PT88847B

PT88847B - Anticorpos monoclonais contra interleuquina-4 humana e hibridomas produtores dos mesmos

Info

Publication number: PT88847B
Application number: PT88847A
Authority: PT
Inventors: John S Abrams; Frank D Lee; Michael K Pearce; Isabelle Chretien
Original assignee: Schering Biotech Corp
Priority date: 1987-10-26
Filing date: 1988-10-25
Publication date: 1993-01-29
Also published as: JPH0698020B2; AU2782789A; MY108526A; IE883213L; EP0375743A1; DE3886760T2; JPH03503118A; KR930008112B1; EP0375743B1; IL88145A0; IE62491B1; CA1335653C; AU611750B2; EP0314402A2; ZA887987B; DK101890D0; KR890701632A; WO1989003846A2; DK169627B1; HK105996A

Description

ANTICORPOS MONOCLONAIS CONTRA INTERLEUQUINA-4 HUMANA Ε HIBRIDOMAS PRODUTORES DOS MESMOS bridomas que secretam os referidos anticorpos e o processo para a produção de polipeptídeos e de composições de ligação especifica que contêm uma região de cadeia leve, de um anticorpo monoclonal especifico para interleuquina-4 humana.

-3Campo do invento invento está relacionado de um modo geral com anticorpos monoclonais e hibridomas que lhes estão associados e mais particularmente com anticorpos monoclonais específicos para a interleuquina-4 humana.

Fundamento

A interleuquina-4 (IL-4) humana foi inicialmente clonada e caracterizada por Yokota et al.,

Proc. Natl.Acad.Sci., Vol 83, págs. 5894-5898 (1986).IL-4 é uma linfoquina altamente pleiotrópica que afecta muitos componentes diferentes do sistema imunitário. Possui actividade de factor de crescimento de células T (TC6F) e actividade de factor de crescimento de células B. E capaz de potenciar a actividade de TCGF da interleuquina-2 (IL-2) e a actividade do factor de estimulação de colónias de granulócitos-macrôfagos (GM-CSF). Induz a produção preferenciada de IgGj e IgE e induz a expressão de antigênios DR classe II de leucócitos humanos. Estas actividades sugerem vários possíveis usos terapêuticos, e.g. como agente potenciador da terapia anticancro com IL-2, como agente potenciador da regeneração de medula óssea .estimulada por GM-CSF ou como agente para tratar o síndrome de linfôcitos nus: Touraine, Lancet, págs. 319-321 (7 de Fevereiro, 1981);Touraine e Betuel, Human Immunology, Vol 2, págs. 147-153 ( 1981 ); e Sullivan et al., J. Clin. Invest, Vol 76, págs 75-79 (1985).

A actividade indutora de IgE da interleuquina-4 poderá ter consequências importantes em pessoas que soframcé doenças alérgicas. A disponibilidade de antagonistas de IL-4 poderá oferecer uma alternativa ao uso de esteroides glucocorticóides, os quais possuem efeitos secundários prejudiciais, especialmente com utilização pro-

longada; e.g. Goodman e Gillman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 6^â Ed. (MacMillan Publishing Company, New York, 1980). Em particular, anticorpos monoclonais fortemen te bloqueadores específicos para a IL-4 humana proporcionam um meio para a construção de antagonistas através da geração de anticorpos anti-idiotipo, e.g. Patente U.S. 4 731 237 ou por despiste de mimotopos, e.g. Geysen et al., J. Immunol Meth., Vol 102, págs. 259-274 (1987); ou Pedidos de Patentes PCT W0 86/06487.

Um aspecto importante de qualquer terapia envolvendo drogas é a capacidade para prever e/ou controlar os níveis de concentração no sangue do paciente ou outros fluídos do corpo. Os anticorpos monoclonais são largamente usados com esta finalidade: e.g. Springer, ed., Hybridoma Technology in the Biosciences and Medicine (P1enum Press, N.Y. 1985); e Patentes U.S. 4 562 003, 4 486 530 e 4 255 329.

Na produção de proteínas por engenharia genética tais como IL-4, a separação da proteína ex pressa a partir das células hospedeiras transformadas e/ou seus sobrenadantes de cultura é um problema importante.Frequentemente os processos de separação envolvem um ou mais passos de passagem do material bruto através de colunas de imunoadsorvente. Os anticorpos monoclonais específicos para a proteína a ser purificada são elementos cruciais de tais colunas. Tais anticorpos monoclonais podem ser igualmente usados para medir o grau de purificação conseguido por um protocolo particular, e.g. por análise de transferências Western, Burnette, Anal. Biochem.Vol 112, págs. 195-203 (1981).

Do que foi dito ê evidente que a disponibilidade de anticorpos monoclonais e/ou policlonais específicos de IL-4 poderá facilitar a sua aplicação média e veterinária através do melhoramento dos métodos convencio-5-

nais de purificação e proporcionando meios para o controle das concentrações de IL-4 nos fluidos do corpo, como sejam o sangue, urina e similares.

Sumário do invento invento proporciona compostos e composições úteis para a detecção, purificação, medição e/ou inibição de IL-4 himana. Os compostos e composições são derivados de hibridomas produtores de anticorpos monoclonais específicos de IL-4 humano. Os compostos e composições do invento incluem os ptôprios hibridomas, anticorpos monoclonais produzidos pelos hibridomas, polipeptídeos da região variável das cadeias pesada e leve e outros fragmentos de tais anticorpos como sejam meias moléculas compreendendo uma cadeia leve ligada a uma cadeia pesada por pontes dissulfureto naturais, fragientos Fab, fragmentos F (ab)₂, fragmentos Fv e similares.

invento também inclui métodos de utilização dos compostos e composições acima para detectar, purificar e medir a concentração de IL-4 humana e Kits para pôr em práctica tais métodos. Em particular, o invento inclui hibridomas IC1.11B4.6 e MP4.25D2.il e seus anticorpos monoclonais e produtos deles derivados.

As composições do invento podem também ser úteis como agonistas ou antagonistas de IL-4 humana. Em particular, composições compreendendo fragmentos de anticorpos antagonistas anti-IL-4, e.g. anticorpos monoclonais de MP4.25D2.il, são úteis como agentes terapêuticos para o tratamento de doenças atôpicas.

As composições do invento também incluem RNA mensageiro (mRNA) extraído dos hibridomas IC1.11B4.6 e MP4.25D2.il. Tais mRNAs são úteis na clonagem e expressão de fragmentos dos anticorpos IC1.11B4.6 e MP4.25D2.il em bactérias, leveduras ou outros hospedeiros.

Os anticorpos compreendem uma montagem de cadeias polipeptídicas ligadas umas às outras por pontes dissulfureto. Duas cadeias polipeptídicas principais, referidas como cadeia leve e cadeia pesada, prefazem as quatro principais classes estruturais (isotipos) do anticorpo. Ambas as cadeias pesadas e leves são ainda divididas em sub-regiões referidas como regiões variáveis e regiões constantes. As cadeias pesadas compreendem uma única região variável e três regiões constantes e as cadeias leves compreendem uma única região variável (diferente da pertencente â cadeia pesada) e uma única região constante (diferentes das pertencentes à cadeia pesada). As regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve são responsáveis pela especificidade de ligação do anticorpo.

Conforme aqui.ê usado, o termo região variável da cadeia pesada significa um polipeptideo (1) que tem 110 a 125 aminoácidos de comprimento e (2) cuja sequência de aminoácidos corresponde à da cadeia pesada de um anticorpo monoclonal do invento, começando do aminoãcido N-terminal da cadeia pesada. Igualmente, o termo região variável da cadeia leve significa um polipeptideo (1) que tem 95 a 115 aminoácidos de comprimento e (2) cuja sequência de aminoácidos corresponde â da cadeia leve de um anticorpo monoclonal do invento, começando no aminoácido N-terminal da cadeia leve.

Os termos Fab, Fc, F(ab)₂ e Fv são empregues com os seus significados imunológicos convencionais: e.g. Klein, Immunology (John Wiley, New York, 1982) ou Parham, Capítulo 14, em Weir, ed. Immunochemistry, 4^§ Ed.

(Blackwell Scientific Publishers, Oxford, 1986).

Tal como aqui ê isado o termo anticorpo monoclonal refere-se a populações homogéneas de imunoglobulinas que são capazes de se ligar especificamente a

IL-4 humana. Compreende-se que IL-4 humana possa ter um ou mais determinantes antigénicos compreendendo (1) determinantes antigénicos peptidicos que consistem em cadeias peptidicas simples dentro da IL-4 humana, (2) determinantes antigênicos conformacionais que consistem em mais de uma cadeia peptidicas espacialmente contíguas cujas respectivas sequências de aminoácidos estão situadas em diferentes locais ao longo da sequência polipeptidica de IL-4 humana; e (3) determinantes antigénicos pós-traducionais que consistem, com um todo ou parte, em estruturas moleculares covalentemente ligadas a IL-4 humana apôs tradução, como sejam grupos de açucares ou similares. Os anticorpos do invento podem ser dirigidos contra um ou mais destes determinantes.

Tal como aqui é usado o termo composição de ligação significa uma composição compreendendo duas cadeias polipeptidicas (1) que, quando operacionalmente associadas, assumem uma conformação tendo elevada afinidade de ligação para IL-4 humana e (2) que são derivados de um hibridoma produtor de anticorpos monoclonais específicos para IL-4 humana. 0 termo operacionalmente associado pretende significar que as duas cadeias polipeptidicas podem ser colocadas uma relativamente à outra para ligação por uma variedade de meios, incluindo associação num fragmento de anticorpo nativo, como seja Fab ou Fv ou por meio de engenharia genética usando adaptadores peptidicos contendo cístei_ na no extremo carboxilo. Normalmente, as duas cadeias polipep tidicas correspondem â região variável de cadeia leve e â regipao variável da cadeia pesada de um anticorpo monoclonal especifico para IL-4 humana.

Breve descrição das figuras

A Figura 1 é uma representação esquemática de um vector de expressão adequada à expressão de IL-4 humana não glicosilada num hospedeiro bacteriano;

A Figura 2 ilustra o perfil de adsor ção a 215 nm da IL-4 humana no passo final de purificação;

e a Figura 3 (partes A e B) mostra a neutralização da ligação.

Descrição detalhada do invento

Os hibridomas do invento são produzidos por técnicas bem conhecidas. Geralmente, o processo envolve a fusão de uma linha celular estabelecida com um linfócito B que produz o anticorpo pretendido. Como alternativa, são possíveis técnicas que não envolvem fusão para a obtenção de linhas celulares imortais produtoras de anticorpos e que estão dentro do âmbito do presente invento, e.g. transformação induzida por vírus: Casali et al., Human Monoclonals from Antigen-Specific Selection ob B Lymphocytes and Transformation by EBV, Science, Vol. 234 págs 476-479 (1986). As linhas celulares estabelecidas são geralmente células de mamíferos transformadas, particularmente células de mieloma de roedor, bovinas ou de origem humana. Mais frequentemente empregam-se linhas celulares de mieloma de rato ou de murganho por questões de conveniência e disponibi 1 idade.

As técnicas para a obtenção de linfócitos adequados a partir de mamíferos injectados com o antigênio alvo são bem conhecidas. De um modo geral usa-se linfócitos do sangue periférico (PBLs) se se pretenderam células de origem humana ou usa-se células do baço ou de nódulos linfáticos se se pretender fontes mamíferas não humanas. Um mamífero hospedeiro ê injectado com dosagens repetidas do antigênio purificado e deixa-se que o mamífero produza células produtoras dos anticorpos pretendidos antes daquelas serem colhidas para a fusão com a linha celular estabelecida. São bem conhecidas as técnicas de fusão que de um modo geral envolvem a mistura das células com um agente de fusão, como seja polietilenoglicol. Os hibridomas são seleccionados por processos convencionais, como seja a selecção com HAT. De entre estes hibridomas são seleccionados os que secretam o anticorpo pretendido testando os seus meios de cultura através de imunoensaios convencionais, tais como transferência Western, ELISA, RIA ou similares. Os anticorpos são recuperados do meio usando técnicas convencionais de purificação de proteína, e.g. Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985). Existem muitas referencias para seguir na aplicação de qualquer uma das técnicas acima: e.g. Kohler et al. Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam 1985);Campbel1, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); e similares.

uso e obtenção de fragmentos de anticorpos são também bem conhecidos; e.g. Fragmentos Fab: Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); e fragmentos Fv; Hochman et al Biochemistry, Vol 12, pãgs 1130-1135 (1973), Sharon et al., Biochemistry, Vol. 15, pãgs 1591-1594(1976) e Ehrlich et al, Patente U.S. 4 355 023; e meias moléculas de anticorpo: Auditore-Hargreaves, Patente U.S. 4 470 925. Ainda, tais compostos e composições do invento podem ser usados para construir anticorpos bi-especificos através de técnicas conhe cidas; e.g. por posteriores fusões de hibridomas (i.e. para formar os chamados quadromas); Reading, Patente U.S.

474 493; ou por reassociação química de meias moléculas: Brennan et al, Science, Vol 229, págs 81-83 (1985).

Os hibridomas e anticorpos monoclonais do invento são produzidos contra versões glicosiladas

V

ou não glicosiladas de IL-4 humana madura produzida por técnicas recombinantes.

Geralmente as versões não glicosiladas de IL-4 humana são produzidas em £. coli e as versões glicosiladas são produzidas em células hospedeiras de mamíferos, e.g. células de macaco CV1 ou COS, células L de murganho ou similares. A IL-4 humana madura, produzida por técnicas recombinantes é obtida pela introdução de um vector de expressão numa célula hospedeira usando protocolos convencionais; e.g. Maniatis et al., Molecular Cloning;A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982); Okayama e Berg, Mol. Cell. Biol, Vol 2 págs 161-170(1982) e Vol 3, pãgs 280-289(1983); Hamer, Genetic Engineering, Vol 2 págs 83-100(1980) e Patente U.S. 4 599 308; Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. Vol 2, págs. 1304-1319 (1982); ou similares.

A construção de vectores de expressão bacterianos ou para mamiferos ê bem conhecida, uma vez determinada a sequencia nucleotídica codificadora de uma proteina pretendida ou de outro modo conhecida; e.g. De Boer na Patente U.S. 4 511 433 descreve promotores para usar em vectores de expressão bacterianos; Goeddel et al., na Patente U.S. 4 601 980 e Riggs, na Patente U.S. 4 431 739 descrevem a produção de proteínas de mamífero por sistemas de expressão de E.co1i; e Riggs (citado atrás),Ferretti et al., Proc. Natl.Acad.Sei. Vol 83, pãgs 599-603 (1986),Sproat et al., Nucleic Acids Research, Vol' 13, págs 2959-2977 (1985) e Mullenbach et al., J. Biol.Chem. Vol. 261, pãgs 719-722 (1986) descreve como construir genes sintéticos para a expressão em bactérias. Deste modo, estas referências são incluídas por referência. A sequência de aminoãcidos de IL-4 humana madura está descrita por Yokota et al.(citado atrás) e o cDNA codificador de IL-4 humano inserido no vector pcD descrito por Yokota et al(citado atrás) está depositado na American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, com o número de acesso 67029. Muitos vectores de expressão

-11bacterianos e hospedeiros podem ser adquiridos comercialmente ou através da ATCC. De preferencia, a IL-4 humana para imunizar animais hospedeiros ê isolada a partir de sobrenadantes de cultura de células COS, CV1 ou L de murganho que tenham sido transitóriamente transfectadas pelo vector pcD atrás referido.

Os anticorpos e fragmentos de anticorpos caracteristicos dos hibridomas do invento, particularmente IC1.11B4.6, podem também ser produzidos por meios recombinantes através da extracção de RNA mensageiro, construção de uma biblioteca de cDNA e selecção de clones, que codifiquem segmentos da molécula de anticorpo: e.g. Wall et al., Nucleic Acids Research, Vol. 5, págs. 3113-3128 (1978); Zalsut et al., Nucleic Acids Research, Vol, 8 págs 3591-3601 (1980); Cabilly et al., Proc. Natl.Acad.Sci., Vol. 81, págs 3273-3277 (1984); Boss et al., Nucleic Acids Research., Vol 12, págs 3791-3806 (1984); Amster et al., Nucleic Acids Research, Vol 8 págs 2055-2065(1980); e Moore et al., Patente U.S. 4 642 234. Em particular, tais técnicas podem ser usadas para produzir anticorpos monoclonais interespecificos, em que a região de ligação de uma espécie é combinada com uma região de não ligação do anticorpo de uma outra espécie; e.g. Liu et al., Proc. Natl.Acad.Sci.

Vol 84, págs 3439-3443 (1987).

As utilizações de anticorpos monoclonais para purificação e quantificação são conhecidas e.g. cromatograf ia de afinidade: Aff inity Chromatography -.Principies and Methods (Pharmacia, Orebro, Sweden, 1979); Secher et al. Nature, Vol 289, págs 446-450 (1980) e Patente U.S.

423 147; e pedido de patente Europeia 0190711 (13 de Agosto de 1986); e técnicas de imunoensaio: Tijssen (citado atrás); Patente U.S. 4 486 530; e Burnette (citado atrás).A cromatografia de afinidade pode ser usada para purificar IL-4 humana através da sua extracção a partir de uma amostra, como seja

sobrenadante de cultura de células transformadas ou transfectadas com um vector de expressão de IL-4 humana. Tal processo de purificação ê aqui referido como um processo de imunopurificação. Tipicamente ele envolve a ligação covalente de um anticorpo monoclonal especifico para IL-4 humana a um suporte de fase sólida (aqui referido como um imunoadsor vente) o qual ê colocado numa coluna ou câmara através da qual passa a mostra.IL-4 humana da amostra liga-se preferencialmente aos sítios de ligação dos anticorpos monoclonais ligados, enquanto o resto do material da amostra ê removida da coluna ou câmara por lavagem. A IL-4 humana ê então eluida do imunoadsorvente por técnicas convencionais, e.g. pH baixo, concentração salina elevada ou similares.

Imunoensaios de dois sitios ou sanduiche são os imunoensaios preferidos do invento, e.g. conforme divulgado na Patente U.S. 4 486 530. Assim, esta patente é incluida através de referência, tais ensaios implicam o uso de duas séries diferentes de anticorpos anti-IL-4, pelo menos um deles consiste num anticorpo monoclonal do invento, como seja o produzido por IC1.11B4.6. Os anticorpos de uma das duas séries são ligados à superfície de um suporte de fase sólida. Os anticorpos ligados são então expostos a uma amostra suspeita de conter IL-4 humana. As moléculas de IL-4 ligam-se aos anticorpos ligados. Em seguida, a segunda série de anticorpos ê aplicada ao IL-4 ligado e estes ligam-se a um ou mais determinantes antigénicos distintos do (ou dos) a que a primeira série de anticorpos se ligou. A IL-4 ê então detectada por um meio gerador de sinal indirecto ou directo associado à segunda série de anticorpos. Por exemplo, os anticorpos podem ser direetame_n te conjugados a uma porção geradora de sinal, como seja uma enzima, quelator terroso raro ou um corante orgânico. Ou podem ser ligados indirectamente a uma ou mais partes geradoras de sinal através de anticorpos adicionais ou complexos de alta afinidade tais como os complexos de avidina-biotina.

As medições quantitativas da concen tração de IL-4 são feitas comparando o sinal gerado pela amostra com os sinais gerados pelos padrões IL-4 contendo concentrações conhecidas de IL-4 humana.

invento inclui Kits de reagentes para usar nos imunoensaios, particularmente imunoensaios de sanduíche. Tais Kits incluem (1) um suporte de fase sólida, (2) um primeiro anticorpo que é monoclonal e é capaz de se ligar a um primeiro determinante antigênico de IL-4 humana, (3) um segundo anticorpo seleccionado do grupo constituído por um anticorpo monoclonal capaz de se ligar a um segundo determinante antigênico de IL-4 humana e um anticorpo policlobal especifico de IL-4 humana (aqui referido como composição de anticorpo policlonal) e (4) um meio gerador de sinal associado a um dos três anticorpos. Dependendo da realização particular, os Kits podem incluir uma selecção de dois dos três tipos de anticorpos anti-Il-4, quer um anticorpo monoclonal especifico para um primeiro determinante antigênico e um anticorpo monoclonal especifico para um segundo determinante antigênico, quer um segundo anticorpo monoclonal especifico para um primeiro ou segundo determinante antigênico e uma composição de anticorpos policlonais.Os anticorpos podem estar em solução ou na forma liofilizada.

Uma das séries de anticorpos pode estar disponível para aplicação à superfície do suporte sólido quando se usa o Kit ou pode vir pré-ligada ao suporte sólido. Os meios geradores de sinal podem vir prê-associados com um dos dois tipos de anticorpos ou pode requerer combinação com um ou mais componentes, e.g. tampões conjugados de anticorpo-enzima, substratos de enzimas ou similares, antes de usar.Existem muitos tipos de meios geradores de sinais e podem constituir um ou mais componentes de um Kit. Vários meios geradores de sinais estão descritos por Tijssen (referido atrás).

Os Kits do invento podem também incluir reagentes adicionais, e.g. reagentes bloqueadores para a redução da ligação inespecifica à superfície da fase sólida, reagentes de lavagem, substratos de enzimas e similares. A superfície da fase sólida pode ser na forma de placas de microtitulação, microesferas ou similares, compostas por cloreto de polivinilo, polistireno ou materiais semelhantes adequados à imobilização de proteínas. Tais materiais tendo superfícies de fase sólida são aqui referidos como meios de suporte. De preferencia, uma enzima que catalisa a formação de um produto fluorescente ou corado ê um componente dos meios geradores de sinal. Mais preferencialmente, a enzima ê seleccionada do grupo constituído por peroxidase, fosfatase alcalina e beta-galactosidase. Os substratos e condições de reacção para estas enzimas são bem conhecidos; e.g. Tijssen (citado atrás).

As composições do invento podem também ser usadas como componentes das composições farmacêuticas dirigidas contra doenças relacionadas com IL-4.As composições farmacêuticas que compreendem anticorpos monoclonais (ou seus fragmentos de ligação) tendo efeitos agonisticos podem ser usadas para aumentar a actividade de 11-4. Ou composições que compreendem anticorpos monoclonais (ou seus fragmentos de ligação) tendo efeitos bloqueadores ou antagonisticos podem ser usados para suprimir a activichde de IL-4.Tais composições contem uma quantidade terapêutica de pelo menos um dos anticorpos monoclonais do invento, ou seus fragmentos de ligação, num veiculo farmaceuticamente eficaz. Um veiculo farmacêutico pode ser qualquer substância não tóxica compatível adequada à libertação das composições do invento a um paciente. Agua estéril, álcool, gorduras, ceras e sólidos inertes podem ser incluídos num veiculo. Adjuvantes farmaceuticemerte aceitáveis(agentes tamponantes, agentes dispersantes) podem também ser incorporados na composição farmacêutica. De um modo geral as composições úteis para administração parenteral de tais drogas são bem conhecidos; e.g. Remington's Pharmaceutica 1 Science, 15^a Ed (Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980). Como alternativa, as

composições do invento podem ser introduzidas no corpo de um paciente por sistemas implantáveis de libertação de drogas; e.g. Urquhart et al., Ann, Rev. Pharmacol. Toxicol.Vol. 24, págs 199-236 (1984).

EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem servem para ilustrar o presente invento. A selecção de vectores e hospedeiros assim como a concentração de reagentes, temperaturas e valores de outras variáveis servem apenas para exemplificar a aplicação do presente invento e não devem ser considerados como limitantes dele.

Exemplo I. Produção de IL-4 humana glicosilada por transfecção de células de macaco COS 7 com pcD-Il-4 humana vector de expressão pcD-IL-4 humana e a célula hospedeira COS 7 estão disponíveis na American Type Culture Collection com os números de acesso 67029 e CRL 1651, respectivamente. 0 clone pcD-IL-4 humana foi amplificado, o DNA de plasmideo foi purificado e em seguida usou-se um protocolo de transfecção convencional para transfectar COS 7: Cerca de ΙχΙΟθ células COS 7 são semeadas em placas de cultura de tecidos de 100 mm contendo meio de Eagle Modificação de Dulbecco (DME), 10% de soro fetal de vitela e 4 mM L-glutamina. Cerca de 24 horas apôs sementeira, o meio ê aspirado das placas e as células são lavadas duas vezes com DME tamponado (50 mM Tris) sem soro. A cada uma das pTacas adiciona-se 4 ml de DME tamponado sem soro (com 4 mM L-glutamina), 80 μ 1 de DEAE-dextrano e 5 microgramas de DNA de pcD-IL-4 humana. As células são incubadas nesta

mistura durante 4 horas a 30°C após o que a mistura ê removida por aspiração e as células são lavadas uma vez com DME tamponado sem soro. Após lavagem adiciona-se a cada placa 5 ml de DME com 4 mM L-glutamina, 100 pM cloroquina e 2% de soro fetal de vitela e as células são incibadas durante 3 horas e cÉpois lavadas duas vezes com meio DME tamponado sem soro. Em seguida, adiciona-se 5 ml de DME com 4 mM L-glutamina e 4% de soro fetal de vitela e as células são incubadas a 37°C durante 24 horas. Após isto as células são lavadas 1-3 vezes com DME ou PBS, adiciona-se 5 ml de DME sem soro (com 4 mM L-glutamina) e as células são incubadas a 37°C até os sdrenadantes das culturas serem colhidos 5 dias mais tarde

Exemplo II. Purificação de IL-4 humana glicosilada a partir de sobrenadantes da transfecção de COS 7

A. Ensaio biológico para purificação.

A actividade de factor de crescimento de células T (TCGF) foi usada para testar a IL-4 humana durante a purificação a partir dos sobrenadantes produzidos de acordo com o Exemplo I. Vários ensaios convencionais têm sido descritos para a actividade TCGF; e.g. Devos et al., Nucleic Acids Research, Vol. 11, pãgs 4307-4323 (1983); Thurman et al., J. Biol Response Modifiers, Vol. 5, págs 85-107 (1986);e Robert-Guroff et al., Capítulo 9 em Guroff, Ed. Growth and Maturation Factors (John Wiley, New York, 1984). De um modo geral, os ensaios de TCGF são baseados na capacidade de um factor para promover a proliferação de linfôcitos T periféricos ou de linhas de células T dependentes de IL-2; e.g. Gillis et al., J. Immunol; Vol 120, pág 2027(1978).A proliferacção pode ser determinada por técnicas convencionais, e.g. incorpo ração de timidina triciada ou por métodos colorimêtricos: Mosmann, J. Immunol. Meth., Vol. 65, págs 55-63(1983). 0 ensaio para a actividade de TCGF da IL-4 humana foi efectuado

como se segue: Sangue de um dador saudável foi removido para um tubo heparinizado e aplicado sobre Ficol1-Hypague; e.g.

ml de sangue por 3 ml de Ficol1-Hypague num tubo de centrífuga de 15 ml. Após centrifugação a 3000 x g durante 20 minutos as células na interface foram aspiradas e diluídas num meio de crescimento consistindo em RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal de vitela, 50 μΜ 2-nercaptoetanol, 20 pg/ml de fito-hemaglutinina (PHA) e IL-2 humana recombinante. Apôs

5-10 dias de incubação a 37°C, os Iinfócitos do sangue periféricos (PBLs) estimulados com PHA foram lavados e usados em ensaios colorimétricos de 2 dias (Mossman, citado atrás).Diluições seriadas de duas vezes de um padrão IL-4 (sobrenadantes de células COS 7 transfectadas com pcD-IL-4 humana) ou a fracção a ser testada foram efectuadas em placas de 96 poços utilizando o meio de crescimento descrito acima para dar um volume fira 1 de 50 μΐ/poço. A cada poço adicionou-se 50 jul £ dos PBLs estimulados com PHA a cerca de 4-8x10 células/ml e as placas foram incubadas a 37°C, durante 2 dias. 0 crescimento celular foi então medido de acordo com Mosmann (referido atrás).

Uma unidade, como aqui ê usado, ê a quantidade de factor que num poço (0,1 ml) estimula 50% da proliferação máxima de 2xlO⁴PBLs estimulados com PHA durante um periodo de 48 horas.

B. Purificação

A purificação foi conseguida por uma aplicação sequenciada de cromatografia de permuta catiónica, filtração em gel e cromatografia liquida de alta pressão em fase reversa. Todas as operações foram efectuadas a 4°C.

As células COS-7 foram removidas por centrifugação e o sobrenadante foi concentrado cerca de 10 vezes por ultrafiltração e guardado a -80°C até ser processa-18-

do. Os títulos de IL-4 foram determinados testando a capacidade da proteína para estimular a proliferação de linfócitos do sangue periférico humano induzidos pela fito-hemaglutinina, i.e. por actividade de TCGF usando o ensaio padrão descrito atrás.

sobrenadante concentrado de COS-7

Λ β tendo actividade de TCGF de aproximadamente 10-10 unidades/ /ml e um teor proteico de aproximadamente 15-20 mg/ml, ê dialisado contra duas mudas de HEPES sódio 50 mM, pH 7,0 dura_n te um período de 24 horas (cada muda sendo de aproximadamente 10-15 vezes o volume de um concentrado).0 dialisado foi aplicado numa coluna (1 x 2,5 cm) de S-Sepharose (fluxo: 0,2 ml/ /min)pré-equi1ibrada com 50 mM HEPES sódio, pH 7,0. A coluna foi lavada com 15 volumes de coluna de tampão de equilíbrio e depois eluida com 20 volumes de um gradiente linear de cloreto de sódio desde 8 a 0,5M de cloreto de sódio com HEPES sódio 50 mM, pH 7,0. A eluição terminou isocráticamente com 5 volumes da coluna de HEPES sódio 50 mM, 0,5M NaCl, pH 7,0. Colheram-se fracçoes de 1,5 ml e de 1,8 ml a partir de dois lotes em separado. Encontrou-se que os títulos de 11-4 para . ambas da cromatografia eluem entre 300 mM e 500 mM de cloreto de sódio.

As fracçoes das colunas de S-Sepharose contendo títulos de IL-4 foram combinadas em volumes totais separados de 9,0 ml e 10,8 ml. Ambos os volumes foram concentrados para 1,9 ml por ultrafiltração usando uma membrana Amicon YM5 (peso molecular de exclusão :5000). A recuperação da proteína deste passo foi de cerca de 80%. A solução de IL-4 concentrada foi aplicada numa coluna de Sephadex G-100 (1,1 x 58 cm) prê-equi1ibrada em 50 mM HEPES, 0,4M NaCl, pH 7,0 e a coluna foi eluida com o mesmo tampão a 0,15 ml/min. Colheu-se um total de 50 fracçoes (1,0 ml/fracção) e analilisou-se quanto aos titulos de IL-4. Observou-se um pico de actividade biológica com um peso molecular aparente de 22000

-19Λ

daltons. A Sephadex G-100 foi calibrada para determinação de peso molecular aparente com albumina do soro bovino (65000 daltons), anidrase carbónica (30000 daltons) e citocrómio (11700 daltons).

Uma fracçao da coluna de Sephadex G-100 contendo actividade IL-4 foi concentrada 3-4 vezes jji vacuo e foi injectada numa coluna de segurança Vydac-C-4 (4,6 x 20 mm). Um gradiente linear de 0 a 72% (v/v) de acetonitrilo em 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacêtico (TFA) foi produzido em 15 minutos a uma temperatura de coluna de 35° e a um fluxo de 1,0 ml/min. Resultaram três picos que foram detectados a 214 nm com tempos de retenção de 7, 8,2 e 8,7 min. (picos 1, 2 e 3 da Figura 2, respectivamente).Uma amostra de 40 /j1 do pico e (8,2 min. de tempo de eluição) foi liofilizada e redissolvida em meio minimo essencial contendo 10% de soro fetal de vitela. Esta solução mostrou uma resposta TCGF positiva. Uma amostra de 300 jul do pico 2 foi evapora da atê secagem e redissolvida em 200 /u1 de 0,l%(p/v) de dodecilsulfato de sódio (SDS). Uma amostra de 2 /j! foi diluída em 200 /ui de 1% (v/v) TFA e recromatografada. A HPLC desta amostra demonstrou um único pico a 215 nm. 0 material do pico g indicou uma actividade de cerca de 7 x 10 unidades/mg.

Exemplo III: Produção de IL-4 humana não glicosilada em

Escherichia coli

Um vector de expressão para

E. coli, designado TRPC11, foi construído usando técnicas convencionais, e.g. conforme descrito em Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).

vector TRPC11 foi construído ligando um fragiento RBS consensus sintético a adaptadores

Clal (ATGCAT) e clonando os fragmentos resultantes em pMTllhc cortado com Ciai (que foi prêviamente modificado para conter o sítio Ciai). pMTllhc ê um pequeno (2,3 Kilobases)

R S derivado de pBR322 de elevado número de cópias, AMP e TET que ê portador da região de poiiadaptador EcoRI-Hind111 do plasmideo VX (descrito por Maniatis et ak,citado atrás).

Foi modificado para conter o sítio Ciai através da restrição de pMTllhc com EcoRI e BamHI,preenchimento dos extremos coesi vos resultantes e ligação com o adaptador Clal (CATCGATG), restaurando assim os sítios EcoRI e BamHI e substituindo o sitio Smal com um sítio Clal.

Um transformante da construção

TRPC11 tem uma sequencia RBS tandem ladeada por sítios Clal . Um dos sitios Clal e parte da segunda cópia da sequencia RBS foram removidos por digestão deste plasmideo com PstI, tratamento com a nuclease Bal31, corte com EcoRI e tratamento com DNA-polimerase de T4 na presença dos quatro trifosfatos de desoxinucleotideos. Os fragmentos de 30-40 pb resultantes foram recuperados por electroforese em gel de poiiacrilamida e clonados em pUC12 cortado com Smal. Um fragmento EcoRI de 248 pB portador de trpP de E.coli derivado de pKClOl (descrito por Nichols et al., em Methods in Enzymology, Vol 101, pág . 155 (Academic Press, N.Y. 1983)) foi então clonado no sitio EcoRI para completar a construção TRPC11, que está ilustrada na Figura 1.

TRPC11 foi empregue como vector de cDNA de 11-4 humana digerindo-o primeiro com Clal e BamHI, purificando-o e depois misturando-o com o fragmento EcoRI/ /BamHI de pcD-125 (depositado com o número de acesso ATCC

67029) numa solução de ligação convencional contendo 0,1 micromolar do seguinte adaptador sintético:
5' ·	- CG ATG	CAC	AAG TGC	GAT - 3'
	TAC	GTG	TTC ACG	CTA

-21E. coli ΑΒΙ899 foi transformada directamente com a solução de ligação usando o processo do cloreto de cálcio convencional, propagada e semeada.As colónias contendo a inserção de cDNA de IL-4 foram seleccionadas usando uma sonda oligonucleotídica marcada. Os transformantes foram cultivados em caldo L e a IL-4 foi expressa constitutiva mente.

Exemplo IV. Purificação de 11-4 humana não glicosilada a partir de agregados produzidos por Escherichia coli

Uma cultura de 1 litro de E. coli AB1899 (lon~) (obtida da Yale University E. coli. Genetics Center, New Havem, CT) foi cultivada até 00^θθ=2 (cerca de

1,6 x 10⁹ células/ml). As células foram colhidas por centrifugação a 4500 x g durante 15 minutos a 4°C. Os sedimentos foram ressuspensos em 30 ml de tampão Tris 50 mM, pH 8,0,contendo 50 mM NaCl, ácido etilenodiaminatetracêtico (EDTA) lmM e fluoreto de fenilmetilsulfonilo 0,lmM (PMSF). 0 EDTA e PMSF foram adicionados para inibir a actividade de proteases que possam degradar a IL-4 humana antes da purificação.Em seguida, as células foram sonicadas (50 pulsos (50%) a 70 Watts) e centrifugadas a 25 000 x g durante 15 minutos a 4°C. Um componente proteico principal do sedimento resultante verificou-se ser IL-4 comparando o padrão de bandas do gel de ma terial do sedimento separado electroforêticamente (o qual tinha sido solubilizado em dodecilsulfato de sódio (SDS) e corado com Coomassie Blue) com um controle negativo.

Após remoção do sobrenadante, o material de sedimento foi ressuspenso em solução tampão Tris (50mM Tris, 50mM NaCl, lmM EDTA, 0,lmM PMSF, pH 8,0; 9 ml para cada grama de material do sedimento), contendo guanidina HC1 5M, glutationa 2mM (forma reduzida) e glutationa 0,2mM

X* (forma oxidada). Após aproximadamente 1 horà à temperatura ambiente, a solução foi diluida a 1:9 numa solução tampão Tris, pH 8,0, contendo glutationa 2mM (forma reduzida) e glutationa 0,2mM (forma oxidada). Sempre que se formaram precipitados durante os passos de diluição, diálise ou concentração, eles foram removidos por centrifugação antes de se prosseguir. Todo o volume foi então dialisado durante a noite 3 vezes contra 3 litros de solução tampão fosfato. 0 dialisato (i.e. o material retido no tubo de diálise) foi concentrado através de um filtro Amicon YM5 (concentração final 8 mg/ml).e submetido a cromatografia de filtração em gel (coluna:P30 (BioRad), 1,5 x 90 cm; tampão de eluição PBS; fluxo: 8 ml/hora). As fracções foram colhidas em intervalos de 15 minutos. As fracções 23-27 foram reunidas e posteriormente analisadas por HPLC de fase reversa. Tal análise indi©u que as fracções reunidas continham 95% de IL-4 humana pura.

rendimento a partir de 1 litro de cultura (D0_56Qde 2) foi de 2 mg de IL-4 humana com uma actividade especifica de 5 x 10⁷unidades/fig.

Exemplo V. Produção do Hibridoma ICl.llb4.6

Um rato Lewis macho foi imunizado intraperitonealmente (i.p.) com 1 ml de solução de IL-4 humana emulsionada com 1 ml de adjuvante completo de Freund(CFA). A solução de IL-4 humana consistiu em IL-4 humana a uma concentração de 14 /jg/ml em lOmM Tris-HCl, 0,5M NaCl, pH 7,4.

A IL-4 humana foi produzida de acordo com os Exemplos I e II e tinha uma actividade especifica de 2 x 10 unidades/mg.

Duas semanas depois da imunização inicial, o rato foi de novo injectado i.p. com 1 ml de solução de IL-4 humana emulsionada com 1 ml de CFA. Três meses depois da segunda injecção, foi dada intravenosamente uma injecção de memória com 1 ml de solução de IL-4 humana (15 £ig). Quatro dias após a injecção de memória matou-se o rato, colheu-se o sangue e removeu-se

Má·-.

s.

'A

-23o baço para fusão. As células do baço foram fundidas com células de mieloma de murganho, P3X63-Ag8.653 (ATCC.CRL 1580), numa proporção de 1:1 usando polietilenoglicol(PEG).

A suspensão de células (3,5 x 10 cêlulasM em meio HAT) foi distribuída por 40 placas de 96 poços. Dez dias mais tarde os sobrenadantes dos hibridomas foram testados quanto à sua capacidade para ligar IL-4 humana directamente imobilizada em placas de microtitulação (ELISA indirecta) ou IL-4 humana ligada à fracção imobilizada de IgG policlonal de coelho anti-IL-4 humana. 0 anticorpo ligado foi detectado com um protocolo convencional usando imunoglobulina de cabra anti-rato conjugada com peroxidase. Os anticorpos que secretaram anticorpos reagindo com 11-4 foram clonados por diluição limite. IC1.11B4.6 foi um dos hibridomas seleccionados por estes processos. Determinou-se que os anticorpos de IC1 ,HB4-6 pertenciam ao isotipo 19623· θ hibridoma pode ser guardado (e.g. a -70°C em meio de cultura com 10% de DMSO) e cultivado usando técnicas convencionais de cultura de células de mamífero (e.g. RPMI 1640 com 10% de soro fetal bovino, suplementado com glutamina lmM e 2-mercaptoetanol 50mM).

Exemplo VI. Produção do hibridoma MP4.25D2.1I

Produziu-se uma colecção de hibridomas e os seus anticorpos foram testados quanto â especificidade para 11-4 humana substancialmente como descrito no Exemplo V. Os hibridomas da colecção foram então testados ainda quanto à capacidade dos seus anticorpos para bloquear a actividade TCGF de IL-4 humana num ensaio in vitro convencional(como descrito no Exemplo II). Dos vários monoclonais bloqueadores identificados, os produzidos por MP4.25D2.il foi seleccionado como tendo 0 titulo mais elevado de actividade bloqueadora.Os anticorpos pradazidos por MP4.25D2.il foram determinados como sendo IgGl de rato.

Exemplo VII.

Ensaio de sanduíche para IL-4 humana

100 μ 1 de anticorpos policlonais de coelho anti-IL-4 humana (10 /jg/ml em PBS purificados numa coluna de afinidade com proteina A) são adsorvidos à superfície de cada poço numa placa de microtitulação de 96 poços em cloreto de polivinilo durante 2 hrs. a 37°C.(PBS consiste em 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KH₂P0₄, 2,9 g de Na₂HP0₄.12H₂0 e 0,2 g de KC1 em 1 1 de ãgua destilada. 0 pH ê 7,4). A placa é lavada com PBS-Tween (preparado exactamente como PBS, excepto adicionar-se 0,5 ml de Tween 20 por.litro) para remover o anticorpo não ligado e depois diluições ser í adas em duplicados (em PBS) de IL-4 humana purificada produzida por E^. coli são colocadas em filas de 12 poços por ordem decrescente de concentração de IL-4, as quais variam de 1000 pg/ml, até 15 pg/ml. As amostras que se seguem foram aplicadas nos restantes poços: (1) sobrenadantes de cultura derivados de um clone de células T humanas, e.g. ClLyl⁺2“/9 (ATCC CRL 8179), (2) sobrenadantes de culturas de células COS 7 transfectadas com pcD-IL-4 humana, (3) soro humano contendo diferentes concentrações de IL-4 produzida por COS 7 e (4) amostras contendo IL-1 <, IL-2, IL-3, IFN- γ, IFN- «.2b, GM-CSF e BSF-2. Todas as amostras foram incubadas durante 2 horas â temperatura ambiente. Após lavagem com PBS-Tween, uma diluição a 1:10 do sobrenadante de uma cultura de IC1.11B4.6 foi adicionado a cada poço (100 yul/poço) e deixou-se a incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Após incubação, a placa foi lavada, adicionado o anticorpo de cabra anti-rato conjugado com peroxidase e deixado a incubar durante 1 hora â temperatura ambiente, após o que a placa foi lavada. Em seguida, adicionou-se o substrato da peroxidase ABTS e as concentrações de IL-4 humana foram determinadas por meio de densidade óptica nos poços. Os resultados indicam que o ensaio pode detectar IL-4 humana produzida por mamíferos em concentrações tão baixas como 50 pg/ml no soro humano e que os ensaios não detectam qualquer uma das linfoquinas referidas

atrás.

A tabela A abaixo e a Fig.3A mostram a capacidade de F(ab), IgG e sobrenadante bruto (anticor

125 po não purifiçado)de 11B4 para inibir a ligação de I-HuIL-4 a células Daudi. As três preparações inibiram a ligação até um nível máximo de 70%. Os anticorpos monoclonais testemunha GL117F(ab), IgG e sobrenadante bruto não afectaram a ligação. (Os anticorpos testemunha são contra um antigênio não relacionado do mesmo idiotipo). A concentração de Ig ou F(ab) de 11B4 purificados necessários para produzir 50% de inibição da ligação está na gama de 10-100 ng/ml.

A tabela B abaixo e a Fig. 3B mostram a capacidade de 25D2.11 F(ab) para inibir a ligação no mesmo ensaio. Esta preparação resultou numa inibição cê 90% com um efeito máximo de 50% a 10-15 ng/ml.

Nas figs. 3A e 3B o eixo dos X mostra ng/ml (nuia escala logarítmica) e o eixo dos Y mostra a percentagem de inibição. Nestas experiências a HuIL-4 foi preparada em células de ovário de hamster chinês e é designada CHO-HuIL-4 nas Tabelas que se seguem:

-26TABELA A • /

Neutralização da ligação de ^^^I-CHO-HuIL-4 a células Daudi por 11B4

Amostra

11B4 F(ab) sobrenadante de 11B4

IgG GL117 percenta.

ng/ml ^gern?^e gaçao

28,1 10 25,34

100 54,28

1000 67,94

10000 64,56 <

0 100 45.1

1000 67,9

2500 74.3

5000 73,6

0

100 1,8

1000 0

10000 0

Amostra

IgG 11B4

GL117 F(ab) sobrenadante de GL117

TABELA B

125

Neutralização da ligação de I-CHO-HuIL-4

pelo fragmento F(ab) 25D2.11
ng/ml	percentagem de inibição	ng/ml
3000	90	15
1500	90	10
1000	84	⁷Z⁵ 3,0
60	77
30	67,4	/

percentagem de ligação ng/ml

0 10 11,7

100 71.01

500 73.66

1000 69^54

0

2.4

100 0

1000 3,7

10000 5,8

7,5

100 4,7

1000 0

2500 5,5

5000 0 a células Daudi percentagem de inibição

54,1

30,75

10,5

As descrições das realizações prece dentes do invento foram apresentadas com fins ilustrativos e descritivos. Elas não pretendem ser exaustivas ou limitantes do invento relativamente às formas precisas divulgadas e ôbviamente muitas modificações e variações são possíveis face ao que foi descrito. As realizações foram escolhidas e descritas de modo a explicar melhor os princípios do invento e a sua aplicação prática para assim permitir a outros a melhor utilização do invento em várias execuções e com várias modificações conforme adequado ao uso particular contemplado. Pretende-se que o âmbito do invento seja definido pelas reivindicações apensas.

Os requerentes depositaram os hibridomas IC1.11B4.6 e MP4.25D2.il na American Type Culture Collection, Rockville, MD USA (ATCC), com os números de acesso HB9550 e HB9809 respectivamente. Estes depósitos foram feitos nas condições do acordo da ATCC quanto ao Depósito de Culturas para fins de patentes, as quais asseguram que os depósitos sejam tornados disponíveis ao US Commissioner of Patents and Trademarks de acordo com 35 USC 122 e 37 CFR 1.14 e ficarão disponíveis ao público quando da publicação da Patente U.S. e que requere que os depósitos sejam mantidos.

A disponibilidade das estirpes depositadas não é considerada como uma permissão para praticar o invento em contravenção com os direitos concedidos sob a autoridade de qualquer governo de acordo com as suas leis sobre patentes.

Claims

l^â. - Anticorpo monoclonal caracterizado por ser especifico para interleuquina-4 humana.
2⁵. - Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser especifico para interleuquina-4 humana não glicosílada.
3^â. - Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser especifico para interleuquina-4 humana glicosílada.
4â acordo com a reivindicação 3, do pelo hibridoma IC1.11B4.6.

- Anticorpo monoclonal, de caracterizado por ser produzi5^â. - Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser capaz de bloquear a actividade biológica de interleuquina-4 humana .

63. - Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por ser produzido pelo hibridoma MP4.25D2.il.

73. - Hibridoma caracterizado por ser capaz de secretar anticorpos monoclonais específicos para interleuquina-4 humana.
8^â. - Hibridoma, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ser capaz de secretar anticorpos monoclonais específicos para interleuquina-4 humana não glicosílada.

-299^ã. - Hibridoma, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ser capaz de secretar anticorpos monoclonais especificos para interleuquina-4 humana glicosilada.
10^â. - Hibridoma, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por ser IC1.11B4.6 ou MP4.25D2.il.
11^a. - Processo para a produção de um polipeptideo caracterizado por se incluir no referido polipeptideo uma região variável da cadeia leve de um anticorpo monoclonal especifico para interleuquina-4 humana.

123. _ Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o referido anticorpo monoclonal ser produzido pelo hibridoma IC1.11B4.6 ou pelo hibridoma MP4-25D2.il.
13^§. - Processo para a preparação de um polipeptideo caracterizado por se incluir no referido polipeptideo uma região variável da cadeia pesada de um anticorpo monoclonal especifico para interleuquina-4 humana.
14®. - Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o referido anticorpo monoclonal ser produzido pelo hibridoma IC1.11B4.6 ou pelo hibridoma MP4.25D2.il.
15^â. - Processo para a produção de uma composição de ligação especifica para interleuquina-4 huiana, caracterizado por se incluir na referida composição uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve de um anticorpo monoclonal especifico para interleuquina-4 humana.
16^â. - Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o referido anticorpo monoclonal ser produzido pelo hibridoma IC1.11B4.6 ou pelo hibridoma MP4.25D2.il.
17^â. - Método para a detecção da presença de interleuquina-4 humana numa amostra suspeita de conter interleuquina-4, caracterizado por compreender os passos de:

obtenção de um primeiro anticorpo monoclo nal especifico para um primeiro determinante antigénico na interleuquina-4;

obtenção de um segundo anticorpo seleccionado do grupo constituído por uma composição de anticorpos policlonais especifica para interleuquina-4 humana e um segundo anticorpo monoclonal especifico para um segund.o determinante antigénico na interleuquina-4 humana, o segundo determinante antigénico sendo diferente do primeiro determinante antigénico;

obtenção de um meio gerador de sinal capaz de ser operacionalmente associado ao primeiro anticorpo monoclonal ou ao segundo anticorpo para produzir um sinal cuja intensidade está monotônicamente relacionada com a quantidade do primeiro anticorpo monoclonal ou do segundo anticorpo respectivamente;

ligação do primeiro anticorpo monoclonal ou do segundo anticorpo, a um suporte para formar um conjugado anticorpo-suporte;

contacto da amostra com o conjugado anticorpo-suporte de modo a que a interleuquina-4 humana na amostra se ligue ao conjugado anticorpo-suporte;

i contacto do primeiro anticorpo monoclonal operacionalmente associado ao meio gerador de sinal com a interleuquina-4 humana ligada ao conjugado anticorpo-suporte, quando o conjugado anticorpo-suporte inclui o segundo anticorpo; ou contacto do segundo anticorpo operacionalmente. associado ao meio gerador de sinal com a interleuquina-4 humana ligada ao conjugado anticorpo-suporte, quando o conjugado anticorpo-suporte inclui o primeiro anticorpo monoclonal; e medição do sinal gerado pelo meio gerador de sinal.
18⁹. - Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o referido conjugado anticorpo-suporte incluir o referido primeiro anticorpo monoclonal e por o referido segundo-anticorpo ser a referida composição de anticorpos policlonais especifica para interleuqu ina-4.
19^â. - Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o referido primeiro anticorpo monoclonal ser o anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma IC1.11B4.6 ou hibridoma MP4.25D2.il.
20^ã. - Método, de acordo com a reiviii dicação 17, caracterizado por o referido conjugado anticorpo-suporte incluir o referido segundo anti-corpo e por o referido segundo anticorpo ser a referida composição de anticor po policlonais especifica para a interleuquina-4 humana.
21^â. - Método, de acordo com a reivini dicação 20, caracterizado por o referido primeiro anticorpo monoclonal ser o anticorpo monoclonal produzido pelo hibrido-32- ma IC1.11B4.6 ou hibridoma MP4.25D2.il.
22^â. - Equipamento (Kit) para a detecção da presença de interleuquina-4 humana numa amostra suspeita de conter interleuquina-4 humana, caracterizado por compreender:

um primeiro anticorpo monoclonal especifico para um primeiro determinante antigénio na interleuquina-4 humana;

um segundo anticorpo seleccionado do grupo constituído por uma composição de anticorpos policlonais especifica para interleuquina-4 humana e um segundo anticorpo monoclonal especifico para um segundo determinante antigénico na interleuquina-4 humana, o segundo determinante antigénico sendo diferente do primeiro determinante antigénico;

um meio de suporte; e um meio gerador de sinal.
23^â. - Equipamento de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o referido primeiro anticorpo monoclonal ser o anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma IC1.11B4.6 ou hibridoma MP4.25D2.il e por o referido segundo anticorpo ser a referida composição de anticorpos policlonais especifica para interleuquina-4.
24^â. - Equipamento de acordo coma reivindicação 23, caracterizado por o referido meio gerador de sinal compreender uma enzima operacionalmente associada com o referido primeiro anticorpo monoclonal, sendo a enzima seleccionada do grupo constituído por peroxidase, beta-galactosidase e fosfatase alcalina.

-3325^â. - Processo de imunoprecipitação para a extracção de interleuquina-4 humana a partir de uma amostra contendo ínterleuquina-4 humana caracterizado por a amostra ser passada através de uma coluna imunoadsorvente compreendendo um anticorpo monoclonal especifico para interleuquina-4 humana.
26^?. - Processo de imunopurificação, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o referi do anticorpo monoclonal ser o produzido pelo hibridoma