폐이외 화농육아종(pyogranulomatous) 감염을 야기하는 토양-서식 병원체성 방선균이다 - 에콰인 로도코코시스(equine rhodococcosis). 어린 망아지가 특히 걸리기 쉬고, 생명-위협적인 폐 질환이 발병한다. 그렇지만, 궤양 소장결장염, 골수염 및 폐혈성 관절염은 가끔 관찰된다. 다수의 면역 전략이 망아지에서 로도코코시스를 예방하기 위해 시도되었고, 성공하지 못하거나 제한적인 성공을 가졌다. 항생제 치료는 모순되게 효과적일 뿐만 아니라 고가이고, 최근 연구는 항생제-내성 균주의 출현이 강조되었다.

감염은 주로 병원체를 운반하는 공기매개 분진의 흡입을 통한다. 숙주로의 진입시, 로도코코시스 에퀴(R. equi)는 흡입 후 폐에서 국부 포식세포, 특히 폐포 포식세포에 의해 흡수된다. 느리게 질행되는 기능적 폐 손실로 확산되고, 이는 조기 임상적 진단을 어렵게 한다. 초기 임상적 징후는 종종 단지 미열, 가끔의 기침, 또는 호흡 속도의 약간 증가로 이루어지고, 이는 망아지가 운동하거나 처리로 스트레스 받지 않는 한 분명하지 않을 수 있다. 추가로 진단은 없고, 용이한 - 풍토성 로도코코시스 에퀴 폐렴을 갖는 농장을 감시하기 위한 현재 권장되는 수단은 백혈구 농도의 분석 및 경기관 세척으로부터의 박테리아의 배양 및 이러한 물질로부터 PCR 또는 세포학적 검사를 통한 로도코코시스 에퀴의 확인이다[참조: van Bargen, K and Haas, A. FEMS Microbiol Rev 2009, 33: 870-891, Vazquez-Boland, JA et al., Vet Microbiol 2013, 167: 9-33].

이러한 의학적 문제를 해결하기 위해, 본원에 개시되거나 청구된 로도코코시스 특정된 (분리된) 재조합 단백질에서 적어도 하나의 항원 모듈이 로도코코시스 에퀴, 예를 들면, 독력-관련 단백질 A(VapA), 면역우세 표면-발현된 지질단백질, 또는 다른 표면 단백질로부터 유래된 항원으로부터 선택될 수 있고, 이는 또한 로도코코시스 에퀴-감염 파지로부터 유래될 수 있다. 개선된 MAT 분자는 특히 백신으로서, 예를 들면, 에콰인 로도코코시스의 치료 및/또는 예방을 위해 유용하게 성취될 수 있다. 치료는 iMAT 분자의 망아지로의 투여를 포함할 수 있고, 및/또는 또한 본 발명에 따른 임신 말의 치료를 포함할 수 있다.

선역은 말에서 감염의 또다른 예이고, 두경부의 림프절의 종기를 특징으로 하는 선역은 스트렙토코쿠스 에퀴에 의해 야기되고, 말의 가장 빈번하게 진단되는 감염 질환 중 하나이고, 새로운 예방 백신을 개발할 중요한 필요성이 남아있다.

추가의 양태에서, 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질은, 특히 바이러스에 의해 야기된 감염 질환을 앓는 말에서 치료 및/또는 예방을 특히 처리하는 방법에서 유용하다.

아프리카 마역(AHS)은 높은 감염성의 치명적인 질환이다. 이는 공통으로 말, 노새, 및 당나귀에서 발병된다. 이는 레오비리대(Reoviridae) 강에 속하는 오르비바이러스 속의 바이러스에 의해 야기된다. AHS는 직접적으로 전염성은 아니지만, 곤충 매개체에 의해, 주로 쿨리코이데스, 뿐만 아니라 쿨렉스, 아노펠레스(Anopheles) 및 아데스(Aedes)에 의해 확산되는 것으로 공지되어 있거나, 진드기(예를 들면, 히알로마(Hyalomma) 또는 리피세팔루스(Rhipicephalus))에 의한 전염가 기재되어 있다. 지금까지 효과적인 치료법은 AHS에 대해 존재하지 않고, 감염된 말의 90% 가까이가 대부분 감염 24시간 내에 호흡 부전으로 사망한다. 결과적으로, 질환의 통제는 예방적 예방접종에 의존한다.

웨스트 나일 바이러스(WNV)는 플라비비리대 강에서 플라비바이러스 속의 일본 뇌염 바이러스 혈청군 내에 그룹화된 모기-전염된 양성-이중가닥 RNA 바이러스이다. WNV는 또한 웨스트 나일 열(West Nile Fever)로 언급되는 질환 증후군의 원인 물질이다. 새는 천연 병원소 숙주이고, WNV는 모기-새-모기 전염 주기로 자연에서 유지된다. 그러나, 말이 감염된 경우, 종종 인지되지 않은 채로 있다. 말은 죽거나, 부전마비, 운동 실조, 횡와(recumbency), 및 근육섬유다발수축을 포함하는 심각한 신경학적 징후 때문에 안락사되고, 다른 것들은 온화하거나 중증의 회색질뇌척수염을 나타낸다. WNV 감염의 진단 및 확인은 직접적으로 바이러스의 확인에 의해 이루어지거나 간접적으로 임상적 표본에서 항체에 대한 시험으로 이루어질 수 있다. 그러나, 이는 전형적으로 말에서 단기간 및 낮은 수준의 바이러스혈증에 의해 방해된다.

추가의 양태에서, 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질은, 말에서 매개체, 예를 들면, 흡혈 파리, 각다귀, 진드기 및/또는 모기에 의한 특히 감염 질환 전염의 예방의 처리 방법에서 특히 유용하다.

병원체는 절지동물 타액과 함께 포유동물 숙주의 피부 내로 전달되고, 절지동물 타액은 광범위하게 다양한 생활성 분자를 포함한다. 이들 타액 성분은 지혈 및 면역 반응을 변경할 수 있고, 병원체가 감염을 생성시키는 능력에 기여할 수 있다. 흡혈 절지동물의 침샘에 감염 미생물의 존재는 자체로 타액 조성물을 변경시키고, 예를 들면, 감염된 모기에서 아피라제 또는 항-트롬비나제의 농도를 변화시킨다. 이들 항원 또는 다른 것들은 본 발명에 따른 iMAT 분자의 항원 모듈에서 사용되는 것으로 매우 적합하고, 말에서 매개체에 의한 감염 병원체의 전염를 방지하는 숙주 면역 시스템을 활성화시키기 위한 백신으로서 특히 유용할 수 있다.

추가의 양태에서, 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질은, 진균류에 의해 야기되는 감염 질환을 앓는 말에서 치료 및/또는 예방을 특히 처리하는 방법에서 특히 유용하다.

백선증 또는 백선은 동물 및 사람에서 발생하는 털의 및 피부의 표피 각질화된 세포 층의 진균 감염이다. 동물친화(zoophilic) 또는 흙친화(geophilic) 피부사상균의 그룹에 속하는 마이크로스포룸 속 또는 트리코피톤 속의 수개의 종은 동물에서 임상적 감염을 야기할 수 있다. 진균류 및/또는 이들의 포자의 다양한 표면 항원은 본 발명에 따른 iMAT 분자의 항원 모듈에서 사용하는데 매우 적합하고, 특히 예를 들면, 말에서 백선증을 치료 및/또는 예방하기 위한 백신으로서 유용할 수 있다.

추가의 양태에서, 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질은, 기생충에 의해 야기되는 감염 질환을 앓는 말에서 치료 및/또는 예방을 특히 처리하는 방법에서 특히 유용하다.

말을 감염시키는 기생충은 전세계적으로 아주 흔하고 임상적으로 중요하다. 말 건강을 위협하는 주요 기생충은 시아토스토민스(cyathostomins), 파라스카리스 에쿼룸(parascaris equorum), 아노플로세팔라 페르폴리아타(anoplocephala perfoliata), 및 스트롱길루스 불가리스(strongylus vulgaris)이다. 구충제 내성의 증가된 수준은 전세계적으로 말 기생충에서 보고되었다. 원생동물, 예를 들면, 크립토스포리디움에 대해, 수개의 약물은 일관되게 숙주에서 기생동물 번식을 억제한다. 주로 망아지가 영향을 받고, 결과는 선천적 및 적응 면역 반응에 의존한다.

성체 기생충로부터 유래되는 항원 뿐만 아니라 잠복기는 본 발명에 따른 iMAT 분자의 항원 모듈에서 사용되는 또다른 예이고, 예를 들면, 말에서 기생동물 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 백신으로서 특히 유용할 수 있다.

특히 말에서 면역 반응을 조절하는 경우에, 적어도 하나의 표적화 모듈은 바람직하게는 말 불변 쇄, 보다 바람직하게는 서열 번호 2, 15, 16에 따른 하나 이상의 아미노산 서열이다.

유리한 양태에서, 본원에 개시되거나 청구된 (분리된) 재조합 단백질이, 단량체성 형성에서 존재하는데, 특히, 봉입체(inclusion bodies)를 통해 제조되는 경우, 이는, 예를 들면, 재조합으로 도입된 알레르겐이 응집을 형성하는 경향이 있기 때문이다. (분리된) 재조합 단백질의 전체 서열에서 적어도 하나의, 바람직하게는 모든 시스테인 잔기를 대체하여, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신 및/또는 아스파르트산에 대해 대체하여, 분자간 디설파이드 결합 형성을 방지하고, 따라서, 임의의 응집, 특히, 분자간 및/또는 분자내 결합의 임의의 비-비변성 형성을 피한다. 즉, 시스테인 잔기가 전혀 없는 (분리된) 재조합 단백질은 응집되지 않는다. 결과적으로, 단백질은 용이하게 발현할 수 있고, 개선된 표적화 및 MHC 제시를 증명한다.

또한 예를 들면, 알레르겐의 이러한 시스테인-유리 변이(여기서, 야생형 알레르겐의 아미노산 서열에서 시스테인 잔기는 단독으로 또는 조합하여 변이된다)는, 상응하는 야생형 알레르겐과 비교하여 감소된 IgE 반응성을 나타내고, 동시에 T-림프구에 대한 실질적으로 반응성을 보유하고, 이에 따라 저알레르기성이다.

따라서, 본 발명은 말에서 예를 들면 IBH를 유발하는 알레르겐의 이러한 저알레르기성 변이에 관한 것이고, 여기서, 변이에서 야생형 알레르겐의 시스테인 잔기는 단독으로 또는 조합하여 변이되었다.

추가로, 예를 들면, 아연- 또는 코발트-충전된 고체 지지체를 사용하는, 본 발명에 따른 iMAT 분자를 포함하는 샘플에서 단백질을 분리하기 위한 tag 모듈의 존재는 정제 처리 동안 응집 없이 융합 단백질을 생성할 가능성을 추가로 개선시킨다. 전형적으로, tag 모듈은 5 내지 6개의 연속적인 히스티딘 잔기의 폴리히스티딘 tag를 포함한다.

본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질은, 약제학적 조성물에서 유용하다. 예를 들면, (분리된) 재조합 단백질은 백신에서 사용하기 위한 것이다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 이러한 백신 조성물은 곤충 물림 과민성(IBH), 두드러기 및/또는 말 재발성 기도 폐쇄(RAO), 병원체, 예를 들면, 로도코쿠스 폐렴, 선역, 아프리카 마역, 웨스트 나일 바이러스 감염, 백선증 및/또는 소화관 또는 다른 기관의 기생충, 예를 들면, 와포자충증, 연충 및/또는 이의 잠복기로부터 유래된 감염 질환을 앓는 말에서 치료학적으로 및/또는 예방적으로 사용될 수 있다. 추가로, 상기 방법은 이러한 병원체에 대항하여 지시되어 사용되는 것, 뿐만 아니라 매개체, 예를 들면, 흡혈 파리, 각다귀, 진드기 및/또는 모기에 의한 전염를 예방하기 위해 숙주 면역 시스템을 활성화하는데 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 바람직한 양태에서, 대상자, 예를 들면, 말에 대한 백신은, 예를 들면, 쿨리코이데스 각다귀 및/또는 다른 흡혈 곤충에 물림에 대한 반응으로 야기되는 IBH를 치료 및/또는 예방하기 위해 제공된다. 추가로, IBH에 대항하는 성공적인 면역요법은 환경 알레르겐에 대한 일반적으로 피부 과민성을 감소시킬 수 있고, 이에 따라, 이러한 소인성 대상자에서 재발성 두드러기의 발생을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, 대상자, 예를 들면, 말에 대한 백신은, 예를 들면, 곰팡이(진균류 및/또는 이들의 포자), 화분, 집먼지 또는 사료 진드기(및/또는 이들의 배설물)에 대한 반응으로 야기되는 RAO를 치료 및/또는 예방하기 위해 제공된다.

본 발명의 추가의 양태에서, 대상자, 예를 들면, 말에 대한 백신은, 예를 들면, 로도코쿠스, 스트렙토코쿠스, 오르비바이러스, 플라비바이러스, 트리코피톤, 마이크로스포룸, 크립토스포리디움 및/또는 스트롱길루스 속에 관련된 감염 질환을 치료 및/또는 예방하기 위해 제공된다. 추가로, 백신은 매개체, 예를 들면, 쿨리코이데스, 쿨렉스 및/또는 익소데스 및/또는 다른 흡혈 곤충에 의한 질환의 전염를 예방하기 위한 숙주 면역 시스템을 활성화하기 위해 제공될 수 있다.

예를 들면, (분리된) 재조합 단백질의 백신 형태의 약제학적 조성물은 바람직하게는 설하 투여, 피하 및/또는 피내 주사, 림프절 내로의 주사를 위해 및/또는 점막을 통한, 특히, 위장관 또는 호흡기계의 점막을 통한 투여를 위해 설계된다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 약제학적 조성물은 비경구로 투여된다.

본 발명에 따른 iMAT 분자는, 예를 들면, 알레르기 장애를 변경하기 위해 약제로서 또는 백신으로서 사용될 수 있다. 예를 들면 곤충 물림 과민성(IBH)은 상기 iMAT 분자로 치료될 수 있다.

쿨리코이데스 속과 같은 IBH 유발 곤충의 알레르겐을 포함하는, 재조합 제조된 iMAT 분자의 소량(1 내지 1000μg은 단지 하나 이상의 항원 모듈의 중량을 언급한다)은, 예를 들면, 1 내지 5회 피하, 피내 또는 직접적으로 림프절 내로 주사되고, 임상적 증상의 완화를 야기하는 말에서 강력하게 장시간 지속되는 면역 반응을 유도한다.

하나의 바람직한 양태에서, 본 발명의 iMAT 분자는 적어도 하나의 보조제와 배합하여 투여된다. 보조제는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 다음 중 하나 이상을 포함한다: 명반, BCG, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 인산칼슘, 지질 에멀젼, 지질 또는 중합체성 나노- 또는 미세구, 미셀, 리포좀, 사포닌, 지질 A, 또는 무라밀 디펩타이드, 박테리아 제품, 케모킨, 사이토킨 및 호르몬, 키토산, 전분, 알기네이트, 셀룰로스 유도체(예를 들면, 에틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스), 핵산, 또는 핵산 작제물. 이들 성분의 하나 이상을 면역 반응을 향상 또는 변형하기 위해 첨가될 수 있다. 대안적으로, iMAT 분자는 보조제 없이 또는 수성 형태로 투여될 수 있다.

iMAT 분자는 약 1μg 내지 1000μg(이러한 및 후속 용량은 단지 하나 이상의 항원 모듈의 중량을 언급함)의 용량으로, 보다 바람직하게는 약 10μg 내지 약 100μg의 용량으로, 더욱 보다 바람직하게는 약 20μg 내지 약 50μg의 용량으로 투여될 수 있지만, 최적 용량은 주사되는 항원, 바람직하게는 알레르겐, 대상자의 체중, 대상자의 면역 시스템 등에 좌우되어 가변될 수 있다. 다수의 경우에 효과적인 치료는 1회 투여로 수행될 수 있다. 몇몇 양태에서, 치료는 1 내지 15회 투여를 포함한다. 바람직한 양태에서, 치료는 1 내지 5회 투여, 보다 바람직하게는 1 내지 3회 투여를 포함한다. 초기 치료를 위해 투여는 주기적으로, 예를 들면, 하루의 과정으로, 1개월 또는 1년에 1 또는 2회, 또는 1년에 수회일 수 있다. 면역 반응의 유지를 위해, 투여는 수개월 또는 수년 간격으로 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질은, 림프절내(lymphatic intranodal) 투여를 위해 설계된다. 림프절 내로 직접 주사 동안, 각각의 림프절은 주사 절차 동안, 예를 들면, 초음파에 의해 가시화되어 니들의 위치 및 림프절 내의 변화, 예를 들면, 팽윤을 모니터링할 수 있다. 하악각, 겨드랑, 서혜부 및/또는 슬와 림프절 내로의 주사는 초음파 안내된 위치 및 주사의 용이성 때문에 바람직하다.

흡혈 곤충의 타액에서 수개(>20)의 동일한 단백질은 말에서 IgE 반응성 및 병리학적 피부 반응을 유도하는 것으로 당해 기술 분야에 공지되어 있다[참조: Schaffartzik, Veterinary Immunology and Immunopathology 2012, 147: 113-126; Allergome (www.allergome.org)]. 따라서, 관련 알레르겐 대부분이 특정한 면역요법을 위한 의약에서 포함되는 경우, 치료는 단지 성공적일 수 있음이 예상된다. 그러나, 놀랍게도 상기 iMAT 분자가 1 내지 5회 피하, 피내 및/또는 직접적으로 림프절 내로 주사되는 경우, 각각 예를 들면, 곤충 타액의 상이한 항원 모듈 또는 유일한 에피토프의 모자이크-유사 작제물을 포함하는 단지 1, 2, 3 또는 4의 상기 본 발명에 따른 iMAT 분자는 질환에 걸린 대상자의 면역조절 및/또는 임상적 개선을 유도하는데 충분하다.

바람직한 양태에서, 단일 iMAT 분자가 사용되고, 말에서 곤충 물림 과민성(IBH), 두드러기 및/또는 말 재발성 기도 폐쇄(RAO)의 발병에서 치료학적 효과 유도 및/또는 예방에 충분하다.

또다른 바람직한 양태에서, 2, 3 또는 4의 iMAT 분자의 조합은 동시에, 순차적으로 및/또는 연대순으로 시차를 둔(chronologically staggered) 공-투여를 통해 사용된다.

바람직한 양태에서, 단일 iMAT 분자가 사용되고, 말에서 감염 질환, 예를 들면, 로도코쿠스 폐렴, 선역, 아프리카 마역, 웨스트 나일 바이러스 감염, 백선증 및/또는 소화관 또는 다른 기관의 기생충, 예를 들면, 와포자충증, 연충 및/또는 이의 잠복기의 치료학적 효과의 유도 및/또는 예방 및/또는 전염의 예방 및/또는 예를 들면, 흡혈 파리, 각다귀, 진드기 및/또는 모기에 의한 이러한 감염 질환 전염의 예방에 충분하다.

또다른 바람직한 양태에서, 2, 3 또는 4 iMAT 분자의 조합은 동시에, 순차적으로 및/또는 연대순으로 시차를 둔 공-투여를 통해 사용된다.

본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질의 열역학적 평가에 좌우되어, 안정성은 시스테인 돌연변이, 즉 상이한 아미노산 잔기(들)의 치환에 의해 영향을 받는다. 예를 들면, 치환은 Cys에서 Ser으로 치환일 수 있다. 그러나, 안정성은 목적하는 안정성 및 용해도를 성취하기 위해 Ser 아미노산 보다 상이한 아미노산 잔기를 사용하여 더 높을 수 있다. 즉, 제1 선택은 Cys의 Ser로의 치환일 수 있지만, 불안정성의 경우 Ser 이외의 다른 아미노산 잔기는 Cys를 대체하여야 한다.

표적화된 서열에서 시스테인 잔기에 대한 대체물로서 아미노산 잔기를 안정화시키는 선택을 위해 3개의 단계 접근법이 선택된다:

1. 말단 헥사히스티딘 tags, iMAT 서열 및 흥미로운 단백질의 일차 아미노산 서열을 포함하는 표적화된 단백질의 3차 구조의 모델링. 모델링은 비변성 서열으로 그리고 시스테인 치환으로 수행될 수 있다.

2. 단일 포인트 치환, 예를 들면, 시스테인 잔기의 상이한 아미노산 잔기, 예를 들면, Ser 및/또는 Ile로의 치환, 및 모든 이용가능한 3차원 구조를 분석하여 대체물의 안정화를 측정하기 위한 채점을 기초로 한 단백질 안정성의 반복 측정.

3. 안정화된 구조의 리모델링 및 단계 1 및 2를 반복하여 안정성의 입증

3-차원 단백질 구조는 분자 수준의 단백질 기능을 이해하는데 중요하고, 다수의 상이한 타입의 생물학적 실험, 예를 들면, 위치-지시된 돌연변이 유발의 합리적인 설계에서 매우 흥미롭다. 그러나, 구조적으로 특성규명된 단백질의 수는 공지된 단백질 서열의 수와 비교하여 적다. 제공된 단백질 서열(표적)에 대해 공지된 구조(템플릿)를 갖는 상동 단백질을 확인할 수 있다. 이러한 경우, 상동성 모델링은 이의 일차 아미노산 서열로부터의 단백질의 신뢰성 있는 3D 모델을 생성하는 선택 방법인 것으로 증명되었다. 상동성 모델을 구축하는 것은 4개의 주요 단계를 포함한다: (1) 구조적 템플릿(들)의 확인, (2) 표적 서열 및 템플릿 구조(들)의 정렬, (3) 모델 구축 및 (4) 모델 품질 평가. 이들 단계는 만족스러운 모델링 결과가 성취될 때까지 반복할 수 있다. 정확한 상동 모델이 결정될 수 없는 경우, 기본 구조(아미노산 서열)로부터 단백질 구조를 결정하는 계산 접근법이 사용된다. "드 노보(De novo)" 또는 "압 이니티오(ab initio)" 방법은 물리적 원리를 기초로 하고, 폴딩 처리를 모방하려고 시도한다. 이러한 방법은 다수의 입체구조를 샘플링하여야 하고, 자유 에너지의 전역 최소값에서 구조를 확인하는 매우 정확한 에너지 기능을 요구한다. 다수의 방법은 이들 기재된 원리의 조합을 사용한다.

단백질의 안정성에 대한 아미노산 치환의 영향의 합리적으로 정확한 추정을 생성하는 계산 수단의 유용성은 광범위한 적용에서 결정적인 중요성이 있다. 특히, 이러한 수단은 변형된 단백질의 생성에 특정된 단백질 조작 및 설계를 격려하고 뒷받침하는 잠재성을 갖는다.

단백질 안정성은 신속하게 가역적으로 언폴드하고 리폴드하는 단백질의 열역학적 안정성에 관하여 간주될 수 있다. 이들 경우에서, 단백질의 안정성은 폴딩 상태와 언폴딩 상태 사이의 깁스 자유 에너지의 차이이다. 안정성에 영향을 미치는 유일한 인자는 폴딩 상태와 언폴딩 상태의 상대적 자유 에너지이다. 폴딩 자유 에너지 차이가 더 크고 많은 양일 수록, 단백질이 변성에 대해 더 안정하다. 폴딩 자유 에너지 차이는 구상 단백질에 대한 5 내지 15 kcal/mol의 정도로 전형적으로 작다. 그러나, 반면에, 단백질 안정성은 혹독한 온도 또는 용매 조건을 견디는 단백질 특성으로서 간주될 수 있다. 이는 열역학적 안정성 뿐만 아니라 폴딩/언폴딩의 가역성 또는 비가역성(운동학적 안정성)에 관련된다.

단백질에서 단일 위치 치환에 의해 야기되는 열역학적 안정성 변화를 예측하기 위해, 수개의 상이한 접근법이 단백질 구조 및 기능에 미치는 이러한 치환의 영향을 연구하기 위해 적용될 수 있다[참조: Pires DE et al., Bioinformatics 2014, 30(3):335-342]. 이러한 접근법은 단백질 단독의 아미노산 서열로부터의 치환의 효과를 이해하기 위해 추구하는 방법 및 광범위한 구조적 정보를 활용하는 방법으로 광범위하게 분류될 수 있다. 구조-기초 접근법은 전형적으로 치환에 대한 단백질 안정성 변화의 지시 또는 실제 자유 에너지 값(ΔΔG)을 예측하기 위해 시도된다.

각 특이적 단백질에 대한 결과 및 이의 상응하는 모델은, 사용된 모델에서 발생 및 단백질 안정성 자유 에너지 변화(ΔΔG)에 기초하여 대체물을 등급화하는, 채점 시스템을 사용하여 특이적 치환의 출현 수에 관하여 통계적으로 분석하고, 이에 따라, 가장 불안정하게 만드는 잔기(만약에 있는 경우)를 인풋 구조 및 가능한 대체물 내에서 결정한다. 스코어를 각 모델에서 각 관심 위치에서 가장 낮은 ΔΔG(ΔΔG<0)를 측정하고, 각 잠재성 대체 위치에 대한 상응하는 선형 값 및 누적 ΔΔG 값을 배치하여 계산하고, 이어서, 결과를 모델 중에서 일관성(consistency)을 측정하여 평가한다. 계산된 단백질 모델은 상이한 품질(올바른 3-차원 구조를 예상할 확률)을 갖기 때문에, 가중치(weighting) 인자는 보다 정확한 모델로부터의 결과를 우선순위 매기기 위해 시행될 수 있다. 중요한(ΔΔG에 기초로 함) 불안정하게 만드는 잔기(만약에 있는 경우)는 치환되고; 새로운 모델은 생성되고, 정상 상태에 도달할 때까지 반복적으로 재분석된다. 추가로 생성된 모델은 주요한 성분 분석을 통해 xyz 좌표를 분석하여 특이적 위치에서 아미노산의 대체로 인한 잠재성 구조적 미스폴딩을 측정하기 위해 평가된다.

또한 추가의 측면에서, 본 발명의 근간을 이루는 목적은 놀랍게도 다음 단계를 포함하는 이러한 미리 결정된 아미노산 서열의 안정화를 가능하게 하는 미리 결정된 아미노산 서열에서 아미노산 치환을 확인하는 방법을 제공하여 해결하였다:

(i) 표적화된 미리 결정된 아미노산 서열의 3-차원/3차 구조의 모델링,

(ii) 단일 포인트 치환, 예를 들면, 시스테인 잔기의 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린 및/또는 이소류신 잔기로의 치환을 기초로 하는 단백질 안정성의 반복 측정, 및 모든 이용가능한 3-차원/3차 아미노산 서열 구조를 분석하여 치환 안정화를 측정하는 단백질 안정성 자유 에너지 변화(ΔΔG)를 기초로 하는 채점 시스템,

(iii) 정상 상태에 도달할 때까지 단계 (ii) 및 (iii)를 반복하여 치환된 3-차원/3차 아미노산 서열 구조의 리모델링 및 이의 안정성의 계산;

또한 추가의 측면에서, 본 발명의 근간을 이루는 목적은 놀랍게도 본원에 기재되고 청구된 (분리된) 재조합 단백질을 제공하여 해결되었고, 여기서, 이의 전체 또는 부분 아미노산 서열은 본원에 기재되고 청구된 미리 결정된 아미노산 서열에서 아미노산 치환을 동정하는 방법에 의해 안정화되었다(본원 실시예 5 참조).

도 1: 종, 알레르겐 및 유니프롯 등록 번호(데이타베이스 공개는 유닛프롯 공개 2013_09이다)를 확인하는 쿨리코이데스 속의 알레르겐의 예를 나타낸다.
도 2: 환원 조건하에 MAT-Fel d1(IVN201)의 SDS-PAGE를 나타낸다; A) 원래 SDS-PAGE(레인당 10μg 단백질, 쿠마시 염색) 및 B) 겔 A로부터 절단되고 SDS-PAGE 상에 재적재된 대역을 갖는 SDS-PAGE(은색 염색)
도 3: 환원 조건하에 Fel d1의 SDS-PAGE를 나타낸다; NuPAGE® 4-12% Bis-Tris Gel. 레인: 1) 마커: SeeBlue Plus2 예비-염색된 표준 2) 5μg Fel d1; 3) 5μg Fel d1
도 4: RP-HPLC 크로마토그램 0.1% TFA/아세토니트릴 구배를 나타낸다; a) 첨가제 없이 비변성 단백질(MAT-Fel d1)(왼쪽 그래프) ; b) 구아니디늄 클로라이드 플러스 DTT의 첨가에 의해 변성된 MAT-Fel d1(오른쪽 그래프)
도 5: MAT-Fel d1 분자 및 이의 카이트 둘리틀(Kyte Doolittle) 소수성 플롯을 도시한다.
도 6: NuPAGE® SDS-PAGE-시스템(4 내지 12% Bis-Tris Gels, 1x MES-실행 완충액, 35분, 200 V). 레인: 1) Lysozym, 1μg 단백질 ox. 2) PageRuler 예비염색된 단백질 래더(Ladder); 3) 요오드아세트아미드(ox.)로 산화된 MAT-Fel d1(5μg); 4) iMAT-Cul o4(ox.); 5) PageRuler 예비-염색된 단백질 래더; 6) 환원된 MAT-Fel d1 (5μg); 7) 환원된 iMAT-Cul o4; 8) 환원된 Lysozym.
도 7: RP-HPLC 크로마토그램 0.1% TFA/아세토니트릴 구배를 나타낸다. 피크는 첨가제 없는 비변성 (산화된) 단백질(iMAT-Cul o4)을 반영한다.
도 8: 측정된 민감화와 비교하여 선택된 쿨리코이데스 알레르겐의 국부 정렬 히트의 카운트를 표시하는 예를 도시한다(상세한 설명 참조). 당해 도는 IBH 말의 코호트에서 중증도(알레르겐 당 총 스코어 값)의 관점에서 HRT 시험에서 항원 예측(밝은 회색 및 오른쪽 Y-축) 및 결과(어두운 회색 및 왼쪽 Y-축) 간의 비교를 도시한다. 중증도는 시험에서 반응 정도를 반-정량적 스케일에서 기재한다(왼쪽 Y 축). 예측으로부터의 데이터는 가장 높은 중증도 스코어와 동일한 가장 높은 발생 스코어를 설정하여 스케일링된다.
도 9: 다음 실험 결과를 나타낸다: RT에서 30분 동안 인큐베이팅되면서 온화하게 혼합되는 단백질 및 Adju-Phos®. 인큐베이션 후, 샘플을 3분 동안 원심분리하고, 후속적으로 SDS-Page 레인으로 분석한다: 1) pageRuler 예비염색된 단백질 래더; 2) iMAT-Cul o3 상청액; 3) 우레아 중 iMAT-Cul o3 펠릿 4) iMAT-Cul o3 상청액 ; 5) 우레아 중 iMAT-Cul o3 펠릿; 6) 비어 있음; 7) iMAT-Cul o2 상청액 8) 우레아 중 iMAT-Cul o2 펠릿 9) iMAT-Cul o2 상청액 10) 우레아 중 iMAT-Cul o2 펠릿; 11) 비어 있음; 12) iMAT-Cul o4 상청액; 13) 우레아 중 iMAT-Cul o4 펠릿 14) iMAT-Cul o4 상청액; 15) 우레아 중 iMAT-Cul o4 펠릿; (2,3,7,8,12,13 w/o 동결 융해); (2회 동결 융해 처리 후 4,5, 9,10, 14,15)
도 10: 과민감화(polysensitized) 말(말 1)에서 5개 농도의 iMAT-Cul o2 및 iMAT-Cul o3 및 각 알레르겐의 히스타민 방출 시험(실시예 2에서 검정의 상세한 설명)을 나타낸다.
도 11: 각 융합 단백질의 일반 부분에서 iMAT 분자에 대한 MAT 분자의 카이트 앤드 돌리틀(Kyte-Doolittle) 소수성 플롯을 나타낸다[즉, 각 항원 모듈(들) 부재]. 소수성 지수는 X-축 상 아미노산 위치에 대해 Y-축 상에서 나타낸다. 지수에서 양의 수는 소수성을 나타낸다. MAT 분자와 비교하여 소수성 플롯의 시작에서 iMAT 분자의 그래프의 이동은 iMAT 분자에서 His-tag 및 하나의 메티오닌 잔기의 추가의 N-말단 존재 뿐만 아니라 임의의 스페이서 모듈(들)의 부재 때문이다.
도 12: 당해 도는 표준 데이타베이스에서 Cul o3(M4X062, 서열 번호 6)에 대해 13개의 아미노산 길이를 갖는 각각의 펩타이드에 대한 비-무작위 히트의 수 및 상응하는 전구체 단백질 내의 이의 위치를 나타낸다. y-축은 전구체 단백질와 관련하여 히트의 수를 도시하고, x-축은 아미노산 위치를 도시한다. 수직 점선은 시스테인 잔기를 나타내고, 쇄선은 비-무작위 발견된 상동성의 수의 이동 평균을 도시하고, 수평 실선은 인실리코 개열된 펩타이드에 상응한다.

실시예

다음 실시예는 추가로 본 발명을 예시하기 위해 수행되지만; 동일한 것이 본원에 개시된 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해되어서는 안된다.

실시예 1 - 면역을 위한 대리 마커 / 면역의 기간

말에 본원에 개시되거나 청구된 (분리된) 재조합 단백질의 투여는 항원 모듈에 존재하는 알레르겐 및/또는 에피토프에 대한 면역학적 반응을 제조한다. 추가로, C- 또는 N- 말단 tag 모듈은, 인접한 모듈로부터 인접한 아미노산 잔기와 함께, 표적 대상자에서 고유한 생성물-특이적 면역학적 신호(예를 들면, 항체- 또는 T-세포 반응)을 검출하기 위해 사용될 수 있고, 이는 면역에 대한 대리 마커 또는 면역의 기간으로서 사용될 수 있다. 이러한 대리 마커는, 치료-특이적 면역학적 파라미터로서, 면역 또는 면역 조절 또는 투여후 면역 기간 또는 면역 조절 기간을 평가할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 (분리된) 재조합 단백질에 의해 촉발된 면역 반응을 위한 특이적 지시자는 말단-tag(임의로 인접한 아미노산 잔기를 갖는) 특이적 항체, 예를 들면, IgG 항체의 도입이다. 대안적으로 또는 추가로, 지시자는 스페이서 및 본원에 기재되고 청구된 모듈 사이의 연결 또는 2개의 모듈 사이의 연결에 특이적인 항체의 도입이다.

실시예 2 - 저알레르기항원성

IBH를 앓는 말의 새롭게 빼낸 혈액을 본원에 개시되거나 청구된 (분리된) 재조합 단백질/iMAT 분자에 대한 호염기구 반응성을 시험하기 위해 제조할 수 있다. 이는 카울(Kaul)의 변형된 방법으로 측정될 수 있다[참조: Kaul, S., 1998. Type I allergies in the horse: Basic development of a histamine release test (HRT). Doctoral thesis. Veterinary School Hannover, Germany]. 간략하게, iMAT 분자 및/또는 재조합 알레르겐의 10-배 일련의 희석물(예를 들면, 10 nM 내지 0.001 nM 최종 알레르겐 농도의 범위)을 PIPES 완충액(AppliChem, Darmstadt, Germany), pH 7.4에서 제조한다. Na-EDTA 응고-저해된 혈액으로부터 입수된 세척된 적혈구 및 백혈구를 개별 희석물로 1시간 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 반응을 얼음 상 인큐베이션에 의해 20분 동안 정지시키고, 방출된 히스타민을 포함하는 상청액을 원심분리 후 각 샘플로부터 수집한다. 최대 히스타민 함량을 혈구를 10분 동안 수욕에서 비등시켜 수득한다(최대 방출). 세척된 혈구를 사용하는 완충액 방출 인큐베이션은 음성 대조군(자발적 방출)으로의 역할을 하였다. 히스타민 농도를 경쟁적 RIA(LDN Nordhorn, Germany)를 사용하여 제조자의 지시에 따라서 측정한다.

대안적으로, 또다른 호염기구 활성화 시험은 세포 항원 자극 시험 CAST® ELISA이고, 이는 또한 시험관내 알레르기 유발 시험으로서 고려될 수 있다. 이러한 검정을 제조자의 지시에 따라 수행한다[참조: Buhlmann Laboratories AG, Allschwil, Switzerland]. CAST®에서, 알레르기 대상자의 혈액으로부터 침전된 백혈구를 동시에 사이토킨 IL-3으로 프라이밍하고, iMAT 분자 및/또는 재조합 알레르겐으로 자극시킨다. 호염기구 세포는 특히 알레르기 매개체, 설파이도류코트리엔 LTC4, 및 이의 대사물질 LTD4 및 LTE4를 생성한다. 이들 신선하게 합성된 설파이도류코트리엔(sLT)은 후속적으로 ELISA 시험에서 측정된다(Enzyme Linked Immunosorbent Assay).

유해 사건(예를 들면, 아나필락시스를 유발하는데 이는 투여의 부작용으로)을 유도하는 iMAT 분자의 잠재성은 각 재조합 알레르겐 단독에 대한 iMAT 분자(알레르겐을 포함함)의 효과와 비교하여, 이들 검정으로 시험관내 평가될 수 있다.

재조합 알레르겐과 비교하여, 감소된 호염기구 탈과립, 예를 들면, iMAT 분자에 의한 히스타민 및/또는 설파이도류코트리엔 방출은 유해한 효과에 대한 낮은 잠재성, 즉, iMAT 분자의 우수한 안전성 프로파일을 지시한다.

상기 HRT(또는 CAST®)는 말에서 1형 알레르기 반응에 대한 시험관내 유발 시험으로서 사용될 수 있다. 알레르겐 특이적 히스타민 방출은 호염기 세포 활성화에 대한 각 알레르겐의 관련성을 지시하고, 이에 따라, 대상자의 알레르겐 특이적 민감화에 대한 정량적 파라미터로서 사용될 수 있다.

선행 기술에서 기술된 MAT 분자를 사용하여, 저알레르기항원성은 상응하는 비변성 알레르겐(Fel d1)과 비교하여 세포 항원 자극 시험(CAST) 검정에서 뿐만 아니라 피내 및 피부내 시험에서 입증될 수 있다[참조: Senti G et al., J Allergy Clin Immunol. 2012, 129(5): 1290-1296]. 알레르겐 및 Fel d1를 포함하는 MAT 분자 사이의 민감도의 정량적 차이는 각각 100-, 23- 및 16-폴드였다. MAT-Fel d1이 분명히 저알레르기성이지만, 몇몇 알레르기항원성이 남아있다.

본 발명에 대하여, 각각 항원 모듈에서 Cul o2 및 Cul o3을 포함하는 본 발명에 따라 제조된 2 iMAT 분자의 안전성을 시험하였다. IBH를 앓는 과민감화(poly-sensitized) 말의 새롭게 빼낸 혈액을 상기한 히스타민 방출 시험(HRT)에서 이용하였다.

도 10에 나타난 바와 같이, 비변성 알레르겐은 강한 히스타민 방출을 도출하는 반면, 놀랍게도 2개의 상이한 iMAT 분자(iMAT-Cul o3 및 iMAT-Cul o2)는 사실상 반응을 전혀 나타내지 않았다.

따라서, iMAT 분자는 선행 기술에 기재된 바와 같이 MAT 분자와 비교하여 안전성에 대해 명백한 우수성을 나타낸다(상기 참조).

IBH를 앓는 말이 상기 iMAT 분자로 치료되는 경우 어떠한 알레르겐 관련 유해한 반응도 일어나지 않는다는 것이 예상될 수 있다.

MAT 분자와 대조적으로 iMAT 분자의 이러한 놀라운 안전성 특성의 결론은 탈감작 단백질로서 사용된 iMAT 분자는 병원체에 대항하는 백신과 유사하게 사용할 수 있다. 전형적 치료학적 알레르겐과 같이 상위-투약(up-dosing)이 없는데, 이는 iMAT 분자를 포함하는 백신은 알레르기 유해 사건에 대해 알레르겐 특성을 나타내지 않기 때문이다. 이미 치료 과정에서 iMAT 분자의 제1 주사의 용량은 효능 고려사항 만을 기초로 하여 선택될 수 있고, 잠재성 알레르기 유해한 반응을 고려할 필요가 없다. 이는 선행 기술에서 기술된 MAT 분자를 사용하여 수행될 수 없는데, 이는 MAT의 알레르기항원성이, 비변성 알레르겐과 비교하여, 단지 특정 수준까지 감소되기 때문이다. 그러나, MAT 분자는 여전히 알레르겐이고; 대조적으로 iMAT 분자는 그렇지 않다. 이들 개선된 특성의 이점은, 예를 들면, 높은 생물의약적 함량(예를 들면, 3회 20μg 내지 50μg iMAT 단백질)을 갖는 3회의 피하 또는 림프내 주사로 보다 효과적인 치료 용법을 가능하게 한다.

시험되는 2개의 iMAT 분자의 알레르기항원성의 부족은 선행 기술에 기술된 MAT 분자와 대조적으로 어떠한 링커 아미노산 잔기[즉, 제1, 제2 및/또는 제3 모듈(들) 사이의 스페이서 모듈(들)]도 상기 iMAT 분자에서 상이한 모듈을 분리하는데 사용되지 않았다는 사실에 의해 설명될 수 있다. 펩타이드 또는 단백질 링커에 의해 연결된 2개 이상의 기능성 폴리펩타이드를 포함하는 조작된 융합 단백질이 단백질의 기능(예를 들면, 면역 시스템에 의한 에피토프 인식)에 있어서 중요하다는 것이 선행 기술에 공지되어 있다[참조: Klein JS et al., Protein Eng Des Sel. 2014, 27(10): 325-330]. 기능성 유닛 사이의 분리 거리는 에피토프 접근 및 항원항체결합력(avidity)을 갖는 결합 능력에 영향을 줄 수 있다. 모듈 사이, 특히 표적화 도메인 및 항원 모듈 사이의 결실 아미노산 잔기 링커가, 보다 강성(rigid) 구조를 야기하는 경우, 알레르겐 모듈의 입체형태적 에피토프는 올바르지 않은 폴딩 때문에 형성되지 않을 것이다. 이의 높은 친화도 수용체에 의해 호염기구(예를 들면, IgE)의 표면 상 결합된 항체의 가교결합은 활성화 및 히스타민 방출을 유도하는데 필요하다. 그러나, 미스폴딩된 알레르겐은 이러한 가교결합을 유도할 수 없다. 따라서, 링커 없는 iMAT 분자는 iMAT 분자를 비-알레르겐성이 되게 하는 입체형태적 IgE 에피토프를 형성할 수 없다.

실시예 3 - 알레르겐/바이오마커의 인실리코 검출

IBH에 대해 본 발명의 명세서에 상세하게 기재된 바와 같이, IBH를 유발하는 주요 알레르겐은 아직 기술되지 않았고 - IBH를 표적화하기 위한 iMAT 항원 모듈의 생물정보학 조작은 특정 알레르겐의 관련성을 인실리코 평가하기 위해 사용될 수 있다(본원의 실시예 6 참조). 예를 들면, 도 8에 나타낸 바와 같이, 인실리코 뿐만 아니라 Cul o3의 생체외 기능적 HRT 시험 결과는 Cul o3이 주요 알레르겐인 것을 나타내는 것으로 보인다. 대부분의 시험된 말은, 전부가 아니지만, Cul o3에 대항하여 명백한 과민성을 나타내었다.

이는 예를 들면, 반 데르 마이데(van der Meide) 등[참조: Vet J 2014, 200: 31-37]에 의한 다른 실험에서처럼, 상이한 재조합 알레르겐이 질환에 대한 이들 관련성에 구별될 수 없다는 점에서 놀라운 것이다: IBH를 앓는 말의 약 80% 내지 90%는 시험된 알레르겐 각각에 대한 민감화를 나타내었다.

따라서, 놀랍게도, 본 발명 중에서 Cul o3이 (i) 사실상 IBH에서 주요 알레르겐(즉, 동물의 > 50%이 민감화됨)이고, (ii) 다른 알레르겐에 비해 우세한 관련성이 있다는 것을 나타낼 수 있다.

iMAT 항원 모듈에서 사용되는 것을 제외하고는, 각 알레르겐은 또한 상기 알레르겐에 대항하는 과민성의 강도를 치료 개시 전에 조사하여 치료 성공을 최적화하는 역할을 할 수 있다. 그리고 치료 과정 내내, 면역 시스템의 상이한 성분의 알레르겐 특이적 조절은 감시될 수 있고, 예를 들면, 알레르겐 특이적 IgE의 변화 및 IgG 항체 역가는 치료 및/또는 예방 효과를 지시할 수 있다.

따라서, 인실리코 검출된 알레르겐 및/또는 각 알레르겐-특이적 면역글로불린은 진단적 및/또는 치료진단(theranostic) 바이오마커로서 사용될 수 있다.

실시예 4 말에서 IBH의 치료학적 백신/예방

단일 iMAT 분자 또는 본 발명에 따른 상이한 항원 모듈을 포함하는 iMAT 분자의 조합은 IBH를 유도하는 곤충 물림을 앓거나 위험에 처한 말을 예방적으로 또는 치료학적으로 치료하는데 사용될 수 있다. 말에서, 본 발명에 따른 iMAT 분자 턱밑 림프절 내로 투여될 수 있다[참조: Landholt et al., Vet Rec 2010, 167: 302-304]. 간략하게, 림프절 위의 털을 ?F게 깍고, 시술적으로 준비한다. 촉진 및/또는 초음파를 가이드를 위해 사용하여 25 G 니들을 림프절 내로 삽입한다. 주사된 iMAT 분자는 보조제로 흡수된다. 보조제는 예를 들면, 알루미늄 포스페이트(Adju-Phos®, Brenntag Biosector, Denmark)로 이루어진다. iMAT 분자 스톡은 바이알 중 375μg/mL 단백질 농도의 냉동된 용액이고, 각각 사용 전에 해동되어 500μL를 포함한다.

iMAT 분자 용액을 해동한 후, 400μL의 용액을, 예를 들면, 200μL의 알루미늄 포스페이트 겔 현탁액과 혼합한다. 이러한 최종 제형은 Adju-Phos®에 대해 iMAT 분자를 흡수시킬 수 있도록 림프내 주사 전에 실온에서 60분 동안 유지된다. 예를 들면, 50μg iMAT 분자를 포함하는 200μL의 혼합물을 림프절 주사를 위해 500μL 시린지로 제거한다. 이러한 제조물은 먼저 전형적으로 0일, 28일 및 56일에 주사 및 iMAT 분자 당 20μg 내지 50μg의 용량(하나 이상의 항원 모듈 단독 중량을 언급함)으로 투여된다.

치료 기간 내내 및/또는 이후에 IBH의 치료 또는 예방의 효능은 피부 병소(예를 들면, 손살된 털(broken hairs), 탈모, 딱딱한/문지른(scrubs) 및 젖은 부위)의 임상적으로 정량적, 반-정량적 또는 정성적 평가에 의해 조사될 수 있다. 문지름(scrubbing)/가려움의 강도는 채점될 수 있다.

이들 임상적 파라미터는 이전 IBH 계절의 개체 말의 임상적 징후 및/또는 치료학적 개입의 시작 이전 중증도와 비교될 수 있다. 대안적으로, 치료되지 않거나 위약 치료된 IBH 발병된 말의 비교는 IBH의 임상적 징후의 iMAT 분자-매개된 치료 및/또는 예방의 효능을 입증할 수 있다.

상기 말의 신선혈(Fresh blood)을 말에서 1형 알레르기 반응을 위한 시험관내 유발 시험에서 예를 들면, HRT 또는 CAST®를 사용하여 사용하였다(상세한 설명을 위해 사익 실시예 3을 참조함). 특정 쿨리코이데스 알레르겐, 예를 들면, 히스타민 및/또는 설파이도류코트리엔 방출을 갖는 예방접종(challenge)에 대한 반응에서 감소된 호염기구 탈과립은 이전과 비교하여 iMAT 분자 투여 후 치료 및/또는 예방 효과를 지시한다.

대안적으로 또는 추가로 특정 쿨리코이데스 알레르겐을 사용한 피내 유발 시험[참조: Langner et al., Vet Immunol Immunopathol 2008, 122(1-2):126-37]은 상기 말에서 사용될 수 있다. 감소된 반응(즉시 및/또는 후기 반응성)은 iMAT 분자 투여의 치료 및/또는 예방 효과를 나타낸다.

추가로, 면역 시스템의 상이한 성분의 조절은 감시될 수 있고, 예를 들면, 알레르겐 특이적 IgE 및 IgG 항체 역가의 변화는 치료 및/또는 예방 효과를 나타낼 수 있다.

IgE 수준의 변화를 제외하고는, 알레르겐-특이적 IgG의 증가는 놀랍게도 말을 IBH에 대해 상기 iMAT 분자를 사용하여 치료하는 경우 발견될 수 있다. 이들 항체는 생체내 IgE-매개된 아나필락시스를 차단할 수 있고, 호염기구 및 비만 세포로부터의 염증 매개체의 알레르겐-유래된 방출을 저해할 뿐만 아니라 T 세포에 대한 IgE-매개된 알레르겐 제시를 저해하는 것 같다. 특히 알레르겐에 결합하는 iMAT-유래된 IgG 항체 중에서, 몇몇 알레르겐-특이적 서브타입은 중요한 "보호" 역할을 하는 것으로 제시되었는데, 이는 이들이 알레르겐-특이적 IgE 항체와 경쟁하고, IgE-매개된 항원 제시를 저해하여 CD4⁺ T 세포의 활성화를 방지할 수 있기 때문이다. 추가로, 분비된 IgG 서브세트는 비만 세포 및 호산구의 중요한 감소를 촉진하고, 염증 매개체의 감소된 방출을 동반한다[참조: Senna G et al., Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2011, 11(4): 375-380].

혈청 "차단" IgG 활성의 기능적 검정은 FcεRI-의존성 호염기구 히스타민 방출의 억제[참조: Niederberger V et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2004, 101: 14677-14682] 및/또는 IgE-알레르겐 복합체의 B 세포로의 FcεRII (CD23)-의존성 결합의 저해에 의해 측정되고 개체 임상적 반응의 우수한 예측을 제공하는 것 같다[참조: Wacholz PA et al., J Allergy Clin Immunol 2003; 112: 915-922].

알레르겐-특이적 면역요법은 면역 시스템의 상이한 성분을 조절할 수 있다. 세포 변형은 알레르겐-특이적 T 세포에서 말초 관용의 유도를 지시하는 알레르겐-유래된 T-세포 증식의 감소, 및 증가된 IFN-γ 생성을 갖는 Th1 반응을 위한 항원-특이적 Th2-우세한 면역 반응의 감소로 이루어진다[참조: Durham SR et al., J Allergy Clin Immunol 1996, 97: 1356-1365]. 이러한 면역학적 전환(switch)을 조정하는 역할을 하는 주요한 세포 타입은 이질적(heterogeneous) T-세포 집단이고, 조절 T 세포(T_reg)로 지칭된다. 세포 수준에서, 성공적인 알레르겐 면역요법을 위한 중요한 인자는 1형 T_reg 세포의 말초 유도이다. 항원 인지에서 특이적인 1형 T_reg 세포에 대한 기능적 연구는, 1형 T_reg 세포에 의한 Th1 및 Th2 반응의 조절이 대부분 사이토킨 IL-10의 분비에 좌우되고, 이는 면역억제 특성을 갖는다는 것을 나타내었다. 사실상, IL-10은 특이적 알레르겐에 대항하는 말초 T 세포의 증식 반응을 저해하고, T-세포 무반응(anergy)의 유도에서 중요한 역할을 한다[참조: James LK, Durham SR, Clin Exp Allergy 2008, 38: 1074-1088]. 시험관내, IL-10은 조절 인자 FoxP3의 발현을 향상시키고, 호산구 기능을 조절하고, 비만 세포에 의해 방출된 염증촉진 매개체를 감소시킨다[참조: Mobs C, et al., Int Arch Allergy Immunol 2008, 147: 171-178].

상기 iMAT 분자-매개된 면역요법의 중요한 임상적 효능의 또다른 가능한 마커는 알레르겐-특이적 T 세포의 수 및 특성의 변화의 검출이다. 예를 들면, Bet v1 테트라머 염색 연구를 기초로 하여, 순환하는 자작나무 화분-특이적 CD4⁺ T 세포의 수준 및 특성은 잠재적으로 SIT 전후와 비교할 수 있다[참조: van Overtvelt L et.al., J Immunol 2008, 180: 4514-4522]. 최근, 변형하는 성장 인자(TGF)-β는 또한 성공적인 SIT에서 주요한 사이토킨으로서 확인되었다. 다수의 작용은 이의 관련성, 예를 들면, 특이적 Th1, Th2 및 Th17 세포의 억제, FoxP3의 유도 및 Tregs의 억제 기능을 설명할 수 있다. 추가로, TGF-β는 랑게르한스 세포에서 FcεRI 발현을 하향조절하고, IgE 합성을 억제한다[참조: Akdis CA, Akdis MJ, Allergy Clin Immunol 2009, 123: 735-746].

실시예 5 - WO 2004/035793(US 상응 US 2005/0281816)에 따른 선행 기술 MAT 분자와 본 발명에 따른 iMAT 분자의 비교

MAT 단백질의 순도의 평가를 위해, 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기이동(SDS-PAGE) 시험 절차를 확립하였다[참조: Thompson J et al.,J Biol Chem 2002, 277: 34310-34331]. 환원제, 리튬 도데실설페이트(LDS)를 사용하고 75℃에서 가열한 샘플 제조를 포함하는 방법은 전기영동 분리 후 재생가능한 다중 날카로운 대역을 야기하였다. 쿠마시 블루를 사용한 염색은 200 내지 1000ng 단백질로 적재된 겔에서 선형 정량적(밀도측정) 특성을 제공한다. 알레르겐 모듈(MAT-Fel d1)로서 Fel d 1를 사용하여 MAT 분자에서 알레르겐 모듈을 검출하는 모노클로날 항체를 사용하여, 주요 대역 및 13 작은 대역 모두 MAT-Fel d1 단백질을 포함하는 것을 나타났다. 소 대역은 또한 겔 상 재적재 후 동일한 위치에서 원래 겔 상에서처럼 이동한다(도 2). PAGE 이전 샘플 제조를 위한 수개의 상이한 방법, 예를 들면, 상이한 온도 및 완충액 조성물 프로토콜은 동일한 대역 패턴을 생성하였다.

이들 대역 모두에서, 전체 길이(완전한) MAT-Fel d1 단백질 및 단지 미량의 숙주 세포 단백질의 존재는 이후에 각 밴드가 겔에서 제외되고, 트립센에 의해 소화되고, 후속적으로 질량 분광계(nanoLC/ESI-MS)로 분석되어서 입증될 수 있다. 이들 실험으로부터, 예를 들면, SDS-PAGE에서 MAT-Fel d1의 상이한 폴딩 변이의 이례적인 특성(겔 이동)을 결론내릴 수 있다. 이는 분석된 제조물에서 MAT-Fel d1이 적합한 생물의약적 분자로서, 특히 임상적 및/또는 시판 생물의약적 제조를 위해 적합하지 않음을 의미하는데, 이는 이의 순도가 표준 방법(예를 들면, SDS-PAGE)으로 뿐만 아니라 상기 설명된 변형된 절차로 측정될 수 없기 때문이다.

MAT-Fel d1 분자의 이러한 겔 이동 현상과 대조적으로, 이와 같은 Fel d1은 SDS PAGE에서 이러한 이례적인 특성을 나타내지 않는다(도 3, 레인 2 및 3). Fel d1은 예상된 분자량(19,6 kD)에서 단일 분명한 대역을 나타낸다.

추가의 이례적인 특성은 RP-HPLC 분석에서 관찰될 수 있다. MAT-Fel d1의 어떠한 단일 피크도 이 분석 방법에서, 단백질의 비변성 입체구조 또는 무질서 및 환원 조건에 의해 유도된 변성 형성에서도, 나타나지 않았다(도 4). 그러나, GMP 인증된 생물의약적 제조를 위해 생체분자의 단일 이소형이 시판 약제학적 제제에서 의무적이다.

SDS-PAGE 및 RP-HPLC 분석에서 이러한 관찰은 아미노산 서열에 기초한 물리화학적 특성에 의해 설명될 수 있다. 카이트 앤드 돌리틀 소수성 프롯(Kyte & Doolittle hydrophobicity plot)에서의 분석[참조: Kyte J, Doolittle RF, Journal of Molecular Biology 1982, 157(1), 105-132]은 인접한 극단 소수성 및 친수성 도메인(도 5)을 나타내었고, 이는 이러한 이례적인 거동에 원인일 수 있다.

특히 융합 단백질의 표적화 도메인의 소수성 영역은 막 단백질의 경막 분절과 유사하고, 이는 이러한 이례적인 특성을 야기하는 것으로 당해 기술 분야에 공지되어 있다[참조: Rath A et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009, 106(6): 1760-1765].

화학식의 분자량과 상관관계가 없는 SDS-PAGE 상의 이동은, "겔 이동"으로 언급되고, 막 단백질에서 공통적인 것으로 나타난다. 이는 이들의 비변성 2D- 또는 3D-구조에 독립적으로 단지 이들의 분자량에 따른 분자의 분리인 SDS-PAGE 방법의 전제 조건이 이러한 경우에 적용되지 않음을 의미한다. 상기 인용된 작업(PNAS article)에서, 저자는, 질환-표현형 잔기 치환을 포함하는, 사람 낭성 섬유증 경막 전도 조절제(CFTR)의 경막 분절 3 및 4로부터 유래된 야생형 및 돌연변이 나선-고리-나선("헤어핀") 서열의 라이브러리를 사용하는 나선 막 단백질의 이례적인 겔 이동을 조사한다. 저자는 이들 헤어핀이 이들의 SDS-PAGE 상 실제 화학식의 분자량에 대해 마이너스 10% 내지 플러스 30%의 속도로 이동하고, 3.4 내지 10g SDS/g 단백질 범위 비에서 세제(detergent)를 적제한다는 것을 발견하였다. 저자는 추가로 돌연변이 겔 이동이 강력하게 헤어핀 SDS 적재 용량의 변화와 그리고 헤어핀 헬리시티과 상호관련된다는 것을 입증하였고, 이는 겔 이동 거동이 변경된 세제 결합에 기인한다는 것을 나타낸다. 몇몇의 경우에, SDS에 의한 이러한 상이한 용매화는 단백질-세제 접촉이 단백질-단백질 접촉으로 대체될 수 있고, 이는 세제 결합 및 폴딩이 친밀하게 연결된다는 것을 의미한다.

MAT 및 iMAT 단백질의 SDS PAGE(도 6) 뿐만 아니라 RP-HPLC 분석(도 4 및 7)은 이동 패턴 또는 용리 각각에서 실질적 차이를 나타내었다. MAT-Fel d1의 산화된 형태는 SDS-PAGE 겔(레인 3)에서 단일 날카로운 대역이 아니라 MAT-Fel d1의 실제 32.2 kD 보다 더 크거나 작은 분명한 분자량을 갖는 수개의 확산 대역을 나타내었다. iMAT-Cul o4와 대조적으로 단일 날카로운 대역(M=41.6 kD)을 산화된 조건하에서 나타내었다. 또한 RP-HPLC 크로마토그램은 단일 피크를 나타내었다(도 7).

환원 조건하에서 SDS-PAGE에서 MAT-Fel d1은 대략적으로 공지된 분자량에서 이동하는 주요 대역을 나타내지만, MAT-Fel d1의 완전한 서열을 포함하는 것으로 공지된 도 2에 기재된 추가의 수개의 작은 대역이 다시 나타난다(도 6, 레인 6). 이는 특성(attribute)이며, 이는 MAT-Fel d1의 이례적인 특징을 특성규명한다. 추가적으로, 환원 조건하의 MAT-Fel d1의 RP-HPLC 크로마토그램(도 4, 오른쪽 그래프)은 MAT-Fel d1의 적어도 3개의 상이한 이소형을 나타낸다. 대조적으로 iMAT 분자는 SDS-PAGE(도 6, 레인 7)에서 뿐만 아니라 RP-HPLC (도 7)에서 단일 이소타입을 분명히 지시하는 특성을 나타낸다.

환원 조건은 MAT 분자에서 디설파이드 브릿지의 개열을 야기하고, 이에 따라, MAT 및 iMAT 분자는, 디설파이드 브릿지가 단독으로 MAT의 이례적인 특징에 원인이 되는 경우, 환원 조건에서와 같이 거동하여야 한다. 그러나, 이는 상기한 케이스가 아닌데, 이는 이례적인 겔 이동 및 MAT 분자의 RP-HPLC에서 이소형의 발생이 여전히 환원 조건하에 나타나기 때문이다.

그러나, iMAT 분자는 이러한 겔 이동을 나타내지 않고, 단백질의 비변성 (산화된) 형태에서 RP-HPLC 크로마토그램에서 피크를 나타낸다. 추가로 MAT 및 iMAT 분자의 카이트 앤드 돌리틀 플롯[참조: Kyte, J. and Doolittle, R. 1982. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 157: 105-132]은 His-tag, TAT 및 표적화 도메인의 서열을 커버하는 N-말단에서 거의 동일하다(도 11). 결과적으로, 당해 기술 분야의 숙련가에게 선행 기술의 단점을 극복하기 위해 다른 아미노산 잔기로 치환된 시스테인 잔기를 사용한 선행 기술에 따른 MAT 분자를 작제하는데 동기부여하지 못할 것이다.

3개의 수득된 iMAT 분자는 하기 실시예 6에 따라서 "생물정보학 조작" 절차에 의해 작제되고, 이. 콜리에서의 재조합 발현 기술에 의해 제조되었다. 모든 3개의 iMAT 분자는 2회 냉동 및 해동 후 완충액(20 mM 시트레이트, 1 M 아르기닌, pH 6.0)에서 안정하였고, 보조제로서 Adju-Phos®(Brenntag, Denmark)에 흡수될 수 있었고, 이에 따라, iMAT 분자는 백신으로서 사용될 수 있다. 단백질은 동일한 완충액 시스템에서 분해 없이 Adju-Phos®로부터 탈착될 수 있다(도 9).

실시예 6 - 말에서 IBH를 표적화하기 위한 iMAT 분자의 "생물정보학 조작"

iMAT 기술을 효과적으로 사용하여, 예를 들면, 알레르기 곤충 물림 과민성(IBH)을 갖는 말을 치료하기 위해, 다음이 추가로 의무적이다:

a) iMAT 분자에서 알레르겐 모듈로서 쿨리코이데스 단백질을 선택하는데, 이는 주요 알레르겐이고, 이에 따라, 발병된 말에서 과민성을 야기하는 높은 유병률을 갖고, 따라서 또한 관용 유도를 위한 표적일 수 있고,

b) iMAT 분자를 상기 주요 알레르겐으로 작제하는데, 이는 열역학적으로 안정하고, 단백질 조작에 의해 효율적으로 제조될 수 있고, 추가로 충분한 양의 품질(즉, 확인, 순도 및 잠재성)을 보장하는 표준 방법으로 분석될 수 있다.

이들 요구사항을 실행하기 위해, 생물정보학 접근법이 본 발명에 따른 iMAT 분자에 포함되는 알레르겐을 선택하기 위해 선택되었다. 선택의 목적은 (i) IBH에서 관련성이 있는 것으로 예측되는 하나 이상의 알레르겐(즉, IBH를 앓는 대부분의 말이 각 알레르겐에 민감화됨)을 선택하는 것이고, (ii) 알레르겐 특성의 선형 에피토프를 포함할, 즉, 공개된 알레르겐에서와 동일한 짧은 펩타이드 서열(7 내지 13 아미노산 잔기)의 고위수를 포함할 가능성이 가장 높은 알레르겐을 선택하는 것이다.

현재 대상자, 예를 들면, 말에서 잠재적으로 알레르기를 도출할 수 있는, 타액에서 발견되는 쿨리코이데스(쿨리코이데스 소노렌시스(Culicoides sonorensis), 쿨리코이데스 누베쿨로수스(Culicoides nubeculosus), 쿨리코이데스 오브솔레투스(Culicoides obsoletus))로부터의 대략적으로 230개 단백질이 공지되어 있다. 약제학적 제제를 위한 적합한 항원을 선택하기 위해, 공지된 비-쿨리코이데스 알레르겐에 대한 국부 서열 정렬을 기초로 한 상동성 비교가 선택되었다. 종종 항체 인식을 위한 에피토프(대부분 입체형태적 에피토프) 검출은 기능적 분석(예를 들면, 펩타이드 마이크로어레이)에 의해 성취되고 또는 T-세포 에피토프(선형 에피토프)에 대해서는 MHC 분자에 대한 펩타이드 결합 가능성을 계산하여 성취된다. iMAT 기술의 치료학적 원리는 그 중에서도 엔도솜에서 산-의존성 프로테아제에 의한, 이어서, MHC II형 결합 및 항원 제시에 의한, 세포내이입 및 분해를 기초로 한다. 말에서, 이러한 시스템의 특성은 현재 완전히 탐구되지 않았는데, 그 이유는 말 MHC 유전자의 대립유전자 다양성이 사람 시스템과 비교하여 훨씬 더 적게 조사되고, 이에 따라, 실험적으로 용이하게 이용가능하지 않기 때문이다. 추가로 I형 알레르기로서 IBH 및 증상을 유발하는 원인 알레르겐에 대한 연구는 단지 최근에 시작되었다. 효과기 세포(즉, 호염기구 과립구)에서 활성인 알레르겐으로서 특성규명되는 제1 단백질은 2008년까지는 기술되지 않았다[참조: Langner et al., Vet Immunol Immunopathol 2008, 122(1-2):126-137].

따라서, 상이한 - 비 실험적인 그러나 생물정보학 - 알레르겐 선택에 대한 접근법이 선택되었고, 이는 공지된 비-쿨리코이데스 알레르겐 단백질에 이르는 대한 쿨리코이데스 단백질로부터 유래된 펩타이드의 국부 상동성 조사를 기초로 하고, 이들 대부분은 사람에서 알레르기를 일으키는 것으로 공지되어 있다. 알레르겐 특성을 갖는 것으로 의심되는 단백질의 아미노산 서열은 공개적으로 이용가능한 데이타베이스(예를 들면, 유니프롯)로부터 보내고, 중복(redundancies)을 서열 상동성의 분석으로 보낸 데이터 세트 내에서 결정하였다. 높은 상동 서열 카운터파트를 제거하고, 서열의 수득한 나머지는 후속적인 분석을 위해 가능한 유용한 항원의 표준 서열 데이타베이스로서 역할을 하였다. 추정되는 높은 알레르겐 잠재성을 갖는 쿨리코이데스 단백질을 측정하기 위해, 단백질을 6 내지 15개의 아미노산의 길이를 갖는 펩타이드로 하나의 아미노산 이동으로 인실리코 개열하였다. 다음에 각각의 쿨리코이데스 단백질의 국부-짝 정렬 및 표준 서열 데이타베이스에 상응하는 펩타이드를 수행하였다. 이후에, 수득된 정렬 히트의 스케일링을 이에 따른 상응하는 펩타이드의 하나 및 정렬 히트에 대한 제공된 쿨리코이데스 단백질의 자가-정렬 스코어를 설정하여 수행하였다. 다음에 제공된 역치를 넘어서는 정렬 히트의 수를 각각의 펩타이드에 대해 계수하고, 공지되지 않은 알레르겐 특성을 사용하여 단백질 서열의 무작위로 생성된 데이타베이스로 국부-짝 정렬로 비교하고, 후속적으로 스케일링하고 계수하였다. 수득한 "비 알레르기 단백질" 계수를 알레르겐 결과의 것에서 빼고, 모든 상응하는 펩타이드의 히트(hits) 수에 기초한 각 쿨리코이데스 단백질에 대한 누적 히트 스코어를 계산하였다(도 12). 가장 높은 계수를 갖는 단백질이 iMAT 항원 모듈 후보로서 선택되었다.

생물정보학 항원 선택 방법의 입증을 위해, 임상적으로 진단된 IBH를 앓는 13마리의 말에서 5개의 쿨리코이데스 알레르겐에 대항하는 민감화 발생을 측정하였다. 모든 선택된 항원을 혈액 샘플로부터 분리된 말 호염기구로부터의 알레르겐 특이적 히스타민 방출을 기초로 하여 반-정량적 기능적 생체외 실험에서 시험하였다(히스타민 방출 시험 = HRT, 검정에 대한 상세한 설명: 실시예 2 참조). 재조합 알레르겐을 3개 농도에서 시험하고, 각 알레르겐에 대한 스코어 값은 0(민감화 없음) 내지 6(최대 민감화) 사이에 범위였다. 모든 13마리의 말로부터의 데이터를 생물정보학 계산의 결과와 비교하였다(도 8). 이러한 분석은 민감화(코호트의 알레르겐 당 총 스코어 값)와 예측 스코어 사이에 우수한 전체 상관관계(r=0.97)를 나타낸다. 이러한 상관관계 분석으로부터 본 발명자들은 생물정보학 항원 선택 방법이 iMAT 분자에서 항원 모듈에 대한 관련 쿨리코이데스 알레르겐을 선택하는데 적합하다고 결론지었다. 따라서, IBH 발병된 말을, 질환 대상자의 하위그룹의 대부분에서 높은 확률로 이들 알레르겐에 대한 관용을 유도하기 위해, 선택된 알레르겐을 포함하는 본 발명에 따른 iMAT 분자로 치료할 수 있다.

3개의 알레르겐은 3개의 상이한 iMAT 분자, 즉, Cul o3, Cul o2 및 Cul o4에 포함된 생물정보학 분석을 기초로 하여 선택되었다.

선택된 알레르겐 각각은 항원 모듈로서 개별적인 iMAT 분자로 통합되고, 후속적으로 3-차원 단백질 구조의 반복 모델링에 의해 열역학적 안정성 및 단일 아미노산의 치환 후 자유 에너지 변화의 계산을 위해 최적화되었다. 물리화학적 특성 및 안정성은 일차 아미노산 서열 내의 상이한 아미노산 잔기(들)을 치환함에 의해 영향을 받는다.

본원에 기재된 분석(항원 조사 및 모델링)의 결론으로서, 예를 들면, IBH를 치료하기 위해 말에서 약리학적 제조 및 적용에 적합한 iMAT 아미노산 서열로 변형시켰다.

실시예 7 - 본 발명에 따른 모자이크-유사 iMAT 분자의 작제

하나 초과의 알레르겐의 성분이 항원 모듈 내로 포함되는 경우, 본 발명에 따른 iMAT 분자는 추가로 개선될 수 있다는 것이 예상된다. 이러한 목적을 위해, 상이한 방식으로 상기한 생물정보학 선택 접근법(실시예 6)의 기본 원리를 적용할 수 있다. 알레르겐 데이터 베이스에서 발견되는 알레르겐 펩타이드의 히트 계수를 기초로 하는 완전한 알레르겐을 선택하는 대신에, 이러한 알레르겐 수개의 단지 매우 풍부한 펩타이드를 사용하여 iMAT 항원 모듈을 조작한다. 따라서, 이러한 iMAT 분자는 수개의 알레르겐으로부터 생겨난 펩타이드의 항원 모듈로 이루어진다. 이는 이의 표적화된 알레르기 프로파일에 대하여 단일 iMAT 분자의 범위를 광범위하게 하고, 이에 따라, 약리학적 약물 개발에 유리하다.

모자이크-유사 iMAT 단백질 230을 정성화하는 짧은 펩타이드 서열을 발견하기 위해, 이러한 타액에서 발견된 쿨리코이데스 종(쿨리코이데스 소노렌시스(Culicoides sonorensis), 쿨리코이데스 누베쿨로수스(Culicoides nubeculosus), 쿨리코이데스 오브솔레투스(Culicoides obsoletus))으로부터의 단백질을 상기된 상동성 비교에 의해 분석하였다(실시예 6 참조). 간략하게 6-15 아미노산 잔기의 펩타이드 길이를 갖는 인실리코 개열된 쿨리코이데스 단백질은 알레르겐-관련된 단백질의 표준 서열 데이타베이스 및 비-알레르기-관련된 단백질의 무작위 데이타베이스로 국부로 정렬되었다. 표준 데이타베이스 내에 발견되는 각각의 펩타이드에 대해 중요한 상동성의 차이의 수를 결정하였다. 후속적으로, 각각의 펩타이드는 거짓 양의 히트를 감소시키기 위해 무작위 데이타베이스를 삼중으로 표준 데이타베이스의 크기로 국부적으로 정렬하였다. 각각의 펩타이드 길이에 대한 남아있는 상동성의 상부(예를 들면, 10번째 백분위수)는 iMAT 분자를 포함하는 모자이크-유사 또는 하이브리드 알레르겐의 작제를 위한 염기로서 수행되는데 특히 적합하다. 모자이크-유사 iMAT 분자를 작제하기 위해 단백질 전구체를 (예를 들면 상위 랭킹 펩타이드에 상응하는 전구체 단백질의 열거로부터) 상위 랭킹 펩타이드를 매립하기 위한 스캐폴드 단백질로서 선택한다. 신호 펩타이드 서열은 스캐폴드 단백질로부터 제거되고, 추가의 인접한 N- 또는 C-말단 아미노산을 갖는 상위 랭킹 펩타이드는 스캐폴드 단백질의 원래 서열 내에 삽입될 수 있거나, 스캐폴드 단백질의 원래 서열의 부분을 대체할 수 있다. 삽입 또는 대체를 위한 위치는 상응하는 전구체 단백질에서 유사한 정렬 또는 펩타이드의 참조 위치를 사용하여 결정한다. 다음 단계로서, His-Tag, TAT 및 표적화 도메인을 첨가한다. 최종적으로 시스테인 잔기는 상기한 잔기를 가장 안정화시킴에 의해 대체된다.

이러한 접근법의 예시적인 예에서, 쿨리코이데스 소노렌시스(유니프롯 데이타베이스 등재 "Q66U13")의 타액 단백질은 스캐폴드 단백질로서 사용되었다. 단백질 내에 대부분 알레르겐 구조는 서열의 이러한 부분을 보존하기 위해 결정되었다. 신호 펩타이드 서열은 제거되고, 후속적으로 유니프롯 데이타베이스 등재 "Q5QBI9", "Q5QBK6", "Q5QBL6", "Q5QBJ4" 및 "Q5QBI2"로부터의 서열이 추가된다. 나중에, 모자이크-유사 알레르겐은 iMAT 일반적 분자 구조 내로 통합된다. 최종적으로, 시스테인 잔기는 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신 및/또는 아스파르트산으로 대체되고, 이는 작제된 iMAT 분자(융합 단백질)의 안정성을 폄하하지 않는다.

서열 번호 17은 본 발명에 따른 예시적인 모자이크-유사(하이브리드) iMAT 분자의 전체 서열을 도시한다[아미노산 잔기 1: N-말단 메티오닌, 아미노산 잔기 2-7: His-tag, 아미노산 잔기 8-18: TAT 서열, 아미노산 잔기 19-128: 표적화 도메인, 아미노산 잔기 129-333: 하이브리드 알레르겐(스캐폴드 단백질 Q66U13 신호 펩타이드 없음 및 삽입된/대체된 서열; 삽입된/대체된 서열: 아미노산 잔기 137-151: Q5QBI9; 아미노산 잔기 155-166: Q66U13; 아미노산 잔기 185-200: Q5QBK6; 아미노산 잔기 215-229: Q5QBL6: 아미노산 잔기 235-250; Q5QBL6; 아미노산 잔기 265-278: Q5QBJ4; 아미노산 잔기 318-333: Q5QBI2; 치환된 시스테인(세린): 46, 146, 158, 173, 222, 225, 246, 273, 283, 329; 치환된 시스테인(류신): 295; 치환된 시스테인(이소류신): 299; 치환된 시스테인(아스파르트산): 181].

실시예 8 - 말에서 재발성 기도 폐쇄(RAO)의 치료학적 백신 / 예방

본 발명에 따른 상이한 항원 모듈을 포함하는 단일 iMAT 분자 또는 iMAT 분자의 조합은 RAO 및/또는 여름 목초지 관련 RAO를 앓고 있거나 이에 걸릴 위험이 있는 말의 예방적 또는 치료학적 치료를 위해 사용할 수 있다. 말에서 본 발명에 따른 iMAT 분자는 실시예 4에 기재된 바와 같이 투여될 수 있다.

RAO의 공지된 병력을 갖는 성체 말이 사용될 수 있다. 치료 전에, 말은, 호흡유량계 측정, 예를 들면, BAL 유체에서 호중구의 퍼센트의 분석을 위한 상기도 내시경 및 기관지폐포 세척(BAL)을 포함하는 완전한 신체적 기도 검사를 가능하게 하기 위해, 예를 들면, 얼굴-마스크를 쓴 가축으로 있도록(stand in stocks) 컨디셔닝한다. 전혈구 측정(Complete blood count) 및 생화학 프로파일을 수행하여 수반되는 의학적 상태의 존재를 배제한다.

하기 파라미터를 호흡기계를 조사하기 위해 그리고 iMAT 분자를 사용한 치료학적 및/또는 예방적 치료의 효능을 측정하기 위해 조사할 수 있다: 폐 기능 변수의 변화, 예를 들면, 호흡률, 최대 경폐압, 폐 저항, 폐 탄력. 추가로, 파라미터는 가중된(weighted) 임상적 채점 시스템으로 도입하여, 예를 들면, 또한 호흡 운동(breathing effort)/복부 들어올릭, 비루 및/또는 벌렁임, 기침 및/또는 비정상적인 폐, 기관지 및/또는 기관음의 임상적 스코어를 평가할 수 있다.

따라서, 치료 기간 내내 및/또는 이후에 RAO의 치료 또는 예방의 효능은 정량적, 반-정량적 또는 정성적 평가에 의해 임상적으로 조사될 수 있다.

이들 임상적 파라미터는 개체 말의 이전 계절의 임상적 징후와 및/또는 치료학적 개입의 시작 전에 중증도와 비교될 수 있다. 대안적으로, 위약으로 치료되지 않거나 치료된 RAO 발병된 말과 비교하여 RAO의 임상적 징후의 iMAT 분자-매개된 치료 및/또는 예방의 효능을 입증할 수 있다.

상기 말의 기관지폐포 세척(BAL) 유체 및/또는 신선혈은, 예를 들면, HRT 또는 CAST®을 사용한 말에서 1형 알레르기 반응을 위한 시험관내 유발 시험에서 사용될 수 있다. (상세한 내용은 실시예 2 및/또는 문헌을 참조한다[참조: Hare et al Can J Vet Res 1998; 62: 133-139]). 특정 알레르겐, 예를 들면, 히스타민 및/또는 설파이도류코트리엔 방출을 갖는 예방접종에 대한 반응에서 감소된 폐 비만 세포 및/또는 호염기구 탈과립은 이전과 비교하여 iMAT 분자 치료 후에 치료 및/또는 예방 효과를 지시한다.

대안적으로 또는 추가로, 특정 재조합 알레르겐을 사용하여 피내 유발 시험, 피부 단자 시험 또는 또한 BAL 유체 또는 혈청 중 알레르겐 특이적 IgE 및/또는 IgG 측정을 상기 말에서 감시할 수 있다[참조: Tilley P et al., J Equine Vet Sci 2012, 32: 719-727]. 감소된 반응(즉시 및/또는 후기 반응성) 및/또는 항체 역가의 변화는 iMAT 분자 치료의 치료 및/또는 예방 효과를 지시한다.

참조문헌

서열 목록에서:

서열 번호 1은, 여전히 기능적이고, 즉, 세포 진입을 효과적으로 촉진할 수 있는, 본 발명에 따른 하나의 전위 모듈에 대한 적합한 최소의 아미노산 서열에 관한 것이고;

서열 번호 2는 전체 말 불변 쇄 아미노산 서열에 관한 것이고;

서열 번호 3은 전체 Cul n4 알레르겐 아미노산 서열에 관한 것이고;

서열 번호 4는 전체 Cul o1 알레르겐 아미노산 서열에 관한 것이고;

서열 번호 5는 전체 Cul o2 알레르겐 아미노산 서열에 관한 것이고;

서열 번호 6은 전체 Cul o3 알레르겐 아미노산 서열에 관한 것이고;

서열 번호 7은 본 발명에 따른 Cul n4 iMAT 분자에 관한 것이고;

서열 번호 8은 본 발명에 따른 Cul n4 iMAT 분자에 관한 것이고;

서열 번호 9는 본 발명에 따른 Cul o1 iMAT 분자에 관한 것이고;

서열 번호 10은 본 발명에 따른 Cul o1 iMAT 분자에 관한 것이고;

서열 번호 11은 본 발명에 따른 Cul o2 iMAT 분자에 관한 것이고;

서열 번호 12는 본 발명에 따른 Cul o2 iMAT 분자에 관한 것이고;

서열 번호 13은 본 발명에 따른 Cul o3 iMAT 분자에 관한 것이고;

서열 번호 14는 본 발명에 따른 Cul o3 iMAT 분자에 관한 것이고;

서열 번호 15는 유지된 세포내 운반 기능을 갖는 말 불변 쇄 아미노산 서열의 특이적 단편에 관한 것이고;

서열 번호 16은 유지된 세포내 운반 기능을 갖는 말 불변 쇄 아미노산 서열의 특이적 단편에 관한 것이고;

서열 번호 17은 본 발명에 따른 예시적인 모자이크-유사 iMAT 분자의 전체 서열에 관한 것이고;

서열 번호 18은 전체 Cul o4 알레르겐 아미노산 서열에 관한 것이고;

서열 번호 19는 전체 Cul o7 알레르겐 아미노산 서열에 관한 것이고;

서열 번호 20은 본 발명에 따른 Cul o4 iMAT 분자에 관한 것이고;

서열 번호 21은 본 발명에 따른 Cul o4 iMAT 분자에 관한 것이고;

서열 번호 22는 본 발명에 따른 Cul o7 iMAT 분자에 관한 것이고;

서열 번호 23은 본 발명에 따른 Cul o7 iMAT 분자에 관한 것이다.

본원에 인용된 모든 선행 기술 참조 뿐만 아니라 본 출원에 수반되는 서열 목록은 이로써 이의 전문이 참조로서 서로 독립적으로 포함된다.

항목:

1. 세포외 공간에서 세포의 내부로 재조합 단백질이 운반되도록 하는 적어도 하나의 제1 모듈, 재조합 단백질이 세포내에서 항원의 처리 또는 항원의 MHC 분자로의 적재에 관여하는 소기관으로 운반되도록 하는 적어도 하나의 제2 모듈, 및 개체에서 재조합 단백질에 의해 조절된 면역 반응의 특이성을 측정하는 적어도 하나의 항원 모듈을 포함하는 분리된 재조합 단백질로서, 이에 의해 이들 모듈은 서로 공유 결합되고, 임의로 상기 모듈 중 적어도 하나 사이에 스페이서 모듈을 포함하고, 여기서,

a.) 제1 모듈은 세포외 공간에서 세포의 내부로 전위되게 하는 아미노산 서열이고,

b.) 제2 모듈은 세포내 재조합 단백질이 항원의 처리 또는 항원의 MHC 분자로의 적재에 관여하는 소기관으로 종 특이 표적화되도록 하는 아미노산 서열이고,

c.) 항원 모듈은 알레르겐인 항원의 적어도 하나의 에피토프로부터 유래된 아미노산 서열이고,

이에 의해 적어도 항원 모듈에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 상기 분리된 재조합 단백질에서 세린 또는 상이한 아미노산 잔기로 치환된다.

2. 항목 1에 따른 분리된 재조합 단백질로서, 여기서, 상기 항원 모듈에서 또는 전체 분리된 재조합 단백질에서, 모든 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기로 치환된다.

3. 항목 1 또는 2에 따른 분리된 재조합 단백질로서, 여기서, 시스테인 잔기는 세린 잔기로 치환된다.

4. 항목 1 또는 2에 따른 분리된 재조합 단백질로서, 여기서, 제2 모듈은 서열 번호 2, 15, 및 16의 아미노산 서열과 같은 말 불변 쇄이고/이거나, 항원 모듈은 말에서 알레르기를 유발하는 알레르겐으로부터 유래된 에피토프를 포함한다.

5. 항목 1 또는 2에 따른 분리된 재조합 단백질로서, 여기서, 항원 모듈은 흡혈 곤충으로부터, 특히 쿨리코이데스 아속으로부터 유래된 알레르겐의 적어도 하나의 에피토프를 포함한다.

6. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 분리된 재조합 단백질로서, 여기서, 알레르겐은 Cul n 4, Cul o 1, Cul o 2 또는 Cul o 3 알레르겐 중 적어도 하나이다.

7. His-tag와 같은 tag 모듈을 포함하는 선행 항목 중 어느 하나에 따른 재조합 단백질로서, 이에 의해 상기 tag 모듈은 N-말단 및/또는 C-말단에 존재할 수 있다.

8. 선행 항목 중 어느 하나에 따른 분리된 재조합 단백질로서, 여기서, 제1 모듈은 전위를 위한 모듈로서 기능하는 HIV-tat, VP22 또는 안테나페디아 또는 이의 부분 서열이다.

9. 단량체 형태로 존재하는 선행 항목 중 어느 하나에 따른 분리된 재조합 단백질.

10. 선형으로 존재하는 선행 항목 중 어느 하나에 따른 분리된 재조합 단백질.

11. 서열 번호 7 내지 14의 서열 중 어느 하나를 포함하거나 이들로서 이루어지는 선행 항목 중 어느 하나에 따른 분리된 재조합 단백질.

12. 약제학적 조성물에서 사용하기 위한 선행 항목 중 어느 하나에 따른 분리된 재조합 단백질.

13. 항목 12에 따른 용도를 위한 분리된 권장(recommend) 단백질로서, 이에 의해 상기 약제학적 조성물은 백신이다.

14. 설하 투여, 피하 또는 피내 주사, 림프절 내로의 주사를 위해 설계된 또는 점막을 통한, 특히 위장관 또는 호흡기계의 점막을 통한 투여를 위해 설계된 항목 12 내지 13 중 어느 하나에 따른 용도를 위한 분리된 재조합 단백질.

15. 항목 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 분리된 재조합 단백질을 암호화하는 핵산.

16. 항목 15에 따른 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 벡터.

17. 항목 15에 주장된 적어도 하나의 벡터 또는 항목 15에 따른 핵산을 포함하는 일차 세포 또는 세포주.

18.

i. 표적화된 단백질의 3차 구조를 모델링하는 단계;

ii. 시스테인의 상이한 아미노산 잔기로의 치환과 같은 단일 포인트 치환을 기준으로 하여, 단백질 안정성을 반복 측정하고, 모든 이용가능한 3차원 구조를 분석하여 대체(replacement) 안정화를 측정하여 채점하는 단계;

iii. 단계 a.) 및 b.)를 반복하여 신규한 구조를 리모델링하고 안정성을 입증하는 단계

를 포함하는 상기 미리 결정된 아미노산 서열을 안정화되게 하는 미리 결정된 아미노산 서열에서 아미노산 치환을 동정하기 위한 방법.

19. 항목 18에 따른 방법으로서, 여기서, 단계 b.)에서, 폴딩 자유 에너지 변화를 추정한다.

20. 항목 18 또는 19에 따른 방법으로서, 여기서, 단계 b.)에서, 사용된 모델에서 발생에 기초한 대체를 등급화하는 채점 시스템을 사용하는 특정한 치환의 출현 횟수 및 단백질 안정성 자유 에너지 변화, ΔΔG.

21. 항목 18 내지 20 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득된 항목 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 재조합 단백질.

22. 말 동물에서 곤충 물림 과민성의 예방 및/또는 치료를 위한 항목 1 내지 14 중 어느 하나에 따른 재조합 단백질.

SEQUENCE LISTING <110> BOEHRINGER INGELHEIM VETMEDICA GMBH <120> IMPROVED MODULAR ANTIGEN TRANSPORTATION MOLECULES AND USES THEROF <130> P01-3045 PCT+FF <150> EP14162575.6 <151> 2014-03-31 <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 1 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 208 <212> PRT <213> equus caballus <400> 2 Met Glu Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Val Pro Ile 1 5 10 15 Leu Gly Gln Arg Pro Ala Ala Pro Glu Arg Lys Cys Ser Arg Gly Ala 20 25 30 Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Val Leu Val Ala Leu Leu Leu Ala Gly Gln 35 40 45 Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Phe Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys 50 55 60 Leu Thr Val Thr Ala Gln Asn Leu Gln Leu Glu Lys Leu Arg Met Lys 65 70 75 80 Leu Pro Lys Ser Ala Lys Pro Val Ser Lys Ile Arg Val Ala Thr Pro 85 90 95 Met Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Glu Gly Leu Ser His Gly Pro Met 100 105 110 Gln Asn Ala Thr Lys Tyr Gly Asn Thr Thr Gln Asp His Val Met His 115 120 125 Leu Leu Leu Arg Ala Asp Pro Leu Lys Val Tyr Pro Gln Leu Lys Gly 130 135 140 Ser Phe Gln Glu Asn Leu Lys His Leu Lys Ser Thr Met Asp Gly Leu 145 150 155 160 Asp Trp Lys Val Phe Glu Asn Trp Met His Gln Trp Leu Leu Phe Glu 165 170 175 Met Ser Arg Asn Ser Leu Glu Glu Lys Pro Thr Gln Gly Pro Thr Lys 180 185 190 Glu Pro Leu Glu Ile Glu Asp Leu Ser Ser Gly Val Gly Met Ala Lys 195 200 205 <210> 3 <211> 152 <212> PRT <213> Culicoides spec. <400> 3 Met Lys Phe Pro Thr Phe Leu Ile Leu Ala Phe Phe Leu Ser Leu Tyr 1 5 10 15 Ile Ser Ser Thr Ala Ser Arg Arg Lys His Phe Arg His Leu Lys Arg 20 25 30 Ile Glu Ala Ala Asn Asp Cys Pro Ala Lys Asn Ser Gly Thr Tyr Gln 35 40 45 Lys Val Cys Lys Gln Leu Gln Lys Tyr Tyr Val Leu Thr Pro Asp Asp 50 55 60 Lys Leu Gly Ser Tyr Leu Lys Gly Gly Leu Gln Glu Ala Ala Asn Arg 65 70 75 80 Val Leu Thr Pro Val Ser Lys Ser Asp Lys Ile Thr Phe Asp Ile Val 85 90 95 Gln Asn Cys Leu Lys Asn Phe Gln Val Met Val Asn Lys His Asn Lys 100 105 110 Glu Ala Leu Arg Lys Tyr Arg Glu Cys Lys Lys Glu Cys Phe Thr 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100 105 110 <210> 16 <211> 110 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 16 Met Glu Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Val Pro Ile 1 5 10 15 Leu Gly Gln Arg Pro Ala Ala Pro Glu Arg Lys Ser Ser Arg Gly Ala 20 25 30 Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Val Leu Val Ala Leu Leu Leu Ala Gly Gln 35 40 45 Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Phe Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys 50 55 60 Leu Thr Val Thr Ala Gln Asn Leu Gln Leu Glu Lys Leu Arg Met Lys 65 70 75 80 Leu Pro Lys Ser Ala Lys Pro Val Ser Lys Ile Arg Val Ala Thr Pro 85 90 95 Met Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Glu Gly Leu Ser His Gly 100 105 110 <210> 17 <211> 333 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 17 Met His His His His His His Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg 1 5 10 15 Arg Arg Met Glu Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Val 20 25 30 Pro Ile Leu Gly Gln Arg Pro Ala Ala Pro Glu Arg Lys Ser Ser Arg 35 40 45 Gly Ala Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Val Leu Val Ala Leu Leu Leu Ala 50 55 60 Gly Gln Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Phe Gln Gln Gln Gly Arg Leu 65 70 75 80 Asp Lys Leu Thr Val Thr Ala Gln Asn Leu Gln Leu Glu Lys Leu Arg 85 90 95 Met Lys Leu Pro Lys Ser Ala Lys Pro Val Ser Lys Ile Arg Val Ala 100 105 110 Thr Pro Met Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Glu Gly Leu Ser His Gly 115 120 125 Ala Arg Val Lys Lys Asn Asp Pro Leu Pro Gly Ala Thr Val Gly Gly 130 135 140 Tyr Ser Gly Gly Asp Leu Val Ser Glu Arg Ala Ser Val Ser Val Lys 145 150 155 160 Lys Gly Gly Tyr Lys Tyr Asn Ala Gln Ala Asn Arg Ser Val Tyr Asp 165 170 175 Ser Arg Asn Phe Asp Pro Gly Lys Glu Phe Leu Lys Leu Val Leu Tyr 180 185 190 Phe Lys Ser Lys Asp Phe Lys Asn Arg Lys Trp Asp Glu Arg Glu Lys 195 200 205 Asn Asn Lys Asn Met Asp Pro Val Lys Asn Gln Ala Gln Ser Gly Ser 210 215 220 Ser Trp Ala Phe Ala Pro Val Pro Ser Arg Ser Tyr Thr Leu Ala Glu 225 230 235 240 Gln Glu Leu Val Asp Ser Glu Thr Thr Ser Ile Lys Gly Leu Lys Met 245 250 255 Ser Ala Arg Arg Ser Leu Asn Pro Arg Leu Gly Phe Arg Gly Gly Trp 260 265 270 Ser Thr Thr Gly Asn Thr Leu Ser Asn Val Ser Leu Gly Arg Asn Arg 275 280 285 Phe Ser Ser Gln Asp Glu Leu Ile His Val Ile Val Trp Asn Lys Gly 290 295 300 Ser Gly Arg Val Arg His Val Ala Arg Ala Glu Asn Ala Ala Glu Asn 305 310 315 320 Lys Ile Lys Ala Ala Gly Gly Ala Ser Val Leu Arg Ala 325 330 <210> 18 <211> 273 <212> PRT <213> Culicoides spec. <400> 18 Met Asn Ile Lys Ser Thr Ile Ile Val Ile Ala Ile Ile Ser Ala Val 1 5 10 15 Tyr Ala Ala Asp His Gln Ser Gln Lys Ala Val Ala Val Pro Ser Tyr 20 25 30 Thr Tyr Arg Arg Pro Ser Thr Lys Ile Ile Gly Gly Ala Pro Ala Phe 35 40 45 Ser His Gln Phe Pro Trp Gln Ala Ser Ile Thr Val Thr Ala Cys Ser 50 55 60 Gly Asp Trp Cys Ser Leu Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Arg Lys His 65 70 75 80 Val Leu Thr Ala Ala His Cys Thr Lys Gly Leu Ser Ser Phe Thr Ile 85 90 95 Gly Leu Gly Ser Asn Thr Arg Asn Arg Pro Ala Val Thr Val Val Ala 100 105 110 Lys Ser Lys Thr Glu His Pro Lys Tyr Asn Pro Glu Ser Leu Ala Asn 115 120 125 Asp Val Ser Ile Ile Thr Leu Ser Leu Asn Val Asn Leu Asn Asn Asn 130 135 140 Ile Lys Val Ile Ser Leu Ala Asn Ser Gly Ile Gly Thr Leu Val Asn 145 150 155 160 Arg Asn Ala Phe Val Ser Gly Tyr Gly Lys Thr Ser Ser Ser Ser Glu 165 170 175 Gly Ser Asn Thr Leu Asn Tyr Leu Ser Met Arg Leu Ile Ser Asn Ser 180 185 190 Asp Cys Tyr Lys Val Phe Gly Pro Gln Ile Tyr Ser Thr Thr Leu Cys 195 200 205 Ala Val Ala Arg Ser Ser Val His Lys Asn Val Cys Ser Gly Asp Ser 210 215 220 Gly Gly Pro Leu Val Ile Lys Arg Asn Gly Asn Tyr Val Gln Val Gly 225 230 235 240 Ile Val Ser Phe Val Ala Lys Val Gly Cys Asp Ala Gly Phe Pro Ser 245 250 255 Gly Tyr Ala Arg Val Ser Ser Phe Arg Asn Trp Ile Thr Gln Asn Met 260 265 270 Asn <210> 19 <211> 159 <212> PRT <213> Culicoides spec. <400> 19 Met Lys Phe Ser Val Ser Lys Leu Ser Leu Leu Leu Cys Ile Thr Ile 1 5 10 15 Leu Cys Ile Cys Phe Ala Thr Ala Ala Pro Gln Trp Gln Ile Ser Glu 20 25 30 Leu Ser Glu Gln Ser Asn Val Ile Lys Cys Ser Asn Glu Asn Asn Phe 35 40 45 Gly Ile Tyr Lys Glu Leu Cys Gln Phe Leu Lys Lys Ile Tyr Ile Lys 50 55 60 Ala Pro Asp Glu Asp Leu Gly Ser Tyr Leu Arg Gly Gly Leu Gln Ser 65 70 75 80 Ala Ala Asn Arg Leu Leu Asp Pro Thr Val Thr Leu Pro Lys Asn Thr 85 90 95 Leu Lys Asn Val Glu Asp Cys Met Lys Asn Phe Gln Ala Val Ile Asn 100 105 110 Glu Tyr Asn Val Val Ala Leu Lys Lys Tyr Gln Glu Cys Asp Gly Gln 115 120 125 Cys Ala Lys Gln Ala Gly Gln Leu Phe Glu Asn Asp Ala Ser Lys Thr 130 135 140 Ala Gly Arg Met Gly Asp Cys Ile Val Ser Leu Ala Ala Leu His 145 150 155 <210> 20 <211> 383 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 20 Met His His His His His His Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg 1 5 10 15 Arg Arg Met Glu Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Val 20 25 30 Pro Ile Leu Gly Gln Arg Pro Ala Ala Pro Glu Arg Lys Ser Ser Arg 35 40 45 Gly Ala Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Val Leu Val Ala Leu Leu Leu Ala 50 55 60 Gly Gln Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Phe Gln Gln Gln Gly Arg Leu 65 70 75 80 Asp Lys Leu Thr Val Thr Ala Gln Asn Leu Gln Leu Glu Lys Leu Arg 85 90 95 Met Lys Leu Pro Lys Ser Ala Lys Pro Val Ser Lys Ile Arg Val Ala 100 105 110 Thr Pro Met Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Glu Gly Leu Ser His Gly 115 120 125 Ala Asp His Gln Ser Gln Lys Ala Val Ala Val Pro Ser Tyr Thr Tyr 130 135 140 Arg Arg Pro Ser Thr Lys Ile Ile Gly Gly Ala Pro Ala Phe Ser His 145 150 155 160 Gln Phe Pro Trp Gln Ala Ser Ile Thr Val Thr Ala Ser Ser Gly Asp 165 170 175 Trp Ser Ser Leu Ser Gly Gly Ser Leu Ile Ser Arg Lys His Val Leu 180 185 190 Thr Ala Ala His Ser Thr Lys Gly Leu Ser Ser Phe Thr Ile Gly Leu 195 200 205 Gly Ser Asn Thr Arg Asn Arg Pro Ala Val Thr Val Val Ala Lys Ser 210 215 220 Lys Thr Glu His Pro Lys Tyr Asn Pro Glu Ser Leu Ala Asn Asp Val 225 230 235 240 Ser Ile Ile Thr Leu Ser Leu Asn Val Asn Leu Asn Asn Asn Ile Lys 245 250 255 Val Ile Ser Leu Ala Asn Ser Gly Ile Gly Thr Leu Val Asn Arg Asn 260 265 270 Ala Phe Val Ser Gly Tyr Gly Lys Thr Ser Ser Ser Ser Glu Gly Ser 275 280 285 Asn Thr Leu Asn Tyr Leu Ser Met Arg Leu Ile Ser Asn Ser Asp Ser 290 295 300 Tyr Lys Val Phe Gly Pro Gln Ile Tyr Ser Thr Thr Leu Ser Ala Val 305 310 315 320 Ala Arg Ser Ser Val His Lys Asn Val Ser Ser Gly Asp Ser Gly Gly 325 330 335 Pro Leu Val Ile Lys Arg Asn Gly Asn Tyr Val Gln Val Gly Ile Val 340 345 350 Ser Phe Val Ala Lys Val Gly Ser Asp Ala Gly Phe Pro Ser Gly Tyr 355 360 365 Ala Arg Val Ser Ser Phe Arg Asn Trp Ile Thr Gln Asn Met Asn 370 375 380 <210> 21 <211> 383 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 21 Met Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Glu Asp Gln 1 5 10 15 Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Val Pro Ile Leu Gly Gln Arg 20 25 30 Pro Ala Ala Pro Glu Arg Lys Ser Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Thr Gly 35 40 45 Phe Ser Val Leu Val Ala Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala Thr Thr Ala 50 55 60 Tyr Phe Leu Phe Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Leu Thr Val Thr 65 70 75 80 Ala Gln Asn Leu Gln Leu Glu Lys Leu Arg Met Lys Leu Pro Lys Ser 85 90 95 Ala Lys Pro Val Ser Lys Ile Arg Val Ala Thr Pro Met Leu Met Gln 100 105 110 Ala Leu Pro Met Glu Gly Leu Ser His Gly Ala Asp His Gln Ser Gln 115 120 125 Lys Ala Val Ala Val Pro Ser Tyr Thr Tyr Arg Arg Pro Ser Thr Lys 130 135 140 Ile Ile Gly Gly Ala Pro Ala Phe Ser His Gln Phe Pro Trp Gln Ala 145 150 155 160 Ser Ile Thr Val Thr Ala Ser Ser Gly Asp Trp Ser Ser Leu Ser Gly 165 170 175 Gly Ser Leu Ile Ser Arg Lys His Val Leu Thr Ala Ala His Ser Thr 180 185 190 Lys Gly Leu Ser Ser Phe Thr Ile Gly Leu Gly Ser Asn Thr Arg Asn 195 200 205 Arg Pro Ala Val Thr Val Val Ala Lys Ser Lys Thr Glu His Pro Lys 210 215 220 Tyr Asn Pro Glu Ser Leu Ala Asn Asp Val Ser Ile Ile Thr Leu Ser 225 230 235 240 Leu Asn Val Asn Leu Asn Asn Asn Ile Lys Val Ile Ser Leu Ala Asn 245 250 255 Ser Gly Ile Gly Thr Leu Val Asn Arg Asn Ala Phe Val Ser Gly Tyr 260 265 270 Gly Lys Thr Ser Ser Ser Ser Glu Gly Ser Asn Thr Leu Asn Tyr Leu 275 280 285 Ser Met Arg Leu Ile Ser Asn Ser Asp Ser Tyr Lys Val Phe Gly Pro 290 295 300 Gln Ile Tyr Ser Thr Thr Leu Ser Ala Val Ala Arg Ser Ser Val His 305 310 315 320 Lys Asn Val Ser Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Ile Lys Arg 325 330 335 Asn Gly Asn Tyr Val Gln Val Gly Ile Val Ser Phe Val Ala Lys Val 340 345 350 Gly Ser Asp Ala Gly Phe Pro Ser Gly Tyr Ala Arg Val Ser Ser Phe 355 360 365 Arg Asn Trp Ile Thr Gln Asn Met Asn His His His His His His 370 375 380 <210> 22 <211> 263 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 22 Met His His His His His His Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg 1 5 10 15 Arg Arg Met Glu Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Val 20 25 30 Pro Ile Leu Gly Gln Arg Pro Ala Ala Pro Glu Arg Lys Ser Ser Arg 35 40 45 Gly Ala Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Val Leu Val Ala Leu Leu Leu Ala 50 55 60 Gly Gln Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Phe Gln Gln Gln Gly Arg Leu 65 70 75 80 Asp Lys Leu Thr Val Thr Ala Gln Asn Leu Gln Leu Glu Lys Leu Arg 85 90 95 Met Lys Leu Pro Lys Ser Ala Lys Pro Val Ser Lys Ile Arg Val Ala 100 105 110 Thr Pro Met Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Glu Gly Leu Ser His Gly 115 120 125 Ala Pro Gln Trp Gln Ile Ser Glu Leu Ser Glu Gln Ser Asn Val Ile 130 135 140 Lys Ser Ser Asn Glu Asn Asn Phe Gly Ile Tyr Lys Glu Leu Ser Gln 145 150 155 160 Phe Leu Lys Lys Ile Tyr Ile Lys Ala Pro Asp Glu Asp Leu Gly Ser 165 170 175 Tyr Leu Arg Gly Gly Leu Gln Ser Ala Ala Asn Arg Leu Leu Asp Pro 180 185 190 Thr Val Thr Leu Pro Lys Asn Thr Leu Lys Asn Val Glu Asp Ser Met 195 200 205 Lys Asn Phe Gln Ala Val Ile Asn Glu Tyr Asn Val Val Ala Leu Lys 210 215 220 Lys Tyr Gln Glu Ser Asp Gly Gln Ser Ala Lys Gln Ala Gly Gln Leu 225 230 235 240 Phe Glu Asn Asp Ala Ser Lys Thr Ala Gly Arg Met Gly Asp Ser Ile 245 250 255 Val Ser Leu Ala Ala Leu His 260 <210> 23 <211> 263 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 23 Met Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Glu Asp Gln 1 5 10 15 Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Val Pro Ile Leu Gly Gln Arg 20 25 30 Pro Ala Ala Pro Glu Arg Lys Ser Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Thr Gly 35 40 45 Phe Ser Val Leu Val Ala Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala Thr Thr Ala 50 55 60 Tyr Phe Leu Phe Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Leu Thr Val Thr 65 70 75 80 Ala Gln Asn Leu Gln Leu Glu Lys Leu Arg Met Lys Leu Pro Lys Ser 85 90 95 Ala Lys Pro Val Ser Lys Ile Arg Val Ala Thr Pro Met Leu Met Gln 100 105 110 Ala Leu Pro Met Glu Gly Leu Ser His Gly Ala Pro Gln Trp Gln Ile 115 120 125 Ser Glu Leu Ser Glu Gln Ser Asn Val Ile Lys Ser Ser Asn Glu Asn 130 135 140 Asn Phe Gly Ile Tyr Lys Glu Leu Ser Gln Phe Leu Lys Lys Ile Tyr 145 150 155 160 Ile Lys Ala Pro Asp Glu Asp Leu Gly Ser Tyr Leu Arg Gly Gly Leu 165 170 175 Gln Ser Ala Ala Asn Arg Leu Leu Asp Pro Thr Val Thr Leu Pro Lys 180 185 190 Asn Thr Leu Lys Asn Val Glu Asp Ser Met Lys Asn Phe Gln Ala Val 195 200 205 Ile Asn Glu Tyr Asn Val Val Ala Leu Lys Lys Tyr Gln Glu Ser Asp 210 215 220 Gly Gln Ser Ala Lys Gln Ala Gly Gln Leu Phe Glu Asn Asp Ala Ser 225 230 235 240 Lys Thr Ala Gly Arg Met Gly Asp Ser Ile Val Ser Leu Ala Ala Leu 245 250 255 His His His His His His His 260

Claims (18)

1. (i) 개선된 MAT(iMAT) 분자가 세포외 공간에서 세포의 내부로 전위(translocation)되도록 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제1 모듈,
   (ii) iMAT 분자가, 항원의 처리 및/또는 항원, 바람직하게는 처리된 항원의 MHC 분자로의 적재에 관여하는 세포 소기관으로 종-특이적 세포내 표적화되게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제2 모듈, 및
   (iii) 적어도 하나의 항원, 바람직하게는 적어도 하나의 알레르겐의 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프로부터 유래된 아미노산 서열인 항원 모듈로서, 상기 iMAT 분자에 의해 조절되는 면역 반응의 특이성을 결정하는 적어도 하나의 제3 모듈
   을 포함하는, 개선된 MAT(iMAT) 분자로서,
   적어도 상기 항원 모듈(들)에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기가 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신 및/또는 아스파르트산으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 개선된 MAT(iMAT) 분자.
2. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항원 모듈에서, 모든 시스테인 잔기가 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신 및/또는 아스파르트산으로 치환되고, 바람직하게는 상기 전체 iMAT 분자에서, 모든 시스테인 잔기가 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신 및/또는 아스파르트산으로 치환되는, iMAT 분자.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 모듈 전부가 2개 이상의 인접한 모듈 사이에, 임의로 상기 제1, 제2 및/또는 제3 모듈 전부 사이에, 임의로 추가의 스페이서(spacer) 모듈(들)에 의해 서로 공유 결합되는, iMAT 분자.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 모듈 전부가 서로 공유 결합되고, 상기 제1, 제2 및/또는 제3 모듈 중 2개 이상의 인접한 모듈 사이에 어떠한 추가의 스페이서 모듈(들)도 존재하지 않는, iMAT 분자.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제2 모듈이 말(equine) 불변 쇄를 포함하고, 바람직하게는 서열 번호 2, 15, 및 16의 아미노산 서열 중 하나 이상으로 이루어지는, iMAT 분자.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항원 모듈이 말에서 알레르기를 유발하는 적어도 하나의 알레르겐으로부터 유래된 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프, 바람직하게는 흡혈 곤충으로부터, 보다 바람직하게는 쿨리코이데스 속(genus culicoides)으로부터 유래된 적어도 하나의 알레르겐의 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프, 및/또는 곰팡이(진균류 및/또는 이들의 포자), 화분, 집먼지 또는 사료 진드기(forage mites)(및/또는 이들의 배설물), 보다 바람직하게는 나무, 잔디, 풀, 돼지풀(ambrosia)로부터의 화분 및/또는 십자화과(brassicaceae) 화분 및/또는 아스페르길루스(aspergillus), 알테르나리아(alternaria), 보트리티스(botrytis), 세르코르포라(cercospora), 클라도스포리움(cladosporium), 쿠르불라리아(curvularia), 드레크슬레라(drechslera), 유로티움(eurotium), 헬민토스포리움(helminthosporium), 에피코쿰(epicoccum), 에리시페/오이디움(erysiphe/oidium), 푸사리움(fusarium), 리치테이미아(lichtheimia), 니그로스포라(nigrospora), 페니실리움(penicillium), 페리코니아(periconia), 페로노스포라(peronospora), 폴리트린시움(polythrincium), 사카로폴리스포라(saccharopolyspora)(이전에 또한 파에니아(faenia) 또는 마이크로폴리스포라(micropolyspora)), 서모아크티노마이세스(thermoactinomyces), 스템필리움(stemphylium), 토룰라(torula) 속의 진균류 및/또는 이들의 포자 및/또는 아카루스(acarus), 글리코파구스(glycophagus), 티로파구스(tyrophagus), 데르마토파고이데스(dermatophagoides) 속의 진드기(및/또는 이들의 배설물)로부터 유래된 적어도 하나의 알레르겐의 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프를 포함하는, iMAT 분자.
7. 제6항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항원, 바람직하게는 적어도 하나의 알레르겐이, Cul n4, Cul o1, Cul o2, Cul o3, Cul o4 및/또는 Cul o7 알레르겐인, iMAT 분자.
8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항원 모듈이 말에서 하나 이상의 감염 질환(들)을 유발하는 병원체의 적어도 하나의 항원으로부터 유래된 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프, 바람직하게는 로도코쿠스(rhodococcus), 스트렙토코쿠스(streptococcus), 오르비바이러스(orbivirus), 플라비바이러스(flavivirus), 트리코피톤(trichophyton), 마이크로스포룸(microsporum), 크립토스포리디움(cryptosporidium) 및/또는 스트롱길루스(strongylus) 속으로부터 유래된 적어도 하나의 항원의 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프를 포함하고, 여기서, 바람직하게는 상기 적어도 하나의 항원 모듈은 또한 말에서 하나 이상의 감염 질환(들)의 전염에 관여하는 매개체의 항원, 보다 바람직하게는 쿨리코이데스(culicoides), 쿨렉스(culex) 및/또는 익소데스(ixodes) 타액 성분일 수 있는, iMAT 분자.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 tag 모듈, 바람직하게는 적어도 하나의 His-tag를 추가로 포함하고, 상기 적어도 하나의 tag 모듈이 바람직하게는 N-말단 및/또는 C-말단에 존재하고, 보다 바람직하게는 하나의 tag 모듈, 바람직하게는 하나의 His-tag가 하나의 메티오닌 잔기 후방의 N-말단에 존재하는, iMAT 분자.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제1 모듈이 HIV-tat, VP22 및/또는 안테나페디아의 아미노산 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 바람직하게는 이들로서 이루어지고, 단, 상기 적어도 하나의 제1 모듈은 세포외 공간에서 세포의 내부로 iMAT 분자의 전위를 위한 모듈로서 기능하는, iMAT 분자.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단량체 형태 및/또는 선형으로 존재하는, iMAT 분자.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 20, 21, 22, 및 23에 따른 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하고, 바람직하게는 이들로서 이루어지는, iMAT 분자.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 iMAT 분자를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물.
14. 말에서 하나 이상의 알레르기(들), 바람직하게는 곤충 물림 과민성(IBH), 두드러기 및/또는 재발성 기도 폐쇄(RAO)의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 iMAT 분자 또는 제13항에 따른 백신 또는 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물.
15. 말에서 하나 이상의 감염 질환(들)의 예방 및/또는 치료 및/또는 말에서 하나 이상의 감염 질환(들) 전염의 예방 및/또는 말에서 하나 이상의 감염 질환(들), 매개체에 의한, 바람직하게는 흡혈 파리, 각다귀, 진드기(tick) 및/또는 모기에 의한, 보다 바람직하게는 로도코쿠스 폐렴, 선역, 아프리카 마역, 웨스트 나일 바이러스 감염, 백선증 및/또는 소화관 및/또는 다른 기관의 기생충 및/또는 와포자충증, 연충 및/또는 이의 잠복기의 전염의 예방 방법에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 iMAT 분자 또는 제13항에 따른 백신 또는 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물.
16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 분리된 재조합 단백질을 암호화하는 핵산.
17. 제16항에 따른 적어도 하나의 핵산을 포함하는 벡터.
18. 제15항에 따른 적어도 하나의 핵산 및/또는 제17항에 따른 적어도 하나의 벡터를 포함하는 일차 세포(primary cell) 또는 세포주.
    

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