JPH0242985A - オンコスタチン‐ａ又はその部分をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明はオンコスタチンＡ又はその部分をコードするＤ
ＮＡに関する。

造血細胞の及びそれによる分化及び増殖の複雑さは、こ
れらの事象を調節する単離された因子のリストが連続的
に増加するに従って、次第に明らかになりつつある。は
とんどの場合、これらの因子は、広範囲の機能を有する
多くの他の蛋白質と共に非常に微量に存在する。単離さ
れそして活性を有することが証明された因子は、Ｔ−イ
ンターフェロン、血小板由来増殖因子、コロニー刺激因
子、インターロイキン−２、エリスロポイエチンのごと
きポリペプチド及び蛋白質、並びに多数の他のリンホカ
インを包含する。これらの血液成分の単離、精製及び特
徴付けには実質的な興味が存在する。なぜなら、これら
は癌のごとき疾患の治療及び説明に使用される可能性が
あるからである。

天然に存在する因子の単離には多くの落とし穴が存在す
る。存在しそして類似の特性を有するであろう他の因子
から目的因子を分離する分離系か開発されなければなら
ない。第２に、存在する他の特質に対比して注目の物質
を特異的に又は実質上特異的に特徴付ける、種々の両分
を測定するための幾つかの手段が与えられなければなら
ない。

注目のポリペプチドが極端に高い活性を有する場合、目
的生成物を単離する困難さは非常に増強される。第３に
、注目の生成物に不都合な影響を与えない方法、特にす
べての変性を回避する方法を得なければならない。さら
に、組成物中には注目の物質に作用してそれを変化せし
める他の物質がしばしば存在し、その結果、最終的に得
られるなんらかの目的の活性を有する物質は天然に存在
する物質ではない。最後に、目的生成物を十分に純粋な
形で単離した後、例えばアミノ酸配列決定、グリコジル
化数、ジスルフィド橋、及びこれらに類する事項により
、そのポリペプチドを物理的に特徴付けることを試みな
ければならない。さらに、物質をその生理学的特性につ
いて特徴イ」けなければならない。

最後に、精製された化合物の単離の後でさえ、該化合物
の生理学的活性の特徴付けはしばしば捕えどころかない
ことが証明されよう。多くの状況において、活性は１又
は複数の他の化合物の存在、狭い濃度範囲、特定の宿主
細胞、又はこれらに類するものに依存し得るので、化合
物の生理学的活性を見出しそしてその活性に影響を与え
る他のパラメーターを証明せるために、実質的直観的努
力及び延長された実験期間が必要とされる。

〔従来技術の記！！］ Ｈｏ１１ｅｙ等、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ（１９８０）７ヱ：５９８９−５９９２は
、上皮細胞増殖阻害物質を記載している。Ｎｅｌｓｏｎ
−Ｈａｍｉｌｔｏｎ及びＨｏ１ｌｅｙ、前掲、（１９８
３）８０　：　５６３６−５６４０は、アフリカミトリ
サル細胞（［１ＳＣ−１）により分泌される蛋白質への
放射性標識されたメチオニンの導入における増殖阻害物
質及び上皮増殖因子の効果を記載している。Ｍｏｒｇａ
ｎ等、Ｔｈｒｏｍｂ。

ｌｌａｅｍｏｓｔ、　（１９８０）４２：１６５２−６
０はヒト血小板ファクター４のアミノ酸配列を与えてい
る。Ｄａｗｅｓ等、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、（１９８３
）　２９：５６９−８１　、及び５ｃｈｅｒｎ　ｔｈａ
ｎｃｒ等、Ａｃｔａ　Ｍｅｄ、Ａｕ５ｔｒｉａｃａ（ｓ
ｕｐｐｌ、）（１９７９）　６　：３７５−９は、血小
板ファクター４に対するポリクローナル抗体を報告して
いる。しａｗｌｅｒ、　Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、（１９
８１）２１：１２１−７はβ−スロンボグロプリンと血
小板ファクター４の配列及び構造を比較している。

〔発明の概要〕

本発明はオンコスタチン−Ａ又はその部分をコードする
ＤＮＡに関するものである。

〔具体的な態様の詳細な記載］ 咄乳動物新生物細胞増殖阻害を行う、ポリペプチド、誘
導体、断片、又はそれらの類憤外を含んで成る組成物が
提供される。この発明のポリペプチドは血小板の抽出に
より得られるエタノール性ＨＣｆｆ画分中の天然ポリペ
プチドに関し、このものは文献中で血小板ファクター４
と呼ばれ、そして以後オンコスタチン−Ａ　（Ｏｎｃｏ
ｓｔａｔｉｎ−Ａ）と称する。このポリペプチドは穏和
な温度（０〜２５°Ｃ）、低いｐＨ１一般に約ｐＨ３以
下、通常ｐＨ２において安定である。このポリペプチド
は、約５，０００〜８，０００の範囲、−層正確には約
６．０００〜７，５００の範囲、さらに特定すれば約７
，０００の分子量を有する。このポリペプチドは、高等
動物、特に霊長類、さらに特定すればヒトの血小板から
得られる。

使用されるポリペプチド化合物は約１５〜８０アミノ酸
を有し、天然ポリペプチド及びその模倣類似体は約６０
〜７５アミノ酸、さらに普通には約６５〜７２アミノ酸
を有し、他方断片は一般に約１５〜６０アミノ酸、さら
に普通には１５〜３５アミノ酸の範囲にあるであろう。

約６８〜７２アミノ酸、さらに特定ずれば６９　、７０
又は７１アミノ酸を有するポリペプチドが特に興味深い
。これらのポリペプチドは、他の化合物、例えば抗原、
レセプター、標識等に結合することができる。

ポリペプチドは少なくとも１つの生物学的に活性な、例
えば免疫学的に又はエピトープとして活性な配列を有し
、そして１個より多（の生物学的に活性な配列を存し、
この場合このような配列が生物学的性質について天然生
成物と競争することができるであろう。

注目の組成物は酸性（陰イオン性）Ｎ−末端及び塩基性
（陽イオン性）Ｃ−末端を有し、荷電領域は６〜１５ア
ミノ酸、通常６〜１２アミノ酸であり、この領域は６〜
８アミノ酸のアミノ酸配列を含み、５０％以上の個数、
通常６０％以上の個数がイオン性アミノ酸であり、そし
て通常９０％以下の個数がイオン性アミノ酸である。イ
オン性アミノ酸は塩基性、Ｋ及びＲ：酸性、Ｄ及びＥで
ある。

約６０以上のアミノ酸を有する組成物は、２５個以上の
アミノ酸、通常４０個以上のアミノ酸、そして約７０個
より少なく、一般に約６５個より少ないアミノ酸により
隔てられた複数の荷電ドメインを有するであろう。荷電
ドメインを隔てるアミノ酸連結配列は、陰イオン性アミ
ノ酸を超える過剰の陽イオン性アミノ酸を有し、−ｉに
約１．５〜３、通常２〜１の比率を有し、化合物のρに
は約６．５〜８、の範囲、特に約７．４であろう。

前記連結配列中には２個のジスルフィド橋が存在し、こ
れら架橋ジスルフィドは約２０〜４５、通常２２〜４０
アミノ酸隔てられており、好ましくは約２５及び３９ア
ミノ酸により隔てられている。Ｎ−末端に近位の複数の
システィンはＮ−末端末から約８〜１６アミノ酸にあり
、Ｃ−末端に近位の複数のシスティンはＣ−末端から約
１２〜４５アミノ酸、通常１６〜４０アミノ酸にある。

注目の組成物は一般に、ペンタデプチドＥ−八−ＥＥ−
Ｄ　、さらに一般にはデカペプチドＥ−Ａ−Ｅ−Ｅ−Ｄ
−ＧＤ−Ｌ−Ｑ−Ｃ、ＬばしばペンタデカペプチドＥ−
Ａ−Ｅ−ＥＤ−Ｇ−Ｄ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｌ−Ｃ−Ｖ−に−
Ｔ　、そしてさらにしばしば次の式：　Ｅ−Ａ−Ｅ−Ｅ
−Ｄ−Ｃ−Ｄ−Ｌ−Ｑ−Ｃ−Ｌ−Ｃ−Ｖ−に−Ｔ−Ｔ−
Ｓ−Ｑ−Ｖ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−）１−の式を有するＮ−末端
に近位の配列を有するであろう。ここで、文字は常法に
従って次の意味を有する。

八−アラニン　　　　　　し−ロイシンＣ−システィン
　　　　　Ｐ−プロリンＤ−アスパラギン酸　　　Ｑ−
グルタミンＥ　−クルタミン酸　　　　Ｒ−アルギニン
Ｇ−グリシン　　　　　　Ｓ−セリン １１−ヒスチジン　　　　　Ｔ−スレオニンソーバリン 注目の組成物は一般に、Ｃ−末端の近位において、弐に
−に−１−１−に−にの配列、さらに一般には弐に−に
−１−Ｉ−に−に−Ｌ−Ｌ　、そして好ましくはＰ−Ｌ
−Ｙ−に−に１−Ｉ−に−に−Ｌ−Ｌ−Ｅ−３の配列を
有するであろう。

アミノ酸の保存的置換（Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　５
ｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）を行うことができると理解
されるべきである。保存的変化にはＤ及びＥＬＦ及びＹ
、Ｋ及びＲ，Ｇ及びＡ；Ｎ及びＱ；Ｖ、Ｉ及びＲ１等が
関与する置換が含まれる。幾つかの場合には、非保存的
変化、例えばＫ又はＲとＮ又はＱとの置換が好ましいで
あろう。この置換は、２−塩基性アミノ酸プロテアーゼ
開裂部位、例えばに−Ｒが存在する場合に特に興味が持
たれ、この場合置換はプロテアーゼ開裂に対してこの部
位を保護する。

さらに、挿入又は除去を含めることができ、この場合通
常挿入又は除去には１〜２個のアミノ酸、特に１個のア
ミノ酸が関与するであろう。

注目の新規なポリペプチドは、はとんどの場合次の構造
式： Ａｃ、−Ｍ、１−Ｂａ。

を有し、ここで、 Ａｃ、（酸性領域）はＮ−末端領域であり、そして１０
〜２０個のアミノ酸を有し、この内４〜５個が酸性アミ
ノ酸であって、最初の３アミノ酸の内生なくとも２個が
酸性アミノ酸であり、２個の酸性アミノ酸はタンデムに
配置されており、そして他の２個の酸性アミノ酸は中性
脂肪族アミノ酸により隔てられており；２個のｃｙｓ残
基が１個の中性脂肪族アミノ酸に隔てられて存在し；こ
のｃｙｓ　−Ｘ　−ｃｙｓが２〜６個のアミノ酸により
Ｄ又はＥ−Ｘ−Ｄ又はＥがら隔てられていることを特徴
とし； ＭＲは中間頭載であり、２〜３０炭素原子の短連結基で
あるか又は約２５〜４０個のアミノ酸を有し；少なくと
も１０個、−１Ｇに少なくとも２０個のアミノ酸により
ＡｃＲのシスティンから隔てられた２個のシスティンを
有し、これらのシスティンのそれがＡｃ、中のシスティ
ンの１つとジスルフィド橋を形成しており；５〜７個の
塩基性アミノ酸及び２〜５個、通常３〜４個の酸性アミ
ノ酸を存し；Ｂａ、Ｉ　（塩基性領域）はＣ−末端領域
であって、１２〜３０個のアミノ酸を有し；２対の塩基
性アミノ酸を有し、それぞれが２〜３個の中性脂肪族ア
ミノ酸により引き継がれ、極性又は非−極性、通常は非
極性であり；Ｃ−末端アミノ酸から１０〜１５アミノ酸
に１個のプロリンを有することにより特徴付けられる。

好ましくは、Ａｃ、は次の式： ％式％ （Ｈ）はＮ−末端における水素を意図し；ａａ’・３は
結合、又は炭素原子数２〜６個の脂肪族アミノ酸、通常
酸性アミノ酸もしくは２〜３個の炭素原子を有する非極
性アミノ酸であることができ； ａａ”は結合、又は炭素原子数２〜６個の脂肪族アミノ
酸、通常塩基性アミノ酸、炭素原子数３〜５個の極性ア
ミノ酸、又は炭素原子数２〜３個の非極性アミノ酸であ
り； ＸＩ　は結合、又は炭素原子数２〜６個、通常炭素原子
数４〜６個のアミノ酸１〜２個から成るアミノ酸配列で
あり、これは脂肪族非極性又は極性アミノ酸であり； ａａ’は炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数２〜４個
の非極性もしくは極性の脂肪族アミノ酸、又は酸性アミ
ノ酸であり： ａａ８は炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数５〜６個
の脂肪族アミノ酸であって、通常非極性であり； ａａ”は炭素原子数２〜６個、通常は炭素原子数４〜６
個の脂肪族アミノ酸であり、特に極性カルボキサミド置
換されており又は塩基性であり；Ｘ２は結合、又は炭素
原子数２〜６個の脂肪族アミノ酸、特に中性アミノ酸１
〜２個からなるアミノ酸配列であり： ａ　ａ　ｌ　ｌは炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数
３〜６個の脂肪族アミノ酸であって、これは非極性又は
極性であることができ； ａ　ａ　＋　３は２〜６個、通常５〜６個の炭素原子を
有する脂肪族アミノ酸であって、特に非極性であり；Ｘ
３は結合、ヒドロキシ、炭素原子数１〜３個のアルコキ
シ基、アミノ、又は１〜６、通常１〜３アミノ酸のアミ
ノ酸配列であって、通常は中性脂肪族で非極性又は極性
のいずれか、特に極性であり、最初の３個のアミノ酸は
一般に中性であり、ここでＸ３は分子の末端であること
ができ、又はＭ＊　　、　Ｂ　ａ　＊もしくは抗原に連
結することができる。

前記の記号のための好ましいアミノ酸は次の通りである
。

ａａ’　−結合、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ａ ａａ”−結合、Ｇ、Ａ、に、Ｒ，Ｓ、ＴＸｌ−結合、（
Ｓ又はＴ）、−（Ｖ、Ｌ又はＩ）１ａは０又は１ ａａ６−３．Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ ａａ’−Ｖ、Ｌ、１ ａａ９−Ｎ、Ｑ、に、Ｒ Ｘ２−　（Ｇ又はＡ）、　−（Ｄ又はＥ）、　−（Ｖ。

Ｌ又は■）。

ａａ目−Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｓ、Ｔ ａａｌｚ−Ｖ　、　　Ｌ　、　　ｌ Ｘ３−結合−（Ｓ又はＴ）、−（Ｇ、Ａ、Ｎ又はＱ）、
　−（Ｖ　、　Ｉ、又はＬ）、　−（ＫＲ、Ｎ　、　Ｑ
　、　Ｈ、Ｆ又はＹ）。

ｂはＯ〜３の整数。

好ましくはＢａ、ｌは次の式： ％式％ ａ　ａ　４０・５６は炭素原子数４〜５個の脂肪族酸性
アミノ酸又はそのアミドであり； ａａ４１１４２°ＳＩ＋　５３°６３°６４＋　６’７
は炭素原子数２〜６個、さらに特定すれば炭素原子数５
〜６個の脂肪族アミノ酸であって特に非極性であり； ａ　ａ　４　Ｓは炭素原子数２〜６個の脂肪族アミノ酸
、特に炭素原子数４〜６個の非極性アミノ酸、又は塩基
性アミノ酸であり； ａ　ａ　４７は炭素原子数３〜５個の脂肪族アミノ酸、
特にヒドロキシもしくはアミド置換基を有する極性アミ
ノ酸、又は酸性アミノ酸であり；ａ　ａ　Ｓ　５は炭素
原子数２〜６個の中性脂肪族アミノ酸、特に炭素原子数
４〜６個の非極性の又はカルボキサミド官能を有する炭
素原子数４〜５個の極性アミノ酸； ａ　ａ　Ｓ　７は炭素原子数２〜６個の脂肪族アミノ酸
、特に炭素原子数２〜３個の非極性アミノ酸、又は塩基
性アミノ酸であり； ａ　ａ　Ｓ　９は炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数
４〜６個の脂肪族アミノ酸、通常非極性の、又は塩基性
のアミノ酸であり； ａ　ａ　６０は脂肪族又は芳香族アミノ酸、特に脂肪族
であれば炭素原子数４〜６個のアミノ酸であり；ａａ６
４′″は結合、又は炭素原子数４〜５個の脂肪族極性ア
ミノ酸、特にカルボキサミド置換されたアミノ酸であり
； ａａ６６は炭素原子数２〜６個の脂肪族アミノ酸、特に
非極性アミノ酸であり； Ｘ４はヒドロキシ、炭素原子数１〜３個のアルコキシ、
アミノ、又は１〜４個の、通常１〜２個のアミノ酸のア
ミノ酸配列であり、このアミノ酸は特に脂肪族アミノ酸
、さらに特定すれば極性及び酸性のアミノ酸であり、前
記ｆｉｌは２〜３個の炭素原子を有する０〜１個の非極
性アミノ酸、０〜３個の酸性アミノ酸及び０〜３個のヒ
ドロキシ置換脂肪族アミノ酸を有し、ここでＸ４は分子
の末端に位置し又は抗原もしくは免疫グロブリンへの連
結である。

記号が次の定義を有する場合特に興味深い。

ａａ””’　−Ｄ　、　Ｅ　、　Ｎ　、　Ｑａ　ａ　４
１　＋　４２　＋　Ｓ　Ｉ　＋　Ｓ　：ｌ　＋　６３・
６４・６フーＶ、Ｌ又はＩａａ４７−Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、
Ｄ、Ｅ ａａ”−Ｎ、Ｏ，Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｖ； 特にＰ又はＬ ａａ””　−Ｖ　、　Ｌ　、　Ｉ　、　Ｋ、　Ｒａａ”
−Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、１１．Ｙ ａａｈ４１−結合、Ｎ又はＱ ａａ６８−Ｇ、Ａ、Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｖ Ｘ’−（Ｇ、Ａ、Ｄ又はＥ）、　−（Ｓ　、Ｔ、　Ｄ。

Ａ、Ｇ又はＥ）、　−（Ｄ又はＥ）ｃ （Ｔ又はＳ）。

ＣはＯ〜２゜ （同じ部位に２個のアミノ酸が示されている場合、その
位置にいずれのアミノ酸が存在していてもよい。） 好ましくは、Ｍｒは次の弐： Ｐ−Ｋ　−ａａ２３−ａａ２４−ａａ２５−Ｓ　　　２
７　Ｄ　　　ｚｑ　　３ｏ　　：１Ｉ−ａａ　　　　−
−ａａ　　　　−ａａ　　　　−ａａＲＴＥ に含まれる少なくとも１５個のアミノ酸の配列を含み、 ここで、 ａ　ａ　２　＋１は芳香族アミノ酸、又は炭素原子数３
〜５個の脂肪族極性アミノ酸、特にアミド置換アミノ酸
であり； ａ　ａ　Ｚ　４は炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数
５又は６個の脂肪族非掻性アミノ酸であり；ａ　ａ　ｔ
　Ｓは炭素原子数３〜５個の脂肪族極性アミノ酸、特に
アミド又はヒドロキシ置換アミノ酸であり； ａ　ａ　ｔ　？・２９・３０は炭素原子数５〜６個の脂
肪族非極性アミノ酸であり； ａ　ａ　：１１は炭素原子数２〜６個の脂肪族アミノ酸
であって、炭素原子数２〜３個の非極性アミノ酸である
か又は塩基性アミノ酸のいずれかであり；ａａ３２は炭
素原子数２〜６個の脂肪族アミノ酸であって、炭素原子
数２〜３個の非極性アミノ酸が又は塩基性アミノ酸のい
ずれかであり；ａ　ａ　３４は炭素原子数２〜６個、通
常炭素原子数３〜５個の脂肪族アミノ酸であり、これは
非極性又は極性であり、特にヒドロキシ置換されており
；ａ　ａ　？は炭素原子数２〜６個、通常炭素原子数３
〜５個の脂肪族アミノ酸であって、これは非極性又は極
性であり、特にプロリン又はカルボキサミド置換されて
おり； ａ　ａ　：Ｉｌ＋は炭素原子数３〜５個の脂肪族極性ア
ミン酸であって、通常アミド又はヒドロキシ置換されて
おり； ａａ：１９は炭素原子数２〜６個の脂肪族非極性アミノ
酸であり； ａ　ａ　４０の炭素原子数４〜５個の脂肪族酸性アミノ
酸又はそのアミドであり； ＸＳは結合、ヒドロキシ、炭素原子数１〜３個のアルコ
キシであり、ここでＸ５は配列の末端に位置し、Ｂａ、
にもしくは抗原への連結である。

記号のための次の定義が特に興味深い。

ａａ２３−Ｆ、Ｈ，Ｙ、Ｎ、Ｑ ａ　ａ　２４　＋　２　’　＋　２９＋　３°−Ｖ、Ｌ
、１ａａ２５”８−３　、　Ｔ　、　Ｎ　、　Ｑａａ”
”２−Ｇ　、　Ａ　、　Ｋ　、　Ｒａａ”−Ｐ　、　Ｓ
　、　Ｔ ａａ″’−Ｐ、Ｎ、Ｑ ａａ３８−３．Ｔ、Ｎ、Ｑ ａａ”　　Ｇ、Ａ、Ｐ、Ｖ、Ｌ、１ ａａ４０−Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ アミノ酸は次のように分類される。

Ｊ１１芙 非血牲　　　Ｇ、Ａ、Ｐ、Ｖ、Ｌ、Ｉ ＬｊｉＳ　、　Ｔ　、　Ｍ　、　ｃ　、　Ｎ　、　Ｑ償
−立　　　　Ｄ、Ｅ 塩基性　　　　Ｋ、Ｒ 芳３己欠　　　　　Ｆ、Ｈ，Ｙ、Ｗ 上記の弐から明らかなように、生理学的活性に有意な影
宮を与えることなく上記の配列中に種々の保存的置換を
行うことができる。さらに、１〜２個のアミノ酸の除去
及び挿入を用いることができる。通常、５個以下、通常
３個以下の変化（置換除去又は挿入）が上記の配列中で
行われるであろう。

この発明において使用するために特に興味あるのは次の
配列： Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａ
ｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　ＣｙｓＣｙｓ　　Ｖａｌ　　Ｌ
ｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　　Ａ
ｒｇ　Ｐｒ。

Ｈ４ｓ　Ｉｃｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｖ
ａｌ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　ＡｌａＰｒｏ　１ｌｉｓ　Ｃｙ
ｓ　　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　　
Ｉｌｅ　ＡｌａＬｅｕ　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａ
ｒｇ　Ｌｙｓ　　ｌｉｅ　Ｃｙｓ　　Ｌｅｕ　ＡｓｐＧ
ｉｎ　　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ　　Ｔｙｒ　　Ｌ
ｙｓ　　Ｌｙｓ　　ｌｉｅ　　Ｉｌｅ　　ＬｙｓＬｅｕ
　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｓｅｒを有する化合物又はそ
の類似体、特に、およそそれらの該当する位置に４個の
システィン、及びＣ−末端又はその近位に１２個のアミ
ノ酸、特にＣ−末端に近位に１０個のアミノ酸、そして
さらに特定すればＣ−末端に近位に８個のアミノ酸（４
個の塩基性及び４個の中性脂肪族アミノ酸を含む）を含
有する類似体又は断片である。上記の組成物の類似体は
通常約８０％以上、さらに普通には約８５％以上、そし
て好ましくは約９０％以上の、上記配列又は上記配列の
部分中と同じアミノ酸を有する。

この発明において使用される天然ポリペプチド組成物は
、鋭敏なバイオアッセイにより確立されるように、高純
度で得ることができる。天然ポリｅｕ Ａｒｇ ｔｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ ペプチド組成物は、約２０重量％未満、さらに普通には
約１０重量％未満、そして好ましくは約５重社％未満の
、該組成物中に存在する主成分以外のポリペプチドを含
むであろう。この汚染ポリペプチドは血小板と関連する
。

この発明のポリペプチド組成物は種々の生理学的活性を
有する。この発明の組成物はイン−ビトロ及びインービ
ボにおいて腫瘍の増殖を阻害するために使用することが
できる。この組成物はまた、ｐｐ６０ｓｒｃのオートホ
スホリレーションを刺激するために使用することができ
る。従って、この組成物はｐｐ６０ｓｒｃ酵素の基質と
して機能することができ、そしてポリペプチドのチロシ
ン位置（残、１６０）においてリン酸化され得る。さら
に、オンコスタチン−Ａにより処理された場合、腫瘍細
胞は５２ｋＤ蛋白質を放出するように誘導され得る。さ
らに、オンコスタチン−Ａ又は類似体、それらの断片、
又は競争的免疫学的性質を有するサブ−配列（断片）を
含有する融合蛋白質は、モノクローナル抗体の製造のた
めに使用され得、あるいは、オンコスタチン−Ａもしく
は免疫学的に競争的な化合物又はオンコスタチン−への
ための細胞表面レセプターの存在を検出するだめの診断
測定における試薬として機能し得る。

この発明の化合物は、腫瘍阻害のために高い活性を有す
る。この組成物は不ノニ旦上旦及び不ｌビポにおいて、
新生物細胞の増殖速度を低下せしめるために使用するこ
とができる。このポリペプチド組成物は、ｌｎｇレベル
において約２０％以上の、１ｌｆｌ　ｍ細胞増殖の、特
に、肺、乳房、皮膚等の癌及び肉腫の阻害をもたらすこ
とができる。好ましくは、このポリペプチド組成物は、
実験の部に記載されているコロニー阻害試験に従えば、
約４０％以上、そしてさらに好ましくは約５０％以上の
腫瘍細胞増殖の阻害をもたらすであろう。

この発明の組成物は、新形成（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）を
有することが疑われる宿主に投与されることにより、イ
ンービボにおいて使用され得る。この組成物は、増殖の
速度を低下せしめるため新生物部位、例えば黒色腫に適
用され得る。適用の方法は、腫瘍の部位、この組成物の
剤形、投与量レベル等に依存して、注射、カテーテルに
より導入、直接適用等を包含する。投与量は、それが全
身的か局所的かに依存して変化し、投与量濃度は一般に
約０．１　ｔｒｇ〜ｌｏｏｏＩ１ｇ／ｋｇであり、そし
て霊長類を含む大形哺乳動物のための全投与量は、治療
投与当り約０．０１〜ｌＯ■である。

オンコスタチン−Ａ及びその同類物を包含するオンコス
タチン−Ａ様物質（同類物とは、オンコスタチン−への
少なくとも１つの生理学的性質を有し、そしてオンコス
タチン−Ａのアミノ酸配列と実質的に同じ少なくとも１
つのアミノ酸配列を含有する化合物であり、ここで同類
物はオンコスタチン＝Ａより多くの又は少ない数のアミ
ノ酸を有する）は、生理学的に許容される担体、例えば
リン酸緩衝化塩溶液、蒸留水、賦形剤又はこれらに類す
るもの中に製剤化することができ、又はそのまま使用す
ることができる。

オンコスタチン−Ａ及びその同類物は、新生物細胞の存
在を検出するために間接的に使用するごとができる。細
胞が約１〜５００ｎｇ／＃ｌｉ！活性剤、好ましくは約
５０〜３５０ｎｇ／ｒｄ、の活性剤の濃度にかけられる
場合、その新生物細胞によって５２ｋＤ蛋白質（ｐ　５
２）が分泌される。従って、外部媒体、例えば栄養培地
、血液、尿、又は他の生理学的液体へのｐ５２の分泌を
検出することによって新生物細胞の存在を検出すること
ができる。従ってオンコスタチン−Ａは宿主の状態及び
新生物状態の存在を監視するために使用され得る。オン
コスタチン−Ａは、監視手術における腫瘍の存非、新生
物のレベル等を診断するために使用され得る。オンコス
タチン−Ａはｐ５２の分泌の誘導をもたらすために十分
な星において、４７二旦上旦又はインービボにおいて（
培地又は宿主に）投与されるであろう。

次に、系に関連する液が、新生物細胞の存在の指橙とし
てｐ５２の存在について監視されるであろう。

オンコスタチン−Ａ様物質はまた、それ自体により、し
かし好ましくは他のリンホカイン、例えばインターフェ
ロン、さらに特定すればγ−インターフェロンと組み合
わせて免疫系を刺激するために使用され得る。すなわち
、オンコスタチンＡ様物質は他のポリペプチドと配合さ
れ、そして免疫系を刺激するために免疫抑制された宿主
に投与され得る。γ−インターフェロンは、単球及びマ
クロファージ、並びに他の組織、例えば内皮及び線維芽
細胞において、■、の発現を誘導することが知られてい
る。オンコスタチン−Ａ様物質は■１発現を誘導しそし
てγ−インターフェロンＩ□誘導を刺激してγ−インタ
ーフェロンの所与の投与量効果を増強する。オンコスタ
チン−Ａ様物質の量は一般に媒体中に約１〜２００、好
ましくは約２〜１０ｎｇ／ｒａｎの範囲の濃度をもたら
すように使用される。Ｔ−インターフェロンの量はその
使用について、リンホカインが一般に約０．５〜２００
　ｎｇ／−の範囲であるように、常法通りであろう。約
１、５倍以上、通常約２倍以上の発現の増強がオンコス
タチン−Ａ様物質により、それがそれ自体として又は他
のリンホカインと組合わせて使用された場合に、達成さ
れる。前記のように投与が行われ得る。

オンコスタチン−Ａ様物質はまた、キナーゼ、特にｐｐ
６０ｓｒｃと組合わせて、該酵素の基質特異性を変える
ために使用することができる。特に、該酵素を少量のオ
ンコスタチン−Ａ様物質と、特に約０．０５〜５０ｘ／
Ｉｎｌの濃度において接触せしめることにより、キナー
ゼ活性が増強され、これにはリン酸化される観察される
アミノ酸の変化が含まれ、特にすＵシ・ン゛がリン酸化
されるほかにセリンもリン酸化される。こうして、ｐｐ
６０ｓｒｃ又は類似のキナーゼとの組合わせが、チロシ
ン及びセリンの両者の増強された比率でのリン酸化をも
たらすことにより、チロシン及びセリンアミノ酸を有す
るポリペプチドを修飾するために使用され得る。

この発明のオンコスタチン−Ａ様物質はまた、ハプテン
又は抗原として、例えば免疫原性相乗剤、例えば抗精子
又はこれらに類するものと連結されたハプテンとして、
モノクローナル抗体又はポリクローナル血清の製造のた
めに使用され得る。これらの抗体は広範囲に、゛特に診
断目的に使用することができる。該抗体はそれ自体によ
り、又はオンコスクチンーＡ様物質として、オンコスタ
チンＡ、及びオンコスタチン−Ａに対する抗体を包含す
るオンコスタチン−Ａレセプターの検出のための試薬と
して使用することができる。

注目の分析対象を決定するために種々の処方及び技法を
用いることができる。これらの技法は、酵素、放射性核
種、螢光剤、化学発光剤、酵素基質、酵素阻害剤、粒子
、及びこれらに類するものを含む種々の標識を用いる。

これらの方法は分離段階を含む（不均一）か又は分離段
階を含まない（均一）ことができる。標識はオンコスタ
チンＡ様物質又はオンコスタチン−Ａ様物質に対する抗
体（抗−オンコスタチン−Ａ）に共有結合されるか、又
は抗−オンコスタチン−Ａ、例えば抗オンコスタチン−
ＡのＦｃに向けられた抗体に接合される。全体抗原、又
はＦａｂ　、　　Ｆ（ａｂ）’１□　　、Ｆｖ、もしく
はこれらに頻するものを包含するその断片を使用するこ
とができる。この発明において使用され得る種々の診断
技法を記載する多数の米国特許が発行されている。これ
らの特許の少数の例は米国特許Ｎα３，７６６、１６２
、Ｎα３，７９Ｌ９３２、阻３．８１７，８３７、Ｎα
３．９９６，３４５、及びＮα４，２３３．４０２であ
る。特定のタイプの測定法にはＲＩＡ、　ＥＩＡ。

ＥＭＩＴＯヒＬＩＳＡ、　５ＬＦＩＡ、　ＦＩＡが包含
され、これらのすべては商業的に適用されており、そし
てそのための試薬が他の分析対象のために入手可能であ
る。キットにおいて種々の試薬を用いることができ、ご
の場合、測定の感度を最適化するように試薬の種類及び
それらの相対量が選択される。

抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル血清の
調製に依存して常法において調製することができる。各
場合において、適当な宿主に注目の１又は複数のエピト
ープ部位を有する免疫原が注射され、通常はこれに続い
てｌ又は複数の追加免疫注射が行われるであろう。ポリ
クローナル抗血清のためには宿主が採血され、そしてグ
ロブリン画分が単離される。この免疫グロブリン画分は
アフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製す
ることができる。モノクローナル抗体のためには、宿主
が前記のように免疫感作されるが、しかしこの場合には
通常肺臓が摘出され、そして適切な融合パートナ−と融
合せしめられるであろう。所望の抗体を発現するハイプ
リドーマの選択の後、このハイブリドーマを限界稀釈に
かけ、そして次に選択及びクローニングを行い、そして
さらに特徴付ける。

この発明の抗体は、天然に存在する任意のタイプ、例え
ば［ｇＡ、　ＩｇＤ、　ＩｇＥ、　ＩｇＧ及びＩｇＭ、
特にＩｇＭ　、そしてＩｇＧの種々のサブタイプ、すな
わちＩｇＧ１．２．３又は４であることができる。

生ずるモノクローナル抗体は、オンコスタチンＡタイプ
の物質にコンホーメーションの類似性を有するであろう
抗−イデオタイブ抗体の製造のための免疫原として使用
され得る。次にこれらは、種々の用途において、オンコ
スタチン−Ａタイプの物質のための代替試薬として使用
され得る。

オンコスタチン−Ａは、約０．３　Ｍエタノール性塩酸
による血小板の抽出により得ることができる。

分解に対する阻害剤として、フェニルメチルスルホニル
フルオリド及びアプロチニンも導入することができ、前
者は抽出組成物の約１〜１０重世％のレベルにおいて、
そして後者は抽出組成物の約０、１〜Ｉ　　ＴＩＵ／ｍ
ｇ（ＴＴｔｌ・・・トリプシン阻害ユニット）のレベル
において導入される。水性水酸化アンモニウムを用いて
ｐＨを約５に上げた後、小量の酢酸アンモニウムを加え
、そして遠心分離又は他の便利な手段により溶液を清澄
にする。

次に、冷エタノール（９５％）及びエーテルを火成に用
いて蛋白質を沈澱せしめ、該沈澱を集め、そして約３．
０００Ｍｒ以下のカットオフを有する透析膜を用いて０
．１〜０．５Ｍ酢酸に対して透析する。

残渣を凍結乾燥し、１Ｍ酢酸中に再懸濁し、清澄にし、
そして次にバイオゲルＰ−１０を用いるゲル透過クロマ
トグラフィーによりさらに精製するために用意する。生
成物を約ＩＭの酢酸により溶出しそして種種の両分を適
当な測定技法、例えばＩｌ！１瘍増殖阻害を用いて監視
する。

増殖阻害活性を有する両分を凍結乾燥し、トリフルオロ
酢酸希水溶液（ｐＨ２〜３）に再懸濁し、清澄にし、そ
して次に高圧液体クロマトグラフ上でクロマトグラフ処
理し、この場合シリカ充填物は約１６〜２０個の炭素原
子、例えば１８個の炭素原子の長脂肪族鎖の被膜を有す
る。カラムは希トリフルオロ酢酸（０，０２〜０．１％
）で平衡化し、そして生成物は、希（０，０１〜０．１
％、通常約０．０４〜０．０５％）トリフルオロ酢酸中
６０％アセトニトリルまでのアセトニトリルグラジェン
トにより溶出する。

比較的ゆるやかな流速、一般に周囲温度において約０．
５〜ｌｄ／分が用いられる。両分は前記のバイオアッセ
イ又は他のバイオアッセイにより測定することができる
。さらに精製するため、カラムから得られた生成物は高
圧ゲル排除クロマトグラフィーを用いて精製することが
できる。

ツババック（Ｎｏｖａｐａｋ）　　Ｃｌｅ逆相液体クロ
マトグラフィーにより分離されたオンコスタチン−Ａ活
性の主ピークを凍結乾燥し、そして０．１％トリフルオ
ロ酢酸を含有する４０％アセトニトリル１００μｌ中に
再懸濁する。サンプルをヒドロキシル化ポリエーテルゲ
ルカラム（ビオラドＴＳに−２５０）中に注入し、そし
て０．１％トリフルオロ酢酸中に４０％アセトニトリル
を含有する移動相により溶出する。各両分のアリコート
を凍結乾燥し、そしてオンコスタチン−Ａ活性について
試験する。腫瘍細胞阻害活性が主ペプチドピーク（Ｒ，
−０，９）と共に同時？容出し、これはまた、このクロ
マトグラフ系に目安を付するために使用された６、００
０Ｍｒインシュリンマーカーのそれに分子量において対
応する。

カラムから得られた生成物をＳＯ３−ｒ’ＡＧＥを用い
て電気泳動することができる。約６，０００〜８，００
０の分子量におけるバンドを単離する。このバンドは、
哺乳類新生物細胞に対する強い増殖阻害活性を有するこ
とが示される。

天然源からのオンコスタチン−Ａの単離又は固体単体上
での該ポリペプチドもしくはその類似物の合成の代りに
、オンコスタチン−ＡはバイブリドＤＮＡ技法により調
製することができる。オンコスタチン−Ａの構造遺伝子
は、アミノ酸配列に基いて調製されたプローブを用いて
宿主細胞ゲノムから得ることができる。このプローブ（
適切に冗長であろう）を用いてゲノムライブラリーを調
査し、ハイブリダイズする断片を単離し、そして該断片
のサイズを小さくし、そして制限地図の作製及び配列決
定により特徴付ける。

他の方法として、同様にしてゲノムライブラリことがで
き、後者は欠失したコドンを補充するためのアダプター
を用いることによって使用する。

便利には、合成遺伝子を合成することができる。

合成遺伝子を用いることにより実質的な柔軟性が達成さ
れ、宿主に好ましいコドンを用いそしてユニーク又はま
れな制限部位を導入することができる。制限部位は、欠
失、トランジション、トランスバージョン、挿入等を導
入して遺伝子の種々の部分を変形する場合に一定の程度
の柔軟性を加える。ヘテロデュプレックス形成を妨害し
ないでハイブリダイジエーション連結媒体中に混合する
ことができる単鎖オーバーラツプ断片を用いるストラテ
ジーを工夫する。次に、生じた２本鎖遺伝子をクローン
化しそして精製することができる。例示的配列を実験の
部に示す。

好ましくは、挿入に際して適切な方向を保証するために
遺伝子の末端は異る。この遺伝子は発現のために適切な
発現ベクターに挿入することができる。原核生物及び真
核生物、例えば菌類、例えば酵母、哺乳動物細胞、例え
ばマウス細胞、霊長類細胞等における発現のために多数
のベクターが使用可能である。複製系はプラスミド、ウ
ィルス又は染色体に由来することができる。代表的な複
製系はＣｏ１Ｅ１　、ラムダ、Ｒ５ＦＩＯＩＯ，２声プ
ラスミド、ＳＶ４０、アデノウィルス、ウシ乳頭腫ウィ
ルス等を包含する。

エピゾーム性維持が望ましい場合（組み込みが必要な場
合には複製系は必要でない）には少なくとも１つの複製
系のほかに、目的遺伝子を含有する宿主の選択を可能に
するマーカーが通常存在するであろう。このマーカーは
通常殺生物耐性をもたらし、例えば抗生物質もしくは重
金属、又は補完、栄養要求宿主への原栄養性をもたらす
であろつ。

構造遺伝子は、通常、ボＩＪ　ＩＪンカー（多数の制限
部位を有する配列）への挿入により、発現宿主により認
識される転写及び翻訳開始及び終止制御領域間に位置す
るであろう。転写開始領域の適切な選択により、転写は
構成的であり又は誘導的である。多数のプロモーター領
域、例えばＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ｔ　ｒ　ｐ及び
Ｉａｃプロモーター、ラムダＰＬ及びＰ、プロモーター
、酵母解糖系酵素プロモーター、ＳＶ４０及びアデノウ
ィルス初期及び後期プロモーター、並びにこれらに類す
るものが単離され、そして有用であることが示されてい
る。

さらに、分泌リーダー及びプロセシングシグナルをコー
ドする５′−配列を構造遺伝子に与えることにより融合
遺伝子を調製することができる。

記載されている代表面な分泌リーダーには、ペニシリナ
ーゼの分泌リーダー、α−ファクター、免疫グロブリン
、Ｔ−細胞レセプター、外層膜蛋白質、及びこれらに類
似するものが包含される。適切なリーディングフレーム
への融合により、成熟オンコスタチン−Ａ又は類似物が
培地中に分泌され得る。

構造遺伝子及び発現の制御をもたらすフランキング領域
を含有する造成物を、便利な手段、例えば、リン酸カル
シウム沈澱したＤＮＡを用いるトランスフォーメーショ
ン、トランスフェクション、トランスダクション、接合
、マイクロインジェクション等により、発現宿主に導入
することができる。次に、宿主を適切な栄養培地中で高
密度に増殖せしめることができる。プロモーターが誘導
性である場合、許容状態、例えば温度変化、代謝生成物
もしくは栄養の枯渇もしくは過剰、又はこれらに類する
ものを用いることができる。

生成物が宿主中に保持される場合、細胞を収得し、溶解
し、そして抽出、沈澱、クロマトグラフィー、電気泳動
等により生成物を単離しそして精製する。生成物が分泌
される場合、栄養培地を集め、そして常法、例えばアフ
ィニティークロマトグラフィーにより生成物を単離する
ことができる。

構造遺伝子配列は、発現のために使用されるほか、デュ
プレックスする配列のハイブリダイゼーション及び検出
のためのプローブとして使用することができる。例えば
、宿主細胞中のｍＲＮＡの存在及び量を検出することが
できる。

次の例は限定的にではなく例示的に与えられる。

実−ｍ＝１ 略号：　ＤＭＥＭ・・・ドゥルベコの改良イーグル培地
；ＰＳＢ・・・リン酸緩衝化塩溶液、Ｐ／Ｓ・・・ペニ
シリン／ストレプトマイシン（各０．５７ｉｔｇ／ｄ）
　　；　Ｆ　Ｃ３・・・ウシ胎児血清；　　５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ・・・ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動。

オンコスタチン−Ａの精製 ヒト−”の　−エ　ノール 新鮮な、又は凍結され室温で解凍された血小板（湿重ｉ
５０ｇ）を２倍容量の：３７５戚エタノール（９５％）
、７．５−濃Ｈ（１，３３ｍフェニルメチルスルホニル
フルオリド及び１　ｍｆｔのアプロチニン（２３ＴＩＩ
Ｉ／ｄ　；ウシ肺由来・・・シグマケミカル社へ６０１
２）に再懸濁した。この混合物を４°Ｃにて一夜攪拌し
、ベックマンタイプ１９０−ター中で８　ｋｒｐｍにて
３０分間遠心分離し、そして上清を取り出した。

この上清のｐＨを濃水酸化アンモニウムにより４．０に
調整し、そしてこのｐＨを１：１ｍ釈の濃水酸化アンモ
ニウムを用いて５．２に上げた。０．１１の上清当りｌ
ｄの２Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ１５，２）を加えた後
、この溶液をタイプ１９０−ター中で８ｋｒｐｍにて３
０分間遠心分離した。上清を除去し、２倍容量の冷９５
％エタノールを加え、次に４倍容量の冷ジエチルエーテ
ルを加え、そしてこの混合物をＯ″Ｃにて一夜放置した
。タイプ１９０−ター中で８　ｋｒｐｍにて３０分間遠
心分離することにより沈澱を集め、そしてペレットを約
１０〜２０緘の１Ｍ酢酸に懸濁した。酢酸分散体を、ス
ペクトラポール（Ｓｐｅｃ　ｔｒａｐｏｒ）透析膜（＃
３）チューブ（カットオフ３，５００Ｍｒ）　（アマ−
ジャム・サイエンティフィック・プロダクツ）中で、５
１ずつ２回交換の０．２Ｍ酢酸に対して十分に透析した
。抽出物を透析し、７、５　ｍｌの１Ｍ酢酸中に再懸濁
し、次に３０ｋｒｐｍにて遠心分離した。

ゲル　゛クロマトグラフィー ビオゲルＰ−１０（２００〜４００メツシュ；ビオ・ラ
ド・ラプス）を１Ｍ酢酸中で一夜膨潤せしめ、十分に脱
気し、そして次に１００　Ｘ　２．５　ｃｍのシリコン
処理されたガラスカラムに注入し、そして１Ｍ酢酸によ
り一夜平衡化せしめた。

２９ｇのヒト血小板からの酸−エタノール可溶化ペプチ
ド（５０〜７０ｍｇの蛋白質）を７．５　ｄの１Ｍ酢酸
に溶解し、そして上記のカラムに適用した。画分（３，
５＋Ｊりを集め、そしてアリコートを凍結乾燥し、そし
てＡ３４９ヒト肺癌細胞への５　　１２Ｓｌ−ヨウドー
２′−デオキシウリジンの導入の阻害について二式験し
た。

官　　　クロマトグラフィー 上記のカラムからの腫瘍増殖阻害活性のピークを含む両
分（蛋白質２００ｎｇ）を凍結乾燥し、そして０．０５
％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸中に再懸濁した。

次に、カラムを、２３°Ｃにて０．８　ｍｌ　７分の流
速において、０．０４５％のトリフルオロ酢酸中ア七ト
ニトリルの０．６０％直線グラジェントにより溶出した
。

各両分のアリコートを凍結乾燥し、そして上記のように
して３回測定した。

次に、阻害活性を含有する両分を０．１％トリフルオロ
酢酸を含有する４０％アセトニトリル中に溶解し、そし
てヒドロキシル化ポリエーテルゲルカラム（ビオ・ラド
・ＴＳＫ−２５０）に適用し、そして０．１％トリフル
オロ酢酸中４０％アセトニトリルの移動相により溶出し
た。画分を集め、凍結乾燥し、そして増殖阻害活性につ
いて３回測定した。活性はインシュリンマーカーが溶出
する両分中に溶出し、そして６〜８ｋＤの分子量に対応
する。

次に、最も高い活性を存する両分を、ＳＯ５−ＰＡＧＥ
を用いて次のようにして電気泳動した。

逆相ＨＰＬＣ精製段階からの主たるオンコスタチン−Ａ
活性に相当するペプチドを凍結乾燥し、１２．５ｍＭ　
　Ｔｒｉｓ−（Ｊ　ｐＨ６，７，４％ＳＯＳ、　１０％
β−メルカプトエタノール、２０％グリセリン及び０．
０１％ブロムフェノールブルーを含有するサンプル調製
緩衝液０．０３ｄ中に再懸濁しそして沸騰せしめた（２
分間）。このサンプルを、０．１％ＳＯＳを含有するｐ
Ｈ８，８の１７〜２７％ポリアクリルアミドグラジェン
トスラブゲル上に注加された５％ポリアクリルアミド重
層ゲル上に負荷した。サンプルが重層ゲルを通って移動
するまで１０ミリアンペアにて、そして染料フロントが
ゲルの底に移動するまで２０ミリアンペアにて、ゲルの
泳動を行った。ゲルを固定し、そして０．２％クーマシ
ーブルー、５０％メタノール及び９％酢酸の溶液中で一
夜染色した。脱染色の後、ホッファ−（Ｉｌｏｆｆｅｒ
）デンシトメーターを用いてクーマシー陽性バンドの位
置を決定した。マーカーはインシュリン（６，ＯＯＯＭ
ｒ）　、）リプシノーチン（２４，５００Ｍｒ）、ＲＮ
アーゼ（１３，７００Ｍｒ）、及びアプロチニン（６，
５００Ｍｒ）を包含した。主ペプチドは、これらの電気
泳動条件下で６，５００Ｍｒアプロチニン標準と共に泳
動した。

使用された測定法は次の通りであった。２日目の朝に、
Ｎｕｎｃ　９６ウエルプレート（Ｋａｍｓ　ｔｒｕｐｒ
ｅ　ｊ９０、Ｄに−４＋　０００．　Ｒｏｓｋｉｌｄｅ
、チンマーク）中に＾５４９細胞（ヒト肺癌）が生じた
。これらの細胞は３０より少ない場合継代された。周囲
のウェルを除くすべてのウェルに４５，０００細胞１５
０μｌ／ウエル（１０％ＦＣＳ　、　Ｐ／Ｓ、グルタミ
ンを含むＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　ｍｌ当り９×１０４細胞）を
導入した。周囲のウェルには５０ｍのＰＢＳを入れ、そ
してプレート全体を３７°Ｃにてインキュベートした。

午後、１０％ＦＣＳ、　Ｐ／Ｓ、グルタミンを含むＤＭ
ＥＭ中に試験サンプルを再懸濁し３連試験を行った。各
試験ウェルに５０μｌを与え、他方、対照ウェルには５
０μｌ　ＤＭＥＭを与えて、プレートを３７°Ｃにて３
日間インキュベートした。４日目に、　＋′Ｉ−ヨード
ー２′−デオキシウリジン（４Ｃｉ／ｌ１１ｇ　　０．
５ｍＣ１／ｍ１）の溶液（ＩＩ／アイソトープ／１０％
ＦＣＳ、　Ｐ／Ｓ、グルタミンを含むＤＭＥＭｕｆり　
５０ｍ１を加え、そしてプレートを３７°Ｃにて一夜イ
ンキユベートした。５日目に、培地をウェルから吸引し
、ＰＢＳで１回洗浄し、１００μｌのメタノールを加え
、このメタノールを１０分間放置し、次にメタノールを
吸引した。次に、ウェルに、１Ｍ水酸化ナトリウム２０
０Ｉｉ１を加え、プレートを３７′Ｃにて３０分間イン
キユヘートし、そして次にタイターチックプラグ（Ｔｉ
ｔｅｒｔｅｋ　ｐｌｕｇ）　（フロー・ラプス）により
１Ｍ水酸化ナトリウムを取り出した。

次に、このプラグをガンマ−カウンター中で放射能につ
いて計数した。

上記のようにして調製されたオンコスタチンＡの有効性
を証明するため、次の試験を行った。この試験を軟寒天
コロニー阻害と称する。使用される材料は、５％寒天（
３，７５ｇノーベル寒天（デイフコ）］、１２５　ｍｆ
ｌのＷｈｅａ　ｔｏｎビン中でオートクレーブされた蒸
留水７５ｍ！、１０％ＦＣ５を含むＤＭＥＭ、１００Ｕ
ペニシリン、１０００ストレプトマイシン、２００ｍＭ
グルタミン、及びヒト黒色腫細胞（Ａ３７５）である。

試験されるべき材料を１２　Ｘ　７５ｍｍの無菌試験管
中で凍結乾燥する。ＤＭＥＭを用いて５％寒天の１＝１
０稀釈物を作りそして水浴中で４６“Ｃに加熱する。６
ウエルｔ＝ｉプレー１・（３５Ｘ１４ｍｍ）の各ウェル
に０．５％寒天溶液１　ｍｌをピペット注入することに
より基層を調製する。この層を、それが硬化するまで、
室温にて放置する。トリプシン処理することによりＳＡ
６細胞を調製し、そして細胞数を計数する。細胞をｌＸ
ｌ０’細胞／戒の最終濃度に稀釈し、そして０．３５ｍ
の細胞を各試験サンプル管に加える。

１０本の試験サンプル管のそれぞれに０．７５０ｍｆの
０．５％寒天溶液をピペット注入し、混合物をゆっくり
回転させ、そして試験サンプル管の内容物（試験サンプ
ル、細胞、寒天）を基層上に注加し、そして寒天が硬化
するまで約２０分間室温に放置する。次に、プレートを
、５％二酸化炭素を伴う３７°Ｃの加湿室中に貯蔵する
。

試験材料の力価に依存して３日後ＩＯ日まで、コロニー
増殖の阻害についてプレートを点検する。

コロニーの数を、無作為な８個の低倍率顕微鏡視野中で
計数する。プレートが５日以上にわたって保持されるべ
き場合には、さらに１戚の０．３％寒天溶液の層を試験
サンプル層上に重層することにより試験サンプル層の乾
燥を防止する。

種々の濃度の精製されたオンコスタチン−Ａを用いなが
ら、上記の方法を使用した。下記の表はその結果を示し
、示されているオンコスタチンＡの量は、試験管に導入
された凍結乾燥された量である。結果は、最大阻害％と
して報告されている。

０．８ ２．６ 上記の結果から、この発明のポリペプチドが細胞増殖の
有効な阻害剤であることが明らかである。

黒色腫細胞を用いて観察されたこの結果に基いて、的５
０％の阻害をもたらすために約１ｎｇで十分である。従
って、この化合物は、新生物細胞増殖を包含する細胞増
殖の阻害において、広範囲の用途を有する。例えば、こ
の化合物はまた、次の表に示されるように、種々の培養
されたヒト腫瘍細胞を阻害するが、正常な非新生物性ヒ
ト包皮綿維芽細胞を阻害しない。

Ｌ−ｍ−ｉ 形質転換された ヒト肺癌（八５４９） ヒト肺腺癌（Ｈ１２５） ヒト黒色腫（Ａ３７５） ヒト乳癌（ＭＣＦ−７） 形質転換されていない ヒト包皮綿維芽細胞（ｌｌｕＦｌ）６）（ネ）記載され
た測定条件を用いて、オンコスタチン−Ａの飽和濃度（
１００ｎｇ／ウェル）において観察されるへ５４９細胞
への１２５１−デオキシウリジンの取込の最大阻害は未
処理対照培養物に対して５０％を超えない。

若い（８〜１０遇齢）の無胸腺マウスに、１００μ！の
リン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）中に懸濁された５×１０
ｂ個のヒト肺癌細胞（Ａ５４９）を鼠径部の皮下に注射
した。接種の７日後、直径２．５〜３．０胴の触知可能
な腫瘍が発生した。この集団から腫瘍担持マウスを無作
為的に選択し、そして７日日に、前記のようにしてヒト
血小板から均一に精製したオンコスタチン−Ａｏ、３０
ｑを含有する５０ＩｌｌのＰＢＳを、腫瘍部位上の皮下
に注射した。オンコスタチン−Ａを含まないＰＢＳの腫
瘍担持対照マウスへの注射は腫瘍の増殖に効果を与えな
かった。次に、腫瘍担持マウスに、Ａ３４９細胞の注射
後の後１１日及び１６日日日、５０ｐｌのＰＢＳ中同量
のオンコスタチン−Ａを注射した。オンコスタチン−へ
のこれらの投与は、３０１／２”ｇ針を用いて、腫瘍塊
中に直接注射した。キャリパ−により水平寸法及び垂直
寸法の両者について腫瘍を測定することにより、示され
た日に腫瘍の大きさをモニターした；（ａ）縦座標に示
す腫瘍サイズはこれら２つの寸法の積を示す。結果を第
１図に示す。

オンコス　チン−Ａによ　　　　れたヒトヒト肺癌細胞
（Ａ５４９）をオンコスタチン−Ａ　（２００ｎ　Ｂ　
／　ｍｌ培養物）で処理し、そして細胞培養上清中に放
出されるポリペプチドに対する効果を決定した。処理さ
れた培養物及び対照培養物（オンコスタチン−Ａ無し）
を、０時〔オンコスタチン−Ａ又は培地のみ（対照）添
加〕において３５Ｓ−メチ。

オニン（５／／Ｃｉ／ｍＩＳ、Ａ、　　８００Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌ）によりパルスした。１２時間後の培養上清を取
り出し、そしてまず低速（Ｌ５００ｘｇにて１５分間）
にて、次に高速（３０，０ＯＯＸ　ｇにて１時間）にて
清澄にした。

清澄にされた上清からトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）により
ペプチドを沈澱せしめ、次に１２．５％アクリルアミド
スラブゲル上でドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にかけた。

ゲルのラジオオートグラフィーはオンコスタチン−Ａに
より処理されたへ５４９細胞からの上清中に３５０、−
メチオニンでラベルされたポリペプチドが存在すること
を示し、他方、未処理癌細胞は最少壇のこの蛋白質を分
泌した（オンコスタチン−Ａ処理後、少なくとも１０倍
の増加が見られた）。処理された培養物と対照培養物と
の間に他の質的又は量的差異は見られなかった。

ｐｐ６０ｓｒｃを、Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ｔｌｓＡ　（１９７９）７６：６２６０−６２６４；　
Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ等、Ｃｏ１ｄＳ　　ｒｉｎ　　　ｌ１
ａｒｂｏｒ　　Ｓ　　ｍ　　、口ｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、
（１９７９）４４：９０２９１７に記載されているよう
にして、イムノアフィニティークロマトグラフィーによ
り精製した。５μ！の精製された酵素（約０．４７ｐｍ
ｏｌｅ）を１１００ｎの精製された均一なオンコスタチ
ン−Ａと、２０ｍＭ　ＡＴＰ、５ｍＭ　ＭｇＣ４，１０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−（／！　　（ｐｉｆ　７．２　）を含
む３０μｌの最終反応容積中で３０゛Ｃにて３０分間イ
ンキユヘートした。２倍量のサンプル緩衝液を添加する
ことによって反応を停止し、そしてＬａｅｍｍｅｌｉ、
Ｕ、に、。

Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）２２７　：６８０−６８５に
記載されているようにしてＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により分析した。スラブゲルのオートラジオ
グラフイーは、ｐｐ６０ｓｒｃのオートホスホリレーシ
ョンにおける１０倍の刺激を明らかに示した。ｓｒｃ酵
素において、ホスホリレーションの増加はチロシン残基
に限定されず、セリン位置にも見出された。

Ｗｅｈｉ−３は、ガンマ−インターフェロン（ｒ　−Ｉ
ＦＮ）によりＨ２クラス■抗原を発現するように誘導さ
れ得るマウスマクロファージ細胞系である。この誘導の
特徴は幾つかの研究室により研究され、そして正常なマ
クロファージ誘導の正確な再現であることが示されてい
る。

これらの細胞を少壇のＴ　−ＩＦＮの存在下又は非存在
下で、血小板オンコスタチン−Ａの幾つかの濃度を用い
て増殖せしめた。ｒ　−ＩＦＮの存在下又は非存在下の
いずれにおいても、オンコスタチン−Ａは、ＦＡＣ３上
での直接免疫螢光により測定した場合、クラス■抗原の
量依存的増強を示した。オンコスタチン−への効果の程
度は、用いられた濃度（〜２−７０ｎｇ／　ｒ／ｄｉ　
）においておよそ２倍であった。

オンコスタチン−Ａに対して特異的なモノクローナル及
びポリクローナル抗体の製造 オンコスタチン−Ａを細菌リポポリサッカライドに交差
リンクさせる方法は、Ｐｒ１ｍ１及びＣａｚｅｎａｖｅ
、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８２Ｎ２９　（３）：
１１２４−１１２９により開発された方法の変法である
。

Ｌｏｎｇのオンコスタチン−Ａ及び１２．５ｎｇの細菌
リポポリサッカライド（ＬＰＳ；シグマ＃Ｌ−２６３）
を１留水により５００Ｉの容量に稀釈した。ＰＢＳ中２
．５％のグルタルアルデヒド５０μｌを加え、そしてこ
の混合物を室温にて３０分間インキユヘートした。

ＰＢＳ中２Ｍグリシン５０μ！を加え、そして室温にて
１時間インキュベートすることにより反応を停止した。

オンコスタチン−Ａ：ＬＰＳ接合体を１０雁の混合され
たリンパ球条件調節された媒体で稀釈し、そしてフィル
ターをイン−ビトロ免疫感作において使用するために殺
菌した。

オンコスタチンとＬＰＳとの　人　によるＢａ１ｂ１？
ｅａｄｉｎｇ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、（１９８２
）　５３：２６１−２６９により記載された方法の変法
を用いて非免疫肺細胞をインービトロ免疫惑作した。

２％ラビット血清を含有するＤＭＥＭ中で同数のＢａ１
ｂ／ｃ及びＣ５７ブラツクマウス胸腺細胞を４×１０６
細胞／ｄにて４８時間培養することにより、混合された
リンパ球条件調節（ＭＬＣ）媒体を調製した。この媒体
を集め、そして−２０°Ｃにて貯蔵した。

チオグリコレート処理されたＢａ１ｂ／Ｃマウスを無菌
ＰＢＳでフランシヱすることにより腹腔滲細胞（ＰＥＣ
）を集めた。ＰＥＣ細胞を、１マウス相当の肺細胞、及
びＬｏｎｇのオンコスタチン−ＡＬＰＳ接合体を含有す
るＭＬＣ媒体１０１ｄと共に培養においた。細胞を７日
間培養した。

モノクローナル−Ｊ、遣 免疫肺細胞を集め、そして１：１の比率においてＳＰ　
２／１０骨ｆｆＪｉｌｌ！１細胞と融合せしめることに
よりオンコスタチン−Ａ特異的モノクローナル抗体を合
成するハイブリドーマを調製した。エンザイムリンクド
イムノアッセイ（ＥｌｊＳＡ）によりオンコスタチン−
Ａ抗体の生産についてハイブリドーマを試験した。限界
稀釈法により陽性ハイブリドーマを２回クローン化した
。クローンを展開し、免疫グロブリンクラスについて試
験し、そして腹水生産のためにＢａ１ｂ／ｃマウスに注
射した。

４０個の陽性ハイブリドーマクローンをまず展開し、そ
して抗−オンコスタチンーＡ活性について再試験した。

７個の最も反応性のクローンを使用してＢａ１ｂ／ｃマ
ウス中に腹水を生産した。残りを展開しそして凍結した
。腹水をＥＬＩＳＡにおいてオンコスタチン−Ａ１オン
コスタチン−ＡペプチドＫＬＨ接合体及びＢＳＡに対す
る特異性について試験した。

腹水は、オンコスタチン−Ａ１及びより少ない程度に、
１〜３０００の稀釈率におけるオンコスタチン−Ａペプ
チドの両者と反応した。免疫グロブリンを、Ｒｕ５ｓｏ
等、八ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８３）　６５：
２６９２７１により記載されているカプリル酸沈澱法に
より精製した。免疫グロブリンのパラボン分析及びオー
クテルロニー分析は、すべての免疫グロブリンがタイプ
ＩｇＭであることを示した。

オンコス　チン−ＡについてのＥＬＩＳＡオンコスタチ
ン−Ａを０．１　Ｍ酢酸中に稀釈し、そして１０ｎｇ／
ウェルを９６ウエルダイナテツクイムロンプレートにピ
ペット注入した。溶液を室温にて一夜乾燥した。ＰＢＳ
中２．５％ＢＳＡ、２．５％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）と
共にウェルを３７°Ｃにて１時間インキュベートするこ
とによりプレートをブロックした。次にこのプレートを
ＰＢＳ中２．５％ＦＣ３で２回洗浄した。次にハイブリ
ドーマ培地、免疫グロブリン又は抗血清を適当な稀釈に
おいて添加した。次にこのプレートを３７°Ｃにて２時
間インキュベートし、そしてＰＢＳ中２．５％ＦＣ５に
より３回洗浄した。製造者の指示に従ってベクターラズ
スのアビジン−ビオチン−１１ＲＰ　ＥＬＩＳＡ試薬を
使用した。各段階の間にウェルをＰＢＳ中２．５％ＦＣ
５により洗浄した。４μｌの３０％過酸化水素／１０ｍ
１溶液を含有する０、１Ｍクエン酸ナトリウム溶液中０
．４■／−オルト−フェニレンジアミンにより陽性ウェ
ルを可視化した。室温にて３０分間反応を継続せしめた
。５０４の１．４　Ｎ　ｆｂｓｏ４／ウェルを添加する
ことにより反応を停止した。

ポリクローナル　−オンコス　チン　　゛の遣 Ｂａ１ｂ／ｃマウスをニトロセルロース固定化オンコス
タチン−Ａにより免疫感作した。この免疫感作法の目的
は宿主によるポリペプチドの急速な排除を回避すること
である。こうして、非常に少量のオンコスタチン−Ａに
より免疫感作を行うことができる。

０、１　Ｍ酢酸中オンコスタチン−への溶液をニトロセ
ルロース（シュライヒエル＆シュエル、０．４５庫）の
小片に付着せしめ、そして放置乾燥した。

最初の免疫のために、ニトロセルロース片を３匹のＢａ
１ｂ／ｃマウスの腹腔に入れた（０．３７５ｎｇ／マウ
ス）。（マウスにさらに０．１　ｄの完全フロインドア
ジュバントを腹腔的注射した。マウスを２週間の間隔で
２回、オンコスタチンを固定したニトロセルロースによ
り追加免疫感作した。追加免疫のためには、ニトロセル
ロースを切断し、０．１　ｄの水及び０．１　ｄの不完
全フロインドアジュバントと共にホモジナイズし、そし
て皮下注射した（０．１２５ｎｇ／マウス）。マウス血
清を前記のＥＬＩＳＡ測定によりオンコスタチン−Ａに
対する特異性について試験し、第２段階の試薬としてホ
ースラデイツシュパーオキシダーゼ接合プロティンＡを
使用した。

特異性を示すため、血清をオンコスタチン−Ａペプチド
−Ｋ　Ｌ　Ｈ接合体及びブロックされたプレートに対し
て試験した。

常法に従って、次の配列を調製した。

ＮｃｏＩ　　　　　　　　　　　　　　　　Ｐｓｔｌ監
朋■　　　　　　　　　　　鉦田二 ＧＧ　ＴＡＣＣＴＴ　ＣＧＡ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＣＴＧ
　ＣＣＴ　ＣＴＡ　ＧＡＣＧＴＣＡＣＧＣＧＣＧＣＣＡ
ＴＧ　　ＧＡＡ　　ＧＣＴ　　ＧＡＡ　　ＧＡＡ　　Ｇ
ＡＣＧＧＡ　　ＧＡＴ　　ＣＴＧ　　ＣＡＧ　　ＴＧＣ
Ｎｉ＋。

臥１ ＧＡＣＡＣＧ　　ＣＡＴ　　ＴＴＴ　　ＴＧＡ　　ＴＧ
Ａ　　ＡＧＡ　　ＧＴＣＣＡＴ　　ＴＣＣＧＧＡ　　Ｇ
ＣＡ　　ＧＴＧＣＴＧ　　ＴＧＣＧＴＡ　　ＡＡＡ　　
ＡＣＴ　　ＡＣＴ　　ＴＣＴ　　ＣＡＧ　　ｅＴＡ　　
ＡＧＧ　　ＣＣＴ　　ＣＧＴ　　ＣＡＣｌｅｕ　ｃｙｓ
　ｖａｌ　Ｉｙｓ　ｔｈｒ　ｔｈｒ　ｓｅｒ　ｇｉｎ　
ｖａｌ　ａｒｇ　ｐｒｏ　ａｒｇ　ｈｉｓＸｈｏｌ　　
　　　　　　　Ｎａｅｌ ＴＡＧ　ＴＧＴ　ＡＧＴ　ＧＡＧ　ＣＴＣＣＡＴ　ＴＡ
Ｇ　ＴＴＴ　ＣＧＧ　ＣＣＧ　ＧＧＣＧＴＧ　ＡＣＧ　
ＧＧＣＡＴＣＡＣＡ　　ＴＣＡ　　ＣＴＣＧＡＧ　　Ｇ
ＴＡ　　ＡＴＣＡＡＡ　　ＧＣＣＧＧＣＣＣＧ　　ＣＡ
ＣＴＧＣＣＣＧ１１ｕ　ｔｈｒ　ｓｅｒ　ｌｅｕ　ｇｌ
ｕ　ｖａｌ　ｉｌｕ　ｌｙｓ　ａｌａ　ｇｌｙ　ｐｒｏ
　ｈｉｓ　ｃｙｓ　ｐｒ。

艷泪−計１− ＴＧＡ　　ＣＧＡ　　ＧＴＣＧＡＣＴＡＧ　　ＣＧＣＴ
ＧＡ　　ＧＡＣｍ　　ＴＴＧ　　ＣＣＡ　　ＧＣＡ　　
ＴτＣＡＣＴ　　ＧＣＴ　　ＣＡＧ　　ＣＴＧ　　ＡＴ
ＣＧＣＧ　　ＡＣＴ　　ＣＴＧ　　ＡＡＡ　　ＡＡＣＧ
ＧＴ　　ＣＧＴ　　ＡＡＧＬｈｒ　ａｌａ　ｇｌｎ　ｌ
ｅｕ　ｉｌｕ　ａｌａ　ｔｈｒ　Ｉｅｕ　ｌｙｓ　ａｓ
ｎｇｌｙ　ａｒｇ　Ｉｙｓ伽ｕＬ沖廷−−Ｐｓｔｌ ＴＡＧ　　ＡＣＡ　　ＧＡＴ　　ＣＴＧ　　ＧＡＣＧＴ
ＣＣＧＡ　　ＧＧＣＧＡＣＡＴＧ　　ＴＴＴ　　ＴＴＴ
　　ＴＡＧＡＴＣＴＧＴ　　ＣＴＡ　　ＧＡＣＣＴＧ　
　ＣＡＧ　　ＧＣＴ　　ＣＣＧ　　ＣＴＧ　　ＴＡＣＡ
Ａ八　八ＡＡ　　ＡＴＣｉｌｕ　ｃｙｓ　Ｉｅｕ　ａｓ
ｐ　Ｉｅｕ　ｇｉｎ　ａｌａ　ｐｒｏ　ｌｅｕ　ｔｙｒ
　ｌｙｓ　ｌｙｓ　１ｌｕＡｆｌ　ＩＩ　ＢａｍＨＩ ＴＡＧ　　ＴＴｒ　　ｍ　　ＧＡＣＧＡＣＣＴＴ　　Ａ
ＧＡ　　ＡＴＴ　　ＣＣＴ　　ＡＧＡＴＣＡＡＡ　　Ａ
ＡＡ　　ＣＴＧ　　ＣＴＧ　　ＧＡＡ　　ＴＣＴ　　Ｔ
ＡＡ　　Ｇ１１ｕ　Ｉｙｓ　Ｉｙｓ　ｌｅｕ　Ｉｅｕ　
ｇｌｕ　ｓｅｒ　””＼ Ｃｏｏ）Ｉ この配列はＥ、コリ中で使用するために両針され、そし
てコード配列の修飾を容易にするために多数の制限酵素
認識部位が考案された。単鎖オーバーラツプ配列を調製
し、アニーリング媒体中で一緒にし、そして連結して、
オンコスタチン−Ａが単離され得る融合蛋白質を調製す
るためにリーディングフェーズを合わせて発現ベクター
中に挿入するために適当な末端を有する完全な遺伝子を
得た。単鎖セグメントをＴ４ポリヌクレオチドリガーゼ
により５′−リン酸化し、そして各セグメント２００ｐ
ｍｏｌｅを３０ｔｔｌの反応容Ｗ　（３０ｍＭ＾ＴＰ、
１０ｍＭＤＴＴ　、　１０ｍＭ　ＭｇＣｅ　ｚ　、Ｉ　
Ｎ／　ｍｌスペルミジン、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＩ
Ｃｊ！　、ｐＨ７，８、及びＴ４　ＤＮＡリガーゼ）中
で一緒にすることによりアニールする。ｄｓ　ＤＮＡを
Ｂｓ５）Ｉ　Ｉｆ及びＢａｍ１ｌ　　！で消化し、そし
て７％天然ポリアクリルアミドゲル上で精製する。

プラスミドｐｔｒｐＥＤ５−１　　（Ｈａｌｌｅｗｅｌ
ｌ及びＥｎｔａｇｅ。

Ｇｅｎｅ（１９８０）　９　：２７；Ｔａｃｏｎ等、Ｍ
ｏｌ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　（１９８０）１７７　：
４２７）をエンドヌクレアーゼＢｓ５ＨＩＩ及びＢａｍ
ＨＩで消化し、そしてｔｒｐＤ遺伝子を欠きそして切断
されたｔｒｐＥ遺伝子を有する実質的に十分な長さの断
片を調製用ゲル電気泳動により単離する。

オンコスタチン−Ａ遺伝子を線状化されたｐ　ｔｒｐＥ
Ｐ５−１プラスミドに連結してプラスミドｐ　ｔｒｐ　
（ＯｎｃＡ）を得、そして連結混合物を用いてＥ、コ１
月ＩＢＩＯＩ細胞を形質転換する。アンピシリン耐性に
より形質転換体を選択し、そしてプラスミドを制限エン
ドヌクレアーゼ消化により分析する。形質転換体をＬｕ
ｒｉａブロス中で３７°Ｃにて約１０１＋細胞／　ｍｌ
に増殖せしめ、そして３−インドール酢酸（Ｉ　ＡＡ）
を約１ｍＭに加え、そして増殖を約１時間継続する。

アリコー）（ｌｄ）をエッペンドルフ遠心管中で数秒間
遠心分離し、そしてペレットを５■／成のシアノゲンプ
ロ矩ドを含有する７％蟻酸５００ＩＪｌ中に懸濁する。

室温にて２４時間置いた後、アリコートを水中に１０倍
に稀釈し、そして稀釈されたサンプルをオンコスタチン
−Ａについて測定する。オンコスタチン−Ａは中間メチ
オニンををさずＮ末端メヂオニンを有するため、融合蛋
白質の開裂が天然オンコスタチン−Ａと同じアミノ酸配
列を有するオンコスタチン−Ａをもたらす。

上記の結果から、この発明の化合物が広範囲の用途を有
することが明らかである。特に、この化合物を新生物状
態の診断及び治療において使用することができる。医療
において、この化合物は腫瘍細胞増殖の緩慢化をもたら
すことができ、そのため腫瘍細胞の破壊のための他の態
様の治療と組み合わせて使用することができる。診療の
ためには、この発明の化合物はｐ５２の生産を誘導し、
その結果この化合物を宿主に投与した際に増強されるｐ
５２レベルが腫瘍細胞の存在の指標であることが見出さ
れる。このことは、新生物状態の治療中に腫瘍細胞の除
去が成功したか又は転移が生じたかを決定するために非
常に重要であり得る。この発明の化合物はまた、オンコ
スタチン−Ａ又はオンコスタチン−Ａレセプターの存在
についての診断測定における試験として使用され得る。

前記の発明が明確な理解のために説明及び例により幾分
詳細に記載されたが、添付された請求の範囲の範囲内に
おいて幾らかの変化及び変法を実施することができるこ
とが明らかであろう。

【図面の簡単な説明】 第１図は、無胸腺（ａｔｈｙｍｉｃ）マウスにおける腫
瘍の増殖に対するオンコスタチン−Ａの効果を比較する
図表である。 −５，ｉ５−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次のアミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 中の少なくとも８個のアミノ酸からなるペプチドをコー
   ドしている約５ｋｂｐ未満のＤＮＡ。