DE3587863T2

DE3587863T2 - Mit thrombozyten verwandter wachstumregulator.

Info

Publication number: DE3587863T2
Application number: DE3587863T
Authority: DE
Inventors: George J. Seattle Wa 98112 Todaro; Daniel R. Bainbridge Island Wa 98110 Twardzik
Original assignee: Oncogen LP
Current assignee: Oncogen LP
Priority date: 1984-03-23
Filing date: 1985-03-19
Publication date: 1994-10-27
Anticipated expiration: 2005-03-20
Also published as: FI92258C; DK540685D0; JPH0632631B2; HUT38300A; JPH0272896A; EP0176588A4; US4645828A; DK540685A; JPH0242985A; HU210662B; WO1985004397A1; EP0176588B1; AU587380B2; ATE107662T1; DK172463B1; AU4235485A; DE3587863D1; FI854604A0; EP0176588A1; FI92258B

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die Komplexität der Regulation der Differenzierung und Proliferation von hämatopoietischen Zellen und durch dieselben wird immer wichtiger, seitdem die Reihe von Faktoren, die als diese Geschehnisse kontrollierend isoliert werden, ständig größer wird. Meistens sind diese Faktoren in außerordentlich geringen Mengen vorhanden, und zwar in Verbindung mit zahlreichen anderen Proteinen, die eine breite Vielfalt von Funktionen ausüben. Faktoren, die isoliert wurden und von denen gezeigt wurde, daß sie wirksam sind, schließen Polypeptide und Proteine wie gamma-Interferon, von Plättchen abgeleitete Wachstumsfaktoren, koloniestimulierende Faktoren, Interleukin-2, Erythropoietin sowie zahlreiche andere Lymphokine ein. Es besteht ein erhebliches Interesse an der Isolierung, Reinigung und Charakterisierung dieser Blutkomponenten, und zwar infolge ihrer möglichen Verwendung bei der Behandlung sowie ihres Einsatzes in der Erforschung von Krankheiten wie Krebs.
Bei der Isolierung eines natürlich auftretenden Faktors gibt es viele Fehlerquellen. Es muß ein Trennsystem entwickelt werden, das den gewünschten Faktor von anderen Faktoren trennt, die vorhanden sein und ähnliche Eigenschaften aufweisen können. Zum zweiten müssen einige Mittel für die Untersuchung der verschiedenen Fraktionen zur Verfügung stehen, die spezifisch oder im wesentlichen spezifisch das interessierende Material charakterisieren, im Gegensatz zu den anderen, vorhandenen Materialien. Wenn das interessierende Polypeptid eine sehr hohe Aktivität aufweist, wird die Schwierigkeit bei der Isolierung des gewünschten Produktes erheblich erschwert.
Drittens muß man über Verfahren verfügen, die das interessierende Produkt nicht nachteilig beeinflussen, wobei insbesondere jede Denaturierung zu vermeiden ist. Zusätzlich gibt es häufig andere Materialien in der Zusammensetzung, die auf das interessierende Material einwirken können und dieses verändern, so daß das letztlich erhaltene Produkt, das einiges an der gewünschten Wirkung aufweisen kann, nicht das natürlich auftretende Material ist. Schließlich muß man nach der Isolierung der gewünschten Komponente in hinreichend reiner Form versuchen, das Polypeptid physikalisch zu charakterisieren, z. B. durch Aminosäuresequenzierung, der Glycosylierungszahl, der Disulfidbrücken und dergleichen. Weiterhin muß man das Material bezüglich seiner physiologischen Eigenschaften weiter charakterisieren.
Selbst nach der Isolierung der gereinigten Verbindung erweist sich die Charakterisierung der physiologischen Wirkung der Verbindung häufig als schwer faßbar. Da in vielen Situationen die Wirkung von der Anwesenheit einer Verbindung oder mehrerer, einem engen Konzentrationsbereich, speziellen Wirtszellen oder dergleichen abhängen kann, werden häufig erhebliche intuitive Bemühungen sowie umfangreiche Versuche erforderlich, um die physiologische Wirkung einer Verbindung zu entdecken und die ihre Wirkung beeinflussenden Parameter darzulegen.

Beschreibung des Standes der Technik

Holley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77 : 5989-5992,beschreibt die Reinigung von Wachstumsinhibitoren der Epithelzellen. Nelsen-Hamilton und Holley, ibid. (1983) 80 : 5636-5640, beschreibt die Wirkung eines Wachstumsinhibitors und epidermalen Wachstumsfaktors bei dem Einbau von radiomarkiertem Methionin in Proteine, die von Zellen des afrikanischen grünen Affen (BSC-1) sekretiert werden. Morgan et al., Thromb. Haemost. (1980) 42 : 1652-60 beschreibt die Aminosäuresequenz des menschlichen Plättchenfaktors 4. Dawes et al., Thromb. Res. (1983) 29 : 569-81 und Schernthaner et al., Acta Med.
Austriaca (Suppl.) (1979) 6 : 375-9 beschreiben polyklonale Antikörper gegen den Plättchenfaktor 4. Lawler, Thromb. Res. (1981) 21 : 121-7 vergleichen die Sequenzen und Strukturen von beta-Thromboglobulin und des Plättchenfaktors 4.
Es werden Polypeptidzusammensetzungen und ihre Verwendung zur Verfügung gestellt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie mindestens eine der folgenden Eigenschaften aufweisen: sie können das Tumorwachstum inhibieren, während sie das Wachstum normaler Zellen nicht inhibieren; sie können die pp60-src-Autophosphorylierung stimulieren; sie können die Sekretion eines 52kDal-Proteins aus Tumorzellen induzieren; und sie weisen eine im wesentlichen äquivalente Aminosäuresequenz von mindestens einem Bereich eines Polypeptids auf, das aus Säugetierplättchen isolierbar ist und mindestens eine der oben genannten Eigenschaften aufweist. Die Polypeptide werden in im wesentlichen reiner Form zur Verfügung gestellt.
Fig. 1, die lediglich zu Zwecken der Erläuterung beigefügt ist, stellt eine Karte dar, in der die Wirkung von Oncostatin-A auf das Tumorwachstum bei einer athymischen Maus verglichen wird.
Zusammensetzungen, die Polypeptide gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 enthalten, werden bereitgestellt, die eine Wachstumsinhibierung von neoplastischen Zellen bei Säugetieren bewirken. Die angesprochenen Polypeptide sind verwandt mit einem natürlich auftretenden Polypeptid in der ethanolischen HCl-Fraktion, die bei der Extraktion von Plättchen erhalten wird, und die in der Literatur mit Plättchenfaktor 4 bezeichnet und im folgenden Oncostatin-A genannt wird. Die Polypeptide sind bei gemäßigten Temperaturen (0 - 25ºC) bei einem niedrigen pH-Wert, im allgemeinen unterhalb von einem pH von etwa 3, gewöhnlich bei einem pH 2, stabil.
Die Polypeptide weisen mindestens eine biologische wirksame Sequenz auf, z. B. immunologisch oder epitopisch, und können mehr als eine biologisch aktive Sequenz aufweisen, wobei eine derartige Sequenz mit einem natürlich auftretenden Produkt hinsichtlich der biologischen Eigenschaft konkurrieren kann.
Interessierende Zusammensetzungen mit der Formel gemäß Anspruch 1 weisen vorzugsweise proximal zu dem C-Terminus eine Sequenz der Formel K-K-I-I-K-K, insbesondere eine Sequenz der Formel K-K-I-I-K-K-L-L und speziell P-L-Y-K-K-I-I-K-K-L-L-E-S auf.
Es können auch Insertionen und Deletionen auftreten, wobei gewöhnlich Insertionen oder Deletionen 1 bis 2 Aminosäuren, insbesondere eine Aminosäure, einschließen.
Natürlich auftretendes Oncostatin-A weist die folgende Sequenz auf:
Glu Ala Glu Glu Asp Gly Asp Leu Gln Cys Leu Cys Val Lys Thr Thr Ser Gln Val Arg Pro Arg His Ile Thr Ser Leu Glu Val Ile Lys Ala Gly Pro His Cys Pro Thr Ala Gln Leu Ile Ala Thr Leu Lys Asp Gly Arg Lys Ile Cys Leu Asp Leu Gln Ala Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser
Die Polypeptide der Erfindung sind Derivate des C-terminalen Abschnittes desselben.
Die Polypeptidzusammensetzungen der Erfindung weisen eine Vielzahl von physiologischen Wirkungen auf. Die Zusammensetzungen können verwendet werden, um das Tumorwachstum in vitro und in vivo zu inhibieren. Die interessierenden Zusammensetzungen können auch verwendet werden, um die Autophosphorylierung von pp60-src zu stimulieren. Die Zusammensetzungen können somit als Substrat für das pp60-src-Enzym dienen und können an der Tyrosinposition (Rest 60) in dem Polypeptid phosphoryliert werden.
Zusätzlich können Oncostatin-A-Fragmente oder Fusionsproteine, enthaltend Untersequenzen (Fragmente) mit kompetitiven immunologischen Eigenschaften verwendet werden, um monoklonale Antikörper herzustellen, oder sie können als Reagenz in diagnostischen Tests für den Nachweis von Oncostatin-A oder immunologisch kompetitive Verbindungen oder die Anwesenheit von Zelloberflächenrezeptoren für Oncostatin-A verwendet werden.
Die interessierenden Verbindungen weisen eine hohe Wirksamkeit bezüglich der Tumorinhibierung auf. Die Zusammensetzungen können in vitro oder in vivo verwendet werden, um die Wachstumsgeschwindigkeit von neoplastischen Zellen zu verringern. Die Polypeptidzusammensetzungen können bei 1ng-Spiegeln mindestens eine 20%-Inhibierung des Tumorzellwachstums liefern, insbesondere von Karzinomen und Sarkomen, z. B. der Lunge, Brust, Haut und dergleichen. Vorzugsweise liefern die Polypeptidzusammensetzungen mindestens etwa 40% und insbesondere mindestens etwa 50% einer Inhibierung des Zellwachstums von Tumoren gemäß dem kolonieinhibierenden Test auf, welcher in dem Versuchsteil beschrieben wird.
Die interessierenden Verbindungen können in vivo eingesetzt werden, indem man sie einem Wirt verabreicht, von dem vermutet wird, daß er an Neoplasien leidet. Die Verbindungen können an einem Ort einer Neoplasie, z. B. einem Melanom, verabreicht werden, um die Proliferationsgeschwindigkeit zu verringern. Verabreichungsmethoden können eine Injektion, die Einführung mittels Katheter, das direkte Auftragen oder dergleichen einschließen, und zwar in Abhängigkeit von dem Ort des Tumors, der Formulierung der interessierenden Zusammensetzung, der Dosierung und dergleichen. Die Dosierung schwankt in Abhängigkeit davon, ob sie systemisch oder lokal erfolgt, wobei die Konzentrationen der Dosierung im allgemeinen von 0,1 ug bis 1000 kg/kg betragen und Gesamtdosierungen für große Säugetiere einschließlich Primaten von etwa 0,01 bis 10 mg pro Behandlungsdosis betragen.
Die Polypeptide der Erfindung können in physiologisch verträglichen Trägern formuliert werden, z. B. phosphatgepuffertes Kochsalz, destilliertes Wasser, Exzipienten oder dergleichen, oder sie können in reiner Form verwendet werden.
Die Polypeptide der Erfindung können indirekt verwendet werden, um die Anwesenheit von neoplastischen Zellen festzustellen. Wenn Zellen Konzentrationen des Wirkstoffes von etwa 1 bis 500 ng/ml, vorzugsweise etwa 50 bis 350 ng/ml, des Wirkstoffes ausgesetzt werden, wird von den neoplastischen Zellen ein 52kDal-Protein (p52) sekretiert. Somit kann man die Anwesenheit von neoplastischen Zellen feststellen, in dem man die Sekretion von p52 in das externe Medium mißt, z. B. in das Nährmedium, Blut, Urin oder eine andere physiologische Flüssigkeit. Die Polypeptide können daher verwendet werden, um den Zustand eines Wirtes und die Anwesenheit oder Abwesenheit eines neoplastischen Zustandes zu überwachen. Die Polypeptide der Erfindung können für die Diagnostizierung, ob ein Tumor existiert, bei der chirurgischen Überwachung, für Metastasenspiegel und dergleichen verwendet werden. Die Polypeptide der Erfindung können in vitro oder in vivo (Kulturmedium oder Wirt) verabreicht werden, und zwar in einer ausreichenden Menge, um die Induktion der Sekretion von p52 zu gewährleisten. Ein mit dem System assoziiertes Fluid kann dann bezüglich der Anwesenheit von p52 überwacht werden, und zwar als Indiz für die Anwesenheit von neoplastischen Zellen.
Die Polypeptide der Erfindung können auch zur Stimulierung des Immunsystems verwendet werden, und zwar entweder als solche, jedoch vorzugsweise in Verbindung mit anderen Lymphokinen, z. B. Interferon, insbesondere gamma-Interferon. Somit können die Polypeptide der Erfindung mit anderen Polypeptiden formuliert und einem Wirt verabreicht werden, der immunosupprimiert ist, so daß das Immunsystem stimuliert wird. Von gamma-Interferon ist bekannt, daß es die Ia-Expression in Monozyten und Macrophagen induziert, sowie in anderen Geweben wie dem Endothel und Fibroblasten. Die Polypeptide der Erfindung induzieren die Ia-Expression und stimulieren die gamma-Interferon-Ia-Induktion, wobei sie die Wirksamkeit einer gegebenen Dosierung von gamma-Interferon verstärken. Die Polypeptide der Erfindung werden im allgemeinen in einer Menge verwendet, so daß eine Konzentration in dem Medium im Bereich von etwa 1 bis 200, vorzugsweise etwa 2 bis 70 ng/ml beträgt. Die Menge an gamma- Interferon ist üblich bezüglich ihrer Verwendung als Lymphokin und liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 0,5 bis 200 ng/ml. Die Verstärkung der Expression von Ia um mindestens etwa das 1,5-, gewöhnlich mindestens das etwa 2-fache, kann mit den Polypeptiden der Erfindung erreicht werden, wenn diese als solche oder in Verbindung mit anderen Lymphokinen verwendet werden. Die Verabreichung kann wie oben beschrieben erfolgen.
Die Polypeptide der Erfindung können auch in Verbindung mit Kinasen, insbesondere pp60-src, verwendet werden, um die Substratspezifität des Enzyms zu verändern. Insbesondere durch Kontaktieren des Enzyms mit kleinen Mengen der Polypeptide der Erfindung, insbesondere bei Konzentrationen von etwa 0,05 bis 50 ug/ml, kann die Kinaseaktivität verstärkt werden, einschließlich einer Veränderung in den beobachteten Aminosäuren, die phosphoryliert werden, wobei insbesondere außer Tyrosin auch Serin phosphoryliert wird. Auf diesem Wege kann die Kombination von pp60-src oder analoger Kinasen verwendet werden, um Polypeptide zu modifizieren, die Tyrosin- und Serinaminosäuren aufweisen, und zwar indem man für die Phosphorylierung sowohl von Tyrosin als auch von Serin mit größeren Geschwindigkeiten sorgt.
Die Polypeptide der Erfindung können auch als Haptene oder Antigene verwendet werden, weiterhin als an einen immunogenen Potentiator gebundene Haptene, z. B. ein Antigen, Teilchen oder dergleichen, zur Produktion von monoklonalen Antikörpern und polyklonalen Seren. Die Antikörper können breite Verwendung finden, insbesondere für diagnostische Zwecke. Die Antikörper können als solche oder in Verbindung mit den Polypeptiden der Erfindung verwendet werden, und zwar als Reagenzien für die Bestimmung von Oncostatin-A und Oncostatin-A-Rezeptoren, einschließlich Antikörpern gegen Oncostatin-A.
Eine breite Vielfalt von Protokollen und Methoden stehen zur Bestimmung von interessierenden Analyten zur Verfügung. Diese Methoden schließen eine breite Vielfalt von Markern ein, einschließlich Enzymen, Radionukliden, fluoreszierenden Mitteln, chemilumineszierenden Mitteln, Enzymsubstraten, Enzyminhibitoren, Teilchen oder dergleichen. Die Methoden können einen Trennschritt (heterogen) oder keinen Trennschritt (homogen) einschließen. Die Markierung kann entweder kovalent an das Polypeptid der Erfindung gebunden sein, oder der dagegen gerichtete Antikörper kann an einen Antikörper konjugiert sein, welcher gegen das anti-Oncostatin-A-Fragment gerichtet ist, das z. B. das Fc des anti-Oncostatin-A aufweist. Man kann den gesamten Antikörper oder Fragmente desselben verwenden, einschließlich Fab, F(ab)'2'' Fv oder dergleichen. Es sind eine Anzahl von US-Patenten erschienen, die eine breite Vielfalt von diagnostischen Methoden beschreiben, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Beispiele für einige dieser Patente sind US-PS 3 766 162, 3 791 932, 3 817 837, 3 996 345 und 4 233 402.
Spezielle Arten von Assays schließen RIA, EIA, EMIT®, ELISA, SLFIA und FIA ein, die sämtlich kommerziell angewendet werden und für die Reagenzien für weitere Analyten erhältlich sind. Die verschiedenen Reagenzien können in Kitform bereitgestellt werden, wobei die Natur der Reagenzien und ihre relativen Mengen ausgewählt werden, um die Empfindlichkeit des Assays zu optimieren.
Die Antikörper können dann in üblicher Weise gemäß der Herstellung von monoklonalen Antikörpern oder polyklonalen Seren produziert werden. In jedem Falle wird einem geeigneten Wirt ein Immunogen injiziert, das einen interessierenden Epitoport oder mehreren aufweist, gefolgt gewöhnlich von einer Boosterinjektion oder mehreren. Für polyklonale Antiseren kann der Wirt zur Ader gelassen und die Globulinfraktion isoliert werden. Die Globulinfraktion kann durch Affinitätschromatographie weiter gereinigt werden. Für monoklonale Antikörper wird der Wirt wie oben immunisiert, wobei in diesem Falle die Milz normalerweise entfernt und mit einem geeigneten Fusionspartner fusioniert wird. Nach der Auswahl von Hybridoma, die den gewünschten Antikörper exprimieren, werden die Hybridoma einer limitierenden Verdünnung unterworfen, gefolgt von einer Selektionierung und Klonierung sowie einer weiteren Charakterisierung.
Die Antikörper gemäß der Erfindung können von den natürlich auftretenden Typen sein, z. B. IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, insbesondere IgM und die verschiedenen Subtypen von IgG, d. h. IgG1, 2, 3 oder 4. Die erhaltenen monoklonalen Antikörper können als Immunogene für die Herstellung von Anti-Idiotyp- Antikörpern verwendet werden, die eine konformationelle Ähnlichkeit gegenüber den Polypeptiden der Erfindung aufweisen. Diese können dann als Ersatzreagenzien für Materialien vom Oncostatin-A-Typ in einer Vielzahl von Anwendungsarten eingesetzt werden.
Die Stammverbindung, Oncostatin-A, die nicht Teil der vorliegenden Erfindung ist, kann erhalten werden, indem man Blutplättchen mit etwa 0,3M ethanolischer Salzsäure extrahiert. Als Inhibitoren gegen- einen Abbau können Phenylmethylsulfonylfluorid und Aprotinin zugesetzt werden, und zwar das erstere bei Spiegeln von etwa 1 bis 10 Gew. -% der zu extrahierenden Zusammensetzung und das letztere bei Spiegeln von etwa 0,1 bis 1 TIU/mg (TIU--Trypsininhibierungseinheiten) der zu extrahierenden Zusammensetzung. Nach Anheben des pH auf etwa 5 unter Verwendung von wässrigem Ammoniumhydroxid wird eine kleine Menge von Ammoniumacetat zugesetzt, und die Lösung wird durch Zentrifugierung oder mittels anderer geeigneter Maßnahmen geklärt.
Das Protein wird anschließend ausgefällt, indem man nacheinander kaltes Ethanol (95%) und Ether verwendet; der Niederschlag wird gesammelt und gegen 0,1 bis 0,5 M Essigsäure unter Verwendung einer Dialysemembran mit einem Cutoff unterhalb von etwa 3000Mr dialysiert. Der Rückstand wird lyophilisiert, erneut in 1M Essigsäure resuspendiert und geklärt, und ist erst dann bereit zu einer weiteren Reinigung durch Gelpermeationschromatographie unter Verwendung von Biogel P-10. Das Produkt wird mit etwa 1M Essigsäure eluiert, und die verschiedenen Fraktionen werden unter Verwendung einer geeigneten Assaytechnik kontrolliert, z. B. mittels der Inhibierung des Tumorwachstums.
Die Fraktionen mit der wachstumsinhibierenden Wirkung werden lyophilisiert, in verdünnter Trifluoressigsäure resuspendiert, pH 2-3, geklärt und anschließend auf einem Hochdruck-Flüssigchromatographen chromatographiert, wobei die Silikagelpackung eine Beschichtung mit einer langen aliphatischen Kette von etwa 16 bis 20 Kohlenstoffatomen, z. B. 18 Kohlenstoffatomen, aufweist. Die Kolonne wird mit verdünnter Trifluoressigsäure (0,02 - 0,1%) äquilibriert, und das Produkt wird mit einem Acetonitril-Gradienten von bis zu 60% Acetonitril in verdünnter (0,01 - 0,1, gewöhnlich etwa 0,04 - 0,05%) Trifluoressigsäure eluiert. Es wird eine relativ niedrige Strömungsgeschwindigkeit verwendet, im allgemeinen etwa von 0,5 bis 1 ml/min bei Umgebungstemperaturen. Die Fraktionen können durch den oben genannten oder mittels anderer Bioassays getestet werden. Für die weitere Reinigung kann das an der Kolonne erhaltene Produkt unter Verwendung einer Hochdruck-Gelausschlußchromatographie gereinigt werden.
Der Hauptpeak der Oncostatin-A-Aktivität, aufgelöst durch Novapak-C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen-Flüssigchromatographie wird lyophilisiert und in 100 ul 40%-igem Acetonitril, enthaltend 0,1% Trifluoressigsäure, resuspendiert. Die Probe wird in eine Gelkolonne mit einem hydroxylierten Polyether (Bio Rad TSK-250) injiziert und mit einer mobilen Phase eluiert, die aus 40% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure besteht. Es werden Teilmengen von jeder Fraktion lyophilisiert und bezüglich einer Oncostatin-A-Aktivität getestet; eine Tumorzellen- Inhibierungsaktivität eluiert zusammen mit dem Peak des Hauptpeptids (Rf-0.9), der in seinem Molekulargewicht auch zu demjenigen des 6000Mr-Insulinmarkers entspricht, der verwendet wird, um dieses chromatographische System zu eichen.
Das von der Kolonne erhaltene Produkt kann unter Verwendung von SDS-PAGE elektrophoresiert werden. Die Bande bei etwa 6000 bis 8000 Molekulargewicht wird isoliert. Es zeigt sich, daß die Bande eine starke wachstumsinhibierende Wirkung gegen neoplastische Säugetierzellen aufweist.
Üblicherweise kann ein synthetisches Gen synthetisiert werden. Durch Verwendung eines synthetischen Gens wird eine erhebliche Flexibilität erreicht, und zwar in der Weise, daß vom Wirt bevorzugte Kodons verwendet werden können und einzigartige oder seltene Restriktionsorte eingeführt werden können. Die Restriktionsorte ermöglichen ein Ausmaß der Flexibilität bezüglich der Modifizierung von verschiedenen Abschnitten des Gens, der Einführung von Deletionen, Transitionen, Transversionen, Insertionen und dergleichen. Es wird eine Strategie entworfen, um einzelsträngige überlappende Fragmente zu verwenden, die in einem Hybridisierungs/Ligationsmedium zusammengemischt werden können, und zwar ohne störende Heteroduplexbildung. Das erhaltene doppelsträngige Gen kann anschließend kloniert und gereinigt werden. Eine beispielhafte Sequenz wird in dem Versuchsteil vorgestellt.
Es ist erwünscht, daß die Termini des Gens verschieden sind, um die- geeignete Orientierung bei der Insertion zu gewährleisten. Das Gen kann in einen geeigneten Expressionsvektor für die Expression insertiert werden. Eine große Anzahl von Vektoren steht für die Expression in Prokaryoten und Eukaryoten zur Verfügung, z. B. Fungi wie Hefe, Säugetierzellen wie Mauszellen, primaten Zellen und dergleichen. Das Replikationssystem kann von Plasmiden, Viren oder Chromosomen abgeleitet sein. Beispiele für Replikationssysteme schließen ColE1, lambda, RSF1010, 2 um-Plasmide, SV40, Adenoviren, Rinderpapillomviren und dergleichen ein.
Abgesehen von mindestens einem Replikationssystem, falls eine episomale Stabilität gewünscht ist (ein Replikationssystem ist nicht erforderlich, wenn eine Integration gewünscht wird), ist gewöhnlich ein Marker vorhanden, der die Selektion des das gewünschte Gen enthaltenen Wirts gestattet. Der Marker liefert gewöhnlich eine Biozidresistenz, z. B. gegen Antibiotika oder Schwermetalle, oder eine Komplementation, eine Prototrophie für einen auxotrophen Wirt. Es kennen ein Marker oder mehrere, gewöhnlich nicht mehr als drei Marker, vorhanden sein.
Das Strukturgen ist, gewöhnlich durch Insertion in einen Polylinker (eine Sequenz mit einer Vielzahl von Restriktionsorten), zwischen Regulationsregionen der transkriptionellen und translationellen Initiation und Termination angeordnet, welche von dem Expressionswirt erkannt werden. Durch geeignete Auswahl der Initiationsregion für die Transkription kann diese konstitutiv oder induzierbar sein. Eine große Anzahl von Promoterregionen ist isoliert und als nützlich nachgewiesen worden, z. B. der E. coli trp- und lac-Promoter, die lambda-PL- und PR-Promoter, die Promoter der glykolytischen Enzyme aus Hefe, die SV40- und Adenovirus-Früh- und Spätpromoter und dergleichen.
Zusätzlich kann ein fusioniertes Gen hergestellt werden, indem man das Strukturgen mit einer 5'-Sequenz versieht, die für ein sekretorisches Leader- und Verarbeitungssignal kodiert. Beispielhafte sekretorische Leader, die beschrieben worden sind, schließen die sekretorischen Leader der Penicillinase, des α-Faktors, der Immunoglobuline, der T-Zellrezeptoren, der äußeren Membranproteine und dergleichen ein. Durch Fusion in geeignetem Leseraster kann das reife Oncostatin-A oder ein Verwandter desselben in das Medium sekretiert werden.
Das das Strukturgen und die flankierenden Regionen, die für die Regulation der Expression sorgen, enthaltende Konstrukt kann in den Expressionswirt mittels üblicher Methoden eingeführt werden, z. B. durch Transformation, z. B. mit Kalziumphosphat-ausgefällter DNA, Transvektion, Transduktion, Konjugation, Mikroinjektion und dergleichen. Der Wirt kann anschließend auf eine hohe Dichte in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet werden. Wenn der Promoter induzierbar ist, können hierfür günstige Bedingungen verwendet werden, z. B. eine Temperaturänderung, eine Erschöpfung oder ein Überschuß eines Stoffwechselproduktes oder Nährstoffes oder dergleichen.
Wenn das Produkt in dem Wirt zurückgehalten wird, werden die Zellen geerntet und lysiert, und das Produkt wird durch Extraktion, Ausfällung, Chromatographie, Elektrophorese oder dergleichen gereinigt. Wenn das Produkt sekretiert wird, kann das Nährmedium gesammelt und das Produkt mittels geeigneter Methoden, z. B. durch Affinitätschromatographie, isoliert werden.
Außer zur Expression können die Strukturgensequenzen als Sonden für die Hybridisierung und Bestimmung von Duplexsequenzen verwendet werden. Zum Beispiel kann die Anwesenheit und die Menge von einer mRNA in Wirtszellen bestimmt werden.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung und sind nicht Teil der Erfindung.

Versuchtsteil

Abkürzungen: DMEM--Dulbecco's modifiziertes Eaglemedium; PBS-phosphatgepuffertes Kochsalz, P/S--Penicillin/Streptomycin (jeweils 0,57 mg/ml); FCS--fötales Kalbsserum; SDS-PAGE-- Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

Reinigung von Oncostatin-A

Säure-Ethanol-Extraktion aus menschlichen Blutplättchen.
Frische oder gefrorene Blutplättchen (50 mg Naßgewicht), aufgetaut auf Umgebungstemperatur, wurden in zwei Volumina von 375 ml Ethanol (95%), 7,5 ml konzentrierter HCl, 33 mg Phenylmethylsulfonylfluorid und 1 ml Aprotinin (23 TIU/ml; aus Rinderlunge--Sigma Chemical Co. A6012) resuspendiert. Das Gemisch wurde über Nacht bei 4ºC gerührt, mit 8K rpm in einem Beckman-Typ-19-Rotor 30 Minuten zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit entfernt. Der pH der überstehenden Flüssigkeit wurde mit konzentriertem Ammoniumhydroxid auf 4,0 eingestellt, und der pH unter Verwendung einer 1 : 10 Verdünnung von konzentriertem Ammoniumhydroxid auf 5,2 gesteigert. Nach dem Zusatz von 1 ml 2M Ammoniumacetat (pH 5,2) pro 0,1 L Überstand wurde die Lösung bei 8K rpm in dem Typ 19-Rotor 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, es wurde ein 2·Volumen kaltes 95% Ethanol zugesetzt, gefolgt von einem 4· Volumen von kaltem Diethylether, und das Gemisch wurde über Nacht bei 0ºC stehengelassen. Der Niederschlag wurde gesammelt, und zwar durch Zentrifugieren bei 8K rpm mit dem Typ 19-Rotor für 30 Minuten, und das Pellet wurde in etwa 10 - 20 ml 1M Essigsäure suspendiert. Die Essigsäuredispersion wurde extensiv gegen 5L X 2 -Austäusche von 0,2M Essigsäure an einer Spectrapor-Dialysemembran (Nr. 3) Hohlfaser (Cutoff 3500Mr) (American Scientific Products) dialysiert. Der Extrakt wurde lyophilisiert, in 7,5 ml 1M Essigsäure resuspendiert, gefolgt von einer Zentrifugierung bei 30K rpm.

Gelpermeationschromatographie

Biogel P-10 (200-400 mesh; Bio Rad Labs) wurde über Nacht in 1N Essigsäure gequollen, gründlich entgast und anschließend in eine 100 · 2,5 cm-silikonisierte Glassäule gegossen; man ließ über Nacht mit 1M Essigsäure äquilibrieren. Sämtliche Lösungen wurden vor der Verwendung entgast.
Die Säure/Ethanol-solubilisierten Peptide (50 - 70 mg Protein) aus 25 g menschlichen Blutplättchen wurden in 7,5 ml 1M Essigsäure gelöst und auf die vorgenannte Säule aufgetragen. Fraktionen (3,5 ml) wurden gesammelt, und Anteile wurden lyophilisiert und bezüglich der Inhibierung des Einbaus von 5-¹²&sup5;-Jodo-2'-deoxyuridin in A549-menschliche Lungenkarzinomzellen getestet.

Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigchromatographie

Die Fraktion, die den Peak der Tumorwachstum-Inhibitionswirkung enthielt (etwa 200 ng Protein) aus der obigen Säule wurde lyophilisiert und in 0,05% (v/v) Trifluoressigsäure resuspendiert. Die Kolonne wurde anschließend mit einem linearen 0,60% Gradienten von Acetonitril in 0,045% Trifluoressigsäure bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,8 ml/min bei 23ºC eluiert. Anteile von jeder Fraktion wurden lyophilisiert und dreifach wie oben beschrieben getestet.
Die Fraktion bzw. die Fraktionen, die die inhibitorische Aktivität enthielt bzw. enthielten, wurde(n) anschließend in 40% Ethanol, enthaltend 0,1% Trifluoressigsäure, gelöst und auf eine Gelkolonne mit hydroxyliertem Polyether (Bio Rad TSK-250) aufgetragen sowie mit einer mobilen Phase von 40% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure eluiert. Fraktionen wurden gesammelt, lyophilisiert und dreifach bezüglich der wachstumsinhibitorischen Wirkung getestet. Die Aktivität wird mit derjenigen Fraktion eluiert, in der der Insulinmarker eluiert, und entspricht einem Molekulargewicht von 6-8 kDal.
Diejenigen Fraktionen, die die höchste Wirkung aufweisen, wurden anschließend unter Verwendung von SDS-PAGE wie folgt elektrophoresiert.
Das Peptid, das der hauptsächlichen Oncostatin-A-Aktivität aus dem Umkehrphasen-HPLC-Reinigungsschritt entspricht, wurde lyophilisiert, resuspendiert und in 0,03 ml eines Probenzubereitungspuffers, enthaltend 12,5 mM Tris-Cl pH 6,7, 4% SDS, 10 % β-Mercaptoethanol, 20% Glycerin und 0,01% Bromphenolblau gekocht (2min). Die Probe wurde auf ein 5% Polyacrylamid- Stapelgel, gegossen über ein 17 bis 27% Polyacrylamidgradienten-Plattengel, enthaltend 0,1% SDS, bei pH 8,8, geladen. Man ließ den Ansatz bei 10 Milliampere laufen, bis Proben durch den Gelstapel wanderten, und bei 20 Milliampere, bis die Farbfront an den Boden des Gels wanderte. Die Gele wurden fixiert und über Nacht in einer Lösung von 0,2% Coomassieblau, 50% Methanol und 9% Essigsäure gefärbt. Nach der Entfärbung wurden Coomassie-positive Banden unter Verwendung eines Hoffer-Densitometers lokalisiert. Die Marker schlossen Insulin (6000Mr), Trypsinogen (24500Mr), RN'ase (13700Mr) und Aprotinin (6500Mr) ein. Das Hauptpeptid wanderte zusammen mit dem 6500Mr-Aprotininstandard unter diesen Bedingungen der Elektrophorese.
Der verwendete Assay war wie folgt: Am Morgen des Tages 2 wurden A549-Zellen (menschliches Lungenkarzinom) in Nunc- Platten mit 96 Vertiefungen (Kamstrupvej 90 DK-4000, Roskilde, Dänemark) bereitgestellt. Wenn weniger als 30 vorhanden waren, wurden diese Zellen subkultiviert. In sämtliche, ausgenommen die peripheren, Vertiefungen wurden 45000 Zellen/50 ul/Vertiefung (9·10&sup4; Zellen pro ml DMEM mit 10% FCS, P/S, Glutamin) gegeben. Die peripheren Vertiefungen erhielten 50 ul PBS, und die gesamte Platte wurde bei 37ºC inkubiert. Am Nachmittag wurden die Testproben in DMEM mit 10% FCS, P/S, Glutamin- Dreifachtest, resuspendiert. In jede Testvertiefung wurde 50 ul gegeben, während Kontrollvertiefungen 50 ul DMEM erhielten, und die Platte wurde bei 37ºC 3 Tage inkubiert. Am Tag 4 wurde in jede Vertiefung 50 ml einer Lösung von ¹²&sup5;-J- Jodo-2'-deoxyuridin (4 Ci/mg-0,5 mCi/ml) (1 ul Isotop/ml DMEM, enthaltend 10% FCS, P/S, Glutamin) gegeben, und die Platte wurde bei 37ºC über Nacht inkubiert. Am Tag 5 wurde das Medium von den Vertiefungen abgesaugt, 1· mit PBS gewaschen, mit 100 ul Methanol versetzt; man ließ das Methanol 10 Minuten stehen, gefolgt von dem Absaugen des Methanols. In die Vertiefungen wurden dann 200 ul, IM Natriumhydroxid gegeben, die Platte 30 Minuten bei 37ºC inkubiert; anschließend wurde das IM Natriumhydroxid mit Titertek-Stopfen (Flow Labs) entfernt. Die Stopfen wurden anschließend in einem Gammazähler bezüglich ihrer Radioaktivität gemessen.
Um die Wirksamkeit des oben hergestellten Oncostatin-A zu testen, wurde der folgende Test durchgeführt. Der Test wird als weiche Agarkolonie-Inhibierung bezeichnet. Die verwendeten Materialien sind 5% Agar (3,75 g Nobel-Agar (Difco)), 75 ml destilliertes Wasser, autoklaviert in einer 125 ml Wheaton-Flasche, DMEM mit 10% FCS, 100U Penicillin, 100U Streptomycin, 200 mM Glutamin und menschliche Melanomzellen (A375).
Die zu testenden Materialien werden in einem sterilen 12·75 mm Teströhrchen lyophilisiert. Eine 1 : 10 Verdünnung des 5% Agar wird mit DMEM hergestellt und in einem Wasserbad auf 46ºC erhitzt. Eine Grundschicht wird hergestellt, indem man 1 ml einer 0,5% Agarlösung in jede Vertiefung einer Kultivierungsplatte (35·14 mm) mit 6 Vertiefungen gibt. Man läßt die Schicht bei Umgebungstemperatur stehen, bis sie härtet. SA&sub6;-Zellen werden durch Trypsinisierung hergestellt, und die Zellenzahl wird bestimmt. Die Zellen werden auf eine Endkonzentration von 1·10&sup4; Zellen pro ml verdünnt, und 0,35 ml Zellen werden in jedes Teströhrchen gegeben.
In jedes von 10 Teströhrchen werden 0,750 ml einer 0,5% Agarlösung pipettiert; das Gemisch wird vorsichtig verwirbelt, und der Inhalt des Teströhrchens (Versuchsprobe, Zellen, Agar) wird auf die Grundschicht gegossen; man läßt es etwa 20 min bei Umgebungstemperatur stehen, bis das Agar hart wird. Die Platten können dann in einem Inkubator mit feuchter Atmosphäre bei 37ºC mit 5% Kohlendioxid gelagert werden.
Die Platten werden hinsichtlich der Inhibierung des Koloniewachstums nach 3 Tagen und nach bis zu 10 Tagen überprüft, und zwar in Abhängigkeit von der Wirksamkeit des Testmaterials. Die Zahl der Kolonien wird in 8 willkürlich gewählten mikroskopischen Feldern bei niedriger Vergrößerung gezählt. Wenn die Platten länger als 5 Tage aufbewahrt werden sollen, wird eine weitere 1 ml Schicht einer 0,3% Agarlösung auf die Versuchsprobenschicht aufgebracht, um ein Austrocknen der Versuchsprobenschicht zu verhindern.
Das obige Verfahren wurde unter verschiedenen Konzentrationen des gereinigten Oncostatin-A durchgeführt. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse, wobei die angegebene Menge von Oncostatin-A die in das Teströhrchen eingeführte lyophilisierte Menge ist. Die Ergebnisse werden als %maximale Inhibierung angegeben.

Tabelle I

Oncostatin-A log&sub1;&sub0;ng Maximale Inhibierung
0,8 45
0,26 73
20 81
60 100
Wie sich aus den obigen Ergebnissen ergibt, ist das interessierende Polypeptid ein wirksamer Inhibitor des Zellwachstums. Auf der Grundlage der mit den Melanomzellen beobachteten Ergebnisse reicht etwa 1 ng aus, um eine etwa 50% Inhibierung zu erhalten. Die interessierende Verbindung kann daher eine breite Vielfalt von Anwendungsarten bei der Inhibierung des Zellwachstums finden, einschließlich des neoplastischen Zellwachstums. Zum Beispiel inhibiert die interessierende Verbindung auch eine Vielzahl von kultivierten meschlichen Tumorzellen, jedoch nicht normale, nicht-neoplastische Fibroblasten aus menschlicher Vorhaut, wie sich aus der folgenden Tabelle ergibt.

Tabelle II

Wirkung von Oncostatin-A auf in vitro-DNA-Synthese in kultivierten menschlichen Zellen.
Zellinie % maximale Inhibierung des Einbaus von ¹²&sup5;J-Deoxyuridin
Transformiert
Menschliche Lungenkarzinome (A549) 100
Menschliche Lungenadenokarzinome (H125) 41
Menschliche Melanome (A375) 67
Menschliche Brustkarzinome (MCF-7) 37
Nicht-transformiert
Menschliche Vorhautfibroblasten (HuFp&sub1;&sub6;) 0
* Unter Verwendung der beschriebenen Assaybedingungen übertrifft die maximale Inhibierung der ¹²&sup5;J-Deoxyuridin- Inkorporation in A549 Zellen, beobachtet bei Sättigungsbedingungen des Oncostatin-A (100 ng/Vertiefung) nicht 50%, bezogen auf unbehandelte Vergleichskulturen.
Wirkungen von Oncostatin-A auf das Wachstum von menschlichen Krebszellen in athymischen Mäusen.
Jungen (8-10 Wochen) athymischen Mäusen wurden subkutan in die inguinale Region 5·10&sup6; menschliche Lungenkarzinomzellen (A549), suspendiert in 100 ul phosphatgepuffertem Kochsalz (PBS), injiziert. Sieben Tage nach der Inokulation entwickelten sich tastbare Tumoren mit einem Durchmesser von 2,5-3,0 mm; tumortragende Mäuse wurden willkürlich aus dieser Population ausgewählt; diesen wurde am Tag 7 subkutan an dem Tumorort 50 ul PBS, enthaltend 0,30 ug Oncostatin-A, gereinigt zur Homogenität aus menschlichen Blutplättchen, wie oben beschrieben, injiziert. Die Injektion bei tumortragenden Vergleichsmäusen mit PBS ohne Oncostatin-A beeinflußte das Tumorwachstum nicht. Den tumortragenden Mäusen wurde anschließend eine äquivalente Dosis von Oncostatin-A in 50 ul PBS an den Tagen 11 und 16 nach der Inokulation mit A549-Zellen injiziert. Diese Dosen von Oncostatin-A wurden direkt in die Tumormasse injiziert, und zwar unter Verwendung von einer 30 1/2''g-Nadel. Die Tumorgröße wurde an den angegebenen Tagen bestimmt, und zwar durch Messung der Tumoren in der horizontalen und der vertikalen Richtung mit Tasterzirkeln; (a) die auf der Ordinate aufgetragene Tumorgröße gibt Vielfache dieser zwei Dimensionen wider. Die Ergebnisse sind in der Fig. 1 zusammengefaßt.
Spezifische Freisetzung eines 52.000Mr-Polypeptids durch Oncostatin-A, behandelt mit menschlichen Lungenkrebszellen.
Menschliche Lungenkrebszellen (A549) wurden mit Oncostatin-A behandelt (200 ng/ml Kultur), und die Wirkung von in den Überstand der Zellkultur abgegebenen Polypeptiden wurde bestimmt. Behandelte und Vergleichskulturen (kein Oncostatin-A) wurden mit ³&sup5;S-Methionin (5 uCi/ml S.A. - 800 Ci/mmol) bei der Zeit 0 (Zugabe von Oncostatin-A oder nur Medium (Vergleich)) gepulst. Zwölf Stunden später wurden die Kulturüberstände entfernt und zunächst bei niedriger Geschwindigkeit (1.500 xg für 15 min) und anschließend bei hoher Geschwindigkeit (30.000 xg für 1 h) geklärt. Die Polypeptide wurden aus den geklärten Überständen mit Trichloressigsäure (TCA) ausgefällt, gefolgt von einer Natrium-dodecylsulfat-Polyacrylamid Gelelektrophorese auf 12,5% Acrylamid-Plattengelen.
Die Radioautographie des Gels zeigte die Anwesenheit eines 52.000Mr ³&sup5;S-Methionin-markierten Polypeptids in den Überständen, abgeleitet von den mit Oncostatin-A behandelten A549-Zellen, wogegen unbehandelte Krebszellen minimale Mengen dieses Proteins freisetzten (mindestens ein zehnfacher Anstieg wurde nach der Oncostatin-A-Behandlung beobachtet). Keine weiteren qualitativen oder quantitativen Unterschiede wurden zwischen behandelten oder Vergleichskulturen festgestellt.
Stimulierung der pp60-src-Autophosphorylierung durch Oncostatin-A.
pp60-src wurde durch Immunoaffinitätschromatographie wie beschrieben gereinigt (Erickson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76 : 6260-6264; Erickson et al., Cold Sprinq Harbor Symp. Quant. Biol. (1979) 44 : 902-917). Fünf Mikroliter des gereinigten Enzyms (annähernd 0,47 pmol) wurden mit 100 ng gereinigtem, homogenem Oncostatin-A in einem Endreaktionsvolumen von 30 ul, enthaltend 20 mM ATP, 5 mM MgCl&sub2;, 20 mM Tris- Cl, ph 7,2, inkubiert, und zwar 30' bei 30ºC. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 2· Probenpuffer beendet und durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wie beschrieben analysiert (Laemmeli, U.K., Nature (1970) 227 : 680-685). Die Autoradiographie der Plattengele zeigte annähernd eine zehnfache Stimulierung der Autophosphorylierung von pp60-src. Die Zunahme der Phosphorylierung war nicht auf Tyrosinreste beschränkt, sondern wurde auch in Serinpositionen in dem src-Enzym gefunden.
Wirkungen von Oncostatin auf die Makrophagen-Ia-Antigenexpression.
Wehi-3 ist eine Maus-Makrophagenzellinie, die durch gamma-Interferon (gamma-IFN) induziert werden kann, um H2-Klasse-II-Antigene zu exprimieren. Die Merkmale dieser Induktion sind von verschiedenen Laboratorien untersucht worden; es wurde gezeigt, daß sie eine genaue Wiedergabe der normalen Makrophagen-Induktion sind. Diese Zellen wurden entweder mit oder ohne eine geringe Menge von gamma-IFN gezüchtet, und zwar bei verschiedenen Konzentrationen von Blutplättchen-Oncostatin-A. Sowohl in der Anwesenheit als auch in der Abwesenheit von gamma-IFN zeigte Oncostatin-A eine dosisabhängige Verstärkung der Klasse-II-Antigene, gemessen durch direkte Immunofluoreszenz auf einem FACS. Die Größe der Oncostatin-A-Wirkung war im allgemeinen zweifach bei den verwendeten Konzentrationen (ca. 2-70 ng/ml).

Herstellung von monoklonalen und polyklonalen, für Oncostatin-A spezifischen Antikörpern

Vernetzung von Oncostatin-A an Bakterien-Lipopolysaccharide.
Das Verfahren zur Vernetzung von Oncostatin-A mit bakteriellen Lipopolysacchariden stellt eine Modifizierung der von Primi und Cazenave, J Immunol. (1982) 129(3): 1124-1129 entwickelten Methode dar.
10 ng Oncostatin-A und 12,5 ng bakterielles Lipopolysaccharid- (LPS; Sigma Nr.L-263) wurden auf ein Volumen von 500 ul mit destilliertem Wasser verdünnt. 50 ul 2,5% Glutaraldehyd in PBS wurden zugesetzt, das Gemisch 30 min bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 ul 2M Glycin in PBS und Inkubieren des Gemisches für eine Stunde bei Umgebungstemperatur gestoppt. Das Oncostatin-A:LPS- Konjugat wurde mit 10 ml eines gemischten, lymphocytenkonditionierten Mediums und einem für die Verwendung in einer in vitro-Immunisierung sterilisierten Filter verdünnt.
In vitro-Immunisierung von Balb/C-Splenocyten mit Oncostatin-A und LPS-Konjugaten.
Nicht-immune Splenocyten wurden in vitro immunisiert, und zwar unter Verwendung einer Modifizierung des von Reading, Immunol. Meth. (1982) 53 : 261-269, beschriebenen Verfahrens.
Gemischtes, lymphocytenkonditioniertes Medium (MLC) wurde hergestellt, indem gleiche Zahlen von Balb/c und C57-schwarze-Maus-Thymocyten in DMEM, enthaltend 2% Kaninchenserum, bei 4·10&sup6; Zellen/ml 48 Stunden kultiviert wurden. Das Medium wurde gesammelt und bei -20ºC aufbewahrt. Zellen aus peritonealem Exudat (PEC) wurden gesammelt, indem eine mit Thioglycollat behandelte Balb/c-Maus mit steriler PBS behandelt wurde. Die PEC-Zellen wurden in eine Kultur mit einem Mausäquivalent von Splenocyten und 10 ml MLC-Medium, enthaltend 10 ng Oncostatin-A-LPS-Konjugat, kultiviert. Die Zellen wurden 7 Tage kultiviert.
Herstellung von monoklonalen Antikörpern.
Die Immunsplenocyten wurden gesammelt und mit SP2/0- Myelomzellen bei einem Verhältnis von 1 : 1 fusioniert, um Hybridoma zu produzieren, die Oncostatin-A-spezifische monoklonale Antikörper synthetisieren. Die Hybridoma wurden auf die Bildung von Oncostatin-A-Antikörpern mit einem enzymverknüpften Immunoassay (ELISA) getestet. Positive Hybridoma wurden zweimal durch begrenzende Verdünnung kloniert. Die Klone wurden expandiert, bezüglich der Immunoglobulinklasse getestet, und in Balb/c-Mäuse für die Aszites-Bildung injiziert.
Vierzig positive Hybridomaklone wurden anfänglich expandiert und erneut bezüglich der anti-Oncostatin-A-Wirkung getestet. Sieben der am stärksten reaktiven Klone wurden verwendet, um Aszites-Fluid in Balb/c-Mäusen zu bilden. Die restlichen Klone wurden expandiert und eingefroren. Die Aszites wurde für Spezifizität gegen Oncostatin-A, ein Oncostatin-A-Peptid-KLH- Konjugat und BSA in einem ELISA getestet. Die Aszites reagierte sowohl mit Oncostatin-A und in weniger ausgeprägtem Umfang auf ein Oncostatin-A-Peptid bei Verdünnung von 1 bis 3.000. Die Immunoglobuline wurden gereinigt, und zwar mittels der Caprylsäure-Ausfällungsmethode, beschrieben von Russo, et al., Anal. Biochem. (1983) 65 : 269-271. Die Paragon-Analyse der Immunoglobuline und die Doppeldiffusion-Ouchterlony-Analyse zeigten sämtlich, daß die Immunoglobuline vom Typ IgM waren.
ELISA-Assay auf Oncostatin-A.
Oncostatin-A wurde in 0,1 M Essigsäure verdünnt, und 10 mg/Vertiefung wurden in eine Dynatech-Immulon-Platte mit 96 Vertiefungen pipettiert. Die Lösung wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur getrocknet. Die Platte wurde durch Inkubation der Vertiefungen mit 2,5% BSA, 2,5% fötales Rinderserum (FCS) in PBS bei 37ºC für 1 Stunde blockiert. Die Platte wurde anschließend mit zweimal 2,5% FCS in PBS gewaschen. Das Hybridoma-Medium, das Immunoglobulin oder Antiserum wurde in der geeigneten Verdünnung anschließend zugesetzt. Die Platten wurden anschließend bei 37ºC 2 Stunden inkubiert und dreimal mit 2,5% FCS in PBS gewaschen. Vektor-Labs-Avidin-Biotin-HRP- ELISA-Reagentien wurden entsprechend den Herstelleranweisungen verwendet. Die Vertiefungen wurden mit 2,5% FCS in PBS nach jedem Schritt gewaschen. Die positiven Vertiefungen wurden durch Zugabe von 0,4 mg/ml ortho-Phenylendiamin in 0,1 M Natriumcitrat-Lösung, enthaltend 4 ul 30% Wasserstoffperoxid/10 ml-Lösung, sichtbar gemacht. Man ließ die Reaktion 30 min bei Umgebungstemperatur fortschreiten. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 ul 1,4 N H&sub2;SO&sub4;/Vertiefung gestoppt.
Bildung von polyklonalem anti-Oncostatin-Antiserum.
Balb/c-Mäuse wurden mit nitrocelluloseimmobilisiertem Oncostatin-A immunisiert. Der Zweck dieses Immunisierungsprotokolls ist der, daß eine rasche Clearance des Polypeptids durch den Wirt vermieden wird. In diesem Falle kann die Immunisierung durch sehr kleine Mengen an Oncostatin-A bewirkt werden.
Eine Lösung von Oncostatin-A in 0,1 M Essigsäure wurde auf kleine Nitrocellulose-Stückchen (Schleicher & Schuell, 0,45 um) punkteweise aufgetragen, und man ließ trocknen. Die Nitrocellulose-Stücke wurden in die Peritonealhöhle von drei Balb/c-Mäusen für die Anfangsimmunisierung gegeben (0,375 ng/Maus). (Die Mäuse erhielten ebenso eine intraperitoneale Injektion von 0,1 ml vollständigem Freund-Adjuvans.) Die Mäuse wurden zweimal in Abständen von zwei Wochen mit Oncostatin-immobilisierter Nitrocellulose geboostet. Für das Boosten wurde die Nitrocellulose zerhackt, mit 0,1 ml homogenisiertem Wasser und 0,1 ml unvollständigem Freund-Adjuvans homogenisiert und subkutan injiziert (0,125 ng/Maus). Die Mausseren wurden bezüglich ihrer Spezifizität gegenüber Oncostatin-A durch den zuvor beschriebenen ELISA-Assay getestet, und zwar mit Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Protein A zur Verwendung als Reagens in der zweiten Stufe. Die Seren wurden gegen Oncostatin-A-Peptid-KLH-Konjugat und eine geblockte Platte getestet, um die Spezifizität zu zeigen.
Die folgende Sequenz wurde mittels üblicher Methoden hergestellt:
Die Sequenz ist für die Verwendung in E. coli bezeichnet, und es wurden eine Anzahl von Restriktionsenzym-Erkennungsorten entwickelt, um eine Modifizierung der Kodierungssequenz zu erleichtern. Es wurden einzelsträngige, überlappende Sequenzen hergestellt, die in einem Verknüpfungsmedium kombiniert und ligiert wurden, um das vollständige Gen mit den geeigneten Termini für die Insertion in einen Expressionsvektor im Leseraster bereitzustellen, und um ein fusioniertes Protein herzustellen, aus dem Oncostatin-A isoliert werden konnte. Die einzelsträngigen Segmente wurden 5'-phosphoryliert, und zwar mit T4-Polynucleotid-Ligase, und durch Kombination von 200 pmol von jedem Segment in 31 ul Reaktionsvolumen (30 mM ATP, 10 mM DTT, 10 mM MgCl&sub2;, 1 ug/ml Spermidin, 100 mM Tris-HCl, ph 7,8 und T4 DNA-Ligase) verknüpft. Die dsDNA wird mit BssHII und BamHI verdaut und auf einem 7% nativen Polyacrylamidgel gereinigt.
Das Plasmid ptrpED5-1 (Hallewell und Entage, Gene (1980) 9: 27; Tacon et al., Mol. Gen. Genet. (1980) 177 : 427) wird mit den Endonucleasen BssHII und BamHI verdaut, und ein Fragment in im wesentlichen voller Länge, dem das trp D-Gen fehlt und das ein stumpfes trp E-Gen aufweist, wird durch präparative Gelelektrophorese isoliert.
Das Oncostatin-A-Gen wird mit dem linearisierten ptrpED5-1-Plasmid ligiert, um das Plasmid ptrp(Onc-A) zu bilden, und das Ligationsgemisch wird verwendet, um E. coli HB101-Zellen zu transformieren. Transformanten werden durch die Ampicillinresistenz selektiert, und die Plasmide werden durch Verdau mit Restriktionsendonucleasen analysiert. Die Transformanten werden bei 37ºC gezüchtet, und zwar auf etwa 108 Zellen/ml in Luria-Brühe, 3-Indolylessigsäure wird bis etwa 1 mM zugesetzt, und das Züchten wird für etwa eine Stunde fortgesetzt. Anteile (1 ml) werden einige Sekunden in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert, und die Pellets werden in 500 ul 7% Ameisensäure, enthaltend 5 mg/ml Bromcyan, suspendiert. Nach 24 h bei Umgebungstemperatur werden Anteile um das Zehnfache in Wasser verdünnt, und die verdünnten Proben werden auf Oncostatin-A getestet. Da Oncostatin-A kein internes Methionin aufweist, liefert eine N-terminale Methioninspaltung des fusionierten Proteins Oncostatin-A mit der gleichen Aminosäuresequenz wie natürlich auftretendes Oncostatin-A.
Es ergibt sich aus den obigen Ergebnissen, daß die interessierenden Verbindungen eine Vielzahl von Anwendungen finden können. Insbesondere können die Verbindungen bei der Diagnose und Behandlung von neoplastischen Zuständen verwendet werden. In der Therapie können die Verbindungen das Verlangsamen des Tumorzellenwachstums bewirken, so daß sie zusammen mit anderen Behandlungsmethoden für die Zerstörung von Tumorzellen verwendet werden können. Für die Diagnose erweist sich bei den interessierenden Verbindungen, daß sie die Bildung von p52 induzieren, so daß bei der Verabreichung der interessierenden Verbindungen an einen Wirt gesteigerte Spiegel von p52 die Anwesenheit von Tumorzellen indizieren können. Dies kann während der Behandlung eines neoplastischen Zustands sehr wichtig sein, um festzustellen, ob die Entfernung der Tumorzellen erfolgreich gewesen ist oder Metastasen aufgetreten sind. Die interessierenden Verbindungen können auch als Reagentien bei diagnostischen Tests auf die Anwesenheit von Oncostatin-A oder Oncostatin-A-Rezeptoren verwendet werden.
Ein Beispiel für ein Polypeptid der Erfindung ist in zusätzlichen technischen Informationen enthalten, die nach dem Einreichen der vorliegenden Anmeldung überreicht werden.

Claims

1. Zusammensetzung, enthaltend eine Verbindung mit der folgenden Aminosäuresequenz:

in der:

aa* V, L oder I,

aa&sup4;&sup5; V, L, I, K oder R,

aa&sup4;&sup7; N, Q, S oder T,

aa&sup5;&sup5; V, L, I, N oder Q,

aa&sup5;&sup7; G, A, K oder R und

aa&sup7;&sup0; G, A, S oder T bedeuten,

gegebenenfalls mit Insertionen oder Deletionen von einer oder zwei Aminosäuren, oder ein Fragment von mindestens 15 Aminosäuren derselben.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der die Verbindung mindestens die &sup8;-Aminosäuresequenz

LYS-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu

enthält.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der die Verbindung die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

Gln-Leu-Ile-Ala-Thr-Leu-Lys- Asp-Gly-Arg-Lys-Ile-Cys-Leu-Asp-Leu-Gln-Asa-Pro-Leu- Tyr-Lys- LYs-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser.

4. Monoklonale Antikörper, spezifisch für die Zusammensetzung gen gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 3.