TW201607554A - 經改良之模組化抗原運輸分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於(經分離)重組蛋白質，亦稱作經改良之MAT(iMAT)分子，其包含至少一個易位模組、至少一個靶向模組及至少一個抗原模組，其中至少一個半胱胺酸殘基係經一不同胺基酸殘基取代。該等iMAT分子特別適用作例如用於治療及/或預防馬之過敏及/或傳染性疾病及/或防止馬之傳染性疾病傳播之疫苗。本發明進一步關於編碼該等iMAT分子之核酸、對應之載體及初級細胞或細胞系。

Description

經改良之模組化抗原運輸分子及其用途
本發明係關於(經分離)重組蛋白質，亦稱作經改良之MAT(iMAT)分子，其包含至少一個易位模組、至少一個靶向模組及至少一個抗原模組，其中至少一個半胱胺酸殘基係經一不同胺基酸殘基取代。該等iMAT分子可以實質上減少之製造努力製得及具物種特異性、更安全且免疫上極有效。該等(經分離)重組蛋白質特別適用為例如用於治療及/或預防馬之過敏及/或感染及/或防止感染傳播之疫苗。
藉由抗原呈現細胞(APC)處理抗原藉由兩種不同途徑發生。產生於細胞內部之抗原係藉由細胞表面上之MHC I(主要組織相容性複合體I類，MHC I類)分子來呈現，而細胞外抗原係藉由細胞表面上之MHC II(主要組織相容性複合體II類，MHC II類)分子來呈現。兩種機制由宿主引發對抗原之免疫反應。抗原從吸收進入細胞中直到呈MHC II-抗原複合體形式呈現於細胞表面上所採用的途徑通過各種細胞器，尤其通過內質網、高爾基體(Golgi apparatus)、反式高爾基網(trans-Golgi network)、溶酶體、內囊胞及通過MHC II類區室(MIIC)繼續進行。MIIC在MHC II介導之抗原呈現中扮演重要角色。在細胞之此等細胞器中，MHC II類分子係負載低分子量抗原或蛋白質之蛋白水解片段。於此過程中，在一開始時結合至MHC II分子之恆定鏈(亦 稱作MHC II γ鏈或Ii)經歷蛋白水解降解，及抗原在直接或間接結合MHC II之各種蛋白質調節下結合至MHC II分子。人體中之此等調節分子尤其包括HLA-DM、HLA-DO、LAMP-1、LAMP-2、CD63、CD83等。此等蛋白質之確切功能部分仍原因不明，但其中有許多具有可促使將其運輸至溶酶體、運輸至內囊胞、運輸至反式高爾基網、運輸至MIIC等之信號序列。許多蛋白酶為參與蛋白水解處理時所必需，使得抗原可呈現於MHC II分子上。存於MIIC中之蛋白酶尤其包括組織蛋白酶家族之各個成員，諸如(例如)組織蛋白酶S及組織蛋白酶L。在除人之外的物種中，同系物MHC II類分子具有不同胺基酸序列。在馬類動物中，MHC系統之組織類似於具有鄰接I類、III類、及II類區域之人類(Kelley J等人，Immunogenetics 2005,56：683-695)。
提供用於調節免疫反應之模組化抗原運輸(MAT)分子、相關聯結構、方法及其用途的概念揭示於WO 2004/035793(美國同等案US 2005/0281816)中。此文獻描述一種三部分分子之有用性，該MAT分子用於引入抗原之抗原決定基至細胞中因而確定待藉由該MAT分子調節之免疫反應。其中，描述各種易位模組、標靶模組及抗原模組。該技術及其基本方法使得以下成為可能：首先，可有效地從細胞外空間傳送抗原進入標靶細胞之細胞內空間中，及其次使得該等抗原可在到達細胞內部中之後有效地到達細胞器以待隨後處理供抗原呈現。一般而言，兩步法可用於靶向、有效地調節個體之免疫反應。MAT分子之用途揭示於(例如)Martínez-Gómez JM等人[Allergy 2009,64(1)：172-178]；Rose H(Arb Paul Ehrlich Inst Bundesinstitut Impfstoffe Biomed Arzneim Langen Hess,2009,96,319-327)及最近SentiG等人[J Allergy Clin Immunol.,2012,129(5)：1290-1296]中。基於MAT技術，主要貓過敏原Fel d1係融合至TAT衍生之蛋白質易位域及融合至人截短型恆定鏈以靶向MHC II類路徑。在小鼠中評估免疫原性，而藉由基於貓毛 過敏患者之嗜鹼細胞反應性之適宜測試來評估可能的安全性問題。已證實此模型化合物之可能用途。在其中描述，預期MAT分子相較重組過敏原或過敏原萃取物在習知過敏原特異性免疫療法(SIT)中可更安全且更有效地誘導期望的免疫反應(亦即，減敏化(hyposensitization))。在Senti G.等人最新公開案中，描述針對人之貓毛過敏之淋巴內免疫療法於三次注射後誘導耐受性。在其中描述使用MAT-Fel d1的人類首次(first-in-human)臨床研究，證實僅在淋巴內注射之三次注射後之安全性及誘導過敏原耐受性。
其他先前技術如下：Gadermaier G等人(Molecular Immunology 2010,47：1292-1298)描述將經半胱胺酸穩定之Art v1折疊靶向用於蒿屬(Artemisia)花粉過敏之免疫治療。作者使用靶向Art v1轉譯後修飾作用之遺傳工程方法，旨在產生出低致敏性分子：(i)藉由定點突變破壞防禦素域之二硫鍵及(ii)在大腸桿菌中表現突變體結構以產生出非醣基化蛋白。然而，明顯地，該目標僅操縱Art v1防禦素域之三維折疊以藉由用絲胺酸交換單一半胱胺酸殘基，同時保持完整(即，未修飾)所識別的T-細胞抗原決定基(即使其等包含半胱胺酸殘基)，來消除IgE-結合(換言之，產生出低致敏性分子)。
第3屆哈弗梅耶馬過敏性疾病研討會(the 3rd Havemeyer workshop on allergenic diseases of the Horse)報告(Hólar,Iceland,2007年6月，Veterinary Immunology and Immunotherapy 2008,126：351-361)聚焦於昆蟲叮咬過敏反應(IBH)及復發性氣管阻塞(RAO)之免疫學及遺傳態樣。在此研討會上，論述新穎的對抗IBH之SIT之方法，尤其論述具有偶聯至模組化抗原易位(MAT)分子之過敏原的病毒載體或蛋白質疫苗接種之用途。
在2010年及2011年SIAF年度報告中，Crameri R報告MAT技術於 感染IBH馬之疫苗接種之用途。
然而，當生產及製造先前技術中所述之MAT分子時出現主要問題。特定言之，在開發用於依優良製造規範(GMP)製造MAT分子之下游方法(DSP)中所使用之標準方法可不適用。明顯由於MAT分子之異常物理化學性質，故不可純化MAT分子之均質分子物質。
對於先前技術中所述之MAT分子而言，雖然測試了不同分離原理(例如，尺寸篩除層析、RP-HPLC)，但是若干純化方法可不適用(參見本文實例5)。用於測定重組蛋白質之純度的方法一般包括層析分離(例如，RP-HPLC)及電泳分離(例如，毛細管區帶電泳、等電聚焦、於還原或非還原條件下之SDS-PAGE)。再者，此等分析方法可不適用在無分子特異性調適之MAT分子上。為了評估純度，必須開發一種經調適之特異性SDS-PAGE測試程序。此測試程序包括利用還原劑及十二烷基硫酸鋰(LDS)及加熱至75℃之樣品製造，在電泳分離後獲得多個可再現明顯譜帶。以考馬斯藍(Coomassie blue)染料染色導致凝膠之線性定量行為(密度測定法)。使用容許檢測MAT分子中之過敏原模組之單株抗體，展現一條主要譜帶及若干次要譜帶。所有譜帶亦在使第二凝膠重新負載第一凝膠之切除譜帶後可再現地遷移至原始凝膠之相同位置。驚人地，在所有此等具有較低及較高表觀分子量之譜帶中，藉由從凝膠中切除譜帶，藉由質譜(nanoLC/ESI-MS-MS)之其胰蛋白酶消化及隨後分析，來識別全長MAT分子。可從該等實驗得出在SDS-PAGE中MAT分子之不同折疊變化之異常行為(「凝膠移位」)之結論。另外，在所有批次之MAT分子中，可檢測到蛋白質之多聚體形式，其等難以與單體形式分離。
就(例如)經濟觀點及亦就監管要求而言，必需改良(i)MAT分子之製造方法及(ii)其用於純度測定之標準分析方法之適合性。另外，就調適MAT分子適於特異性標靶物種(諸如馬)而言，需要調適在MAT技 術中之免疫學靶向。
另外，MAT分子可輕易地用於由已知主要過敏原誘導的過敏(例如，由Fel d1引發之人之貓毛過敏)中。然而，先前技術之MAT分子似乎很難用於臨床設定諸如過敏中，其中，例如，已知涉及各種非交叉反應性過敏原，但尚不知曉此等過敏原在誘導過敏時之重要性(換言之，尚不知曉主要過敏原)。
本發明基本目標係提供經改良之MAT分子，其可克服先前技術之問題，適用作醫藥組合物諸如疫苗中之活性劑。
在一個態樣中，本發明基本目標已驚人地藉由提供一種(經分離)重組蛋白質，較佳經改良之MAT(iMAT)分子得以解決，該經分離重組蛋白質包含：(i)至少一個第一模組，其為使得iMAT分子自細胞外空間易位進入細胞內部中之胺基酸序列，(ii)至少一個第二模組，其為使得iMAT分子之物種特異性細胞內靶向至參與處理抗原及/或使MHC分子加載抗原(較佳係經處理之抗原)之細胞器的胺基酸序列，及(iii)至少一個第三模組作為抗原模組，其為衍生自至少一種抗原，較佳至少一種過敏原之至少一個完全或部分抗原決定基，從而確定由該iMAT分子調節的免疫反應之特異性之胺基酸序列，其特徵在於，至少在該(等)抗原模組中，至少一個半胱胺酸殘基係經一不同胺基酸殘基，較佳絲胺酸、白胺酸、異白胺酸及/或天冬胺酸取代。
較佳地，在該至少一個抗原模組中，所有半胺氨酸殘基係經一不同胺基酸殘基，較佳絲胺酸、白胺酸、異白胺酸及/或天冬胺酸取代。更佳地，在整個iMAT分子中，所有半胱胺酸殘基係經一不同胺 基酸殘基，較佳絲胺酸、白胺酸、異白胺酸及/或天冬胺酸取代。
較佳地，若非全部半胱胺酸殘基經一不同胺基酸殘基，較佳絲胺酸、白胺酸、異白胺酸及/或天冬胺酸取代，則會有偶數個半胱胺酸留於整個iMAT分子中。
較佳地，所有該等模組視情況藉由兩個或更多個相鄰模組，視情況所有該第一、第二及/或第三模組之間的額外間隔模組彼此共價連接。
更佳地，所有該等模組彼此共價連接，且該第一、第二及/或第三模組之兩個或更多個相鄰模組之間根本不存在額外間隔模組。
在另一態樣中，本發明基本目標已驚人地藉由提供一種包含如本文中所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質之疫苗或免疫原性組合物或醫藥組合物得以解決。
在另一態樣中，本發明基本目標已驚人地藉由提供如本文中所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質或如本文中所揭示並主張的疫苗或免疫原性組合物或醫藥組合物得以解決，其等用於一種預防及/或治療馬之一或多種過敏，較佳昆蟲叮咬過敏反應(IBH)、蕁麻疹及/或復發性氣管阻塞(RAO)的方法中。預防及/或治療有此需要之馬之對應方法及於製備用於預防及/或治療馬之醫藥組合物/藥物之用途亦意欲屬於本發明之範疇內。
在另一態樣中，本發明基本目標已驚人地藉由提供如本文中所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質或如本文中所揭示並主張的疫苗或免疫原性組合物或醫藥組合物得以解決，其用於一種預防及/或治療馬之一或多種傳染性疾病及/或防止馬之一或多種傳染性疾病傳播及/或防止馬之一或多種傳染性疾病經載體，較佳經食血蒼蠅、蠓(midge)、壁蝨(tick)及/或蚊，更佳紅球菌肺炎、腺疫、非洲馬疫、西尼羅病毒感染、皮癬菌病及/或消化道及/或其他器官之寄生蟲及/或隱 孢子蟲病、蠕蟲及/或其潛隱期傳播之方法中。預防及/或治療有此需要之馬之對應方法及於製備用於預防及/或治療馬之醫藥組合物/藥物之用途亦意欲屬於本發明之範疇內。
在另一態樣中，本發明基本目標已驚人地藉由提供一種編碼如本文中所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質之核酸得以解決。
在另一態樣中，本發明基本目標已驚人地藉由提供一種包含至少一種如本文中所揭示並主張的核酸之載體得以解決。
在又一態樣中，本發明基本目標已驚人地藉由提供一種包含至少一種如本文中所揭示並主張的核酸及/或至少一種如本文中所揭示並主張的載體之初級細胞或細胞系得以解決。
驚人地，如本文中所揭示並主張的根據本發明之iMAT分子確實具有使其優於相關先前技術之MAT分子之物理化學及/或免疫學特性：
(i)抗原模組，較佳整個iMAT分子中至少一個半胱胺酸殘基，較佳所有半胱胺酸經一不同胺基酸殘基之取代，其經電腦模擬方式選擇成不損及最終iMAT分子之穩定性，使得根據本發明之iMAT分子驚人地適合應用用於生物醫藥之標準純化程序及標準分析方法。
(ii)iMAT分子之模組(即第一易位模組、第二靶向模組及第三抗原模組)之較佳直接共價連接，而無任何額外間隔模組介於該等模組之間，即，根本無其他間隔模組介於該第一、第二及/或第三模組之兩個或更多個相鄰模組之間，除了上述(i)外還造成根據本發明之iMAT分子之優異特性：該等被認為是三維結構更剛性且因此無法形成構形IgE抗原決定基之iMAT分子甚至更具低致敏性，如本文實例2所顯示，實質上沒有檢測到過敏性。
(iii)(準)N-端His-標籤之較佳存在導致，根據本發明之iMAT分子可用作用於監測免疫性及/或免疫性持續時間之替代物標記，此乃因 該標籤模組視情況連同一或多個來自易位模組之相鄰胺基酸殘基一起可用於誘導目標個體之對iMAT分子之一般結構具特異性之特異性免疫上可檢測信號(例如抗體)(參見本文實例1)。另外，該標籤模組之存在可用於分離包含根據本發明之iMAT分子之樣品中的蛋白質，例如，使用載鋅或載鈷固體擔體，且因此進一步增加製造根據本發明之iMAT分子而在純化製程期間無聚结之可能性。
(iv)根據本發明之iMAT分子中之至少一個靶向模組較佳係具物種特異性，即，就該等iMAT分子對馬之預期應用而言，選擇馬靶向模組，例如，馬恆定鏈。藉由該物種特異性靶向，可成功地達成根據本發明之iMAT分子對MHC II類分子之最佳化結合特性。
(v)根據本發明之iMAT分子中之至少一個抗原模組較佳為過敏原。其可衍生自黴菌(真菌及/或其孢子)、花粉、室內塵埃或飼料螨(及/或其糞便)，較佳來自樹、草、草本、豚草之花粉及/或十字花科花粉及/或曲黴菌屬(aspergillus)、鏈格孢菌屬(alternaria)、灰黴菌屬(botrytis)、尾孢菌屬(cercospora)、枝孢菌屬(cladosporium)、彎孢菌屬(curvularia)、內臍蠕孢菌屬(drechslera)、散囊菌屬(eurotium)、麥類胡麻葉枯病菌屬(helminthosporium)、附球孢菌屬(epicoccum)、白粉菌屬(erysiphe)/粉孢菌屬(oidium)、鐮孢菌屬(fusarium)、橫梗黴屬(lichtheimia)、黑孢菌屬(nigrospora)、青黴菌屬(penicillium)、黑團孢菌屬(periconia)、霜黴菌屬(peronospora)、浪梗黴菌屬(polythrincium)、糖多孢菌屬(saccharopolyspora)(先前亦稱作乾草菌屬(faenia)或小多孢菌屬(micropolyspora))、高溫放線菌屬(thermoactinomyces)、匍柄黴菌屬(stemphylium)、圓酵母屬(torula)之真菌及/或其孢子及/或粉蟎屬(acarus)、糖蟎屬(glycophagus)、食酪蟎屬(tyrophagus)、塵蟎屬(dermatophagoides)之蟎(及/或其糞便)。根據本發明之iMAT分子中之至少一個抗原模組更佳為庫蠓(culicoides)過 敏原。依照以下標準來選擇過敏原：在尚不知曉誘導個體過敏之主要過敏原時，可藉由本文實例6及7中例示性地且詳細描述之生物資訊方法來選擇根據本發明之iMAT分子中之至少一個抗原模組。依此方式可獲得特別適用作例如用於治療及/或預防馬之過敏之疫苗的經改良之MAT分子。根據本發明之iMAT分子中之至少一個抗原模組亦可係參與一或多種傳染性疾病之病原體之抗原。其可衍生自紅球菌屬(rhodococcus)、馬鏈球菌屬(streptococcus)、環狀病毒屬(orbivirus)、黃病毒屬(flavivirus)、毛癬菌屬(trichophyton)、小孢癬菌屬(microsporum)、隱孢子蟲屬(cryptosporidium)及/或圓線蟲屬(strongylus)。根據本發明之iMAT分子中之至少一個抗原模組亦可係參與一或多種傳染性疾病之傳播之載體之抗原，例如，係庫蠓屬、庫蚊屬及/或硬蜱屬之唾液組分。依此方式可獲得特別適用作例如用於治療及/或預防馬之傳染性疾病及/或防止馬之傳染性疾病傳播之疫苗的經改良之MAT分子。
特定言之，本發明提供展現經改良之溶解度之(經分離)重組蛋白質，其可輕易地應用於層析分離技術且顯示經改良之穩定性。
此外，根據本發明之(經分離)重組蛋白質較佳呈現在誘導期望之免疫學效應，即，有利地，物種特異性調節個體(較佳馬)之抗過敏原之免疫反應上的高活性及效力。例如，依此方式，治療及減輕感染IBH的馬之症狀變成可行。
圖1：顯示庫蠓屬之過敏原之實例，識別物種、過敏原及uniprot寄存號(資料庫發行為UniProt發行2013_09)
圖2：顯示MAT-Fel d1(IVN201)在還原條件下之SDS-PAGE；A)初始SDS-PAGE(10μg蛋白質/泳道，考馬斯染色)及B)具有已從凝膠A中切除及重新加載於SDS-PAGE上之譜帶之SDS-PAGE(銀染色)
圖3：顯示Fel d1在還原條件下之SDS-PAGE；NuPAGE® 4至12% Bis-Tris凝膠。泳道：1)標記物：SeeBlue Plus2預染色標準2)5μg Fel d1；3)5μg Fel d1
圖4：顯示RP-HPLC層析圖，0.1% TFA/乙腈梯度a)不含添加劑之天然蛋白質(MAT-Fel d1)(左圖)；b)藉由添加氯化胍加上DTT變性之MAT-Fel d1(右圖)
圖5：描繪MAT-Fel d1分子及其Kyte Doolittle疏水性圖
圖6：顯示NuPAGE® SDS-PAGE-系統(4至12% Bis-Tris凝膠，1×MES-運行緩衝液，35分鐘，200V)。泳道：1)溶菌酶，1μg蛋白質ox。2)PageRuler預染色蛋白梯；3)經碘乙醯胺氧化之MAT-Fel d1(5μg)(ox.)；4)iMAT-Cul o4(ox.)；5)PageRuler預染色蛋白梯；6)還原之MAT-Fel d1(5μg)；7)還原之iMAT-Cul o4；8)還原之溶菌酶
圖7：顯示RP-HPLC層析圖，0.1% TFA/乙腈梯度。峰反映不含添加劑之天然(經氧化)蛋白質(iMAT-Cul o4)。
圖8：描繪一展現選定庫蠓過敏原之局部比對擊中計數與所測得敏化比較的實例(詳細內容請參見發明說明)。該圖描繪在一組IBH馬群中就嚴重度(每一過敏原之總評分值)方面之HRT測試中之抗原預測(淺灰色及右Y軸)與結果(深灰色及左Y軸)之間的比較。嚴重度以半定量標度(左Y軸)描述該測試中反應之程度。來自預測之數據係藉由設定等於最高嚴重度評分之最高出現率評分來縮放。
圖9：顯示隨後實驗之結果：在RT下培養30分鐘同時輕輕地混合之蛋白質及Adju-Phos®。在培養之後，將樣品離心3分鐘及於隨後進行SDS-Page分析：泳道1)pageRuler預染色蛋白梯；2)iMAT-Cul o3上清液；3)在尿素中之iMAT-Cul o3細胞小球；4)iMAT-Cul o3上清液；5)在尿素中之iMAT-Cul o3細胞小球；6)空白；7)iMAT-Cul o2上清液；8)在尿素中之iMAT-Cul o2細胞小球；9)iMAT-Cul o2上清液；10) 在尿素中之iMAT-Cul o2細胞小球；11)空白；12)iMAT-Cul o4上清液；13)在尿素中之iMAT-Cul o4細胞小球；14)iMAT-Cul o4上清液；15)在尿素中之iMAT-Cul o4細胞小球；(2、3、7、8、12、13 w/o凍融)；(4、5、9、10、14、15係在兩次凍融製程之後)
圖10：顯示5種濃度的iMAT-Cul o2及iMAT-Cul o3及多敏化馬(馬1)中之各別過敏原之組織胺釋放測試(分析之詳細內容可參見實例2)
圖11：顯示各別融合蛋白質之一般部分[即，不含各別抗原模組]中MAT分子相對iMAT分子之Kyte-Doolittle疏水性圖。疏水性指數係相對在X軸上之胺基酸位置顯示在Y軸上。指數之正數值指示疏水性。在疏水性圖開始處iMAT分子之圖相對MAT分子之圖的位移係歸因於iMAT分子中N端額外存在His-標籤及一個甲硫胺酸殘基及不存在任何間隔模組所致。
圖12：該圖顯示正規資料庫中之Cul o3(M4X062，SEQ ID NO：6)之每個具有13個胺基酸長度之肽的非隨機擊中數及其在對應前驅蛋白質中之位置。y軸描繪擊中數及x軸描繪參考前驅蛋白質的胺基酸位置。垂直點線指示半胱胺酸殘基，點虛線描繪非隨機發現的同源性數的平均移動及水平實線對應於電腦模擬裂解肽。
在更詳細地論述本發明之實施例之前，應注意，如本文及隨附申請專利範圍中所用，除非本文清楚地另作指明，否則單數形式「一」、「一個」、及「該」包括複數指示物。
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術及科學術語具有如本發明所屬技術之一般技術人員所通常瞭解之意義。除非另有指示或以其他方式為熟習此項技術者已知，否則所有的給定範圍及數值可改變1至5%，因此，術語「約」通常從描述及申請專利範圍省去。雖然類似於或等效於彼等如本文所述者之任何方法及材料可用於實施或測 試本發明，但現將描述較佳之方法、裝置、及材料。本文中述及的所有公開案係出於如可結合本發明使用之公開案中所報告般描述並揭示物質、賦形劑、載劑、及方法之目的而以引用的方式併入本文中。本文任何內容均不應被解釋為承認本發明無權先於藉助先前發明之此等揭示內容。
術語「經分離重組蛋白質」、「重組蛋白質」及/或「經改良之MAT(iMAT)分子」可在本發明之過程中互換使用。其等均具有相同含義。
在本發明之過程中，術語「模組」係指特異性胺基酸序列，例如多肽之一部分、單元或部分，通常係具有所定義功能之短胺基酸/肽序列。
本文中術語「第一模組，其為使得(經分離)重組蛋白質，較佳經改良之MAT(iMAT)分子從細胞外空間易位進入細胞內部中之胺基酸序列」亦可互換地稱作「易位模組」或「異位序列」，在本發明之過程中係指促使貨物分子(cargo molecule)例如胺基酸序列、肽、多肽、蛋白質及其他類別之物質諸如核酸或醫藥活性成分(API)運輸至細胞，特定言之真核細胞，更特定言之如文獻中已知之表面上表現MHC II類分子及/或表面上表現MHC I類分子之細胞之內部中之特異性胺基酸序列。
異位模組之存在，可促使該貨物分子進入至該等細胞中。
適用作易位模組之胺基酸序列述於先前技術中。例如，US 7,653,866揭示若干有用的易位序列，其等包含衍生自單純皰疹病毒之HIV-tat分子或蛋白質VP22。促使指定標靶分子進入細胞內部中之該原理多數地述於相關專利案及非專利案文獻中的不同研究中。此外，適宜的易位序列包括同源異型蛋白質(homeoprotein)序列、白胺酸拉鏈序列、富含精胺酸及/或富含離胺酸之序列、及(不管缺乏分泌信號 序列)分泌的蛋白質或多肽之各種其他序列。特別有用的是病毒肽序列，例如蛋白質HIV轉錄活化蛋白(HIV tat)。已在先前技術中描述Tat序列或Tat肽(包括各種不同修改)。先前技術中所述的Tat之肽序列的所有變型一般適用作易位模組。其他實例包括VP22肽及衍生自果蠅同源蛋白觸角足蛋白之觸角足蛋白肽。此外，可使用其他同源異型蛋白質。適宜同源異型蛋白質之各種實例述於先前技術中。此外，可使用白胺酸拉鏈蛋白質，例如人cFos-(139-164)、或人cJun-(252-279)。 除此之外，富含精胺酸及/或富含離胺酸之肽適用作包含例如HIV-1 rev(34-50)或衍生自病毒或酵母之其他肽之序列的易位模組。當然，富含聚精胺酸及/或富含聚離胺酸之肽可以合成方式製得。該等富含聚精胺酸及/或富含聚離胺酸之肽可包含其他胺基酸。適宜的實例述於相關先前技術中。在一較佳實施例中，該至少一個易位模組包括(較佳由)不是由如上所說明的完全蛋白質序列組成而是由仍舊具功能性(即，可有效地促進細胞進入)之最小序列組成之胺基酸序列(組成)。一適宜之最小序列為(例如)根據SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
在另一較佳實施例中，該至少一個易位模組包括(較佳由)HIV-tat、VP22及/或觸角足蛋白或其部分序列(組成)，限制條件為該至少一個易位模組作用為用於從細胞外空間易位進入細胞內部中之模組。
本文中術語「第二模組，其為使得(經分離)重組蛋白質，較佳經改良之MAT(iMAT)分子物種特異性細胞內靶向參與處理抗原及/或使MHC分子加載抗原，較佳經處理之抗原之細胞器之胺基酸序列」亦可互換地稱作「靶向模組」或「靶向序列」，在本發明之過程中，係指容許/促進將如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質細胞內運輸至該等參與處理抗原及/或使MHC分子加載抗原之細胞器之特異性胺基酸序列。
特定言之，該等細胞器包括內質網、高爾基體、反式高爾基
網、溶酶體、內囊胞及MHC II區室。此等細胞內細胞器參與諸如(例如)運輸及/或處理抗原、製造及/或使MHC II分子加載抗原或經處理之抗原、及/或運輸加載該等抗原之MHC II分子至細胞表面之過程。
相關技術中已知多種序列。有用的靶向序列之一個突出實例包括MHC II類分子之恆定鏈，亦稱作Ii恆定鏈或MHC II γ鏈。恆定鏈之各種變體述於專利案及非專利案文獻中。
在本發明之一較佳實施例中，恆定鏈係選自應調節免疫反應的物種及/或係選自應細胞內靶向iMAT分子的物種。
例如，就馬類(equine)諸如馬(horse)而言，所選的較佳恆定鏈為馬恆定鏈，包括(較佳由)根據SEQ ID NO：2之胺基酸序列或其片段(組成)，限制條件為該等片段維持其細胞內運輸功能。較佳的該等片段為根據SEQ ID NO：15及/或16之胺基酸序列。
靶向序列之其他適宜實例包括溶酶體膜蛋白，其包含適用作靶向模組之序列。即，許多膜蛋白產生於溶酶體中，其具有容許靶向溶酶體之序列基元。蛋白質之該等組別尤其包括lamp 1、lamp 2、lamp 3、limp II及lap。此外，四跨膜蛋白在先前技術中已知為靶向模組。 其他蛋白質可在顯示靶向性質之內囊胞/溶酶體區室中發現。熟習此項技術者明瞭如何據此確定適宜之靶向序列。
在另一較佳實施例中，該至少一個靶向模組包括(較佳由)馬恆定鏈(組成)及較佳由SEQ ID NO：2、15、16之胺基酸序列中之一或多者組成。
本文中術語「第三模組作為抗原模組，其為衍生自至少一種抗原，較佳至少一種過敏原之至少一個完全或部分抗原決定基，從而確定由該(經分離)重組蛋白質，較佳經改良之MAT(iMAT)分子調節(個體，較佳馬)之免疫反應之特異性之胺基酸序列」亦可互換地稱作「抗原模組」或「抗原序列」，在本發明之過程中係指容許調節個 體，較佳馬之抗抗原決定基/抗原之免疫反應及確定個體，較佳馬之免疫反應之特異性的特異性胺基酸序列。
在該內文中，該(等)抗原模組包括至少一個經一不同胺基酸殘基，較佳絲胺酸、白胺酸、異白胺酸及/或天冬胺酸取代之半胱胺酸殘基。因此，該免疫反應與暴露於抗原之未經改變的胺基酸序列之個體，較佳馬之免疫反應相比不同。
在該方法基礎上，不存在與抗原相關的限制。該方法可(例如)用於活化個體抗病原體，諸如(例如)抗病毒、細菌、真菌、寄生蟲、原蟲等之免疫系統，即，極通常用作疫苗。另外，該方法不僅可用於直接抗該等病原體，而且可用於活化宿主免疫系統以防止與病毒、細菌、真菌、寄生蟲、原蟲等有關的載體傳播疾病之傳播。此外，該方法可用於活化抗退化細胞諸如(例如)腫瘤細胞等之免疫系統。然而，該方法另一方面亦可用於個體抗諸如(例如)衍生自食物、黴菌(真菌及/或其孢子)、花粉、動物毛髮、室內塵埃或飼料蟎(及/或其糞便)、昆蟲毒素等之過敏原之免疫系統之減敏或用於免疫系統之靶向抑制，例如，假若存在自體免疫反應，諸如(例如)關節炎、風濕病、糖尿病、SLE(全身性紅斑狼瘡)等，及用於抑制移植排斥反應。未明確提及但與太強或太弱之免疫反應相關聯之其他疾病可同樣地經如本文所揭示並主張的iMAT分子治療。
可呈抗原模組用於本發明之目的，原則上，抗原之所有類型可調節免疫反應。目前已經知曉的抗原及欲在將來發現的抗原均適宜。 在一些情況中，抗原亦可係彼等利用目前相關技術中已知的習知免疫接種方法不會導致免疫反應但在個體應用本發明所述的新穎方法時導致免疫反應者。另外，術語抗原包涵包含抗原決定子(亦稱作抗原決定基)之抗原片段。因此，抗原模組可為整體分子，例如蛋白質，或為分子之包含至少一個抗原決定子或抗原決定基之部分，即，其片 段，例如肽。該至少一個抗原決定子或抗原決定基可引起抗抗原之免疫反應。抗原決定基可包含一個或多於一個胺基酸或肽或可引起免疫反應之其他結構(諸如糖結構、磷酸化胺基酸等)或其組合。抗原可為連續抗原決定基(即，不依賴於構形，例如呈(例如)天然及變性蛋白質存在)或不連續抗原決定基(即，依賴於構形，例如僅呈天然、折疊形式存在，但不以變性蛋白質存在)。不僅可使用蛋白質及肽，而且可使用糖結構、脂質(例如脂多糖)、脂磷壁酸及細菌膜之其他組分(CD1b與例如糖結構及脂質結合)、核酸(諸如(例如)包含CpG基元之DNA)、有機物質(諸如(例如)乳膠或用作用於本發明之目的之抗原的醫藥活性物質)。抗原可衍生自所有可能的生命形式，諸如(例如)人、動物、植物、真菌、寄生蟲、單細胞或多細胞微生物、病毒及其他生命形式。抗原可從生物材料分離，已製成重組抗原或已藉由合成，例如藉由肽合成製得。以合成方式製得之抗原可為自然生成或非自然生成但係藉由化學合成獲得之物質。非自然生成物質(其然而在一些情況中適用作抗原)之實例為：例如，存於藥物中之以合成方式製得之物質、或具有非自然生成之胺基酸序列之合成肽、或模擬肽(peptidomimetic)等。自然生成或合成或重組抗原可藉由分子生物學方法、酵素方法、化學方法及/或其他方法修飾以賦予其更有利地用於特定應用之性質。該等有利的性質可尤其係，作為抗原之更高或更低活性、作為抗原之更寬廣或更特異性作用、在親水性或疏水性溶劑中之更佳溶解度、抗原模組對細胞膜、對細胞器膜、對血腦障壁、對血液-CSF障壁等之更大滲透性、更長或更短活體內或活體外半衰期、更低或更高毒性、施用呈iMAT分子形式之抗原後活體內或活體外抗原之更佳可檢測性等。另外，可出於本發明之目的而將複數種抗原在一個抗原模組中組合。為此，相同抗原可呈多於一個複本存於抗原模組中，或例如相同抗原之不同變體可在抗原模組中組合。抗原模組中抗 原(例如抗原1)及其他抗原(例如抗原2)之組合亦可行等。諸如(例如)呈多於一個複本之抗原1及呈單一複本之抗原2之其他組合亦可在抗原模組中組合等。另外，一或多個不同及/或一或多個相同抗原模組亦可存於一個iMAT分子中。原則上，衍生自一或多種不同抗原之抗原之單及多重存在的相同或改變複本之所有可能的組合可出於本發明之目的而進行組合。
在一較佳實施例中，抗原模組包含衍生自至少一種抗原之至少一個完全或部分抗原決定基，其中該抗原為過敏原。至少一個抗原決定基可引起抗過敏原之免疫反應，藉此該抗原決定基可包含一種或多於一種可引起免疫反應之結構，例如肽。抗原決定基可係過敏原之連續抗原決定基或不連續抗原決定基。抗原決定基較佳係至少八個胺基酸長度，較佳係至少十個胺基酸長度，更佳係至少13個胺基酸長度。 抗原模組包含至少一個完全或部分抗原決定基，但亦可包含兩個或更多個可彼此相同或相異的完全或部分抗原決定基。另外，抗原模組可包含鄰接該至少一個完全或部分抗原決定基之額外胺基酸序列。抗原決定基可係自然生成之抗原決定基或可係經修飾之抗原決定基，在其胺基酸序列中修飾及/或藉由一或多次轉譯後修飾修飾。
在一實施例中，該至少一個第三抗原模組包含衍生自參與一或多種傳染性疾病的病原體之至少一種抗原的至少一個完全或部分抗原決定基。此可衍生自紅球菌屬、馬鏈球菌屬、環狀病毒屬、黃病毒屬、毛癬菌屬、小孢癬菌屬、隱孢子蟲屬及/或圓線蟲屬。根據本發明之iMAT分子中之該至少一種抗原模組亦可係參與一或多種傳染性疾病之傳播之載體之抗原，例如，蠓、庫蚊屬及/或硬蜱屬唾液組分。
在另一較佳實施例中，該至少一個第三抗原模組包含衍生自至少一種引起馬之一或多種過敏之過敏原之至少一個完全或部分抗原決 定基。此可係至少一種衍生自黴菌(真菌及/或其孢子)、花粉、室內塵埃或飼料蟎(及/或其糞便)，較佳來自樹、草、草本、豚草之花粉及/或十字花科花粉及/或曲黴菌屬、鏈格孢菌屬、灰黴菌屬、尾孢菌屬、枝孢菌屬、彎孢菌屬、內臍蠕孢菌屬、散囊菌屬、麥類胡麻葉枯病菌屬、附球孢菌屬、白粉菌屬/粉孢菌屬、鐮孢菌屬、橫梗黴屬、黑孢菌屬、青黴菌屬、黑團孢菌屬、霜黴菌屬、浪梗黴菌屬、糖多孢菌屬(先前亦稱作乾草菌屬或小多孢菌屬)、高溫放線菌屬、匍柄黴菌屬、圓酵母屬之真菌及/或其孢子及/或粉蟎屬、糖蟎屬、食酪蟎屬、塵蟎屬之蟎(或其糞便)之過敏原之至少一個完全或部分抗原決定基。
在一較佳實施例中，此較佳係至少一種衍生自食血昆蟲，更佳衍生自庫蠓屬之過敏原之至少一個完全或部分抗原決定基。
庫蠓屬之過敏原之實例顯示於圖1中，識別物種、過敏原及uniprot寄存號(資料庫發行為UniProt發行2013_09)。
在另一較佳實施例中，該至少一種抗原為Cul n4、Cul o1、Cul o2、Cul o3、Cul o4及/或Cul o7過敏原。抗原模組之較佳特異性序列為根據SEQ ID NO：3、4、5、6、18、19之胺基酸序列。
在本發明之過程中術語「藉由(...)調節之免疫反應」或可互換的「免疫調節免疫反應」與「(經分離)重組蛋白質」及/或「iMAT分子」搭配時係指免疫原性及/或致耐受性免疫反應。
在本發明之過程中，術語「過敏原」係指一類呈天然形式產生出異常顯著免疫反應，其中免疫系統消除所有感知威脅，否則將對個體無害之抗原。典型地，該等類型之反應導致稱作過敏之表型。先前技術中描述各種類型之過敏原，包括食物、藥物、動物產品或天然或合成物質。較佳地，當蛋白質呈天然形式引起至少五種個體，較佳馬之特異性IgE反應時，蛋白質被認為係過敏原。為避免疑義，「過敏原」與「至少一個包含衍生自至少一種過敏原之至少一個完全或部分 抗原決定基之第三抗原模組」搭配時不再必需呈天然形式，此點亦較佳，換言之，在本發明之過程中術語「過敏原」亦明確地係指作為如本文所描述並主張的iMAT分子之部分之非天然胺基酸序列，其不引起至少五種個體，較佳馬之特異性IgE反應。
本文中術語「抗原決定基」亦可互換地稱作「抗原決定子」，在本發明之過程中係指抗原之可藉由免疫系統，無論藉由B-細胞或T-細胞中識別之部分。抗原決定基借助其等所結合的MHC分子呈現於抗原呈現細胞之表面上。
本文中術語「個體(subject)」亦可互換地稱作「個體(individual)」及/或「生物體」，在本發明之過程中，較佳係指馬。
本文中術語「馬(equine)」亦可互換地稱作「馬(horse)」，在本發明之過程中，包含馬屬(Equus)之任何成員。其包含(例如)任何馬、小型馬及/或驢，分類指示為：野馬(Equus ferus)及/或家馬(Equus caballus)、及/或子種馬(Equus ferus caballus)。馬可為(例如)家養馬。
術語「肽」及「蛋白質」在本發明之過程中並列用作等效物。 肽或蛋白質出於本發明之目的意指至少兩個胺基酸經肽鍵之共價連接。術語「胺基酸」及術語「胺基酸殘基」在本申請案中用作等效物，即，此兩術語之含義相同。術語胺基酸/胺基酸殘基及肽/蛋白質在本申請案中呈最寬廣可能定義形式進行使用。
在該連用中，術語「重組蛋白質」係指可藉由遺傳工程及在真核或原核系統中表現來獲得之多肽。此外，該術語包含藉由人工(例如，固相)合成獲得之多肽。
如本文所用，術語「不同胺基酸殘基」除非另有指示，否則係指除了半胱胺酸之外之已知胺基酸殘基。例如，該胺基酸殘基可係自然生成之胺基酸殘基，諸如絲胺酸或異白胺酸。
如本文所用，術語「線性形式」係指根據本發明之缺乏二級結構之蛋白質。該等蛋白質通常假設為展現隨機捲取構形，其中唯一的固定關係係由肽鍵將相鄰胺基酸殘基接合。
在一較佳實施例中，如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質係呈單體形式及/或線性形式存在。
如本文所用，術語「治療」係指投與如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質、及/或對應之疫苗及/或免疫原性組合物及/或醫藥組合物以獲得所需之臨床結果，包括預防及/或治療性治療。
如本文所用，術語「免疫治療」係指(例如)藉由預防性及/或治療性疫苗接種來治療性及/或預防性治療個體。
如本文所用，術語「載體」與「一或多種傳染性疾病之傳播」搭配時係指活生物體，及在本文中可與術語「生物學載體」、「生物學攜帶者」及/或「疾病攜帶者」諸如食血蒼蠅、蠓、壁蝨及/或蚊互換使用。
另外，可能且較佳地，如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質另外包含至少一個標籤模組。即，可能且較佳地，一或多個不同及/或相同標籤模組為如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質之部分。標籤模組通常係由至多20個胺基酸或非胺基酸組成的官能基組成之短肽，諸如(例如)生物素或毛地黃毒苷(digoxigenin)。適宜之標籤模組包括熟知且較佳的包含4至12個或更多個組胺酸序列，較佳直接連續組胺酸殘基，較佳5、6或7個連續組胺酸殘基的His-標籤。其他適宜之標籤模組包括HA-標籤、FLAG-標籤、GST-標籤或Strep-標籤。雖然標籤可存於如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質之任何位置，但是在一較佳實施例中，標籤模組存於(經分離)重組蛋白質之N-端及/或C-端。
標籤模組適用於分離出如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白 質，及此外可檢測活體外或活體內該等(經分離)重組蛋白質之存在。 另外，可使用視情況連同來自相鄰模組之一或多個相鄰胺基酸殘基或間隔開不同模組之連接子一起之標籤模組以引起目標個體中之可用作免疫性及/或免疫性持續時間之替代標記之特異性免疫上可檢測信號(例如抗體)。利用如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質進行免疫治療，引發目標個體之抗原-特異性，較佳過敏原-特異性免疫反應，其在暴露於自然存在之抗原，較佳過敏原後可與自然免疫反應定性區別。因此，結合至抗原模組之抗體不適用於成為iMAT誘導之免疫調節效應之效率的替代標記之目的。該障礙可藉由確定藉由C-端及/或N-端標籤模組(視情況連同相鄰胺基酸殘基一起)獲得的獨特抗原特異性免疫學信號來消除。因此，可相應地提供適宜之替代標記。
在一較佳實施例中，如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質進一步包含至少一個標籤模組，較佳至少一個His-標籤，其中該至少一個標籤模組較佳係存在於(經分離)重組蛋白質之N-端及/或C-端，更佳係緊跟一個甲硫胺酸殘基後面之N-端。
除此之外，如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質之模組，即，至少一個易位模組、至少一個靶向模組及至少一個抗原模組，可視情況由一或多個位於至少兩個該等模組之間之間隔模組間隔開。
該等間隔模組可尤其係肽序列或有機分子。相關技術中已知許多可用於本發明目的之間隔分子。此外，亦可使用將在將來出於本發明之目的而開發或發現的間隔分子。適宜之間隔模組尤其係肽間隔物、交聯劑、天然或合成聚合物(諸如(例如)核酸)、經取代或未經取代之烴等。
耦聯不但可藉由共價連接(較佳)而且可藉由非共價連接來發生。 間隔模組尤其具有使如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質之各個不同模組空間上彼此分離使得其等對彼此在其功能性方面無不良影 響之任務。用於本發明目的之(經分離)重組蛋白質之模組可藉由一或多個可藉由化學及/或酶促反應例如藉由蛋白酶裂解的間隔模組來偶聯。因此可視需要使如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質之經間隔模組連接的模組彼此分離。
然而，在一較佳實施例中，特定言之，假若抗原模組係衍生自至少一種抗原(係至少一種過敏原)之至少一個完全或部分抗原決定基之胺基酸序列，則在該第一、第二及/或第三模組之兩個或更多個相鄰模組之間根本不存在任何該等額外間隔模組，即，不存在額外間隔模組。
如本文所揭示並主張之(經分離)重組蛋白質之個別模組之任何期望之配置一般係可行的。各模組可一或多次地存在於(經分離)重組蛋白質中。最低要求係存在至少一個易位模組、至少一個靶向模組及至少一個抗原模組。額外模組諸如標籤模組、間隔模組等可視情況存在但並非必需存在。所有模組可一或多次地存在於如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質中。假若模組多於一次地存在，則其等可呈相同複本形式存在，或模組之不同變型可在各情況中呈單一複本或呈多於一個複本形式存在。相同類別之模組之完全不同的模組例如His-標籤模組及生物素-標籤模組亦可存於如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質中。這兩個模組在(經分離)重組蛋白質中功能上承擔相同的任務(標籤模組)，但並非必需在就其分子結構方面有共同之處。
在一較佳實施例中，該等模組中之一者之兩個或更多個複本可存於如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質中。即，可存在相同或不同抗原模組之兩個或更多個複本。或者，(經分離)重組蛋白質可包含兩個不同抗原模組以調節個體之免疫反應。
重組蛋白質中之抗原模組之兩個或更多個相同複本可(例如)對該相關抗原引起增強的免疫反應。兩個或更多個不同抗原模組可(例如) 經組合在一個(經分離)重組蛋白質中以同時地對兩個或更多個不同抗原調節免疫反應。兩個或更多個不同易位模組可用於如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質中。例如，Tat序列及VP22序列可用來使得易位更有效，此乃因(經分離)重組蛋白質之易位接著可有效地在更寬廣範圍的不同細胞類型或組織類型中發生。亦可(例如)使用兩個或更多個標籤模組於一(經分離)重組蛋白質中，例如，His-標籤及FLAG-標籤，在該情況中，例如His-標籤可用於分離重組蛋白質及例如FLAG-標籤用於檢測(經分離)重組蛋白質。可使用兩個或更多個不同靶向模組於一(經分離)重組蛋白質中，例如，衍生自MHC II分子之恆定鏈之序列，及使用甘露糖6磷酸基作為另一靶向模組。例如，恆定鏈充作進入MIIC中之靶向模組，及甘露糖6磷酸根基介導靶向進入溶酶體中，因此，可增加抗原呈現之效率或總體上藉由抗原呈現細胞呈現之抗原之不同抗原決定基之數量。此外，本發明之iMAT分子可包含兩條或更多條不同的源於相同或不同物種之恆定鏈，因此，容許將根據本發明之蛋白質用於不同物種中。
如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質中個別模組之位置亦可視需要改變，只要存在至少一個易位模組、至少一個靶向模組及至少一個抗原模組即可。(經分離)重組蛋白質之所有或某些模組亦可(例如)不是呈模組之線性連續配置形式存在，而是呈圓形或呈分支化模組結構形式或呈樹枝狀聚合物形式、或呈線性及/或分支化及/或圓形及/或樹枝狀聚合物分子部分之組合形式存在。存在表現載體之商業供應商，其可供應使得可藉由此等機制製得圓形融合蛋白質之特異性載體，諸如(例如)來自美國馬薩諸塞州比佛利New England Biolabs之IMPACTTM-TWIN系統。分支化模組可例如藉由從聚L-離胺酸開始，將一新離胺酸殘基附接至隨後離胺酸殘基各者之兩個游離胺基合成肽來製得。依此方式可建立具有實質上任何分支化程度之肽結構。接著 可於隨後合成(例如)易位模組及/或靶向模組至該分支化肽基本結構上。其他模組亦可藉由蛋白質接合耦合至線性、圓形或分支化肽基本結構上。亦可在肽合成期間將(例如)生物素基團引入至肽基本結構中，及可接著經由(例如)鏈黴親和素Strep標籤系統或經由PinPointTM系統(分別來自德國哥廷根IBA GmbH及美國加州聖路易斯奥比斯波Promega Biosciences Inc.)將模組附接至該等生物素基團。依此方式附接的模組接著經由非共價連接耦合至肽的基本結構。
在一較佳實施例中，如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質包含(較佳由)根據SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、14、17、20、21、22、23之胺基酸序列中之一或多者(組成)。
如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質尤其可用於明確解決治療及/或預防罹患昆蟲叮咬過敏反應(IBH)及/或蕁麻疹之馬的方法中。
昆蟲叮咬過敏反應可能是由引起個體全身反應之其他無害昆蟲唾液、毒液、身體部分、外分泌物或內分泌物誘導。實際上，IBH係一種痛苦的常見馬過敏性皮膚疾病及表現為通常因在世界各地發現的庫蠓屬昆蟲叮咬而引起的慢性復發季節性過敏性皮膚炎。IBH在全世界以不同名稱諸如甜癢、夏癢、夏疹、卡森(Kasen)、昆士蘭癢(Queensland itch)、季節性皮膚炎或庫蠓屬過敏反應報告。被感染的個體極癢且非常痛苦，及強烈地擦摩及啃咬自身。一典型臨床症狀係瘙癢症，飛蟲叮咬起泡，所起泡可能滲液，從而引起結硬皮、疥瘡及剝落。長時間的擦摩及啃咬尤其導致毛髮損失及損傷皮膚，有時伴隨潰瘍性出血。偶爾可發生二次細菌感染。馬擦摩掉其鬣毛及上尾毛亦並非不常見。長遠而言，可能發生皮膚增厚及毛髮損失之色素沉著。鬣毛及尾最常受感染；然而，具有嚴重症狀之馬可在整個身體之大部分區域上具有病灶。診斷係以臨床檢查及典型、季節性發生症狀為基 礎。對馬之IBH之病理生理學所知甚少。與其他物種相比，就皮膚之表現症狀而言過敏似乎顯著不同。因此，其對治療之回應亦不同，例如，組胺酸受體拮抗劑無法改善臨床症狀(Olsen等人，Vet.J.2011,187：347-351)。亦已使用過敏原特異性免疫治療(SIT)，在過去於馬之IBH方面並未取得成功(Ginel等人，Vet.Derm.2014,25：29-e10)。為解決該醫療問題，如本文所揭示並主張的IBH專用(經分離)重組蛋白質中之至少一個抗原模組係選自目前發現的自庫蠓屬(雙翅目：蠓科)之不同物種之蠓所分離的過敏原之群。另外，感染IBH的馬具有增加7.1倍的亦罹患蕁麻疹之風險[Kehrli D等人，J Vet Intern Med 2015,29(1)：320-326]。蕁麻疹(亦稱作「麻疹(hives)」/「風疹(nettle rash)」)之特徵係出現在皮膚中之離散型腫脹。該等離散型腫脹可係圓形斑塊、環形病灶，模擬馬蹄形或具有其他非尋常形狀。大多數病例係蕁麻疹之復發性、突然發作及在24至48小時或數天內自發地恢復。
有良好的證據證明存在與蕁麻疹相關聯之IgE介導過敏組分。然而，仍舊鮮少知曉病理生理學。在易感性個體，例如，罹患IBH及/或另外對環境過敏原易感皮膚過敏反應之馬中，直接的誘因可係昆蟲之叮或咬、膳食、藥物反應、草墊、化學品等。因此，成功的(例如)抗IBH之免疫治療可減少該等個體之復發性蕁麻疹之發生。
在另一實施例中，如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質尤其可用於明確解決治療及/或預防罹患復發性氣管阻塞(RAO)之馬的方法中。
馬之復發性氣管阻塞(RAO)(一種類似於人哮喘之呼吸系統疾病)係全球範圍內感染中年及老年馬肺之最常見確診病症之一。其亦稱作氣喘病、或慢性支氣管炎/細支氣管炎，或在早期時稱作慢性阻塞性肺部疾病。當在例如馬處於放牧飼養時的夏日存在時，使用術語與夏日放牧飼養相關聯之阻塞性肺部疾病或與夏日放牧飼養相關聯之 RAO。RAO為1型速發型過敏反應性過敏性疾病，其包括一系列典型事件，以反應抗體(主要係IgE)開始，導致肥大細胞去顆粒而致產生出組織胺及可共同用來誘導氣管發炎及可逆性氣管阻塞之其他化學介體。惡化期間所觀察到的臨床症狀可係嚴重及包括運動無耐力、咳嗽、流鼻涕及增加的休息時呼吸努力。診斷程序諸如肺功能測定、血液氣體分析或支氣管肺泡灌洗可提供額外關於疾病之資訊。典型治療僅涉及緩解性治療(例如支氣管擴張劑及/或腎上腺皮質類固醇)，但目前尚沒有病因治療可以採行(Leclere等人，Respirology 2011,16：1027-1046，Pirie,Equine Vet J 2014,46：276-288)。
目前已聲明利用克瑞拉細胞(Clara Cell)10kDa蛋白質(CC10)的治療可有效地保護或適用作罹患RAO的馬之被動式免疫治療。CC10係主要產生於人及動物之氣管上皮中之抗炎症防禦蛋白質家族成員之一。該發明述於US 2014/0105906中。
RAO係一種複雜疾病，但顯然地，暴露於空氣致敏原在病因方面起關鍵作用。通常藉由免除暴露於空氣致敏原來達成臨床緩解。然而，迄今為止尚未清楚地識別觸發RAO相關的主要抗原。許多可能的作用劑存於例如有機塵埃中，其主要呈馬廄或乾草塵埃存於關在馬廄中的馬中或存於另外與花粉有關的牧馬中(Leclere等人，Respirology 2011,16：1027-1046，Pirie,Equine Vet J 2014,46：276-288)。
可依照如本文中實例6及7中例示性且詳細地論述的生物資訊方法來選擇根據本發明之iMAT分子之抗原模組。依此方式可使得iMAT分子特別適用作例如用於治療及/或預防個體，較佳馬之RAO之疫苗。
在另一實施例中，如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質特別適用於明確解決治療及/或預防罹患由細菌引起之傳染性疾病之馬的方法中。
馬紅球菌(Rhodococcus equi)為引發肺及肺外化膿性肉芽腫性感染(馬紅球菌炎)之長在土壤中之致病原性放線菌。幼馬特別容易患病及發展為威脅生命之肺部疾病。然而，偶爾觀察到潰瘍性小腸結腸炎、骨髓炎及敗血性關節炎。已嘗試過許多免疫接種方法來預防小馬之紅球菌炎，沒有成功或僅有限成功。抗生素治療非一致性地有效且昂貴，及新近的研究已突顯抗抗生素菌株之出現。
感染主要係經由吸入帶有病原體之空氣塵埃。在進入至宿主中時，馬紅球菌在吸入後被肺中局部巨噬細胞(特別是齒槽巨噬細胞)吸收。其擴散而肺功能緩慢漸進性地損失，使得早期臨床診斷困難。早期臨床症狀通常僅由輕度發熱、偶爾咳嗽、或呼吸速率輕微增加(該增加可能不明顯，除非藉由處理使小馬運動或受壓)組成。另外，診斷並非那麼容易，目前，用於監測農場中地方性馬紅球菌肺炎之所推薦工具係分析白血球濃度及培養來自經氣管洗液之細菌並且藉由PCR或細胞學檢查從該材料識別出馬紅球菌(van Bargen,K及Haas,A.FEMS Microbiol Rev 2009,33：870-891，Vazquez-Boland,JA等人，Vet Microbiol 2013,167：9-33)。
為解決該醫學問題，如本文所揭示並主張的紅球菌炎專用(經分離)重組蛋白質中之至少一個抗原模組可選自衍生自馬紅球菌之抗原，例如，毒性相關聯蛋白質A(VapA)、免疫顯性表面表現脂蛋白、或其他表面蛋白質，其亦可衍生自受馬紅球菌感染的噬菌體。經改良之MAT分子可達成明確用作(例如)用於治療及/或預防馬紅球菌炎之疫苗。治療可能涉及投與iMAT分子給小馬及/或亦可包括根據本發明來治療懷孕母馬。
腺疫係馬感染之另一實例。腺疫，其特徵為頭頸部淋巴結化膿，係由馬鏈球菌(Streptococcus equi)引起及為最頻繁確診的馬傳染性疾病之一及仍亟需開發新穎預防性疫苗。
在另一實施例中，如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質特別適用於明確解決治療及/或預防罹患由病毒引起之傳染性疾病之馬的方法中。
非洲馬疫(AHS)係一高度傳染性且致命性疾病。其通常感染馬、騾及驢。其係由屬於呼腸孤病毒科(Reoviridae)之環狀病毒屬(Orbivirus)之病毒引起。AHS不是直接傳染，然而，已知係藉由昆蟲載體，主要藉由庫蠓、以及庫蚊、按蚊(Anopheles)及斑蚊(Aedes)擴散，或已描述藉由壁虱(例如璃眼蜱屬(Hyalomma)或扇頭蜱屬(Rhipicephalus))之傳播。迄今，尚無針對AHS之有效治療，就24小時的感染而言，受感染的馬中有接近90%主要死於呼吸衰竭。因此，對該疾病之控制仰賴於預防性疫苗接種。
西尼羅病毒(WNV)係屬於黃病毒科中黃病毒屬之日本腦炎病毒血清型群的經蚊傳播之正鏈RNA病毒。WNV為疾病症候群之致病物，亦稱作西尼羅發熱。鳥類係自然貯存宿主，及WNV在自然中維持蚊-鳥-蚊傳播循環。然而，當馬受感染時，其通常仍未被頻繁地識別出。馬因重度神經症狀(包括輕癱、失調、仰臥及肌肉顫動)而死亡或安樂死，其他馬展現輕度至重度腦脊髓灰質炎。WNV感染之診斷及證實可直接地藉由識別病毒或直接地藉由測試臨床樣本中之抗體來進行。然而，其通常受到馬之病毒血症之短持續時間及低程度妨礙。
在另一實施例中，如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質特別適用於明確解決防止馬之傳染性疾病經載體(例如食血蒼蠅、蠓、壁虱及/或蚊)傳播的方法中。
病原體連同包含多種生物活性分子之節肢動物唾液一起遞送至哺乳動物宿主之皮膚中。該等唾液組分可改變止血及免疫反應及可促成病原體建立感染之能力。食血節肢動物自身唾腺中傳染性微生物之存在會改變唾液組成，諸如，受感染蚊中腺苷三磷酸雙磷酸酶或抗凝 血酶之濃度改變。該等或其他抗原極適合用於根據本發明之iMAT分子之抗原模組中及可明確適用作用於活化宿主免疫系統以防止馬之經載體傳播傳染性病原體之疫苗。
在另一實施例中，如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質特別適用於明確解決治療及/或預防罹患由真菌引起之傳染性疾病之馬的方法中。
皮癬菌病或輪癬係發生在動物及人之毛髮及皮膚表面角質化細胞層之真菌感染。屬於親動物性或親土壤性皮癬菌病群組之小孢癬菌屬或毛癬菌屬之若干物種可引起動物之臨床感染。真菌及/或其孢子之多種表面抗原極適合用於根據本發明之iMAT分子之抗原模組中及可明確用作(例如)用於治療及/或預防馬之皮癬菌病之疫苗。
在另一實施例中，如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質特別適用於明確解決治療及/或預防罹患因寄生蟲引起之傳染性疾病之馬的方法中。
感染寄生蟲的馬無國界且在全球具臨床重要意義。威脅馬健康的主要寄生蟲係小型圓線蟲(cyathostomins)、馬蛔蟲(parascaris equorum)、葉狀裸頭絛蟲(anoplocephala perfoliata)、及尋常圓線蟲(strongylus vulgaris)。全球報告在馬寄生蟲中驅蟲藥耐藥性程度漸增。就原生蟲例如隱孢子蟲屬而言，很少藥物可始終抑制宿主中寄生蟲再現。主要係小馬受感染及結果仰賴於先天及適應性免疫反應。
衍生自成年寄生蟲之抗原及潛隱期(prepatent stage)為意欲用於根據本發明之iMAT分子之抗原模組之另一實例及可明確用作(例如)用於治療及/或預防馬之寄生蟲感染之疫苗。
特定言之，就調節馬之免疫反應而言，至少一個靶向模組較佳為馬恆定鏈，更佳係一或多個根據SEQ ID NO：2、15、16之胺基酸序列。
在一有利實施例中，如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質呈單體形式存在，此乃因(例如)重組引入之過敏原傾向於形成聚结物，尤其假若經由包含體產生。藉由取代(經分離)重組蛋白質之整體序列中之至少一個，較佳全部半胱胺酸殘基，較佳藉由取代為絲胺酸、白胺酸、異白胺酸及/或天冬胺酸，可防止形成分子間二硫鍵，因此，避免任何聚结，特定言之，避免任何非自然形成之分子間-及/或分子內鍵。即，整體缺乏半胱胺酸殘基之(經分離)重組蛋白質不会聚結。因此，蛋白質可輕易地表現及展現經改良之靶向及MHC呈现。
另外，(例如)過敏原之該等不含半胱胺酸之變體，其中野生型過敏原之胺基酸序列中之半胱胺酸殘基已單獨地或以組合方式突變，顯示與對應之野生型過敏原相比減低之IgE反應性且同時實質上保持對T-淋巴細胞反應性及因此具低致敏性。
本發明因此關於誘導馬之(例如)IBH之過敏原之該等低致敏性變體，其中在該等變體中，野生型過敏原之半胱胺酸殘基已單獨地或以組合方式突變。
另外，用於分離包含根據本發明之iMAT分子之樣品中蛋白質的標籤模組之存在，(例如)使用載鋅或載鈷固體擔體，進一步提高產生出融合蛋白質而不在純化製程期間聚结之可能性。典型地，標籤模組包括5至6個連續組胺酸殘基之聚組胺酸標籤。
如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質可用於醫藥組合物中。例如，(經分離)重組蛋白質係用於疫苗中。因此，本發明提供包含一或多種如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質之疫苗組合物。該疫苗組合物可治療上及/或預防上用於罹患昆蟲叮咬過敏反應(IBH)、蕁麻疹及/或馬復發性氣管阻塞(RAO)、由病原體誘導之傳染性疾病(例如紅球菌肺炎、腺疫、非洲馬疫、西尼羅病毒感染、皮癬 菌病)及/或消化道或其他器官之寄生蟲(例如隱孢子蟲病、蠕蟲及/或其潛隱期)之馬中。另外，該方法可不僅針對抗該等病原體使用，而且可用於活化宿主免疫系統以防止經載體例如食血蒼蠅、蟎、壁虱及/或蚊傳播。
因此，在本發明之一較佳實施例中，提供用於個體諸如馬之疫苗以治療及/或預防因對例如庫蠓及/或其他食血昆蟲之叮咬反應引起之IBH。另外，成功地抗IBH之免疫治療一般可減低對環境過敏原之皮膚過敏反應及因此可減低該等易感性個體之復發性蕁麻疹之發生。
在本發明之另一實施例中，提供用於個體諸如馬之疫苗以治療及/或預防因對例如黴菌(真菌及/或其孢子)、花粉、室內塵埃或飼料螨(及/或其孢子)反應引起之RAO。
在本發明之另一實施例中，提供用於個體諸如馬之疫苗以治療及/或預防與例如紅球菌屬、馬鏈球菌屬、環狀病毒屬、黃病毒屬、毛癬菌屬、小孢癬菌屬、隱孢子蟲屬及/或圓線蟲屬相關之傳染性疾病。另外，可提供疫苗以活化宿主免疫系統來防止疾病經載體例如庫蠓屬、庫蚊屬及/或硬蜱屬及/或其他食血昆蟲傳播。
(經分離)重組蛋白質之例如呈疫苗形式之醫藥組合物較佳經設計用於舌下投與、皮下及/或皮內注射、注射至淋巴結中及/或用於經黏膜，特定言之經胃腸道或呼吸系統之黏膜投與。
在本發明之一較佳實施例中，醫藥組合物係以非經腸方式投與。
根據本發明之iMAT分子可用作醫藥或用作疫苗來調節(例如)過敏性疾病。例如，昆蟲叮咬過敏反應(IBH)可藉由該等iMAT分子來治療。
少量(1至1000μg係指僅一或多個抗原模組之重量)包含誘導IBH之昆蟲例如庫蠓屬之過敏原的重組製得之iMAT分子，例如經皮下、 經皮內或直接注射至淋巴結中1至5次，引發馬之強力且持久免疫反應，從而導致舒緩臨床症狀。
在一較佳實施例中，本發明之iMAT分子係以與至少一種佐劑組合方式投與。該佐劑包括(但不限於)以下中之一或多者：明礬、BCG、氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鈣、脂質乳液、脂質或聚合奈米-或微球體、膠束、脂質體、皂苷、脂質A、或胞壁醯二肽、細菌產物、趨化激素、細胞激素及激素、甲殼素、澱粉、海藻鹽、纖維素衍生物(例如，乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素)、核酸、或核酸構築體。可添加該等組分中之一或多者以增進或改良免疫反應。或者，iMAT分子可在不含佐劑下或呈水溶液形式投與。
iMAT分子可以約1μg至1000μg(該劑量及隨後的劑量係指僅一或多個抗原模組之重量)之劑量及更佳以約10μg至約100μg之劑量及甚至更佳以約20μg至約50μg之劑量投與，然而，最佳劑量可根據注射的抗原(較佳係過敏原)、個體體重、個體之免疫系統等改變。在許多情況中，有效之治療可藉由一次投與來實現。在一些實施例中，治療包括1至15次投與。在較佳實施例中，治療包括1至5次投與及更佳包括1至3次投與。就初始治療而言，投與可例如在數天中定期進行，每月或每年一次或兩次、或每年數次。就維持免疫反應而言，投與可以數月至數年之時間間隔進行。
在本發明之一較佳實施例中，如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質係經設計用於淋巴結內投與。在直接注射至淋巴結中之過程中，各別淋巴結可在注射程序期間例如藉由超音波可視化，以監測針頭位置及淋巴結改變(諸如腫脹)。注射至下頜、腋、腹股溝及/或膕肌淋巴結中較佳，此歸因於便於超音波導引定位及注射。
相關技術中已知食血昆蟲唾液中有若干(>20)種識別的蛋白質誘導馬之IgE反應性及病理皮膚反應[Schaffartzik,Veterinary Immunology and Immunopathology 2012,147：113-126；Allergome (www.allergome.org)]。因此，預期治療可僅在大多數相關過敏原包含於用於特異性免疫治療之藥物中之情況下成功。然而，驚人地，根據本發明之各包含(例如)昆蟲唾液之不同抗原模組或僅抗原決定基之似鑲嵌結構之該等iMAT分子中僅1個、2個、3個或4個足以引起患病個體之免疫調節及/或臨床改善，假若該等iMAT分子經皮下、經皮內及/或直接注射至淋巴結中1至5次。
在一較佳實施例中，單一iMAT分子經使用且足以誘導治療效應及/或預防發展出馬之昆蟲叮咬過敏反應(IBH)、蕁麻疹及/或馬復發性氣管阻塞(RAO)。
在另一較佳實施例中，2個、3個或4個iMAT分子之組合係藉由同時、連續及/或時序交錯地共同投與進行使用。
在一較佳實施例中，單一iMAT分子經使用且足以誘導治療效應及/或預防及/或防止馬之傳染性疾病(例如紅球菌肺炎、腺疫、非洲馬疫、西尼羅病毒感染、皮癬菌病及/或消化道或其他器官之寄生蟲例如隱孢子蟲病、蠕蟲及/或其潛隱期)傳播及/或該等傳染性疾病藉由例如食血蒼蠅、蠓、壁虱及/或蚊傳播。
在另一較佳實施例中，2個、3個或4個iMAT分子之組合係藉由同時、連續及/或時序交錯地共同投與進行使用。
端視如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質之熱動力評估而定，穩定性受到半胱胺酸突變(即，不同胺基酸殘基之取代)影響。例如，該取代可係Cys或Ser取代。然而，使用除Ser胺基酸外之不同胺基酸殘基，穩定性可更高以達成期望之穩定性及溶解性。即，儘管第一選擇可係改由Ser取代Cys，然而，在不穩定性之情況下，應改由除Ser外之其他胺基酸殘基置換Cys。
為選擇穩定胺基酸殘基作為標靶序列中半胱胺酸之替代，選用 三步方法：
1.將包含末端六聚組胺酸標籤、iMAT序列及受關注蛋白質之一級胺基酸序列之靶向蛋白質之三級結構模型化。模型化可利用天然序列且併與半胱胺酸取代來進行。
2.基於單點取代，諸如改由一不同胺基酸殘基例如Ser及/或Ile取代半胱胺酸殘基來反覆測定蛋白質穩定性，及評分以藉由分析所有可取得的三維結構來確定穩定之替代。
3.再模型化經穩定結構及藉由重複步驟1及2驗證穩定性。
三維蛋白質結構對於在分子水平上明瞭蛋白質功能具關鍵性且對於許多不同類型之生物實驗諸如定點突變產生之合理設計受到極大關注。然而，經結構表徵之蛋白質之數目與已知蛋白質序列之數目相比很小。對於給定蛋白質序列(標靶)，可識別具有已知結構之同源蛋白質(模板)。在該等情況中，已證實同源模型化係選擇性地自蛋白質之一級胺基酸序列產生出其可靠3D模型之方法。建構同源模型，包括四個主要步驟：(1)識別結構模板，(2)將標靶序列及模板結構比對，(3)建構模型及(4)模型品質評估。可重複該等步驟直到達成令人滿意的模型化結果。在無法確定準確同源模型之情況中，使用計算方法以自一級結構(胺基酸序列)確定蛋白質結構。「重新(De novo)」或「從頭開始(ab initio)」方法係基於物理原理及嘗試模擬折疊過程。該等方法必須對大量構形取樣及需要極準確能量函數以識別在總體自由能最小之結構。許多方法利用該等所述原理之組合。
產生合理地準確估計胺基酸取代對蛋白質之穩定性影響的計算工具之可利用性在寬廣範圍應用中具關鍵重要性。特定言之，該等工具具有刺激並支持專門用於產生出改質蛋白質之蛋白質工程及設計工程之潛力。
可在就可逆地快速去折疊及再折疊之蛋白質之熱動力穩定性方 面考慮蛋白質穩定性。在該等情況中，蛋白質之穩定性係折疊及去折疊狀態之間的吉布斯(Gibbs)自由能差。影響穩定性之唯一因素係折疊及去折疊狀態之相對自由能。折疊自由能差越大且為越大的正值，則蛋白質之變性更穩定。折疊自由能差通常很小，對於球蛋白而言，係在5至15kcal/mol級別。然而，另一方面，蛋白質穩定性可被認為是耐受苛刻溫度或溶劑條件之蛋白質性質。此與熱動力穩定性相關然亦與折疊/去折疊之可逆性或不可逆性(動力學穩定性)相關。
為預測因蛋白質中單點取代引起之熱動力穩定性改變，可應用數種不同方法以研究該等取代對蛋白質結構及功能之影響[Pires DE等人，Bioinformatics 2014,30(3)：335-342]。該等方法可大致被歸類為彼等尋求明瞭自僅蛋白質之胺基酸序列取代之效應者、及彼等利用大量結構資訊者。基於結構之方法通常嘗試基於取代或實際自由能值(ΔΔG)中來預測蛋白質穩定性改變。
就特定取代出現的次數而言使用評分系統對各特異性蛋白質及其對應模型之結果作統計分析，該評分系統係基於在使用的模型中之出現及蛋白質穩定性自由能改變(ΔΔG)而對取代評級，因而確定輸入結構及可能取代中最不穩定的殘基(若有的話)。藉由測定各模型中受關注各位置處之最低ΔΔG(ΔΔG<0)及對各可能取代位置指派對應之線性值及累積ΔΔG值來計算分數且接著評估結果以確定模型之間之一致性。由於經過計算的蛋白質模型具有不同品質(預測正確三維結構之可能性)，故可實施加權因子以優先排序更準確模型之結果。明顯(基於ΔΔG而言)不穩定之殘基(若有的話)經取代；產生出新穎模型且反覆再分析直到達成穩態。藉由通過主要組分分析法分析xyz座標來評估額外產生出的模型以確定由於在特定位置取代胺基酸所致之可能結構錯誤折疊。
在又一態樣中，本發明基本目標已驚人地藉由提供一種識別預 定胺基酸序列中之胺基酸取代使得該等預定胺基酸序列穩定之方法得以解決，該方法包括以下步驟：(i)將標靶預定胺基酸序列之三維/三級結構模型化，(ii)基於單點取代，諸如改由不同胺基酸殘基，較佳絲胺酸及/或異白胺酸殘基取代半胱胺酸殘基來反覆確定蛋白質穩定性，及基於蛋白質穩定性自由能改變(ΔΔG)之評分系統藉由分析所有可取的三維/三級胺基酸序列結構來確定穩定之取代，(iii)將經取代之三維/三級胺基酸序列結構再模型化及藉由重複步驟(ii)及(iii)來計算得其穩定性直到達成穩態。
在又一態樣中，本發明基本目標已驚人地藉由提供如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質得以解決，其中其完全或部分胺基酸序列係藉由如本文所揭示並主張的識別預定胺基酸序列中之胺基酸取代之方法而穩定化(參見本文中實例5)。
實例
下列實例用來進一步說明本發明，但其不應解釋成限制本文所揭示之本發明之範疇。
實例1-免疫性/免疫性之持續時間之替代標記
投與如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質給馬，而對存於抗原模組中之過敏原及/或抗原決定基產生出免疫學反應。另外，可使用C-或N-端標籤模組連同來自相鄰模組之相鄰胺基酸殘基一起以檢測可用作用於免疫性或免疫性持續時間之替代標記的目標個體中獨特的產物特異性免疫學信號(例如，抗體-或T-細胞反應)。作為治療特異性免疫學參數，該替代標記可實現評估投與後之免疫性或免疫調節或免疫性持續時間或免疫調節持續時間。因此，用於由根據本發明之(經分離)重組蛋白質所觸發之免疫反應之特異性指示係誘導末端-標籤(視情況與相鄰胺基酸殘基)特異性抗體，諸如IgG抗體。或者或另 外，指示係誘導對間隔物及如本文所揭示並主張的模組之接合或兩個模組之間之接合特異性之抗體。
實例2-低致敏性
準備罹患IBH的馬之新抽取的血液以測試對如本文所揭示並主張的(經分離)重組蛋白質/iMAT分子之嗜鹼細胞反應性。此可藉由Kaul之改良方法[Kaul,S.,1998.Type I allergies in the horse：Basic development of a histamine release test(HRT).Doctoral thesis.Veterinary School Hannover，德國]來測定。簡言之，iMAT分子及/或重組過敏原之10倍稀釋系列(例如，範圍自10nM至0.001nM最終過敏原濃度)係在PIPES緩衝液(AppliChem，德國達姆斯塔特)(pH 7.4)中製得。在37℃利用個別稀釋液培養自Na-EDTA凝結抑制之血液獲得的經洗滌之紅血球及白血球1小時。藉由在冰上培養20分鐘停止反應及在離心之後自各樣品收集包含所釋放組織胺之上清液。藉由在水浴中煮沸血液細胞維持10分鐘，獲得最大組織胺含量(最大釋放)。以經洗滌之血液細胞培養釋放緩衝液充作陰性對照組(自發釋放)。使用競爭性RIA(LDN Nordhorn，德國)按照製造商指示來測定組織胺濃度。
或者，另一嗜鹼細胞活化測試係細胞抗原刺激測試CAST® ELISA，其亦可被視為是活體外過敏激發測試。根據製造商指示(Bühlmann Laboratories AG，瑞士阿勒斯海姆)來進行此試驗。在CAST®中，自過敏個體血液沉澱出的白血球同時地底塗細胞激素IL-3及藉由iMAT分子及/或重組過敏原刺激。嗜鹼細胞尤其產生出過敏性介體、硫化白三烯(sulfidoleukotriene)LTC4、及其代謝產物LTD4及LTE4。於隨後以ELISA測試法(酶聯免疫吸收分析法)測定該等新合成的硫化白三烯(sLT)。
可利用該等試驗，藉由僅比較iMAT分子(包含過敏原)及僅各別重組過敏原之效應來活體外評估iMAT分子引起不良事件例如作為投 藥之副作用激發過敏性反應之可能性。
與重組過敏原相比，藉由iMAT分子之減低之嗜鹼細胞去顆粒(例如，組織胺及/或硫化白三烯釋放)，顯示不良效應之較低可能性，即，iMAT分子之安全性特性更佳。
該HRT(或CAST®)可用作用於馬之1型過敏反應之活體外激發測試。過敏原特異性組織胺釋放指示各別過敏原針對嗜鹼細胞活化之相關性及因此可用作用於個體之過敏原特異性敏化之定量參數。
就先前技術中所述之MAT分子而言，在細胞抗原刺激測試(CAST)分析及真皮內及皮內測試中證實與對應之天然過敏原(Fel d1)相比之低致敏性[Senti G等人，J Allergy Clin Immunol.2012,129(5)：1290-1296]。過敏原及包含Fel d1之MAT分子之間之敏感性定量差異分別為100、23及16倍。儘管MAT-Fel d1清楚地係低致敏性，但保留部分過敏性。
關於本發明，測試2種根據本發明製得之在抗原模組中分別包含Cul o2及Cul o3之iMAT分子之安全性。在如上所述之組織胺釋放測試(HRT)中使用罹患IBH的多重敏化馬之新抽取的血液。
如圖10中所顯示，天然過敏原誘導強力之組織胺釋放，然而，驚人地，這兩種不同iMAT分子(iMAT-Cul o3及iMAT-Cul o2)顯示實質上根本沒有反應。因此，iMAT分子與如先前技術中所述之MAT分子(參見上述)相比顯示在就安全性方面之明顯優勢。
可預期假若罹患IBH的馬藉由該等iMAT分子處理，則不發生與過敏原相關的不良反應。
與MAT分子不同，iMAT分子之該驚人安全性特性之結果是，用作脫敏蛋白質之iMAT分子可類似於抗病原體疫苗使用。不需要擴大典型治療性過敏原之劑量，此乃因包含iMAT分子之疫苗不顯示在就過敏不良事件方面之過敏原性質。治療過程中iMAT分子之首次注射 劑量可已經僅基於療效考量來選擇而不須要考慮可能的過敏不良反應。此不可使用先前技術中所述之MAT分子來進行，此乃因與天然過敏原相比MAT之過敏性僅減低至特定水平。然而，MAT分子仍舊是過敏原；相反地，iMAT分子不是。該等改良之性質之優點係可藉由例如以高生物醫藥含量三次皮下或經淋巴注射(例如，3次，20μg至50μg iMAT蛋白質)實現更有效之治療療程。
所測試的這兩種iMAT分子之致敏性之缺乏可由與先前技術中所述之MAT分子不同不使用連接子胺基酸殘基[即，介於第一、第二及/或第三模組之間之間隔模組]以分離該等iMAT分子中之不同模組之事實來解釋。先前技術中已知包含兩種或更多種經肽或蛋白質連接子接合之功能性多肽之改造融合蛋白質對於蛋白質之功能(例如，藉由免疫系統識別抗原決定基)具重要作用[Klein JS等人，Protein Eng Des Sel.2014,27(10)：325-330]。功能性單元之間之分離距離可影響抗原決定基進入及以抗體親抗原性結合能力。假若模組之間，特定言之靶向域與抗原模組之間缺失胺基酸殘基連接子，則獲得更剛性的結構，可能因不正確折疊而無法形成過敏原模組之構形抗原決定基。必需使嗜鹼細胞(例如IgE)表面上以其高親和力受體結合的抗體交聯以引發活化及組織胺釋放。然而，錯誤折疊的過敏原可能無法引發該交聯。因此，不含連接子之iMAT分子可不形成構形IgE抗原決定基，此使得iMAT分子具非致敏性。
實例3-過敏原/生物標記之電腦模擬檢測
如本發明在IBH方面之敘述中詳細地描述，尚未描述引發IBH之主要過敏原，可使用針對靶向IBH之iMAT抗原模組之生物資訊工程來電腦模擬評估某些過敏原之相關性(參見本文中實例6)。例如，如圖8所顯示，Cul o3之電腦模擬及活體外功能性HRT測試結果似乎顯示Cul o3為主要過敏原。經測試的大多數馬(然非全部)顯示明顯的抗Cul o3 過敏反應。
此點令人驚訝，如在其他實驗中，例如，藉由van der Meide等人(Vet J 2014,200：31-37)，不同重組過敏原在其針對疾病相關性中不可區分：罹患IBH的馬中有約80%至90%顯示對所測試過敏原各者敏感。
因此，驚人地，在本發明之過程中，可證實Cul o3(i)事實上為IBH之主要過敏原(即，>50%的動物敏化)及(ii)與其他過敏原相比具卓越相關性。
除用於iMAT抗原模組中外，各別過敏原亦可用於藉由在開始治療前研究抗該過敏原之過敏反應之強度使得治療成就最佳化。及在整個治療過程中，可監測免疫系統之不同組分之過敏原特異性調節，例如，過敏原特異性IgE及IgG抗體效價之改變可指示治療及/或預防效應。
因此，電腦模擬檢測到的過敏原及/或各別過敏原特異性免疫球蛋白可用作診斷及/或治療診斷生物標記。
實例4-馬之IBH之治療性疫苗/預防
根據本發明之包含不同抗原模組之單一iMAT分子或iMAT分子之組合可用於預防性或治療性地治療罹患或意欲處在引起IBH之昆蟲叮咬風險中之馬。根據本發明之iMAT分子可投與至馬之下顎下淋巴結中(Landholt等人，Vet Rec 2010,167：302-304)。簡言之，夾住位於淋巴結上之毛髮及做好手術準備。使用觸診及/或超音波引導，將25G針頭插入至淋巴結中。注射的iMAT分子被吸附至佐劑。佐劑係由(例如)磷酸鋁組成(Adju-Phos®，Brenntag Biosector，丹麥)。iMAT分子原液為小瓶中之375μg/mL蛋白質濃度之冷凍溶液，各小瓶裝納500μL，意欲在使用前解凍。
在解凍iMAT分子溶液後，取400μL溶液與例如200μL磷酸鋁凝 膠懸浮液混合。讓該最終調配物在室溫下靜置60分鐘再經淋巴內注射以容許iMAT分子吸附至Adju-Phos®，例如，將200μL之包含50μg iMAT分子之混合物移至500μL針筒中以用於淋巴結注射。通常在第0天、第28天及第56天以每次注射介於20μg與50μg(係指僅一或多個抗原模組之重量)之間之劑量及iMAT分子首次投與該製劑。
在整個治療期中及/或於此後，可臨床上藉由定量、半定量或定性評估皮膚病灶(例如，斷髮、掉髮、結殼/磨砂及濕區域)來研究治療或預防IBH之療效。可對磨砂/癢之強度評分。
可將該等臨床參數與先前IBH季節中個別馬之臨床症狀及/或在開始治療干預前之嚴重度進行比較。或者，與未經治療或經安慰劑治療之感染IBH的馬之比較證實iMAT分子介導之治療及/或預防IBH之臨床症狀的療效。
(例如)利用HRT或CAST®(關於細節請參見上述實例3)，該等馬之新鮮血液可用於馬之1型過敏反應之活體外激發測試。與iMAT分子投與前相比在iMAT分子投與後回應於某些庫蠓過敏原之挑戰，嗜鹼細胞去顆粒減低，例如組織胺及/或硫化白三烯釋放指示治療及/或預防效應。
或者或另外，利用某些庫蠓過敏原之真皮內激發測試[Langner等人，Vet Immunol Immunopathol 2008,122(1-2)：126-37]可用於該等馬中。減低之反應(速發及/或後期階段反應性)指示iMAT分子投與之治療及/或預防效應。
另外，可監測免疫系統之不同組分之調節，例如，過敏原特異性IgE及IgG抗體效價之改變可指示治療及/或預防效應。
利用該等iMAT分子治療馬之IBH時，除了IgE含量改變外，可驚人地發現過敏原特異性IgG之增加。該等抗體可阻斷活體內IgE介導之過敏性反應及似乎不僅抑制過敏原引發之發炎介體自嗜鹼細胞及肥大 細胞釋放，而且抑制IgE介導之過敏原對T細胞呈現。在iMAT引起之特異性結合至過敏原之IgG抗體中，已表明一些過敏原特異性亞型發揮重要「保護」作用，此乃因其等與過敏原特異性IgE抗體競爭及可藉由抑制IgE介導之抗原呈現來防止活化CD4+T細胞。另外，所分泌的IgG子集促使肥大細胞及嗜酸細胞顯著減少，伴隨著發炎介體減少釋放[Senna G等人，Curr Opin Allergy Clin Immunol.2011,11(4)：375-380]。
如藉由抑制FcεRI依賴性嗜鹼細胞組織胺釋放測定之血清「阻斷」IgG活性[Niederberger V等人，Proc Natl Acad Sci U S A 2004,101：14677-14682]及/或抑制FcεRII(CD23)依賴性IgE-過敏原複合物與B細胞結合之功能分析似乎可更好地預測個別臨床反應(Wacholz PA等人，J Allergy Clin Immunol 2003；112：915-922)。
過敏原特異性免疫治療可調節免疫系統之不同組分。細胞修飾由減低過敏原引起之T-細胞增殖所組成，指示誘導過敏原特異性T細胞中之外周耐受性及抗原特異性Th2主導之免疫反應之減低，隨著IFN-γ生成增加有利於Th1反應(Durham SR等人，J Allergy Clin Immunol 1996,97：1356-1365)。負責配位此免疫學切換之重要細胞類型為異質T-細胞群體，稱作調節T細胞(Treg)。在細胞層級上，成功的過敏原免疫治療之關鍵因素係1型Treg細胞之外周誘導。對在識別抗原上具特異性之1型Treg細胞之功能性研究顯示，藉由1型Treg細胞來調節Th1及Th2反應主要取決於具有免疫抑制特性之細胞激素IL-10之分泌。事實上，IL-10抑制外周T細胞抗特異性過敏原之增殖反應且在誘導T細胞無反應性中具有重要作用(James LK、Durham SR,Clin Exp Allergy 2008,38：1074-1088)。活體外IL-10增進調節因子FoxP3之表現，調節嗜伊紅血球功能及減少由肥大細胞釋放之前發炎性介體(Mobs C等人，Int Arch Allergy Immunol 2008,147：171-178)。
經該等iMAT分子介導之免疫治療之傑出臨床療效之另一可能標記係檢測過敏原特異性T細胞之數量或性質之改變。基於(例如)Bet v1四聚物染色研究之基礎上，循環樺樹花粉特異性CD4+T細胞之含量及特性可潛在性地在SIT之前及之後進行比較(van Overtvelt L等人，J Immunol 2008,180：4514-4522)。最近，轉變生長因子(TGF)-β亦已識別為成功SIT中之重要細胞激素。諸多作用可說明其相關性，諸如，特異性Th1、Th2及Th17細胞之抑制、FoxP3之誘導及Tregs之功能抑制。此外，TGF-β下調蘭格罕(Langherhans)細胞上之FcεRI表現及抑制IgE合成(Akdis CA,Akdis MJ,Allergy Clin Immunol 2009,123：735-746)。
實例5-根據本發明之iMAT分子與根據WO 2004/035793(US同等案US 2005/0281816)之先前技術MAT分子之間的比較
就評估MAT蛋白質之純度而言，已建立十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測試程序(Thompson J等人，J Biol Chem 2002,277：34310-34331)。該方法包括利用還原劑十二烷基硫酸鋰(LDS)製備樣品及在75℃下加熱，在電泳分離後產生可再現多條明顯譜帶。在負載有200至1000ng蛋白質之凝膠中利用考馬斯藍(Coomassie blue)染色可提供線性定量(密度測定法)特徵。使用單株抗體，在具有Fel d 1作為過敏原模組之MAT分子(MAT-Fel d1)中檢測過敏原模組，已顯示主要譜帶及13條次要譜帶均包含MAT-Fel d1蛋白質。小型譜帶亦在重新裝載於凝膠上之後遷移到如在初始凝膠上之相同位置(圖2)。在PAGE之前用於製備樣品之數種不同方法，諸如不同溫度及緩衝劑組合物方案產生出相同譜帶圖譜。
在所有該等譜帶中，在各譜帶從凝膠中切出之後，藉由胰蛋白酶消化及於隨後藉由質譜法(nanoLC/ESI-MS)分析，可證實存在全長(完全)MAT-Fel d1蛋白質及僅微量的宿主細胞蛋白質。從該等實驗可 得出結論SDS-PAGE中MAT-Fel d1之例如不同折疊變體之異常特徵(凝膠移位)。此意指所分析之製劑中之MAT-Fel d1不適合用作特定言之用於臨床及/或商業生物醫藥製造之生物醫藥分子，此乃因其純度不可用標準方法(例如SDS-PAGE)來測定，而僅可藉由上文所闡述的改良程序測定。
與該MAT-Fel d1分子之凝膠移位現象不同，Fel d1本身不顯示SDS PAGE中之該異常特徵(圖3，泳道2及3)。Fel d1在預期分子量(19.6kD)下呈現單一明顯譜帶。
可在RP-HPLC分析中觀察到另一異常特徵。在該分析方法中未見到MAT-Fel d1之單峰(圖4)，在蛋白質之天然構形中或在藉由離液及還原條件誘導之變性形式中咸未看到。然而，就經GMP驗證之生物醫藥製造而言，所銷售醫藥製劑中生物分子之單一同功異型物係強制性的。
SDS-PAGE及RP-HPLC分析中之該等觀察結果可藉由基於胺基酸序列之物理化學性質來解釋。Kyte及Doolittle疏水性圖分析[Kyte J、Doolittle RF,Journal of Molecular Biology 1982,157(1),105-132]顯示相鄰極端疏水性及親水性域(圖5)，此可造成此異常行為結果。
特定言之，融合蛋白質之靶向域之疏水性區域類似於相關技術中已知可引起該異常特徵之膜蛋白之跨膜片段[RathA等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2009,106(6)：1760-1765]。
SDS-PAGE上與式之分子量無關聯之遷移(稱作「凝膠移位」)顯示對於膜蛋白而言常見。此意指僅根據其分子量分離分子而與其天然2D-或3D結構無關之SDS-PAGE方法之先決條件不適用於該等情況。 在上文引述之著作(PNAS文章)中，作者使用衍生自人囊性纖維化跨膜傳導調節子(CFTR)之跨膜片段3及4之野生型及突變體螺旋-環-螺旋(「髮夾(hairpin)」)序列庫(包括疾病-表型殘基取代)，來研究螺旋狀 膜蛋白之異常凝膠遷移。其等發現該等髮夾以相對其實際式之分子量-10%至+30%之速率在SDS-PAGE上遷移及以範圍自3.4至10g SDS/g蛋白質之比裝載清潔劑。其等另外證實突變體凝膠移位與髮夾SDS裝載能力改變、及髮夾螺旋度有強烈相關性，指明凝膠移位行為源自於清潔劑結合之改變。在某些情況中，此藉由SDS之差別性溶劑化作用可能由於蛋白質-清潔劑接觸改為蛋白質-蛋白質接觸替代所引起，此意味著清潔劑結合及折疊緊密地聯結。
MAT及iMAT蛋白質之SDS PAGE(圖6)及RP-HPLC分析(圖4及7)分別顯示遷移圖譜或洗脫方面之實質差異。MAT-Fel d1之氧化形式沒有顯示SDS-PAGE凝膠上單一明顯譜帶(泳道3)，然顯示若干離散的具有比MAT-Fel d1之實際分子量32.2kD更大及更小表觀分子量之譜帶。相反地，iMAT-Cul o4在氧化條件下展現單一明顯譜帶(M=41.6kD)。此外，RP-HPLC層析圖顯示單一峰(圖7)。
在還原條件下，SDS-PAGE中之MAT-Fel d1顯示大約在已知分子量處遷移之主要譜帶，但此外圖2中所述已知包含MAT-Fel d1之完全序列之某些次要譜帶再次出現(圖6，泳道6)。此係一表徵MAT-Fel d1之異常特徵之屬性。另外，MAT-Fel d1在還原條件下之RP-HPLC層析圖(圖4，右圖)顯示MAT-Fel d1之至少3種不同同型物。相反地，iMAT分子顯示明顯指示SDS-PAGE(圖6，泳道7)及RP-HPLC(圖7)中之單一同型物之特徵。
該等還原條件導致MAT分子中之二硫鍵裂解，因此，MAT及iMAT分子在還原條件下的行為應相似，假若二硫鍵係唯一造成MAT之異常特徵之原因。然而，此並非係該種情況，此乃因在還原條件下仍舊存在MAT分子之異常凝膠移位及在RP-HPLC中出現同型物。
然而，呈蛋白質之天然(氧化)形式之iMAT分子不顯示該凝膠移位但在RP-HPLC層析圖中展現峰值。另外，MAT及iMAT分子之Kyte- Doolittle圖(Kyte,J.及Doolittle,R.1982.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein.J.Mol.Biol.157：105-132)在涵蓋His-標籤、TAT及靶向域之序列的N-端處幾近相同(圖11)。 因此，熟習此項技術者將不欲依照先前技術改由其他胺基酸殘基取代半胱胺酸殘基以克服先前技術之缺點來建構MAT分子。
所產生的三種iMAT分子已藉由依照以下實例6之「生物資訊工程」程序進行建構及藉由在大腸桿菌中之重組表現技術產生出。所有這三種iMAT分子在凍融兩次後於緩衝液(20mM檸檬酸鹽、1M精胺酸，pH 6.0)中穩定及可吸附至作為佐劑之Adju-Phos®(Brernntag，丹麥)，使得該等iMAT分子可用作疫苗。該等蛋白質可自Adju-Phos®解吸附而不在相同緩衝液系統中降解(圖9)。
實例6-靶向馬之IBH之iMAT分子的「生物資訊工程」
為(例如)有效地使用iMAT技術來治療罹患過敏性昆蟲叮咬過敏反應(IBH)之馬，進一步地強制以：a)將庫蠓蛋白質選作iMAT分子中之過敏原模組，其係主要過敏原及因此高普遍性地在受感染的馬中引起過敏反應及因此亦可係用於耐受性誘導之標靶，及b)建構具有該等主要過敏原之iMAT分子，其係熱力學穩定且可有效地藉由蛋白質工程製得且可另外利用標準方法分析以確保足夠的品質(即，同一性、純度及效力)。
為滿足該等要求，選擇一種生物資訊方法以選擇欲包含於根據本發明之iMAT分子中之過敏原。選擇之目標係(i)選擇一或多種預期具IBH相關性之過敏原(即，罹患IBH之馬中大多數對各別過敏原敏感)，及(ii)選擇具有最高概率的包含過敏原特徵之線性抗原決定基之過敏原，亦即，彼等已公開的過敏原之包含最大數目之短肽序列(7至13個胺基酸殘基)之同系物。
目前，已知來自庫蠓屬(沙諾氏庫蠓(Culicoides sonorensis)、云斑庫蠓(Culicoides nubeculosus)、不顯庫蠓(Culicoides obsoletus))之在唾液中發現的約230種蛋白質可潛在性地引起個體例如馬之過敏。為選擇用於醫藥製劑之適宜抗原，選擇基於與已知非庫蠓過敏原的局部序列比對的同源性比較。通常，用於抗體識別之抗原決定基(主要是構形抗原決定基)之檢測係藉由功能性分析(例如肽微陣列)來達成或T-細胞抗原決定基(線性抗原決定基)之檢測係藉由計算與MHC分子之肽結合概率來達成。iMAT技術之治療原理尤其是以內囊胞中酸依賴性蛋白酶之內吞及降解接著MHC II類結合及抗原呈現為基礎。目前馬中該等系統之特徵並未全面地進行探討，此乃因與人系統相比對馬MHC基因之對偶基因多樣性的研究少得多且因此實驗上無法輕易地取得。另外，僅在最近開始對呈I類過敏之IBH及誘導症狀之病因性過敏原進行研究。直到2008年才描述特徵為效應細胞(即，嗜鹼細胞粒細胞)中過敏原活性之第一蛋白質[Langner等人，Vet Immunol Immunopathol 2008,122(1-2)：126-137]。
因此，選用一種不同的用於過敏原選擇之非實驗但生物資訊方法，該方法以相對已知非庫蠓過敏蛋白質對衍生自庫蠓蛋白質之肽進行局部同源性研究為基礎，已知其中的大多數可增進人過敏。從可公開取得的資料庫(例如UNIPROT)匯出疑似具有致敏性質之蛋白質胺基酸序列及藉由分析所匯出資料集中之序列同源性來確定豐餘性。消除高度同源序列對應物及所得的其餘序列充作可能有效抗原之正規序列資料庫用於隨後分析。為確定具有推定高致敏可能性之庫蠓蛋白質，將蛋白質電腦模擬裂解成具有6至15個胺基酸長度之肽，其中一個胺基酸移位。接著，在各庫蠓蛋白質及對應肽與正規序列資料庫之間進行局部逐對比對。於此之後，藉由設定給定庫蠓蛋白質相對一者之自比對評分及相應地對應肽之比對擊中來進行所獲得比對擊中之縮放。 接著，對各肽計數超出給定臨限值之比對擊中數量及以局部逐對比對方式與不具有已知致敏性質之隨機產生的蛋白質序列資料庫進行比較，及於隨後縮放並計數。所得「非過敏性蛋白質」計數係從過敏原結果之其等計數被減去及基於所有對應肽之擊中數量來計算得各庫蠓蛋白質之累積擊中評分(圖12)。具有最高計數之蛋白質選作候選iMAT抗原模組。
就驗證生物資訊抗原選擇方法而言，在13隻罹患臨床確診之IBH之馬中測量抗5種庫蠓過敏原之敏化發生。在半定量功能性活體外實驗中，以釋放自血液樣品分離的馬嗜鹼細胞之過敏原特異性組織胺為基礎，來測試所有選定抗原(組織胺釋放測試=HRT，試驗之詳細內容：參見實例2)。以3種濃度測試重組過敏原及各過敏原之評分值範圍在0(無敏化)至6(最高敏化)之間。將所有13隻馬之資料與生物資訊計算結果比較(圖8)。該分析顯示敏化(每一過敏原群組之總體評分值)與預測評分之間之極佳總體相關性(r=0.97)。從該相關性分析可得出的結論是，生物資訊抗原選擇方法適用於選擇相關庫蠓過敏原用於iMAT分子中之抗原模組。因此，感染IBH的馬可利用根據本發明之包含選定過敏原之iMAT分子進行治療以在大比例之患病個體子群中以高概率誘導抗該等過敏原之耐受性。
已基於生物資訊分析選擇3種過敏原以意欲包含於三種不同iMAT分子(即，Cul o3、Cul o2及Cul o4)中。
將選定過敏原中之各者作為抗原模組整合入單獨iMAT分子中及於隨後藉由三維蛋白質結構之反覆模型化及計算單胺基酸取代後自由能改變，而最佳化熱動力穩定性。藉由於一級胺基酸序列中取代不同胺基酸殘基，可影響物理化學性質及穩定性。
將本文所述分析(抗原研究及模型化)之結果轉換成適用於馬之藥理學製造及應用之iMAT胺基酸序列中以治療(例如)IBH。
實例7-根據本發明之鑲嵌狀iMAT分子之結構
預期假若多於一種過敏原之組分包含於抗原模組中，則可進一步改良根據本發明之iMAT分子。就此目的而言，可以不同方式應用上述生物資訊選擇方法(實例6)之基本原理。代替基於在過敏原資料庫中發現的過敏原肽之擊中計數來選擇完全過敏原，僅使用數種該等過敏原之最豐餘肽來改造iMAT抗原分子。因此，該iMAT分子由源於數種過敏原之肽之抗原模組組成。此容許加寬單一iMAT分子在就其靶向過敏特性方面之範圍及因此對藥理學藥物開發有益。
為尋求具有該鑲嵌狀iMAT蛋白質資格之短肽序列，藉由如上文所述之同源性比較(參見實例6)來分析在唾液中發現的衍生自庫蠓物種(沙諾氏庫蠓、云斑庫蠓、不顯庫蠓)之230種蛋白質。簡言之，將經電腦模擬裂解的具有6至15個胺基酸殘基之肽長度之庫蠓蛋白質局部地與過敏原相關蛋白質之正規序列資料庫及非過敏相關蛋白質之隨機資料庫比對。確定在正規資料庫中發現的各肽之顯著同源性差異數。於隨後，將各肽局部地與大小三倍於正規資料庫的隨機資料庫比對以減少假陽性擊中。各肽長度之殘餘同源性之頂部(例如，第十百分位數)尤其適合充作用於建構帶有鑲嵌狀或混合過敏原之iMAT分子之基底。為建構鑲嵌狀iMAT分子，將蛋白質前驅物選擇(例如，從對應於最高等級肽之前驅蛋白質清單)作為用於包埋最高等級肽之骨架蛋白質。自骨架蛋白質移除信號肽序列及可將具有額外相鄰N-或C-端胺基酸之最高等級肽插入至骨架蛋白質之初始序列中或可替代骨架蛋白質之初始序列之部分。使用相似比對或對應前驅蛋白質中肽之參考位置來確定插入或取代之位置。作為下一步驟，新增His-標籤、TAT及靶向域。最終，如上所述改由最穩定之殘基取代半胱胺酸殘基。
在該方法之一例示性實例中，將沙諾氏庫蠓(UniProt資料庫條目「Q66U13」)之唾液蛋白質用作骨架蛋白質。確定該蛋白質中最具致 敏性之結構以保留序列之該部分。移除信號肽序列及於隨後新增UniProt資料庫條目「Q5QBI9」、「Q5QBK6」、「Q5QBL6」、「Q5QBJ4」及「Q5QBI2」之序列。之後，將鑲嵌狀過敏原整合至iMAT一般分子結構中。最終，半胱胺酸殘基改由其他胺基酸殘基，較佳絲胺酸、白胺酸、異白胺酸及/或天冬胺酸取代，這不減損所建構iMAT分子(融合蛋白質)之穩定性。
SEQ ID NO：17描繪一根據本發明之例示性鑲嵌狀(混合)iMAT分子之整體序列[胺基酸殘基1：N-端甲硫胺酸，胺基酸殘基2至7：His-標籤，胺基酸殘基8至18：TAT序列，胺基酸殘基19至128：靶向域，胺基酸殘基129至333：混合過敏原(不含信號肽及經插入/取代序列之骨架蛋白質Q66U13；經插入/取代之序列：胺基酸殘基137至151：Q5QBI9；胺基酸殘基155至166：Q66U13；胺基酸殘基185至200：Q5QBK6；胺基酸殘基215至229：Q5QBL6：胺基酸殘基235至250；Q5QBL6；胺基酸殘基265至278：Q5QBJ4；胺基酸殘基318至333：Q5QBI2；經取代之半胱胺酸(絲胺酸)：46、146、158、173、222、225、246、273、283、329；經取代之半胱胺酸(白胺酸)：295；經取代之半胱胺酸(異白胺酸)：299；經取代之半胱胺酸(天冬胺酸)：181]。
實例8-馬之復發性氣管阻塞(RAO)之治療性疫苗/預防
根據本發明之包含不同抗原模組之單一iMAT分子或iMAT分子之組合可用於預防性或治療性地治療罹患或處在RAO及/或與夏日放牧飼養相關聯RAO風險之馬。在馬中，可如實例4中所述投與根據本發明之iMAT分子。
將使用具有已知RAO病史之成年馬。在治療之前，馬經調理(例如)以使其在原地穿戴面罩站立而可實現全身氣管檢查，包括呼吸速度描記器量測、上氣管內視鏡及支氣管肺泡灌洗(BAL)以分析例如 BAL流體中嗜中性細胞百分比。進行全血計數及生物化學特性以排除相伴醫學病狀之存在。
可研究以下參數以檢查呼吸系統及量測以iMAT分子之治療性及/或預防性治療之療效：肺功能變數例如呼吸速率、最大經肺壓力、肺抗性、肺彈性之改變。另外，參數可併入至加權臨床評分系統中，例如，亦評估呼吸努力(breathing effort)/抬高腹部、流鼻涕及/或鼻翼搧動、咳嗽及/或肺功能異常、支氣管及/或氣管音之臨床評分。
因此，貫穿治療期間及/或之後，可臨床上藉由定量、半定量或定性評估來研究治療或預防RAO之療效。
可將該等臨床參數與在先前季節之個別馬之臨床症狀及/或在開始治療干預之前之嚴重度進行比較。或者，與未經治療或經安慰劑治療之感染RAO的馬之比較可證實，iMAT分子介導之治療及/或預防RAO之臨床症狀之療效。
該等馬之支氣管肺泡灌洗(BAL)流體及/或新鮮血液可(例如)利用HRT或CAST®用於針對馬之1型過敏反應之活體外激發測試中(關於詳細內容請參見實例2及/或Hare等人之Can J Vet Res 1998；62：133-139)。與在iMAT分子治療之前相比，在iMAT分子治療之後，響應於某些過敏原挑戰之肺肥大細胞及/或嗜鹼細胞去顆粒減少，例如組織胺及/或硫化白三烯釋放，指示治療及/或預防效應。
或者或另外，利用某些重組過敏原，可在該等馬中監測真皮內激發測試、皮膚刺傷測試抑或BAL流體或血清中之過敏原特異性IgE及/或IgG測定(TilleyP等人，J Equine Vet Sci 2012,32：719-727)。減低之反應(速發及/或後期階段反應性)及/或抗體效價之改變指示iMAT分子治療之治療及/或預防效應。
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在序列表中：SEQ ID NO：1 係關於一個根據本發明之仍具功能性，亦即，可有效地促進細胞進入之易位模組之適宜最短胺基酸序列；SEQ ID NO：2 係關於完全馬恆定鏈胺基酸序列；SEQ ID NO：3 係關於完全Cul n4過敏原胺基酸序列；SEQ ID NO：4 係關於完全Cul o1過敏原胺基酸序列；SEQ ID NO：5 係關於完全Cul o2過敏原胺基酸序列；SEQ ID NO：6 係關於完全Cul o3過敏原胺基酸序列；SEQ ID NO：7 係關於根據本發明之Cul n4 iMAT分子；SEQ ID NO：8 係關於根據本發明之Cul n4 iMAT分子；SEQ ID NO：9 係關於根據本發明之Cul o1 iMAT分子；SEQ ID NO：10 係關於根據本發明之Cul o1 iMAT分子；SEQ ID NO：11 係關於根據本發明之Cul o2 iMAT分子；SEQ ID NO：12 係關於根據本發明之Cul o2 iMAT分子；SEQ ID NO：13 係關於根據本發明之Cul o3 iMAT分子；SEQ ID NO：14 係關於根據本發明之Cul o3 iMAT分子；SEQ ID NO：15 係關於馬恆定鏈胺基酸序列之具有維持細胞內運輸功能之特異性片段；SEQ ID NO：16 係關於馬恆定鏈胺基酸序列之具有維持細胞內運輸功能之特異性片段；SEQ ID NO：17 係關於一根據本發明之例示性鑲嵌狀iMAT分子之完整序列；SEQ ID NO：18 係關於完全Cul o4過敏原胺基酸序列； SEQ ID NO：19 係關於完全Cul o7過敏原胺基酸序列；SEQ ID NO：20 係關於根據本發明之Cul o4 iMAT分子；SEQ ID NO：21 係關於根據本發明之Cul o4 iMAT分子；SEQ ID NO：22 係關於根據本發明之Cul o7 iMAT分子；SEQ ID NO：23 係關於根據本發明之Cul o7 iMAT分子。
本文所引述之所有先前技術參考及隨附本申請案之序列表彼此獨立地以其全文引用之方式併入本文中。
項目：
1.一種經分離重組蛋白質，其包含至少一可自細胞外空間運輸重組蛋白質進入細胞內部中之第一模組、至少一可細胞內運輸重組蛋白質至參與處理抗原或使MHC分子加載抗原之細胞器之第二模組、及至少一確定個體之藉由該重組蛋白質調節之免疫反應之特異性的抗原模組，藉此該等模組彼此共價連接，視情況，在至少一個該等模組之間包含間隔模組，其中a.)該第一模組為使自細胞外空間易位進入細胞內部中之胺基酸序列，b.)該第二模組為使得該重組蛋白質在細胞內物種特異性靶向參與處理抗原及/或使MHC分子加載抗原之細胞器之胺基酸序列，c.)該抗原模組為衍生自抗原(係過敏原)之至少一個抗原決定基之胺基酸序列，藉此，至少在該抗原模組中，該經分離重組蛋白質中之至少一個半胱胺酸殘基係經絲胺酸或一不同胺基酸殘基取代。
2.根據項目1之經分離重組蛋白質，其中在該抗原模組或在整個經分離重組蛋白質中，所有半胱胺酸殘基係經一不同胺基酸殘基取代。
3.根據項目1或2之經分離重組蛋白質，其中該等半胱胺酸殘基係 經絲胺酸殘基取代。
4.根據項目1或2之經分離重組蛋白質，其中該第二模組為馬恆定鏈，例如，SEQ ID.No：2、15、16之胺基酸序列，及/或該抗原模組包含衍生自引起馬過敏之過敏原之抗原決定基。
5.根據項目1或2之經分離重組蛋白質，其中該抗原模組包含衍生自食血昆蟲，特定言之衍生自庫蠓亞屬之過敏原之至少一個抗原決定基。
6.根據前述項目中任一項目之經分離重組蛋白質，其中該過敏原為Cul n 4、Cul o 1、Cul o 2或Cul o 3過敏原中之至少一者。
7.根據前述項目中任一項目之重組蛋白質，其進一步包含標籤模組，例如His-標籤，藉此該標籤模組可在N-端及/或C-端存在。
8.根據前述項目中任一項目之經分離重組蛋白質，其中該第一模組為HIV-tat、VP22或觸角足蛋白或其作用為用於易位之模組之部分序列。
9.根據前述項目中任一項目之經分離重組蛋白質，其係呈單體形式存在。
10.根據前述項目中任一項目之經分離重組蛋白質，其係呈線性形式存在。
11.根據前述項目中任一項目之經分離重組蛋白質，其包含(或由)Seq.ID-No：7至14之序列中任何一者(組成)。
12.根據前述項目中任一項目之經分離重組蛋白質，其係用於醫藥組合物中。
13.一種根據項目12使用之經分離重組蛋白質，其中該醫藥組合物為疫苗。
14.一種根據項目12至13中任一項目使用之經分離重組蛋白質，其係設計用於舌下投與、皮下或皮內注射、注射至淋巴結中或用 於經黏膜，特定言之經胃腸道或呼吸系統之黏膜投與。
15.一種編碼根據項目1至11中任一項目之經分離重組蛋白質之核酸。
16.一種包含至少一種根據項目15之核酸序列之載體。
17.一種包含至少一種根據項目15所主張的載體或根據項目15之核酸之初級細胞或細胞系。
18.一種識別預定胺基酸序列中使得該預定胺基酸序列穩定化之胺基酸取代之方法，該方法包括以下步驟：i.將靶向蛋白質之三級結構模型化；ii.基於單點取代(例如，由一不同胺基酸殘基取代半胱胺酸)反覆測定蛋白質穩定性，及評分以藉由分析所有可取得三維結構來確定穩定化取代；iii.將經新穎結構再模型化及藉由重複步驟i.)及ii.)驗證穩定性。
19.根據項目18之方法，其中在步驟ii.)中，評估折疊自由能改變。
20.根據項目18或19之方法，其中在步驟ii.)中，出現特異性取代的次數，使用基於在所使用模型中出現率及蛋白質穩定性自由能改變ΔΔG而對代換分級的評分系統。
21.根據項目1至11中任一項目之重組蛋白質，其係藉由根據項目18至20中任一項目之方法獲得。
22.根據項目1至14中任一項目之重組蛋白質，其係用於預防及/或治療馬類動物之昆蟲叮咬過敏反應。
<110> 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司
<120> 經改良之模組化運輸分子及其用途
<130> P01-3045 PCT+FF
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<211> 11
<212> PRT
<213> 合成肽
<400> 1
<210> 2
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<213> 家馬
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Claims (20)

  1. 一種經改良之MAT(iMAT)分子，其包含：(i)至少一個第一模組，其為使得iMAT分子自細胞外空間易位進入細胞內部中之胺基酸序列，(ii)至少一個第二模組，其為使得iMAT分子物種特異性細胞內靶向參與處理抗原及/或使MHC分子加載抗原(較佳係經處理之抗原)之細胞細胞器之胺基酸序列，及(iii)至少一個第三模組作為抗原模組，其為衍生自至少一種抗原，較佳至少一種過敏原之至少一個完全或部分抗原決定基之胺基酸序列，從而確定由該iMAT分子調節的免疫反應之特異性，其特徵在於至少在該(等)抗原模組中，至少一個半胱胺酸殘基係經一不同胺基酸殘基，較佳絲胺酸、白胺酸、異白胺酸及/或天冬胺酸取代。
  2. 如請求項1之iMAT分子，其中在該至少一個抗原模組中，所有半胱胺酸殘基均經一不同胺基酸殘基，較佳絲胺酸、白胺酸、異白胺酸及/或天冬胺酸取代，其中，較佳在整個iMAT分子中，所有半胱胺酸殘基均經一不同胺基酸殘基，較佳絲胺酸、白胺酸、異白胺酸及/或天冬胺酸取代。
  3. 如請求項1或2之iMAT分子，其中所有該等模組視情況藉由在該第一、第二及/或第三模組之兩個或更多個相鄰模組，視情況所有模組間的額外間隔模組而彼此共價連接。
  4. 如請求項1或2之iMAT分子，其中所有該等模組彼此共價連接，且其中該第一、第二及/或第三模組之兩個或更多個相鄰模組之間根本不存在額外間隔模組。
  5. 如請求項1或2之iMAT分子，其中該至少一個第二模組包含馬恆定鏈及較佳係由SEQ ID NO：2、15、16之胺基酸序列中之一或多者組成。
  6. 如請求項1或2之iMAT分子，其中該至少一個抗原模組包含衍生自至少一種引起馬之過敏之過敏原的至少一個完全或部分抗原決定基，較佳至少一種衍生自食血昆蟲，更佳衍生自庫蠓屬(culicoides)之過敏原的至少一個完全或部分抗原決定基，及/或至少一種衍生自黴菌(真菌及/或其孢子)、花粉、室內塵埃或飼料螨(及/或其糞便)，更佳來自樹、草、草本、豚草之花粉及/或十字花科花粉及/或曲黴菌屬(aspergillus)、鏈格孢菌屬(alternaria)、灰黴菌屬(botrytis)、尾孢菌屬(cercospora)、枝孢菌屬(cladosporium)、彎孢菌屬(curvularia)、內臍蠕孢菌屬(drechslera)、散囊菌屬(eurotium)、麥類胡麻葉枯病菌屬(helminthosporium)、附球孢菌屬(epicoccum)、白粉菌屬(erysiphe)/粉孢菌屬(oidium)、鐮孢菌屬(fusarium)、橫梗黴屬(lichtheimia)、黑孢菌屬(nigrospora)、青黴菌屬(penicillium)、黑團孢菌屬(periconia)、霜黴菌屬(peronospora)、浪梗黴菌屬(polythrincium)、糖多孢菌屬(saccharopolyspora)(先前亦稱作乾草菌屬(faenia)或小多孢菌屬(micropolyspora))、高溫放線菌屬(thermoactinomyces)、匍柄黴菌屬(stemphylium)、圓酵母屬(torula)之真菌及/或其孢子及/或粉蟎屬(acarus)、糖蟎屬(glycophagus)、食酪蟎屬(tyrophagus)、塵蟎屬(dermatophagoides)之蟎(及/或其糞便)之過敏原的至少一個完全或部分抗原決定基。
  7. 如請求項6之iMAT分子，其中該至少一種抗原，較佳至少一種過敏原為Cul n4、Cul o1、Cul o2、Cul o3、Cul o4及/或Cul o7過敏 原。
  8. 如請求項1或2之iMAT分子，其中該至少一個抗原模組包含衍生自至少一種引起馬之一或多種傳染性疾病之病原體之抗原的至少一個完全或部分抗原決定基，較佳至少一種衍生自紅球菌屬(rhodococcus)、馬鏈球菌屬(streptococcus)、環狀病毒屬(orbivirus)、黃病毒屬(flavivirus)、毛癬菌屬(trichophyton)、小孢癬菌屬(microsporum)、隱孢子蟲屬(cryptosporidium)及/或圓線蟲屬(strongylus)之抗原的至少一個完全或部分抗原決定基，其中，較佳地，該至少一個抗原模組亦可係參與馬之一或多種傳染性疾病之傳播的載體之抗原，更佳係庫蠓屬(culicoides)、庫蚊屬(culex)及/或硬蜱屬(ixodes)唾液組分。
  9. 如請求項1或2之iMAT分子，其進一步包含至少一個標籤模組，較佳至少一個His-標籤，其中該至少一個標籤模組較佳存在於N-末端及/或C-末端，更佳係一個標籤模組，較佳係一個在一個甲硫胺酸殘基後N-末端的His-標籤。
  10. 如請求項1或2之iMAT分子，其中該至少一個第一模組包含HIV-tat、VP22及/或觸角足蛋白(Antennapedia)之胺基酸序列或其部分序列(較佳由其等組成)，限制條件為該至少一個第一模組作用為用於使iMAT分子自細胞外空間易位進入細胞內部中之模組。
  11. 如請求項1或2之iMAT分子，其係呈單體形式及/或線性形式存在。
  12. 如請求項1或2之iMAT分子，其包含根據SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、14、17、20、21、22、23之胺基酸序列中之一或多者(較佳由其等組成)。
  13. 如請求項1或2之iMAT分子，其用於預防及/或治療馬之一或多種過敏，較佳昆蟲叮咬過敏反應(IBH)、蕁麻疹及/或復發性氣管阻 塞(RAO)之方法中。
  14. 如請求項1或2之iMAT分子，其用於預防及/或治療馬之一或多種傳染性疾病及/或防止馬之一或多種傳染性疾病傳播及/或防止馬之一或多種傳染性疾病經載體，較佳經食血蒼蠅、蠓、壁蝨及/或蚊，更佳紅球菌肺炎、腺疫、非洲馬疫、西尼羅病毒感染、皮癬菌病及/或消化道及/或其他器官之寄生蟲及/或隱孢子蟲病、蠕蟲及/或其潛隱期(prepatent stage)傳播之方法中。
  15. 一種包含如請求項1至12中任一項之iMAT分子之醫藥組合物。
  16. 如請求項15之醫藥組合物，其用於預防及/或治療馬之一或多種過敏，較佳昆蟲叮咬過敏反應(IBH)、蕁麻疹及/或復發性氣管阻塞(RAO)之方法中。
  17. 如請求項15之醫藥組合物，其用於預防及/或治療馬之一或多種傳染性疾病及/或防止馬之一或多種傳染性疾病傳播及/或防止馬之一或多種傳染性疾病經載體，較佳經食血蒼蠅、蠓、壁蝨及/或蚊，更佳紅球菌肺炎、腺疫、非洲馬疫、西尼羅病毒感染、皮癬菌病及/或消化道及/或其他器官之寄生蟲及/或隱孢子蟲病、蠕蟲及/或其潛隱期傳播之方法中。
  18. 一種編碼如請求項1至12中任一項之經分離重組蛋白質之核酸。
  19. 一種包含至少一種如請求項18之核酸之載體。
  20. 一種包含至少一種如請求項18之核酸及/或至少一種如請求項19之載體之初級細胞或細胞系。
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