KR930008112B1 - 사람 인터루킨-4에 대한 모노클로날 항체 및 이를 생성하는 하이브리도마 - Google Patents

사람 인터루킨-4에 대한 모노클로날 항체 및 이를 생성하는 하이브리도마 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
사람 인터루킨-4에 대한 모노클로날 항체 및 이를 생성하는 하이브리도마
[도면의 간단한 설명]
제 1 도는 글리코실화되지 않은 사람 IL-4를 세균숙주내에서 재현시키기에 적합한 발현벡터를 도식적으로 표시한 것이다.
제 2 도는 사람 IL-4의 최종 정제단계시 215nm에서의 흡광양상을 나타낸 것이다.
제 3 도(a 및 b)는 도디(Daudi) 세포에 결합하는125I-CHO HuIL-4의 중화를 나타낸 것이다.
[발명의 상세한 설명]
[본 발명의 분야]
본 발명은 모노클로날 항체 및 이의 관련된 하이브리도마, 특히 사람 인터루킨-4에 특이적인 모노클로날 항체에 관한 것이다.
[배경]
사람 인터루킨-4(IL-E)는 요코타 등[참조 : Yokota etal., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 83, pgs. 5894-5898(1986)]에 의해 처음으로 클론닝되고 특정화 되었다. IL-4는 면역 시스템의 각기 다른 많은 성분에 영향을 끼치는 매우 다상성(pleiotropic)인 림포카인이다. 이는 T 세포성장인자(TCGF) 활성, 및 B 세포성장인자 활성을 지닌다. 이것은 인터루킨-2(IL-2)의 TCGF 활성 및 과립구-대식세포 콜로니-자극인자(GM-CSF)의 콜로니 형성 활성을 강화할 수 있다. 이것은 IgG1및 IgE의 생성을 우선적으로 유도하며, 사람의 백혈구 II형 DR항원의 발현을 유도한다. 이러한 활성은 여러 치료적 이용가능성, 예를들면 IL-2 항암 요법에 대한 강화제, GM-CSF-자극성 골수 재생에 대한 강화제, 또는 림프구 부족증(barelymphocyte syndrome) 치료제로서 사용할 수 있음을 제시 한다[참조 : Touraine, Lancet, pgs. 319-321(February 7, 1981) ; Touraine and Betuel, Human Immunology, Vol. 2, pgs. 147-153(1981) ; and Sullivan et al., J. Clin. Invest., Vol. 76, pgs. 75-79(1985)].
IL-4의 IgE-유도활성은 알레르기 질환을 알고 있는 사람에게 중요한 영향을 미칠 수 있다. IL-4 길항제의 이용가능성은 특히, 장기투여시에 많은 유해한 부작용을 일으키는 글루코콜티코이드 스테로이드 사용에 대한 대안을 제공할 수 있다[참조 : Goodman and Gillman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 6th Ed.(MacMillan Publishing Company, New York, 1980)]. 특히 사람 IL-4에 특이적인 강한 차단력을 지닌 모노클로날 항체는 항-아이디오타입(idiotype) 항체를 생성시키거나[참조 : 미합중국 특허 제 4,731,237 호], 미모톱(mimotope) 선별법에 의해[참조 : Geylen et., J. Immunol. Meth., Vol. 102, pgs. 259-274(1987), PCT 특허원 WO86/00991 및 WO86/06487] 길항제를 제조하기 위한 수단을 제공한다.
약제를 사용하는 치료에 있어서 중요한 점은 환자의 혈액 또는 다른 체액중의 농도를 예측 및/또는 탐지하는 것이다. 모노클로날 항체는 이러한 목적으로 널리 이용된다[참조 : Springer, ed., Hybridoma Techbology in the Biosciences and Medicine(Plenum Press, M. Y., 1985), 미합중국 특허 제 4,562,003 호 ; 제 4,486,530호 ; 제 4,255,329 호].
IL-4와 같은 유전공학 처리한 단백질의 생산에 있어서, 발현된 단백질을 형질전환된 숙주 세포 및/또는 이의 배양 상등액으로부터 분리하는 것이 주요과제이다. 빈번하게도 분리 과정에는 조물질을 면역흡착 컬럼에 1회 이상 통과시키는 과정이 포함된다. 정제될 단백질에 대해 특이적인 모노클로날 항체는 이러한 컬럼에 있어서 중요한 요소이다. 이러한 모노클로날 항체는 특정원리, 예를들면 "웨스턴"블럿 분석에 의해 달성된 정제속도를 측정하는데 사용될 수도 있다[참조 : Burnette, Anal. Biochem., Vol. 112, pgs. 195-203(1981)].
상기한 바로부터 IL-4에 특이적인 모노클로날 및/또는 폴리클로날 항체의 이용가능성은 현재의 정제방법을 개성시키고, 체액(예 : 혈액, 뇨, 등)중의 IL-4의 농도를 탐지하는 수단을 제공함으로써 이의 인체의학 및 수의학적 사용을 조장한다.
[발명의 요약]
본 발명의 사람 IL-4의 검출, 정제, 측정 및/또는 억제에 유용한 화합물 및 조성물을 제공한다. 이러한 화합물 및 조성물은 사람 IL-4에 특이적인 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마로부터 유도된다. 본 발명의 화합물 및 조성물에는 하이브리도마 그 자체, 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체, 이러한 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 폴리펩타이드 및 기타 단편(예 : 경쇄가 천연 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 결합된 반-분자, Feb 단편, F(ab)2단편, Fv 단편, 등)이 포함된다. 본 발명은 또한 사람 IL-4를 검출, 정제 및 농도측정에 상기 화합물 및 조성물을 이용하는 방법, 및 이러한 방법을 실행하는데 필요한 키트를 제공한다. 특히, 본 발명은 하이브리도마 IC1. 11B4.6 및 MP4.25D2.11 및 모노클로날 항체, 및 이로부터 유도된 생성물을 포함한다.
본 발명의 조성물은 또한 사람 IL-4의 효능제 또는 길항제로서 유용할 수도 있다. 특히, 길항성 항-IL-4 항체, 예를들면, MP4.25D2.11의 모노클로날 항체 단편을 함유하는 조성물은 아토피성질환 치료를 위한 치료제로서 유용하다.
본 발명의 조성물은 또한 하이브리도마 IC1. 11B4.6 및 MP4.25D2.11로부터 추출한 전령 RNA(mRNA)도 포함한다. 이러한 mRNA는 IC1. 11B4.6 및 MP4.25D2.11 항체의 단편을 세균, 효모 또는 기타 숙주내에서 클로닝시키고 발현시키는데 유용하다.
항체는 디설파이드 브리지에 의해 서로 결합된 폴리펩타이드 쇄의 조립체를 함유한다. 중쇄 및 경쇄로 지칭되는 2가지 주요 폴리펩타이드 쇄는 항체의 모든 주요 구조적 성분 종류를 이룬다(동위형 : isotype). 중쇄 및 경쇄 모두는 가변영역 및 불변영역이라 불리우는 소단위 영역으로 더욱 세분된다. 중쇄는 1개의 가변영역과 3개의 상이한 불변영역을 지니고, 경쇄는 1개의 가변영역(중쇄가변영역과는 상이)과 1개의 불변영역(중쇄불변영역과는 상이)을 지닌다. 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 항체의 결합특이성에 관계한다.
본원에서 사용된 "중쇄 가변영역"이란 용어는 110 내지 125 아미노산 길이이고 이들의 아미노산 서열이, 중쇄 N-말단 아미노산으로부터 시작하여, 본 발명의 모노클로날 항체의 중쇄의 것과 상응하는 폴리팹타이드를 의미한다. 이와 마찬가지로, "경쇄 가변영역"이란 95 내지 115 아미노산 길이이고,이들의 아미노산 서열이, 경쇄 N-말단 아미노산으로부터 시작하여, 본 발명의 모노클로날 항체의 중쇄와 상응하는 폴리펩타이드를 의미한다.
Fab, Fc, F(ab)2, 및 Fv는 이들의 표준 면역학적 의미로 사용된다[참조 : Klein, Immunology(John Wiley, New York, 1982), or Parham, Chapter 14, in Weir, ed. Immunochemistry, 4the Ed. (Blackwell Scientific Publishers. Oxford. 1986)].
본원에서 사용된 "모노클로날 항체"라는 용어는 사람 IL-4에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린의 균질집단을 의미한다. 사람의 IL-4는 (1) 사람 IL-4내에 1개의 펩타이드 쇄로 이루어진 펩타이드 항원 결정기, (2) 각각의 아미노산 서열이 사람 IL-4 폴리펩타이드 서열을 따라 분산되어 위치하는 공간적으로 인접한 펩타이드 쇄 하나 이상으로 구성된 구조적 항원 결정기, 및 (3) 해독후에 사람 IL-4에 공유 결합된 분자성 구조물(예 : 탄수화물 그룹 등)의 전부 또는 일부로 이루어진 해독후 항원 결정기로 구성된 하나 이상의 항원 결정기를 지닐 수 있다. 본 발명의 항체는 이러한 결정기 하나 이상에 대한 것일 수도 있다.
본원에서 사용된 "결합 조성물"이란 용어는 (1) 작동적으로 결합되었을 때 사람 IL-2에 대한 결합친화도가 높은 구조를 지니는 것으로 추측되며, (2) 사람 IL-4에 특이적인 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마로부터 유도되는 두개의 폴리펩타이드 쇄로 이루어진 조성물을 의미한다. "작동적으로 결합된"이란 용어는 2개의 폴리펩타이드 쇄가 천연항체 단편(예 : Fab 또는 Fv)과 결합되는 것을 포함한, 여러 가지 형태로, 또는 카복시 말단의 유전공학적으로 처리된 시스테인 함유 펩타이드 링커를 통하여 상호 결합할 수 있도록 위치할 수 있음을 나타낸다. 통상적으로, 2개의 폴리펩타이드 쇄는 사람 IL-4에 특이적인 모노클로날 항체의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역에 상응한다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명의 하이브리도마는 공지의 기술로 제조된다. 통상적으로, 이 방법에는 생존력이 강한(immortalizing) 세포주를, 목적하는 항체를 생성하는 B-림프구와 융합시키는 단계를 포함한다. 또한, 생존력이 강한 항체 생성 세포주를 생성시키는 비융합 기술로도 가능하며(예 : 바이러스 유도 형질전환), 본발명의 범위내에 포함된다[참조 : Casali et al., "Human Monoclonals from Antigen-Specific Selection of B Lymphocytes and Transformation by EBV", Science, Vol. 234 pgs. 476-479(1986)]. 생존력이 강한 세포주는 통상 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 사람의 골수증 세포이다. 편의상 및 구입 용이성을 고려하여 랫트 또는 마우스의 골수증 세포주가 가장 많이 사용되고 있다.
표적항원을 주입한 포유동물로부터 적합한 림프구를 수득하는 기술도 익히 공지되어 있다. 사람의 세포를 필요로 하는 경우엔 말초혈림프구(PBL)를 사용하고, 사람이 아닌 포유동물 세포를 필요로 한는 경우에는 비장세포 또는 림프절세포를 사용하는 것이 일반적이다. 숙주 포유동물에게 정제된 항원을 수회 반복투여하고, 포유동물이 목적하는 항체-생성 세포를 생성하도록 방지한 후, 세포를 수거하여 생존력이 강한 세포주와 융합시킨다. 융합기술은 본 분야에 공지되어 있으며 통상적으로 세포를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 융합제와 혼합하는 단계가 포함된다. 하이브리도마는 표준방법, 예를들면 HAT 선별방법에 의해 선별된다. 이들 하이브리도마중 목적하는 항체를 분비하는 것은 이들의 배양 배지를 표준 면역분석법(예 : 웨스턴 블럿팅, ELISA, RIA, 등)으로 분석하여 선별할 수 있다. 항체는 표준 단백질-정제기술을 사용하여 배지로부터 회수한다[참조 : Tijssin, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier, Amsterdam, 1985)]. 상기 방법을 사용하는데 필요한 지침서로서 많은 문헌이 있다[참조 : Kohler et al., Hybridoma Techiques(Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980) ; Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier, Amsterdam, 1985) ; Campbell, Monoclonal Antibody Technology(Elsevier, Amsterdam, 1984) ; Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies : Techniqres and Applications(CRC Press, Boca Raton, FL, 1982) ; 등].
항체 단편의 사용 및 생성방법 역시 공지되어 있다[참조 : Fab 단편 ; Tijssin, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier, Amsterdam, 1985) ; Fv 단편 : Hochaman et al. Biochemistry, Vol. 12, pgs. 1130-1135(1973), Sharon et al., Biochemistuy, Vol. 15, pgs. 1591-1594(1976) 및 Ehrlich et al., 미합중국 특허 제 4,355,023 호 ; 항체 반-분자 : Auditore-Hargreaves, 미합중국 특허 제 4,470,925 호]. 무엇보다도, 본 발명의 이러한 화합물 및 조성물은 공지의 방법, 예를들면, 하이브리도마의 추가융합[즉 쿼드로마(quadroma) 생성][참조 : 미합중국 특허 제 4,474,493 호] 또는 반-분자의 화학적 재결합[참조 : Brennan et al., Science, Vol. 229, pgs. 81-83(1985)]에 의해 이중-특이적 항체를 제조하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 하이브리도마 및 모노클로날 항체는 재조합 방법으로 생성된 숙성 사람 IL-4의 글리코실화 또는 비-글리코실화 양태 모두에 대하여 생성된다. 일반적으로, 사람 IL-4의 비-글리코실화된 형태는 이. 콜라이 내에서 생성되고, 글리코실화된 형태는 포유동물 세포숙주(예 : CVI 또는 COS 원숭이 세포, 마우스 L세포, 등)내에서 생성된다. 재조합 방법에 의해 생성된 숙성 사람 IL-4는 발현벡터를 표준기술을 이용하여 숙주세포내에 도입시킴으로써 생성된다[참조 : Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory, New York. 1982) ; Okayama and Berg, Mol. Cell. Biol., Vol. 2, pgs, 161-170(1982) and Vol. 3, pgs, 280-289(1983) ; Hamer, Genetic Engineering, Vol. 2, pgs, 83-100(1980) and 미합중국 특허 제 4,599,308 호 ; Kaufman et al., Mol. Cell.Biol., Vol. 2, pgs. 1304-1319(1982) ; 등].
세균 또는 포유동물 발현벡터의 작제 방법은 본 분야에 익히 공지되어 있고 목적하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있거나 시판되고 있다. 예를들어, 세균 발현벡터에서 사용하기 위한 프로모터[참조 : DeBoer, 미합중국 특허 제 4,511,433 호], 이. 콜라이 발현 시스템에 의한 포유동물 단백질의 생성[참조 : Goeddel et. al, 미합중국 특허 제 4,604,980 호, 및 Riggs. 미합중국 특허 제 4,431,739 호], 세균내 발현용 합성 유전자의 제조방법[참조 : Riggs : 상기 참조, Ferretti et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 83. pgs. 599-603(1975), Sproat et al., Nucleic Acids Research, Vol., 13, pgs. 2959-2977(1985) 및 Mullenbach et al., J. Biol. Chem., Vol. 261 pgs. 719-722(1986)]등이 기술되어 있다. 따라서, 상기 문헌들은 참조로서 인용된다. 숙성 사람 IL-4의 아미노산 서열은 요코타 등에 의해 기술되어 있으며(상기 참조), pcD 벡터에 의해 운반되는 사람 IL-4 암호화 cDNA(상기 참조)는 기탁되어 있다(ATCC 67029). 많은 세균발현 벡터 및 숙주는 시판되거나, ATCC를 통해 구입할 수 있다. 숙주동물을 면역시키기 위한 사람 IL-4는 상기 언급된 pcD 벡터에 의해 일시적으로 형질감염된 COS, CV1, 또는 마우스 L 세포의 배양 상등액으로부터 분리된다.
본 발명의 하이브리도마, 특히 IC1.11B4.6의 항체 및 항체 단편은 mRNA를 추출하여, cDNA 라이브러리를 제조한 후, 항체 분자의 단편을 암호화하는 클론을 선별해냄으로서 제조합방법으로 생성할 수 있다[참조 : Wall et al., Nucleic Acids Research, Vol. 5, pgs. 3113-3128(1978) ; Zalsut et al., Nucleic Acids Research, Vol. 8, pgs. 3591-3601(1980) ; Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 81, pgs. 3273-3277(1984) ; Boss et al., Nucleic Acids Research, Vol. 12, pgs. 3791-3806(1984) ; Amster et al., Nucleic Acids Research, Vol. 8, pgs. 2055-2065(1980) ; and Moore et al., 미합중국 특허 제 4,642,234 호], 특히, 이러한 기술은 항종의 결합영역이 다른 종의 항체의 비-결합 영역과 조합된 종간 모노클로날 항체를 생성시키는데 유용하다[참조 : Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 84 pgs. 3439-3443(1987)].
정제 및 측정을 위한 노모클로날 항체의 사용예도 공지되어 있다[참조 : 친화성 크로마토그라피 ; Affinity Chromatography : Principles and Methods(Pharmacia, Orebro, Sweden, 1979) ; Secher et al., Nature, Vol. 285, pgs. 446-450(1980), 미합중국 특허 제 4,423,147 호 ; 유럽 특허원제 0190711 호(1986.8.13) ; 면역분석방법 : Tijssen(상기 참조) ; 미합중국 특허 제 4,486,530 호 ; Burnette(상기 참조)]. 친화성 크로마토그라피는 사람의 IL-4 발현벡터로 형질전환되거나 형질감염된 세포의 배양 상등액과 같은 시료로 부터 사람 IL-4를 추출함으로써 이를 정제하는데 사용된다. 이러한 정제방법을 면역정제법이라 한다. 통상적으로 이러한 정제방법에는 시료가 통과되는 컬럼 또는 챔버에 위치한 고체상 지지체(이하 "면역 흡착제")에 사람 IL-4에 특이적인 모노클로날 항체를 공유결합시키는 단계를 포함한다. 시료중의 사람 IL-4는 결합된 모노클로날 항체의 결합부위에 우선적으로 결합하는 반면에 시료의 나머지 부분은 컬럼 또는 챔버로부터 세척된다. 이어서, 표준기술(예 : 낮은 pH, 고염농도 등)을 사용하여 사람 IL-4를 면역흡착제로부터 용출시킨다.
"이중 부위(two site)" 또는 "샌드위치"면역분석이 본 발명의 면역분석법으로서 더욱 바람직하다[참조 : 미합중국 특허 제 4,486,530 호]. 상기 특허도 참조로서 인용된다. 이러한 분석에는 두개의 서로 다른 항-IL-4 항체 세트가 사용되어야 하며, 두 개의 세트중 적어도 하나는 본 발명의 모노클로날 항체(예 : IC1.11B4.6에 의해 생성된 항체)로 구성된다. 두 세트중 하나로부터의 항체를 고체상 지지체의 표면에 결합시킨다. 이어서, 결합된 항체를 사람 IL-4를 함유하는 것으로 예상되는 시료에 노출시킨다. IL-4 분자는 결합된 항체에 붙는다. 그후, 두번째 항체 세트를 결합된 IL-4에 적용 결합시키면, 이들은 처음 항체 세트가 결합된 것들과는 상이한 하나 이상의 항원 결정기에 결합한다. 이어서, 두번째 항체 세트와 관련된 간접 또는 직접 시그날 생성 방법을 이용하여 IL-4를 검출한다. 예를들어, 항체는 시그날-생성 잔기(예 : 효소, 희토류 킬레이트제, 또는 유기염료)에 직접 결합될 수 있다. 또는 이들을 추가의 항체, 또는 고친화성 복합체(예 : 아비딘-바이오틴 복합체)를 통해 하나 이상의 시그날-생성 잔기에 간접적으로 결합시킬 수도 있다. IL-4 농도는 시료에 의해 생성된 시그날과 기지 농도의 사람 IL-4를 함유하는 IL-4 표준물질에 의해 생성된 시그날을 비교함으로써 정량 분석한다.
본 발명은 면역분석, 특히 샌드위치 면역분석에 사용하기 위한 시약 키트를 포함한다. 이러한 키트에는, (1) 고체상 지지체, (2) 모노클로날 상태이며 사람 IL-4의 첫 번째 항원 결정기에 결합할 수 있는 제 1 항체, (3) 사람 IL-4의 두번째 항원 결정기에 결합할 수 있는 모노클로날 항체 및 사람 IL-4에 특이적인 폴리클로날 항체(여기에서는 "폴리클로날 항체 조성물"이라 한다)로 이루어진 그룹중에서 선택된 제 2 항체, 및 (4) 3가지중 1개의 항체와 관련된 시그날 생성물질이 포함된다. 특정 양태에 따라, 키트에는 3개중 2개의 항-IL-4 항체 형태로서, 제 1 항원 결정기에 특이적인 모노클로날 항체 및 제 2 항원 결정기에 특이적인 모노클로날 항체, 또는 제 1 또는 제 2 항원 결정기에 특이적인 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체 조성물의 선별과정도 포함되어 있다. 항체는 용액상태 또는 동결건조 상태로 존재할 수 있다. 항체 세트중 하나는, 키트를 사용할 때 고체 지지체의 표면에 적용시킬 수 있거나, 고체 지지체에 미리 결합시킬 수도 있다.
시그날-생성물질은 사용전에 두가지 항체 형태중 한가지와 미리 결합시키거나, 하나 이상의 성분(예 : 완충액, 항체-효소 결합체, 효소기질 등)과의 조합물로서 사용될 수 있다. 여러 종류의 시그날 생성물질을 사용할 수 있으며, 키트의 하나 이상의 성분을 이룰 수 있다. 여러 종류의 시그날-생성물질은 문헌[참조 : Tijssen, 상기 참조]에 기술되어 있다. 본 발명의 키트는 고체상 표면에 비특이적으로 결합하는 것을 감소시키기 위한 차단제, 세척제, 효소기질 등과 같은 추가의 제제를 함유할 수도 있다. 고체상 표면은 단백질고정에 적합한 물질인 폴리비닐클로라이드, 폴리스티렌등으로 구성된 미세역가 측정판, 마이크로스피어(microsphere)등의 형태일 수 있다. 고체상 표면을 갖는 이러한 물질을 여기에서는 "지지체 물질"이라 한다. 형광 또는 착색 생성물 형성을 촉매하는 효소가 시그날 생성물질의 한 성분인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 효소는 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 및 β-칼락토시다제로 이루어진 구룹중에서 선택된다. 이들 효소에 대한 기질 및 반응조건은 본 분야에 공지되어 있다[참조 : Tijssen, 상기 참조].
본 발명의 조성물은 또한 IL-4 관련 질환에 대한 약학 조성물의 성분으로 사용될 수 있다. 효능제 효과를 갖는 모노클로날 항체(또는 이들의 결합단편)을 함유하는 약학 조성물은 IL-4 활성을 향상시키는데 사용될 수 있다. 차단 또는 길항효과를 갖는 모노클로날 항체(또는 이들의 결합 단편)로 구성된 조성물은 IL-4 활성을 억제시키는데 사용될 수도 있다. 이러한 조성물은 약학적으로 효과적인 담체중에 함유된, 본 발명의 모노클로날 항체, 또는 이들의 결합 단편 하나 이상의 치료량을 함유한다.
약학적 담체는 본 발명의 조성물을 환자에 투여하기 적합한, 혼화성의 비독성 물질일 수 있다. 멸균수, 알콜, 지방, 왁스 및 불활성 고체가 담체내에 함유될 수도 있다. 약학적으로 허용되는 보조제(완충제, 분산제)가 약학 조성물내로 도입될 수도 있다. 일반적으로, 이러한 약제의 비경구투여에 유용한 조성물은 익히 공지되어 있다.[참조 : Remington's Pharmaceutical Science, 15th Id.(Mack Publishing Company, Easton. PA. 1980)].
본 발명의 조성물은 또한 삽입용 약제투여 시스템을 이용하여 환자의 체내에 도입시킬 수 있다[참조 : Urqugart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., Vol. 24, pgs. 199-236(1984)].
[실시예]
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이다. 벡터 및 숙주 뿐만 아니라 시약의 농도, 온도 및 다른 변수에 대한 선택은 본 발명을 단지 예시하기 위한 것이므로 이로써 제한되지 않는다.
[실시예 1]
COS 7 원숭이 세포를 pcD-사람-IL-4로 형질감염시킴에 의한 글리코실화된 사람 IL-4의 생성
발현벡터 pcD-사람-IL-4 및 숙주세포 COS 7은 각각 ATCC 67029 및 ATCC CRL 1651로서 입수가능하다. pcD-사람-IL-4 클론을 증폭시키고, 플라스미드 DNA를 정제시킨 후, 표준 형질감염 방법으로 COS 7을 형질감염시킨다. 듈베코 변형 이글 배지(DMF), 10% 태 송아지 혈청, 및 4mM L-글루타민을 함유하는 조직배양판 100mm 상에 약 1×106COS 7 세포를 접종한다. 접종한지 약 24시간 경과후, 배지를 플레이트에서 뽑아내고, 세포를 혈청-비함유 완충(50mM 트리스) DME로 세척한다. 각 플레이트에 혈청-비함유 완충 DME(4mM L-글루타민 함유) 4ml, 80μl DEAE-덱스트란 및 pcD-사람-IL-4 DNA 5μg을 가한다. 세포를 상기 혼합물중 30℃에서 4시간 동안 배양시킨 후, 혼합물을 뽑아내고, 세포를 혈청-비함유 완충 DME로 1회 세척한다. 세척 후, 4mM L-글루타민, 100μM 클로로퀴논, 및 2% 태 송아지 혈청을 함유하는 DME 5ml를 각 플레이트에 가하고, 세포를 3시간 동안 배양시킨 후, 혈청-비함유 완충 DME로 2회 세척한다. 그후, 4mM L-글루타민 및 4% 태 송아지 혈청을 함유하는 DME 5ml를 가하고, 세포를 37℃에서 24시간 동안 배양한다. 그후, 세포를 DME 또는 PBS로 1 내지 3회 세척하고, 혈청-비함유 DME(4mM L-글리타민 함유)5ml를 가한 후, 세포를 37℃에서 배양하고, 5일 후 배양 상등액을 수거한다.
[실시예 II]
COS 7 형질감염 상등액으로부터 글리코실화된 사람 IL-4의 정제
[A. 정제를 위한 생물학적 분석]
T 세포성장인자(TCGF) 활성은 실시예 I에 따라 생성된 상등액으로부터 정제중에 사람 IL-4를 분석하는데 사용된다. TCGF 활성에 대한 몇몇 표준분석법은 기술된 바 있다[참조 : Devos et al., Nucleic Acids Research, Vol. 11, pgs. 4307-4323(1983) ; Thurman et al., J. Biol. Response Modefiers, Vol. 5, pgs. 85-107(1986) ; and Robert-Guroff et al., Chapter 9 in Guroff, Ed. Growth and Maturation Factors(John Wiley, New York, 1984)]. 일반적으로, TCGF 분석은 말초성 T 림프구 또는 IL-2-의존성 T 세포주의 증식을 촉진시키는 인자의 능력을 기준으로 한다[참조 : Gillis et al., J. Immunol., Vol. 120, pg. 2027(1978)]. 증식정도는 표준방법, 예를들어 삼중 수소처리된 티미딘 혼입방법, 또는 색도측정법을 이용하여 판정할 수 있다[참조 : Mosmann. J .Immunol. Meth, Vol, 65, pgsa, 55-63(1983)].
사람 IL-4 TCGF활성 분석은 하기와 같이 수행한다. 건강한 공여체로부터 취한 혈액을 헤파린 처리된 시험관에 넣고 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)상에, 예를들어 15ml 원심분리 튜브내에 피콜-하이파그 3ml당 혈액 5ml로 층을 형성시킨다. 3000xg에서 20분간 원심분리시킨 후, 접촉 세포를 뽑아내고, 10%태 송아지 혈청, 50μM 2-머캅토에탄올, 20μg/m파이토헤모글루티닌(PHA), 및 재조합 사람 IL-2를 함유하는 RPMI1640으로 조성된 성장 배지중에 희석시킨다. 37℃에서 5 내지 10일간 배양시킨 후, PHA-자극된 말초혈 림프구(PBL)를 세척하고 2일간 색도측정 분석을 수행한다[참조 : Mossnan, 상기 참조]. IL-4표준물(pcD-사람-IL-4-형질감염된 COS 7세포에서 수득된 상등액)또는 시험대상 분획을 상술한 성장배지를 사용하여 96-웰 트레이(tary)에서 연속 2배 희석하여 최종 용적 50μ
Figure kpo00001
/웰이 되도록 한다. 약 4 내지 8×106세포/ml의 PHA-자극된 PBL 50㎕를 각 웰에 가하고, 트레이를 37℃에서 2일간 배양시킨다. 이어서, 문헌[참조 : Mosmann, 상기 참조]에 따라 세포성장을 측정한다.
여기에서 사용되는 1단위는 한개의 웰(0.1m)내에서 48시간 동안 2×104PHA-자극된 PBL의 50% 최대 증식을 자극하는 인자의 양을 의미한다.
[B. 정제]
양이온 교환 크로마토그래피, 겔여파 및 역상 고압액체 크로마토그래피를 순차적으로 수행하여 정제한다.
모든 조작은 4℃에서 수행한다.
COS-7세포를 원실분리하여 제거하고, 상등액을 한외 여과시켜 약 1-배로 농축시키고, 다시 사용할 때까지 -80℃에서 저장시킨다. IL-4의 역가는 파이토헤마글루티닌-유도된 사람 말초혈 림프구의 증식을 자극하는 단백질의 능력을 분석하여, 즉 상술한 표준 분석법을 사용하여 TCGF활성을 이용하여 측정한다.
TCGF 활성이 약 104-106단위/ml이고, 단백질 함량이 약 15 내지 20mg/ml인 농축된 COS-7상등액을 pH 7.0에서 24시간 동안 50nM나트륨 HEPES를 2회 바꿔주면서 이에 대하여 투석시킨다(각각의 교환은 하나의 농축물의 약 10 내지 15배 용적을 사용한다). 투석물을 50mM나트륨 HEPES(pH 7.0)로 예비평형화시킨 S-세파로즈(유속 : 0.2ml/분) 컬럼(1×2.5cm)에 적용시킨다.
컬럼 용적의 15배가 되는 평형화 완충액으로 칼럼을 세척하고, 50mM나트륨 HEPES, pH 7.0 중의 0 내지 0.5M 염화나트륨 영역의 선상 염화나트륨 직선 구배의 컬럼 용적의 20배 용량으로 용출시킨다. 50mM나트륨 HEPES, 0.5M NaCl(pH 7.0)의 컬럼 용적의 5배 용량으로 이소크래틱(isocrotically)하게 용출과정을 종료시킨다. 두개의 분리 뱃치로부터 분획 1.5ml 및 1.8ml를 수거한다. IL-4역가는 300mM 내지 500mM의 염화나트륨으로 용출하는 두가지 크로마토그래피를 통해 관측된다.
S-세파로즈 컬럼에서 분리한 IL-4역가를 지닌 분획을 합하여 총 분리용적이 9.0 및 10.8ml가 되도록 한다. 아미콘 YM5 막(Amicon YM 5 membrane : 분자량 약 5000)을 사용한 한외 여과를 수행하여 두가지 용적이 1.9ml가 되도록 한다. 이 단계로부터 회수되는 단백질 회수율은 약 80%이다. 농축된 IL-4용액을, 50mM HEPES, 0.4M Nacl(pH 7.0)으로 예비 평형화시킨 세파덱스 G-100컬럼(1.1×58cm)에 적용시키고, 컬럼을 0.15ml/분에서 동일한 완충제로 용출시킨다. 전체 50개의 분획(10ml/분획)을 수거하고 IL-4 역가를 분석한다. 생물학적 활성을 지닌 피크는 겉보기 분자량 22,000달톤에서 관찰된다. 세파덱스x G-100를 겉보기 분자량 측정을 위하여, 소의 혈청 알부민(65,000달톤), 카보닉 안하이드라제(30,000달톤) 및 사이토크롬 C(11,700달톤)으로 산정기준을 잡는다.
세파덱스 G-100컬럼에서 분리한 IL-4 활성을 지닌 분획을 진공하에서 3 내지 4배로 농축시키고 비덱(Vydac) C-4가드(guard) 컬럼(4.6×20mm)상에 주입시킨다. 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산(TFA)중의 0 내지 72%(v/v) 아세토니트릴의 직선구배는 컬럼온도 35℃ 및 유속 1.0ml/분 15분 후에 형성된다. 214nm에서 측정된 3개의 피크에 대한 보유시간은 7, 8.2 및 8.7분 이었다(제 2 도의 피크 1,2, 및 3).
피크 2의 분취량 40㎕(용출시간, 8.2분)를 동결건조시키고 10%태 송아지 혈청을 함유하는 최소 필수배지를 다시 용해시킨다. 이 용액은 TCGF양성 반응을 보인다. 피크 2의 분취량 300㎕를 증발건고시키고 0.1%(w/v)나트륨 도데실 설페이트(SDS) 200㎕중에 다시 용해시킨다. 분취량 2㎕를 1%(v/v) TFA 200㎕로 희석시키고 다시 크로마토그래피시킨다. 상기 시료의 HPLC는 215nm에서 단일피크를 형성한다. 피크 2물질은 약 7×108단위/mg의 활성을 나타낸다.
[실시예 III]
글리코실화되지 않은 사람 IL-4의 이. 콜라이내 생성
이. 콜라이 발현 벡터, TRPC 11을 표준방법[참조문헌 : Maniatis et al., Molecular Cloning ; A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory, New, York, 1982)]을 사용하여 제조한다.
합성 콘세서스(consensus) RBS단편을 Cla I 링커(ATGCAT)에 연결하고, 생성된 단편을 Cla I-제한된 pMT11hc(Cla I 부위를 함유하도록 미리 변형시킴)에 클로닝시킴으로써 TPRC11 벡터를 제조한다. pMT11hc는 소형(2.3kbp)의 높은 카피수를 지니는 것으로서, πVX플라스미드[참조문헌 : Maniatis et al, 상기 참조]의 EcoR I-Hind II 폴리링커 영역을 함유하는 pBR 322의 AMPR, TETS 유도체이다. pMT11hc를 EcoR I 및 BamH I으로 절단하고, 생성된 점성말단을 충진시킨 후, Cla I 링커(CATCGATG)와 연결시킴으로써, EcoR I 및 BamH I 부위가 복구되고 Sma I 부위를 Cla I 부위로 대치시킴으로써 Cla I 부위를 함유하도록 변형시킨다.
TRPC11작제시의 변형체중의 하나는 Cla Ⅰ 부위에 의해 플랭킹된 탄뎀(tandem) RBS 서열을 지닌다. Cla I 부위중 하나 및 RBS 서열의 제 2 카피중 일부는, 상기 플라스미드를 Pst I으로 분해하고, Ba131 뉴클레아제로 처리한 후, EcoR I으로 절단하고, 4가지 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 모두가 존재하는 가운데 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 제거할 수 있다. 생성된 30 내지 40bp단편을 폴리아크릴아미드겔 전기영동시켜 회수하고 Sma I 처리된 pUC12에 클로닝시킨다. pKC101에서 유도된 248bp의 이. 콜라이 trpp-함유 EcoR I 단편[참조 : Nichols et al., in Methods in Enzymology, Vol. 101. pg, 155(Academic Press, N, Y. 1983)]을 EcoR I에 부위에 클로닝시켜 제 1 도에서와 같이 TRPC11을 작제한다.
TRPC11을 Cla I 및 BamH I으로 분해하고, 정제시킨 후, 이를 하기 합성 링커 0.1μM을 함유하는 표준 연결 용액중의 pcD-125(ATCC No. 67029로 기탁)의 EcoRV/BamH I 단편과 혼합시킴으로써, TRPC11을 사람 IL-4 cDNA에 대한 벡터로서 사용된다.
5'-CG ATG CAC AAG TGC GAT-3'
TAC GTG TTC ACG CTA
이. 콜라이 AB1899를 표준 염화칼슘 방법을 사용하여, 연결 용액으로 직접 형질전환시키고, 번식시킨 후, 플레이팅 한다. IL-4 cDNA 삽입물을 함유하는 콜로니는 표지된 올리고 뉴클레오타이드 탐침을 사용하여 선별할 수 있다. 형질 전환체를 L-육즙액중에서 배양시키고, IL-4를 구조적으로 발현시킨다.
[실시예 IV]
이. 콜라이에 생성된 응집물로부터 글리코실화되지 않은 사람 IL-4의 정제
이. 콜라이 AB1899(lon-)[입수처 : Yale University E. coli Genetics Center, New Haven, CT]의 배양액 1ℓ를 OD560=2(약 1.6×1-9/세포/ml)가 되도록 성장시킨다. 4℃에서 15분간 4500xg로 원심분리시켜 세포를 수거한다. 펠렛을 50mM NaCl, 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 및 0.1mM 페닐메틸설페닐 플루오라이드(PMSF)를 함유하는 pH 8.0의 50mM 트리스 완충액 30ml중에 재현탁시킨다. EDTA 및 PMSF를 가하여 정제 전에 사람 IL-4를 분해시킬 염려가 있는 프로테아제 활성을 억제한다. 그후, 세포를 초음파처리(70와트에서 50펄스(50%)하고, 4℃에서 15분간 25,000xg로 원심분리시킨다. 생성된 펠렛의 주요 단백질 성분은, 전기영동으로 분리된 펠렛 물질(이것은 나트륨 도데실 설페이트(SDS)에 용해되며 쿠마씨 블루로 염색된다)의 겔 밴드 패턴을 음성 대조물질과 비교한 결과, IL-4임이 확인되었다.
상등액을 제거한 후, 펠렛 물질을 5M 구아니딘 HCl, 2mM 글루타치온(환원형), 및 0.2mM 글루타치온 (산화형)을 함유하는 트리스 완충용액(50mM 트리스, 50mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1mM PMSF, pH 8.0 ; 펠렛 물질 g당 9ml)중에 재현탁시킨다. 용액을 실온에서 약 1시간 경과 후에, 2mM 글루타치온(환원형) 및 0.2mM 글루타치온(산화형)을 함유하는 트리스 완충용액(pH 8.0)에 1 : 9로 희석한다. 희석, 투석, 또는 농축 과정중에 침전물이 생성되면, 더 진행시키기 전에 원심분리하여 제거한다. 전체 용적을 하룻밤 동안 인산염 완충용액 3ℓ에 대하여 3회 투석시킨다. 투석불(즉, 투석백내에 있는 물질)을 아미콘 YM5필터로 농축시키고(최종농도 8mg/ml), 겔 여과 크로마토그래피시킨다[칼럼 : P30(BioRad), 1.5×90cm·PBS 용출 완충액 ; 유속, 8ml/hr]. 분획을 15분 간격으로 수집한다. 분획 23 내지 27번을 모으고, 역상 HPLC로 더 분석한다. 상기 분석을 통하여, 합해진 분획이 순도 95%의 사람 IL-4를 함유하는 것으로 나타냈다. 배양액(OD500: 2) 1ℓ로부터 특이적 활성이 5×107단위/mg인 사람 IL-4는 2mg이 수득되었다.
[실시예 V]
하이브리도마 IC1.11b4.6의 생성
루이스 랫트 숫컷을 완전 프로인트 보조제(CFA)1ml로 유화시킨 사람 IL-4 용액 1ml로 복강내(i.p)로 접종하여 면역시킨다. 사람 IL-4용액은 10mM 트리스-HC1,0.5M NaCl, pH 7.4중에 14㎍/mg의 농도로 사람 IL-4를 함유한다. 사람 IL-4는 실시예 I 및 II에 따라 생성되며, 2×107단위/mg의 특이활성을 지닌다. 1차 면역시킨지 2주 경과후, CFA 1ml로 유화시킨 사람 IL-4용액 1ml를 랫트의 복강내로 주사한다. 2차 주입 3개월후, 랫트에 사람 IL-4용액 1ml(15㎍)를 정맥내로 2차 보강접종시킨다. 2차 보강접종한지 4일후, 랫트를 죽이고 혈액을 취한 후, 융합에 사용하기 위해 비장을 절제해낸다. 비장세포를 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 사용하여 마우스 골수종 세포 P3×63-Ag8.653(ATCC CRL 1580)와 1 : 1의 비율로 융합시킨다. 세포 현탁액(HAT 배지중의 3.5×105세포/ml)을 96-웰 플레이트 40개에 분배한다. 10일후, 하이브리도마 상등액을 미세역가 축정판에 직접 고정된 사람 IL-4에 결합하는 능력(간접 ELISA), 또는 토끼 안티-사람 IL-4의 고정된 폴리클로날 1g G분획에 결합된 사람 IL-4에 결합하는 능력을 시험한다. 표준방법을 이용하여 퍼옥시다제-결합된 염소 안티-랫트 면역글로블린을 사용하여 결합된 항체를 탐지한다. IL-4와 반응하는 항체-분비 하이브리도마는 제한 희석법으로 클로닝시킨다. IC1,11B4.6은 이러한 방법으로 선별된 하이브리도마의 일종이다. IC1.11B4.6에서 수득된 항체는 IgG29동위형인 것으로 밝혀졌다. 하이브리도마는 저장될 수 있으며(예 : 10% DMSO를 함유하는 배지중 -70℃에서) 표준 포유동물 세포 배양 기술로 배양시킬 수 있다 (예 : 글루타민 1mM 및 2-머캅토에탄올 50mM이 보충된 10%태 송아지 혈청을 함유하는 RPMI 1640).
[실시예 VI]
하이브리도마 MP4.25D2.11의 생성
하이브리도마 수집물을 생성시키고, 실시예 V와 거의 동일한 방법으로 이들의 항체를 사람 IL-4 특이성을 기준으로 스크린한다. 하이브리도마 수집물을 표준 시험관내 분석(실시예 II에 기술된 방법)으로 사람 IL-4의 TCGF 활성을 차단하는 항체의 능력에 대하여 추가로 스크린한다. 동정된 몇몇의 차단 모노클로날중, MP4.25D2.11에 의해 생성된 것이 가장 높은 차단 활성역가를 갖는 것으로 선별되었다. MP4.25D2.11에 의해 생성된 항체는 랫트의 IgG1으로 측정되었다.
[실시예 VII]
사람 IL-4에 대한 샌드위치 분석
토끼 폴리클로날 안티-사람 IL-4 항체 100㎕(단백질 A친화성 컬럼상에 정제된 PBS 중의 10㎍/ml)를 96-웰 염화 폴리비닐 미세역가 측정판의 각 웰 표면상에 37℃에서 2시간 동안 흡착시킨다(PBS는 증류수 1ℓ 중에 NaCl 8.0g, KH2PO40.2g, Na2HPO4, 12H2O 2.9g 및 KCl 0.2g으로 구성되며, pH는 7.4이다). 플레이트를 PBS-트윈(트윈 20을 1당 0.5ml 가하는 점을 제외하고는 PBS와 동일하게 제조한다)으로 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고, 정제된 이. 콜라이 생성 사람 IL-4의 이중 연속 희석액(PBS중)을 한 줄이 12개로 이루어진 두줄의 웰에 가하여 IL-4의 농도를 1000pg/ml 내지 15pg/ml로 감소시킨다. 하기 시료를 남아 있는 웰에 가한다 : (1) 사람 T세포 클론, 예를들어 C1Ly1+2-/9(ATCC CRL 8179)의 세포 상등액, (2) pcD-사람-IL-4로 형질감염된 COS 7 세포의 배양 상등액, (3) 각기 다른 농도의 정제된 COS 7-생성 IL-4를 함유하는 사람 혈청, 및 (4) 사람 IL-1α, IL-2, IL-3, IFN-2, IFN-α2b, GM-CSF 및 BSF-2를 함유하는 시료. 시료 모두를 실온에서 2시간 동안 배양시킨다. PBS-트윈으로 세척한 후, IC1·11B4.6 배양물의 상등액 1 : 10희석액을 각 웰(100㎕/웰)에 가하고 실온에서 1시간 동안 배양시킨다. 배양 후, 플레이트를 세척하고, 퍼옥시다제-접합된 염소 안티-랫트 항체를 가한 후, 실온에서 1시간 동안 배양시키고 플레이트를 세척한다.
이어서, 퍼옥시다제 기질 ABTS를 가하고, 사람 ID-4 농도를 웰내의 흡광도로서 측정한다. 이에 대한 결과는 분석에 의해 포유동물-생성 사람 IL-4가 최소한 사람 혈청 ml당 50pg 검출될 수 있고, 상술한 림포카인은 어떠한 것도 검출되지 않음을 나타낸다. 하기의 표 1 및 제 3a 도는 125I-HuIL-4가 도디 세포에 결합되는 것을 억제하는 11B4F(ab), IgG, 및 조 상등액(비정제 항체)의 능력을 나타낸다. 세가지 시료 모두는 최대 70%까지 결합을 억제한다. 대조용 모노클로날 항체 GL117 F(ab), IgG, 및 조 상등액은 결합에 영향을 미치지 않았다(즉, 대조용 항체는 동일한 아이디오타입의 항원과 관련이 없다). 50% 결합억제에 필요한 정제된 11B4IgG 또는 F(ab)의 농도는 10 내지 100ng/ml 범위내이다.
하기 표 2 및 제 3b 도는 동일한 분석방법에서 25D2.11 F(ab)의 결합억제능력을 나타낸 것이다. 이 제제는 10 내지 15ng/ml의 농도에서 50% 최대효과를 지니면서 90%억제하는 효과를 지니는 것으로 나타났다.
제 3a 및 제 3b 도에서 X축은 ng/ml(log-scale)를 나타내고, Y축은 억제율을 나타낸다.
이들 실험에서, HuIL-4는 중국산 햄스터 난소세포에서 제조하고, 하기 표에서 이를 CHO-HuIL-4라 정한다.
[표 A]
11B4에 의한 125I-CHO-HuIL-4의 도디 세포에의 결합 억제율
Figure kpo00002
[표 B]
25D 2.11 F(ab)단편에 의한 125I-CHO-HuIL-4의 도디 세포에의 결합억제율
Figure kpo00003
본 발명의 상기 양태에 관한 기술은 본 발명을 더욱 상세히 설명하기 위한 것이다. 이것으로 본 발명을 기술된 형태로 제한하기 위한 것이 아니며, 상기 설명을 통해 다양한 변화 및 변형이 가능할 것이다. 발명의 원리 및 이의 실제적인 적용을 가장 적절히 설명할 수 있는 양태를 선택하고 기술함으로써, 본 분야의 다른 기술자들이 본 발명을 특정 용도에 맞게 적절히 변화 및 변형시켜 사용할 수 있도록 하기위한 것이다. 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구 범위를 통해서 규정된다.
출원인 하이브리도마 IC1.11B4.6 및 MP4.25D2.11을 국제기탁기관(American Type Culture Collection Rockville, MD, USA)에 각각 기탁번호 HB 9550 및 HB 9809로 각기 기탁하였다. 이러한 기탁은 특허 절차상의 미생물 기탁을 위한 ATCC의 승인하에서 이루어진 것이며, 이들 기탁물은 35 USC 122 및 37 CFR 1.14에 따라 US 특허 및 상표청장에게 분양될 수 있으며, 미합중국 특허 허여시 일반인에게 분양될 수 있고, 이들 기탁물은 보존을 필요로 한다. 기탁균주의 입수성은 특허법에 따라 정부에 의해 허여된 권리에 위배되는 발명의 실시를 허가하는 것으로 해석되어서는 안된다.

Claims (8)

  1. 사람 인터루킨-4에 특이적인 모노클로날 항체.
  2. 사람 인터루킨-4에 특이적인 모노클로날 항체를 분비할 수 있는 하이브리도마.
  3. 사람 인터루킨-4에 특이적인 모노클로날 항체의 경쇄 가변영역을 함유하는 폴리펩타이드.
  4. 사람 인터루킨-4에 특이적인 모노클로날 항체의 중쇄 가변영역을 함유하는 폴리펩타이드.
  5. 사람 인터루킨-4에 특이적인 모노클로날 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 함유하는, 사람 인터루킨-4에 특이적인 결합 조성물.
  6. 사람 인터루킨-4상의 제 1 항원결정기에 특이적인 제 1 모노클로날 항체를 제공하고, 사람 인터루킨-4에 특이적인 폴리클로날 항체 조성물 및 제 1 항원 결정기와는 상이한 사람 인터루킨-4상의 제 2 항원 결정기에 특이적인 제 2 모노클로날 항체로 이루어진 그룹중에서 선택되는 제 2 항체를 제공한 후, 제 1 모노클로날 항체 또는 제 2 항체와 작동적으로 결합하여 제 1 모노클로날 항체 또는 제 2 항체 각각의 양에 대해 일정한 강도의 시그날을 생성할 수 있는 시그날-생성 물질을 제공하고, 제 1 모노클로날 항체 또는 제 2 항체를 지지물질에 결합시켜 항체-지지체 연결체를 형성토록 한 후, 시료를 항체-지지체 연결체와 접촉시켜 시료중의 사람인터루킨-4가 항체-지지체 연결체와 결합하도록 하고, 항체-지지체 연결체가 제 2 항체를 함유하는 경우, 시그날 생성물질과 작동적으로 결합된 제 1 모노클로날 항체를, 항체-지지체 연결체와 결합된 사람 인터루킨-4와 접촉시키거나, 항체-지지체 연결체가 제 1 모노클로날 항체를 함유하는 경우, 시그날 생성물질과 작동적으로 결합된 제 2 항체를, 항체-지지체 연결체와 결합된 사람 인터루킨-4와 접촉시키고, 시그날 생성물질에 의해 생성된 시그날을 측정하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는, 사람 인터루킨-4를 함유하는 것으로 예측되는 시료중의 사람 인터루킨-4의 존재 판정 방법.
  7. 사람 인터루킨-4상의 제 1 항원 결정기에 특이적인 제 1 모노클로날 항체, 사람 인터루킨-4에 특이적인 폴리클로날 항체 조성물 및 제 1 항원 결정기와는 상이한 사람 인터루킨-4상의 제 2 항원 결정기에 특이적인 제 2 모노클로날 항체로 이루어진 그룹중에서 선택되는 제 2 항체 : 지지체 물질, 및 시그날 생성물질로 이루어짐을 특징으로 하는, 사람 인터루킨-4를 함유하는 것으로 예측되는 시료중의 사람 인터루킨-4의 존재 판정용 키트.
  8. 시료를 사람 인터루킨-4에 특이적인 모노클로날 항체를 함유하는 면역흡착 컬럼에 통과시킴을 특징으로 하는, 사람 인터루킨-4함유 시료로부터 사람 인터루킨-4를 추출하기 위한 면역 정제 방법.
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