DK169627B1

DK169627B1 - Monoklonale antistoffer mod human interleukin-4, hybridomaer producerende sådanne, fremgangsmåde og sæt til påvisning af human interleukin-4 samt fremgangsmåde til immunoprensning af human interleukin-4

Info

Publication number: DK169627B1
Application number: DK101890A
Authority: DK
Inventors: John S Abrams; Isabelle Chretien; Frank D Lee; Michael K Pearce
Original assignee: Schering Biotech Corp
Priority date: 1987-10-26
Filing date: 1990-04-25
Publication date: 1994-12-27
Also published as: WO1989003846A2; IL88145A0; JPH0698020B2; CA1335653C; EP0314402A2; JPH03503118A; EP0375743A1; CN1176391A; CN1032816A; WO1989003846A3; ES2061736T3; DK101890D0; HK105996A; US5041381A; AU611750B2; IE883213L; DK101890A; AU2782789A; DE3886760D1; PT88847B

Description

Opfindelsen angår monoklonale antistoffer, der er specifikke for human interleukin-4, hybridomaer producerende sådanne, fremgangsmåde og sæt til påvisning af human interleukin-4 samt fremgangsmåde til immunop-5 rensning af human interleukin-4.

Human interleukin-4 (IL-4) blev først klonet og karakteriseret af Yokota et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, s. 5894-5898 (1986). IL-4 er en meget pleio-tropisk lymfokin, der påvirker mange forskellige kompo-10 nenter i immunsystemet. Den besidder aktivitet som T celle vækstfaktor (TCGF) og som B celle vækstfaktor. Den er i stand til at potentiere TCGF aktiviteten af interleukin-2 (IL-2) og den kolonidannende aktivitet af granulocyt makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF). 15 Den inducerer den foretrukne produktion af IgG-j^ og IgE og inducerer ekspressionen af human leukocyt klasse II DR antigener. Disse aktiviteter peger i retning af adskillige mulige terapeutiske anvendelser, f.eks. som et potentierende middel for IL-2 anticancerterapi, som et 20 potentierende middel for GM-CSF-stimuleret knoglemarvsregenerering eller som et middel til at behandle bar lymfocyt syndromet: Touraine, Lancet, s. 319-321 (7.

februar 1981); Touraine og Betuel, Human Immunology, 2, s. 147-153 (1981); og Sullivan et al., J. Clin.

25 Invest., 76, s.75-79 (1985).

Den IgE-inducerende aktivitet af IL-4 kunne have vigtige konsekvenser for personer, der lider af allergiske sygdomme. Tilgængelighed for IL-4 antagonister kunne give et alternativ til anvendelse af gluco-30 corticoide steroider, der har mange skadelige bivirkninger, især ved langvarig brug: se f.eks. Goodman og Gillman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 6. udgave (MacMillan Publisching Compant, New York, 1980). Især tilvejebringer kraftigt blokerende monoklo-35 nåle antistoffer, der er specifikke for human IL-4, et middel til at konstruere antagonister ved at danne an- 2 ti-idiotype antistoffer, se f.eks. US patentsksrift nr. 4.731.237, eller ved mimotop gennemsøgning, se f.eks. Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102, s. 259-274 (1987); eller PCT patentansøgninger WO 86/000991 og 5 WO 86/06487.

Et vigtigt aspekt ved en hvilken som helst behandling med medikamenter er evnen til at forudsige og/eller følge koncentrationen af disse i patientens blod eller i andre kropsvæsker. Monoklonale antistoffer 10 benyttes meget til dette formål: se f.eks. Springer, ed., Hybridoma Technology in the Bioscience and Medi-cne (Plenum Press, N.Y., 1985); og US patentskrifterne nr. 4.562.003, 4.486.530 og 4.255.329.

Ved produktionen af genetisk konstruerede pro-15 teiner såsom IL-4 er adskillelse af det eksprimerede protein fra de transformerede værtsceller og/eller supernatanten fra kulturen deraf et vigtigt problem. Ofte skal man ved adskillelsen lade råmaterialet passere en eller flere gange gennem immunadsorbentkolon-20 ner. Monoklonale antistoffer, der er specifikke for det protein, der skal renses, er nødvendige elementer i sådanne kolonner. Sådanne monoklonale antistoffer kan også benyttes til at måle renhedsgraden opnået ved en bestemt fremgangsmåde, f.eks. ved "Western" blot analyse, 25 Burnette, Anal. Biochem., 112, s. 195-203 (1981).

Det ses klart af det ovenstående, at tilgængeligheden af monoklonale antistoffer, der er specifikke for IL-4, kunne lette dettes medicinske og veterinære anvendelser ved at forbedre de øjeblikkelige rensnings-30 metoder og ved at give midler til at kontrollere koncentrationer af IL-4 i kropsvæsker såsom i blod, urin eller lignende.

Monoklonale antistoffer rettet mod murin IL-4 er kendt. Således undersøger Finkelman et al., Proc. Natl. 35 Acad. Sci. USA 83 (1986), 9675-9678, om det monoklonale rotte IgGl anti-IL-4 antistof 11B11 påvirker produktio- 3 nen af polyklonale IgGl og IgE hos parasitinficerede eller specielt antistofbehandlede mus, og Ohara Et al., J. Immunology 139 (1987), 1127-1134, meddeler affini-tetschromatografisk oprensning af murin IL-4 under an-5 vendelse af ovennævnte monoklonale murine IL-4 antistof 11B11. Referencerne meddeler imidlertid intet om monoklonale antistoffer mod human IL-4, endsige sådanne, der er rettet mod forskellige epitoper på human IL-4.

I modsætning til de kendte antistoffer mod human 10 IL-4 er de monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen ejendommelige ved, at de er specifikke for human IL-4.

Antistofferne ifølge opfindelsen er nyttige til påvisning, rensning, måling og/eller inhibering af human IL-4. De omhandlede antistoffer er afledt af hybri-15 domaer, der er ejendommelige ved, at de er i stand til at udskille antistoffer ifølge opfindelsen.

Fagmanden ved, at ud over de omhandlede monoklonale antistoffer kan tungkædede og letkædede variabel region polypeptider og andre fragmenter af sådanne an-20 tistoffer, såsom halvmolekyler omfattende en let kæde forbundet til en tung kæde med naturlige disulfidbindinger, Fab fragmenter, F(ab)2 fragmenter, Fv fragmenter og lignende benyttes på lignende måde. Opfindelsen inkluderer endvidere fremgangsmåder til anvendelse 25 af de ovennævnte forbindelser til at påvise, rense og måle koncentrationen af human IL-4 samt sæt til udførelse af sådanne fremgangsmåder. Især inkluderer opfindelsen hybridomaerne IC1.11B4.6 og MP4.25D2.il og deres monoklonale antistoffer.

30 Blandinger indeholdende de omhandlede antistof fer eller fragmenter deraf kan endvidere være nyttige som agonister eller antagonister for human IL-4. Især er blandinger, der omfatter fragmenter af antagonistiske anti-lL-4 antistoffer, f.eks. monoklonale antistof-35 fer fra MP4.25D2.il, nyttige terapeutiske midler til behandling af atopiske sygdomme.

4 Sådanne blandinger inkluderer også messenger RNA (mRNA) ekstraheret fra hybridomaer IC1.11B4.6 og MP4.25D2.ll. Sådanne mRNA'er er nyttige ved kloning og eksprimering af fragmenter af IC1.11B4.6 og MP4.25D2.il 5 antistoffer i bakterier, gær eller andre værter.

Antistoffer omfatter en gruppe af polypeptid-kæder, der er sammenkædet med disulfidbroer. To vigtige polypeptidkæder, der betegnes som den lette kæde og den tunge kæde, udgør alle de vigtigste strukturelle 10 klasser (isotyper) af antistof. Både de tunge kæder og de lette kæder er yderligere opdelt i underregioner, der betegnes variable regioner og konstante regioner. Tunge kæder omfatter en enkelt variabel region og tre forskellige konstante regioner, og lette kæder omfatter 15 en enkel variabel region (der afviger fra en sådan i den tunge kæde) og en enkelt konstant region (der afviger fra, hvad man finder i den tunge kæde). De variable regioner i den tunge og i den lette kæde er ansvarlige for bindingsspecificiteten af antistoffet.

20 I denne forbindelse betyder betegnelsen "tung kæde variabel region" et polypeptid (1) hvis længde er 110-125 aminosyrer og (2) hvis aminosyresekvens svarer til en sådan fra en tung kæde fra et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen, idet man udgår fra den tunge 25 kædes N-terminale aminosyre. På lignende måde betyder betegnelsen "let kæde variabel region" et polypeptid (1) hvis længde er 95-115 aminosyrer og (2) hvis aminosyresekvens svarer til en sådan fra en let kæde fra et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen, idet man ud-30 går fra den lette kædes N-terminale aminosyre.

Betegnelserne Fab, Fc, F(ab)2 og Fv benyttes med deres standard immunologiske mening: se f.eks. Klein, Immunology (John Wiley, New York, 1982), eller Parham, Kapitel 14 i Weir, ed. Immunochemistry, 4. udgave 35 (Blackwell Scientific Publishers, Oxford, 1986).

I denne sammenhæng skal betegnelsen "monoklonalt antistof" referere til homogene populationer af immuno- 5 globuliner, der er i stand til specifikt at binde til human IL-4. Man bør forstå, at human IL-4 kan have en eller flere antigeniske determinanter omfattende (l) peptid antigeniske determinanter, der består af enkelte 5 peptidkæder i human IL-4, (2) konformationelle antigeniske determinanter, der består af mere end en rumligt nærliggende peptidkæde, hvori de forskellige aminosyre-sekvenser er anbragt usammenhængende langs polypeptid-sekvensen i human IL-4; og (3) posttranslationelle 10 antigeniske determinanter, der enten helt eller delvis består af molekylære strukturer, der er kovalent bundet til human IL-4 efter translation såsom carbonhydrat-grupper eller lignende. Antistoffer ifølge opfindelsen kan være rettet mod en eller flere af disse determinan-15 ter.

I denne forbindelse skal betegnelsen "bindende blanding" betyde en blanding omfattende to polypeptid-kæder (1) der, når de associeres under virkning, antager en konformation med stærkt bindende affinitet for 20 human IL-4, og (2) der er afledt fra et hybridoma, der producerer monoklonale antistoffer, der er specifikke for humant IL-4. Betegnelsen "associeres under virkning" skal angive, at de to polypeptidkæder med henblik på binding kan være anbragt i forhold til hinanden på 25 forskellige måder, deriblandt associering i et nativt antistoffragment såsom Fab eller Fv eller ved hjælp af genetisk fremstillede cysteinholdige peptidlinkere ved carboxyltermini. Normalt svarer de to polypeptidkæder til den lette kæde variable region og tung kæde variab-30 le region i et monoklonalt antistof, der er specifikt for human IL-4.

På tegningen viser fig. 1 en diagrammatisk repræsentation af en ekspressionsvektor, der er egnet til at eksprimere ikke 35 glycosyleret human IL-4 i en bakterievært; 6 fig. 2 absorptionsprofilen i slutrensningstrin-net for human IL-4; og fig. 3 (del A og B) neutralisering af 125I-CHO HuIL-4 binding til Daudiceller.

5 Hybridomaer ifølge opfindelsen fremstilles ved kendt teknik. Sædvanligvis involverer processen, at man fusionerer en udødelig cellelinie med en B lymfocyt, der producerer det ønskede antistof. Alternativt er ikke fusionsfremgangsmåder til fremstilling af udødeli-10 ge antistofproducerende cellelinier mulige, f.eks. en viralt induceret transformation: Casali et al., "Human Monoclonals from Antigen-Specific Selection of B Lymphocytes and Transformation by EBV", Science, 234, s. 476-479 (1986). Udødelige cellelinier er sædvanligvis 15 transformerede pattedyrsceller, især myelomaceller fra gnavere, kvæg eller mennesker. Man anvender oftest rotte elller muse myelomacellelinier, da de er lettest tilgængelige og er bekvemme.

Fremgangsmåder til opnåelse af de relevante lym-20 focyter fra pattedyr, der har modtaget en injektion med det relevante antigen, er velkendte. Man benytter almindeligvis perifere blodlymfocytter (PBL'er), hvis man ønsker celler af human oprindelse eller miltceller eller lymfeknudeceller, hvis man ønsker ikke humane pat-25 tedyrskilder. Man giver et værtsdyr gentagne gange indsprøjtninger med det rensede antigen og lader dyret generere de ønskede antistofproducerende celler, før disse indhøstes til fusionering med den udødeliggjorte cellelinie. Fusionsfremgangsmåden er også velkendt og 30 involverer almindeligvis, at man blander cellerne med et sammensmeltende middel såsom polyethylenglycol. Hy-bridomaerne udvælges ved standardteknik såsom ved HAT udvælgelse. Blandt sådanne hybridomaer udvælger man sådanne, der udskiller det ønskede antistof, ved at fore-35 tage analyse på dyrkningsmediet ved standardimmunassays såsom Western blot, ELISA, RIA eller lignende. Anti- 7 stofferne udvindes fra medium under anvendelse af standard proteinrensningsfremgangsmåder, f.eks. Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985). Mange referencer er tilgængelige, så 5 man kan blive vejledt med henblik på en af de ovenfor nævnte fremgangsmåder, se f.eks. Kohier et al,, Hybri-doma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, 10 Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, PL, 1982); og lignende.

Anvendelse og frembringelse af fragmenter af an-15 tistoffer er også velkendt, f.eks. Fab fragmenter: Tijssen, Practice and Theory of Enzyme immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); og Fv fragmenter: Hochman et al., Biochemistry, 12, s. 1130-1135 (1973), Sharon et al., Biochemistry, 15, s. 1591-1594 (1976) og 20 Ehrlich et al., US patentskrift nr. 4.355,023; og antistof halvmolekyler: Auditore-Hargreaves, US patentskrift nr. 4.470.925. Derudover kan man benytte sådanne forbindelser og blandinger ifølge opfindelsen til at konstruere bispecifikke antistoffer ved kendt teknik, 25 f.eks. ved yderligere fusion af hybridomaer (dvs. til dannelse af såkaldte kvadromaer): Reading, US patentskrift nr. 4.474.493; eller ved kemisk forening af halvmolekyler: Brennan et al., Science, 229, s. 81-83 (1985) .

30 Hybridomaer og monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen frembringes enten mod glycosylerede eller ikke-glycosylerede versioner af rekombinant fremstillet færdig human IL-4. Almindeligvis frembringes ikke glycosylerede versioner af human IL-4 i E^ coli, og gly-35 cosylerede versioner frembringes i pattedyrscelleværter, f.eks. CV1 eller COS abeceller, muse L celler el- 8 ler lignende. Rekombinant fremstillet færdigt human IL-4 fremstilles, idet man indfører en ekspressionsvektor i en værtscelle under anvendelse af kendt teknik, se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Labora-5 tory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982); Okayama og Berg, Mol. Cell. Biol., 2, s. 161-170 (1982) og 3, s. 280-289 (1983); Hamer, Genetic Engineering, 2, s. 83-100 (1980) og US patentskrift nr.

4.599.308; Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 2, s.1304-10 1319 (1982); eller lignende.

Konstruktion af bakterielle ekspressionsvektorer eller pattedyrsekspressionsvektorer hører til kendt teknik, såsnart man kender eller på anden måde har adgang til nucleotidsekvenser, der koder for et ønsket 15 protein; se f.eks. DeBoer i US patentskrift nr. 4.511.433, der beskriver promotere til anvendelse i bakterielle ekspressionsvektorer; Goeddel et al., i US patentskrift nr. 4.601.980 og Riggs i US patentskrift nr. 4.431.739, der beskriver produktion af pat-20 tedyrsproteiner af coli ekspressionssystemer; og Riggs (se ovenfor), Ferreti et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, s. 599-603 (1986), Sproat et al.. Nucleic Acids Research, 13, s. 2959-2977 (1985), og Mullenbach et al., J. Biol. Chem., 261, s. 719-722 (1986), der be-25 skriver, hvordan man skal konstruere syntetiske gener til ekspression i bakterier. Aminosyresekvensen for færdig human IL-4 beskrives af Yokota et al. (se ovenfor), og cDNA, der koder for human IL-4 båret af pcD vektoren beskrevet af Yokota et al. (se ovenfor) er de-30 poneret hos American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, under deponeringsnummer 67029. Mange bakterielle ekspresssionvektorer og værter er kommercielt tilgængelige eller kan fås hos ATCC. Man isolerer foretrukket human IL-4 til immunisering af værtsdyr fra 35 kultursupernatanter af COS, CV1 eller muse L celler, der er blevet midlertidigt transficeret med den ovenfor nævnte pcD vektor.

9

Antistoffer og antistoffragmenter, der er karakteristiske for hybridomaer ifølge opfindelsen, især IC1.11B4.6, kan endvidere fremstilles rekombinant, idet man ekstraherer messenger RNA, konstruerer et cDNA bi-5 bliotek og udvælger kloner, der koder for segmenter af antistofmolekylet: se f.eks. Wall et al.., Nucleic

Acids Research, 5, s. 3113-3128 (1978); Zalsut et al., Nucleic Acids Research, 8, s. 3591-3601 (1980); Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81, s. 3273-3277 10 (1984); Boss et al., Nucleic Acids Research, 12, s. 3791-3806 (1984); Amster et al., Nucleic Acids

Research, 8, s. 2055-2065 (1980); og Moore et al., US patentskrift nr. 4.642.234. Især kan sådanne fremgangsmåder benyttes til at fremstille interspecifikke mono-15 klonale antistoffer, hvori den bindende region fra en specie er kombineret med en ikke bindende region af antistoffet fra en anden specie; se f.eks. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84, s. 3439-3443 (1987).

Anvendelser af monoklonale antistoffer til rens-20 ning og målinger er velkendt, f.eks. affinitetschroma-tografi: Affinity Chromatography: Principles and

Methods (Pharmacia, Orebro, Sverige, 1979); Secher et al., Nature, 285, s. 446-450 (1980), og US patentskrift nr. 4.423.147; samt EP patentansøgning nr. 0190711 25 (13. august 1986); og immunassaysfremgangsmåder: Tijs-sen (se ovenfor); US patent nr. 4.486.530; og Burnette (se ovenfor). Man kan benytte affinitetschromatrografi til at rense humant IL-4, idet man ekstraherer dette fra en prøve såsom en kultursupernatant fra celler 30 transformeret eller transficeret med en human IL-4 ekspresssionvektor. I denne forbindelse vil en sådan rensningsproces blive betegnet en immunoprensningsproces.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til ved immun-35 oprensning at ekstrahere human interleukin-4 fra en prøve med indhold heraf er ejendommelig ved det i krav 13's kendetegnende del angivne.

10

Typisk vil man kovalent fæste et monoklonalt antistof, der er specifikt for human IL4, til en bærer i fast fase (i denne beskrivelse betegnet et "immunad-sorbent"), der anbringes i en kolonne eller en behol-5 der, gennem hvilken man lader prøven passere. Human IL-4 fra prøven bindes fortrinsvis til bindingsstederne på de tilfæstede monoklonale antistoffer, hvorimod resten af materialet fra prøven bortvaskes fra kolonnen eller beholderen. Derefter eluerer man human IL-4 fra 10 immunadsorbenten ved kendt teknik, f.eks. ved lav pH værdi, høj saltkoncentration eller lignende.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til påvisning af eventuelt tilstedeværende human interleukin-4 i en prøve er ejendommelig ved det i krav 7's kendetegnende 15 del angivne.

Sådanne "two site" eller "sandwich" immunassays' er f.eks. beskrevet i US patentskrift nr. 4.486.530. Disse assays involverer anvendelse af to forskellige grupper af anti IL-4 antistoffer, hvoraf mindst et be-20 står af et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen, såsom et sådant produceret af IC1.11B4.6. Man fæster antistoffer fra det ene af de to grupper til overfladen af en bærer på fast fase. Derefter udsætter man de fæstede antistoffer for en prøve, der mistænkes for at 25 indeholde human IL-4. IL-4 molekyler binder til de tilfæstede antistoffer. Nu tilfører man den anden gruppe antistoffer til det bundne IL-4, og disse binder til en eller flere antigene determinanter, der er forskellige fra den eller disse, til hvilken/hvilke den første an-30 tistoffer blev bundet. Derefter påviser man IL-4 ved indirekte eller direkte signaldannende forholdsregler, der står i forbindelse med den anden gruppe antistoffer. Man kan f.eks. direkte konjugere antistofferne til en signaldannende enhed såsom et enzym, et sjælden 35 jordart chelaterende middel eller et organisk farvestof, eller de kan indirekte forbindes til en eller 11 flere signaldannende enheder gennem yderligere antistoffer eller komplekser med høj affinitet, såsom avidin-biotin komplekser. Man foretager kvantitative målinger af koncentrationen af IL-4 ved at sammenligne 5 det signal, der dannes fra prøven, med et signal stammende fra IL-4 standarder med kendte koncentrationer af humant IL-4..

Opfindelsen inkluderer sæt af reagenser til anvendelse ved ovennævnte fremgangsmåde ifølge opfindel-10 sen, idet sættet er ejendommeligt ved det i krav 10' s kendetegnende del angivne.

Sådanne sæt inkluderer (1) en bærer på fast fase, (2) et første antistof, der er monoklonalt og er i stand til at binde til en første antigenisk determi-15 nant fra human IL-4, (3) et andet antistof udvalgt blandt et monoklonalt antistof, der er i stand til at binde til en anden antigenisk determinant fra human IL-4 og et polyklonalt antistof, der er specifikt for human IL-4 (i denne sammenhæng betegnet en "polyklo-20 nal antistofblanding") og (4) midler til signaldannelse i forbindelse med ét af de tre antistoffer. Afhængig af udførelsesformen kan sættene inkludere en udvælgelse af to af de tre anti IL-4 antistoftyper, enten et monoklonalt antistof, der er specifikt for en første antige-25 nisk determinant og et monoklonalt antistof, der er specifikt for en anden antigenisk determinant, eller et monoklonalt antistof, der er specifikt for en første og anden antigenisk determinant og en polyklonal antistofblanding. Antistofferne kan foreligge i opløsning eller 30 på frysetørret form. Et af grupperne af antistoffer kan være tilgængeligt til anbringelse på overfladen af den faste bærer, når sættes skal benyttes, eller kan leveres allerede fæstet til den faste bærer. Midler til dannelse af signaler kan leveres allerede i forbindelse 35 med én af de to antistof typer eller kan kræve kombinering med en eller flere komponenter, f.eks. puffere, 12 antistof-enzymkonjugater, enzymsubstrater eller lignende, før brugen. Mange typer signaldannende midler findes tilgængelige, og disse kan udgøre en eller flere komponenter i et sæt. Forskellige signaldannende midler 5 beskrives af Tijssen (se ovenfor). Sættene kan også inkludere yderligere reagenser, f.eks. blokerende reagenser for at reducere uspecifik binding til overfladen af den faste fase, vaskereagenser, enzymsubstrater og lignende. Overfladen af den faste fase kan udgøres af mi-10 krotiterplader, mikrokugler eller lignende, fremstillet af polyvinylchlorid, polystyren eller lignende materialer, der er egnet til immobilisering af proteiner. Sådanne materialer med fast-fase-overflader betegnes her som "bæremidler". Foretrukket er et enzym, der kataly-15 serer dannelsen af et fluorescerende eller farvet produkt, en komponent i de signaldannende midler. Mere foretrukket udvælger man enzymet blandt peroxidase, alkalisk phosphatase og β-galactosidase. Substrater og reaktionsbetingelser for sådanne enzymer hører til kendt 20 teknik; se f.eks. Tijssen (se ovenfor).

Antistofferne ifølge opfindelsen eller fragmenter deraf kan endvidere benyttes som komponenter i farmaceutiske blandinger rettet på IL-4 relaterede sygdomme. Farmaceutiske blandinger, der omfatter sådanne mo-25 noklonale antistoffer (eller bindingsfragmenter deraf) med agonistisk virkning kan benyttes til at forstærke IL-4 aktivitet. På den anden side kan blandinger, der omfatter de monoklonale antistoffer (eller bindingsfragmenter deraf) med blokerende eller antagonistisk 30 virkning benyttes til at undertrykke IL-4 aktivitet. Sådanne blandinger indeholder en terapeutisk mængde af i det mindste én af de monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen eller bindingsfragmenter deraf i en farmaceutisk effektiv bærer. En farmaceutisk bærer kan være 35 en hvilken som helst forligelig ugiftig substans, der er egnet til indgivelse af antistofferne ifølge opfin- 13 delsen eller fragmenter deraf til en patient. Man kan som en bærer benytte sterilt vand, alkohol, fedtstoffer, voksarter og inerte faste stoffer. Farmaceutisk acceptable adjuvanser (puffermidler, dispergerende mid-5 ler) kan også indføres i det farmaceutiske præparat. Almindeligvis er blandinger, der er egnede til parenteral indgivelse af sådanne medikamenter, velkendte, se f.eks. Remington's Pharmaceutical Science, 15. udgave (Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980). Alterna-10 tivt kan man indføre blandinger ifølge opfindelsen i patientens krop ved et implanterbart indgivelsessystem for medikamenter, se f.eks. Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 24, s. 199-236 (1984).

De følgende eksempler skal illustrere opfindel-15 sen. Udvælgelsen af vektorer og værter såvel som koncentrationen af reagenser, temperaturer og værdien af andre variable er givet som eksempler på anvendelse af opfindelsen.

Eksempel I

20

Produktion af glycosyleret human IL-4 ved transfice-ring af COS 7 abeceller med pcD-human-lL-4

Ekspressionsvektoren pcD-human-IL-4 og værts-25 cellen COS 7 er tilgængelig fra American Type Culture Collection med deponeringsnummre henholdsvis 67029 og CRL 1651. Man mangfoldiggjorde pcD-human-IL-4 klonen, oprensede plasmid DNA og fulgte en standardtransfice-ringsfremgangsmåde til at transficere COS 7. Man udsåe-30 de ca. 1 x 106 COS 7 celler på 100 mm vævskulturplader med indhold af Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DME), 10% kalvefosterserum og 4 mM L-glutamin. Ca. 24 timer efter denne udsåning sugede man mediet fra pladerne og vaskede cellerne to gange med serumfri pufret 35 (50 mM Tris) DME. Til hver plade sætter man 4 ml serumfri pufret DME (med 4 mM L-glutamin), 80 μΐ DEAE-dex- 14 tran og 5 pg pcD-human-IL-4 DNA. Cellerne inkuberes i denne blanding i 4 timer ved 30 °C, hvorefter man bortsuger blandingen og vasker cellerne en gang med serumfri pufret DME. Efter vask sætter man 5 ml DME med 4 mM 5 L-glutamin, 100 μΐ chloroquin og 2% kalvefoster serum til hver plade og inkuberer cellerne i 3 timer, hvorefter man vasker dem to gange med serumfri puf ret DME.

Nu tilsætter man 5 ml DME med 4 mM L-glutamin og 4% 0 kalvefosterserum og inkuberer cellerne ved 37 C i 24

10 timer, hvorefter man vasker cellerne 1-3 gange med DME

eller PBS, 5 ml serumfri DME (med 4 mM L-glutamin) til- 0 sættes, og man inkuberer cellerne ved 37 C, indtil man 5 dage senere indhøster kultursupernatanterne.

15 Eksempel II

Rensning af glycosyleret human IL-4 fra supernatanter fra COS 7 transficering 20 A. Biologisk assay til rensning

Man benyttede T celle vækstfaktoraktivitet (TCGF) til analyse for human IL-4 under rensning fra supernatanterne fremstillet ifølge eksempel I. Der fin-25 des standardassays beskrevet for TCGF aktivitet: f.eks. Devos et al.. Nucleic Acids Research, 11, s. 4307-4323 (1983); Thurman et al., J. Biol. Response Modifiers, 5, s. 85-107 (1986); og Robert-Guroff et al., kapitel 9 i Guroff, ed. Growth and Maturation Factors (John Wiley, 30 New York, 1984). Almindeligvis er TCGF assays baseret på evnen hos en faktor til at fremme proliferering af perifere T lymfocytter eller IL-2-afhængige T cellelinier; se f.eks. Gillis et al., J. Immunol., 120, s. 2027 (1978). Proliferering kan bestemmes ved stan-35 dardteknik, f.eks. ved inkorporering af tritieret thy-midin eller ved kolorimetriske fremgangsmåder: Mosmann, 15 J. Immunol. Meth., 65, s. 55-63 (1983). Man udførte analysen for human IL-4 TCGF aktivitet på følgende måde: Blod fra en sund donor blev af tappet i et hepari-niseret reagensglas og anbragt ovenpå Ficoll-Hypaque, 5 f.eks. 5 ml blod pr. 3 ml Ficoll-Hypaque i et 15 ml centrifugerør. Efter centrifugering ved 3000 g i 20 minutter bortsugede man celler ved fasegrænsen og fortyndede disse i et vækstmedium bestående af RPMI 1640 med indhold af 10% kalvefosterserum, 50 μΐ 2-mercapto- 10 ethanol, 20 pg/ml phytohæmagglutinin (PHA) og rekombi- 0 nant human IL-2. Efter 5-10 dages inkubering ved 37 C vaskede man de PHA stimulerede perifere blodlymfocyter (PBL'er) og benyttede disse i et 2 dages kolometrisk assay (Mosmann, se ovenfor). Serier af dobbelte for-15 tyndinger af en IL-4 standard (supernatanter fra pcD-human-IL4-transficerede COS 7 celler) eller den fraktion, der skulle afprøves, blev anbragt i 96 brønds bakker, idet man benyttede det ovenfor beskrevne vækstmedium til opnåelse af slutrumfang på 50 μΐ/brønd. Man 20 satte 50 μΐ af PHA stimuleret PBL'er med ca. 4-8 x 10^ celler/ml til hver brønd og inkuberede bakkerne ved 0 37 C i 2 dage. Derefter målte man cellevæksten ifølge Mosmann (se ovenfor).

En enhed er i denne forbindelse den mængde fak-25 tor, der i en brønd (0,1 ml) stimulerer 50% maksimal proliferering af 2 x 104 PHA stimuleret PBL'er over en 48 timers periode.

B. Rensning 30

Man opnåede rensning ved i rækkefølge at benytte kationbytterchromatografi, gelfiltrering og revers fase højtryksvæskechromatografi. Alle operationer blev ud-0 ført ved 4 C.

35 Man bortcentrifugerede COS 7 cellerne, ind koncentrerede supernatanten ca. 10 gange ved ultra- 16 filtrering og lagrede den ved -80 C indtil senere anvendelse. Man bestemte indholdet af IL-4 ved at analysere for evnen hos proteinet til at stimulere prolife-ring af phytohæmagglutinininducerede humane perifere 5 blodlymfocytter, dvs. ved TCGF aktivitet under anvendelse af det ovenfor beskrevne standardassay.

Man dialyserede koncentreret COS-7 supernatant med en TCGF aktivitet på ca. 104-106 enheder/ml og et proteinindhold på ca. 15-20 mg/ml imod skift af 50 10 mM natrium HEPES, pH 7,0 over en 24 timers periode (hvert skift var på ca. 10-15 gange rumfanget af et koncentrat). Man satte dialysatet på en kolonne (1 x 2,5 cm) af S-Sepharose® (flowhastighed: 0,2 ml/min), der i forvejen var bragt i ligevægt med 50 mM natrium 15 HEPES. pH 7,0. Kolonnen blev vasket med 15 kolonnerumfang af ligevægtspuffer og derefter elueret med 20 kolonnerumfang af en lineær natriumchloridgradient, der gik fra 0-0,5 M natriumchlorid i 50 mM natrium HEPES, pH 7,0. Man afsluttede elueringen isocratisk med 5 ko-20 lonnerumfang 50 mM natrium HEPES, .0,5 M NaCl, pH 7,0. Man samlede 1,5 ml og 1,8 ml fraktioner fra to forskellige produktioner. Man fandt ved begge disse forsøg, at indholdet af IL-4 eluerede mellem 300 mM-500 mM natriumchlorid .

25 Man kombinerede fraktionerne fra S-Sepharose®- kolonnerne med indhold af IL-4, idet de to rumfang tilsammen var 9,0 og 10,8 ml. Begge disse blev indkoncentreret til 1,9 ml ved ultrafiltrering under anvendelse af en Amicon® YM5 membran (molekylvægtsafskæring: 30 5000). Genudvindingen af protein fra dette trin var ca. 80%. Man satte den indkoncentrerede IL-4 opløsning på en Sephadex® G-100 kolonne (1,1 x 50 cm), der i forvejen var bragt i ligevægt med 50 mM HEPES, 0,4 M NaCl, pH 7,0, og eluerede kolonnen med samme puffer ved 0,15 35 ml/min. Man samlede ialt 50 fraktioner (1,0 ml/frak-tion) og analyserede for IL-4 indhold. Man kunne ob- 17 servere en top i biologisk aktivitet ved en tilsyneladende molekylvægt på 22.000 dalton. Sephadex® G-100 blev kalibreret for bestemmelse af tilsyneladende molekylvægt med serumalbumin fra kvæg (65.000 dalton), kul-5 syreanhydrase (30.000 dalton) og cytochrom C (11.700 dalton).

Man indkoncentrerede en fraktion med indhold af IL-4 aktivitet fra Sephadex® G-100 kolonnen 3-4 gange under vakuum og indsprøjtede den i en Vydac C-4 guard 10 kolonne (4,6 x 20 mm). Man frembragte en lineær gradient af 0-72% (v/v) acetonitril i 0,1% (v/v) tri- fluoreddikesyre (TFA) i 15 minutter ved en kolonnetem-0 peratur på 35 C og med en flowhastighed på 1,0 ml/min. Herved opnåede man tre toppe, der blev påvist ved 214 15 nm, idet opholdstiderne var henholdsvis 7, 8,2 og 8,7 minutter (toppene l, 2 og 3 i fig. 2). En 40 μΐ portion af top 2 (elueringstid 8,2 min) blev frysetørret og igen opløst i mindst mulig mængde essentielt medium med indhold af 10% kalvefosterserum. Denne opløsning viste 20 en positiv TCGF respons. En 300 μΐ portion af top 2 blev inddampet til tørhed og igen opløst i 200 μΐ 0,1% w/v natriumdodecylsulfat (SDS). En 2 μΐ portion blev fortyndet i 200 μΐ 1% v/v TFA og igen chromatografe-ret. HPLC på denne prøve gav en enkelt top ved 215 nm. 25 Materiale fra top 2 tydede på en aktivitet på ca. 7 x 108 enheder/mg.

Eksempel III

30 Produktion af ikke-qlycosyleret human IL-4 i Escherichia coli

Man konstruerede en E. coli ekspressionsvektor benævnt TRPCll under anvendelse af standardteknik, 35 f.eks. som beskrevet i Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).

18

Man konstruerede vektoren TRPC11 ved at ligere et syntetisk konsensus RBS fragment til Clal linkere (ATGCAT) og ved at klone de opnåede fragmenter i pMTllhc, der var gennemskåret med Clal (og som tidlige-5 re var modificeret til at indeholde Clal stedet). pMTllhc er et lille (2,3 kilobaser) højkopi, AMPR, TETS derivat af pBR322, der bærer Ecol-Hindlll polylinkerr-egionen fra ttVX plasmidet (beskrevet af Maniatis et al., se ovenfor). Det blev modificeret til at indeholde 10 Clal stedet, idet man gennemskår pMTllhc med Ecol og BamHI, udfyldte de dannede klæbende ender og ligerede med Clal linker (CATCGATG), hvorved EcoRI og BamHI stederne blev genoprettet, og Smal stedet blev erstattet med et Clal sted.

15 En transformant fra TRPC11 konstruktionen havde en tandem RBS sekvens flankeret af Clal steder. Man-fjernede det ene af Clal stederne og en del af den anden kopi af RBS sekvensen ved at fordøje dette plasmid med Pstl, behandle med Bal3l nuclease, gennemskære med 20 EcoRI og behandle med T4 DNA polymerase under tilstedeværelse af alle fire desoxynucleotidtriphosphater. De opnåede 30-40 bp fragmenter blev udvundet ved poly-acrylamidgelelektroforese og klonet i pUC12, der var gennemskåret med Smal. Derefter klonede med et 248 bp 25 E^ coli trpP-bærende EcoRI fragment afledt af pKClOl (beskrevet af Nichols et al. i Methods in Enzymology, 101, s. 155 (Academic Press, N.Y. 1983)) i EcoRI stedet til at fuldstændiggøre TRPCll konstruktionen, der illustreres i fig. 1.

30 Man benyttede TRPCll som en vektor for human IL-4 cDNA, idet man først fordøjede den med Clal og BamHI, rensede den og derefter blandede den med EcoRV/BamHI fragmentet fra pcD-125 (deponeret hos ATCC med deponeringsnummer 67029) i en standardligerings-35 blanding med indhold af 0,1 ]im af følgende syntetiske linker: 19 5» - CG ATG CAC AAG TGC GAT - 3'

TAG GTG TTC ACG CTA

5 Man transformerede coll AB1899 direkte med ligeringsopløsningen under anvendelse af standardcal-ciumchloridfremgangsmåden, propagerede og udplattede. Man udvalgt kolonier, der indeholdt IL-4 cDNA indsætningsstykket, idet man benyttede en mærket oligonu-10 cleotidsonde. Transformanterne blev dyrket i L-urt og IL-4 blev i det væsentlige eksprimeret.

Eksempel IV

15 Rensning af ikke qlycosyleret human IL-4 fra aggregater produceret af Escherichia coli

Man dyrkede en 1 1 kultur af Eh_ coli AB1899 (Ion-) (opnået fra Yale University Eh_ coli Genetics 20 Center, New Haven, CT) til en OD560=2 (ca. 1,6 x 109 celler/ml). Cellerne blev indhøstet ved centrifugering 0 ved 4500 g i 15 minutter ved 4 C, og man suspenderede centrifugebundfaldet i 30 ml 50 mM Tris puffer, pH 8,0 med indhold af 50 mM NaCl, 1 mM ethylendiamintetraeddi-25 kesyre (EDTA) og 0,1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). Man tilsatte EDTA og PMSF for at inhibere pro-teaseaktivitet, der kunne nedbryde human IL-4 før rensningen. Derefter lydbehandlede man cellerne (50 Hz (50%) ved 70 W) og centrifugerede ved 25000 g i 15 mi-0 30 nutter og 4 C. Man kunne vise, at den vigtigste proteinkomponent i det dannede centrifugebundfald var IL-4, idet man sammenlignede båndmønsteret fra en gel af elektroforetisk adskilt pelletmateriale (der var solu-biliseret i natriumdodecylsulfat (SDS) og farvet med 35 Coomassie blåt) med en negativ kontrol.

Efter fjernelse af supernatanten suspenderede man igen centrifugebundfaldet i Tris pufferopløsning 20 (50 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, pH 8,0; 9 ml for hvert gram bundfaldmateriale) med indhold af 5M guanidin,HCl, 2 mM glutathion (reduceret form) og 0,2 mM glutathion (oxideret form). Efter ca. 5 1 time ved stuetemperatur fortyndede man opløsningen 1:9 i en Tris pufferopløsning, pH 8,0, med indhold af 2 mM glutathion (reduceret form) og 0,2 mM glutathion (oxideret form). Hvis der dannedes bundfald under fortyndingen, dialysen eller indkoncentreringen, fjernede 10 man disse ved centrifugering før man fortsatte. Hele rumfanget blev derefter dialyseret natten over tre gange mod 3 liter phosphatpufferopløsning. Dialysatet (dvs. det materiale, der var holdt tilbage i dialysesækken) blev indkoncentreret på et Amicon® YM5 filter 15 (slutkoncentration 8 mg/ml) og underkastet gelfiltre-ringschromatografi (kolonne: P30 (BioRad), 1,5 x 90 cm; PBS elueringspuffer; flowhastighed: 8 ml/time). Man indsamlede fraktioner over 15 minutters intervaller. Fraktionerne 23-27 blev sammenbragt og yderligere ana-20 lyseret ved revers fase HPLC. Denne analyse tydede på, at de samlede fraktioner indeholdt 95% ren human IL-4. Udbyttet fra 1 liter kulturen (OD560 = 2) var 2 mg human IL-4 med en specifik aktivitet på 5 x 107 enheder/ mg.

25

Eksempel V

Produktion af hybridoma IC1.11B4.6 30 Man immuniserede en Lewis rotte af hankøn intra- peritonealt (i.p.) med 1 ml af en opløsning af human IL-4 emulsifieret med 1 ml af Freunds komplette adju-vans (CFA). Opløsningen af human IL-4 bestod af human IL-4 med en koncentration på 14 pg/ml i 10 mM Tris HCl, 35 0,5 mM NaCl, pH 7,4. Det humane IL-4 var produceret ifølge eksemplerne I og II og havde en specifik aktivi- 21 tet på 2 x 107 enheder (mg). To uger efter den første immunisering fik rotten igen en indsprøjtning i.p. med 1 ml opløsning af human IL-4 emulfisieret med 1 ml CFA. Tre måneder efter den anden injektion fik rotten 5 en forstærkende intravenøs indsprøjtning med en 1 ml opløsning af human IL-4 (15 mg). Fire dage efter den forstærkende injektion aflivede man rotten, man indsamlede blod og fjernede milten til fusion. Miltcellerne blev fusioneret med musemyelomaceller, P3C63-Ag8.653 10 (ATCC CRL 1580) i et 1:1 forhold under anvendelse af polyethylenglycol (PEG). Cellesuspensionen (3,5 x 105 celler/ml i HAT medium) blev fordelt i 40 96-brønds plader. Ti dage senere afprøvede man hybridomasuperna-tanterne for deres evne til at binde til human IL-4 di-15 rekte immobiliseret på mikrotiterplader (indirekte ELISA) eller til human IL-4 bundet til en immobiliseret polyklonal igG fraktion af kanin antihuman IL-4. Man påviste bundet antistof ved hjælp af peroxidase konjugeret gede antirotte immmunoglobulin ved en standard-20 fremgangsmåde. De hybridomaer, der udskilte antistoffer, der reagerede med IL-4 blev klonet ved begrænsende fortynding. Ét hybridoma, udvalgt ved denne fremgangsmåde var IC1.11B4.6. Man bestemte, at antistofferne fra IC1.11B4.6 var af IgG2a isotype. Hybridomaerne kan lag-25 res (f.eks. ved -70°C i dyrkningsmedium med io% DMSO) og dyrkes under anvendelse af standardpattedyrscelle dyrkningsteknik (f.eks. RPMI 1640 med 10% kalvefoster-serum supplementer et med 1 mM glutamin og 50 mM 2-mer-captoethanol).

30 22

Eksempel VI

Produktion af hybridoma MP4.25D2.il 5 Man producerede en gruppe hybridomaer og gennem søgte antistofferne derfra for human IL-4 specificitet i det væsentlige som angivet i eksempel V. Derefter gennemsøgte man hybridomaerne i gruppen yderligere for evnen hos deres antistoffer til at blokere TCGF aktivi-10 teten hos human IL-4 ved et standard in vitro assay (som beskrevet i eksempel II). Blandt de mange identificerede blokerende monoklonale antistoffer udvalgte man det, der blev produceret af MP4.25D2.il, da det havde den højste værdi for blokerende aktivitet. Anti-15 stofferne produceret af MP4.25D2.il blev bestemt til at være rotte igGj.

Eksempel VII

20 Sandwich assay for human IL-4

Man adsorberer 100 μΐ kanin polyklonal antihu-man IL-4 antistof (10 pg/ml i PBS renset på en protein A affinitetskolonne) på overfladen af alle brøndene i 25 en 96-brønds polyvinylchloridmikrotiterplade i 2 timer ved 37°C. (PBS består af 8,0 g NaCl, 0,2 g KH2P04, 2,9 g Na2HP04,12H20 og 0,2 g KCl i 1 liter destilleret vand, pH er 7,4). Man vasker pladen med PBS-Tween® (fremstilket nøjagtigt som PBS, idet man dog tilsætter 30 0,5 ml Tween® 20 pr. liter) til fjernelse af ikke bundet antistof og anbringer derefter to sæt fortyndinger i rækkefølge (i PBS) af renset E. coli frembragt human IL-4 i to 12-brønds rækker af brønde efter faldende IL-4 koncentration, der går fra 1000 pg/ml til 15 35 pg/ml. Man anbragte følgende prøver i de tilbageblevne brønde: (l) kultursupernatanter fra en human Y celle 23 klon, f.eks. ClLyl+2~/9 (ATCC CRL 8179), (2) kultursu-pernatanter af COS 7 celler transficeret med pcD-hu-man-IL-4, (3) human serum med indhold af forskellige koncentrationer af renset COS 7 produceret IL-4, og (4) 5 prøver med indhold af humant IL-Ια, IL-2, IL-3, IFN-y, IFN-a2b, GM-CSF og BSF-2. Alle prøverne blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur. Efter vask med PBS-Tween® satte man 1:10 fortynding af supernatant fra en kultur og IC1.11B4.6 til hver brønd (100 μΐ/brønd) og tillod 10 inkubation i 1 time ved stuetemperatur. Efter inkube-ringen vaskede man pladen og tilsatte peroxidasekon-jugeret gede anti-rotte antistof og lod dette inkubere i 1 time ved stuetemperatur, hvorefter man igen vaskede pladen. Derefter tilsatte man peroxidasesubstratet 15 ABTS og bestemte koncentrationerne af human IL-4 ved hjælp af de optiske densiteter i brøndene. Resultaterne tyder på, at man ved assayet kan påvise pattedyrsproduceret human IL-4 i koncentrationer så lave som ' 50 pg/ml i humant serum, og at man ved assayet ikke på-20 viser nogen af de ovenfor opregnede lymfokiner.

Tabel A nedenfor og fig. 3A viser evnen hos 11B4 F(ab), IgG og rå supernatant (urenset antistof) til at inhibere binding af 125I-HulL-4 til Daudi celler. Alle tre præparater inhiberede bindingen til en maksimal 25 grad på 70%. De monoklonale antistoffer GL117 F(ab), IgG og rå supernatant som kontrol påvirkede ikke bindingen. (Kontrolantistofferne er mod et ubeslægtet antigen af samme idiotype). Den koncentration af renset 11B4, IgG eller F(ab), der kræves for at producere 50% 30 bindingsinhibering, ligger i området 10-100 ng/ml.

Tabel B nedenfor og fig. 3B viser evnen hos 25D2.11 F(ab) til inhibere binding ved samme assay. Dette præparat gav en 90% inhibering med en 50% maksimal virkning ved 10-15 ng/ml.

35 I figurerne 3A og 3B viser X-aksen ng/ml (i lo garitmisk skala), og Y-aksen viser procentisk inhibering.

24

Ved disse eksperimenter var HulL-4 fremstillet i kinesiske hamster ovarieceler, det betegnes CHO-HulL-4 i de følgende tabeller:

5 Tabel A

Neutralisering af 125l-CH0-HulL-4 binding til Daudi-celler af 11B4.

10 Prøve ng/ml procentisk Prøve ng/ml Procentisk binding binding 11B4 F(ab) 1 28tl HB4 IgG 1 0 10 25,34 10 11.7 100 54,28 100 71.01 1000 67,94 500 73,66 15 10000 64,56 1000 69^54 11B4 super- 10 0 GL117 F(ab) 1 0 natant 100 45,1 10 2,4 1000 67i 9 100 0 2500 74',3 1000 3.7 5000 73,6 10000 5^8 20 GL117 IgG 1 0 GL117 super- 10 7,5 10 0 natant 100 4,7 100 1.8 1000 0 1000 0 2500 5,5 10000 0 5000 0 ’ΊΙ 25

Tabel Β

Neutralisering af 125l-CHO-HulL-4 binding til Daudi-celler af 25D2.ll F(ab) fragment 5 ng/ml procentisk ng/ml Procentisk inhibering inhibering 3000 90 15 54,1 1500 90 10 30.75 10 1000 84 7.5 10,5 60 77 3.0 0 30 67,4

Vi har deponeret hybridomaerne IC1.11B4.6 og MP4.25D2.il hos American Type Collection, Rockville, 15 MD, USA (ATCC) med deponeringsnumrene henholdsvis HB9550 og HB9809. Betingelserne for deponeringerne var sådanne som givet under ATCCs Agreement for Culture Deposit for Patent Purposes, hvilket sikrer at det deponerede er tilgængeligt for US Commissioner of Patents 20 and Trademarks ifølge 35 USC 122 og 37 DFR 1.14 og· vil være tilgængeligt for offentligheden efter udstedelsen af et US patent, og som kræver, at det deponerede materiale skal opretholdes. En tilgængelighed for de deponerede stammer skal ikke forstås som en ret til at ud-25 øve opfindelsen, der krænker de rettigheder som en hvilken som helst regering har givet i overensstemmelse med dens patentlove.

HB 9550 blev deponeret 29. september 1987, og deponeringen blev modificeret ifølge Budapestertrakta-30 ten 7. september 1988. HB 9809 blev deponeret ifølge Budapestertraktaten 1. september 1988.

35

Claims

1. Monoklonalt antistof, kendetegnet ved, at det er specifikt for human interleukin-4.

2. Monoklonalt antistof ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er specifikt for ikke gly- 5 kolyseret human interleukin-4.

3. Monoklonalt antistof ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er specifikt for glykoly-seret human interleukin-4, især et sådant produceret af hybridoma IC1.11B4.6.

4. Monoklonalt antistof ifølge krav 1, ken detegnet ved, at det er i stand til at blokere den biologiske aktivitet af human interleukin-4, især et sådant produceret af hybridoma MP4.25D2.ll.

5. Hybridoma, kendetegnet ved, at det 15 er i stand til at udskille et monoklonalt antistof ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4.

6. Hybridoma ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det er IC1.11B4.6 eller MP4.25D2.il.

7. Fremgangsmåde til påvisning af tilstedevæ-20 relse af human interleukin-4 i en prøve, der muligvis indeholder human interleukin-4, kendetegnet ved, at man: tilvejebringer et første monoklonalt antistof ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, idet dette 25 første monoklonale antistof er specifikt for en første antigenisk determinant på human interleukin-4; tilvejebringer et andet antistof udvalgt blandt en polyklonal antistofblanding, der er specifik for human interleukin-4, og et andet monoklonalt antistof 30 ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4; idet dette andet monoklonale antistof er specifikt for en anden antigenisk determinant på human interleukin-4, og idet den anden antigeniske determinant er forskellig fra den første antigeniske determinant; tilvejebringer et middel til signaldannelse, der under anvendelsen kan associeres med enten det første monoklonale antistof eller det andet antistof til frembringelse af et signal, hvis intensitet er en monoton 5 funktion af henholdsvis mængden af det første monoklonale antistof og mængden af det andet antistof; fæster enten det første monoklonale antistof eller det andet antistof til et bæremiddel til dannelse af et antistof-bærer-konjugat; 10 bringer prøven i kontakt med antistof-bærer- konjugatet, således at human interleukin-4 i prøven bindes til antistof-bærer-konjugatet; bringer det første monoklonale antistof, associeret til anvendelse med midlet til signaldannelse, i 15 kontakt med human interleukin-4 bundet til antistof-bærer-konjugatet, hvis dette inkluderer det andet antistof; eller bringer det andet antistof, associeret til anvendelse med midlet til signaldannelse, i kontakt med 20 human interleukin-4 bundet til antistof-bærer-konjugatet, hvis dette inkluderer det første monoklonale antistof; og måler signalet fra midlet til signaldannelse.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kende-25tegnet ved, at antistof-bærer-konjugatet inkluderer det første monoklonale antistof, især et sådant ifølge krav 3 eller 4, og at det andet antistof er den polyklonale antistofblanding, der er specifik for human interleukin-4.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kende tegnet ved, at antistof-bærer-konjugatet inkluderer det andet antistof, at dette andet antistof er den polyklonale antistofblanding, der er specifik for human interleukin-4, og at det første monoklonale antistof 35 fortrinsvis er et sådant ifølge krav 3 eller 4.

10. Sæt til påvisning af tilstedeværelse af human interleukin-4 i en prøve, der muligvis indeholder human interleukin-4, kendetegnet ved, at det omfatter: et første monoklonalt antistof ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, idet dette første monoklonale 5 antistof er specifikt for en første antigenisk determinant på human interleukin-4; et andet antistof udvalgt blandt en polyklonal antistofblanding, der er specifik for human interleukin-4, og et andet monoklonalt antistof ifølge et hvil- 10 ket som helst af kravene 1-4, idet dette andet monoklonale antistof er specifikt for en anden antigenisk determinant på human interleukin-4, og idet den anden an-tigeniske determinant er forskellig fra den første an-tigeniske determinant; 15 et bæremiddel; og et middel til signaldannelse.

11. Sæt ifølge krav 10, kendetegnet ved. at det første monoklonale antistof er et sådant ifølge krav 3 eller 4, og at det andet antistof er den 20 polyklonale antistofblanding, der er specifik for human interleukin-4.

12. Sæt ifølge krav 10, kendetegnet ved, at midlet til signaldannelse omfatter et enzym, der til anvendelse er associeret med det første mono- 25 klonale antistof, og at enzymet er udvalgt blandt peroxidase, β-galactosidase og alkalisk phosphatase.

13. Fremgangsmåde til ved immunoprensning af ekstrahere human interleukin-4 fra en prøve med indhold af human interleukin-4, kendetegnet ved, at 30 man lader prøven passere en immunadsorbentkolonne omfattende et monoklonalt antistof ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, især et sådant ifølge krav 3 eller 4.