ES2618898T3 - Oligopéptidos sintéticos diseñados de cistein proteasas de ácaros y métodos para la producción de anticuerpos policlonales IgY para la detección de ácaros intradomiciliares - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al diseño, síntesis y evaluación de 6 oligopéptidos sintéticos, no descritos previamente diseñados a partir de los epítopes T y B de alérgenos del grupo I de los ácaros intradomiciliarios de las especies Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae y Blomia tropicales los cuales pueden ser empleados en inmunomodulación en sujetos con sistemas inmunocompetentes y en la producción de anticuerpos policlonales IgY. Asimismo la presente invención corresponde a un primer método para la obtención de una composición de anticuerpos policlonales IgY útil como reactivo de diagnóstico de bajo costo y alta reactividad frente a ácaros intradomiciliarios, y a un segundo método para la detección de alérgenos de ácaros que emplea la composición de anticuerpos IgY desarrollada en el primer método. La presente invención también comprende la composición como tal de los anticuerpos policlonales IgY.

Description

DESCRIPCIÓN

Oligopéptidos sintéticos diseñados de cistein proteasas de ácaros y métodos para la producción de anticuerpos policlonales IgY para la detección de ácaros intradomiciliares

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1. BREVE DESCRIPCIÓN DEL INVENTO

Acá se divulga el diseño, síntesis y evaluación de 6 péptidos sintéticos, no descritos previamente diseñados a partir de las secuencias de las proteínas naturales de los alergenos del grupo I de los ácaros intradomiciliarios de las especies Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae y Blomia tropicalis, capaces de 10 desencadenar respuestas inmunológicas específicas. Por lo tanto, se divulgan seis fragmentos oligopéptídicos, evaluados de forma individual en su capacidad inmunogénica que presentan en su estructura epítopes T y B, de los alergenos Der p I, Der f I y Blo t I. Adicionalmente, también se divulgan los usos ventajosos de estos péptidos sintéticos y/o fragmentos de los mismos, en el desarrollo de métodos de diagnóstico y protocolos de inmunomodulación en sujetos con sistemas inmunocompetentes. La presente invención está descrita con mayor 15 detalle en las siguientes secciones.

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Asimismo la presente divulgación corresponde a un primer método para la obtención de una composición de anticuerpos policlonales IgY útil como reactivo de diagnóstico de bajo costo y alta reactividad frente a ácaros intradomiciliarios, y a un segundo método para la detección de alérgenos de ácaros que emplea la composición de 20 anticuerpos IgY desarrollada en el primer método. La presente divulgación también comprende la composición como tal de los anticuerpos policlonales IgY.

El primer método permite obtener de manera reproducible y a un bajo costo una composición de anticuerpos policlonales IgY capaces de reconocer un amplio espectro de alérgenos de ácaros intradomiciliarios pertenecientes 25 a la familia de las cistein proteasas.

El segundo método permite las determinaciones de los niveles totales de alérgenos en muestras provenientes de ambientes intramuros que estén contaminados y colonizados por ácaros intradomiciliarios. El nivel de alérgenos se determina por la medición de cambios en las propiedades biofísicas de los reactantes en sistemas de identificación a 30 través de mecanismos inmunoquímicos cuando se comparan con estándares de referencia.

2. ESTADO DE LA TÉCNICA

Las enfermedades alérgicas se caracterizan por tener una alta prevalencia, morbilidad y comorbilidad. El uso de 35 péptidos sintéticos se ha convertido en un área de investigación y desarrollo que provee herramientas diagnósticas y terapéuticas más eficaces para este tipo de enfermedades. La evidencia citada en la literatura, muestra que en estudios de fase I y fase II, péptidos provenientes de alérgenos de himenópteros, pólenes y felinos, son eficaces en modular la respuesta inmune tanto en modelos experimentales como en humanos. Las evidencias anexa aquí nos permiten solicitar protección sobre seis oligopéptidos sintéticos diseñados a partir de las secuencias de las proteínas 40 naturales de los alérgenos del grupo I de ácaros intradomiciliarios (1).

2.1. Los Alérgenos

Los alérgenos son moléculas, generalmente de naturaleza proteica, que en individuos atópicos, el sistema 45 inmunitario las reconoce como "extrañas" diferentes al polimorfismo antigénico propio, induciendo una respuesta inmune adaptativa exagerada tipo Th2 con la secreción de IL-4, IL-5 e IL-13, promoviendo en los linfocitos B la producción de altas cantidades de anticuerpos IgE alergeno-especificas, que en posteriores contactos al mismo inmunógeno producirá la liberación de mediadores químicos, en particular la histamina, que producirán los síntomas típicos de la reacción alérgica. En general las proteínas alergénicas exhiben dos o tres propiedades moleculares 50 distintas: la propiedad de sensibilizar, es decir inducir al sistema inmunológico a producir una respuesta inmune adaptativa de anticuerpos IgE de alta afinidad; y la capacidad para provocar una respuesta inflamatoria alérgica, es decir desencadenar síntomas y signos característicos de las enfermedades alérgicas en individuos previamente sensibilizados. Adicionalmente un alérgeno tiene la propiedad de unir anticuerpos IgE específicos. Un alérgeno es una proteína que comúnmente induce una respuesta inmune exagerada mediada por anticuerpos IgE en individuos 55 genéticamente predispuestos. (1)

Los análisis de la base de datos de proteínas sugieren que el universo de los alérgenos abarca más de 120 familias distintas de proteínas. (2) Muchas proteínas pueden tener actividad biológica que influencia la respuesta inmune. Sin embargo, la mayoría de alérgenos purificados no tienen efectos sobre la piel, tracto digestivo, nariz, y otros, en 60 individuos no alérgicos. (3) Los alérgenos se derivan de proteínas con una variedad de funciones biológicas, incluyendo enzimas, proteínas de unión, proteínas estructurales, proteínas de transferencia de lípidos, profilinas, proteínas de unión a calcio, y otros. La función biológica de las enzimas proteolíticas de los ácaros del polvo intradomiciliario, influencian directamente el desarrollo de las respuestas de IgE y pueden iniciar procesos inflamatorios en el pulmón y otros órganos diana a las cuales se asocia el asma. Las características estructurales o 65

biológicas pueden también influenciar el tiempo que los alérgenos persisten en los ambientes interiores y al aire libre, así como la conservación de su alergenicidad en el tracto digestivo. (4)

2.1.1. Características moleculares de las proteínas alergénicas

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La estructura molecular de las proteínas alergénicas, presentan regiones inmunodominantes, denominadas epítopes, las cuales interactúan con los fragmentos de unión al antígeno (Fab) de los anticuerpos IgE específicos. Los complejos inmunes Fab-alérgeno, tienen entre 15 a 22 residuos de aminoácidos. De éstos, sólo de 3 a 5 residuos contribuyen al proceso de unión a través de múltiples enlaces complementarios de tipo no covalente, originados por fuerzas electrostáticas, principalmente de tipo van der Waals. (5-7) 10

A la fecha, se investiga ampliamente para determinar si las características intrínsecas de los epítopes se encuentran relacionadas con su capacidad alergénica. Es decir, si su complejidad molecular (secuencia de aminoácidos, estructura secundaria, y tipo de plegamiento), así como su solubilidad, la estabilidad, el tamaño y la actividad bioquímica de un alérgeno, promueven las condiciones inmunológicas necesarias para la sensibilización del sistema 15 inmunológico del huésped, la interacción con anticuerpos IgE y la inducción de las reacciones alérgicas (alergenicidad). (8)

2.1.2. Alérgenos de los ácaros del polvo intradomiciliarios

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Los ácaros son pequeños artrópodos pertenecientes a la clase Arácnida, poseen cuatro pares de patas, ausencia de segmentación del cuerpo y carencia de antenas. Estos se encuentran distribuidos por todo el mundo, adaptados a vivir en diversos medios. Entre las numerosas especies se encuentran aquellos que viven en el polvo de las casas y basan su nutrición en detritus humano y animal (9).

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Dermatophagoides pteronyssinus es la especie de ácaros intradomiciliarios más importante en Europa Occidental, Australia, Inglaterra y Nueva Zelanda. Dermatophagoides farinae es el ácaro predominante en los Estados Unidos y Japón, aunque D. pteronyssinus es el más prevalente en algunas regiones de estos países (10-11), pero la infestación con una u otra especie de ácaro depende no solo de la ubicación geográfica, sino también de las condiciones ambientales de cada hogar. El ácaro Blomia tropicalis es importante en regiones tropicales y 30 subtropicales particularmente en Suramérica y el Sureste Asiático. (12). Las especies del género Dermatophagoides y del genero Blomia son evolutivamente dispares y por lo que presentan baja reactividad cruzada en sus proteínas, debido a que presentan secuencias aminoacídicas disímiles. (13)

Los alérgenos para el ácaro del polvo han sido divididos en grupos de acuerdo a la función biológica que cumplen 35 estas proteínas. Los alérgenos del grupo I (Der p 1, Der f 1 y Blo t 1), son cistein-proteasas, con preferencia por sustratos con una cadena lateral hidrofóbica grande en la posición P2 o con residuos básicos; pueden actuar como enzimas digestivas del ácaro y se encuentran en concentraciones elevadas en las heces de los mismos (partículas de 10-20 micras de diámetro) (13). El alérgeno Der p1 es una proteína de 360 aa, y un peso molecular de 36104 Da (NCBI Cod. AAB60215). El alérgeno Der f 1 es una proteína de 361 aa con un peso molecular de 36391 Da (NCBI 40 Cod. P16311). El alérgeno Blo t 1 es una proteína de 221 aa con un peso molecular de 25126 Da (NCBI Cod. AAK58415).

Los alérgenos de un mismo grupo presentan un alto grado de homología en su secuencia amino acídica, razón por la cual se manifiesta el fenómeno de reactividad cruzada, éste ocurre cuando anticuerpos originalmente aumentados 45 para un alérgeno se unen o reconocen un epítope (fracción) en una proteína similar de un recurso diferente. Así, la interacción con tales proteínas homólogas puede desencadenar reacciones alérgicas o puede ser completamente irrelevante para el paciente (27).

Los ácaros de polvo doméstico son organismos complejos y en ellos se producen miles de proteínas diferentes y 50 otras macromoléculas. Se han caracterizado hasta el momento más de 21 grupos de alérgenos en nueve especies de ácaros diferentes y se han clasificado de acuerdo a su identidad bioquímica. El primer alérgeno de ácaros descrito fue Der p 1 de Dermatophagoides pteronyssinus (16). Der f 1 fue después caracterizado por diversos investigadores. Der p 1 fue también el primer alérgeno con el que se desarrolló un análisis con cDNA. El análisis del cDNA reveló que ellas eran cistein proteasas de la misma familia de la papaína y actinidina. (28) El grupo de 55 alérgenos 1 ha sido identificado como alérgenos mayores a partir de estudios con extractos alergénicos estos se unen a IgE de sujetos alérgicos a los ácaros con alta frecuencia. Estas proteínas están presente en heces de los ácaros en altas concentraciones. La actividad proteolítica de estas cistein proteasas, se ha propuesto que aumentan su capacidad de sensibilizar seres humanos (29). La IgE dirigida contra Der p 1 está notablemente en un rango del 50 - 70% en el suero de estos mismos pacientes alérgicos (30). 60

2.1.3. Las Cisteína proteasas de ácaros intradomiciliarios. Características biológicas y moleculares

Las proteasas se agrupan en clanes y familias. Los clanes son grupos de familias para quienes hay evidencia de ascendencia común. Las familias son agrupadas por su tipo catalítico: A, aspartato; C, cisteína; G, ácido glutámico; 65 S, serina; T, treonina; y U, desconocido. Las serin, treonin y cistein proteasas utilizan en su sitio activo un

aminoácido nucleófilo y forman un estado intermediario acilo y pueden también actuar fácilmente como transferasas. (64)

La cistein proteasa del ácaro D. pteronyssinus (Der p 1) es una proteína de 25 Kda, codificado por un único gen, que presenta frecuentes polimorfismos, los cuales han sido ya secuenciados. (26) Tiene una variación prevalente de la 5 secuencia alanina - valina en la posición 124 y aparecen variaciones esporádicas que difieren en 2 - 3 residuos. (57-59)

El marco abierto de lectura codifica un péptido señal de 18 aa, un pro-péptido de 80 aa, y la región de la proteína madura abarca 222 aa. La secuencia incluye cuatro sitios de potencial N-glicosilación, tres en la secuencia madura 10 y uno en el pro-péptido. Der p 1 es producida como una enzima inactiva, que se activa después de la separación del pro-péptido. Aparte de inhibir la actividad de la pro-enzima, el pro-péptido puede también actuar como plataforma de plegamiento para la maduración de Der p 1, según lo sugerido para otras proteasas. Cuando Der p 1 se extrae de las heces del ácaro, está presente en la forma madura (nDer p 1). (60-61)

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Las cistein proteasas se dividen en cinco clanes, cada una contiene a un número de familias, agrupadas basados en la arquitectura de su díada o triada catalítica. Der p 1 pertenece al clan CA, a la familia C1, que también incluye a la papaína y a sus parientes. Las estructuras cristalinas de la papaína y de varias proteasas estrechamente relacionadas de esta misma familia han sido determinadas, y los residuos catalíticos se han identificado como Cys, His, y Asn. Además, un residuo conservado de Gln es esencial para la actividad catalítica y se cree que ayuda a 20 formar el agujero del oxianionico, el cual estabiliza el estado transitorio durante la catálisis. (62).

En la Figura 1 se observa la estructura biológica Der p 1 A. proDer p 1 y B Der p 1 maduro y completamente activo.(33) Fuente de libre acceso : PDB.

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Los residuos catalíticos Cys e His se piensa forman un Ion tiolato-imidazolium estabilizado por un puente de Hidrógeno directo entre las cadenas laterales de los residuos catalíticos His y Asn. (64)

La mayoría de los miembros de la familia C1 tienen pro-péptidos homólogos al de la papaína (115 aa), aunque la longitud puede variar. Se estima que el pro-péptido actúa ocultando el sitio activo y blindándolo del acceso a los 30 sustratos, de tal modo que inhibe la actividad enzimática. La proteólisis del mismo es evitada ligando el pro-péptido en la orientación reversa comparada con la de un sustrato. El pro-péptido de Der p 1 tiene solo 17 residuos idénticos al ser alineada su secuencia con el propéptido de la papaína. (65)

La estructura secundaria de la cistein proteasa del ácaro Dermatophagoides pteronyssinus está constituida en un 35 28% por hélices alfa (8 hélices; 63 residuos) y el 23% por laminas beta (18 hojas; 53 residuos) con diversos enlaces disulfuro que estabilizan la proteína. (Ver Figura 2)

Epítopes moleculares de la Proteína Der P 1.

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La región entre los aminoácidos 15-- 33 de la proteína madura es accesible a la interacción con paratopes de anticuerpos IgE, pero es relativamente extendida y podría constituir epítopes discontinuos con partes de la región entre los aminoácidos 188 - 199. La región 34 - 47, la cual contiene residuos de cisteína catalíticos, es una hélice enterrada en el interior de la molécula. El segmento que comprende los residuos 52 a 111 está bien expuesto sobre la superficie y podría ser subdivido en pequeños segmentos: 52 - 56, 60 - 80, 81-94, y 101 - 111, correspondiendo a 45 epítopes lineales o epítopes discontinuos. El epítope 81 - 94 consiste de dos epítopes continuos separados por los aminoácidos 101 - 111, y este mismo es también expuesto a la superficie y constituye un epítope lineal ideal, al igual que el epítope 117 - 133. La región 155 - 175 está parcialmente enterrada en la interface de un dímero y puede ser parte de un epítope discontinuo con el segmento adyacente 176 - 187, o con parte del segmento 60 - 80. Finalmente, la región 188 - 199 es suficientemente compacta para constituir un epítope lineal o combinado con 15 - 50 33. Hay variaciones en todos los epítopes descritos comparados con Der f 1 y Eur m 1 con la excepción de la región 60 - 80, la cual está completamente conservada con respecto a Der f 1. (63)

Se han reportado por lo menos 12 isoformas de Der p 1 (36). Los residuos amino acídicos dentro del propéptido median su asociación a la membrana, y desempeñan un papel en el transporte de la proenzima a los lisosomas. (67-55 68)

El grupo 1 de ácaros intradomiciliarios está constituido por las cistein proteasas de cada una de las diferentes especies de ácaros. Estas proteínas provocan síntomas clínicos claros en >80% pacientes alérgicos a los ácaros. Se han caracterizado hasta el momento las cistein proteasas de Dermatophagoides pteronyssinus (Der p 1), 60 Dermatophagoides farinae (Der f 1), Blomia tropicalis (Blo t 1), Dermatophagoides microceras (Der m 1) y Euroglyphus maynei (Eur m 1) (13). Entre las proteínas que producen síntomas clínicos se destacan las cistein proteasas Der p 1, que es positiva en el 92% de los pacientes alérgicos a los ácaros por RAST (39) y Der f 1 que en el 87% de los pacientes alérgicos a ácaros, elicita anticuerpos IgE contra Der f 1. (70)

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En la Figura 2 Estructura secundaria de Der p 1 completamente activo. (63) Fuente de libre acceso: PDB.

Estas cisteín proteasas han sido implicadas en enfermedades humanas como cáncer, artritis reumatoide, osteoporosis y enfermedad de Alzheimer's. (71) Por esta razón consideramos a las cistein proteasas de ácaros intradomiciliarios como moléculas blanco para el diseño de estrategias encaminadas al diagnóstico, tratamiento, y control de enfermedades alérgicas. (72) 5

Reactividad cruzada entre cistein proteasas

El fenómeno de reactividad cruzada ocurre cuando anticuerpos IgE, originalmente aumentados para un alérgeno, se unen o reconocen un epítope (fracción) en una proteína similar de un recurso diferente. La interacción con tales 10 proteínas homólogas puede desencadenar reacciones alérgicas o puede ser completamente irrelevante para el paciente. (73-75)

El grupo 1 de ácaros intradomiciliarios comparten características estructurales que permite agruparlas dentro del clan CA, en la familia C1, que también incluye a la papaína, catepsinas de mamíferos (B, C, F, H, L, K, O, S, V, X y 15 W) y a sus parientes. Estas proteínas poseen dominios muy conservados (ver Figura 3) que hacen que estas proteínas alergénicas sean reconocidas por anticuerpos IgE de pacientes sensibilizados contra cistein proteasas de un recurso diferente. Es decir estas proteínas presentan reactividad cruzada entre sí, por lo que un grupo muy diverso de recursos pueden elicitar síntomas alérgicos comunes. (76-77) Se ha comprobado que Der p I y Der f I tienen reactividad cruzada superior al 80 %. (78-79). 20

En la Figura 3 se observan los dominios Conservados de pro Der p 1. (80) Fuente de libre acceso: NCBI.

Entre otros recursos relevantes con reactividad cruzada con el grupo 1 de ácaros intradomiciliarios tenemos a las catepsinas, un grupo de exopeptidasas lisosomales expresadas en todos los tejidos humanos, involucrada en la 25 degradación de proteínas, procesamiento de antígenos, activación de proenzimas y en procesos apoptóticos. (81-82). Las catepsinas de plantas las cuales son utilizadas en la movilización de proteínas de reserva. (83-85)

Respuesta inmune a las cistein proteasa

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Aunque hay una comprensión creciente de los mecanismos implicados en el desarrollo de la inflamación alérgica, una vez la sensibilización ha ocurrido, los mecanismos de la interacción entre Der p 1 y las poblaciones celulares de la vía aérea y su papel en el proceso de sensibilización siguen siendo confusos. (86)

El epitelio bronquial es la primera barrera encontrada por los antígenos inhalados, esta proporciona un acoplamiento 35 importante entre el medio externo y el interior del cuerpo. La activación de células dendríticas por los antígenos inhalados conduce normalmente a la inducción de la tolerancia de la inhalación más que a la inflamación alérgica. Los mecanismos implicados en la interrupción de esta tolerancia en individuos alérgicos se desconocen. Se ha demostrado que una corta exposición a altas concentraciones de Der p 1 o la exposición prolongada a bajas concentraciones causó degradación de las uniones estrechas en células epiteliales bronquiales en pacientes 40 asmáticos y también en las células de individuos no asmáticos. Esto incrementa la permeabilidad del epitelio, lo cual podría favorecer la penetración en la mucosa de la vía aérea, no solo de Der p 1, sino también de otros antígenos desprovistos de actividad proteolítica, de tal modo que aumenta la probabilidad de encontrar células presentadoras de antígenos y causar sensibilización. Tal fenómeno explicaría por qué la sensibilización contra los antígenos del ácaro del polvo doméstico se asocia con frecuencia a la sensibilización con múltiples antígenos (87). 45

La exposición de las células epiteliales de la vía respiratoria a Der p1 induce la secreción de citosinas pro inflamatorias, particularmente (GM-CSF), e IL -6. La secreción de estos mediadores de las células epiteliales bronquiales de pacientes asmáticos se asocia al transporte intracelular del alérgeno y ocurre después de una breve exposición a concentraciones bajas de Der p1. (88) De esta forma la actividad catalítica cistein-proteasa del 50 alérgeno de ácaro de polvo casero Der p 1 se asocia con el incremento de la permeabilidad en el epitelio bronquial, facilitando así su propio procesamiento.

En la Figura 4 se observa el incremento en la permeabilidad de membrana por acción proteolítica de Der p 1. (89)

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Este alérgeno es capaz también de cortar a CD23 (receptor de baja afinidad para IgE´s, el cual regula la síntesis de estas inmunoglobulinas) y a CD25 (la subunidad α del receptor para interleucina-2). Como resultado del clivaje del CD25 de superficie, los linfocitos T de sangre periférica disminuyen su proliferación y la secreción IFN-γ como respuesta a una estimulación. Las poblaciones de la célula Th1 y Th2 promueven el desarrollo de células del mismo subconjunto, mientras que suprime la propagación de los del otro subconjunto. Por lo tanto, el clivaje 60 inducido por Der p 1 de CD25 probablemente conduce al crecimiento deteriorado de las células del subconjunto Th1 y al consiguiente aumento de los del subconjunto Th2.(113) Este subset de células T produce un perfil de citoquinas que incluyen IL-4, IL-5, IL-6, e IL-13, las cuales ejercen sus efectos sobre los mismos linfocitos T, pero también sobre otro tipo de células incluyendo linfocitos B y células presentadoras de antígenos tales como monocitos y células dendríticas. La IL-4 sirve como factor de crecimiento de los linfocitos B e induce la producción 65

de los isótipos IgE e IgG4. En la exposición inicial al alérgeno, los linfocitos T son estimulados, y la producción de IgE es inducida; estos anticuerpos se unen a los receptores de la superficie de los mastocitos. (89-90).

2.2. Los ácaros intradomiciliarios y su asociación con las enfermedades alérgicas.

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Estudios epidemiológicos, inmunológicos y clínicos en Colombia, sustentan el concepto que la sensibilización (producción de IgE específicos para alérgenos de ácaros y clonas de linfocitos T alérgeno-específicos) por los alérgenos de ácaros, es una causa de asma y rinitis, mas no simplemente un factor desencadenante. Estos hallazgos son coherentes con lo informado en la literatura científica. Estudios previos en nuestro país muestran que la prevalencia de sensibilización a los antígenos de ácaros en pacientes asmáticos, en la ciudad de Barranquilla, 10 tiene un patrón similar de comportamiento que a nivel mundial (80-85%). En estos mismos estudios, se describe que las especies de ácaros más frecuentemente encontradas en los ecosistemas de los pacientes hogareños son: Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronyssinus y Blomia tropicalis. (2-4)

Estos artrópodos son organismos complejos en su composición proteica. Actualmente se han caracterizado más de 15 21 grupos de alérgenos en nueve especies de ácaros diferentes y se han clasificado de acuerdo a su identidad bioquímica (5-6).

El grupo 1 de ácaros intradomiciliarios, de interés para esta propuesta, se caracteriza por tener cistein proteasas que provocan síntomas clínicos claros en más del 80% de pacientes alérgicos a los ácaros. A la fecha se conocen las 20 características bioquímicas y moleculares de las cistein proteasas de Dermatophagoides pteronyssinus (Der p 1), Dermatophagoides farinae (Der f 1), Blomia tropicalis (Blo t 1) de interés para esta solicitud (7-8).

2.3. Estudios experimentales con oligopéptidos que producen inmunomodulación.

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Se ha demostrado que péptidos sintéticos inducen tolerancia antígeno específica, así como hipo respuesta en diversos modelos murinos tanto en enfermedades autoinmunes como en enfermedades alérgicas (9). Briner, et al., sensibilizaron ratones con el alérgeno de gato Fel d 1 y posteriormente demostraron la capacidad de péptidos derivados de alergenos para inhibir la producción de citocinas de células Th2 (10). Hoyne et al., administraron péptidos de Der p 2 intranasalmente a ratones. Los resultados demostraron un cambio en la respuesta Th2 hacia 30 Th1, luego de estimulación con la proteína natural intacta. (11) Astori, et al. al administrar oligopéptidos con epítopes de células T del alergeno Bet v 1 a ratones CBA/J. encontraron una proliferación de células T especificas hacia este alérgeno, la cual fue inhibida por tratamientos terapéuticos con el epítope antes descrito (12).

En otro modelo experimental murino, el alérgeno del veneno de Himenópteros, fosfolipasa A2 (PLA2; Api m 1). 35 moduló negativamente la síntesis de IgE específica, demostrándose una inhibición en su síntesis. Posterior al protocolo con IT experimental se confirma la modulación. (19) En conjunto, los estudios descritos anteriormente apoyan el uso de oligopéptidos provenientes de alérgenos nativos para modular la respuesta y la polarización Th1/Th2 de células T.

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2.3.1 Estudios experimentales con oligopéptidos en Humanos

Existe considerable evidencia experimental que demuestra que la Inmuno Terapia (IT) con péptidos modula la respuesta inmune. A la fecha se han desarrollado estudios con oligopéptidos sintéticos provenientes de 4 alérgenos: el alérgeno de gato Fel d 1, el alérgeno del veneno de abeja Api m 1, el alergeno del polen de ambrosia Amb a 1 y el 45 alérgeno de polen del cedro Japonés Cry j 2. (13)

Los primeros estudios emplearon una combinación de dos péptidos, provenientes de Fel d 1. (Allervax Cat, ImmuLogic Corp., Waltham, Mass). Al finalizar el tratamiento de IT en estos pacientes, se evidenció una mejoría significativa de los síntomas en los sujetos de estudio (14). 50

En otro estudio, doble ciego, placebo controlado con grupos paralelos, utilizando péptidos de Fel d 1 o placebo, administrados semanalmente en inyecciones subcutáneas (4x250 ug) en 42 pacientes con rinitis y/o asma alérgica a los alérgenos de gato, se obtuvieron resultados similares a el estudio anterior (15).

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Recientemente se han desarrollado otros estudios clínicos, usando mezclas de péptidos de secuencia corta de Fel d 1. Estos péptidos fueron administrados intradérmicamente a pacientes con asma alérgica sensibilizados con Fel d 1. Se demostró mejoría en los síntomas a pruebas de reto con este alérgeno en los sujetos del estudio, sin embargo se presentaron efectos adversos. Crisis asmáticas que fueron dependientes de la dosis, se observaron con una única inyección de la mezcla de 12 péptidos. Sin embargo se pudo evidenciar tolerancia al desafío varios meses 60 después. Adicionalmente, la evaluación de la respuesta de los PBMC a los alérgenos in vitro demostró reducción en la producción de las citocinas del perfil TH2 y marcada secreción de IFN-g. (13-15)

La misma mezcla de 12 péptidos fue administrada en dosis crecientes por dos semanas en un estudio doble ciego placebo controlado con 24 pacientes asmáticos alérgicos a los alérgenos de gato. Posteriormente se les hizo 65 pruebas de provocación, inhalando metacolina PC20 y alérgeno PD20. El tratamiento demostró una significativa

reducción tanto en las reacciones cutáneas de fase temprana como en la de fase tardía al desafío intradérmico con el alérgeno. En este mismo trabajo, también se pudo evidenciar una reducción en la respuesta proliferativa alérgeno específico, al igual que una reducción en la producción de citocinas del perfil Th2. Otro hallazgo importante de este estudio fue un incremento en la producción de IL-10 por parte de los PBMC. (13)

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2.4. Producción de anticuerpos IgY policlonales usando oligopéptidos sintéticos

Los anticuerpos son proteínas presentes en el suero y en los tejidos de los vertebrados y se unen específicamente a moléculas extrañas (antígenos), en una respuesta inmune adaptativa. Son un instrumento valioso en investigación con una amplia aplicación como reactivo diagnóstico y como herramienta terapéutica para el tratamiento de diversas 10 enfermedades. Los anticuerpos actualmente disponibles son anticuerpos monoclonales o policlonales comúnmente producidos en mamíferos como conejos, hámster, cabras, ovejas y caballos. El uso de estos animales presentan algunas dificultades: las dos primeras especies mencionadas, que son las más usadas, generan cantidades reducidas de suero y las otras son de difícil mantenimiento por su talla, alto costo de dieta y difícil manipulación (16). Una alternativa actual es la producción de anticuerpos policlonales obtenidos en yema de huevo de gallina (IgY). 15 Esta tecnología ha sido ampliamente utilizada en inmunología, bioquímica, biotecnología, salud humana y animal. En Alergología Experimental se ha demostrado que los anticuerpos IgY son capaces de identificar y cuantificar alergenos de nuez de Brasil, maní, péptidos alergénicos nativos de Fel d 1 y Amb a 1 recombinante.

En la producción y purificación de anticuerpos policlonales a partir de sangre de mamíferos se obtienen bajos niveles 20 de rendimiento y con procedimientos laboriosos en muchos casos. Las desventajas de las técnicas disponibles y la preocupación por los derechos de los animales realzan el interés en desarrollar métodos alternativos para la producción de anticuerpos. En el sentido de la protección animal, el uso de aves para la producción del anticuerpos representa un refinamiento en el que no hay que llevar a cabo procedimientos dolorosos para la toma de muestras de sangre. Todo esto es substituido por la recolección de los huevos. Aunque el hecho de que las gallinas 25 inmunizadas transfieran anticuerpos a la yema de huevo se conoce hace mucho tiempo, esta posibilidad alternativa de producir anticuerpos ha atraído la atención solamente en la última década (17-20).

Esta gran cantidad de anticuerpos producidos en la yema de huevo de gallinas, muy bien almacenados y muy estables, facilita su producción y aplicación en la detección de antígenos para diagnóstico en medicina humana, 30 como también en producción de conjugados. Además, disminuye considerablemente el número de animales utilizados para la producción, con respecto a otras especies (21).

Por ejemplo, Finlay W, et al., usaron el sistema de inmunoglobulinas aviares para proveer un método rápido para la generación de anticuerpos altamente específicos contra los alérgenos Fel d 1 recombinante y Amb a 1 nativo (22). 35 Al evaluar sus resultados por ELISA y Western blot lograron demostrar que obtuvieron anticuerpos IgY específicos contra estos alérgenos. Blais BW, et al., desarrollaron un inmunoensayo enzimático, Dot blot, para la detección de alergenos de maní, utilizando anticuerpos IgY pegados a platos de poliestireno y revelando con anticuerpos anti-alérgenos de maní conjugados con peroxidasa; obteniendo resultados excelentes (23). Burton WB, por su parte utilizó IgY en una ELISA sándwich para capturar y detectar inmunoespecíficamente proteínas alergénicas de nuez 40 de Brasil, logrando buenos resultados y recomendándolo como un método simple que podría apoyar a las agencias reguladoras de la industria alimenticia para descartar la presencia de alérgenos no declarados en alimentos y productos relacionados. Lo anterior ha demostrado que los anticuerpos IgY son capaces de identificar y cuantificar alérgenos en concentraciones menores de 1ppm en ensayos inmunohistoquímicos. (24)

45

2.5. Tecnología IgY en la detección de alérgenos

Los aeroalérgenos son partículas transportadas por el aire, capaces de producir alergia respiratoria, cutánea o conjuntival. Las sustancias que con mayor frecuencia producen cuadros alérgicos a través de la inhalación son: los pólenes, esporas de hongos, diferentes tipos de ácaros, cucaracha, epitelio de animales, y otras sustancias que 50 afectan directamente la mucosa respiratoria a través de una serie de procesos inmunológicos. La mayor parte de los alérgenos transportados por el aire suelen ser proteínas o sustancias unidas a proteínas. La mayoría resultan ser glicoproteínas solubles, sin características físico-químicas especiales, salvo un peso molecular comprendido entre 10,000 y 40,000 Da. El tamaño de los aeroalérgenos es también importante. Los alérgenos mejor conocidos varían entre 1 y 60 μm (91-93). 55

Los mecanismos protectores de la mucosa nasal y de las vías respiratorias (a través de los cilios que transportan las partículas a la orofaringe, siendo éstas deglutidas y desnaturalizadas rápidamente en el estómago) eliminan la mayoría de las partículas más grandes, de tal manera que sólo aquéllas de 3 μm o menores son capaces de alcanzar los alvéolos pulmonares. Ello explica una mayor exposición de las mucosas nasal y conjuntival, y de las 60 vías respiratorias superiores. Sin embargo, puesto que la mayoría de las partículas, dado su tamaño, no penetran en los bronquios terminales y alvéolos, deben considerarse otros mecanismos alternativos de respuesta de las vías aéreas. Un aeroalérgeno tendrá importancia clínica cuando reúna estas dos circunstancias: (1) poseer grupos antigénicos específicos capaces de provocar respuestas de hipersensibilidad en el hombre; y (2) encontrarse en concentración suficiente en el aire, de tal modo que el nivel de exposición sea adecuado para evocar una respuesta 65 inmunológica. Tales criterios, aparentemente sencillos, no siempre se consiguen a la vez en muchas de las

partículas alergénicas posibles. Existen muchas sustancias transportadas en el aire, tanto de origen vegetal y animal, como productos químicos, capaces de provocar síntomas alérgicos en individuos humanos sensibilizados. La respuesta individual depende de múltiples factores, tanto inherentes al sujeto alérgico, como al propio alérgeno: estado del sistema inmune, dosis de alérgeno, frecuencia y ruta de penetración, características físico-químicas, etc. (94) Entre los aeroalérgenos más importantes tenemos las proteínas de ácaros intradomiciliarios y cucaracha. 5 Anticuerpos IgY fueron usados por investigadores del Food and Drug Administration en Rockville, Maryland, Estados Unidos para la identificación y caracterización de nuevos alérgenos en extractos de cuerpo entero de Blattella germanica y Periplaneta americana demostrando gran especificidad y sensibilidad a estos anticuerpos. (95)

Investigadores del centro de Evaluación e Investigación Biológica en Bethesda, Maryland, Estados Unidos, 10 desarrollaron un sistema de inmunoglobulinas aviar para producir anticuerpos recombinantes altamente específicos para un alérgeno particular (Fel d 1 recombinante o Amb a 1 nativo) o para múltiples alérgenos (Fel d 1 recombinante y Amb a 1 nativo) de un mínimo de animales experimentales. Los fragmentos de anticuerpos IgY generados demostraron ser eficientes en identificación y cuantificación de alérgenos, en comparación con los inmunoensayos estándares. (96) 15

La alergia a los alimentos se presenta en el 1-8% de la población. (96-97) La presencia de alérgenos no declarados en alimentos representa un serio riesgo para individuos alérgicos, que pueden inducir reacciones a su exposición desde leves hasta severas. En Norte América y Europa, los alérgenos alimenticios comúnmente implicados en las reacciones alérgicas incluyen huevo, crustáceos, leche, pescado, soya, trigo, maní, nuez, frutos secos (tales como 20 avellanas, nuez de Brasil, etc.). (98-99)

Maní, nuez, y otros productos con componentes alergénicos son frecuentemente usados como ingredientes en la elaboración de alimentos para mejorar su sabor y calidad nutricional, y su presencia en tales alimentos debe ser claramente indicada para permitir su identificación por parte individuos alérgicos. Dado el riesgo de contaminación 25 inadvertida de alimentos con productos alergénicos durante su proceso de fabricación, la industria alimenticia y las agencias regulatorias requieren herramientas para monitorear la presencia de alérgenos. (100)

En este sentido la Agencia Canadiense para la Inspección de Alimentos desarrolló un Dot Blot para la detección de proteínas de maní en alimentos usando anticuerpos IgY anti-maní, y las proteínas de maní unidas fueron detectadas 30 por reacciones secuenciales con anticuerpos anti-IgY conjugados con peroxidasa y reveladas con un sustrato cromogénico. El ensayo dio resultados discernibles con concentraciones tan pequeñas como 0.03 ug/ml. Mientras que el umbral de la dosis exacta para las reacciones adversas en las personas sensibles al maní no se conoce, en un estudio se demostró que la ingestión de un mínimo de 100 mg de proteína de maní es capaz de provocar síntomas de una reacción alérgica. (101) Por tanto, este ensayo usando anticuerpos IgY demostró ser adecuado 35 para la detección de proteínas de maní a los niveles asociados con una reacción alérgica. La especificidad de los anticuerpos IgY contra las proteínas de maní, fue confirmada en estos experimentos, en donde se evaluó con extractos de legumbres, lentejas, frijol rojo, así como también con extractos similares de frutos secos, avellana, nuez de Brasil. (102) Sin embargo, dado que el Dot Blot es una prueba que no nos permite establecer las características dosis-respuestas precisas, Investigadores del Centro de Química Analítica en el Instituto de Agrobiotecnología, 40 Konrad Lorenz, Tulln-Austria, desarrollaron un inmunoensayo enzimático competitivo indirecto basado en la tecnología IgY, para la detección de proteínas de avellana en los alimentos, logrando un límite de detección de 10 ug/l y un límite de cuantificación de 30 ug/l. También reportaron una reactividad cruzada con diversos alimentos entre otros soya, frijoles, arroz, huevo, trigo. Esta reactividad cruzada disminuyó con la purificación de los anticuerpos IgY. (103-104) 45

Los ensayos descritos hasta ahora se diseñaron para la detección de alérgenos particulares. En el centro canadiense para la inspección de alimentos antes mencionado, diseñaron una prueba inmunoquímica para la detección simultánea de múltiples alérgenos usando anticuerpos IgY anti proteínas de avellana, nuez de Brasil, y maní, obteniendo límites de detección entre 1.0 y 0.1 ug / g; demostrando la viabilidad del diseño de pruebas 50 inmunoquímicas con anticuerpos IgY contra múltiples alérgenos. (104-105)

Se ha demostrado que la exposición a los alérgenos es un factor de riesgo para el desarrollo de enfermedades alérgicas respiratorias, así también como para el desencadenamiento de los síntomas y signos de la enfermedad alérgica respiratoria. Actualmente se promueve la reducción de los niveles de alérgenos a través de diversos 55 métodos y técnicas, todos ellos de limitada utilización en países en vías de desarrollo. El concepto de “Vida con bajos niveles en alérgenos” está siendo utilizado en Europa y Canadá. Existen estudios que sustentan la disminución de morbilidad y comorbilidad cuando se implementan estos protocolos de intervención ambiental. Para los pacientes es beneficioso poder realizar monitoreos ambientales de estos niveles en sus hogares y lugares de trabajo, a través de los cuales se logra un adecuado control de los espacios donde se realizan sus actividades 60 cotidianas.

US 5820862A divulga un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No 1. Este péptido contiene epítopos T que son reconocidos por los pacientes alérgicos a los ácaros intradomiciliarios. Este documento establece que los péptidos pueden comprender sustituciones de aminoácidos. El péptido divulgado en este 65 documento está comprendido en una composición farmacéutica y se usa en métodos diagnósticos y terapéuticos.

Garavito et al. (Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2009, 123, S223) divulga la generación de anticuerpos específicos para Der pl, Der fl y Blot tl usando péptidos derivados de estas proteínas, aunque las secuencias exactas de los péptidos usados para generar los anticuerpos no se describen específicamente.

5

W02007/140505 describe anticuerpos IgY contra 8 péptidos derivados del alérgeno de ácaros Der pl.

Los métodos convencionales de detección de ácaros emplean principalmente anticuerpos monoclonales, los cuales requieren de altos tiempos y costos de producción.

10

3. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La invención aquí descrita corresponde a un método para producir una composición de anticuerpos policlonales IgY útil como reactivo de diagnóstico, caracterizado porque comprende las etapas de:

a) preparar una composición inmunogénica que comprende al menos un péptido que consiste en una 15 secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos. 1, 2, 3, 5 y 6;

b) hiperinmunizar un ave con dicha composición inmunogénica;

c) extraer los anticuerpos policlonales IgY de la yema de huevo puesto por el ave;

d) purificar los anticuerpos policlonales IgY;

e) opcionalmente marcar los anticuerpos policlonales IgY; y, 20

f) opcionalmente generar inmunoconjugados de los anticuerpos policlonales IgY. Debido a que estos fragmentos proteicos se comportan como epítopeos T y B, de los alérgenos Der p I, Der f I y Blo t I, esto permitiría el uso de estas secuencias peptídicas sintéticas cortas, como una estrategia para la inducción de tolerancia periférica y de modulación del balance Th2/Th1, que conlleven en un futuro al diseño de protocolos terapéuticos en el manejo de estas patologías. Adicionalmente, dada su capacidad para funcionar como antígenos con muy buena avidez para 25 unir anticuerpos específicos, son usados adicionalmente en el desarrollo de pruebas diagnósticas que detecten alérgenos del grupo I de ácaros intradomiciliarios.

La invención está fundamentada en la evaluación y confirmación que los péptidos sintéticos aquí descritos son inmunógenos que inducen la producción de anticuerpos específicos para epítopos presentes en los alérgenos del 30 grupo I de los ácaros intradomiciliarios Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae y Blomia tropicalis. Estos péptidos corresponden a fragmentos proteicos diseñados y obtenidos de las proteínas alergénicas del grupo I de ácaros intradomiciliarios, Der p I, Der f I y Blo t I. Las ventajas del uso de estos péptidos sintéticos incluyen, pero no se limita, a su capacidad para inducir respuestas de células inmunocompetentes.

35

Para este efecto, los péptidos de la presente invención son incluidos en composiciones adecuadas para diferentes rutas de administración, por ejemplo, para administración vía parenteral y/o intramuscular en una solución acuosa estéril. Para la administración intravenosa, los transportadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, buffer fosfato salino (PBS), etc. Las soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas por incorporación de los compuestos activos (péptidos sintéticos), en las cantidades requeridas en un solvente 40 apropiado, y/o vehículo adecuado con una o más combinaciones con los ingredientes mencionados anteriormente.

Sin limitarlo a un mecanismo particular, los seis péptidos sintéticos inducen una respuesta inmune que permite identificar alérgenos del grupo I de ácaros intradomiciliarios y distinguen entre las especies de Dermatophagoides spp. y Blomia tropicalis. Los péptidos aquí descritos son químicamente puros e inducen respuestas específicas. 45 Los seis péptidos sintéticos se encuentran libres de material biológicamente activo, de suspensiones celulares, de restos de tejidos o de precursores químicos provenientes de su síntesis química.

Para determinar la homología de secuencias de aminoácidos entre los péptidos sintéticos y las proteínas naturales, las secuencias fueron alineadas con el propósito de una óptima comparación. Cuando el aminoácido de una 50 secuencia correspondió con el aminoácido ubicado en la segunda secuencia, se consideró que estas secuencias eran idénticas en esta posición. El número de aminoácidos que comparten posiciones idénticas determinan el grado de homología entre las secuencias comparadas.

Esta invención es un modelo experimental que induce la producción de anticuerpos específicos para epítopos de los 55 alérgenos del grupo I de los ácaros intradomiciliarios (Dermatophaoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae y Blomia tropicalis).

Las manipulaciones de las secuencias están incluidas dentro del alcance de la divulgación, estas modificaciones pueden ser desarrolladas durante su traducción o síntesis por ejemplo: glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones, 60 amidaciones, clivaje proteolítico, etc. Sustituciones de aminoácidos conservativas, pueden ser realizadas en los péptidos de uno o más residuos de aminoácidos no esenciales para la respuesta inmunológica.

Seis oligopéptidos sintéticos, inmunogénicos, diseñados a partir de la secuencia amino acídicas de las proteínas naturales de los alérgenos del grupo I de los ácaros intradomiciliarios: Dermatophagoides pteronyssinus, 65 Dermatophagoides farinae y Blomia tropicalis, los cuales son epítopos lineales con múltiples aplicaciones, tales

como la inducción de la producción de anticuerpos policlonales son acá divulgados. Las secuencias correspondientes a cada uno de los fragmentos oligopeptídicos y sus correspondientes números de identificación, los cuales incluyen secuencias de 17, 18, 19 y 20 aminoácidos, según sea cada caso específico, se relacionan a continuación:

5

Asimismo la presente invención corresponde a un primer método para producir una composición de anticuerpos policlonales IgY útil como reactivo de diagnóstico, caracterizado porque comprende las etapas de:

a) preparar una composición inmunogénica que comprende al menos un péptido que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos. 1, 2, 3, 5 y 6;

b) hiperinmunizar un ave con dicha composición inmunogénica; 10

c) extraer los anticuerpos policlonales IgY de la yema de huevo puesto por el ave;

d) purificar los anticuerpos policlonales IgY;

e) opcionalmente marcar los anticuerpos policlonales IgY; y,

f) opcionalmente generar inmunoconjugados de los anticuerpos policlonales IgY, y a un segundo método para la detección de alérgenos de ácaros que emplea la composición de anticuerpos IgY desarrollada en el 15 primer método. La presente invención también comprende la composición como tal de los anticuerpos policlonales IgY desarrollados en el primer método.

El primer método de la presente invención, permite obtener de manera reproducible y a un bajo costo una composición de anticuerpos policlonales IgY capaces de reconocer un amplio espectro de alérgenos de ácaros 20 intradomiciliarios pertenecientes a la familia de las cistein proteasas.

El segundo método permite las determinaciones de los niveles totales de alérgenos en muestras provenientes de ambientes intramuros que estén contaminados y colonizados por ácaros intradomiciliarios. El nivel de alérgenos se determina por la medición de cambios en las propiedades biofísicas de los reactantes en sistemas de identificación 25 a través de mecanismos inmunoquímicos cuando se comparan con estándares de referencia.

3.1. DISEÑO DE LOS PÉPTIDOS

3.1.1. Análisis de secuencias 30

Con el propósito de determinar homología entre las secuencias (similitud e identidad. (Anexo 1) se desarrollaron alineamientos de las secuencias de aminoácidos usando los softwares BLAST (Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., and. Lipman D.J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research 25(17): 3389-3402.), ClustalW (Higgins D., Thompson 35 J., Gibson T., Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J.(1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22: 4673-4680.) y Protscale (Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Human Press (2005). pp. 571-607). 40

Los resultados de estos análisis (Figuras 18-23) permiten establecer regiones consenso entre los tres diferentes alérgenos del grupo 1 de interés para esta solicitud. Con la información anterior se diseñaron dos péptidos universales identificados como secuencia 2 y 3. Las regiones disimiles identificadas en el análisis anterior fundamentaron el diseño de los cuatro péptidos restantes. 45

Breve Descripción de las Figuras 18-22 de alineamiento de secuencias.

Fig. 18. Representa el alineamiento de los alérgenos del grupo 1 de ácaros intradomiciliarios, (proDer p 1, proDer f 1, y Blo t 1) en este podemos observar un alto grado de homología entre las proDer p 1 y pro Der f 1, con un 50 porcentaje de identidad del 83 %, entre pro Der p 1 y Blo t 1 de 33 % y entre pro Der f 1 y Blo t 1 del 34%.

Fig. 19. Representa el alineamiento de los alérgenos del grupo 1 de ácaros intradomiciliarios, (proDer p 1, proDer f 1, Blo t 1 y Seq Nº 3) en esta podemos observar que la Seq Nº 2 comparte 12 de sus 17 aminoácidos.

55

Fig. 20. Representa el alineamiento de los alérgenos del grupo 1 de ácaros intradomiciliarios, (proDer p 1, proDer f 1, Blo t 1 y Seq Nº 4) en esta podemos observar que la Seq Nº 3 comparte solo 2 de sus 20 aminoácidos, permitiría discriminar entre los géneros Dermatophagoides y el género Blomia.

Fig. 21. Representa el alineamiento de los alérgenos del grupo 1 de ácaros intradomiciliarios, (proDer p 1, proDer f 60 1, Blo t 1 y Seq Nº 5) en esta podemos observar que la Seq Nº 4 comparte solo 3 de sus 20 aminoácidos, permitiría discriminar entre los géneros Dermatophagoides, del género Blomia.

Fig. 22. Representa el alineamiento de los alérgenos del grupo 1 de ácaros intradomiciliarios, (proDer p 1, proDer f 1, Blo t 1 y Seq Nº 6) en esta podemos observar que la Seq Nº 5 comparte solo 2 de sus 20 aminoácidos, permitiría 65 discriminar entre los géneros Dermatophagoides, del género Blomia.

Fig. 23. Representa el alineamiento de los alérgenos del grupo 1 de ácaros intradomiciliarios, (proDer p 1, proDer f 1, Blo t 1 y Seq Nº 8) en esta podemos observar que la Seq Nº 6 comparte solo 3 de sus 20 aminoácidos, permitiría discriminar entre los géneros Dermatophagoides, del género Blomia.

5

A continuación se presentan y se identifican las secuencias correspondientes a cada uno de los seis péptidos:

SEQ ID Nº 1 DER P 1 UN1: Fragmento oligopeptídico diseñado a partir de la región consenso entre las proteínas Derp 1, Derf 1 y Blot 1 y que presenta la secuencia específica

10

TNACSINGNAPAEIDLRQMR (20 aa)

SEQ ID N°2 DER P 1 PUJ1 homólogo.- Fragmento oligopeptídico diseñado a partir de la región consenso entre las proteínas Derp 1, Derf 1 y Blot 1 y que presenta la secuencia específica

15

PIRMQGGCGSCWAFSGV (17 aa)

SEQ ID N°3 DER P 1 PUJ2 homólogo: Fragmento oligopeptídico diseñado a partir de la región consenso entre las proteínas Derp 1, Derf 1 y Blot 1 y que presenta la secuencia específica

20

DYWIVRNSWDTNWGDNGYGY (20 aa)

SEQ ID N° 4 DER P 1 PUJ3: Fragmento oligopeptídico diseñado a partir de la región consenso entre las proteínas Derp 1, Derf 1 y Blot 1 y que presenta la secuencia específica

FRHYDGRTIIQRDNGYQPNY (20 aa) 25

SEQ ID N° 5 BLO T 1 UN2: Fragmento oligopeptídico diseñado a partir de la región consenso entre las proteínas Derp 1, Derf 1 y Blot 1 y que presenta la secuencia específica

IPANFDWRQKTHVNPIRNQG (19 aa)

30

SEQ ID N° 6 BLO T 1 PUJ4:- Fragmento oligopeptídico diseñado a partir de la región consenso entre las proteínas Derp 1, Derf 1 y Blot 1 y que presenta la secuencia específica

AHFRNLRKGILRGAGYNDAQ (20 aa)

35

3.1.2. Mapeo de epítopos

Con el propósito de establecer si nuestras secuencias estaban informadas en la base de datos Immuneepitope, (NIAID-NIH) se utilizaron los softwares Epitope sequence and 3D structural homology mapping y Epitope viewer (Beaver JE, Bourne PE, Ponomarenko JV. 2007. EpitopeViewer: a Java application for the visualization and analysis 40 of immune epitopes in the Immune Epitope Database and Analysis Resource (IEDB). Immunome Res 3:3.), para definir en una búsqueda entre las secuencias informadas de epítopos en estas bases de datos, si las secuencias de los oligopéptidos descritas en esta invención eran idénticas a las descritas a la fecha para las proteínas de esta base de datos y para evidenciar las características estructurales de las secuencias en la estructura tridimensional de la proteína Der p1 (PDB). 45

Experiencias previas nos han permitido diferenciar enzimas homólogas de una misma familia haciendo uso de la metodología descrita. La gran mayoría de la experiencia que la literatura reporta en la modulación de la respuesta inmune, cuando de evaluación de la cascada inmunológica alérgica se trata, se ha logrado con proteínas y/o péptidos recombinantes. Podemos asegurar que no existe a la fecha informes previos del uso de péptidos sintéticos 50 de alérgenos de ácaros intradomiciliarios para producir respuestas adaptativas específicas en organismos inmunocompetentes.

En la industria farmacéutica se desarrolla actualmente la búsqueda de nuevos fármacos y/o medicamentos en la terapia biológica, que incluyen el uso de proteínas completas o péptidos recombinantes. El uso de péptidos 55 sintéticos provenientes de diferentes alérgenos, con capacidad de generar respuesta inmune adaptativa representa un modelo experimental hacia el logro de estos objetivos

A continuación se presentan los resultados de los análisis que soportan que los péptidos acá divulgados no han sido identificados como epítopos en las bases de datos para tal fin, así como tan poco se han reportado péptidos 60 similares.

PÉPTIDO 1

En la Figura 5A se presenta el Péptido 1, diseñado con base en las proteínas alergénicas del grupo I. Esta no ha 65 sido reportada en la base de datos “ImmuneEpitope”, dado que no se resalta en naranja.

Podemos observar en esta Figura 5B cómo el péptido 1, presenta aminoácidos enterrados (azul) aminoácidos expuestos (rojo), y aminoácidos medio expuestos y medio enterrado enterrados (sin color). Esta secuencia se encuentra en la superficie de la proteína madura. (Ver imagen 3D)

5

PÉPTIDO 2

En la Figura 6A observamos al Péptido 2, diseñado con base en las proteínas alergenicas del grupo I, se encuentra en la proteína madura. Esta no ha sido reportada en la base de datos”ImmuneEpitope”, dado que no se resalta en 10 naranja.

Podemos observar en la Figura 6B como la secuencia 2, presenta aminoácidos enterrados (azul) aminoácidos expuestos (rojo), y aminoácidos medio expuestos y medio enterrado enterrados (sin color). Esta secuencia presenta una gran región enterrada, debido a esto es posible que los epítopes presentes en esta secuencia se encuentre 15 entre los aminoácidos entre la prolina (24) y la cisterna (31) de la proteína madura. (Ver imagen 3D)

PÉPTIDO 3

En la Figura 7A observamos el Péptido 3, diseñado con base en las proteínas alergénicas del grupo I. Esta 20 secuencia se encuentra en la proteína madura. Esta no ha sido reportada en la base de datos “ImmuneEpitope”, pues no aparece en color naranja.

En la Figura 7B podemos observar como la secuencia 3, en la estructura tridimensional presenta aminoácidos 25 enterrados: (azul) aminoácidos expuestos (rojo) y aminoácidos expuestos parcialmente (sin color). La secuencia del péptido 1 se encuentra en la superficie de la proteína madura. (Ver imagen 3D)

PÉPTIDO 4

30

En la Figura 8A observamos al Péptido 4, diseñado con base en las proteínas alergenicas del grupo I, esta secuencia se encuentra en la proteína madura. Esta no ha sido reportada en la base de datos immune epítopo, dado que no se resalta en naranja.

Podemos observar en la Figura 8B como la secuencia 4, presenta aminoácidos enterrados (azul) aminoácidos 35 expuestos (rojo), y aminoácidos medio expuestos y medio enterrado enterrados (sin color). Esta secuencia se encuentra en la superficie de la proteína madura. (Ver imagen 3D)

PÉPTIDO 5

40

En la Figura 9A observamos al Péptido 5, diseñado con base en las proteínas alergenicas del grupo I. Esta no ha sido reportada en la base de datos “ImmuneEpitope”, dado que no se resalta en naranja. Para Blo t 1 no se ha reportado experimentalmente su estructura 3D, por tal razón, realizamos el mapeo en la estructura de la proteína madura Der p 1 con la cual presento una identidad del 37 % (11 de 19 aminoácidos) (ver segundo alineamiento). Podemos observar en esta gráfica como la secuencia 6, presenta aminoácidos enterrados (azul) aminoácidos 45 expuestos (rojo), y aminoácidos medio expuestos y medio enterrados (sin color) en la Figura 9B.

PÉPTIDO 6

En la Figura 10 A observamos al Péptido 6, diseñado con base en las proteínas alergénicas del grupo I. Esta no ha 50 sido reportada en la base de datos ”ImmuneEpitope, dado que no se resalta en naranja. Para Blo t 1 no se ha reportado experimentalmente su estructura 3D. Podemos observar en esta gráfica como la secuencia 5, presenta aminoácidos enterrados (azul) aminoácidos expuestos (rojo), y aminoácidos medio expuestos y medio enterrado enterrados (sin color) en la Figura 10B.

55

3.1.3. Descripción de la síntesis de los péptidos

Los oligopéptidos anteriormente descritos en la presente invención fueron producidos por síntesis química aplicando química F-moc en fase sólida. El principio general de este método se basa en ciclos repetidos de acoplamiento y desprotección usando al
9H-(f)luoren-9-yl(m)eth(o)xy(c)arbonil, como grupo protector del extremo N-terminal de los 60 péptidos en crecimiento. Se utilizó la máquina 396 de Advantace Chemtech, se purificaron por cromatografías FPLC y posteriormente liofilizados. La pureza de los péptidos se verifico por: RP-HPLC usando un cromatógrafo Waters. A cada uno de ellos se le confirmo su identidad por espectrometría de masas y su longitud oscilo entre 17 y 20 aminoácidos.

65

3.1.4. Evaluación capacidad inmunogénica:

EJEMPLO 1:

OLIGOPÉPTIDO SINTÉTICO - PÉPTIDO 2 - DISEÑADO A PARTIR DE LAS SECUENCIAS HOMÓLOGAS DE LOS ALÉRGENOS DEL GRUPO I DE ÁCAROS INTRADOMICILIARIOS QUE PRODUCE ANTICUERPOS IGY 5 POLICLONALES ANTI-ALÉRGENOS DEL GRUPO I DE ÁCAROS INTRADOMICILIARIOS

PÉPTIDO EVALUADO PÉPTIDO 2:

SECUENCIA: PIRMQGGCGSCWAFSGV 10

Para demostrar la capacidad inmunogénica de este péptido, se describe el uso de esta secuencia en la generación de anticuerpos específicos. En el grupo de experimentos se utilizó un modelo experimental aviar, representado por gallinas Hi Line Brown, inmunizadas con el péptido 2, usando adyuvante completo de Freund durante la primera inmunización y adyuvante incompleto de Freund, para las tres inmunizaciones posteriores descritas en el protocolo de inmunización utilizado. Como control positivo, se inmunizaron gallinas con BSA y como control negativo, gallinas 15 sin ninguna inmunización. Los anticuerpos se extrajeron de la yema de huevo usando un solvente orgánico y se purificaron por cromatografía tiofílica. Se desarrollaron pruebas ELISA Indirecta para medir el título de anticuerpos y se determinó su especificidad por ELISA Indirecta. (25-26)

A continuación se presentan los resultados de un conjunto de experimentos que validan la inmunogenicidad de los péptidos. Como reactantes se utilizaron: l extractos alergénicos de Dpt, y Bt. 20

En la Figura 11 se ilustra el Elisa para el péptido 2. Los resultados de muestran los valores de DENSIDAD OPTICA (DO) resultantes de la interacción de los anticuerpos IgY anti - P02 con los extractos usados.

Resultado: 25

Las DO para los IgY anti P02 presentan un comportamiento semejante a lo largo de las fechas evaluadas con los extractos de Dpt y Bt. Se aprecia una mayor DO de estos IgY anti P06 contra las proteínas de Bt. Los picos de DO sobresalientes en la gráfica coinciden para las proteínas de las tres especies estudiadas.

Conclusiones: El oligopéptido sintético P02 (péptido universal de grupo 1 de ácaros intradomiciliarios) induce la 30 producción de anticuerpos IgY anti-P06 que reconocen epítopes B y/o T en las proteínas nativas de las especies de los ácaros intradomiciliarios Df, Dp y Bt.

EJEMPLO 2:

35

OLIGOPÉPTIDO SINTÉTICO - PÉPTIDO 6 - DISEÑADO A PARTIR DE LA SECUENCIA DE EL ALÉRGENO BLO T 1, QUE PRODUCE ANTICUERPOS IGY POLICLONALES ANTI-ALÉRGENOS DEL GRUPO 1 DE ÁCAROS INTRADOMICILIARIOS

PÉPTIDO EVALUADO PÉPTIDO 6: 40

SECUENCIA: AHFRNLRKGILRGAGYNDAQ

Para demostrar la capacidad inmunogénica de este péptido se describe el uso de este oligopéptido en la generación de anticuerpos IgY que reconocen alérgenos de los géneros Dp y Bt, En el grupo de experimentos se utilizó un modelo experimental aviar, representado por gallinas Hi Line Brown, inmunizadas con el péptido 2, usando 45 adyuvante completo de Freund durante la primera inmunización y adyuvante incompleto de Freund, para las tres inmunizaciones posteriores descritas en el protocolo de inmunización utilizado. Como control positivo, se inmunizaron gallinas con BSA y como control negativo, gallinas sin ninguna inmunización. Los anticuerpos se extrajeron de la yema de huevo con un solvente orgánico y se purificaron por cromatografía tiofílica. Se desarrollaron pruebas ELISA Indirecta para medir el título de anticuerpos, y se determinó su especificidad por ELISA Indirecta. 50 (25-26)

Se desarrollaron ELISAS indirectas usando como antígenos extractos de Dpt, y Bt. Se evalúo con los extractos de Anticuerpo IgY anti P02. En la Figura 12 se ilustran los resultados de Elisa para el péptidos 6.

Resultado: Las DO para las IgY anti P02 presentan un comportamiento semejante a lo largo de las fechas 55 evaluadas con los extractos de Dpt y Bt. Se aprecia una mayor DO de estos IgY anti P02 contra las proteínas de Bt. Los picos de DO sobresalientes en la gráfica coinciden para las proteínas de las especies estudiadas.

Se logró obtener anticuerpos IgY policlonales específicos para los géneros Dp y Bt del grupo 1 de ácaros intradomiciliarios utilizando oligopéptidos sintéticos P02.

Conclusiones: El oligopéptido sintético P02 del grupo 1 de ácaros intradomiciliarios induce la producción de anticuerpos IgY anti-P06 que reconocen epítopes B y/o T en las proteínas nativas de los ácaros pertenecientes a los géneros Dp y Bt.

EJEMPLO 3: 5

OLIGOPÉPTIDO SINTÉTICO - PÉPTIDO 1 - DISEÑADO A PARTIR DE LAS SECUENCIAS DE LOS ALÉRGENOS DER P1 Y DER F1 DEL GENERO DERMATOPHAGOIDES QUE PRODUCE ANTICUERPOS IGY POLICLONALES ANTI-ALÉRGENOS DEL GRUPO 1 DE ÁCAROS INTRADOMICILIARIOS

10

PÉPTIDO EVALUADO PÉPTIDO 1:

SECUENCIA: TNACSINGNAPAEIDLRQMR

Para demostrar la capacidad inmunogénicas de este péptido se describe el uso de este oligopéptido en la generación de anticuerpos IgY que reconocen alérgenos de los géneros Dp y Bt, En el grupo de experimentos se 15 utilizó un modelo experimental aviar, representado por gallinas Hi Line Brown, inmunizadas con el péptido 4, usando adyuvante completo de Freund durante la primera inmunización y adyuvante incompleto de Freund, para las tres inmunizaciones posteriores descritas en el protocolo de inmunización utilizado. Como control positivo, se inmunizaron gallinas con BSA y como control negativo, gallinas sin ninguna inmunización. Los anticuerpos se extrajeron de la yema de huevo con un solvente orgánico y se purificaron por cromatografía tiofílica. Se desarrollaron 20 pruebas ELISA Indirecta para medir el titulo de anticuerpos, y se determinó su especificidad por ELISA Indirecta. (25-26)

Se desarrollaron ELISAS INDIRECTAS usando como antígenos los extractos de Dpt y Bt. Se evalúo con los extractos crudos de Anticuerpo IgY anti P04. En la Figura 13 se ilustran los resultados del ELISA para el péptido 1.

25

Experimento:

Se desarrollaron ELISAS INDIRECTAS usando como antígenos los extractos de Dpt, y Bt. Se evalúo con los extractos crudos de Anticuerpo IgY anti P04

Resultado: 30

Las DO para los IgY anti P01 presentan un comportamiento semejante a lo largo de las fechas evaluadas con los extractos de Dpt y Bt. Se aprecia una mayor DO de estos IgY anti P01 contra las proteínas Bt. Los picos de DO sobresalientes en la gráfica coinciden para las proteínas de las especies estudiadas.

Se logró obtener anticuerpos IgY policlonales específicos del grupo 1 de ácaros intradomiciliarios utilizando oligopéptidos sintéticos P04. 35

Conclusiones: El oligopéptido sintéticos P01 del grupo 1 de ácaros intradomiciliarios induce la producción de anticuerpos IgY anti-P04 que reconoce epítopes B y/o T en las proteínas nativas de los ácaros intradomiciliarios Dp y Bt.

EJEMPLO 4:

OLIGOPÉPTIDO SINTÉTICO - PÉPTIDO 5- DISEÑADO A PARTIR DE LA SECUENCIA DE EL ALÉRGENO BLO 40 T 1, QUE PRODUCE ANTICUERPOS IGY POLICLONALES ANTI-ALÉRGENOS DEL GRUPO 1 DE ÁCAROS INTRADOMICILIARIOS

PÉPTIDO EVALUADO PÉPTIDO 5:

45

SECUENCIA: IPANFDWRQKTHVNPIRNQG

Para demostrar la capacidad inmunogénica de este péptido se describe el uso de esta secuencia en la generación de anticuerpos específicos. Se utilizó un modelo experimental aviar, representado por gallinas Hi Line Brown, inmunizadas con el péptido 5, usando adyuvante completo de Freund durante la primera inmunización y adyuvante 50 incompleto de Freund, para las tres inmunizaciones posteriores descritas en el protocolo de inmunización utilizado. Como control positivo, se inmunizaron gallinas con BSA y como control negativo, gallinas sin ninguna inmunización. Los anticuerpos se extrajeron de la yema de huevo con un solvente orgánico y se purificaron por cromatografía tiofílica. Se desarrollaron pruebas ELISA Indirecta para medir el título de anticuerpos, y se determinó su especificidad por ELISA Indirecta (Figura 14) 55

Experimento: Se desarrollaron ELISAS indirectas usando como antígenos los extractos de Dpt, y Bt. Se evaluó con los extractos crudos de anticuerpo IgY anti P05 (Bt).

Resultado: Las DO para las IgY anti P05 son considerablemente mayores para Bt y Df en comparación con Dpt. Se logró la obtención de anticuerpos IgY policlónales específicos del grupo 1 de ácaros intradomiciliarios utilizando oligopéptidos sintéticos P05.

Conclusiones: El oligopéptido sintético P05 del grupo 1 de ácaros intradomiciliarios induce la producción de 5 anticuerpos IgY anti-P05 que reconoce epítopes B y/o T en las proteínas nativas de los ácaros intradomiciliarios Dp y Bt.

3.2. MÉTODO DE OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES IGY Y MÉTODO DE DETECCIÓN DE ALÉRGENOS DE ÁCAROS.

10

Una modalidad de la invención aquí descrita corresponde al método para la obtención de una composición de anticuerpos policlonales IgY útil como reactivo diagnóstico de bajo costo y alta especificidad, para la detección de alérgenos de ácaros intradomiciliarios, dicho método comprende las etapas de:

a) preparar una composición inmunogénica que comprende al menos un péptido que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos. 1, 2, 3, 5 y 6; 15

b) hiperinmunizar un ave con dicha composición inmunogénica;

c) extraer los anticuerpos policlonales IgY de la yema de huevo puesto por el ave;

d) purificar los anticuerpos policlonales IgY;

e) opcionalmente marcar los anticuerpos policlonales IgY; y,

f) opcionalmente generar inmunoconjugados de los anticuerpos policlonales IgY. La invención 20 también abarca la composición de anticuerpos policlonales IgY como tal obtenidos por dicho método.

La presente invención también se refiere a un método para la detección de alérgenos de ácaros intradomiciliarios en muestras de polvo provenientes de ambientes tales como dormitorios, oficinas, guarderías, hoteles, cine, etc. usando una composición de anticuerpos policlonales IgY obtenidos mediante el primer método descrito en esta 25 solicitud, que son específicos para alérgenos del grupo 1 de ácaros y que permiten la detección de alérgenos en bajas concentraciones (de hasta 0.03g/mL).

Con el primer método de la invención se logran obtener anticuerpos policlonales IgY con una alta especificidad, que reconocen alérgenos de ácaros intradomiciliarios, y que son inducidos por péptidos sintéticos especiales, que 30 permiten dirigirlos a regiones particulares de proteínas de ácaros. Los anticuerpos policlonales IgY obtenidos en la presente invención son los únicos anticuerpos IgY descritos a la fecha, que son específicos para alérgenos de ácaros intradomiciliarios, pues los anticuerpos anti-alérgenos de ácaros descritos hasta el momento corresponden a anticuerpos monoclonales. Los péptidos sintéticos empleados en el método de la invención para la obtención de anticuerpos policlonales IgY son diseñados a partir de los diferentes alérgenos del grupo1 de ácaros 35 intradomiciliarios y, son aquellos de secuencias SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 5, SEQ ID No 6 divulgados anteriormente.

Los métodos convencionales para la producción de anticuerpos IgY utilizan proteínas naturales y/o recombinantes, las cuales generan anticuerpos contra cualquier región de la proteína, afectando la especificidad de la reacción. Los 40 péptidos sintéticos son compuestos químicamente bien definidos y, por lo tanto, permiten reducir la variabilidad interensayo e intraensayo. A diferencia de los antígenos que se obtienen por cultivo, los sintéticos permiten realizar estudios con epítopos de difícil acceso.

En el presente caso, el uso de péptidos sintéticos diseñados con base en las proteínas naturales de los ácaros 45 intradomiciliarios, y que preferentemente comprenden o consisten en las secuencias SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5, SEQ ID No 6, permite que estos anticuerpos IgY se unan a epítopos moleculares característicos de diferentes cistein proteasas de ácaros intradomiciliarios, particularmente a las cistein proteasas de los ácaros Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, y Blomia tropicalis, principales agentes desencadenantes de enfermedad alérgica respiratoria en el trópico. Asimismo, el uso de la 50 tecnología IgY permite obtener grandes volúmenes de anticuerpos IgY, lo cual facilita su masificación y transferencia al sector productivo.

Adicionalmente, la presente invención proporciona ún método pára la detección de alérgenos de ácaros intradomiciliarios en muestras de polvo, basado en técnicas inmuno enzimáticas, inmunocromatográficas y/o 55 electrotransferencia, que emplea la composición de anticuerpos desarrollada en la presente invención, los cuales han demostrado ser muy eficientes en la detección de los alérgenos del grupo 1 de ácaros intradomiciliarios con un límite de detección de 0.03ug/ml.

El desarrollo de anticuerpos policlonales de alta especificidad y gran sensibilidad, permite efectuar una detección 60 confiable de los alérgenos de ácaros intradomiciliarios, a un menor costo que los métodos que emplean anticuerpos monoclonales, pero obteniendo resultados comparables a estos.

El método de detección de alérgenos en muestras de polvo involucra una secuencia de eventos que van desde recolección de las muestras de polvo, producción del extracto proteico, y evaluación y análisis de las mismas.

3.2.1. MÉTODO PARA LA OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES IGY.

5

El primer método, que conduce a la manufactura de una composición de anticuerpos policlonales IgY, útil como reactivo diagnóstico de bajo costo para ácaros intradomiciliarios consiste en las etapas de:

a) preparar una composición inmunogénica que comprende al menos un péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID N°. 1, 2, 3, 4, 5 y 6;

b) hiperinmunizar gallinas de la variedad Hy Line Brown, de 16 - 20 semanas de edad; 10

c) extraer los anticuerpos policlonales IgY de la yema de huevo puesto por el ave;

d) purificar los anticuerpos policlonales IgY,

e) opcionalmente marcar los anticuerpos policlonales IgY; y,

f) opcionalmente generar inmunoconjugados de los anticuerpos policlonales IgY.

15

En el paso a), para la preparación de la composición de péptidos se toman entre 50-150 ul de los péptidos sintéticos diluidos en agua estéril con una concentración entre 100 y 300ug/ml y se homogenizan con 50-150 ul del adyuvante.

En el paso b), durante la inmunización de las gallinas se realizan entre 3 y 6 inmunizaciones intramuscularmente en los músculos pectorales (pechuga) a intervalos de 2-3 semanas durante 2-3 meses. El antígeno (péptido sintético) 20 es inyectado a una concentración de 50-200 µg/ml, emulsificado en adyuvante completo de Freund® durante las primeras inmunizaciones (1-2) y en adyuvante incompleto de Freund® para los refuerzos siguientes.

En el paso c), el aislamiento de los anticuerpos se efectúa separando cuidadosamente la yema de huevo de la clara, midiendo los volúmenes, tanto de la yema como de la clara. Se delipida mediante el uso de un solvente orgánico 25 (v.gr. cloroformo). El contenido de la yema se emulsifica en 0,5 - 2 veces su volumen en un buffer acuoso (v.gr. PBS); posteriormente, 1,5 - 3 volúmenes del solvente orgánico son adicionados y la mezcla es incubada a temperatura ambiente entre 1 - 3 horas; centrifugada a 2000-4000 rpm por 10-30 minutos a una temperatura entre 14 y 25°C y el sobrenadante es recolectado y almacenado para su posterior purificación.

30

En el paso d) la purificación se realiza por cromatografia de columna, v.gr. cromatografía tiofílica. En este caso se utiliza un soporte de Sefarosa CL4B activado con divinilsulfona (DVS) acoplado a β- mercaptoetanol (β-MESH), el soporte activo se equilibra en tampón de fosfatos 50 mM pH 6,8-7,8, se adiciona con Na2SO4 0,5 M (tampón de equilibrio). Posteriormente una dilución ½ de la muestra en tampón de equilibrio se adiciona al soporte de sefarosa activado. La elusión de la proteína retenida (anticuerpos policlonales IgY) se obtiene mediante la adición del tampón 35 de fosfatos 50 mM pH 6.8-7.8.

Una vez son obtenidos los anticuerpos éstos son evaluados por técnicas inmunoquimicas conocidas, como por ejemplo ELISA indirecta. Los extractos alergénicos de los ácaros Dermatophagoide pteronyssinus, Dermatophagoides farinae y/o Blomia tropicalis son diluidos en PBS 1X y se adiciona a una placa de poliestireno, se 40 incuba a 37ºC durante 15-24 horas en cámara húmeda. La placa se bloquea con solución de bloqueo (v.gr., PBS, Tween 0.05%, Leche descremada al 5%), se incuba durante 1-3 horas a 37ºC en cámara húmeda. Seguidamente se lava con solución de lavado (v.gr., PBS, Tween 0.05%). Se adicionan series de diluciones dobles de los anticuerpos (IgY producidas mediante el primer método de la invención) en las placas de poliestireno previamente tratadas y se incuba durante 0,5-2 horas a 37ºC en cámara húmeda, seguido de lavados en las condiciones 45 descritas anteriormente. Finalmente, se adicionan anticuerpos Anti-IgY, conjugados (v.gr., Anti-IgY conjugada con peroxidasa) diluido 1/1000, se revela con sustrato (v.gr., TMB 3,3´,5,5´tetrametilbenzidina), la reacción se detiene con HCl 1N y se lee a una longitud de onda de 450nm. La anterior evaluación también puede efectuarse empleando técnicas inmunoquímicas directas conocidas en el arte.

50

Adicionalmente, en varias modalidades de la invención los anticuerpos policlonales IgY son marcados de acuerdo con técnicas de marcaje conocidas en la técnica o pueden formar inmunoconjugados como por ejemplo, inmunoconjugados con partículas de oro coloidal o biotina.

3.2.2. MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE ALÉRGENOS DE ÁCAROS. 55

El segundo método de la invención, dirigido a la detección de los alérgenos en muestras de polvo comprende las etapas de:

1. Toma de muestras de polvo de ambientes en los cuales este presente o se sospeche están 60 presente los ácaros intradomiciliarios;

2. Preparación de extracto de proteínas de las muestras de polvo;

3. Desarrollo de pruebas inmunoquímicas con la composición de anticuerpos policlonales IgY obtenidos usando el primer método, evaluando la presencia de los alérgenos en las muestras colectadas previamente. 65

En la etapa 1 se usa una aspiradora manual, en un área de 1 a 2 m2 usando una bolsa de recolección independiente por área a evaluar.

En la etapa 2 se toman entre 10-30 mg de polvo, se adiciona 1-3 mL de buffer de extracción (v.gr., PBS 1X - Tween 20 al 0,05% v/v), seguido de agitación por 1-3 minutos a temperatura ambiente. Las proteínas disueltas en la fase 5 acuosa se separan del material insoluble por centrifugación a 2.700 a 3.700 r.p.m por 3-8 minutos. Con el fin de asegurar la completa separación, el sobrenadante se depura con un filtro de 0,22 μm. tomando el sobrenadante para su posterior análisis.

El contacto del extracto proteíco con la composición de anticuerpo IgY y la detección del alérgeno se efectúa de 10 manera directa por métodos conocidos en el estado del arte, o de manera indirecta como se muestra en la Figura 5.

Para la detección de forma indirecta, se incuba la placa de poliestireno con el extracto de proteínas del polvo, luego se incuba nuevamente con los anticuerpos IgY anti alérgenos del grupo 1 de ácaros intradomiciliarios y posteriormente con el anticuerpo anti-IgY conjugado (p.ej., conjugado con peroxidasa), la reacción se revela 15 agregando el sustrato (p.ej., TMB) y se detecta la absorbancia a 450 nm. La detección se efectúa por la correlación del cambio de color o fluorescencia a la presencia de los alérgenos de ácaros tal como se muestra en la Figura 15

EJEMPLO 5:

MÉTODO PARA LA OBTENCIÓN DE UNA COMPOSICIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES IgY ÚTIL 20 COMO REACTIVO DIAGNÓSTICO DE BAJO COSTO PARA LA DETECCIÓN DE ALÉRGENOS DE ÁCAROS INTRADOMICILIARIOS.

Se emplearon los péptidos SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5, SEQ ID No 6 o que tienen un 85% de homología con estos, se emulsificaron a una concentración 100 µg/ml en adyuvante completo 25 de Freund para una primera inmunización y en adyuvante incompleto para las inmunizaciones subsiguientes.

Se inmunizaron gallinas ponedoras de 16 - 20 semanas de edad en cuatro inmunizaciones intramuscularmente en los músculos pectorales (pechuga) a intervalos de 2 semanas durante 2 meses y se colectaron diariamente los huevos, marcados y almacenados a 4ºC. 30

Se separaron cuidadosamente la yema y la clara de huevo, midiendo los volúmenes de cada una; se emulsificó la yema en igual volumen de PBS y se adicionaron 2 volúmenes de cloroformo para delipidar; se incubó la mezcla a temperatura ambiente 2 horas; se centrifugó a 3500 rpm por 15 minutos a una temperatura entre 17°C y se recolectó el sobrenadante; 35

Los anticuerpos fueron purificados utilizando el soporte de Sefarosa CL4B activado con divinilsulfona (DVS), al cual se acopló β- mercaptoetanol (β-MESH) Dos mililitros del soporte activo se equilibraron en tampón de fosfatos 50 mM pH 7,4 adicionado con Na2SO4 0,5 M (tampón de equilibrio). Posteriormente una dilución 1:2 de la muestra en tampón de equilibrio se adicionó al soporte de sefarosa. La elusión de la proteína retenida se obtuvo mediante la 40 adición del tampón de fosfatos 50 mM pH 7.4.

La cantidad de proteína en los extractos se cuantificó por los métodos de Bradford y Lowry, para los cuales se preparó una solución del colorante diluida 1:5 a la que se le adicionaron 100 l de la muestra, la densidad óptica (DO) se leyó a 595 nm. La concentración de proteínas se determinó extrapolando la DO obtenida en una curva de 45 titulación (DO vs concentración) construida utilizando un patrón.

EJEMPLO 6:

MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE ALÉRGENOS DE ÁCAROS INTRADOMICILIARIOS:

50

Se recolectaron muestras de polvo con una aspiradora manual en un área de 1 a 2 m2 guardando una proporción de 0,5 m2/min. Se tomaron 20 mg de cada muestra, se diluyeron en 2 ml de buffer fosfato y se agitaron por 5 minutos; se hicieron diluciones seriadas del sobrenadante y se colocaron en una placa de poliestireno; se incubaron a 37ºC durante 18 horas en cámara húmeda; se adicionó solución de bloqueo y se incubó a 37°C por 2 horas; se adicionaron series de diluciones dobles de la composición de anticuerpos policlonales IgY obtenida en el primer 55 método de la invención; las placas de reacción se incubaron entre 37°C por 2 horas en cámara húmeda; se efectuaron lavados; se adicionaron anticuerpos Anti-IgY, conjugada con peroxidasa de rábano (HRP) diluida 1/1000, y la prueba se reveló con sustrato TMB 3,3´,5,5´-tetrametilenzidina, la reacción se detuvo con HCl 1N o marcando el los anticuerpos IgY que constituyen el reactivo diagnóstico obtenido mediante el primer método de la invención, con fluorocromos, enzimas, metales preciosos, o ligandos radiomarcados. 60

PRODUCCIÓN DE UNA PRUEBA INMUNOCROMATOGRÁFICA (LATERAL FLOW IMMUNOASSAYS) CON INMUNOCONJUGADOS IGY-NANOPARTICULAS DE ORO COLOIDAL.

Se marcaron los anticuerpos IgY anti-oligopéptidos sintéticos de alérgenos del grupo 1 de los ácaros D. pteronyssinus, D. farinae y B. tropicales (obtenidos por el primer método de la invención), con nano-partículas de oro 5 coloidal de 40 nm de diámetro. Los inmunoconjugados (IgY-nanoGold) se emplearon como reactivo de detección para la prueba inmnunocromatográfica, cuya ejecución implicó la construcción de una tira de prueba. La tira consta de cuatro secciones, cuya descripción aparece abajo:

ii) La zona de aplicación o “cojín muestra” está formada por una fibra de celulosa cuya función 10 es remover el material viscoso o particulado presente en la mezcla y ajustar las condiciones de reacción para la inmunodetección.

iii) La zona de marcación o “cojín del conjugado” es compuesta por fibra de vidrio y constituye la fase móvil del sistema inmunocromatográfico, sobre esta se ha liofilizado un “conjugado coloreado”, que es el anticuerpo de detección IgY anti- oligopeptidos sintéticos de los 15 alérgenos Der p1, Der f1 y Blot 1 (obtenidos por el primer método de la invención), conjugado a nano-partículas de oro coloidal (40 nm); el anticuerpo de detección IgY se une específicamente al alérgeno presente en la muestra, formando el complejo “alérgeno- anticuerpo conjugado coloreado”.

iiii) La tercera sección (zona de detección) de la tira está formada por una membrana de 20 nitrocelulosa y constituye el soporte sólido del sistema inmunocromatográfico. Esta sección tiene dos zonas de reacción: una zona de reacción primaria (T) en la cual se encuentra inmovilizada una mezcla del alérgeno de prueba Der p1, Der f1 y/o Blot 1 con BSA (alérgeno/BSA), y una zona de reacción secundaria (C) en la cual se encuentra inmovilizado el anticuerpo de captura (IgG anti-IgY). Si el alérgeno de prueba se encuentra presente en la 25 muestra, se une al anticuerpo de detección IgY formado el complejo “alérgeno- conjugado coloreado”, el cual se moviliza a la zona T. Debido a que los sitios de unión del anticuerpo de detección están ocupados por el alérgeno presente en la muestra no se produce señal coloreada en esta zona (prueba positiva). El complejo “alérgeno- conjugado coloreado” sigue movilizándose hacia la zona C donde se une al anticuerpo de captura IgG- anti IgY, formando 30 el complejo “anticuerpo de captura- conjugado coloreado- antígeno”, que se visualiza como una línea en esta zona. En presencia o en ausencia del alérgeno en la muestra, la señal en la zona C debe estar presente, constituyéndose está en un control de la prueba, es decir confirma que una prueba es funcional o válida independientemente de si la zona T indica un resultado negativo o positivo. 35

ivi) La cuarta sección sobre la tira de prueba está formada por un “cojín absorbente” que dirige el flujo lateral de la muestra en solución de forma continua corriente arriba (ver Figura 16).

Para la realización de esta prueba se emplea preferentemente el dispositivo divulgado en la patente WO2010/086730. 40

EJEMPLO 8:

PRODUCCIÓN DE UNA PRUEBA INMUNOCROMATOGRÁFICA (LATERAL FLOW IMMUNOASSAYS) CON INMUNOCONJUGADOS IGY- BIOTINA.

45

Para el inmunoensayo cromatográfico con inmunoconjugados IgY- Biotina, los anticuerpos purificados disueltos en buffer salino fosfato se marcaron con biotina usando un reactivo de marcación comercial NHS-LC- Biotina (Priece, Rockford, III). También se preparó una proteína portadora de straptavidina (BSA-streptavidina). El diseño de la tira de prueba se muestra en la Figura 17.

50

La preparación de la muestra para el inmunoensayo cromatográfico se realizó de igual forma que para el Elisa indirecto, en este caso para la interpretación de resultado se le otorgó un valor numérico a los resultados colorimétricos por intensidad de color, del 1 al 5, siendo 1 sin coloración y 5 la intensidad de coloración más alta.

Para la realización de esta prueba se emplea preferentemente el dispositivo divulgado en la patente 55 WO2010/086730.

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Abstract

]

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Abstract

]

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̀

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para producir una composición de anticuerpos policlonales IgY contra alérgenos de ácaros útil como reactivo de diagnóstico, caracterizado porque comprende las etapas de:

   a) preparar una composición inmunogénica que comprende al menos un péptido que consiste en una 5 secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID Nos. 1, 2, 3, 5 y 6;

   b) hiperinmunizar un ave con dicha composición inmunogénica;

   c) extraer los anticuerpos policlonales IgY de la yema de huevo puesto por el ave; y

   d) purificar los anticuerpos policlonales IgY;

   e) opcionalmente marcar los anticuerpos policlonales IgY; y, 10

   f) opcionalmente generar inmunoconjugados de los anticuerpos policlonales IgY.
2. 2. El método de Reivindicación 1, en donde la etapa b) incluye más de una inmunización.
3. 3. El método de Reivindicación 1, en el que en la etapa a), la preparación de la composición inmunogénica se 15 efectúa por emulsificación del péptido con adyuvante de Freunds completo para una primera inmunización en la etapa b), y con adyuvante de Freunds incompleto para posteriores inmunizaciones en la etapa de hiperinmunización b).
4. 4. El método de laS Reivindicaciones1 y 2, en donde, en la etapa b), la hiperinmunización se efectúa en 20 gallinas de la línea comercial Hy Line Brown.
5. 5. El método de la Reivindicación 1, en donde en la etapa b) la hiperinmunización se efectúa en los músculos pectorales de las gallinas a intervalos de 15 días.

   25
6. 6. El método de la Reivindicación 1, en donde la purificación de la etapa d) se efectúa empleando una columna de sefarosa CL4B activada con divinilsulfona acoplada con β-Mercapto etanol, en donde el soporte activo se equilibra en tampón fosfato suplementado con Na2SO4, y posteriormente se adiciona una dilución de la muestra en tampón de equilibrio, y la elución de los anticuerpos policlonales IgY se obtiene mediante la adición de un tampón fosfato. 30
7. 7. Una composición de anticuerpos policlonales IgY obtenidos por el método de la Reivindicación 1.
8. 8. Un método para la detección de alérgenos de ácaros en muestras de polvo provenientes de espacios intramuros usando anticuerpos policlonales IgY específicos para las proteínas alergénicas de ácaros 35 intradomiciliarios producidos de los oligopéptidos de la Reivindicación 1, que comprende los siguientes pasos:

   i) tomar muestras de polvo de ambientes en los cuales esté presente o se sospeche están presentes los ácaros intradomiciliarios;

   ii) preparar extractos de proteínas de las muestras de polvo;

   iii) desarrollar pruebas inmunoquímicas por contacto del extracto de proteínas con la composición de 40 anticuerpos policlonales IgY de la Reivindicación 7, con el fin de evaluar la presencia de alérgenos en las muestras colectadas previamente.
9. 9. El método de la Reivindicación 8, en donde en el paso (ii), las muestras se preparan empleando un buffer de extracción PBS - Tween, agitación, centrifugación y filtración con un filtro de 0.22 μm, preservando el 45 sobrenadante y descartando los sólidos retenidos en el filtro.
10. 10. El método de la Reivindicación 8, en donde el paso (iii) comprende poner en contacto el extracto proteico con la composición de anticuerpos policlonales IgY, y la detección de los alérgenos se efectúa mediante anticuerpos anti-IgY conjugados con peroxidasa de rábano (HRP) diluidos 1/1000, y la prueba se revela con sustrato TMB 50 3,3´,5,5´tetrametilenzidina.
11. 11. El método de la Reivindicación 8, en donde la detección de alérgenos de ácaros se efectúa mediante una prueba inmunocromatográfica (lateral Flow Immunoassays) con inmunoconjugados seleccionados entre inmunoconjugado IgY-nanoparticulas de oro coloidal, e inmunoconjugado IgY-biotina. 55
12. 12. Un kit analítico para la detección de ácaros que comprende la composición de anticuerpos de la Reivindicación 7.

    60

    65