HU210662B

HU210662B - Method for production of a conposition inhibiting tumor cell growth and for delection of tumor cells

Info

Publication number: HU210662B
Application number: HU852180A
Authority: HU
Inventors: Daniel R Twardzik; George J Todaro
Original assignee: Oncogen
Priority date: 1984-03-23
Filing date: 1985-03-19
Publication date: 1995-06-28
Also published as: EP0176588A4; AU4235485A; EP0176588B1; AU587380B2; EP0176588A1; US4645828A; DE3587863T2; FI854604A; FI92258C; ATE107662T1; JPH0242985A; DK540685D0; DK172463B1; FI854604A0; JPH0272896A; WO1985004397A1; FI92258B; DK540685A; JPH0632631B2; HUT38300A

Description

A találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy az zisformájú sejt-, illetve tumorsejt-növekedést gátló kéOncostatin-A-t a gyógyszerkészítésnél szokásos hor- szítménnyé alakítjuk, dozó- és adalékanyagokkal összekeverve szokásos dóHU 210 662 B

A leírás terjedelme: 10 oldal (ezen belül 1 lap ábra)

HU 210 662 B

A találmány tárgya sejtnövekedést gátló készítmény előállítására és tumorsejtek kimutatására.

A hematopoietikus sejtek differenciálódása és szaporodása szabályozásának összetett volta, valamint ezen sejteknek a differenciálódásban és szaporodásban betöltött szerepének bonyolultsága egyre nyilvánvalóbb, ahogy folyamatosan nő az ezeket az eseményeket szabályozó izolált faktorok száma. Ezek a faktorok legnagyobb részben rendkívül kis mennyiségben, számos eltérő funkciójú fehérjével együtt fordulnak elő. Az izolált és igazolt aktivitású faktorok közé tartoznak az olyan polipeptidek és fehérjék mint például a γ-interfenon, vérlemezkéből származó növekedési faktor, kolónia stimuláló faktor, interleukin-2-, eritropoiétin, valamint számos egyéb limfpokin. Nagy érdeklődés mutatkozik ezeknek a vér-komponenseknek az izolálásában, tisztításában és jellemzésében mivel valószínűleg alkalmazhatók a kezelésben, valamint olyan betegségek, mint például a rák, kimutatásában.

Számos csapda található a természetes faktorok izolálásában. Olyan elválasztási rendszert kell kidolgozni, amely a kívánt faktort elválasztja a többi jelenlévő és esetleg hasonló jellemzőkkel rendelkező faktortól. Másodszor, valami olyan vizsgáló rendszert kell kidolgozni a különböző frakciók elemzésére, amely specifikusan vagy lényegében specifikusan jellemzi a számunkra érdekes anyagot, a jelenlévő többi anyaggal szemben. Ahol az érdekes polipeptid aktivitása kiemelkedően magas, ott a kívánt termék izolálásának nehézségei nagymértékben megnőnek. Harmadszor, olyan eljárást kell alkalmazni, amelynek nincs hátrányos hatása a kívánt termékre, különösen kerülni kell bármilyen denaturálódást. Ezenkívül gyakran találhatók olyan más anyagok a készítményben, melyek hatnak a kívánt termékre, megváltoztatják azt, így a végül kapott termék, amely rendelkezik valamilyen mértékben a kívánt aktivitással, már nem a természetben előforduló anyag. Végül a kívánt komponens megfelelően tiszta formában való izolálása után meg kell próbálni fizikailag jellemezni a polipeptidet, például aminosavsorrend meghatározással, a glikozilezési szám, a di5 szulfid-hidak számának és hasonlóknak meghatározásával. Az anyagot tovább kell jellemezni például a fiziológiai jellemzők szempontjából is.

Végül, még a tisztított vegyület izolálása után is a vegyület fiziológiai aktivitása gyakran megfoghatat10 lannak bizonyulhat. Mivel számos esetben az aktivitás függhet egy vagy több más vegyület jelenlététől, egy keskeny koncentráció-tartománytól, adott gazdasejtektől vagy hasonlóktól, sok ötletre, erőfeszítésre, kiterjedt kísérleti tapasztalatokra van szükség ahhoz, hogy felfedezzük egy vegyület fiziológiai aktivitását és kimutassuk az aktivitását befolyásoló paramétereket.

Holley és munkatársai [Proc. Natl. AcadSci. USA 77, 5989-5992 (1980)] leírták az epiteliális sejtnövekedés inhibitorok tisztítását. Nelsen-Hamilton és Holley [Proc.

Natl. Acad Sci. USA, 80, 5636-5640 (1983)] leírták egy növekedési inhibitor és epidermális növekedési faktor hatását radioaktívan jelzett metioninnak afrikai zöldmajom-sejtek (BSC-1) által kiválasztott fehérjékbe való beépülésére. Morgan és munkatársai [Thromb. Haemost, 42

1652-60 (1980)] leírták az emberi 4. vérlemezke faktor aminosav-sorrendjét. Dawes és munkatársai [Thromb. Rés. 29, 569-81 (1983)] valamint Schemthaner és munkatársai [Acta Med. Austriaca (Suppl.) 6, 375-9 (1979)] poliklonális antitesteket írnak le a 4. vérlemezke faktorra.

Lawler [Thromb. Rés 21, 121-7 (1981)] összehasonlítja a β-thromboglobulin és a 4. vérlemezke faktor aminosavsorrendjét és szerkezetét.

A találmányban emlős neoplasztikus sejtnövekedést gátló polipeptidet tartalmazó készítményekkel foglalkozunk.

A jelen találmány szerinti hatóanyag, az Oncostatin-A összetétele a következő:

Glu Alá Glu Glu Asp Gly Asp Leu Gin Cys Leu Cys Val Lys Thr Thr Ser Gin Val Arg Pro Arg His Ile Thr Ser Leu Glu Val Ile Lys Alá Gly Pro His Cys Pro Thr Alá Gin Leu Ile Alá Thr Leu Lys Asp Gly Arg Lys Ile Cys Leu Asp Leu Gin Alá Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser

A fenti Oncostatin-A PF4 néven ismert, és előállí- 45 tását és tisztítását Morgan és munkatársai ismertetik, a Thromb. Haemost. 42: 1652-60 cikkükben. Ugyanakkor nem volt ismert e vegyület és származékai sejt- és tumorsejtnövekedést gátló hatása, valamint alkalmazhatósága tumorsejtek kimutatására.

A jelen találmány szerinti készítményt in vitro és in vivő tumor növekedésének gátlására használhatjuk. A találmány szerinti készítményeket használhatjuk a pp60 src autofoszforilezésének stimulálására. A találmány szerinti készítmények ezek szerint a pp60 src enzim szubsztrátjaként szolgálnak, és foszforilezhetők a polipeptidben a tirozinon (60 maradék). A tumorsejtek készíthetők arra, hogy Oncostatin-A-val kezelve egy 52 kDal fehérjét bocsássanak ki. Ezenkívül az Oncostatin-A-t tartalmazó fúziós fehérjéket használhatjuk monoklonális antitestek előállítására vagy reagensként diagnosztikai vizsgálatokban az OncostatinA vagy immunológiailag kompetitív vegyületek vagy az Oncostatin-A sejtfelszíni receptorai jelenlétének detektálására.

A találmány szerinti vegyületek magas tumorgátló aktivitással rendelkeznek. A találmány szerinti készítményeket használhatjuk in vitro vagy in vivő a a heoplasztikus sejtek növekedési sebességének csökkentésére. A polipeptid készítmények 1 ng színtelen képesek leg55 alább 20%-ban gátolni a tumorsejtek növekedését, főleg a karcinómákat és szarkómákat, például a tüdő, mell, bőr stb. tumorokat. A polipeptid készítmények előnyösen legalább 40%-ban, még előnyösebben legalább körülbelül 50%-ban gátolják a tumorsejtek növekedését, össz60 hangban a kísérleti részben leírt kolónia-gátló teszttel.

HU 210 662 B

A találmány szerinti készítményeket használhatjuk in vivő, feltételezhetően neoplasiaval rendelkező alanynak beadva. A találmány szerinti készítményeket alkalmazhatjuk egy neoplasztikus helyen, például egy melanómán, hogy csökkentsük a szaporodás sebességét. Az alkalmazás módszere lehet injekciózás, katéterrel való bevezetés, direkt alkalmazás vagy hasonló, a tumor helyétől, a találmány szerinti készítmény formájától, a dózisszinttől és hasonlóktól függően. A dozírozás változik attól függően, hogy szisztémás vagy lokális, a dózis-koncentrációk általában 0,1-1000 μg/kg között változnak és a nagy emlősök, beleértve a főemlősöket, teljes dózisa 0,01-10 mg per kezelési dózis.

Az Oncostatin-A-t fiziológiásán elfogadható hordozókban formulázhatjuk, úgymint foszfáttal pufferolt sóoldatban, desztillált vízben, hordozóban, vagy hasonlókban, vagy alkalmazhatjuk tisztán.

Az Oncostatin-A-t használhatjuk indirekt módon, a neoplasztikus sejtek jelenlétének kimutatására. Ha a sejteket a hatóanyag körülbelül 1-500 ng/ml-es koncentrációjának, előnyösen a hatóanyag körülbelül 50350 ng/ml koncentrációjának tesszük ki, a neoplasztikus sejtek egy 52 kD fehérjét (p52) választanak ki. így a neoplasztikus sejtek jelenlétét detektálhatjuk a p52 kiválasztásának detektálásával a külső közegben, például a táplevesben, vérben, vizeletben vagy más fiziológiás folyadékban. Az Ocostatin A tehát használható egy szervezet állapotának vizsgálatára, valamint a neoplasztikus állapot meglétének vagy hiányának kimutatására. Az Oncostatin-A-t használhatjuk a tumor meglétének diagnosztizálására, sebészeti beavatkozás vizsgálatára, a metasztázis szintjének vizsgálatára vagy hasonlókra. Az Oncostatin-A anyagot beadhatjuk in vitro vagy iv vivő (tenyészlé vagy szervezet) elegendő mennyiségben ahhoz, hogy a p52 kiválasztását indukáljuk. A rendszerrel kapcsolatban álló folyadékban vizsgálhatjuk a p52 jelenlétét, a neoplasztikus sejtek jelenlétének indikációjaként.

Az Oncostatin-A-t használhatjuk az immunrendszer stimulálására is, akár magában is, de előnyösen más limfokinekkel, például interferonnal, főleg gamma-interferonnal együtt. így az Oncostatin-A-t formulázhatjuk más polipeptidekkel és egy immunszuppreszszált szervezetbe adhatjuk be az immunrendszer stimulálása céljából. A gamma-interferonról ismert, hogy az la kifejeződését indukálja monocitákban és makrofágokban, valamint más szövetekben, például az endotéliumban és fibroblasztokban. Az Oncostatin-A indukálja az la kifejeződését és stimulálja a gamma-interferon la indukáló hatását, megnöveli egy adott gammainterferon dózis hatékonyságát. Az Oncostatin-A általánosan alkalmazott mennyisége annyi, hogy a közegben körülbelül 1-200, előnyösen körülbelül 270 mg/ml koncentrációt biztosítsunk. A gamma-interferon mennyisége esetén általában a 0,5-200 ng/ml tartományban van. Az la kifejeződésében legalább 1,5szeres, általában legalább kétszeres növekedést lehet elérni Oncostatin-A-al magukban vagy más limfokinekkel együtt alkalmazva. Az adagolást az előzőkben leírt módon végezhetjük.

Az Oncostatin-A-t alkalmazhatjuk más kinázokkal együtt, például pp60 src-vel, hogy az enzim szubsztrátspecifitását megváltozhassuk. Az enzimet kismennyiségű Oncostatin-A-val összehozva, különösen körülbelül 0,05-50 μg/ml koncentrációban, a kináz aktivitást fokozhatjuk, beleértve a foszforilezett aminosavakban beálló változást, azaz a foszforileződő tirozin mellett a szerint is foszforileződik. Ilymódon a pp60 arc vagy analóg kinézek kombinációját használhatjuk tirozin és szerin aminosavakat tartalmazó polipeptidek módosítására, megnövelve mind a tirozin, mind a szerin foszforileződési sebességét.

A találmány szerinti Oncostatin-A-t alkalmazhatjuk hapténként vagy antigénként, hapténként immunogén potenciátorhoz, például antigénhez, részecskéhez vagy hasonlóhoz kapcsolva, monoklonális antitestek vagy poliklonális szérumok előállítása céljából. Az antitestek széleskörű alkalmazásra találhatnak, főleg diagnosztikai célokra. Az antitesteket használhatják önmagukban, vagy Oncostatin-A-val együtt, mint reagensekkel az Oncostatin-A és Oncostatin-A receptorok detektálására, ideértve az Oncostatin-A-ra specifikus antitesteket is.

Módszerek és technikák számos változata ismert az érdekes analízisek meghatározására. Ezekhez a technikákhoz tartozik a jelzések széles változata, ideértve enzimeket, radioaktív atomokat, fluoreszkáló anyagokat, kemilumineszkáló anyagokat, enzim szubsztrátokat, enzim-inhibitorokat, részecskéket és hasonlókat. A módszer működhet elválasztási lépéssel (heterogén) vagy lehet elválasztási lépés nélkül (homogén). A jelzés kötődhet vagy az Oncostatin-A-hoz, vagy az Oncostatin-A-ra specifikus antitesthez (az anti-Oncostatin-A-hoz) vagy konjugálódhat egy anti-Ocostatin A specifikus antitesthez, például az anti-Oncostatin-A F_crészéhez. Használhatjuk a teljes antitestet vagy annak fragmentjeit, beleértve az Fab-t, az F(ab)₂-t, Fv-t vagy hasonlót. Számos amerikai egyesült államokbeli szabadalomban közölnek a jelen találmányban használható diagnosztikai technikákat. Példaként megemlítünk néhány szabadalmat: a 3 766 162; 3 791 932; 3 817 837; 3 996 345 és 4 233 401 sorszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés. A használt vizsgálatok közé tartozik például a RIA, EIA, EMIT^R, ELISA, SLFIA, FIA, ezek mind használják a gyakorlatban, megvehető, és a más célokra használatos reagensek hozzáférhetők. Különböző reagenseket adnak a kitekben, melyekben a reagensek természete és egymáshoz viszonyított mennyisége úgy van megválasztva, hogy a vizsgálat érzékenysége optimális legyen.

Az antitesteket szokványos módon állíthatjuk elő, a monoklonális antitestek vagy poliklonális szérumok előállításával összhangban. Minden esetben egy megfelelő gazdaszervezetet be kell injekciózni egy vagy két érdekes epitop hellyel rendelkező immunogénnel, ezt általában egy vagy több megerősítő, fokozó injekció követi. Poliklonális antiszérum előállítása céljából a gazdaszervezet vérét kell venni és a globulin frakciót izolálni. A globulin frakciót tovább tisztíthatjuk affinitás-kromatográfiával. Monoklonális antitestek előállí3

HU 210 662 Β tása céljából a gazdaszervezetet úgy immunizáljuk, mint az előbb, de ebben az esetben a lépet általában eltávolítjuk és egy megfelelő fúziós partnerrel fuzionáltatjuk. Miután a kívánt antitestet kiválasztó hibridómákat szelektáltuk, a hibridómákat határhígításnak vetjük alá, ezt követően szelektáljuk és klónozzuk majd tovább jellemezzük.

A jelen találmány szerinti antitestek bármely, a természetben előforduló típusúak lehetnek, úgymint IgA, IgD, IgS, IgG és IgM, főleg IgM és az IgG különböző altípusai, például az IgG 1, 2, 3 vagy 4.

A kapott monoklonális antitesteket immunogénként használhatjuk anti-idiotípusos antitestek előállítására, melyek az Oncostatin-A-hoz konformációs hasonlósággal rendelkeznek. Ezeket használhatjuk majd az Oncostatin-A helyettesítő reagensként számos alkalmazásban.

Az Oncostatin-A-t úgy állíthatjuk elő, hogy a vérlemezkéket körülbelül 0,3 mólos etanolos sósavval extraháljuk. A degradálódás elleni inhibitorként fenil-metilszulfonil-fluoridot és aprotinint is adhatunk hozzá, az előzőt az extrahálandó anyag 1-10 súlyszázalékában alkalmazva, az utóbbit az extrahálandó anyagra számítva 0,1-1 TlU/mg (TlU-tripszin gátló egység) koncentrációban alkalmazva. Miután a pH értékét vizes ammónium-hidroxid alkalmazásával 5-re növeltük, kismennyiségű ammónium-acetátot adunk hozzá és az oldatot centrifugálással vagy más egyszerű módon tisztítjuk.

A fehérjét ezután hideg, 95%-os etanol és éter egymás után való alkalmazásával kicsapjuk, a csapadékot összegyűjtjük és 0,1-0,5 M ecetsavval szemben dializáljuk, 3000 Mr alatti vágási értékkel rendelkező dialízis membránt alkalmazva. A maradékot liofilezzük, 1 mólos ecetsavban újra szuszpendáljuk, tisztítjuk és ekkor kész az anyag további tisztításra Bioge^ P-10 gélpermeációs kromatográfiával. A terméket körülbelül 1 mólos ecetsavval eluáljuk, majd az egyes frakciókat megfelelő vizsgáló technikával, például tumor növekedés gátlásának mérésével vizsgáljuk.

A növekedésgátló hatással rendelkező frakciókat liofilezzük, híg vizes (pH 2-3) trifluorecetsavban reszuszpendáljuk, majd nagynyomású folyadékkromatográffal kromatografáljuk, a szilíciumdioxid töltet, felszíne körülbelül 16-20 szénatomos, például 18 szénatomos hosszú alifás lánccal van borítva. Az oszlopot híg (0,02-0,1%) trifluorecetsavval egyensúlyba hozzuk, majd a terméket híg (0,01-0,1 m általában 0,04-0,05%-os, maximális acetonitril koncentráció 60%) eluáljuk. Viszonylag kis áramlási sebességet alkalmazunk általában 0,51 ml/perc-et, szobahőmérsékleten.

A frakciókat az előzőekben említett, vagy más biológiai vizsgáló módszerrel vizsgáljuk. További tisztítás céljából az oszlopról nyert terméket nagynyomású gélkizárásos kromatográfiával tisztítjuk.

A Novapak C_]8 fordított fázisú folyadékkromatográfiával kinyert Oncostatin-A aktivitást mutató fő csúcsot tartalmazó frakciót liofilezzük és 100 μΐ 0,1% trifluorecetsavat tartalmazó 40%-os acetonitrilben szuszpendáljuk. A mintát hidroxilezett poliéter-gél oszlopra visszük (Sió Rád TSK-250) és 0,1%-os trifluorecetsavban készült 40%-os acetonitrillel mint mozgó fázissal eluáljuk. Minden egyes frakcióból alikvot részeket veszünk ki, liofilezzük és vizsgáljuk Oncostatin-A aktivitását; a tumorsejt gátló aktivitás együtt eluálódik a fő fehérje-csúccsal (Rf-0,9) melynek molekulasúlya megfelel az ennek a kromatográfiás rendszernek a kalibrálására használt 6000-es molekulasúlyú inzulin molekulasúlyának.

Az oszlopról nyert terméket SDS-PAGE alkalmazásával lehet elektroforetizálni. Egy körülbelül 60008000-as molekulatömegű csíkot izolálunk. A csíkból nyert anyagnak erős, neoplasztikus emlős sejtek növekedését gátló hatása van.

Ahelyett hogy az Oncostatin-A-t természetes forrásból izolálnánk vagy a polipeptidet és a rokon vegyületeket szilárd hordozón megszintetizálnánk, az Oncostatin-A-t hibrid DNS technológiával állíthatjuk elő. Az Ocostatin A struktúrgénjét a gazdasejt kromoszómájából nyerhetjük az ismert aminosav-sorrenden alapuló próbák alkalmazásával, génbankot végigvizsgáljuk a (megfelelő redundáns) próbát használva, hibridizálva az izolált fragmenteket, a fragmentek méretét csökkentve és restrikciós térképezéssel, valamint szekvenálással jellemezve.

Egy másik módszer szerint a DNS-t a génbankhoz hasonló módon kereshetjük, és ha teljes vagy részleges sturktúrgént izolálunk, az utóbbit megfelelő adaptor használatával alkalmazhatjuk a hiányzó kodonokat helyettesítve.

Kényelmes, ha szintetikus gént szintetizálunk. Szintetikus gén használatakor lényeges flexibilitást érhetünk el annyiban, hogy a gazdaszervezetben gyakrabban használt kodonokat használhatunk, és egyedi, vagy ritka restrikciós helyeket építhetünk be. A restrikciós helyek bizonyos fokú flexibilitást adnak a gén különböző részeinek módosításában, deléciók, tranziciók, transzverziók, inszerciók és hasonlók bevetésével. Olyan stratégiát tervezünk, melyben egyszálú, átfedő fragmenteket alkalmazunk, ezek hibridizáló, ligáló közegben összekeverhetők, anélkül, hogy aheteroduplex képződést zavarnánk. A kapott kétszálú gént klónozhatjuk és tisztíthatjuk. Erre egy példát a kísérleti részben írunk le.

Kívánatos, hogy a gén két vége különböző legyen, ezáltal az inszerciónál helyes orientációt tudunk biztosítani. A gént a kifejeződés biztosítására megfelelő expressziós vektorba építjük be. Számos vektor található prokariótákban, és eukariótákban, úgymint gombákban, például élesztőben, emlős sejtekben, például egérsejtekben, főemlős sejtekben, stb. való kifejeződéshez. A replikációs rendszer származhat plazmidokból, vírusokból, vagy kromoszómákból. A jellemző replikációs rendszerek közé tartozik például a Col El, lambda, RSF 1010, 2 gm plazmid, SV40, adenovírus, papilóma bovine vírus, stb.

A legalább egy rendszer mellett, ha az episzomális fennmaradás szükséges (nincs szükség replikációs rendszerre, ha az integrálódás a cél), általában egy olyan genetikai bélyeg van még jelen, amely lehetővé teszi a kívánt gént tartalmazó gazdasejt szelekcióját. A

HU 210 662 Β genetikai jelzés rendszerint biocid rezisztencia, például antibiotikum vagy nehézfém rezisztencia, vagy egy auxotróf gazdasejt prototróffá való komplementációja. Egy vagy több genetikai jelzés lehet jelen; általában nem több, mint három.

A stuktúrgén általában egy polilinkerbe beépítve (a polilinker sok restrikciós helyet tartalmazó szakasz) és kifejező gazdaszervezet által felismert transzkripciós és transzlációs iniciációs és a terminációs regulációs szakaszok között található. A transzkripciós iniciációs régió megfelelő megválasztásával a tanszkripció lehet konstitutív vagy indukálható. Számos promoter régiót izoláltak és igazolták hasznos voltukat, úgymint az Escherichia coli trp és lac promotere, a lambda fág P_Lés P_R promoterei, az élesztő glikolitikus enzimeinek promoterei, az SV40 és az adenovfrus korai és késői promoterei és hasonlók.

Ezenkívül fuzionált gént állíthatunk elő, egy kiválasztási vezér-peptidet és processzáló jelet tartalmazó 5’-szakaszt kapcsolva a struktúrgénhez. A leírt kiválasztási vezérpeptidek néhány jellemző példája a penicillináz, az alfa-faktor, az immunglobulinok, a T-sejt receptorok, a külső membrán-fehérjék és hasonlók kiválasztási vezérpeptidje.

Megfelelő leolvasási fázisban fuzionáltatva az érett Oncostatin-A kiválasztható a tápközegbe.

A stuktúrgént és az expressziót szabályoz szakaszokat tartalmazó konstrukciós bármely ismert módszerrel, például transzformációval (például kalciumfoszfáttal kicsapott DNS-sel), transzfekációval, transzdukcióval, konjugációval, mikroinjektálással juttathatjuk be a kifejező gazdaszervezetbe. A gazdaszervezetet ezután megfelelő tápközegben nagy sűrűségben ki kell növeszteni. Ahol a promoter indukálható, ezután permisszív körülményeket alkalmazunk, például hőmérséklet-változást, egy metabolizmus-termék vagy táptalajkomponens fölöslegét vagy hiányát, vagy hasonlót.

Ha a termék bennmarad a gazdaszervezetben, a sejteket összegyűjtjük, elroncsoljuk és a terméket izoláljuk valamint tisztítjuk extrakcióval, kicsapással, kromatográfiával, elektroforézissel, és hasonlóval. Ha a termék kiválasztódik, akkor a tápközeget kell összegyűjteni és a terméket ismert módszerekkel, például affinitás kromatográfiával tisztítani.

Amellett, hogy expressziós célra használjuk, a stuktúrgén szakaszokat használhatjuk hibridizációhoz próbaként, valamint a kettőzódő szakaszok kimutatására. Például a mRNS jelenlétét és mennyiségét mutathatjuk ki a gazdaszervezetben.

Az 1. ábrán az Oncostatin-A-nak a hatását mutatjuk be atimuszos egerekben lévő tumor növekedésére.

A következő példákat illusztrációként mutatjuk be, nem tekinthetők korlátozásnak.

Kísérleti rész

Rövidítések: EMEM-Dulbecco módosított Eagletáptalaj (Sigma Chemical Company, No. D2902), PBSfoszfáttal pufferolt sóoldat: P/S-penicillin/Streptomicin (0,57 mg/ml mindegyik); FCS-borjúmagzat szérum:

SDS-PAGE-nátrium-dodecilszulfát poliakrilamid gélelektroforézis.

Az Oncostatin-A tisztítása

Savas-etanolos extrakció humán vérlemezkékből g nedves tömegű friss vagy fagyasztott, szobahőmérsékleten megolvasztott vérlemezkét két térfogat 375 ml 95%-os etanol, 7,5 ml tömény sósav, 33 mg fenil-metilszulfonil-fluorid és 1 ml aprotinin (23TIU/ml; szarvasmarha tüdőből, Sigma Chemical Co., A6012) összetételű oldatban szuszpendálunk. A keveréket 4 °C-on éjszakán át keverjük, 8000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk 19-es típusú Beckmann rotorban 30 percig, majd a felülúszót eltávolítjuk. A felülúszót pH-ját tömény ammónium-hidroxiddal 4,0ra állítjuk, majd 1:10 arányban hígított tömény ammónium-hidroxiddal a pH-t 5,2-re növeljük. A felülúszót 0,1 literéhez 1 ml 2 mólos ammónium-acetátot (pH = 5,2) adunk, majd az oldatot 800/perc fordulatszámmal 19-es típusú rotorban 30 percig centrifugáljuk. A felülúszót eltávolítjuk, két térfogat hideg 95%os alkoholt adunk hozzá, majd ezt követően négy térfogat hideg dietilétert, és az elegyet éjszakán át 0 °C-on hagyjuk állni. A csapadékot 8000/perc fordulatszámmal 19-es típusú rotorban 30 percig centrifugálva öszszegyűjtjük, majd az üledéket körülbelül 10-20 ml 1 mólos ecetsavban szuszpendáljuk. Az ecetsavas szuszpenziót 5 liter 0,2 mólos ecetsavval szemben dializáljuk (2 x cseréljük az oldatot) Spectrapor dialízis membrán hüvelyben (ΨΑ3, vágási érték 3500 American Scientific Products). Az extraktumot liofílezzük 7,5 ml 1 mólos ecetsavban szuszpendáljuk, majd 30 000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk.

Gélpermeációs kromatográfia

Biogal Ρ-10-et (200-400 mesh, Bio Rád Laba) éjszakán át 1 mólos ecetsavban duzzasztjuk, gondosan gázmentesítjük majd 100 x 2,5 cm-es, szilikonozott üvegcsőbe töltjük, majd hagyjuk hogy egy éjszakán át egyensúlyba jusson 1 mólos ecetsavval. Minden oldatot gázmentesítünk használat előtt.

g humán vérlemezkéből származó, savas-etanolos kezeléssel szolubilizált peptidet (50-70 mg fehérje) 7,5 ml 1 mólos ecetsavban oldunk és a fenti oszlopra visszük. 3,5 ml-es frakciókat szedünk, ezek alikvot részeit liofilizáljuk, és vizsgáljuk, mennyiben gátolják az 5-I¹²⁵-dezoxi-uridin beépülését A549 emberi tüdőkarcinóma sejtekbe,

Reverz-fázisú nagynyomású folyadékkromatográfia

A tumor-növekedést gátló aktivitás maximumát tartalmazó frakciót (körülbelül 200 ng fehérje) liofílezzük és újra szuszpendáljuk 0,05 tf% trifluorecetsavban. Az oszlopot ezután 0,045%-os trifluorecetsavban készült, 0,60%-os lineáris acetonitril gradienssel eluáljuk 0,8 ml/perc áramlási sebességgel 23 °C-on. Minden egyes frakcióból aükvot részeket liofilezünk és három párhuzamosban, a fentiekben leírt módon vizsgálunk.

A gátló aktivitást tartalmazó frakció(ka)t ezután 40%-os 0,1% trifluorecetsavat tartalmazó acetonitril5

HU 210 662 B ben oldjuk, majd hidroxilezett poliéter-gél oszlopra visszük (Bio- Rád TSK-250) és 40% acetonitrilt (0,1%-os trifluorecetsavban oldva) tartalmazó mobil fázissal eluáljuk. Frakciókat szedünk, liofilezzük és vizsgáljuk növekedés-gátló hatásukat három párhuzamosban. Az aktivitás az inzulin markerrel együtt eluálódik, ez megfelel annak, hogy molekulatömege 6-8 kD között van.

A legmagasabb aktivitású frakciókat SDS-PAGEval elektroforetizáljuk.

A reverz fázisú HPLC tisztítási lépésből származó fő Oncostatin-A aktivitásnak megfelelő peptidet liofilezzük és 0,03 ml minta-pufferben (12,5 mM TriszHC1 pH 6, 7,4% SDS, 10% béta-merkapto-etanol, 20% glicerin és 0,01% brómfenol kék) szuszpendáljuk majd 2 percig forraljuk. A mintát olyan 5%-os poliakrilamid zárógélbe töltjük, melyet 0,1% SDS-t tartalmazó, pH 8,8-as 17-27% poliakrilamidot tartalmazó gradiens lapgélre öntünk. A gélt 10 milliamper áramerősséggel futtatjuk míg a minták átvándorolnak a zárógélen, majd 20 milliamperrel addig, míg a festék-front a gél aljáig vándorol. A géleket fixáljuk és éjszakán át 0,2% Coomassie blue, 50% metanol és 9% ecetsav összetételű oldatban festjük. A festék-fölösleg eltávolítása után a Coomassie pozitív csíkokat Hoffer denzitométerrel lokalizáljuk. A markerek közé tartozik az inzulin (6000 D), tripszinogén (24 400 D), RN-áz (13 700 D) és aprotitin (6500 D). A fő peptidcsúcs együtt vándorol ilyen elektroforézis körülmények között a 6500 D molekulatömegű aprotinin standarddal.

Az alkalmazott vizsgáló módszerek a következők: a 2. napon reggel A549 sejteket (humán tüdőkarcinóma) Nunc 96 lukas lemezekbe (Kamstrupvej 90, DK-4000, Roskilde, Denmark) viszünk. Ezeket a sejteket akkor használjuk, mikor még 30-nál kevesebben vannak. A szélső lukak kivételével mindegyik lukba 45 000 sejt/50 μΐ/luk mennyiségét viszünk (9 x 10⁴ sejt/ml DMEM 10% FCS-sel, P/S, glutamin). A szélső lukakba 50 μΐ PBS-t teszünk és a teljes lemezt 37 °C-on inkubáljuk. A következő délután a vizsgált mintákat 10% FCS-t, P/S-t és glutamint tartalmazó DMEM-ben szuszpendáljuk, három párhuzamos méréssel vizsgáljuk. Mindegyik vizsgáló lukba 50 μΐ-t teszünk, míg a kontroll lukakba 50 μΐ DMEM-et teszünk és a lemezt 37 °C-on 3 napig inkubáljuk. A 4. napon mindegyik lukba 50 μΐ I^I25-dezoxiuridin oldatot teszünk (4 Ci/mg-0,5 Ci/ml; 1 μΐ izotóp/ml 10% FCS, P/S glutamintartalmú DMEM), majd a lemezt éjszakán át 37 ’Con inkubáljuk. Az 5. napon a közeget kiszívjuk a tokákból, egyszer mossuk PBS-sel, 100 μΐ metanolt adunk hozzá, hagyjuk 10 percig állni, majd a metanolt leszívjuk. A tokákhoz ezután 200 μΐ 1 mólos nátriumhidroxidot adunk, a lemezt 30 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd az 1 mólos nátrium-hidroxidot Titerfek dugókkal (Flow Labs) eltávolítjuk. A dugók radioaktivitását ezután gamma-számlálóban mérjük.

Hogy demonstráljuk a fentiek szerint preparált Oncostatin-A hatásosságát, a következő vizsgálatot végezzük. A vizsgálatot lágy-agar telepgátlásnak hívjuk. A használt anyagok a következők: 5%-os agar, [3,75 g

Növel agar (Difco)], 7,5 ml desztillált víz 125 ml-es Wheaton palackban autoklávozva, DMEM 10% FESvel, 1000 egység penicillinnel, 100 egység streptomicinnel, 200 mM glutaminnal, valamint A375 humán metanolos sejtek.

A vizsgálandó anyagokat steril 12 X 75 mm-es csövekben liofilezzük. Az 5%-os agárból DMEM-mel tízszeres hígítást készítünk majd vízfürdőn 46 °C-ra melegítjük. Az alapréteget úgy készítjük el, hogy 1 ml 0,5%-os agaroldatot pipettázunk egy hatlukú tenyésztő-lemez (35 x 14 ml) minden egyes lukába. A réteget szobahőmérsékleten hagyjuk állni míg megkeményedik. SA<5 sejteket (normál patkány fibroblast sejtek) készítünk tripszinezéssel és a sejtszámot meghatározzuk. A sejteket 1 X 10⁴ sejt per milliliter végkoncentrációra hígítjuk és mindegyik mintához 0,35 ml sejtet adunk.

Mind a 10 vizsgált mintát tartalmazó csőbe 0,75 ml 0,5%-os agaroldatot pipettázunk, az elegyet gyengén vortexeljük és a cső tartalmát (vizsgált minta, sejtek, agar) az alaprétegre öntjük és körülbelül 20 percig szobahőmérsékleten hagyjuk állni, mialatt az agar megkeményedik. A lemezeket ezután nedvesített inkubátorban, 5% széndioxiddal, 37 °C-on tároljuk.

A lemezeken 3, maximum 10 nap után vizsgáljuk a telepnövekedés gátlását, a vizsgált minta erősségétől függően. A telepek számát 8, random kiválasztott alacsony nagyítású mikroszkóp látómezőben vizsgáljuk. Ha a lemezeket több mint 5 napig kell tárolni, újabb 1 ml 0,3%-os agaroldatot rétegezőnk a vizsgált mintára, hogy megakadályozzuk a vizsgált minta rétegének kiszáradását.

A fenti módszert alkalmaztuk különböző koncentrációjú tisztított Ocostatin A-val. A következő táblázaton mutatjuk be az eredményeket, az Ocostatin A jelzett mennyisége a vizsgálandó csőbe bevitt liofilizált anyagmennyiség. Az eredményeket a maximális gátlás százalékában fejezzük ki.

1. Táblázat

Oncostatin-A logjo 10 ng	Maximális gátlás %
0,8	45
0,26	73
20	81
60	100

A fenti eredményekből nyilvánvaló, hogy a vizsgált polipeptid hatékonyan gátolja a sejtek növekedését. A melanoma-sejtekkel megfigyelt eredmények alapján körülbelül 1 ng elegendő a körülbelül 50%-os gátláshoz. A találmányban szereplő vegyület tehát széleskörű alkalmazást nyerhet sejtnövekedést gátló szerként, beleértve a neoplasztikus sejtnövekedést. A találmányban szereplő vegyület például gátolja számos tenyésztett humán tumorsejt növekedését is, de nem gátolja a normális, nem neoplasztikus humán először fibroblasztokat, amint azt a következő táblázattal igazoljuk.

HU 210 662 B

II. Táblázat

Az Oncostatin-A hatása tenyésztett humán sejtekben az in vivő DNS szintézisre
Sejtvonal	AI¹²⁵ dezoxiuridin beépülés maximális* %-os gátlása
Transzferált
Humán-tüdőkarcinóma (A 549)	100
Humán tüdő adenokarcinóma(H125)	41
Humán melanóma (A 375)	67
Humán mell-karcinóma (MCF-7)	37
Nem-transzformált
Humán először fibroblaszt (HuFpe)	0

* A leírt vizsgálati körülmények között az I¹²⁵-dezoxiuridin beépülés A549 sejtekbe maximális gátlása az Oncostatin-A telítési koncentrációjánál (100 ng/luk) megfigyelve nem haladja meg a kezeletlen kontroll tenyészetek 50%-át.

Az Oncostatin-A hatása atímuszos egerekben a humán ráksejtek növekedésére Fiatal (8-10 hetes) atímuszos egereket injektálunk szubkután módon a lágyéktáji részen 5 x 10⁶ humán tüdőkarcinóma sejttel (A549), 100 μΐ foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) szuszpendálva. A beoltás után hét (7) nappal 2,5-3,0 mm átmérőjű tumorok fejlődnek ki; a daganat-hordozó egereket random választjuk ki és a 7. napon szubkután az injekció helyén 50 μΐ, az előzőekben leírt módon humán vérlemezkékből homogénezve tisztított Oncostatin-A-ból 0,30 μg-ot tartalmazó PBS-sel injekciózzuk. A tumorhordozó kontroliegerek injekciózása PBS-sel Oncostatin-A nélkül nem hat a tumomövekedésre. A tumorhordozó egerek ezután ekvivalens dózisú Oncostatin-A 50 μΐ-es PBS-es oldatával injekciózzuk az A549 sejtekkel való beoltás utáni 11. és 16 napon. Ezeket az Ocostatin A dózisokat 30 1/2 G jelű tű használatával juttatjuk közvetlenül a tumorba. A tumor-méretet a jelzett napokon a tumor horizontális és vertikális kiterjedésének mérésével követjük. Az ordinátán jelzett tumor-méret a két kiterjedés szorzatát mutatja. Az eredmények az 1. ábrán láthatók.

Az 52 000 D polipeptid specifikus kibocsátása Ocostatin A-val kezelt humán tüdőrák sejtekből Az A 549 humán tüdőkarcinóma sejteket Oncostatin-A-val kezeljük (200 ng/ml tenyészet) és a sejttenyészet felülúszójába kibocsátott polipeptidekre gyakorolt hatását meghatározzuk. A kezelt és kezeletlen tenyészeteket (Oncostatin-A nélkül) pulzus-jelöljük S³⁵-metioninnal (5 μθί/ιη1 S. A - 800 Ci/mmol) a 0 időpontban [Oncostatin-A vagy csak tápközeg (kontroll) hozzáadása]. Tizenkét órával később a felülúszót eltávolítjuk és először alacsony sebességű (1500 g 15 percig) majd nagysebességű (30 000 g 1 óráig) centrifugálással tisztítjuk. A polipeptideket a tiszta felülúszóból trifluorecetsavval (TCA) kicsapjuk, majd nátrium-dodecilszulfát-poliakrilamid gélen elektroforetizáljuk 12,5% akrilamid lapgélt használva.

A gél radiográfiás vizsgálata kimutatta, hogy az Oncostatin-A-val kezelt A549 sejtekből S³⁵-tel kezelt 52 000 D molekulatömegű fehérje választódik ki, míg a kezeletlen ráksejtek minimális mennyiségű ilyen fehérjét választanak ki (legalább tízszeres növekedés figyelhető meg az Oncostatin-A kezelés után). Semmi más minőségi vagy mennyiségi különbség nem figyelhető meg a kezelt és kontroll tenyészetek között.

A pp60 src autofoszforilezésének stimulálása Oncostatin-A-val

A pp60 src-t az irodalomból ismert módon tisztítjuk immunaffinitás kromatográfiával [Erickson et-al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 76, 6260-6264 (1979)., Erickson et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioi. 44, 902-917 (1979)]. Öt mikroliter tisztított enzimet (körülbelül 0,47 pmól) inkubálunk 100 mg tisztított homogén Oncostatin-A-val 30 μΐ végső reakciótérfogatban, melynek összetétele 20 mM ATP, 5 mM MgCl₂,10 mM TRISZ-HC1 pH 7,2 30 percig 30 ’C-on. A reakciót 2 x minta-puffer hozzáadásával állítjuk le és ismert módon [Leammeli, U. K. Natúré, 227, 680-685 (1970)] SDS poliakrilamid gélelektroforézissel tisztítjuk. A lapgél autográfiás vizsgálata a pp60 src autofoszforilezés tízszeres stimulálását mutatja ki. A foszforilezódés növekedése nem korlátozódik a tirozin maradékokra, megtalálható az src enzim szerint helyzetében.

Az Oncostatin-A hatása a makrofág la antigén kifejeződésére

A Wehi-3 egy egér makrofág sejtvonal, melyet gamma interferonnal (γ-IFN) indukálhatunk a H2 Π osztályú antigének kifejlesztésére. Ennek az indukciónak a tulajdonságait számos laboratóriumban vizsgálták és kimutatták, hogy ez a normál makrofág indukció pontos másolata. Ezeket a sejteket alacsony koncentrációjú gamma-interferon jelenlétében vagy anélkül növesztették, különböző koncentrációjú vérlemezke Ocostatin A-val. A gamma-interferon jelenlétében vagy anélkül, az Ocostatin A dózisfüggő módon serkentette a II osztályú antigént, amit direkt immunofluoreszcenciás módszerrel FACS készülékben mértek.

Az Oncostatin-A hatásának mértéke az alkalmazott koncentrációknál (~ 2-70 ng/1) általában kétszeres volt.

Az Oncostatin-A-ra specifikus monoklonális és poliklonális antitestek előállítása

Az Oncostatin-A hozzákötése bakteriális lipopoliszacharidhoz

Az Oncostatin-A bakteriális lipopoliszacharidhoz kötésének eljárása a Primi és Cazenava [7. Immunoi,

HU 210 662 B

129 (3), 1124-1129 (3), 1124-1129 (1982)] által kifejlesztett módszer módosítása.

ng Oncostatin-A-t és 12,5 ng bakteriális lipopoliszacharidot (LPS; Sigma i=é L-263) desztillált vízzel 500 μΐ térfogatra hígítunk. Ötven μΐ 2,5%-os glutáraldehidet adunk hozzá PBS-ben, majd az elegyet 30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. A reakciót 50 μΐ két mólos glicin PBS-es oldatának hozzáadásával állítjuk le, majd az elegyet szobahőmérsékleten egy órán át inkubáljuk. Az Oncostatin-A: LPS konjugátuma 10 ml kevert limfocita kondicionált tápközeggel hígítottuk, majd szűréssel sterilezzük in vitro immunizálásra való felhasználás céljából.

Balb/C- Splenocyták in vitro immunizálása Oncostatin-A és LPS konjugátumával Nem-immun splenocytákat in vitro imunizálunk a

Reading [Immunoi. Meth., 53. 261-269 (1982)] által leírt módszer módosításával.

Kevert limfocita kondicionált (MLC) táptalajt készítünk olymódon, hogy azonos számú Balb/C és C 57 fekete egér timocitát tenyésztünk 2% nyúlszérumot tartalmazó DMEM-ben 4 x 10⁶ sejt/ml koncentrációban 48 órán át. A tápközeget összegyűjtjük és -20 °C-on tároljuk.

Peritonális váladék-sejteket (PEC) gyűjtünk, steril PBS-sel öblítve tioglukolláttal kezelt Balb/C egeret. A PEC sejteket együtt tenyésztjük 1 egérnek megfelelő splenocytával és 10 ml, 10 ng, Ocostatin A: LPS konjugátumot tartalmazó MLC közeggel. A sejteket 7 napig tenyésztjük.

Monoklonális antitestek előállítása

Az immun-splenocytákat összegyűjtjük és SP2/0 melanóma sejtekkel 1:1 arányban fuzionáltatjuk, így Oncostatin-A-ra specifikus hibridómákat állítunk elő. A hibridómák Oncostatin-A antitest termelését enzimmel kapcsolt immun assay-val (ELISA) vizsgáljuk. A pozitív hibridómákat határhígításos módszerrel kétszer klónozzuk. A kiónokat felnövesztjük, vizsgáljuk, hogy melyik immunoglobulin osztályba tartoznak, majd aszcitesz előállítása céljából Balb/C egerekbe injekciózzuk.

Először negyven pozitív hibridóma kiónt növesztettünk fel, és vizsgáltuk újra anti-Oncostatin-A aktivitását. A maradék klómokat felnövesztettük és lefagyasztottuk. Az aszcitesz specifitását vizsgáltuk Ocostatin A, egy Oncostatin-A peptid-KLH (keyhole limpetmhemocianin adjuváns) konjugátum és BSA ellen ELISAval. Az aszcitesz reagált mind Oncostatin-A-val mind pedig kisebb mértékben Oncostatin-A pepiiddel 13000-szeres hígításban. Az immunoglobulinokat kaprilsavas kicsapási módszerrel [Russo et al., Anal., Biochem, 65, 269-271 (1983)] tisztítjuk. Az immunoglobulinok paragon analízise és kettős-diffúziós Onchterlony analízise azt mutatta, hogy az összes immunoglobulin I gM típusú.

ELISA vizsgálat Oncostatin-A-ra

Az Oncostatin-A-t 0,1 mólos ecetsavval hígítjuk és 10 ng/luk mennyiséget pipettázunk 96 lukas Dynatech Immulon lemezbe. Az oldatot szobahőmérsékleten éjszakán át beszárítjuk. A lemezt blokkoljuk, a lukakat 1 órán át 37 °C-on inkubálva 2,5% BSA-t, 2,5% borjúmagzat szérumot (FCS) tartalmazó PBS-ben. A lemezt ezután kétszer mossuk, 2,5% FCS tartalmú PBS-ben. Ezután megfelelő hígításban hozzáadjuk a hibridóma tápközeget, immunoglobulint vagy antiszérumot. A lemezeket két órán át 37 °C-on inkubáljuk, utána háromszor mossuk 2,5% FCS-t tartalmazó PBS-sel. A vektor laboratóriumok avidin-biotin-HRP ELISA reagenseit használjuk a gyártók előírásai szerint. Minden egyes lépés között a lukakat 10 ml oldatonként 4 μΐ 30%-os hidrogén-peroxidot tartalmazó 0,1 mólos nátrium-citrát oldatban lévő 0,4 mg/ml orto-feniléndiamin hozzáadásával tesszük láthatóvá. A reakciót 30 percig hagyjuk lejátszódni szobahőmérsékleten. A reakciót lukanként 50 μΐ 1,4 normál kénsav hozzáadásával állítjuk le.

Poliklonális Anti-Oncostatin-A antiszérum előállítása

Balb/c egereket nitrocellulózon immobilizált Oncostatin-A-val immunizáljuk. Ennek az immunizálási eljárásnak az a célja, hogy elkerüljük a polipeptid gyors kitisztulását a gazdaszervezetből. Ilyen módon az immunizálást nagyon kis mennyiségű OncostatinA-val végezhetjük.

Az Oncostatin-A 0,1 mólos oldatát kicseppentjük kis nitrocellulóz darabkákra (Schleicher and Schnell, 0,45 pm) és hagyjuk megszáradni. A nitrocellulóz darabkákat három Balb/C egér peritonális üregébe helyezzük (0,375 ng/egér) a kezdeti immunizálás céljára. (Az egerek ezenkívül 0,1 ml komplett Ferud adjuváns injekciót kapnak intraperotinálisan). Az egerekben kéthetes intervallumokban kétszer megerősítjük a kezdeti hatást nitrocellulózon immobilizált Oncostatinnal. Megerősítés céljából a nitrocellulózt felaprítjuk, 0,1 ml vízzel és 0,1 ml inkomplett Freud adjuvánssal homogenizáljuk, majd bőr alá injekciózzuk (0,125 ng/egér). Az egér-széium specifitását Oncostatin-A-ra az előzőekben leírt ELISA vizsgáló módszerrel vizsgáljuk, a második lépés reagenseként protein-A-val konjugált torma-peroxidázt használva. A szérumokat Oncostatin-A peptid-KLH konjugátummal és blokkolt lemezzel szemben vizsgáljuk a specifitás kimutatására.

Oncostatin-A előállítása rekombináns DNS módszerrel:

A következő nukleotid-szekvenciát állítjuk elő a leíró részben említett módon, a foszfotriészter DNSszintézis módszenei:

Ncol

BaaHB

GG	TAC	CTT	CGA	CTT	CTT	CTG	CCT	CTA	GAC	GTC	ACG
CGC GCC	ATG	GAA	GCT	GAA	GAA	GAC	GGA	GAT	CTG	CAG	TGC
	met	glu	ala	glu	glu	asp	gly	asp	leu	gin	cys

NHf

HIJ 210 662 Β

Stul

GAC

ACG

CAT

TTT

TGA

AGA

GTC

CAT

TCC

GGA

GCA

GTG

CTG

TGC

GTA

AAA

ACT

TCT

CAG

GTA

AGG

CCT

CGT

CAC

-78

leu

cys

val

lys

thr

ser

gin

val

arg

pro

arg

his

Xhol

TAG

TGT

AGT

GAG

CTC

CAT

TAG

TTT

CGG

CCG

GGC

GTG

ACG

GGC

ATC

ACA

TCA

CTC

GAG

GTA

ATC

AAA

CCC

GGC

CCG

CAC

TGC

CCG

ile

thr

ser

leu

glu

val

ile

lys

ala

gly

pro

his

cys

pro

PVull

Nrul

TGA

CGA

GTC

GAC

TAG

CGC

TGA

GAC

TTT

TTG

CCA

GCA

TTC

ACT

GCT

CAG

CTG

ATC

GCG

ACT

CTG

AAA

AAC

GGT

CGT

AAG

-159

thr

ala

gkn

leu

ile

ala

thr

leu

lys

asn

gly

arg

lys

BgllIIXbal

PstI

TAG

ACA

GAT

CTG

GAC

GTC

CGA

GGC

GAC

ATG

TTT

TAG

ATC

TGT

CTA

GAC

CTG

CAG

GCT

CCG

CTG

TAC

AAA

ATC

ile

cys

leu

asp

leu

gin

ala

pro

leu

tyr

lys

ile

AflII

BamHl

TAG

TTT

GAC

CTT

AGA

ATT

CCT

AG

-223

ATC

AAA

CTG

GAA

TCT

TAA

G

ile

lys

leu

glu

ser~

COOH

Az alábbi reakciókat Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1982) útmutatása, valamint az enzimek gyártóinak előírása szerint végeztük:

A nukleotid-szekvenciát Escherichia coli-ban való alkalmazásra terveztük, és számos restrikciós enzim felismerési helyet terveztünk bele, hogy a kódoló szakaszt könnyen módosíthassuk. Egyszálú átfedő szakaszokat állítunk elő, anelláló közegben összekeverjük, majd ligáljuk, így egy olyan komplett gént kapnuk, mely megfelelő végekkel rendelkezik ahhoz, hogy leolvasási fázisában beépítsük egy expressziós vektorba, és így fúziós fehéqét kapunk, melyből az Ocostatin A izolálható. Az egyszálú szakaszokat az 5’ végen T4 polinukleotid kinázzal foszforilezzük, anelláljuk 200 pmólt téve mindegyik szegmentből egy 30 μΐ-es reakció-térfogatba (30 mM ATP, 10 mM DTT, 10 mM magnézium-klorid, 1 gg/ml spetmidin, 100 mM TRISZ-HC1 pH 7,8 és T4 polinukleotid-kináz. A dsDNS-t TlssHII enzimmel emésztjük, majd 7%os natív poliakrilamid gélen tisztítjuk.

A ptrp ED5-1 plazmidot [Hallewell and Entage, Gene, 9, 27 (1980); Tacon et al., Mól. Gén. Génét 177, 427 (1980)] Bss HU és BamHl restrikciós endonukleázokkal emésztünk, és egy lényegében teljes hosszúságú fragmentet, melyről hiányzik a trp D gén és csonkított trp E génnel rendelkezik, preparatív gélelektroforézissel izolálunk.

Az Oncostatin-A gént a linearizált ptrp ED5-1 plazmádba ligáljuk, így kapjuk a ptrp (Onc-A) plazmidot, és a ligáló eleggyel transzformáljuk az Escherichia coli HB 101 sejteket. Atranszformánsokat ampicillin rezisztencia alapján szelektáljuk és a plazmidokat restrikciós endonukleázos emésztés alapján analizáljuk. Atranszformánsokat 37 °C-on körülbelül 10⁸ sejt/ml sűrűségig növesztjük Luria táplevesen (LB) (10 g Bacto-tryptone, 5 g Bacto-yeast extraktum, 10 g NaCl/1, pH 7,5), ezután 3-indolil-ecetsavat (IAA) adunk hozzá és a növesztést további egy órán át folytatjuk. 1 ml-es alikvot részeket néhány másodpercig Eppendorf centrifugában centrifugálunk, az üledéket 500 μΐ, 5 mlg/ml brómciánt tartalmazó 7%-os hangyasavban szuszpendáljuk. 24 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, majd alikvot részeket tízszeresre hígítunk vízzel, és a hígított minták Oncostatin-A aktivitását vizsgáljuk. Mivel az Oncostatin-A-ban nincs belső metionin, a fúziós fehéqét N-terminális metioninnal hasítva a természetes Oncostatin-A-val azonos aminosav-sorrenddel rendelkező Oncostatin-A-t kapunk.

A fenti eredményekből nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti vegyület igen széles körben használható. A vegyület főleg a neoplasztikus állapotok diagnosztizálásában és kezelésében használható. A terápiában a vegyület a tumorsejtek növekedésének lehasításában használható, úgyhogy más kezelési módszerekkel együtt a tumorsejtek kiirtására használható. A diagnosztizálásban a találmány szerinti vegyület a p52 termelését indukálja, úgy hogy a találmány szerinti vegyületet betegnek beadva, a p52 megnövekedett szintje jelezheti tumorsejtek jelenlétét. Neoplasztikus állapot kezelésében nagyon fontos, hogy meg tudjuk határozni vajon a tumorsejtek eltávolítása sikeres volt-e vagy áttételek keletkeztek. A találmány szerinti vegyületek használhatók diagnosztikai vizsgálatokban, Oncostatin-A vagy Oncostatin-A receptorok jelenlétének eldöntésére.

Jóllehet a jelen találmányt az illusztrálás céljából bizonyos részletességgel ismertettük, hogy világos és érthető legyen, nyilvánvaló, hogy az igénypontok által meghatározott területen belül bizonyos változtatások, módosítások hajthatók végre.

Claims

1. Eljárás hatóanyagként az alábbi aminosavszekvenciájú

HU 210 662 B

Oncostatin-A-t tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az Oncostatin-A-t a gyógyszerkészítésnél szokásos hordozó- és adalékanyagokkal összekeverve szokásos dózisformájú sejt-, illetve tumorsejt-növekedést gátló készítménnyé alakítjuk.

2. Eljárás tumorsejtek jelenlétének kimutatására normálisan funkcionáló sejtek között, azzal jellemezve, hogy a sejteket az 1. igénypontban meghatározott szek10 venciájú Oncostatin-A-val hozzuk érintkezésbe, és inkubálás után a tumorsejtek által termelt 52 kD nagyságú protein jelenlétét kimutatjuk.