JPH0272896A - オンコスタチン―ａに対して特異的なモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の分野〕 本発明はオンコスタチンに対するモノクローナル抗体に
関する。

造血細胞の及びそれによる分化及び増殖の複雑さは、こ
れらの事象を調節する単離された因子のリストが連続的
に増加するに従って、次第に明らかになりつつある。は
とんどの場合、これらの因子は、広範囲の機能を有する
、多（の他の蛋白質と共に非常に微量に存在する。単離
されそして活性を有することが証明された因子は、γ−
インターフェロン、血小板由来増殖因子、コロニー刺激
因子、インターロイキン−２、エリスロボイエチンのご
ときポリペプチド及び蛋白質、並びに多数の他のリンホ
カインを包含する。これらの血液成分の単離、精製及び
特徴付けには実質的な興味が存在する。なぜなら、これ
らは癌のごとき疾患の治療及び説明に使用される可能性
があるからである。

天然に存在する因子の単離には多くの落とし穴が存在す
る。存在しそして類似の特性を有するであろう他の因子
から目的因子を分離する分離系が開発されなければなら
ない。第２に、存在する他の特質に対比して注目の物質
を特異的に又は実質１特異的に特徴付ける、種々の両分
を測定するための幾つかの手段が与えられなければなら
ない。

注目のポリペプチドが極端に高い活性を有する場合、目
的生成物を単離する困難さは非常に増強される。第３に
、注目の生成物に不都合な影響を与えない方法、特にす
べての変性を回避する方法を得なければならない。さら
に、組成物中には注目の物質に作用してそれを変化せし
める他の物質がしばしば存在し、その結果、最終的に得
られるなんらかの目的の活性を有する物質は天然に存在
する物質ではない。最後に、目的生成物を十分に純粋な
形で単離した後、例えばアミノ酸配列決定、グリコジル
化数、ジスルフィド橋、及びこれらに類する事項により
、そのポリペプチドを物理的に特徴付けることを試みな
ければならない。さらに、物質をその生理学的特性につ
いて特徴付けなければならない。

最後に、精製された化合物の単離の後でさえ、該化合物
の生理学的活性の特徴付けはしばしば捕えどころかない
ことが証明されよう。多くの状況においで、活性は１又
は複数の他の化合物の存在、狭い濃度範囲、特定の宿主
細胞、又はこれらに類するものに依存し得るので、化合
物の生理学的活性を見出しそしてその活性に影響を与え
る他のパラメーターを証明せるために、実質的直観的努
力及び延長された実験期間が必要とされる。

〔従来技術の記載〕

Ｈｏ１ｌｅｙ等、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃ
ｉ　ＵＳＡ（１９８０）１１　：５９８９−５９９２は
、上皮細胞増殖阻害物質を記載している。Ｎｅｌｓｏｎ
−ｔｌａｍｉｌｔｏｎ及びＨｏ１ｌｅｙ、前掲、（１９
８３）別：５６３６−５６４０は、アフリカミドリザル
細胞（ＢＳＣ−１）により分泌される蛋白質への放射性
標識されたメチオニンの導入における増殖阻害物質及び
上皮増殖因子の効果を記載している。Ｍｏｒｇａｎ等、
Ｔｈｒｏｍｂ。

ＨａｅｍｏｓＬ、　（１９８０）４２：１６５２−６０
はヒト血小板ファクター４のアミノ酸配列を与えている
。Ｄａｗｅｓ等、Ｔｈｒｏｉｂ、Ｒｅｓ、（１９８３）
　２９：５６９−８１　、及び５ｃｈｅｒｎ　ｔｈａｎ
ｅｒ等、　Ａｃｔａ　　Ｍｅｄ、八ｕｓｔｒｉａｃａ（
ｓｕｐｐｌ、）（１９７９）６　　：３７５−９は、血
小板ファクター４に対するポリクローナル抗体を報告し
ている。Ｌａｗｌｅｒ、　ＴｈｒｏＩＩｌｂ、Ｒｅｓ、
（１９８１）２１：１２１−７はβ−スロンボグロプリ
ンと血小板ファクター４の配列及び構造を比較している
。

（発明の概要〕 本発明は、次のアミノ酸配列： Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａ
ｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　ＣｙｓＬｅｕ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ
　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　
ＡｒｇＰｒｏ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅ
ｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　ｌ１ｅＬｙｓ　　Ａｌａ
　　Ｔｈｒ　　Ａｌａ　　Ｇｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ
　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　ＬｅｕＬｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌ
ｙ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ
　ＬｅｕＧｉｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｌ
ｙｓ　Ｌｙｓ　ｌｉｅ　Ｉｌｅ　ＬｙｓＬｙｓ　Ｌｅｕ
　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒを有する物質に対して特異的
なモノクローナル抗体に関するものである。

［具体的な態様の詳細な記載〕 哺乳動物新生物細胞増殖阻害を行う、ポリペプチド、誘
導体、断片、又はそれらの類似外を含んで成る組成物が
提供される。この発明のポリペプチドは血小板の抽出に
より得られるエタノール性ＨＣｆｆｉ画分中の天然ポリ
ペプチドに関し、このものは文献中で血小板ファクター
４と呼ばれ、そして以後オンコスタチン−Ａ　（Ｏｎｃ
ｏｓｔａｔｉｎ−Ａ）と称する。このポリペプチドは穏
和な温度（０〜２５°Ｃ）、低いｐＨ１一般に約ｐ）１
３以下、通常ｐＨ２において安定である。このポリペプ
チドは、約５．０００〜８，０００の範囲、−層正確に
は約６，０００〜７，５００の範囲、さらに特定すれば
約７，０００の分子量を有する。このポリペプチドは、
高等動物、特に霊長類、さらに特定すればヒトの血小板
から得られる。

使用されるポリペプチド化合物は約１５〜８ｏアミノ酸
を有し、天然ポリペプチド及びその模倣類似体は約６０
〜７５アミノ酸、さらに普通には約６５〜７２アミノ酸
を有し、他方断片は一般に約１５〜６ｏアミノ酸、さら
に普通には１５〜３５アミノ酸の範囲にあるであろう。

約６８〜７２アミノ酸、さらに特定すれば６９　、７０
又は７１アミノ酸を有するポリペプチドが特に興味深い
。これらのポリペプチドは、他の化合物、例えば抗原、
レセプター、標識等に結合することができる。

ポリペプチドは少なくとも１つの生物学的に活性な、例
えば免疫学的に又はエピトープとして活性な配列を有し
、そして１個より多くの生物学的に活性な配列を有し、
この場合このような配列が生物学的性質について天然生
成物と競争することができるであろう。

注目の組成物は酸性（陰イオン性）Ｎ−末端及び塩基性
（陽イオン性）Ｃ−末端を有し、荷電領域は６〜１５ア
ミノ酸、通常６〜１２アミノ酸であり、この領域は６〜
８アミノ酸のアミノ酸配列を含み、５０％以上の個数、
通常６０％以上の個数がイオン性アミノ酸であり、そし
て通常９０％以下の個数がイオン性アミノ酸である。イ
オン性アミノ酸は塩基性、Ｋ及びＲ：酸性、Ｄ及び巳で
ある。

約６０以上のアミノ酸を有する組成物は、２５個以上の
アミノ酸、通常４０個以上のアミノ酸、そして約７０個
より少なく、一般に約６５個より少ないアミノ酸により
隔てられた複数の荷電ドメインを有するであろう。荷電
ドメインを隔てるアミノ酸連結配列は、陰イオン性アミ
ノ酸を超える過剰の陽イオン性アミノ酸を有し、−ｉに
約１．５〜３、通常２〜１の比率を有し、化合物のρに
は約６．５〜８、の範囲、特に約７．４であろう。

前記連結配列中には２個のジスルフィド橋が存在し、こ
れら架橋ジスルフィドは約２０〜４５、通常２２〜４０
アミノ酸隔てられており、好ましくは約２５及び３９ア
ミノ酸により隔てられている。Ｎ−末端に近位の複数の
システィンはＮ−末端末から約８〜１６アミノ酸にあり
、Ｃ−末端に近位の複数のシスティンはＣ−末端から約
１２〜４５アミノ酸、通常１６〜４０アミノ酸にある。

注目の組成物は一般に、ペンタペプチドＥ−Ａ−ＥＥ−
Ｄ　、さらに一般にはデカペプチドＥ−へ−Ｅ−［４−
Ｄ−ＧＤ−Ｌ−Ｑ−Ｃ、ＬばしばベンタデカベプチトＥ
−Ａ−Ｅ−ＥＤ−Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｑ−Ｃ−Ｌ−Ｃ−Ｖ−に
−Ｔ　、そしてさらにしばしば次の式：　Ｅ−Ａ−Ｅ−
Ｅ−Ｄ−Ｃ−Ｄ−Ｌ−Ｑ−Ｃ−Ｌ−Ｃ−Ｖ−に−Ｔ−Ｔ
−３−Ｑ−Ｖ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｈ−の式を有するＮ−末端
に近位の配列を有するであろう。ここで、文字は常法に
従って次の意味を有する。

Ａ−アラニン　　　　　　Ｍ−メチオニンＣ−システィ
ン　　　　　Ｎ−アスパラギンＤ−アスパラギン酸　　
　Ｐ−プロリンピーグルタミン酸　　　　Ｑ−グルタミ
ンＦ−フェニルアラニン　　Ｒ−アルギニンＣ−グリシ
ン　　　　　　Ｓ−セリン ビーヒスチジン　　　　　Ｔ−スレオニン１、−イソロ
イシン　　　　■−バリンに一リジン　　　　　　　　
Ｗ−トリプトファンし一ロイシン　　　　　　Ｙ−チロ
シン注目の組成物は一般に、Ｃ−末端の近位において、
弐に−に４−１４−にの配列、さらに一般には弐に−に
−［−１−に−に−Ｌ−Ｌ　、そして好ましくはＰ−Ｌ
−Ｙ−に−Ｋ［−１−に−に−Ｌ−Ｌ−Ｅ−５の配列を
有するであろう。

アミノ酸の保存的置換（Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　５
ｕｂｓｔｉｔｕ−ｔｉｏｎｓ）を行うことができると理
解されるべきである。保存的変化にはＤ及びＥ；Ｆ及び
Ｙ；Ｋ及びＲ；Ｇ及びＡ；Ｎ及びＱｉＶ、■及びＲ１等
が関与する置換が含まれる。幾つかの場合には、非保存
的変化、例えばＫ又はＲとＮ又はＱとの置換が好ましい
であろう。この置換は、２−塩基性アミノ酸プロテアー
ゼ開裂部位、例えばに−Ｒが存在する場合に特に興味が
持たれ、この場合置換はプロテアーゼ開裂に対してこの
部位を保護する。

さらに、挿入又は除去を含めることができ、この場合通
常挿入又は除去には１〜２個のアミノ酸、特に１個のア
ミノ酸が関与するであろう。

注目の新規なポリペプチドは、はとんどの場合次の構造
式： ％式％ Ａｃ＋＋（酸性領域）はＮ−末端領域であり、そして１
０〜２０個のアミノ酸を有し、この内４〜５個が酸性ア
ミノ酸であって、最初の３アミノ酸の内生なくとも２個
が酸性アミノ酸であり、２個の酸性アミノ酸はタンデム
に配置されており、そして他の２個の酸性アミノ酸は中
性脂肪族アミノ酸により隔てられており；２個のｃｙｓ
残基が１個の中性脂肪族アミノ酸に隔てられて存在し；
このｃｙｓ−Ｘ−ｃｙｓが２〜６個のアミノ酸によりＤ
又はＥ−Ｘ−Ｄ又はＥから隔てられていることを特徴と
し； ＭＲは中間領域であり、２〜３０炭素原子の短連結椿で
あるか又は約２５〜４０個のアミノ酸を有し；少な（と
も１０個、一般に少なくとも２０個のアミノ酸によりＡ
ｃ＋＋のシスティンから隔てられた２個のシスティンを
有し、これらのシスティンのそれがＡｃ＋＋中のシステ
ィンの１つとジスルフィド橋を形成しており；５〜７個
の塩基性アミノ酸及び２〜５個、通常３〜４個の酸性ア
ミノ酸を有し：Ｂａ、ｌ　（塩基性領域）はＣ−末端領
域であって、１２〜３０個のアミノ酸を有し；２対の塩
基性アミノ酸を有し、それぞれが２〜３個の中性脂肪族
アミノ酸により引き継がれ、極性又は非−極性、通常は
非極性であり；Ｃ−末端アミノ酸からｌＯ〜１５アミノ
酸に１個のプロリンを有することにより特徴付けられる
。

好ましくは、Ａｃ、は次の式： ％式％ （Ｈ）はＮ−末端における水素を意図し；ａ　ａ　ｈ：
ｌは結合、又は炭素原子数２〜６個の脂肪族アミノ酸、
通常酸性アミノ酸もしくは２〜３個の炭素原子を有する
非極性アミノ酸であることができ； ａａ２は結合、又は炭素原子数２〜６個の脂肪族アミノ
酸、通常塩基性アミノ酸、炭素原子数３〜５個の極性ア
ミノ酸、又は炭素原子数２〜３個の非極性アミノ酸であ
り； Ｘｌは結合、又は炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数
４〜６個のアミノ酸１〜２個から成るアミノ酸配列であ
り、これは脂肪族非極性又は極性アミノ酸であり； ａａ６は炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数２〜４個
の非極性もしくは極性の脂肪族アミノ酸、又は酸性アミ
ノ酸であり； ａａ８は炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数５〜６個
の脂肪族アミノ酸であって、通常非極性であり； ａａ’は炭素原子数２〜６個、通常は炭素原子数４〜６
個の脂肪族アミノ酸であり、特に極性カルボキサミド置
換されており又は塩基性であり；）（ｚは結合、又は炭
素原子数２〜６個の脂肪族アミノ酸、特に中性アミノ酸
１〜２個からなるアミノ酸配列であり； ａ　ａ　ｌ　＋は炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数
３〜６個の脂肪族アミノ酸であって、これは非極性又は
極性であることができ； ａａ１３は２〜６個、通常５〜６個の炭素原子を有する
脂肪族アミノ酸であって、特に非極性であり；ｘ３は結
合、ヒドロキシ、炭素原子数１〜３個のアルコキシ基、
アミノ、又は１〜６、通常１〜３アミノ酸のアミノ酸配
列であって、通常は中性脂肪族で非極性又は極性のいず
れか、特に極性であり、最初の３個のアミノ酸は一般に
中性であり、ここでＸ３は分子の末端であることができ
、又はＭえ　、Ｂａ□もしくは抗原に連結することがで
きる。

前記の記号のための好ましいアミノ酸は次の通りである
。

ａａ’　−結合、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ａ ａａ”−結合、Ｇ、Ａ、に、Ｒ，Ｓ、ＴＸｌ−結合、（
Ｓ又はＴ）、−（Ｖ、Ｌ又はＩ）。

ａは０又は１ ａａ６−３．Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ ａａ”−Ｖ、Ｌ、Ｉ ａａ９−Ｎ、Ｑ、に、Ｒ Ｘ”　−（Ｇ又はＡ）、　−（Ｄ又はＥ）、　−（Ｖ。

Ｌ又はＩ）１ ａａ”　−Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ ａａ”−Ｖ　、　Ｌ　、　ｌ Ｘ３−結合−（Ｓ又はＴ）ｂ−（Ｇ、Ａ、Ｎ又はＱ）、
　−（Ｖ　、　ｌ、又はＬ）、−（Ｋ。

Ｒ，Ｎ、Ｑ、Ｈ，Ｆ又はＹ）１ ｂはＯ〜３の整数。

好ましくはＢａＲは次の式： ４０４宜４ｚＧＳａｓＫ４７Ｇ−に−に−ａａｓ＋ａａ
　　　−ａａ　　　−ａａ　　　−−−ａａ　　　−−
ａａ　　　−ＡＴ　　　　　　　ＲＡｌ？ｌ？ ｃ−ａａＳｆｆ−Ｄ　へａａｚａ−ａａ５６−ａａ５７
−Ｐ−ａａＳ９−ａａ６０−Ｋ　　　Ｋ　　　　６ゴＥ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
ＲＲ６４ｈａＩＩＫ−に−ａａ６？−ａａ６Ｂ−Ｘ４ａ
ａ　　−ａａ　　−ＲＲ を有し、ここで、 ａ　ａ　４０°５６は炭素原子数４〜５個の脂肪族酸性
アミノ酸又はそのアミドであり； ａａ′１・４Ｚ＋ＳＩ・Ｓ：ｌ＋６３・６４°６７は炭
素原子数２〜６個、さらに特定すれば炭素原子数５〜６
個の脂肪族アミノ酸であって特に非極性であり； ａａ”は炭素原子数２〜６個の脂肪族アミノ酸、特に炭
素原子数４〜６個の非極性アミノ酸、又は塩基性アミノ
酸であり； ａａ”は炭素原子数３〜５個の脂肪族アミノ酸、特にヒ
ドロキシもしくはアミド置換基を有する極性アミノ酸、
又は酸性アミノ酸であり；ａ　ａ　５　Ｓは炭素原子数
２〜６個の中性脂肪族アミノ酸、特に炭素原子数４〜６
個の非極性の又はカルボキサミド官能を存する炭素原子
数４〜５個の極性アミノ酸； ａａ５７は炭素原子数２〜６個の脂肪族アミノ酸、特に
炭素原子数２〜３個の非極性アミノ酸、又は塩基性アミ
ノ酸であり； ａ　ａ　５　ｑは炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数
４〜６個の脂肪族アミノ酸、通常非極性の、又は塩基性
のアミノ酸であり； ａ　ａ　６　Ｇは脂肪族又は芳香族アミノ酸、特に脂肪
族であれば炭素原子数４〜６個のアミノ酸であり；８８
６４ｍは結合、又は炭素原子数４〜５個の脂肪族極性ア
ミノ酸、特にカルボキサミド置換されたアミノ酸であり
； ａ　ａ　６１１は炭素原子数２〜６個の脂肪族アミノ酸
、特に非極性アミノ酸であり； Ｘ′はヒドロキシ、炭素原子数１〜３個のアルコキシ、
アミノ、又は１〜４個の、通常１〜２個のアミノ酸のア
ミノ酸配列であり、このアミノ酸は特に脂肪族アミノ酸
、さらに特定すれば極性及び酸性のアミノ酸であり、前
記配列は２〜３個の炭素原子を有する０〜１個の非極性
アミノ酸、０〜３個の酸性アミノ酸及び０〜３個のヒド
ロキシ置換脂肪族アミノ酸を有し、ここでｘ４は分子の
末端に位置し又は抗原もしくは免疫グロブリンへの連結
である。

記号が次の定義を有する場合特に興味深い。

ａａ４０””　−Ｄ　、　Ｅ　、　Ｎ　、　Ｑａ　ａ　
４１　＋　４２　＋　Ｓ　Ｉ°５１，６３°６４°６ｆ
ｆ−ｖ、Ｌ又はＩａａ”−Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ ａａ”＝Ｎ　、　Ｏ、Ｐ　、　Ｌ　、　Ｉ　、　Ｖ　；
特にＰ又はＬ ａ　ａ　４５°”−Ｖ、Ｌ、Ｉ、に、Ｒａａ”−Ｖ、Ｌ
、Ｉ、Ｆ、Ｈ，Ｙ ａａ６４１−結合、Ｎ又はＱ ａａ”−Ｃ，、Ａ、Ｐ、Ｌ、［Ｖ Ｘ’　−（Ｇ、Ａ、Ｄ又はＥ）、　−（Ｓ　、　Ｔ、　
Ｄ。

Ａ、Ｇ又はＥ）、　−（Ｄ又はＥ）ｃ （Ｔ又は５）１ ＣはＯ〜２゜ （同じ部位に２個のアミノ酸が示されている場合、その
位置にいずれのアミノ酸が存在していてもよい。） 好ましくは、Ｍｒは次の弐： ｐ−Ｋ　−ａａｚｓ−ａａｚａ−ａａｚｓ−８２７Ｄ　
　　ｚｑ　　＋ｌＯｆｆ−ａａ　　　−−ａａ　　　−
ａａ　　　−ａａ１？　　　　　　　　　　　　　Ｔ　
　　　　　Ｅに含まれる少なくとも１５個のアミノ酸の
配列を含み、 ここで、 ａ　ａ　２　：ｌは芳香族アミノ酸、又は炭素原子数３
〜５個の脂肪族極性アミノ酸、特にアミド置換アミノ酸
であり； ａ　ａ　ｔ　４は炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数
５又は６個の脂肪族非極性アミノ酸であり；ａ　ａ　Ｚ
　Ｓは炭素原子数３〜５個の脂肪族極性アミノ酸、特に
アミド又はヒドロキシ置換アミノ酸であり； ａａ２’Ｌ＋２９・３０は炭素原子数５〜６個の脂肪族
非極性アミノ酸であり； ａａ３′は炭素原子数２〜６個の脂肪族アミノ酸であっ
て、炭素原子数２〜３個の非極性アミノ酸であるか又は
塩基性アミノ酸のいずれかであり；ａ　ａ　３　Ｚは炭
素原子数２〜６個の脂肪族アミノ酸であって、炭素原子
数２〜３個の非極性アミノ酸か又は塩基性アミノ酸のい
ずれかであり；ａ　ａ　３４は炭素原子数２〜６個、通
常炭素原子数３〜５個の脂肪族アミノ酸であり、これは
非極性又は極性であり、特にヒドロキシ置換されており
；ａ　ａ　３ｇは炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数
３〜５個の脂肪族アミノ酸であって、これは非極性又は
極性であり、４．？にプロリン又はカルボキサミド置換
されており； ａ　ａ　：＋　Ｉ＋は炭素原子数３〜５個の脂肪族極性
アミノ酸であって、通常アミド又はヒドロキシ置換され
ており； ａａ３９は炭素原子数２〜６個の脂肪族非極性アミノ酸
であり； ａ　ａ　４　Ｇの炭素原子数４〜５個の脂肪族酸性アミ
ノ酸又はそのアミドであり； Ｘ５は結合、ヒドロキシ、炭素原子数１〜３個のアルコ
キシであり、ここでＸ５は配列の末端に位置し、ＢａＲ
にもしくは抗原への連結である。

記号のための次の定義が特に興味深い。

ａａ”−Ｆ、Ｈ，Ｙ、Ｎ、Ｑ ａａＺ４＋　Ｚ’？＋　２９＋　ゴ’−Ｖ、Ｌ、１ａａ
”””　−３、Ｔ　、　Ｎ　、　Ｑａａ”””　−Ｇ　
、　Ａ　、　Ｋ　、　Ｒａａ”−Ｐ　、　Ｓ　、　Ｔ ａａ”−Ｐ　、　Ｎ　、　Ｑ ａａ”−３，Ｔ、Ｎ、Ｑ ａａ”−Ｇ、Ａ、Ｐ、Ｖ、Ｌ、夏 ａａ”−Ｄ　、　Ｅ　、　Ｎ　、　Ｑ アミノ酸は次のように分類される。

湛」１１Ｇ　、　Ａ　、　Ｐ　、　Ｖ　、　Ｌ　、　　
１極二」生　　　　Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｃ，Ｎ、Ｑ酸ヨＪ１．
−　　　　　Ｄ、Ｅ 塩基１　　　　Ｋ、Ｒ 男１Ｌ疾　　　　　　Ｆ　、　Ｈ、Ｙ、　Ｗ上記の式か
ら明らかなように、生理学的活性に存意な影響を与える
ことなく上記の配列中に種々の保存的置換を行うことが
できる。さらに、１〜２個のアミノ酸の除去及び挿入を
用いることができる。通常、５個以下、通常３個以下の
変化（置換除去又は挿入）が上記の配列中で行われるで
あろう。

この発明において使用するために特に興味あるのは次の
配列： Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａ
ｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　ＬｅｕＣｙｓ　　Ｖａ
ｌ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌ
ｎ　　Ｖａｌ　　Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　　ＡｒｇＨｉｓ　
ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｉ
ｌｅ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ＧｌｙＰｒｏ　１ｌｉｓ　Ｃｙ
ｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ
　Ａｌａ　ＴｈｒＬｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　　Ｇｌ
ｙ　　Ａｒｇ　　Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　　Ｃｙｓ　　Ｌｅ
ｕ　　Ａｓｐ　　ＬｅｕＪｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ
　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＩＩｅＩｌｅ　Ｌｙｓ　Ｌ
ｙｓＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ を有する化合物又はその類似体、特に、およそそれらの
該当する位置に４個のシスティン、及びＣ−末端又はそ
の近位に１２個のアミノ酸、特にＣ末端に近位に１０個
のアミノ酸、そしてさらに特定すればＣ−末端に近位に
８個のアミノ酸（４個の塩基性及び４個の中性脂肪族ア
ミノ酸を含む）を含有する類似体又は断片である。上記
の組成物の類似体は通常約８０％以上、さらに普通には
約８５％以上、そして好ましくは約９０％以上の、上記
配列又は上記配列の部分中と同じアミノ酸を有する。

この発明において使用される天然ポリペプチド組成物は
、鋭敏なバイオアッセイにより確立されるように、高純
度で得ることができる。天然ポリペプチド組成物は、約
２０重量％未満、さらに普通には約１０重量％未満、そ
して好ましくは約５重■％未満の、該組成物中に存在す
る主成分以外のポリペプチドを含むであろう。この汚染
ポリペプチドは血小板と関連する。

この発明のポリペプチド組成物は種々の生理学的活性を
有する。この発明の組成物はイン−ビトロ及びインービ
ボにおいて腫瘍の増殖を阻害するために使用することが
できる。この組成物はまた、ｐｐ６０ｓｒｃのオートホ
スホリレーションを刺激するために使用することができ
る。従って、この組成物はｐｐ６０ｓｒｃ酵素の基質と
して機能することができ、そしてポリペプチドのチロシ
ン位置（残基６０）においてリン酸化され得る。さらに
、オンコスタチン−Ａにより処理された場合、腫瘍細胞
は５２ｋＤ蛋白質を放出するように誘導され得る。さら
に、オンコスタチン−Ａ又は類似体、それらの断片、又
は競争的免疫学的性質を有するサブ−配列（断片）を含
をする融合蛋白質は、モノクローナル抗体の製造のため
に使用され得、あるいは、オンコスタチン−Ａもしぐは
免疫学的に競争的な化合物又はオンコスタチン−Ａのた
めの細胞表面レセプターの存在を検出するだめの診断測
定における試薬として機能し得る。

この発明の化合物は、腫瘍阻害のために高い活性を有す
る。この組成物はエラニー１？ト旦及び不／−ビボにお
いて、新生物細胞の増殖速度を低下せしめるために使用
することができる。このポリペプチド組成物は、ｌｎｇ
レベルにおいて約２０％以上の、腫瘍細胞増殖の、特に
、肺、乳房、皮膚等の癌及び肉腫の阻害をもたらすこと
ができる。好ましくは、このポリペプチド組成物は、実
験の部に記載されているコロニー阻害試験に従えば、約
４０％以上、そしてさらに好ましくは約５０％以上の腫
瘍細胞増殖の阻害をもたらすであろう。

この発明の組成物は、新形成（ｎｅｏｐｌａｓ　ｉａ）
を有することが疑われる宿主に投与されることにより、
インービボにおいて使用され得る。この組成物は、増殖
の速度を低下せしめるため新生物部位、例えば黒色腫に
適用され得る。適用の方法は、ＩＩ！Ｉ瘍の部位、この
組成物の剤形、投与量レヘル等に依存して、注射、カテ
ーテルにより導入、直接適用等を包含する。投与量は、
それが全身的か局所的かに依存して変化し、投与量濃度
は一般に約０．１ｎ〜１０００ｎ／ｋｇであり、そして
霊長類を含む大形咄乳動物のための全投与量は、治療投
与当り約０．０１〜１０■である。

オンコスタチン−Ａ及びその同類物を包含するオンコス
タチン−Ａ様物質（同類物とは、オンコスタチン−Ａの
少なくとも１つの生理学的性質を有し、そしてオンコス
タチン−Ａのアミノ酸配列と実質的に同じ少なくとも１
つのアミノ酸配列を含有する化合物であり、ここで同類
物はオンコスタチン−Ａより多くの又は少ない数のアミ
ノ酸を有する）は、生理学的に許容される担体、例えば
リン酸緩衝化塩溶液、蒸留水、賦形剤又はこれらに類す
るもの中に製剤化することができ、又はそのまま使用す
ることができる。

オンコスタチン−Ａ及びその同類物は、新生物細胞の存
在を検出するために間接的に使用することができる。細
胞が約１〜５００ｎｇ／ｄ活性剤、好ましくは約５０〜
３５０ｎｇ／ｍｌｌの活性剤の濃度にかけられる場合、
その新生物細胞によって５２ｋＤ蛋白質（ｐ　５２）が
分泌される。従って、外部媒体、例えば栄養培地、血液
、尿、又は他の生理学的液体へのｐ５２の分泌を検出す
ることによって新生物細胞の存在を検出することができ
る。従ってオンコスタチン−Ａは宿主の状態及び新生物
状態の存在を監視するために使用され得る。オンコスタ
チン−Ａは、監視手術における腫瘍の存非、新生物のレ
ヘル等を診断するために使用され得る。オンコスタチン
−Ａはｐ５２の分泌の誘導をもたらすために十分な量に
おいて、イン−ビトロ又はインービボにおいて（培地又
は宿主に）投与されるであろう。

次に、系に関連する液が、新生物細胞の存在の指標とし
てｐ５２の存在について監視されるであろう。

オンコスタチン−Ａ様物質はまた、それ自体により、し
かし好ましくは他のリンホカイン、例えばインターフェ
ロン、さらに特定すればγ−インターフェロンと組み合
わせて免疫系を刺激するために使用され得る。すなわち
、オンコスタチンＡ様物質は他のポリペプチドと配合さ
れ、そして免疫系を刺激するために免疫抑制された宿主
に投与され得る。γ−インターフェロンは、単球及びマ
クロファージ、並びに他の組織、例えば内皮及び線維芽
細胞において、！８の発現を誘導することが知られてい
る。オンコスタチン−Ａ様物質は１、発現を誘導しそし
てγ−インターフェロン１１誘導を刺激してＴ−インタ
ーフェロンの所与の投与量効果を増強する。オンコスタ
チン−Ａ様物質の計は一般に媒体中に約１〜２００、好
ましくは約２〜７０ｎｇ／ｍ１の範囲の濃度をもたらす
ように使用される。Ｔ−インターフェロンの足はその使
用について、リンホカインが一般に約０．５〜２００　
ｎｇ／ｍρの範囲であるように、常法通りであろう。約
１．５倍以上、通常約２倍以上の発現の増強がオンコス
タチン−Ａ様物質により、それがそれ自体として又は他
のリンホカインと組合わせて使用された場合に、達成さ
れる。前記のように投与が行われ得る。

オンコスタチン−Ａ様物質はまた、キナーゼ、特にｐｐ
６０ｓｒｃと組合わせて、該酵素の基質特異性を変える
ために使用することができる。特に、該酵素を少量のオ
ンコスタチン−Ａ様物質と、特に約０．０５〜５０　ｎ
　／　ｍｌの濃度において接触せしめることにより、キ
ナーゼ活性が増強され、これにはリン酸化される観察さ
れるアミノ酸の変化が含まれ、特に千ロジンがリン酸化
されるほかにセリンもリン酸化される。こうして、ｐｐ
６０ｓｒｃ又は類似のキナーゼとの組合わせが、チロシ
ン及びセリンの両者の増強された比率でのリン酸化をも
たらすことにより、チロシン及びセリンアミノ酸を有す
るポリペプチドを修飾するために使用され得る。

この発明のオンコスタチン−Ａ様物質はまた、ハプテン
又は抗原として、例えば免疫原性相乗剤、例えば抗粒子
又はこれらに類するものと連結されたハプテンとして、
モノクローナル抗体又はポリクローナル血清の製造のた
めに使用され得る。これらの抗体は広範囲に、特に診断
目的に使用することができる。該抗体はそれ自体により
、又はオンコスタチン−Ａ様物質として、オンコスタチ
ン−Ａ、及びオンコスタチン−Ａに対する抗体を包含す
るオンコスタチン−Ａレセプターの検出のための試薬と
して使用することができる。

注目の分析対象を決定するために種々の処方及び技法を
用いることができる。これらの技法は、酵素、放射性核
種、螢光剤、化学発光剤、酵素基質、酵素阻害剤、粒子
、及びこれらに類するものを含む種々の標識を用いる。

これらの方法は分離段階を含む（不均一）か又は分離段
階を含まない（均一）ことができる。標識はオンコスタ
チンＡ様物質又はオンコスタチン−Ａ様物質に対する抗
体（抗−オンコスタチン−Ａ）に共有結合されるか、又
は抗−オンコスタチン−Ａ、例えば抗−オンコスタチン
−ＡのＦｃに向けられた抗体に接合される。全体抗原、
又はＦａｂ　、　　Ｐ（ａｂ）’ｚ′、Ｆｖ、もしくは
これらに類するものを包含するその断片を使用すること
ができる。この発明において使用され得る種々の診断技
法を記載する多数の米国特許が発行されている。これら
の特許の少数の例は米国特許Ｎα３，７６６、１６２、
Ｎα３，７９１，９３２、Ｎα３．８１７，８３７、Ｎ
ｏ、　３．９９６，３４５、及びＮｏ、　４，２３３，
４０２である。特定のタイプの測定法にはＲＩＡ、　Ｅ
ｌ＾。

ＥＭＩＴＯＥＬＩＳＡ、　５ＬＦＩＡ、　ＦＩＡが包含
され、これらのすべては商業的に適用されており、そし
てそのための試薬が他の分析対象のために人手可能であ
る。キットにおいて種々の試薬を用いることができ、こ
の場合、測定の感度を最適化するように試薬の種類及び
それらの相対量が選択される。

抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル血清の
調製に依存して常法において調製することができる。各
場合において、適当な宿主に注目の１又は複数のエピト
ープ部位を有する免疫原が注射され、通常はこれに続い
てｌ又は複数の追加免疫注射が行われるであろう。ポリ
クローナル抗血清のためには宿主が採血され、そしてグ
ロブリン画分が単離される。この免疫グロブリン画分は
アフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製す
ることができる。モノクローナル抗体のためには、宿主
が前記のように免疫感作されるが、しかしこの場合には
通常肺臓が摘出され、そして適切な融合パートナ−と融
合せしめられるであろう。所望の抗体を発現するハイブ
リドーマの選択の後、このハイブリドーマを限界稀釈に
かけ、そして次に選択及びクローニングを行い、そして
さらに特徴付ける。

この発明の抗体は、天然に存在する任意のタイプ、例え
ばＩｇ八、　ＩｇＤ、　ＩｇＥ、　工ｇＧ及び［ｇ門、
特にＩｇＭ　、そしてＩｇＧの種々のサブタイプ、すな
わちＩｇＧ１，２．３又は４であることができる。

生ずるモノクローナル抗体は、オンコスタチンＡタイプ
の物質にコンホーメーションの類似性を有するであろう
抗−イデオタイプ抗体の製造のための免疫原として使用
され得る。次にこれらは、種々の用途において、オンコ
スタチン−Ａタイプの物質のための代替試薬として使用
され得る。

オンコスタチン−Ａは、約０．３Ｍエタノール性塩酸に
よる血小板の抽出により得ることができる。

分解に対する阻害剤として、フェニルメチルスルホニル
フルオリド及びアプロチニンも導入することができ、前
者は抽出組成物の約１〜ｌＯ重星％のレベルにおいて、
そして後者は抽出組成物の約０、１−Ｉ　　ＴＩＵ／■
（Ｔｌｌｌ・・・１−リブシン阻害ユニッ（−）のレベ
ルにおいて導入される。水性水酸化アンモニウムを用い
てｐ＋＋を約５に上げた後、小量の酢酸アンモニウムを
加え、そして遠心分離又は他の便利な手段により溶液を
清澄にする。

次に、冷エタノール（９５％）及びエーテルを吹成に用
いて蛋白質を沈澱せしめ、該沈澱を集め、そして約３．
ＯＯＯＭｒ以下のカットオフを有する透析膜を用いて０
．１〜０．５Ｍ酢酸に対して透析する。

残渣を凍結乾燥し、１Ｍ酢酸中に再懸濁し、清澄にし、
そして次にバイオゲルＰ−１０を用いるゲル透過クロマ
トグラフィーによりさらに精製するために用意する。生
成物を約ＩＭの酢酸により溶出しそして抽挿の両分を適
当な測定技法、例えば腫瘍増殖阻害を用いて監視する。

増殖阻害活性を有する両分を凍結乾燥し、トリフルオロ
酢酸希水？８液（ｐＨ２〜３）に再懸濁し、清澄にし、
そして次に高圧液体クロマトグラフ上でクロマトグラフ
処理し、この場合シリカ充填物は約１６〜２０個の炭素
原子、例えば１８個の炭素原子の長脂肪族鎖の被膜を有
する。カラムは希トリフルオロ酢酸（０，０２〜０．１
％）で平衡化し、そして生成物は、希（０，０１〜０．
１％、通常約０．０４〜０．０５％）トリフルオロ酢酸
中６０％アセトニトリルまでのアセトニトリルグラジエ
ントにより溶出する。

比較的ゆるやかな流速、一般に周囲温度において約０．
５〜ｌｄ／分が用いられる。両分は前記のパイオアンセ
イ又は他のバイオアッセイにより測定することができる
。さらに精製するため、カラムから得られた生成物は高
圧ゲル排除クロマトグラフィーを用いて精製することが
できる。

ツバパック（Ｎｏｖａｐａｋ）　　Ｃ＋ａ逆相液体クロ
マトグラフィーにより分離されたオンコスタチン−Ａ活
性の主ピークを凍結乾燥し、そしてＯ，１％トリフルオ
ロ酢酸を含有する４０％アセトニトリル１００μｌ中に
再Ｑｉする。サンプルをヒドロキシル化ポリエーテルゲ
ルカラム（ビオラＦＴＳＫ−２５０）中に注入し、そし
て０．１％トリフルオロ酢酸中に４０％アセトニトリル
を含有する移動相により溶出する。各両分のアリコート
を凍結乾燥し、そしてオンコスタチン−Ａ活性について
試験する。腫瘍細胞阻害活性が主ペプチドピーク（１１
，−０，９）と共に同時？容出し、これはまた、このク
ロマトグラフ系に目安を付するために使用された６、Ｏ
ＯＯＭｒインシュリンマーカーのそれに分子量において
対応する。

カラムから得られた生成物をＳＯ５−ＰＡＧＥを用いて
電気泳動することができる。約６，０００〜８．０００
の分子量におけるハンドを単離する。このノ＼ンドは、
咄乳類新生物細胞に対する強い増殖阻害活性を有するこ
とが示される。

天然源からのオンコスタチン−Ａの単離又は固体単体上
での該ポリペプチドもしくはその類似物の合成の代りに
、オンコスタチン−ＡはバイブリドＤＮＡ技法により調
製することができる。オンコスタチン−Ａの構造遺伝子
は、アミノ酸配列に基いて調製されたプローブを用いて
宿主細胞ゲノムから得ることができる。このプローブ（
適切に冗長であろう）を用いてゲノムライブラリーを調
査し、ハイブリダイズする断片を単離し、そして該断片
のサイズを小さくし、そして制限地図の作製及び配列決
定により特徴付ける。

他の方法として、同様にしてゲノムライブラリことがで
き、後者は欠失したコドンを補充するためのアダプター
を用いることによって使用する。

便利には、合成遺伝子を合成することができる。

合成遺伝子を用いることにより実質的な柔軟性が達成さ
れ、宿主に好ましいコドンを用いそしてユニーク又はま
れな制限部位を導入することができる。制限部位は、欠
失、トランジション、トランスバージョン、挿入等を導
入して遺伝子の種々の部分を変形する場合に一定の程度
の柔軟性を加える。ヘテロデュプレックス形成を妨害し
ないでハイブリダイジエーション連結媒体中に混合する
ことができる単鎖オーバーラツプ断片を用いるストラテ
ジーを工夫する。次に、生じた２本鎖遺伝子をクローン
化しそして精製することができる。例示的配列を実験の
部に示す。

好ましくは、挿入に際して適切な方向を保証するために
遺伝子の末端は異る。この遺伝子は発現のために適切な
発現ベクターに挿入することができる。原核生物及び真
核生物、例えば菌類、例えば酵母、哺乳動物細胞、例え
ばマウス細胞、霊長類細胞等における発現のために多数
のヘクターが使用可能である。複製系はプラスミド、ウ
ィルス又は染色体に由来することができる。代表的な復
製系はＣｏ１Ｅｌ　、ラムダ、Ｒ３ＦＩＯＩＯ，２Ｍプ
ラスミド、ＳＶ４０、アデノウィルス、ウシ乳頭腫ウィ
ルス等を包含する。

エピゾーム性維持が望ましい場合（Ｍｉみ込みが必要な
場合には複製系は必要でない）には少なくとも１つの複
製系のほかに、目的遺伝子を含有する宿主の選択を可能
にするマーカーが通常存在するであろう。このマーカー
は通常殺生物耐性をもたらし、例えば抗生物質もしくは
重金属、又は補完、栄養要求宿主への原栄養性をもたら
すであろつ。

構造遺伝子は、通常、ポリリンカー（多数の制限部位を
有する配列）への挿入により、発現宿主により認識され
る転写及び翻訳開始及び終止制御領域間に位置するであ
ろう。転写開始領域の適切な選択により、転写は構成的
であり又は誘導的である。多数のプロモーター領域、例
えば巳、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ｔ　ｒ　Ｐ及びｌａｃ
プロモーター、ラムダＰＬ及びＰ、プロモーター、酵母
解糖系酵素プロモーター、ＳＶ４０及びアデノウィルス
初期及び後期プロモーター、並びにこれらに類するもの
が単離され、そして有用であることが示されている。

さらに、分泌リーダー及びプロセシングシグナルをコー
ドする５′−配列を構造遺伝子に与えることにより融合
遺伝子を調製することができる。

記載されている代表面な分泌リーダーには、ペニシリナ
ーゼの分泌リーダー、α−ファクター、免疫グロブリン
、Ｔ−細胞レセプター、外層膜蛋白質、及びこれらに類
似するものが包含される。適切なリーディングフレーム
への融合により、成熟オンコスタチン−Ａ又は類似物が
培地中に分泌され得る。

構造遺伝子及び発現の制御をもたらすフランキング領域
を含有する造成物を、便利な手段、例えば、リン酸カル
シウム沈澱したＤＮＡを用いるトランスフォーメーショ
ン、トランスフェクション、トランスダクション、接合
、マイクロインジヱクション等により、発現宿主に導入
することができる。次に、宿主を適切な栄養培地中で高
密度に増殖せしめることができる。プロモーターが誘導
性である場合、許容状態、例えば温度変化、代謝生成物
もしくは栄養の枯渇もしくは過剰、又はこれらに類する
ものを用いることができる。

生成物が宿主中に保持される場合、細胞を収得し、溶解
し、そして抽出、沈澱、クロマトグラフィー、電気泳動
等により生成物を単離しそして精製する。生成物が分泌
される場合、栄養培地を集め、そして常法、例えばアフ
ィニティークロマトグラフィーにより生成物を単離する
ことができる。

構造遺伝子配列は、発現のために使用されるほか、デュ
プレックスする配列のハイブリダイゼーション及び検出
のためのプローブとして使用することができる。例えば
、宿主細胞中のｍＲＮＡの存在及び量を検出することが
できる。

次の例は限定的にではなく例示的に与えられる。

実−一一狡 略号：　ＤＭＥＭ・・・ドゥルベコの改良イーグル培地
；ＰＳＢ・・・リン酸緩衝化塩溶液、Ｐ／Ｓ・・・ペニ
シリン／ストレプトマイシン（各０．５７ｍｇ／＋１）
　　；　Ｆ　Ｃ３・・・ウシ胎児血清、　　５Ｏ５−Ｐ
ＡＧＥ・・・ドデシル硫酸すトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動。

オンコスタチン−への精製 ヒト−ハ　か゛の　−エ　ノール　１１新詳な、又は凍
結され室温で解凍された血小板（湿重量５０ｇ）を２倍
容星の：　　３１５ｍ１エタノール（９５％）、７．５
ｍｆ濃ＨＣｆｆ、３３ｍ！フェニルメチルスルボニルフ
ルオリド及び１　ｍｌｌのアプロチニン（２３ＴＩＵ／
ｄ　、ウシ肺由来・・・シグマケミカル社Ａ６０１２）
に再懸濁した。この混合物を４°Ｃにて一夜攪拌し、ベ
ックマンタイプ１９０−ター中で３　ｋｒｐｍにて３０
分間遠心分離し、そして上清を取り出した。

この上清のｐＨを濃水酸化アンモニウムにより４．０に
調整し、そしてこのｐＨをｌ：１０稀釈の濃水酸化アン
モニウムを用いて５．２に上げた。０．１ｒの上清当り
ｌ　ｍｌの２Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５，２）を加え
た後、この溶液をタイプ１９０−ター中で８ｋｒｐｍに
て３０分間遠心分離した。上清を除去し、２倍容量の冷
９５％エタノールを加え、次に４倍容量の冷ジエチルエ
ーテルを加え、そしてこの混合物を０°Ｃにて一夜放置
した。タイプ１９０−ター中で３　ｋｒｐｍにて３０分
間遠心分離することにより沈澱を集め、そしてペレット
を約ｌＯ〜２０戚の１Ｍ酢酸に懸濁した。酢酸分散体を
、スペクトラボール（Ｓｐｅｃ　ｔｒａｐｏｒ）透析膜
（＃３）チューブ（カットオフ３，５００Ｍｒ）　（ア
マ−ジャム・サイエンティフィック・プロダクツ）中で
、５１ずつ２回交換の０．２Ｍ酢酸に対して十分に透析
した。抽出物を透析し、７、５　ｔｔｒｌの１Ｍ酢酸中
に再懸濁し、次に３０ｋｒｐｏ＋にて遠心分離した。

°ル　　クロマトブーツ ビオゲルＰ−１０（２００〜４００メツシュ；ビオ・ラ
ド・ラプス）を１Ｍ酢酸中で一夜膨潤せしめ、十分に脱
気し、そして次に１００Ｘ　２．５　ｃｍのシリコン処
理されたガラスカラムに注入し、そして１Ｍ酢酸により
一夜平衡化せしめた。

２９ｇのヒト血小板からの酸−エタノール可溶化ペプチ
ド（５０〜７０ｍｇの蛋白質）を７．５　ｍｌの１Ｍ酢
酸に溶解し、そして上記のカラムに適用した。両分（３
，５１ｎＲ）を集め、そしてアリコートを凍結乾燥し、
そしてＡ３４９ヒト肺癌細胞への５　　　＋ｚｓ■−ヨ
ウドー２′−デオキシウリジンの導入の阻害について試
験した。

立　　　クロマトグーフィー 上記のカラムからの腫瘍増殖阻害活性のピークを含む両
分（蛋白質２００ｎｇ）を凍結乾燥し、そして０．０５
％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸中に再懸濁した。

次に、カラムを、２３°Ｃにて０．８ｄ／分の流速にお
いて、０．０４５％のトリフルオロ酢酸中アセトニトリ
ルの０．６０％直線グラジェントにより溶出した。

各両分のアリコートを凍結乾燥し、そして上記のように
して３回）則定した。

次に、阻害活性を含有する両分を０．１％トリフルオロ
酢酸を含有する４０％アセトニトリル中に溶解し、そし
てヒドロキシル化ポリエーテルゲルカラム（ビオ・ラド
・ＴＳＫ−２５０）に適用し、そして０．１％トリフル
オロ酢酸中４０％アセトニトリルの移動相により溶出し
た。画分を集め、凍結乾燥し、そして増殖阻害活性につ
いて３回測定した。活性はインシュリンマーカーが溶出
する画分中に溶出し、そして６〜８ｋＤの分子量に対応
する。

次に、最も高い活性を有する両分を、５ＯＳＰＡＧＥを
用いて次のようにして電気泳動した。

逆相ＨＰＬＣ精製段階からの主たるオンコスタチンＡ活
性に相当するペプチドを凍結乾燥し、１２．５ｍＭ　　
Ｔｒｉｓ−ＣＩｐＨ６，７，４％ＳＤＳ、　１０％β−
メルカプトエタノール、２０％グリセリン及び０．０１
％ブロムフェノールブルーを含有するサンプル調製緩衝
液０．０３ｄ中に再懸濁しそして沸騰せしめた（２分間
）。このサンプルを、０．１％ｓＤｓを含有するｐｌ＋
８．８の１７〜２７％ポリアクリルアミドグラジェント
スラブゲル上に江別された５％ポリアクリルアミド重層
ゲル上に負荷した。サンプルが重層ゲルを通って移動す
るまで１０ミリアンペアにて、そして染料フロントがゲ
ルの底に移動するまで２０ミリアンペアにて、ゲルの泳
動を行った。ゲルを固定し、そして０．２％クーマシー
ブルー、５０％メタノール及び９％酢酸の溶液中で一夜
染色した。脱染色の後、ホソファ−（Ｈｏｆｆｅｒ）デ
ンシトメーターを用いてクーマシー陽性バンドの位置を
決定した。マーカーはインシュリン（６，０００Ｍｒ）
　、）リプシノーゲン（２４、５００Ｍｒ）、ＲＮアー
ゼ（１３，７００Ｍｒ）、及びアプロチニン（６，５０
０Ｍｒ）を包含した。主ペプチドは、これらの電気泳動
条件下で６，５００Ｍｒアプロチニン標準と共に泳動し
た。

使用された測定法は次の通りであった。２日目の朝に、
Ｎｕｎｃ　９６ウエルプレー１べにａｍｓ　ｔｒｕｐｒ
ｅｊ９０．０に−４，０００，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、チン
マーク）中に八５４９８１１胞（ヒト肺癌）が生じた。

これらの細胞は３０より少ない場合継代された。周囲の
ウェルを除くすべてのウェルに４５，０００細胞１５０
ｔｄ／ウエル（１０％ＦＣ５，Ｐ／Ｓ、グルタミンを含
むＤＭＥＭ緘当り９×１０４細胞）を導入した。周囲の
ウェルには５０μｌのＰＢＳを入れ、そしてプレート全
体を３７°Ｃにてインキュベートした。午後、ｌＯ％Ｆ
Ｃ３，Ｐ／Ｓ、グルタミンを含むＤＭＥＭ中に試験サン
プルを再懸濁し３連試験を行った。各試験ウェルに５０
ｄを与え、他方、対照ウェルには５０μｌ　ＤｌＩＥｉ
ｌを与えて、プレートを３７°Ｃにて３日間インキュベ
ートした。４日目に、　目５Ｉ−ヨードー２′−デオキ
シウリジン（４ｃｔ／■−０，５ｔｍ　ｃｔ／　ｄ　）
の溶液（１μ！／アイソト一プ／１０％ＦＣ５ＳＰ／Ｓ
、グルタミンを含むＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　ｍｌ　）　５０　
ｍｌを加え、そしてプレートを３７°Ｃにて一夜インキ
ユヘートした。５日目に、培地をウェルから吸引し、Ｐ
ＢＳで１回洗浄し、１００Ｉのメタノールを加え、この
メタノールを１０分間Ｉｆｆし、次にメタノールを吸引
した。次に、ウェルに、１Ｍ水酸化ナトリウム２００Ｉ
を加え、プレートを３７°Ｃにて３０分間インキュベー
トし、そして次にタイターチックプラグ（Ｔｉｔｅｒｔ
ｅｋ　ｐｌｕｇ）（フロー・ラプス）により１Ｍ水酸化
ナトリウムを取り出した。

次に、このプラグをガンマ−カウンター中で放射能につ
いて計数した。

上記のようにして調製されたオンコスタチンへの有効性
を証明するため、次の試験を行った。この試験を軟寒天
コロニー阻害と称する。使用される材料は、５％寒天（
３，７５ｇノーヘル寒天（デイフコ）］、１１２５ｍの
Ｗｈｅａ　ｔｏｎビン中でオートクレーブされた薄留水
１５ｍ１．１０％ＦＣＳを含む開開、１００Ｕペニシリ
ン、１０００ストレプトマイシン、２００ｍＭグルタミ
ン、及びヒト黒色腫細胞（Ａ３７５）である。

試験されるべき材料を１２　Ｘ　７５ｍｍの無菌試験管
中で凍結乾燥する。ＤＭＥＭを用いて５％寒天の１：１
０稀釈物を作りそして水浴中で４６°Ｃに加熱する。６
−ウェル培養プレート（３５Ｘ１４ｍｍ）の各ウェルに
０．５％寒天溶液１　ｍｌをピペット注入することによ
り基層を調製する。この層を、それが硬化するまで、室
温にて放置する。トリプシン処理することによりＳＡ、
細胞を調製し、そして細胞数を計数する。細胞をｌＸｌ
０’細胞／ｄの最終濃度に稀釈し、そして０．３５ｄの
細胞を各試験サンプル管に加える。

１０本の試験サンプル管のそれぞれに０．７５０ｍｆｆ
１の０．５％寒天溶液をピペット注入し、混合物をゆっ
くり回転させ、そして試験サンプル管の内容物（試験サ
ンプル、細胞、寒天）を基層上に江別し、そして寒天が
硬化するまで約２０分間室温に放置する。次に、プレー
トを、５％二酸化炭素を伴う３７°Ｃの加湿室中に貯蔵
する。

試験材料の力価に依存して３日後１０日まで、コロニー
増殖の阻害についてプレートを点検する。

コロニーの数を、無作為な８個の低倍率顕微鏡視野中で
計数する。プレートが５日以上にわたって保持されるべ
き場合には、さらに１滅の０．３％寒天溶液の層を試験
サンプル層上に重層することにより試験サンプル層の乾
燥を防止する。

種々の濃度の精製されたオンコスタチン−Ａを用いなが
ら、上記の方法を使用した。下記の表はその結果を示し
、示されているオンコスタチン＝Ａの世は、試験管に導
入された凍結乾燥された星である。結果は、最大阻害％
として報告されている。

上記の結果から、この発明のポリペプチドが細胞増殖の
有効な１徂害剤であることが明らかである。

黒色腫細胞を用いて観察されたごの結果に基いて、？７
５０％の阻害をもたらすために約１１ｇで十分である。

従って、この化合物は、新生物細胞増殖を包含する細胞
増殖の阻害において、広範囲の用途を有する。例えば、
この化合物はまた、次の表に示されるように、種々の培
養されたヒト腫瘍細胞を１１害するが、正常な非新生物
性ヒト包皮線維芽細胞を阻害しない。

一表一−ｎ 形質転換された ヒト肺癌（Ａ５＝１９） ヒト肺腺癌（Ｈ１２５） ヒト黒色腫（八３７５） ヒト乳癌（ＭＣＦ−７） 形質転換されていない ヒト包皮線維芽細胞（ＩＩＵＰ＋）６）（ネ）記載され
た測定条件を用いて、オンコスタチン−への飽和濃度（
１００ｎｇ／ウェル）において観察されるへ５４９細胞
への１２５１−デオキシウリジンの取込の最大阻害は未
処理対照培養物に対して５０％を超えない。

若い（８〜１０週齢）の無胸腺マウスに、１００ｔ１１
のリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）中に懸濁された５Ｘ１
０”個のヒト肺癌細胞（＾５４９）を鼠径部の皮下に注
射した。接種の７日後、直径２．５〜３．０　ｍｍの触
知可能なｌ１ｆｆ！瘍が発生した。この集団から腫瘍担
持マウスを無作為的に選択し、そして７日目に、前記の
ようにしてヒト血小板から均一に精製したオンコスタチ
ン−Ａｏ、３０ｉを含有する５０μノのＰＢＳを、腫瘍
部位上の皮下に注射した。オンコスタチン−Ａを含まな
いＰＢＳの腫瘍担持対照マウスへの注射は腫瘍の増殖に
効果を与えなかった。次に、１１１１１’Ｒ担持マウス
に、Ａ３４９細胞の注射後の後１１日及び１６６日目、
５０μ！０ＰＢＳ中同量のオンコスタチンーＡを注射し
た。オンコスタチン−へのこれらの投与は、３０１／２
”ｇ針を用いて、腫瘍塊中に直接注射した。キャリバー
により水平寸法及び垂直寸法の両者について腫瘍を測定
することにより、示された日に腫瘍の大きさをモニター
した；（ａ）１座標に示す腫瘍サイズはこれら２つの寸
法の積を示す。結果を第１図に示す。

ヒト肺癌細胞（Ａ５４９）をオンコスタチン−Ａ　（２
００ｎｇ／ｍｌ培養物）で処理し、そして細胞培養上清
中に放出されるポリペプチドに対する効果を決定した。

処理された培養物及び対照培養物（オンコスタチン−Ａ
無し）を、０時〔オンコスタチン−Ａ又は培地のみ（対
照）添加〕において３５３−メチオニン（５ｕ　Ｃｉ　
／　Ｉｎｌ１ｓ、Ａ、−８００Ｃ４／ｍｍｏｌ）により
パルスした。１２時間後の培養上清を取り出し、そして
まず低速（１，５００Ｘｇにて１５分間）にて、次に高
速（３０，０００Ｘ　ｇにて１時間）にて清澄にした。

清澄にされた上清からトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）により
ペプチドを沈澱せしめ、次に１２．５％アクリルアミド
スラブゲル上でドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にかけた。

ゲルのラジオオートグラフィーはオンコスタチン−Ａに
より処理されたＡ３４９細胞がらの上清中に３５８−メ
チオニンでラベルされたポリペプチドが存在することを
示し、他方、未処理癌細胞は最少量のこの蛋白質を分泌
した（オンコスタヂンーＡ処理後、少なくとも１０倍の
増加が見られた）。処理された培養物と対照培養物との
間に他の質的又は量的差異は見られなかった。

ｐｐ６０ｓｒｃを、Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ等、ｒ’ｒｏｃ、
Ｎａ目、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　（１９７９）７６：６２６０−６２６４；　Ｅ
ｒ１ｃｋｓｏｎ等、Ｃｏ１ｄＳ　ｒｉｎ　　ｌ１ａｒｂ
ｏｒ　Ｓ　ｍ　、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、（１９７９）
４４：９０２９１７に記載されているようにして、イム
ノアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。

５．１の精製された酵素（約０．４７ｐｍｏｌｅ）を１
１００ｎの精製された均一なオンコスタチン−Ａと、２
０ｍＭ　ＡＴＰ。

５ｍＭ　ｈＣｊ２　、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−（Ｊ　　
（ｐｔｌ”７．２　）を含む３０μｌの最終反応容積中
で３０°Ｃにて３０分間インキュベートした。２倍量の
サンプル緩衝液を添加することによって反応を停止し、
そしてＬａｅｍｍｅｌｉ、Ｕ、に、。

Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）２２７　：６８０−６８５ニ
記載サレテイルようにしてＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により分析した。スラブゲルのオートラジオ
グラフィーは、ｐｐ６０ｓｒｃのオートホスホリレーシ
シンにおける１０倍の刺激を明らかに示した。ｓｒｃ酵
素において、ホスホリレーションの増加はチロシン残基
に限定されず、セリン位置にも見出された。

Ｗｅｈｊ−３は、ガンマ−インターフェロン（γ−ＩＦ
Ｎ）によりＨ２クラス■抗原を発現するようにｆｌされ
得るマウスマクロファージ細胞系である。この３ｉ　Ｒ
の特徴は幾つかの研究室により研究され、そして正常な
マクロファージ誘導の正確な再現であることが示されて
いる。

これらの細胞を少量の７−ＩＦＮの存在下又は非存在下
で、血小板オンコスタチン−への幾つかの濃度を用いて
増殖せしめた。γ〜ＩＦＮの存在下又は非存在下のいず
れにおいても、オンコスタチン−Ａは、ＦＡＣ５上での
直接免疫螢光により測定した場合、クラス■抗原の量依
存的増強を示した。オンコスタチン−への効果の程度は
、用いられた濃度（〜２−７０ｎｇ　／　ｒｒｄｌ　）
においておよそ２倍であった。

オンコスタチン−Ａに対して特異的なモノクローナル及
びポリクローナル抗体の製造 オンコスタチン−Ａを細菌リポポリサッカライドに交差
リンクさせる方法は、Ｐｒ１ｍ１及びＣａｚｅｎａｖｅ
、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８２）１２９　（３）
：１１２４−１１２９により開発された方法の変法であ
る。

Ｌｏｎｇのオンコスタチン−Ａ及び１２．５ｎｇの細菌
リポポリサッカライド（ＬＰＳ、シグマ＃Ｌ−２６３）
を蒸留水により５００Ｉの容量に稀釈した。ＰＢＳ中２
．５％のグルタルアルデヒド５０４を加え、そしてこの
混合物を室温にて３０分間インキュベートした。

ＰＢＳ中２Ｍグリシン５０μｌを加え、そして室温にて
１時間インキユヘートすることにより反応を停止した。

オンコスタチン−Ａ：ＬＰＳ接合体を１０ｍ２の混合さ
れたリンパ球条件調節された媒体で稀釈し、そしてフィ
ルターをインービトロ免疫惑作において使用するために
殺菌した。

Ｒｅａｄｉｎｇ、［ｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、（１９Ｂ
２）　５３：２６１−２６９により記載された方法の変
法を用いて非免疫肺細胞をイン−ビトロ免疫感作した。

２％ラビット血清を含有するＤＭＥＭ中で同数のＢａ１
ｂ／ｃ及びＣ５７ブランクマウス胸腺細胞を４×１０６
細胞／ｄにて４８時間培養することにより、混合された
リンパ球条件調節（ＭＬＣ）媒体を調製した。この媒体
を集め、そして−２０℃にて貯蔵した。

チオグリコレート処理されたＢａ１ｂ／ｃマウスを無菌
ＰＢＳでフラッシュすることにより腹腔滲細胞（ＰＥＣ
）を集めた。ＰＥＣ細胞を、１マウス相当の肺細胞、及
び１０ｎＨのオンコスタチン−八−ＬＰＳ接合体を含有
するＭＬＣ媒体媒体１０七！に培養においた。細胞を７
日間培養した。

天込文旦二去火汎止傅盟遣 免疫肺細胞を集め、そして１：ｌの比率においてＳＰ　
２／１０骨髄腫細胞と融合せしめることによりオンコス
タチン−Ａ特異的モノクローナル抗体を合成するハイブ
リドーマを調製した。エンザイムリンクドイムノアッセ
イ（ＥＬＩＳ＾）によりオンコスタチン−Ａ抗体の生産
についてハイブリドーマを試験した。限界稀釈法により
陽性ハイブリドーマを２回クローン化した。クローンを
展開し、免疫グロブリンクラスについて試験し、そして
腹水生産のためにＢａ１ｂ／ｃマウスに注射した。

４０個の陽性ハイブリドーマクローンをまず展開し、そ
して抗−オンコスタチンーＡ活性について再試験した。

７個の最も反応性のクローンを使用してＢａ１ｂ／ｃマ
ウス中に腹水を生産した。残りを展開しそして凍結した
。腹水をＥＬＩＳＡにおいてオンコスタチン−Ａ、オン
コスタチン−Ａベブチド−Ｋ　Ｌ　Ｈ接合体及びＢＳＡ
に対する特異性について試験した。

腹水は、オンコスタチン−Ａ、及びより少ない程度に、
１〜３０００の稀釈率におけるオンコスタチン−Ａペプ
チドの両者と反応した。免疫グロブリンを、Ｒｕ５ｓｏ
等、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８３）　ｉ５：
２６９２７１により記載されているカプリル酸沈澱法に
より精製した。免疫グロブリンのパラボン分析及びオー
クテルロニー分析は、すべての免疫グロブリンがタイプ
ＩｇＭであることを示した。

オンコスタチン−ＡについてのＥｌ、ＩＳＡオンコスタ
チン−Ａを０．１　Ｍ酢酸中に稀釈し、そしてＬｏｎｇ
／ウェルを９６ウエルダイナテツクイムロンプレー１・
にピペット注入した。溶液を室温にて一夜乾燥した。Ｐ
ＢＳ中２．５％ＢＳ八、２．５％ウシ胎児血清（Ｆｅ２
）と共にウェルを３７°Ｃにて１時間インキュベートす
ることによりプレートをブロンクした。次にこのプレー
トをＰＢＳ中２．５％ＦＣ５で２回洗浄した。次にハイ
ブリドーマ培地、免疫グロブリン又は抗血清を適当な稀
釈において添加した。次にこのプレートを３７°Ｃにて
２時間インキュベートし、そしてＰＢＳ中２．５％ＦＣ
３により３回洗浄した。製造者の指示に従ってベクター
ラズスのアビジン−ビオチン−１１ＲＰ　ＥＬ４ＳＡ試
薬を使用した。各段階の間にウェルをＰＢＳ中２．５％
ＦＣ５により洗浄した。４Ｉ１１の３０％過酸化水素／
１０ｍ２溶液を含有する０、１Ｍクエン酸ナトリウム溶
液中０．４　［１１ｇ／　ｍｌｌオルト−フェニレンジ
アミンにより陽性ウェルを可視化した。室温にて３０分
間反応を継続せしめた。５０ｍの１．４　Ｎ　＋１□５
０４／ウエルを添加することにより反応を停止した。

ボ冨クロー　ル　−オンコス　チン“の遣 Ｂａ１ｂ／Ｃマウスをニトロセルロース固定化オンコス
タチン−Ａにより免疫感作した。この免疫感作法の目的
は宿主によるポリペプチドの急速な排除を回避すること
である。こうして、非常に少鼠のオンコスタチン−Ａに
より免疫感作を行うことができる。

０．１Ｍ酢酸中オンコスタチチンＡの溶液をニトロセル
ロース（シュライヒエル＆シュエル、０．４５−）の小
片に付着せしめ、そして放置乾燥した。

最初の免疫のために、ニトロセルロース片を３匹のＢａ
１ｂ／ｃマウスの腹腔に入れた（０．３７５ｎｇ／マウ
ス）。（マウスにさらに０．１　ｍｌの完全ソロインド
アジュバントを腹腔内注射した。マウスを２週間の間隔
で２回、オンコスタチンを固定したニトロセルロースに
より追加免疫感作した。追加免疫のためには、ニトロセ
ルロースを切断し、Ｏ，ｌ　ｍｌの水及び０．１　ｄの
不完全フロインドアジュバントと共にホモジナイズし、
そして皮下注射した（０．１２５ｎｇ／マウス）。マウ
ス血清を前記のＥＬＩＳＡ測定によりオンコスタチン−
Ａに対する特異性について試験し、第２段階の試薬とし
てホースラデイツシュパーオキシダーゼ接合プロティン
Ａを使用した。

特異性を示すため、血清をオンコスタチン−Ａペプチド
−ＫＬＨ接合体及びブロックされたプレートに対して試
験した。

常法に従って、次の配列を調製した。

Ｎｃｏｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｐｓｔ
ｌＢｓｓｌｌｌｌ　　　　　　　　　　　　　販用−Ｇ
Ｇ　　ＴＡＣＣＴＴ　　ＣＧＡ　　ＣＴＴ　　ＣＴＴ　
　ＣＴＧ　　ＣＣＴ　　ＣＴＡ　　ＧＡＣＧＴＣＡＣＧ
ＣＧＣＧＣＣＡＴＧ　　ＧＡＡ　　ＧＣＴ　　ＧＡＡ　
　ＧＡＡ　　ＧＡＣＧＧＡ　　ＧＡＴ　　ＣＴＧ　　Ｃ
ＡＧ　　ＴＧＣ／”°１°１“°１°°１°“１”ａｓ
ｐ　ｇｌｙ　ａｓ“１°”１°°パＮ１］２ Ｓｔｕ＋ ＧＡＣＡＣＧ　　ＣＡＴ　　ＴＴＴ　　ＴＧＡ　　ＴＧ
Ａ　　ＡＧＡ　　ＧＴＣＣＡＴ　　ＴＣＣＧＧＡ　　Ｇ
ＣＡ　　ＧＴＧＣＴＧ　　ＴＧＣＧＴＡ　　ＡＡＡ　　
ＡＣＴ　　ＡＣＴ　　ＴＣＴ　　ＣＡＧ　　ＣＴＡ　　
ＡＧＧ　　ＣＣＴ　　ＧＧＴ　　ＣＡＣ−７８Ｉｅｕ　
ｃｙｓ　ｖａｌ　ｌｙｓ　ｔｈｒ　ｔｈｒ　ｓｅｒ　ｇ
ｌｎ　ｖａｌ　ａｒｇ　ｐｒｏ　ａｒｇ　ｈｉｓＸｈｏ
ｌ　　　　　　　　　　ＮａｅｌＴＡＧ　　ＴＧＴ　　
ＡＧＴ　　ＧＡＧ　　ＣＴＣＣＡＴ　　ＴＡＧ　　ＴＴ
Ｔ　　ＣＧＧ　　ＣＣＧ　　ＧＧＣＧＴＧ　　ＡＣＧ　
　ＧＧＣＡＴＣＡＣＡ　　ＴＣＡ　　ＣＴＣＧＡＧ　　
ＧＴＡ　　ＡＴＣＡＡＡ　　ＧＣＣＧＧＣＣＣＧ　　Ｃ
ＡＣＴＧＣＣＣＧ　　　−１２０ｉ１ｕ　ｔｈｒ　ｓｅ
ｒ　ｌｅｕ　ｇｌｕ　ｖａｌ　ｉｌｕ　ｌｙｓ　ａｌａ
　ｇｌｙ　ｐｒｏ　ｈｉｓ　ｃｙｓ　ｐｒ。

Ｐｖｕｌｌ　　　ＮｒｕＴ ＴＧＡ　　ＣＧＡ　　ＧＴＣＧＡＣＴＡＧ　　ＣＧＣＴ
ＧＡ　　ＧＡＣＴＴＴ　　ＴＴＧ　　ＣＣＡ　　ＧＣＡ
　　ＴＴＣＡＣＴ　　ＧＣＴ　　ＣＡＧ　　ＣＴＧ　　
ＡＴＣＧＣＧ　　ＡＣＴ　　ＣＴＧ　　ＡＡＡ　　ＡＡ
ＣＧＧＴ　　ＣＧＴ　　ＡＡＧ　　　　　　　−１５９
ｔｈｒ　　ａｌａ　　ｇｉｎ　　Ｉｅｕ　　ｉｌｕ　　
ａｌａ　　Ｌｈｒ　　ｌｅｕ　　Ｉｙｓ　　ａｓｎ　　
ｇｌｙ　　ａｒｇ　　ｌｙｓｊｌｌｌＴ　Ｘｂａｌ　　
　Ｐｓｔ＋ ＴＡＧ　　ＡＣＡ　　ＧＡＴ　　ＣＴＧ　　ＧＡＣＧＴ
ＣＣＧＡ　　ＧＧＣＧＡＣＡＴＧ　　ＴＴＴ　　ＴＴＴ
　　ＴＡＧＡＴＧ　　ＴＧＴ　　ＣＴＡ　　ＧＡＣＣＴ
Ｇ　　ＣＡＧ　　ＧＣＴ　　ＣＣＧ　　ＣＴＧ　　ＴＡ
Ｃへへへ　ΔＡＡ　　ＡＴＣｉｌｕ　ｃｙｓ　ｔａｕ　
ａｓｐ　ｌｅｕ　ｇｌｎ　ａｌａ　ｐｒｏ　ｌｅｕ　ｔ
ｙｒ　ｌｙｓ　ｌｙｓ　１ｌｕＡｆｌ　ＩＩ　Ｂａｍ１
ｌｌ ＴＡＧ　　ＴＴＴ　　ＴＴＴ　　ＧＡＣＧＡＣＣＴＴ　
　ＡＧＡ　　ＡＴＴ　　ＣＣＴ　　ＡＧ八へＣＡＡＡ　
　ＡＡＡ　　ＣＴＧ　　ＣＴＧ　　ＧＡＡ　　ＴＣＴ　
　ＴＡＡ　　Ｇこの配列はＥ、コリ中で使用するために
百計され、そしてコード配列の修飾を容易にするため番
こ多数の制限酵素認識部位が考案された。単鎖オーハー
ラソプ配列を調製し、アニーリング媒体中で−ｔａにし
、そして連結して、オンコスタチン−Ａが単離され得る
融合蛋白質を調製するためにリーディングフェーズを合
わせて発現ベクター中に挿入するために適当な末端を有
する完全な遺伝子を得た。単鎖・セグメントをＴ４ポリ
ヌクレオチドリガーゼにより５′−リン酸化し、そして
各セク゛メント２００ｐｍｏｌｅを３０ｔｔｌの反応容
Ｉｔ　（３０ｍＭ　ＡＴＰ、１０ｍＭＤＴＴ　、１０ｍ
Ｍ　ＭｇＣ／！　ｚ　、１　ｎ／　ｘｉ！スペルミジン
、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　、　ｐＨ７、８、
及びＴ、ｉ　ＤＮＡリガーゼ）中で一緒にすることによ
りアニールする。ｄｓ　ＤＮＡをＢｓ５ＨＩＩ及びＢａ
ｍ１ｌ　　Ｉで消化し、そして７％天然ポリアクリルア
ミドゲル上で精製する。

プラスミドｐｔｒｐＥＤ５−Ｌ　　（Ｈａｌｌｅｉｌｅ
ｌｌ及びＥｎｔａｇｅ。

Ｇｅｎｅ（１９８０）　９　：２７；Ｔａｃｏｎ等、Ｍ
ｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　（１９８０）１７７　：
４２７）をエンドヌクレアーゼＢｓ５ＨＩＩ及びＢａｍ
ＨＩで消化し、そしてｔｒｐＤ遺伝子を欠きそして切断
されたｔｒｐＥ遺伝子を有する実質的に十分な長さの断
片を調製用ゲル電気泳動により単離する。

オンコスタチン−Ａ遺伝子を線状化されたｐ　ＬｒｐＥ
Ｐ５−１プラスミドに連結してプラスミドｐＬｒｐ（Ｏ
ｎｃ八）を得、そして連結混合物を用いてＥ、コ１月Ｉ
ＢＩＯＩ細胞を形質転換する。アンピシリン耐性により
形質転換体を選択し、そしてプラスミドを制限エンドヌ
クレアーゼ消化により分析する。形質転換体をしｕｒｉ
ａブロス中で３７°Ｃにて約１０’細胞／ｄに増殖せし
め、そして３−インドール酢酸（ＩＡＡ）を約１＋ｍＭ
に加え、そして増殖を約１時間継続する。

アリコー）（１ｍ）をエッペンドルフ遠心管中で数秒間
遠心分離し、そしてペレフトを５■／ｄのシアノゲンプ
ロミドを含有する７％蟻酸５０ｏＩｉｌ中に懸濁する。

室温にて２４時間置いた後、アリコートを水中に１０倍
に稀釈し、そして稀釈されたサンプルをオンコスタチン
−Ａについて測定する。オンコスタチン−Ａは中間メチ
オニンを有さずＮ−末端メチオニンを有するため、融合
蛋白質の開裂が天然オンコスタチン−Ａと同しアミノ酸
配列を有するオンコスタチン−Ａをもたらす。

上記の結果から、この発明の化合物が広範囲の用途を有
することが明らかである。特に、この化合物を新生物状
態の診断及び治療において使用することができる。医療
において、この化合物は腫瘍細胞増殖の緩慢化をもたら
すことができ、そのため腫瘍細胞の破壊のための他の態
様の治療と組み合わせて使用することができる。診療の
ためには、この発明の化合物はｐ５２の生産をＦ’！し
、その結果この化合物を宿主に投与した際に増強される
ｐ５２レベルがｌＩＩ瘍細胞の存在の指標であることが
見出される。このことは、新生物状態の治療中に腫瘍細
胞の除去が成功したか又は転移が生じたかを決定するた
めに非常に重要であり得る。この発明の化合物はまた、
オンコスタチン−Ａ又はオンコスタチン−Ａレセプター
の存在についての診り幾分詳細に記載されたが、添付さ
れた請求の範囲の範囲内において幾らかの変化及び変法
を実施することができることが明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、無胸腺（ａｔｈｙｍｉｃ）マウスにおける腫
瘍の増殖に対するオンコスタチン−への効果を比較する
図表である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次のアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 を有する物質に対して特異的なモノクローナル抗体。 ２、標識されている特許請求の範囲第１項記載のモノク
   ローナル抗体。