JP2843674B2 - ヒトインターロイキン−４に対するヒト化モノクローナル抗体のクローニング及び発現 - Google Patents

ヒトインターロイキン−４に対するヒト化モノクローナル抗体のクローニング及び発現

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 ヒトインターロイキン−４（IL−４）は、最初、ヨコ
タ（Yokota）ら〔Proc.Natl.Acad.Sci.83:5894（198
6）〕によってクローン化され、特徴が明らかにされ
た。IL−４は、免疫系の多くの異なる成分に影響を及ぼ
す高度に多面作用性のリンフォカインである。それは、
Ｔ細胞成長因子（TCgF）活性、及びＢ細胞成長因子活性
を有する。それは、インターロイキン−２（IL−２）の
TCGF活性及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子
（GM−CSF）のコロニー形成活性を増強することができ
る。それは、IgG1及びIgEの優先的産生を誘導し、IgEの
低親和性レセプター（CD23）を誘導し、そしてヒト白血
球クラスII DR抗原の発現を誘導する。
これら活性は、IL−４の幾つかの治療的用途の可能
性、例えば、抗腫瘍剤〔テパー（Tepper）ら,Cell 57:5
03（1989）〕、IL−２抗癌治療の増強剤として、GM−CS
F刺激骨髄再生の増強剤として、又は露出リンパ球症候
群（bare lymphocyte syndrome）を治療するための物質
〔トゥレーヌ（Touraine）,Lancet,pgs.319−321（Febr
uaty 7,1981）；トゥレーヌら,Human Immunology 2:147
（1981）；及びサリバン（Sullivan）ら,J.Clin,Inves
t.76:75（1985）〕としての用途を示唆している。かく
して、IL−４及びIL−４アゴニストは、潜在的に有用な
治療剤である。
IL−４のIgE及びCD23誘導活性は、アレルギー性疾患
を患っている人にとって重要性を有しているかも知れな
い。IL−４アンタゴニストが利用できれば、特に長期使
用で多くの有害な副作用を有するグルココルチコイドス
テロイドを用いる代わりになるかも知れない〔ゴッドマ
ン（Goodman）及びギルマン（Gillman）,The Pharmacol
ogical Basis of Therapeutics,6th Ed.（MacMillan Pu
blishing Company.New York,1980〕。
ヒトIL−４に特異的な強い遮断性のモノクローナル抗
体は、抗イディオタイプ抗体を生成させることによる
（米国特許第4,731,237号）か又はミモトープ（mimotop
e）スクリーニングによる〔ゲイセン（Geysen）ら,J.Im
munol.Meth.102:259（1987）;PCT特許出願WO86/00991及
びWO86/06487〕アゴニスト又はアンタゴニストの構築手
段を提供する。殆どのモノクローナル抗体はげっ歯類細
胞起源のものであるので、人の治療に用いる場合、特に
長期間用いる場合は、それらは免疫原性である可能性が
ある。この可能性を回避するには、ヒトIL−４に対する
ヒト抗体又は“ヒト化”抗体を有するのが望ましい。
げっ歯類抗体の免疫原性をを低下させようとする初期
の努力は、マウス可変領域をヒト不変領域と融合させた
キメラ抗体の産生を包含した〔リウ（Liu）ら、Proc.Na
tl.Acad.Sic.U.S.A.84:3439（1987）〕。しかしなが
ら、ヒト可変領域とマウス不変領域のハイプブッドを注
射されたマウスは、ヒト可変領域に対して向けられた強
い抵抗体反応を示すことが分かった。このことは、ヒト
の系において、かかるキメラ抗体内に全縁げっ歯類Fv領
域を保持することが、依然としてヒト抗マウス抗体のも
とになり得ることを示唆している。
可変ドメインのCDRループが抗体分子の結合部位を含
むと一般に考えられている。ヒトフレームワーク上への
げっ歯類CDRループの移植（即ち、ヒト化）は、げっ歯
類の配列を更に最小限にしようとしたものであった〔ジ
ョウンズ（Jones）ら,Nature 321:522（1986）；ベルホ
ーヤェンら,Science 239:1534（1988）〕。カバト（Kab
at）らによる研究〔J.Immunol.147:1709（1991）〕によ
り、抗体可変ドメインのフレームワーク残基は、CDRル
ープ支持体の中に包含されていることが示された。
抗原結合親和性を保存するためにヒト化抗体のフレー
ムワーク支持体残基内の変化が要求され得ることも見出
された。幾つかのヒト化抗体構築体内にCDR移植を用い
ること及びフレームワーク残基を保存することが、例え
ば、クィーン（Queen）ら〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
86:10029（1989〕、ゴーマン（Gorman）ら〔Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.88:4181（1991）〕及びボジソン（Hodg
son）〔Bio/Technology 9:421（1991）〕により報告さ
れている。正確な配列情報は、僅かなヒト化構築体につ
いて報告されているに過ぎない。
上記の事柄から、IL−４に特異的な治療に用いること
ができるモノクローナル抗体が必要とされていることは
明らかである。好ましくは、これら抗体はヒト化抗体で
あるベきである。
発明の要旨 本発明は、IL−４関連疾患の治療に有用なモノクロー
ナル抗体及び組成物、及びかかる物質を作るための中間
体を提供することにより、この必要性を満足するもので
ある。
より詳しくは、本発明は、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション受託番号ATCC HB 9809の下に寄託
された細胞系の同定用特徴を有するハイブリドーマによ
って産生されるモノクローナル抗体、及び該ハイブリド
ーマ自体を提供する。
本発明は、更に、配列番号:1、配列番号:2により明示
されたアミノ酸配列又はそれらの小配列を有するモノク
ローナル抗体の重鎖又は軽鎖可変領域を含むポリペプチ
ドを提供する。
本発明は、なお更に、ヒトインターロイキン−４に特
異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖可変
領域又はかかる抗体の相補性決定領域（CDR）をコード
する単離されたDNA、又はその機能的等価物を提供す
る。
本発明は、なお更に、上記モノクローナル抗体の軽鎖
及び／又は重鎖可変領域からのCDRを含む結合組成物、
単鎖結合タンパク質、及びキメラ又はヒト化モノクロー
ナル抗体を提供する。
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託
番号ATCC HB 9809の下に寄託された細胞系の同定用特徴
を有するハイブリドーマによって産生されるモノクロー
ナル抗体、該ハイブリドーマにより産生されるモノクロ
ーナル抗体からの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む
ヒトインターロイキン−４に特異的に結合する結合組成
物、該ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル
抗体の軽鎖及び／又は重鎖可変領域からのCDRを含むヒ
トインターロイキン−４に特異的に結合する単鎖結合タ
ンパク質、該ハイブリドーマにより産生されるモノクロ
ーナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を含むヒトインター
ロイキン−４に特異的に結合するキメラモノクローナル
抗体、及び該ハイブリドーマにより産生されるモノクロ
ーナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域からのCDRを含むヒ
トインターロイキン−４に特異的に結合するヒト化モノ
クローナル抗体からなる群から選ばれるヒトIL−４アン
タゴニスト；及び生理学的に許容できるキャリヤーを含
む医薬組成物も本発明により提供される。
図面の簡単な説明 本発明は、添付の図面を参照することによってより容
易に理解することができる。
図１は、細菌宿主内で未グリコシル化ヒトIL−を発現
させるのに適する発現ベクターを図示したものである。
図２は、ヒトIL−４の最終精製段階における215nm吸
収プロフィールを示すものである。
図３（パートＡ及びＢ）は、ダウジ（Daudi）細胞に
結合している125I−CHO HuIL−４の中和を示す。
図４は、プラスミドpKM20を図示したものである。
図５は、プラスミドpSh25D2H−１を図示したものであ
る。
図６は、種々のヒト化抗体内に行ったアミノ酸残基の
置換を、抵抗25D2及びLAYと比較して示すものである。
発明の説明 ここに引用される全ての参考文献は、参照によってそ
っくりそのままここに取り込まれるものとする。
ここで用いる場合、“DNA"という用語は、標準的な
５′から３′までのホスホジエステル鎖内に連結された
デオキシリボヌクレオチドを含む分子として定義され、
小さなオリゴデオキシリボヌクレオチド及び大きなデオ
キシリボ核酸のいずれをも含む。
抗体は、ジスルフィド架橋によって共に連結されたポ
リペプチド鎖の集合体を含む。軽鎖及び重鎖といわれる
２本の最も重要なポリペプチド鎖は、抗体の全ての主要
構造クラス（アイソタイプ）を作り上げている。重鎖及
び軽鎖のいずれも、可変領域及び不変領域といわれる小
領域に更に分割される。重鎖は１の可変領域と３又は４
の異なる不変領域を含み、軽鎖は１の可変領域（重鎖の
ものとは異なる）と１の不変領域（重鎖のものとは異な
る）を含む。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗体の結合特
異性のものになっている。
ここで用いる場合、“CDR構造ループ”という用語
は、抗体分子の結合部分上のβ鎖を架橋する抗体の可変
部分内の３軽鎖領域と３重鎖領域を意味する。これらル
ープは、特徴的な規模的構造を有している〔コチア（Ch
othia）ら,J.Mol.Biol.196:901（1987）；コチアら,J.M
ol.Biol.227:799（1992）〕。
“カバトCDR"とう用語は、カバトら〔Sequences of P
roteins of Immunological Interest,4th Edition,198
7,U.S.Department of Health and Human Services,Nati
onal Institutes of Health〕により定義された重鎖及
び軽鎖上の超可変抗体配列のことをいう。
ここで用いる場合、“重鎖可変領域”という用語は、
（１）長さ110〜125アミノ酸であり、そして（２）その
アミノ酸配列が本発明のモノクローナル抗体の重鎖のＮ
末端アミノ酸から始まるアミノ酸配列と一致するポリペ
プチドを意味する。同じく、“軽鎖可変領域”という用
語は、（１）長さが95〜115アミノ酸であり、そして
（２）そのアミノ酸配列が本発明のモノクローナル抗体
の軽鎖のＮ末端アミノ酸から始まるアミノ酸配列と一致
するポリペプチドを意味する。
Fab、Fc、Ｆ（ab）2、及びFvは、それらの標準的な免
疫学的意味で用いられる〔クライン（Klein）,Immunolo
gy（John Wiley,New York,1982）;Parham,Chapter 14,i
n Weir,ed,Immunochemistry,4th Ed.（Blackwell Scien
tific Publishers,Oxford,1986）〕。
ここで用いる場合、“モノクローナル抗体”という用
語は、ヒトIL−４に特異的に結合できるイムノグロブリ
ンの同種集団のことをいう。ヒトIL−４は、（１）ヒト
IL−４内の１本のペプチド鎖からなるペプチド抗原決定
基、（２）１を超える空間的に近接したペプチド鎖であ
ってそれぞれのアミノ酸配列がヒトIL−４ポリペプチド
配列に沿って分離して位置するペプチド鎖からなる配座
性（conformational）抗原決定基；及び（３）炭水化物
基等の如き、翻訳後にヒトIL−４に共有結合で結合した
分子構造から全体的又は部分的になる翻訳後抗原決定基
を含む、１又は２以上の抗原決定基を有してもよいと理
解される。本発明の抗体は、１又は２以上のこれら決定
基に対して向けられていてもよい。
ここで用いる場合、“結合組成物”という用語は、
（１）機能できるように会合した時に、ヒトIL−４に対
する高い結合親和性を有するコンフォメーションをと
り、そして（２）ヒトIL−４に特異的なモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマ由来である、２本のポリ
ペプチド鎖を含む組成物を意味する。“機能できるよう
に会合した”という用語は、Fab又はFvの如き天然の抗
体断片における会合又はカルボキシル末端で遺伝子操作
されたシステイン含有ペプトドリンカーを介する会合を
含む、種々の手段による結合のために該２本のポリペプ
チド鎖が相互に関連して配置され得ることを意味する。
本発明のハイブリドーマは、周知の技術によって作る
ことができる。通常、その方法は、不死化細胞系と目的
の抗体を産生するＢリンパ球との融合を包含する。ま
た、不死抗体産生細胞系を生ずる非融合技術、例えば、
ウィルス的に誘導された形質転換〔キャサリ（Casali）
ら,Science 234:476（1986）〕が可能であり、本発明の
範囲内のものである。不死化細胞系は、通常、形質転換
された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシ、及びヒト起
源のミエローマ細胞である。便利でありかつ入手容易で
あることから、ラット又はマウスミエローマ細胞系が最
も頻繁に用いられる。
標的抗原を注射した哺乳動物から適当なリンパ球を得
る技術は周知である。一般に、ヒト起源の細胞が望まし
い場合には末梢血リンパ球（PBL）が用いられ、また非
ヒト哺乳動物源が望ましい場合には脾臓細胞又はリンパ
節細胞が用いられる。宿主哺乳動物を精製した抗原で繰
り返し注射して、目的の抗体産生細胞を生成させた後、
これらを採取して不死化細胞系と融合させる。融合技術
も当該技術分野で周知であり、一般に細胞をポリエチレ
ングリコールの如き融合剤と混合することを含む。
HAT（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）
選択の如き標準操作によりハイブリドーマを選択する。
これらハイブリドーマの中から、ウェスタンブロッティ
ング、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、RIA（放射性
免疫検定法）等の如き標準的免疫検定法によりそれらの
培地を分析することによって、目的の抗体を分泌するも
のを選択する。抗体は、標準的タンパク質精製技術を用
いて培地から回収する〔ティユセン（Tijssen）,Practi
ce and Theory of Enzyme Immunoassays（Elsevier,Ams
terdam,1985）〕。上のどの技術を適用するに当たって
も、多くの参考文献を利用することができる〔コーラー
（Kohler）ら,Hybridoma Techniques（Cold Spring Har
bor Laboratory,New York,1980）；ティユセン,Pratice
and Theory of Enzyme Immunoassays（Elsevier,Amste
rdam,1985）；キャンベル（Campbell）,Monoclonal Ant
ibody Technology（Elsevier,Amsterdam,1984）；ヒュ
レル（Hurrell）,Monoclonal Hybridoma Antibodies:Te
chniques and Applications）CRC Press,Boca Raton,F
L,1982）〕。
モノクローナル抗体は、周知のファージライブラリー
系を用いて産生させることもできる。
抗体の断片の使用及び生成も周知であり、例えば、Fa
b断片〔ティユセン,Pratice and Theory of Enzyme Imm
unoassays（Elsevier,Amsterdam,1985）〕、Fv断片〔ホ
ックマン（Hochman）ら、Biochemistry 12:1130（197
3）；シャロン（Sharon）ら,Biochemistry 15:1591（19
76）；エールリッヒ（Ebrlich）ら，米国特許第4,355,0
23号〕及び抗体半分子（antibody half molecules）
（オーダトーレ−ハーグリーブズ（Auditore−Hargreav
es），米国特許第4,470,925号）のようである。更に、
本発明のかかる化合物及び組成物は、公知の技術によ
り、例えば、ハイブリドーマの更なる融合（即ち、いわ
ゆるクワドローマ（quadroma）の生成；リーディング
（Reading），米国特許第4,474,493号）により、又は半
分子の化学的再結合〔ブレナン（Brennan）,Science 22
9:81（1985）〕により、二重特異性抗体の構築に用いる
ことができる。
本発明のハイブリドーマ及びモノクローナル抗体は、
組換え体産生成熟ヒトIL−４のグリコシル化型又は未グ
リコシル化型のいずれかに対して作られる。一般に、ヒ
トIL−４の未グリコシル型は大腸菌内で産生され、グリ
コシル型は哺乳動物細胞宿主、例えば、CV1又はCOSサル
細胞、マウスＬ細胞、又はそれらに類したもので産生さ
れる。組換え体産生成熟ヒトIL−４は、標準的手順〔マ
ニアチス（Maniatis）ら,Molecular Cloning:A Laborat
ory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory.New Yor
k,1982）：オカヤマ（Okayama）及びバーク（Berg）,Mo
l.Cell.Biol.2:161（1982）：オカヤマ及びバーグ,Mol.
Cell.Biol.3:280（1983）；ハーマー（Hamer）,Genetic
Engineering 2:83（1980）：米国特許第4,599,308号；
カウフマン（Kaufman）ら,Mol,Cell.Biol.2:1304（198
2）〕を用いて宿主細胞内に発現ベクターを導入するこ
とによって産生される。
目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列が公
知であるか又は入手可能でありさえすれば、細菌又は哺
乳動物発現ベクターの構築は当該技術分野で周知であ
る。例えば、デボアー（DeBoer）（米国特許第4,511,43
3号）は、細菌発現ベクターに用いるプロモーターを開
示している。ジョーデル（Goeddel）ら（米国特許第4,6
01,980号）及びリッグス（Riggs）（米国特許第4,431,7
39号）は、大腸菌発現系による哺乳動物タンパク質の産
生を開示している。リッグス（前記文献）、フェリッチ
（Ferretti）ら〔Proc.Natl.Acad.Sci.83:599（198
6）〕、スプロート（Sproat）ら〔Nucleic Acids Res.1
3:2959（1985）〕及びマリンバック（Mullenbach）ら
〔J.Biol.Chem.261:719（1986）〕は、細菌内発現用の
合成遺伝子の構築法を開示している。
成熟ヒトIL−４のアミノ酸配列は、ヨコタら（前記文
献）により開示されており、ヨコタらにより開示された
pcDベクターにより保持されたヒトIL−４をコードするc
DNAが、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（ATCC），ロックビル,MD,に受託番号ATCC67029の下
に寄託された。
多くの細菌発現ベクター及び宿主が市販されているか
又はATCCを介して入手可能である。好ましくは、宿主動
物を免疫感作するためのヒトIL−４を、上記のpcDベク
ターにより一過的に形質移入されたCOS、CV1、又はマウ
スＬ細胞の培養上澄み液から単離する。組換えヒトIL−
４は、例えば、ジェンザイム（Genzyme）・コーポレー
ション（ボストン,MA）から及びICN・フロー（Flow）
（コスタメサ,CA）から購入することもできる。
特に、かかる技術は、１つの種の結合領域がもう１種
の抗体の非結合領域と組み合わさっている種間モノクロ
ーナル抗体を産生するのに用いることができる〔リウ
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:3439（1987）〕。例
えば、げっ歯類モノクローナル抗体からのCDRをヒト抗
体上に移植し、それによって、該げっ歯類抗体を“ヒト
化”することができる〔リークマン（Riechmann）ら,Na
ture 332:323（1988）〕。より詳しくは、CDRをヒト不
変領域を有しても有さなくてもよいヒト抗体可変領域内
に移植することができる。かかる方法は、ヒトインター
ロイキン−２レセプターのp55（Tac）サブユニットに対
するマウスモノクローナル抗体をヒト化するのに用いら
れてきた〔クィーンら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:1
0029（1989）〕。
本発明のハイブリドーマから抽出した伝令RNA（mRN
A）は、細菌、酵母、又は他の宿主内でモノクローナル
抗体の断片をクローニング又は発現するのに有用であ
る。かかるモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域
及びCDRをコードするかかるmRNAから生成した相補的DNA
（cDNA）は、標準方法により操作した抗体及び単鎖結合
タンパク質を産生するのに用いることができる。
該抗体の可変領域内でのCDRの位置は、幾つかの周知
の標準方法を用いて決定することができる。例えば、カ
バトら〔Sequences of Proteins of Immunological Int
erest,4th Edition,1987,U.S.Department of Health an
d Human Services,National Institutes of Health〕
は、CDRの位置を突き止める方式を公表した。これら方
式を用いて決定されたCDRをここでは“カバトCDR"とい
う。例えば、以下に記載したようなコンピュータプログ
ラムも利用でき、それを抗体鎖の３次元結合部位ループ
に関与するアミノ酸残基に基づいてCDR構造ループを同
定するのに用いることができる。
以下に記載するヒト化抗体は、（ａ）ヒト化のための
ヒトフレームワークとして用いるべきヒト抗体配列を選
択すること、及び、（ｂ）選択したヒトフレームワーク
内に挿入するのにげっ歯類モノクローナル抗体のどの可
変領域残基を選択すべきかを決定すること、を含む２段
階法を用いて作った。
第１段階は、配列情報が利用可能である最良の入手可
能なヒトフレームワーク配列の選択を含むものであっ
た。この選択プロセスは、次の選択規準に基づくもので
あった。
（１）同一性のパーセント ヒト化すべきげっ歯類モノクローナル抗体の重鎖及び
軽鎖可変領域の配列を最適になるように並べて、他の公
知のヒト抗体の重鎖及び軽鎖可変領域配列と比較した。
これは、２つのヒト抗体、つまりNEWとKOLだけを用いる
ことに大きく頼った先行技術の方法とは対照的である。
これら抗体についての構造上の情報は入手可能であっ
て、該抗体の呼称はそれらが由来した患者（ヒト）のイ
ニシャルである。抗体HILの構造も今日では公知である
（ブルークヘイブン・コード（Brookhaven Code）P8FA
B）。
こうして配列を比較したからには、残基の同一性を記
録して同一性のパーセントを決定する。他の全ての要因
が等しければ、該動物抗体と最高の同一性パーセントを
有するヒト抗体を選択することが望ましい。
（２）配列曖昧性 次いで、未同定残基及び／又は配列不確実性である曖
昧性の存在について、該公知のヒト抗体鎖配列を評価し
た。かかる不確実性の最もありふれたものは、配列分析
操作中のアンモニアの損失によるアミドアミノ酸につい
ての酸性アミノ酸の誤った同定、例えば、タンパク質内
に現実に存在する残基がグルタミン残基であった場合
に、グルタミン酸残基と同定する不正確な同定である。
不確実性は、カバトらの前記文献のものの如きデータベ
ースの検定によって確認される。他の全ての要因が等し
ければ、かかる曖昧性をできるだけ少なく有するヒト抗
体鎖を選択することが望ましい。
（３）ピン領域間隔 抗体鎖可変領域は、ドメイン内ジスルフィド架橋を含
有する。これら架橋を含むシステイン残基間の距離（残
基の数）は、ピン領域間隔（Pin−region spacing）
〔コチアら,J.Mol.Biol.196:901（1987）〕といわれ
る。他の全ての要因が等しければ、選択されるヒト抗体
のピン領域間隔は、該動物抗体のそれと類似しているか
又は同一であることが最も望ましい。また、コンピュー
ターモーデリングを容易にするために、ヒト配列ピン領
域間隔は、公知の抗体３次元構造のそれと類似している
か又は同一であることが望ましい。
上述の規準の基づき、望ましい特徴の最良の総合的組
み合わせを有するヒト抗体、つまり抗体LAYが、げっ歯
類抗体のヒト化用フレームワークとして選択された。
第２段階は、いずれのげっ歯類抗体可変領域配列がヒ
トフレームワーク内への移植用に選択されるべきかの決
定を含むものであった。この選択プロセスは、次の選択
規準に基づくものであった。
（１）残基選択 ２つのタイプの可能性ある可変領域残基をげっ歯類抗
体配列内で評価した。そのうちの最初のものを“最小残
基”と呼んだ。これら最小残基は、CDR構造ループに加
えて、CDR構造ループを支持及び／又は方向付けるのに
要求される、コンピューターモデリングにより示された
何らかの付加的残基を含んだ。
もう１つの可能性ある可変領域残基を“最大残基”と
呼んだ。それらは、該最小残基とカバトCDRに加えて、
約５ÅのCDR構造ループ残基内に収まりかつ約５Å2又は
それより大きい水溶媒接触可能表面〔リー（Lee）ら,J.
Biol.Chem.55:379（1971）〕を有する、コンピューター
モデリングにより決められた何らかの付加的残基を含ん
だ。
（２）コンピューターモデリング 可能性ある可変領域残基を特定するために、（ａ）ヒ
ト化されるべきげっ歯類抗体の可変領域配列、（ｂ）選
択したヒト抗体フレームワーク配列、及び（ｃ）種々の
最小及び最大動物抵抗残基が移植されたヒト抗体フレー
ムワーク配列を含む全ての可能な組換え抗体に関して、
コンピューターモデリングを行った。
このコンピューターモデリングは、タンパク質モデリ
ングに適するソフトウェアー及び（ａ）げっ歯類抗体の
ものと殆ど同一である可変領域アミノ酸配列を有しかつ
（ｂ）公知の３次元構造を有する抗体から得られる構造
上の情報を用いて行った。用いたソフトウェアーは、SY
BYLバイオポリマー・モジュール・ソフトウェアー（Tri
pos Associates）であった。
上述の分析で得られた結果に基づき、げっ歯類抗体の
ものに最も近いコンピューターモデリング構造をもたら
すげっ歯類可変領域を含有する組換え鎖を、ヒト化用に
選択した。
抗ヒトIL−４モノクローナル抗体25D2の重鎖（VH）及
び軽鎖（VL）可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド
配列（その作成は以下に記載してある）をそれぞれ配列
番号:1及び２により配列表に明示している。これらヌク
レオチド配列から予測されるアミノ酸配列も配列番号:1
及び２に明示している。
コバトらの前記文献の方法により決定したモノクロー
ナル抗体25D2の重鎖可変領域のCDRは、配列番号:1によ
り明示されるアミノ酸配列のアミノ酸基31〜35、50〜66
及び99〜110を含む。以下に記載する結合部位ループ構
造のコンピューター分析により決定して、モノクローナ
ル抗体25D2の重鎖可変領域のCDRは、配列番号:1により
明示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基26〜32、53〜56
及び100〜108を含む。
上述の重鎖CDRをコードするヌクレオチド配列は、配
列番号:1により明示されるヌクレオチド配列の塩基91〜
105、148〜198及び295〜330（コバト決定法）及び塩基7
6〜96、157〜168及び298〜324（ループ分析法）を含
む。
コバトらの前記文献の方法により決定したモノクロー
ナル抗体25D2の軽鎖可変領域のCDRは、配列番号:2によ
り明示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基24〜34、50〜
56及び89〜96を含む。以下に記載する結合部位ループ構
造のコンピューター分析により決定して、モノクローナ
ル抗体25D2の軽鎖可変領域のCDRは、配列番号:2により
明示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基26〜31、50〜52
及び91〜95を含む。
上述の軽鎖CDRをコードするヌクレオチド配列は、配
列番号:2により明示されるヌクレオチド配列の塩基70〜
102、148〜168及び265〜288（コバト決定法）及び塩基7
6〜93、148〜156及び271〜285（ループ分析法）を含
む。
上述の事柄から、こうして決定したCDRは９〜51塩基
によりコードされることが分かる。従って、タンパク質
操作に有用なDNAは、それぞれ配列番号:1及び２により
明示されたヌクレオチド配列の約12〜363塩基及び約９
〜321塩基含む。また、重要なのは、タンパク質操作用
のアイソタイプの選択のための不変領域である。
本発明のCDRをヒト抗体上に移植することによりヒト
化された抗体を産生するのに用いる場合、CDR又はIL−
４と相互作用しそうな１又は２以上のアミノ酸残基をCD
Rの外側に含めることが望ましいといえる（クィーンら
の前記文献）。
本発明のCDRは、抗体25D2の機能的特性を真似る非ペ
プチド擬態化合物の設計の基礎を形成することもでき
る。かかる擬態化合物を作る方法は、サラゴビ（Sarago
vi）ら〔Science 253:792（1991）〕により記載されて
いる。
抗体ヒト化の基礎を提供するのに加えて、配列番号:1
及び２の情報は、バード（Bird）ら〔Science 242:423
（1988）〕により記載されたような、Fv領域の連結され
た重鎖及び軽鎖断片、又はヒューストン（Huston）ら
〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5879（1988）〕により
記載されたような、生合成抗体結合部位（BABS）を含む
単鎖IL−４結合タンパク質を作るのに用いることができ
る。単離した重鎖可変ドメインを含む単ドメイン抗体
〔ワード（Ward）ら,Nature 341:544（1989）〕も配列
番号:1における情報を用いて調製することができる。
本発明の２又は３以上のCDRを直接に又はリンカー配
列によって１つのポリペプチドにカップリングすること
もできる。１又は２以上のCDRを他の（非イムノグロブ
リン）ポリペプチド又はタンパク質に工学的に作り上
げ、それによって、該ポリペプチド又はタンパク質にIL
−４結合能力を付与することもできる。
“配列番号:1又は２により明示された配列を有するモ
ノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖可変領域、又はその小
配列を含む”ポリペプチドは、上述のCDR含有具体化物
の全てを含むものとここで定義される。
抗体25D2の重鎖及び軽鎖可変領域又はそれからのCDR
をコードするDNAは、配列番号:1及び２に示した核酸配
列情報を用いる標準方法によって調製することができ
る。例えば、かかるDNAは、例えば、マテウッシ（Matte
ucci）ら〔J.Am.Chem.Soc.103:3185（1981）〕のホスホ
ラミダイト固体支持法（phosphoramidit1e solid suppo
rt method）、ヨー（Yoo）ら〔J.Biol.Chem.764:17078
（1989）〕の方法、又はその他の周知の方法を用いて、
化学的に合成することができる。
また、遺伝子の配列及び多くの入手可能な制限エンド
ヌクレアーゼの部位特異性が公知であるので、当業者は
ハイブリドーマMP4.25D2.11のゲノミックDNAから遺伝子
を容易に同定及び単離して、目的の配列を得るために該
DNAを開裂することができる。ドーハティ（Daugherty）
ら〔Nucleic Acids Res.19:2471（1991）〕により例示
されたように、PCR法〔サイキ（Saiki）ら,Science 23
9:487（1988）〕を用いて同じ結果を得ることもでき
る。所望により、PCRに用いるプライマーをデザインし
て適切で新たな制限部位を導入して、所与のベクターへ
の組み込みを容易にしてもよい。
抗体25D2の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするDNAを
得るためのいま１つの方法は、ハイブリドーマIC1.11B
4.6又はMP4.25D2.11から単離したmRNAを鋳型として用い
てcDNAの調製を行い、標準方法を用いてそれから該可変
領域をクローニングする方法である〔例えば、ウォール
（Wall）ら,Nucleic Acids Res.5:3113（1978）；ザル
サット（Zalsut）ら,Nucleic Acids Res.8:3591（198
0）；キャビリィ（Cabilly）ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.81:3273（1984）；ボス（Boss）ら,Nucleic Acids
Res.12:3791（1984）；アムスター（Amster）ら,Nuclei
c Acids Res.8:2055（1980）；モーア（Moore）ら，米
国特許第4,642,234号〕。
もちろん、遺伝子コードの縮退により、多くの異なる
ヌクレオチド配列が、配列番号:1及び２に明示したアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド及びその中のCDRをコー
ドすることができる。コドンは、原核又は真核系で最大
に発現するように選択することができる。かかる機能的
等価物も本発明の一部分である。更に、当業者であれ
ば、生物学的機能を実質的に変えない重要でないアミノ
酸置換、付加又は欠失がある控えめに修飾された変異型
が存在し得ることが分かる〔アンフィセン（Anfinse
n）,Science 181:223（1973）；グランタム（Grantha
m）,Science 185:862（1974）〕。
配列番号:1及び２により明示したアミノ酸配列のかか
る控えめに修飾された変異型も本発明により意図されて
いる。例えば、化学合成により又は修飾したPCRプライ
マーを用いることにより又は部位特異的変異誘発法によ
り本発明のDNAを修飾して、所望によりかかる変異型を
作ることは、十分に当該技術分野の熟練の範囲内であ
る。
より大幅な修飾を行うことも有益であり得る。例え
ば、ロバーツ（Roberts）ら〔Nature 328:731（198
7）〕は、部位特異的変異誘発法により結合部の周辺の
２つの荷電した残基を除去することにより親和性と特異
性が高められた抗体を作った。
抗体25D2の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするDNAの
ベクターへの挿入は、該DNA及びベクター両方の端末が
適合制限部位を含んでいれば、容易に行われる。もしも
これを行えないならば、制限エンドヌクレアーゼ開裂に
よって生じた一本鎖DNA張出し部分を消化することによ
って該DNA及び／又はベクターの末端を修飾してブラン
トエンドを生成させるか、又は適当なDNAポリメラーゼ
で該一本鎖末端を充填することによって同じ結果を達成
することが必要かも知れない。また、該末端上にヌクレ
オチド配列（リンカー）を連結するこによって、あらゆ
る目的の部位を生成させることができる。かかるリンカ
ーは、目的の制限部位を規定する特有のオリゴヌクレオ
チド配列を含んでもよい。必要であれば、ホモポリマー
性テーリング（homopolymeric tailing）によって、開
裂したベクター及びDND断片を修飾してもよい。
本発明のモノクローナル抗体、結合組成物又は単鎖結
合タンパク質、又はかかるモノクローナル抗体に対して
調製された抗イディオタイプ抗体を用いて、IL−４関連
疾患を治療する医薬組成物を調製するこができる。
該組成物のあるものは、IL−４遮断作用又はアンタゴ
ニスト作用を有するので、IL−４活性を抑制するのに用
いることができる。かかる組成物は、本発明のモノクロ
ーナル抗体、結合組成物又は単鎖結合タンパク質及び生
理学的に許容できるキャリヤーを含む。
他の組成物は、本発明のモノクローナル抗体を抗原と
して用いて調製した抗イディオタイプ抗体及び生理学的
に許容できるキャリヤーを含む。モノクローナルであっ
てもポリクローナルであってもよくかつ標準方法で作る
れるこれら抗イディオタイプ抗体は、IL−４自体の結合
活性を真似ることができる。かくして、それらは、潜在
的にIL−４アゴニスト又はアンタゴニストとして有用で
あり得る。
有用な製剤上の担体は、適合性で無毒であれば、本発
明の組成物を患者に送達するのに適する処何なる物質で
あってもよい。無菌水、アルコール、脂肪、ワックス、
及び不活性固体がキャリヤーに含まれ得る。該医薬組成
物には、薬学的に許容できるアジュバント（緩衝剤、分
散剤）を加えてもよい。一般に、かかる薬品の非経口投
与に有用な組成物は周知であり；例えば、Remington's
Pharmaceutical science,15th Ed.（Mack Publishing C
ompany,Easton,PA,1980）がある。また、本発明の組成
物を移植可能な薬品送達系により患者の体内に導入して
もよい〔アーカート（Urquhart）ら,Ann,Rev.Pharmaco
l.Toxicol.24:199（1984）〕。
実施例 以下の非制限実施例は、本発明を例証するのに役立つ
ものである。ベクターおよび宿主の選択並びに試薬濃
度、温度および他の変数値は、本発明の用途を単に例示
するものであり、本発明を制限するものと考えるべきで
はない。
特に断らない限り、固体混合物中固体、液体中液体お
よび液体中固体に関して以下に示した百分率は、それぞ
れ重量／重量、容量／容量および重量／容量基準に基
く。滅菌条件は、細胞培養の間維持された。
実施例I. pcD−ヒトIL−４によるCOS7サル細胞のトランスフェク
ションによるグリコシル化ヒトIL−４の製造 発現ベクターpcD−ヒトIL−４および宿主COS7細胞
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（American Type Culture Collection）から、それぞれ
受託番号67029およびCRL1651として入手可能である。pc
D−ヒトIL−４クローンを増幅させ、プラスミドDNAを精
製した後、標準トランスフェクションプロトコルを用い
てCOS7をトランスフェクトした。すなわち、COS7細胞約
1x106個を、ダルベッコ修飾イーグル培地（DME）、10％
ウシ胎児血清および4mM L−グルタミンが入っている100
mm組織培養プレート上に播種する。播種して約24時間後
に、培地をプレートから吸引し、細胞を血清不含緩衝
（50mMトリス）DMEで２回洗浄した。各プレートに対し
て血清不含緩衝DME（4mM L−グルタミン含有）4ml、DEA
E−デキストラン80マイクロリットルおよびpcD−ヒトIL
−4 DNA5マイクログラムを加える。細胞をこの混合中に
おいて30℃で４時間インキュベートした後、混合物を吸
引除去し、そして細胞を血清不含緩衝DMEで１回洗浄す
る。洗浄後、4mM L−グルタミン、100μＭクロロキニン
および２％ウシ胎児血清を含むDME5mlを各プレート対し
て加え、細胞を３時間インキュベートした後、血清不含
緩衝DMEで２回洗浄する。次に、4mM L−グルタミンおよ
び４％ウシ胎児血清を含むDME5mlを加え、細胞を37℃で
24時間インキュベートする。次に、細胞をDMEまたはPBS
で１〜３回洗浄し、血清不含DME（4mM L−グルタミン含
有）5mlを加え、そして５日後に培養物上澄みを採取す
るまで細胞を37℃でインキュベートする。
実施例II. COS7トランスフェクション上澄みからのグリコシル化ヒ
トIL−４の精製精製に関する生物検定 Ｔ細胞成長因子（TCGF）活性を用いて、実施例Ｉによ
って製造された上澄みから精製中のヒトIL−４を検定し
た。いくつかの標準検定がTCGF活性に関して記載されて
きた［デヴォス（Devos）ら、Nucleic Acids Res.11:43
07（1983）；サーマン（Thurman）ら、J.Biol.Response
Modifiers 5:85（1986）；ロバート（Robert）−グロ
フ（Guroff）ら、グロフ監修、Growht and Maturation
Factors（ジョン・ウィリー（John Wiley）、ニューヨ
ーク、1984）の９章］。概して、TCGT検定は、末梢Ｔリ
ンパ球またたIL−２依存Ｔ細胞系の増殖を促進する因子
の能力に基いている［ジリス（Gillis）ら、J.Immunol.
120:2027（1978）］。増殖は、標準的な技法、例えば、
トリチウム化チミジンの取込みによってまたは比色定量
法［モスマン（Mosmann）、J.Immunol.Meth.65:55（198
3）］によって決定することができる。
ヒトIL−４のTCGF活性の検定は以下のように実施され
た。すなわち、健康な提供者からの血液をへパリン処理
試験管中に採血し、そしてフィコール・ハイパクー（Fi
coll−Hypaque）上に重層する。例えば、15ml遠心管中
のフィコール・ハイパクー3mlにつき血液5ml。300xgで2
0分間遠心分離後、界面にある細胞を吸引し、そして10
％ウシ胎児血清、50μM 2−メートルルカプトエタノー
ル、フィトヘマグルチニン（PHA）20μg/mlおよび組換
え体ヒトIL−２を含むRPMI1640から成る増殖培地中で希
釈した。37℃で５〜10日間のインキュベーション後、PH
Aに刺激された末梢血液リンパ球（PBL）を洗浄し且つ２
日間の比色定量検定（モスマン、上記）において用い
た。IL−４標準（pcD−ヒトIL−４でトランスフェクト
されたCOS7細胞からの上澄み）または検査される部分の
連続２倍希釈を、96ウェルトレー中において上記の増殖
倍地を用いて実施して、最終容量50μ1/ウェルを生成し
た。細胞約４〜８×106個/mlのPHA刺激PBL50μ１を各ウ
ェルに対して加え、そしてトレーを37℃で２日間インキ
ュベートした。次に、細胞増殖をモスマン（上記）にし
たかって測定した。
本明細書中で用いられる１単位は、一つのウェル（0.
1ml）において2x104個のPHA刺激PBLの50％最大増殖を48
時間以上刺激する因子の量である。
精製 精製は、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過
および逆相高速液体クロマトグラフィーの連続利用によ
って達成された。全ての操作を４℃で実施した。
COS7細胞を遠心分離によって除去し、上澄みを限外濾
過によって約10倍に濃縮し、そして更に処理されるまで
−80℃で貯蔵した。IL−４力価は、フィトヘマグルチニ
ンに誘導されたヒト末梢血液リンパ球の増殖を刺激する
タンパク質の脳力を検定することによって、すなわち、
上記の標準検定を用いるTCGF活性によって検定された。
TCGF活性が約104〜106単位/mlで且つタンパク質含量
が約15〜20mg/mlである濃縮されたCOS−７上澄みを、50
mMナトリウムへペス（HEPES）、pH7.0の２回交換に対し
て24時間にわたって透析した（各交換は、一つの濃縮物
の約10〜15倍容量である）。透析物を、50mMナトリウム
ヘペス、pH7.0で予め平衡させたＳ−セファロース（SEP
HAROSE）（登録商標）（流速:0.2ml/分）カラム（１×
2.5cm）に入れた。カラムを15カラム容量の平衡用緩衝
液で洗浄した後、50mMナトリウムヘペス、pH7.0中０〜
0.5M塩化ナトリウムに及ぶ直線塩化ナトリウム勾配の２
カラム容量で溶離した。溶離は、５カラム容量の50mMナ
トリウムヘペス、0.5M NaCl、pH7.0による無勾配によっ
て終結した。1.5mlおよび1.8ml部分を２種類の別個のバ
ッチから集めた。IL−４力価は、両方のクロマトグラフ
ィーに関して300mMおよび500mM塩化ナトリウムの間で溶
離することが分かった。
IL−４力価を有するＳ−セファロース（登録商法）カ
ラムからの画分を、全部の別個の容量9.0および10.8ml
に関して混合した。両方の容量を、アミコン（Amicon）
YM5膜（分子量カットオフ:5000）を用いる限外濾過によ
って1.9mlまで濃縮した。この工程からのタンパク質の
回収率は約80％であった。濃縮IL−４溶液を、50mMヘペ
ス、0.4M MaCl、pH7.0で予め平衡させたセファデックス
（SEPHADEX）Ｇ−100（登録商標）カラム（1.1×58cm）
に入れ、そしてカラムを同緩衝液によって0.15ml/分で
溶離した。50の画分（1.0ml/画分）全部を集め、そして
IL−４力価を分析した。生物学的活性のピークは、見掛
の分子量22,000ダルトンで観察された。セファデックス
Ｇ−100（登録商標）カラムは、見掛の分子測定に関し
てウシ血清アルブミン（65.000ダルトン）、カルボニッ
クアンヒドラーゼ（30,000ダルトン）およびシトクロム
Ｃ（11,700ダルトン）を用いて検量された。
IL−４活性を有するセファデックスＧ−100（登録商
標）カラムからの画分を真空中において３〜４倍に濃縮
し、そしてVYDAC C−４（登録商標）ガードカラム（4.6
×20mm）上に注入した。0.1％（v/v）トリフルオロ酢酸
（TFA）中０〜72％（v/v）アセトニトリルの直線勾配
を、カラム温度35℃および流速1.0ml/分において15分間
で生じさせた。214nmにおいて保持時間７分、8.2分およ
び8.7分に検出された３個のピークが得られた（それぞ
れ図２のピーク１、２および３）。ピーク２（溶離時間
8.2分）のアリコート40μｌを凍結乾燥させ且つ10％ウ
シ胎児血清を含む最少必須培地中に再溶解させた。この
溶液は陽性のTCGF応答を示した。ピーク２のアリコート
300μｌを蒸発乾固させ且つ0.1％（w/v）ドデシル硫酸
ナトリウム（SDS）20μｌ中に再溶解させた。アリコー
ト２μｌを１％（v/v）TFA200μｌ中で希釈し、そして
再度クロマトグラフィーを行なった。この試料の高速液
体クロマトグラフィーは、215nmでの単一ピークを実証
した。ピーク２物質は、約７×108単位/mgの活性を示し
た。
実施例III. 大腸菌における非グリコシル化ヒトIL−４の生産 TIRPC11と示された大腸菌発現ベクターを、標準的な
技法を用いて、例えば、マニアティス（Maniatis）ら、
Molecular Cloning:A Lboratoru Manual（コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harb
or Laboratory）、ニューヨーク、1982年）において開
示されたように構築した。
TRPC11ベクターは、合成共通RBSフラグメントをClaI
リンカー（ATGCAT）に対して連結することによっておよ
び得られたフラグメントを（ClaI部位を含むように予め
変更された）ClaI制限pMT11hc中にクローン化すること
によって構築された。pMT11hcは、（マニアティスら、
上記に引用、によって記載された）πVXプラスミドのEc
oRI−HindIIIポリリンカー領域を有するpBR322の、小型
（2.3キロベース）高コピーAMPR、TETS誘導体である。
それは、pMT11hcをEcoRIおよびBamHIで制限し、得られ
た付着端にフィルインし、そしてClaIリンカー（CATCGA
TG）と連結し、それによってEcoRIおよびBamHI部位を修
復し且つSmaI部位をClaI部位で置換することにより、Cl
aI部位を含むように変更された。
TRPC11構築からの１種類の形質転換細胞は、ClaI部位
が隣接したタンデムRBS配列を有していた。ClaI部位の
一つおよびRBS配列の第二コピーの一部分は、このプラ
スミドをPstIで消化し、BalIヌクレアーゼで処理し、Ec
oRIで制限し、そして全４種類のデオキシヌクレオチド
三リン酸の存在下においてT4 DNAポリメラーゼで処理す
ることによって除去された。得られた30〜40bpフラグメ
ントをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって回収し
且つSmaI制限pUC12中にクローン化した。次に、［ニコ
ルス（Nichols）らによってMethods in Enzymology,101
巻、155頁（アカデミック・プレス（Academic Pres
s）、ニューヨーク、1983年）に記載された］pKC101由
来の248bpの大腸菌trpP含有EcoRIフラグメントをEcoRI
部位中にクローン化して、図１に図示されているTRPC11
構築を完了した。
TRPC11は、ヒトIL−4 cDNAのベクターとして、それを
ClaIおよびBamHIで最初に消化し、それを精製した後、
配列が配列番号３および４で定義されてる２種類のオリ
ゴヌクレオチドから成る二本鎖合成リンカー0.1マイク
ロモルを含む標準的な連結反応溶液中において（受託番
号67029としてATCCに寄託された）pcD−125のEcoRV/Bam
HIフラグメントとそれを混合することによって用いられ
た。
大腸菌AB1899を、標準的な塩化カルシウム法を用いて
連結反応溶液によって直接的に形質転換し、増殖させ、
そして平板培養した。IL−4 cDNAインサートを含むコロ
ニーを、標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて選択
した。形質転換細胞をＬ−ブイヨン中で培養し、そして
IL−４を本質的に発現させた。
実施例IV. 大腸菌によって生産された凝集体からの非グリコシル化
IL−４の精製 （エール大学大腸菌遺伝学センター（Yale Universit
y E.coli Genetics Center）、ニューヘブン、CTから入
手した）大腸菌AB1899（lon-）の１リットル培養物をOD
560＝２（細胞約1.6×109個/ml）まで増殖させた。細胞
を、４℃において4500xgで15分間の遠心分離によって採
取した。ペレットを、50mM NaCl、1mMエチレンジアミン
四酢酸（EDTA）および0.1mMフッ化フェニルメチルスル
フェニル（PMSF）を含む50mMトリス緩衝液、pH8.0の30m
l中に再懸濁させた。EDTAおよびPMSFは、精製前にヒトI
L−４を分解するかもしれないプロテアーゼ活性を阻害
するために加えられた。次に、細胞を音波処理し［70ワ
ットで50パルス（50％）］、そして４℃において25,000
xgで15分間遠心分離した。得られたペレットの主タンパ
ク質成分は、（ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）中に可
溶化され且つクマシーブルーで染色された）電気泳動に
よって分離されたペレット物質のゲルバンドパターンと
陰性対照とを比較することによってIL−４であることが
分かった。
上澄み液の除去後、ペレット物質を、5MグニジンHC
l、2mMグルタチオン（還元型）および0.2mMグルタチオ
ン（酸化型）を含むトリス緩衝溶液（50mMトリス、50mM
NaCl、1mM EDTA、0.1mM PMSF、pH8.0;ペレット物質１グ
ラムにつき9ml）中に再懸濁させた。室温で約１時間
後、溶液を、2mMグルタチオン（還元型）および0.2mMグ
ルタチオン（酸化型）を含むトリス緩衝溶液、pH8.0中
に1:9に希釈した。希釈、透析または濃縮工程中に沈殿
が形成した場合は必ず、手順の前にそれらを遠心分離に
よって除去した。次に、全容量を、リン酸緩衝溶液３リ
ットルに対して一晩中に３回透析した。透析物（すなわ
ち、透析バックに残された物質）をアミコンYM5フィル
ターで濃縮し（最終濃度8mg/ml）、そしてゲル濾過クロ
マトグラフィーに供した（カラム:P30（バイオラド（Bi
oRad）、1.5×90cm;PBS溶離緩衝液；流速8ml/時）。画
分を15分間にわたって集めた。画分23〜27をプールし、
そして更に、逆相高速液体クロマトグラフィーによって
分析した。このような分析により、プールされた画分が
純粋なヒトIL−４を＞95％含んでいたことが示された。
１リットル培養物（OD560が２）からの収量は、比活性
５×107単位/mgのヒトIL−４が2mgであった。
実施例V. ハイブリドーマIC1.11B4.6の製造 雄のルイス（Lewis）ラットを、完全フロイントアジ
ュバント（CFA）1mlで乳化したヒトIL−４溶液1mlを用
いて腹腔内に免疫感作した。ヒトIL−４溶液は、10mMト
リス−HCl、0.5M NaCl、pH7.4中に14μg/mlの濃度のヒ
トIL−４から成った。ヒトIL−４は、実施例ＩおよびII
にしたがって製造され、その非活性は２×107単位/mgで
あった。最初の免疫感作の２週間後、ラットに、CFA1ml
で乳化したヒトIL−４溶液1mlを再度腹腔内注射した。
２回目の注射の３か月後、ラットにヒトIL−４溶液1ml
（15μｇ）を静脈内に追加投与した。ブースター注射の
４日後にラットを屠殺し、血液を集め、そして融合用に
脾臓を摘出した。
脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞P3X63−Ag8.653（ATCC C
RL 1580）とを、ポリエチレングリコール（PEG）を用い
て1:1の比率で融合した。細胞懸濁液（HAT培地中細胞3.
5×105個/ml）を40枚の96ウェルプレート中に分配し
た。10日後、ハイブリドーマ上澄みを、微量滴定プレー
ト上に直接的に固定されたヒトIL−４に対して（間接エ
リザ）またはウサギ抗ヒトIL−４の固定された多クロー
ン性IgG部分に結合したヒトIL−４に対して結合するそ
れらの能力に関して検査した。結合抗体は、標準的なプ
ロトコルを用いるペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ラット免
疫グロブリンによって検出された。
IL−４と反応するハイブリドーマ分泌抗体を限界希釈
によってクローン化した。IC1.11B4.6は、これらの方法
によって選択されたこのようなハイブリドーマの一つで
あった。IC1.11B4.6からの抗体は、IgG2aイソタイプ由
来であることを確認された。ハイブリドーマは貯蔵し
（例えば、10％DMSO含有培地中−70℃）且つ標準的な哺
乳動物細胞培養技術（例えば、1mMグルタミンおよび50m
M 2−メルカプトエタノールを補足した10％ウシ胎児血
清含有RPMI1640）を用いて培養することができる。
実施例VI. ハイブリドーマMP4.25D2.11の製造 ハイブリドーマの集合を製造し、そしてそれらの抗体
のヒトIL−４特異性を実施例Ｖの場合と実質的に同様の
方法でスクリーニングした。次に、集合のハイブリドー
マを、ヒトIL−４のTCGF活性を阻止するそれらの抗体の
能力に関して（実施例IIに開示されたような）標準的な
インビトロ検定において更にスクリーニングした。識別
されたいくつかの阻止性単クローン性抗体の内、MP4.25
D2.11によって生産されたものを、最高力価の阻止活性
を有するものとして選択した。MP4.25D2.11によって生
産された抗体はラットIgG1であることが確認された。
実施例VII. ヒトIL−４のサンドイッチ検定 ウサギ多クローン性抗ヒトIL−４抗体（プロテインＡ
アフィニティーカラム上で精製されたPBS中10μg/ml）1
00μｌを、90ウェルのポリ塩化ビニル微量滴定プレート
中の各ウェルの表面上に37℃で２時間吸着させる。（PB
Sは、蒸留水１リットル中にNaClが8.0g、KH2PO4が0.2
g、Na2HPO4・12H2Oが2.9gおよびKC1が0.2gから成る。pH
は7.4である。）プレートを、PBS−トゥイーン（Twee
n）（トゥイーン20を0.5ml/リットル加えることを除
き、PBSとして正確に調製された）で洗浄して非結合抗
体を除去した後、精製された大腸菌生産ヒトIL−４の二
重反復連続希釈（PBS中）を12ウェル列の２列のウェル
中に、1000pg/ml〜15pg/mlの減少するIL−４濃度の順に
入れる。以下の試料を残りのウェル中に入れた。すなわ
ち、（１）ヒトＴ細胞クローンからの培養物上澄み、例
えば、CILy1+2-/9（ATCC CRL 8179）、（２）pcD−ヒト
IL−４でトランスフェクトされたCOS7細胞の培養物上澄
み、（３）種々の濃度の精製COS7生産IL−４を含むヒト
血清並びに（４）ヒトIL−１α、1L−２、IL−３、IFN
−γ、IFN−α2b、GM−CSFおよびBSF−２を含む試料。
全部の試料を室温で２時間インキュベートした。PBS
−トゥイーンで洗浄後、IC1.11B4.6の培養物からの上澄
みの1:10希釈を各ウェルに加え（100 1/ウェル）、そし
て室温で１時間インキュベートした。インキュベーショ
ン後、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗
ラット抗体を加え、そして室温で１時間インキュベート
した後、そのプレートを洗浄した。次に、ペルオキシダ
ーゼ基質ABTSを加え、そしてヒトIL−４濃度をウェル中
の光学濃度によって決定した。結果は、検定が哺乳動物
生産ヒトIL−４をヒト血清中において50pg/ml程度の低
濃度で検出することができることおよび検定は前記に挙
げたいずれのリンホカインも検出しないことを示す。
下記の表１および図3Aは、ダウディ（Daudi）細胞に
対する125I−HuIL−４の結合を阻害する11B4 F（ab）、
IgGおよび粗製上澄み（未精製抗体）の能力を示す。３
種類の標品はいずれも、最大限70％まで結合を阻害し
た。対照単クローン性抗体GL117 F（ab）、IgGおよび粗
製上澄みは結合に影響を及ぼさなかった。（対照抗体は
同様のイディオタイプに無関係の抗原に対する。）結合
を50％阻害するのに必要とされる精製11B4 IgGまたはＦ
（ab）の濃度は、10〜100ng/mlの範囲内である。
下記の表２および図3Bは、同様の検定において結合を
阻害する25D2.11 F（ab）の能力を示す。この標品は、1
0〜15ng/mlでの50％最大効果によって90％阻害を引起こ
した。
図3Aおよび3Bにおいて、Ｘ軸は（対数目盛りで）ng/m
lを示し且つＹ軸は阻害パーセントを示す。
これらの実験において、HuIL−４はチャイニーズハム
スター卵巣細胞において製造され且つ下記の表において
CHO−HuIL−４と表示される。
実施例VIII. 抗体25D2のクローニング 一般的な方法および試薬 特に断らない限り、標準的な組換えDNA法を、本質的
にはマニアティスら、Molecular Cloning:A Laboratory
Manual,1982年，コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリーに記載されたように実施した。
飽和した一晩培養物からのプラスミドDNAの小規模な
単離は、バーンボイム（Birnboim）ら［Nuc.Acids Res.
7:1513（1979）］の方法にしたがって実施した。この方
法は、分析目的のための細菌培養物からの少量おDNAの
単離を可能にする。特に断らない限り、多量のプラスミ
ドDNAは、クルウェル（Clewell）ら［J.Bagcteriol,11
0:1135（1972）］によって記載されたように製造され
た。
プラスミドDNAの切断によって誘導された特異的制限
酵素フラグメントを、アガロース中における分離用電気
泳動によって単離した。９×5 1/2cmの寸法のゲルをト
リス−ホウ酸緩衝液（マニアティスら、上記、454頁）
中において50mAで１時間流した後、臭化エチジウム0.5
μg/mlで染色してDNAを可視化した。適当なゲル部分を
切取り、そしてDNAを電気溶出した（マニアティスら、
上記、164頁）。電気溶出後、DNAをフェノール抽出し
（マニアティスら、上記、458頁）、そしてエタノール
沈殿させた（マニアティスら、上記、461頁）。
制限酵素およびT4 DNAリガーゼは、ニュー・イングラ
ンド・バイオラブズ（New England Biolabs）（ビバリ
ー、MA）から購入した。スーパースクリプトRNアーゼH-
逆転写酵素はBRL/ギブコ（Gibco）（ロッックビル、M
D）製であり、Raq DNAポリメラーゼはストラタジーン
（Stratagene）（ラホヤ、CA）製、DNAポリメラーゼク
レノウフラグメントはファーマシア・エルケイビー・バ
イオテクノロジー・インコーポレーテッド（Pharmacia
LKB Biotechnology.Inc.）（ピスカタウェイ、NJ）製、
子ウシ腸ホスファターゼはベーリンガー・マンハイム・
バイオオケイカルズ（Boehringer Mannheim Biochemica
ls）（インディアナポリス、IN）製、そしてRNアシンは
プロメガ（Promega）（マディソン、WI）製であった。
酵素は全て製造者の指示にしたがって用いた。シークエ
ナーゼ（Seqeunase）変型2.0配列決定システムは、ユナ
イテッド・ステーツ・バイオケミカル（United States
Biochemical）（クリーヴランド、OH）から得られた。
ドデシルヌクレオチド三リン酸およびオリゴdT12〜18
プライマーはファーマシア・LKB・バイオテクノロジー
から、ウシ血清アルブミンはベーリンガー・マンハイム
・バイオケミカルズから、そして再蒸溜フェノールはBR
L/ギブコからであった。
プラスミドベクターブルースクリプトはストラタジー
ンから購入したが、適格な大腸菌菌株DH5−α（マクス
・エフィシェンシー（Max Efficiency））はBRL/キブコ
製であった。
組織培養培地および補足物はBRL/キブコ製であり、ウ
シ胎児血清はハイクローン・ラボラトリーズ・インコー
ポレーテッド（Hyclone Laboratories,Inc.）（ローガ
ン、UT）製であった。
細胞培養 ハイブリドーマ細胞系MP4.25D2.11を、５％CO2を含む
給湿された37℃の室中において、10％熱不活化ウシ胎児
血清、2mMグルタミンおよびペニシリン／ストレプトマ
イシン10単位/mlを補足したRPMI1640培地中で維持し
た。
単クローン性抗体25D2の単離および配列決定 ハイブリドーマ細胞系MP4.25D2.11によって状態調節
された培地を限外濾過によって10〜40倍に濃縮した後、
0.01Mリン酸ナトリウム、pH7.0、0.15M NaClと0.005％
アジ化ナトリウム中のガンマバインド（GAMMABIND）Ｇ
（登録商標）−アガロースカラムに入れた。ガンマバイ
ンドＧ−アガロースは、組換え体連鎖球菌性プロテイン
Ｇが共有結合によって固定されているビーズのアガロー
スである。次に、結合タンパク質を、水酸化アンモニウ
ムでpH3.0に調整された0.5M酢酸によって溶離した。精
製単クローン性抗体25D2を含む画分は、本質的にはレー
ムリ（Laemmli）［Nature 227:680（1970）］によって
記載されたように、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）によって決定され
た。
２種類の方法を用いて、配列決定のための精製抗体25
D2の重鎖および軽鎖を分離した。最初の方法は、半分離
用SDS−PAGEに続いてポリ二フッ化ビニル（PVDF）膜上
でのエレクトロブロッティングを用いた。簡単にいう
と、高度に精製された抗体120μｇ（800ピコモル）を、
２−メルカプトエタノールで還元後にSDS中でのスラブ
ゲル電気泳動に供した（レームリ、上記）。次に、分離
された重鎖および軽鎖を、本質的にはマツダイラ（Mats
udaira）［J.Biol.Chem.261:10035（1987）］のエレク
トロブロッティング法を用いて、イモビロン（IMMOBILO
N）（登録商標）膜（ミリポア（Millipore）、ベッドフ
ォード、MAからのPVDF膜）上に移した。重鎖および軽鎖
に対応するバンドを、クマシーブリリアントブルーで染
色後に膜から切取り且つＮ末端の配列決定用に処理し
た。
もう一つの方法は、多量の重鎖および軽鎖を溶液中に
おいて単離することを可能にした。この方法を用いて、
タンパク質1mg/mlを含む精製抗体25D2の試料6mlを、本
質的にはモアヘッド（Morehead）ら［Biochemistry 2
3:2500（1984）］によって記載されたように、0.1Mトリ
ス−HCl、1mM EDTA、pH8.0に対して４℃で透析した後、
NaSO3／Na2S2O6中での酸化的亜硫酸分解に供した。亜硫
酸分解後、抗体標品を1M酢酸に対して透析し、凍結乾燥
させ、1M酢酸中に還元して容量1.5mlとし、そして同緩
衝液で平衡させた１×30cmのセファデックス（SEPHADE
X）Ｇ−75（登録商標）カラム（ファーマシア、ピスカ
タウェイ、NJ）中においてゲル濾過を行なった。
重鎖および軽鎖に富む画分を別個にプールし、そして
別個に、1M酢酸中の1.5×100cmセファデックスＧ−75
（登録商標）カラムでゲル濾過を行なった。この工程後
の重鎖および軽鎖の純度は、分析的SDS−PAGEによって
評価された。重（４ナノモル）鎖および軽（３ナノモ
ル）鎖を含む画分を別個にプールし、そして配列決定用
に約0.1ml容量まで真空中で濃縮した。
Ｎ末端アミノ酸の配列決定はいずれも、アプライド・
バイオシステムズ（Applied Biosystems）477A型タンパ
ク質−ペプチドシークエンサーを用いて行なった。イモ
ビロン（登録商標）膜上にブロットされた単離された重
鎖および軽鎖の配列決定は、本質的にはユワン（Yuen）
ら［Biotechniques 7:74（1989）］によって記載され
たように行なった。溶液中の単離された鎖の分析は、シ
ークエンサーの製造者の指示にしたがって行なった。
オリゴヌクレオチドプライマーの設計およびクローニン
グ計画 前述のアミノ酸配列分析から得られた情報に基いて、
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法［サイキ（Saiki）ら、
Science 239:487（1988）］において用いるための縮重
オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。B1798と称
する一つの縮重プライマーは、25D2の成熟重鎖のアミノ
末端の13アミノ酸残基をコードしているヌクレオチド配
列を有していた。B1873と称するもう一つの縮重プライ
マーは、抗体の成熟軽鎖のアミノ末端の７アミノ酸残基
をコードしているヌクレオチド配列を有していた。
更に、抗体重鎖をコードしているDNAの３′非翻訳領
域中のセグメントに対応するヌクレオチド配列を有する
B1797と称する非縮重オリゴヌクレオチドプライマー
［ブルジェマン（Bruggemann）ら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 83:6075（1986）］は、抗体軽鎖をコードしてい
るDNAのκ不変部中のセグメントに対応するヌクレオチ
ド配列を有するB1868と称する非縮重オリゴヌクレオチ
ドプライマー［シェパード（Sheppard）ら、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 78:7064（1981）］と同様に設計され
た。
他の非縮重プライマーは、完全な重鎖および軽鎖をコ
ードしているcDNAのPCR増幅後に得られたヌクレオチド
配列情報を基いて、抗体25D2の重鎖および軽鎖の可変部
をコードしているcDNAの単離ておいて用いるために設計
された。
オリゴヌクレオチド合成 配列表に定義された配列を有するオリゴヌクレオチド
プライマーを、アプライド・バイオシステムズ380B型シ
ンセサイザーを用いる標準法によって合成した。
これらのプライマーの呼称は、括弧内に対応する配列
番号を伴って以下の通りである。
B1797（配列番号:5） B1798（配列番号:6） B1868（配列番号:7） B1873（配列番号:8） B1884（配列番号:9） B1902（配列番号:10） B1921（配列番号:11） B1922（配列番号:12） B1932（配列番号:13） T3（配列番号:14） T7（配列番号:15） プライマーB1798およびB1873は、クローニングを容易
にするために、５′NotI制限部位を規定するように設計
された。プライマーB1797およびB1868は、同様の理由の
ために、３′SpeI制限部位を規定するように設計され
た。
RNA単離 全細胞質RNAを、ハイブリドーマ細胞系MP4.25D2.11か
ら、10mMトリス−HCl、pH7.4、10mM NaCl、2mM MgCl2お
よび0.5％ノニデト（Nonidet）P40（フェノールのモル
当り平均９モルのエチレンオキシドを含むオクチルフェ
ノール−エチレンオキシド濃縮物）から成る溶解緩衝液
中において細胞を15分間インキュベートすることによっ
て単離した。４℃において2,000xgで５分間の遠心分離
工程後、核ペレットを捨て、上澄みを４℃において10,0
00xgで15分間再度遠心分離した。
２回目の遠心分離工程後、上澄み液を、200mM NaCl、
10mMトリス−HCl、pH7.4、20mMエチレンジアミン四酢酸
（EDTA）および２％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を
含む等量の溶液と混合した。混合物を等量のトリス緩衝
フェノール／クロロホルム（1:1）で１回、そしてクロ
ロホルムで１回抽出した。抽出後、混合物を1/20容量の
0.2M酢酸ナトリウム、pH5.5および2.5容量の無水エタノ
ールを用いて−20℃で一晩中沈殿させた。
第一鎖合成 第一鎖cDNAは、10μ１の反応容量中において全細胞質
RNAから直接的に37℃で90分間合成された。反応混合物
は、ピロ炭酸ジエチル処理された蒸留H2O中のRNAを5.6
μ１、RNアシン（40,000単位/ml）0.25μ１、5X逆転写
酵素反応緩衝液（250mMトリスHCl、pH8.3、200mM KCl、
30mM MgCl2、3mMジチオトレイトール）２μ１、ウシ血
清アルブミン（4mg/ml）0.25μｌ、10mM dNTP混合物（d
ATP、TTP、dCTP、dGTP）１μｌ、オリゴdTプライマー
（0.5mg/ml）0.4μｌおよびスーパースクリプトRNアー
ゼH-逆転写酵素（200単位/ml）0.5μｌを含んでいた。
ポリメラーゼ連鎖反応 PCR増幅は、テクネ（Techne）プログラム化可能熱サ
イクルを用いて行なった。PCR反応混合物は、第一鎖cDN
A反応混合物10μｌ、蒸留H2Oが53.5ml、10X Taqポリメ
ラーゼ反応緩衝液（50mM KCL、100mMトリス−HCl、pH8.
3、15mM MgCl2、0.1％ゼラチン）10μｌ、1.25mM dNTP
混合物（dATP、TTP、dCTP、dGTP）16μｌ、目的の各プ
ライマー（20ピコモル／μｌ）５μｌおよびサーマス・
アクアティクス（Thermus aquaticus）DNAポリメラーゼ
0.5μｌから成った。
PCR条件は、95℃で２分間の変性、37℃で２分間のプ
ライマーアニーリング、72℃で３分間のプライマー伸長
および72℃で９分間の最終伸長時間を30サイクル含ん
だ。増幅の最後に、100mM dNTP混合物１μｌおよびDNA
ポリメラーゼクレノウフラグメント（５単位／μｌ）１
μｌを、PCR反応それぞれに対して加え、そしてフィル
イン工程を室温で10分間進行させた。
PCR混合物を、臭化エチジウム0.5μg/mlを含む１％ア
ガロース／トリス−ホウ酸塩ゲル中の電気泳動に供し
た。目的のPCRフラグメントをゲルから切取り且つ電気
溶出によって精製した。
サブクローニングおよびDNA配列決定 ゲル精製されたPCRフラグメントをNotIおよびSpeIで
消化した後、50mMトリスーHCl、pH7.5、10mM MgCl2、10
mMジチオトレイトール、ウイ血清アルブミン50μg/ml、
1mM ATPおよびT4 DNAリガーゼ10単位を含む混合物中に
おいて脱リン酸化NotI/SpeI消化ブルースクリプトプラ
スミドベクターに対して15℃で16〜24時間連結させた。
適格大腸菌菌株DH5−α（マスク・エフィシェンシー）
細胞を連結反応混合物で形質転換した。
得られた形質転換細胞の診断用分析は、NotIおよびSp
eIを用いる制限消化によって、更には、最初のプライマ
ー反応において用いられるオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いるPCRによって行なわれた。目的のサブクロー
ンのインサートを、シークエンサーシステムを用いるDN
A配列決定に供した。
オリゴヌクレオチドプライマーT7、B1884、B1921およ
びB1922を用いて、重鎖の可変部をコードしているDNAを
得た。プライマーT3およびB1902およびB1932を用いて、
軽鎖の可変部をコードしているDNAを得た。
CDR決定 単クローン性抗体25D2の重鎖および軽鎖の可変部中の
CDRを、カバト（Kabat）らの上記方法および計算機結合
部位ループ分析両方によって決定した。後者の分析用
に、シビル（Sybyl）またはインパクト（IMPACT）ソフ
トウェアを用いるシリコン・グラフィクス・パーソナル
・イリス（Silicon Graphics Personal Iris）4D/25型
計算機を用いた。用いられた方法は、本質的に、セヴィ
ル（Seville）ら［Biochemistry 27:8344（1988）］の
３次元模型作成法と、チョチア（Chothia）ら［J.Mol.B
iol.196:901（1987）;Nature 342:877（1989）］の免疫
グロブリン超可変部コンホメーション分析法と、トラモ
ンタノ（Tramontano）ら［RROTEINS:Structure,Functio
n and Genetics 6:382（1989）］のタンパク質ループ
コンホメーション分析法との組合せを必要とした。
実施例IX.抗体人間化 一般的な方法および試薬 制限酵素およびDNA修飾酵素は、ニュー・イングラン
ド・バイラブス製であった。Taqポリメラーゼは、パー
キン・エルマー・シータス・インコーポレーテッド（Pe
rkin−Elmer Cetus,Inc.）から入手した。マウス抗ヒト
IgG4−Fc抗体は、カルビオケム（CalBiochem）から購入
した。ヒツジ抗ヒトIgG（Ｈ＋Ｌ）ペルオキシダーゼ結
合体およびヒトIgG4タンパク質標準は、ザ・バインディ
ング・サイト・インコーポレーテッド（The Biding Sit
e,Inc.）から入手した。ヤギ抗ラットIgGは、ジャクソ
ン・イムノ・リサーチ・ラブズ（Jackson Immuno−Rese
arch Labs）から購入した。
精製ヒトIL−４（hIL4）は、本質的には、ランデル
（Lundel）ら［J.Indust.Microbiol.5:215（1990）］に
よって記載されたように、細菌発現システムから得ら
れ、そして製造者の指示にしたがってヨードジェン（IO
DOGEN）（登録商標）（ピアス・ケミカル・カンパニー
（Pierce Chemical Co.）法によって放射性ヨウ素化さ
れた。25D2と称する精製ラット単クローン性抗体は、デ
クルイフ（DeKruyff）ら［J.Exp.Med.170:1477（198
9）］によって記載された。
ヒト成長ホルモン（hGH）標準およびヤギ抗ウサギIgG
ペリオキシダーゼ結合体は、ベーリンガー・マンハイム
・バイオケミカルズ・インコーポレーテッドから購入し
た。ウサギ抗hGHはダコ・コーポレーション（DakoCor
p.）製であり且つヒツジ抗hGHはバイオデザイン・イン
ターナショナル（Biodesign International）から入手
した。プロテイン−Ｇセファロース（登録商標）CL−4B
は、ファーマシア・インコーポレーデットから購入し
た。オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステ
ムズ（ABI）380B型DNAシンセサイザーを用いて合成し
た。
殺菌菌株、プラスミド、細胞系および組換えDNA法 プラスミドは全て、大腸菌Ｋ−12菌株MM294（ATCC336
25）中において増殖させた。ブルースクリプト（KS）お
よびブルースクライブ（Bluescribe）プラスミドはスト
ラタジーン・インコーポレーテッドから入手した。プラ
スミドpDSRS（ATCC68232）およびpSRS（ATCC68234）
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ATCC）から入手可能である。ヒトκ不変部をコードし
ているプラスミドHuCKおよびIgG4不変部をコードしてい
るプラスミドp24BRHは、ATCCから（それぞれ受託番号AT
CC59173およびATCC57413として）入手した。プラスミド
ベクターpUC19およびpSV.Sportは、BRL/ギブコ（ゲイサ
ーズバーグ、MD）製であった。
ATCCから入手したCOS7細胞（ATCC CRH1651）を、10％
FBSおよび6mMグルタミンを補足したダルベッコ修飾イー
グル培地（DMEM）／高グルコース中において増殖させ
た。CHO細胞系DXB11は、L.チェイシン博士（Dr.L.Chasi
n）（ローコロンビア大学、NY,NY）から入手し、そして
10％FBS、16mMグルタミン、0.1mM非必須アミノ酸、0.1m
Mヒポキサンチンおよび0.016mMチミジンを補足したハム
（Ham′ｓ）F12培地中においてトランスフェクション前
に増殖させた。トランスフェクトされたCHO細胞を、10
％透析FBS、18mMグルタミンおよび選択用の0.1mM非必須
アミノ酸を補足したDMEM/高グルコース中において増殖
させた。
ヒト生殖系ε転写プロモーターに対して機能的に結合
したヒト成長ホルモンリポータ遺伝子を含む組換え体ベ
クターによって安定に形質転換されたジジョア（Jijoy
e）細胞系（C12細胞と称する）おほび細胞表面上におい
て多量のヒトIL−４受容体を発現するジジョア細胞系
（CJ細胞と称する）は、シェリング・プラウ・コーポレ
ーション（Schering−Plough Corporation）のチャン・
ハジェン博士（Dr.Chung−HerJenh）から入手した。両
方の細胞系を、15％ウマ血清、５％FBS、6mMグルタミ
ン、0.1mM非必須アミノ酸、ジェネティシン（ギブコ）
0.5mg/mlを含むRPMI（ギブコ）中において増殖させた。
特に断らない限り、組換えDNA法は、アニアティスら、
上記に記載されたように行なった。PCRは、標準的な条
件下において行なわれ［サイキ（Saiki）ら、Sciece 2
30:1350（1985）］、PCRによって生成されたフラグメン
トの配列は、手動かまたは自動DNA配列決定によって確
証された。手動DNA配列決定は、シークエナーゼ（登録
商標）（ユナイテッド・ステーツ・バイオケミカル・カ
ンパニー）を用いて、製造者の指示にしたがって行なっ
た。自動DNA配列決定は、ABIによって提供されたTaqポ
リメラーゼサイクル配列決定キットを用いるABI373A型D
NAシークエンサーにおいて、製造者の提示にしたがって
行なった。プラスミドDNAは、キアジェン（Qiagen）カ
ラム（キアジェン・インコーポレーテッド）を用いて製
造者の指示にしたがって製造した。
酵素結合イムノソルベント検定法（エリザ（ELISA））
による抗体濃度の決定 抗体濃度は、IgG4特異的エリザによって決定された。
簡単にいうと、ヌンク・マキシソルブ（Nunc MAXISOR
B）（登録商標）イムノプレートに、マウス抗ヒトIgG4
−Fc単クローン性抗体を50mM重炭酸塩緩衝液、pH9.5中
に５μg/mlで用いて４℃で少なくとも４時間被覆した。
プレートをブロッキング緩衝液［ダルベッコ修飾リン酸
緩衝溶液（PBS;ギブコ−BRL）中３％ウシ血清アルブミ
ン（BSA）］中において室温で１時間ブロックした。プ
レートを洗浄緩衝液（10mMリン酸カリウム、pH7.4、0.0
5％トゥイーン−20）で洗浄後、精製抗体としてかまた
は状態調節培地として100μｌ容量の連続希釈試料をプ
レートのウェルに入れた。
典型的に、人間化抗体を含む状態調節培地を、検定前
に遠心濾過（アミコン・インコーポレーテッド）によっ
て10〜30倍に濃縮した。プレートを室温で１〜２時間イ
ンキュベートした後、試料を吸引し且つウェルを３回洗
浄した。抗ヒトIgG（Ｈ＋Ｌ）ペルオキシダーゼ結合体5
0マイクロリットルを各ウェルに加え、そしてプレート
を室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを
３回洗浄し、そして免疫複合体を検出するためにABTSペ
ルオキシダーゼ基質（ベーリンガー・マンハイム・バイ
オケミカルズ）50μｌを各ウェルに加えた。プレートを
分光光度分析によって405nmで読取った。
トランスフェクション 以下に記載の組換え体抗体それぞれに関して、重鎖お
よび軽鎖双方のプラスミド５μｇを、ハイオラド・ジー
ン・パルサー（Biorad Gene Pulser）を用いるエレクト
ロポレーションによって全容量250μｌ中において５×1
06個のCOS7細胞中にトランスフェクトした。４時間後、
培地（DMEMおよび10％FBS）を、血清を除いたDMEMに取
替えた。細胞を72時間増殖させた後、培地を採取し、遠
心分離によって透明にし、そして引き続き抗体精製する
ために−20℃で貯蔵した。多量の人間化抗体を得るため
に、h25D2−１またはh25D2−４と称する抗体を産生する
組換え体CHO細胞計を樹立した。
安定なCHO細胞系を単離するために、適当な重鎖およ
び軽鎖プラスミドDNA［（dhfr遺伝子を含む）重鎖プラ
スミド：軽鎖プラスミドのモル比10:1］20μｇを、リン
酸カルシウム沈降法［グラハム（Graham）ら、Virology
52:456（1973）］によって５×106個CHODXB11細胞中
にトランスフェクトした。２日後、ヒポキサンチンおよ
びチミジン飢餓に対する耐性、すなわち、dhfr発現に関
して細胞を選択した［シムケ（Schimke）ら、Methods i
n Enzymology 151:85（1987）］。
抗体を分泌するクローンをエリザによって識別し、増
加させ、そしてメトトレキセート媒介遺伝子増幅を行な
った。最大量の抗体を分泌するクローンをローラーボト
ル中に増加させ、そして血清不含培地を連続的に採取し
た。合流したローラーボトル培養物を血清含培地中にお
いて48時間増殖させた後、細胞をダルベッコ修飾PBSで
洗浄し、そして培地を血清不含標品に取替えた。引き続
き抗体精製するために血清不含培地を３〜４日後に採取
した。
抗体精製 抗体を含む血清不含状態調節培地を、連鎖球菌性プロ
テインＧ−セファロース（登録商標）CL−4B（ファーマ
シア）のMabトラップ（TRAP）（登録商標）カラムに通
過させ、そして製造者の指示にしたがって抗体を溶離し
た。最終抗体濃度を上記のエリザによって決定した。
親和性測定 A.親和定数 人間化抗体がヒトIL−４を結合することができるかど
うかを決定するために、イムノプレートをマウス抗ヒト
IgG4−Fc（捕捉抗体）で被覆し、そしてエリザ検定に関
して前記に記載したようにプレートをブロッキングする
ことによって見掛の解離定数を決定した。ウェルを洗浄
後、人間化抗体の１種類（100μl/ウェル）を含む濃厚
状態調節培地と一緒にプレートを室温で２時間インキュ
ベートした。野生型ラット抗体25D2を、比較のために平
行して抗ラットIgGを捕捉抗体として用いて検定した。
ウェルを洗浄し且つ最終容量100μｌ中において4,000
〜2pM濃度の125I−hIL−４と一緒にインキュベートし
た。検定はいずれも三重反復試験で行ない、そしてバッ
クグラウンド結合は、対照ウェル中において1000培モル
過剰の非標識hIL4を用いることによって決定された。室
温で２時間インキュベーション後、ウェルを洗浄し、タ
ンパク質を可溶化緩衝液［0.1N NaOH/1％ドデシル硫酸
ナトリウム（SDS）］75μｌ中に可溶化し、そして溶液
をLKBガンマカウンターで計数した。結合および遊離hIL
4の濃度を決定し、そしてスキャッチャードプロット分
析によって抗体の親和性を決定した［ベルツォフスキー
（Berzofsky）ら、Fundamental Immunology,1984,ポー
ル（Paul）E.E.監修、ラヴェン・プレス（Reven Pres
s）、ニューヨーク、ニューヨーク、595〜644頁］。
B.競合的結合分析 野生型ラット抗体25D2および人間化抗体による抗原結
合の比較を、いずれも精製された非標識抗体25D2、人間
化抗体h25D2−１または人間化抗体h25D2−４の存在下に
おいて、抗体25D2で被覆されたプレートに対する標識ヒ
トIL−４（125I−hIL−４）の結合が測定されたプレー
ト結合競合検定を用いて行なった。
イムノソルブプレートを、PBS（100μl/ウェル）中で
希釈されたラット25D2抗体の溶液60ng/mlを用いて４℃
で少なくとも16時間被覆した。次に、ウェルをブロッキ
ング緩衝液（PBS中３％BSA）を用いて室温で４時間ブロ
ックした。２倍連続希釈された競合抗体50マイクロリッ
トルおよび適当量の125I−hIL−４（全容量50μｌ）を
各ウェルに加え、そしてプレートを室温で16〜24時間イ
ンキュベートした。プレートを、リン酸カリウム、pH7.
4および0.05％トゥイーン20で３回洗浄した。ウェルを
吸引乾燥させ、そして可溶化緩衝液（0.1N NaOH/1％SD
S）75μｌを各ウェルに加え且つ室温で30分間インキュ
ベートした。溶液を各ウェルから取出し且つLKBガンマ
カウンターで計数した。
受容体結合の阻害 人間化抗体を、微量滴定プレート中においてジジョア
CJ細胞で発現された組換え体ヒトIL−４受容体に対する
放射性標識されたhIL−４の結合を阻害する能力に関し
て検定した。簡単にいうと、人間化抗体を、細胞増殖培
地中においてタンパク質濃度8.6nM〜4pMで連続希釈し
た。ラット抗体25D2を同様に希釈し且つ陽性対照として
用いた。次に、ジジョアCJ細胞（細胞105個）および44p
M 125I−hIL−４を各ウェルに加え（最終容量200μl/ウ
ェル）、プレートを４℃で２時間インキュベートした。
インキュベーション後、ウェルの内容物を混合し、18
5μｌを取出し、そしてスクロースクッション（増殖培
地および0.02％アジ化ナトリウム中５％スクロース150
μｌ）上に重層した。遠心分離（1500rpm、４℃、10分
間）後、試験管を液体窒素中において急速冷凍し、そし
て細胞ペレットが入っている試験管底部を削り取り且つ
ガンマカウンターで計数した。結合cpmを抗体濃度に対
してプロットし、そして受容体結合の50％阻害を引起こ
すのに必要な濃度（IC50）で人間化抗体を天然抗体と比
較した。
生殖系イプシロンプロモーター受容体遺伝子検定 ジジョアC12細胞を、培地中の細胞密度４×105個/125
μl/ウェルで96ウェル皿中に播種した。連続希釈された
試験抗体およびhIL−４の1ng/mLを細胞に加え、そして
プレートを37℃で約64時間インキュベートした。インキ
ュベーション後、状態調節培地100μｌを各ウェルから
取出し、そして炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.5中におい
て1:2000希釈のヤギ抗ヒト成長ホルモン（αhGH）で予
め被覆されたイムノプレートの個々のウェルに対して加
えた。プレートを室温で２時間インキュベートし、そし
て0.05％トゥイーン−20含有10mMリン酸カリウム緩衝液
で５回洗浄した。（1:1000希釈の）ウサギahGHの100マ
イクロリットルを各ウェルに加え、そしてインキュベー
ションを１時間続けた。
ウェルを上記のように再度洗浄し、そして（1:10,000
希釈の）西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ
IgG100μｌを各ウェルに加えた。洗浄後、免疫複合体の
検出のために、ABTSペルオキシダーゼ基質50μｌをウェ
ルに加えた。プレートを分光光度分析によって405nmで
読取った。
405nmでの光学濃度（O.D.）を抗体濃度に対してプロ
ットし、そして生殖系εプロモーター制御下においてヒ
ト成長ホルモンの発現の50％阻害を引起こすのに必要な
濃度（IC50）で人間化抗体を比較した。
人間化抗体 相同模型作成 上記の方法を用いて、抗体LAYが最適ヒトフレームワ
ーク候補であることが確認された。LAY重鎖および軽鎖
対を最初に追跡した。
フレームワーク配列中に移植しうる可能な最小および
最大25D2残基のリストは、上記方法により、表３に示さ
れた通りであることが確認された。
下記に記載の特異的構築物は、前述の表による以下の
残基を含む。
人間化25D2の構築 軽鎖発現ベクター （５′〜３′までの）15個の５′非コーディング塩基
と、開始メチオニン残基、リーダー配列および抗体の可
変部をコードしている塩基とを含む人間化25D2軽鎖（h2
5D2L）の最初の変異型に関するDNAのヌクレオチド配列
は、該リーダーおよび該抗体の対応するアミノ酸配列と
一緒に、配列表において配列番号:16として定義され
る。
この人間化軽鎖の構築において、サイレント制限エン
ドヌクレアーゼ切断部位は、ジェネティクス・コンピュ
ーター・グループ（Genetics Computer Group）（GCG;
マディソン、WI）サイレント・マップ（SLENT MAP）
（登録商標）プログラムから推定された。タンパク質配
列をコードするように選択されたヌクレオチド配列は、
ラット25D2配列中で見出されたコドンを利用したが、い
くつかのコドンは、制限エンドヌクレアーゼ切断部位に
生成するように変更された。
抗体の可変部全部を、オリゴヌクレオチド対として合
成された３個の隣接するDNAフラグメントとしてクロー
ン化した。これらのオリゴヌクレオチド対をPCRによっ
て増幅させ、そして独特の制限エンドヌクレアーゼ切断
部位に結合した。結果は、EcoRI/KpnI（フラグメント
１）、KpnI/PstI（フラグメント２）およびPstI/MscI
（フラグメント３）部位によって輪郭が描かれる（５′
〜３′まで番号を付けた）３種類のフラグメントであっ
た。増幅反応において、各対の二つのオリゴヌクレオチ
ドは、18〜24ヌクレオチドの伸長にわたって互いに相補
的であった。したがって、それぞれのオリゴヌクレオチ
ドはもう一方の鋳型としても役立った。
これらのオリゴヌクレオチドプライマーの呼称は、括
弧内に対応する配列番号を伴って以下の通りであった。
2481（配列番号:17） 2482（配列番号:18） 2700（配列番号:19） 2641（配列番号:20） 2483（配列番号:21） 2491（配列番号:22） 2662（配列番号:23） 2661（配列番号:24） フラグメント１の合成は、２回のPCR増幅を必要とし
た。プライマー2481および2482を用いる最初のPCRは、
翻訳開始配列およびリーダーペプチドコーディング配列
を欠いてるフラグメントを生じた。このフラグメント
を、プライマー2700および2641を用いて再度増幅させ
て、翻訳開始およびリーダーペプチドコーディング配列
を伴ったEcoRI部位に加えた。したがって、最終フラグ
メント１は、その５′末端にのところに、EcoRI部位に
続いて翻訳開始配列［コダック（Kodak）、Nucleic Aci
ds ReS.12:857（1984）］および抗キャンパス（CAMPAT
H）−１抗体［ライヒマン（Reichmann）ラ、Nature 33
2:323（1988）］に対応するリーダーペプチドをコード
している配列を含んだ。
フラグメント１配列は、KpnI部位によって伸長し且つ
人間化軽鎖の可変部のアミノ酸残基１〜36をコードし
た。フラグメント２は、５′および３′末端のそれぞれ
KpnIおよびPstI部位を含む、人間化軽鎖の残基36〜79を
コードした。フラグメント１および２を独特のKpnI部位
において結合させ、そしてベクター中のEcoRIおよびPst
I部位間のブルースクリプト（KS）ベクター中にサブク
ローン化してフラグメント１−２を生成した。フラグメ
ント３は、可変ドメインの残りのアミノ酸（残基78〜10
6）をコードし且つ（可変ドメインの３′末端の22塩基
上流に位置する）MscI部位によってPstI部位から伸長
し、そして３′末端にEcoRI部位を含んだ。
フラグメント３を、ベクター中のPstIおよびEcoRI部
位間のブルースクリプト（KS）ベクター中にサブクロー
ン化した。ヒトκ不変部全部に関するコーディング配列
に対して結合した、MscI部位を含む人間化可変部の３′
末端にある22ヌクレオチドを有する321bpグラグメント
は、鋳型としてのHuCKプラスミドと、配列がそれぞれ配
列番号25および配列番号26として定義されているプライ
マー2856および2857とを用いるPCRによって生じた。フ
ラグメント４の５′末端のMscI部位の他に、クローニン
グを容易にするようにEcoRI部位が３′末端に含まれ
た。
フラグメント４を、可変部中の共通MscI部位と、フラ
グメント４の３′末端およびベクター上に存在するEcoR
I部位との間のフラグメント３に対して結合した。EcoRV
部位は、ベクター中のフラグメント３−４の下流に存在
した。フラグメント３−４をPstI/EcoRVフラグメントと
して除去し、そして可変部中の共通PstI部位と、ベクタ
ー中のブラント末端SmaI部位との間のフラグメント１−
２に対して連結した。h25D2L軽鎖の完全なコーディング
領域は、ブルースクリプトベクター中のコーディング領
域に隣接したSalIおよびBamHI部位での切断後に得るこ
とができた。
哺乳動物発現ベクターは、３′末端にh25D2L配列を有
するブルースクリプトベクターをBamHIによって最初に
切断した後、平滑末端を残す条件下において切断生成物
をクレノウフラグメントDNAポリメラーゼで処理するこ
とによって構築された。次に、h25D2L DNAフラグメント
を、SalIによる５′末端での切断後に得た。最後に、h2
5D2Lコーディング領域を、SalIおよびSmaIによって予め
消化されたベクターpDSRSに対して連結した。pSDh25Lと
称する完成されたベクターは、シグナルペプチドを含む
人間化25D2抗体に関する全コーディング領域およびヒト
κ不変部を含んだ。
前述のh25D2L DNAと重鎖DNA（h25d2h−１と称する；
以下に記載されたように製造された）とのCOS7細胞中へ
の共トランスフェクションは、測定しうる抗体発現を生
じなかったが、h25D2L DNAを無関係の抗体からの人間化
重鎖のDNAと共にトランスフェクトした場合に抗体発現
が観察された（データは示されていない）。
h25D2L軽鎖は無関係の重鎖によって発現されることが
できたので、人間化25D2軽鎖かまたは人間化重鎖の配列
がh25D2抗体発現を阻害したと考えられた。
25D2分子模型のFv界面の実験は、ヒトLAY残基ロイシ
ン46およびチロシン49の、動物残基フェニルアラニン46
およびフェニルアラニン49による置換が、重鎖と結合す
るh25D2Lの能力に影響を与えることがあることを示唆し
た。更に、スイス・プロット（Swiss−Prot）タンパク
質データベース（バイロッチ（Bairoch）、アモス（Amo
s））におけるヒトκ鎖可変部配列の比較は、46位アミ
ノ酸のロシインおよび49位アミノ酸のチロシンが高度に
保存されたことを示した。したがって、前述の人間化軽
鎖遺伝子は、これらの位置で突然変異を導くように再構
築された。更に、h25D2L DNAにおいて抜けていた107位
のアルギニン残基を置換した。
h25D2L DNAを修飾するために、２対のオリゴヌクレオ
チドプライマーを合成して、h25D2Lコーディング領域の
PCRに基く突然変異誘発を行なった。５′プライマーと
して用いられたプライマー3016（配列番号:28）は、軽
鎖可変ドメインのアミノ酸残基38〜51のコーディング領
域を包含し且つ５′末端にStuI部位を含んでいた。更
に、プライマー3016は、３種類のヌクレオチド変更をh2
5D2L配列中に組入れた。この結果、アミノ酸配列の46位
のフェニルアライン残基とロイシン残基との置換（F46
L）並びに49位のフェニルアラニン残基と49位のチロシ
ンコドンとの置換（F49Y）が生じた。3017（配列番号:2
9）と称する３′プライマーは、237位にPstI部位を包含
した。
126bpフラグメントは、オリゴヌクレオチドプライマ
ー3016および3017並びに鋳型DNAとしてのh25D2Lブルー
スクリプトプラスミドを用いるPCRによって生成され
た。StuI/PstI PCRフラグメントを用いて、ベクターh25
D2L中の対応するフラグメントを置換し、それによってF
46L、F49Y変更を組入れた。
MscI部位を５′末端に含む軽鎖可変部のアミノ酸残基
95〜106と、ヒトκ不変部の最初の３残基とを包含した3
018（５′プライマーとして用いられた；配列番号:30）
と称するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。更
に、アルギニンのコドン（R107）を、プライマー中の可
変部および不変部の結合部に挿入した。3019（配列番
号:31）と称するもう一つのプライマーを、３′プライ
マーとして役立つように合成した。このプライマーは、
BamHIおよびSpeI部位をブルースクリプトベクター中の
配列に対応した。
プライマー3018および3019並びに鋳型としてのh25D2L
ブルースクリプトプラスミドを用いて、可変ドメインの
残基95〜107およびヒトκ鎖の完全なコーディング領域
を含んだフラグメントをPCRによって生成した。このMsc
I/SpeI PCRフラグメントを用いて、上記のF46L、F49Yベ
クター中の対応するフラグメントを置換した。PCRフラ
グメントのDNA配列を確証した後、ベクターをSpeIで消
化し且つ平滑末端付き末端を生じる条件下においてクレ
ノウフラグメントDNAポリメラーゼで処理した。人間化
抗体軽鎖h25D2L−１の完全なコーディング領域を含むフ
ラグメントをSalI消化後に単離し、そしてSslIおよびSm
aIで予め消化されたpDSRSベクターに対して連結させ
た。F46L、F49YおよびR107を含む得られたh25D2L−１発
現ベクターを図４に図示する。
（５′〜３′までの）15個の５′非コーディング塩基
と、開始メチオニン残基、リーダー配列および抗体の可
変部をコードしている塩基とを含む人間化25D2軽鎖の修
飾された変異型に関するDNAのヌクレオチド配列は、該
リーダーおよび該抗体の対応するアミノ酸配列と一緒
に、配列表において配列番号:27として定義される。
人間化25D2の構築 重鎖発現ベクター （５′〜３′までの）15個の５′非コーディング塩基
と、開始メチオニン残基、リーダー配列および抗体の可
変部をコードしている塩基とを含む人間化25D2重鎖の最
初の変異型に関するDNAのヌクレオチド配列は、該リー
ダーおよび該抗体の対応するアミノ酸配列と一緒に、配
列表において配列番号:32として定義される。シグナル
ペプチドを含む、タンパク質配列をコードするように選
択されたヌクレオチド配列は、ラット25D2配列中で見出
されたコドンを利用したが、いくつかのコンドは、制限
エンドヌクレアーゼ切断部位を生成するように変更され
た。
可変部全部を、オリゴヌクレオチド対として合成され
た３種類の隣接するDNAフラグメントとしてクローン化
した。これらのオリゴヌクレオチド対をPCRによって増
幅させ、そして独特の制限エンドヌクレアーゼ切断部位
に結合した。結果は、SalI/SmaI（フラグメント１）、S
maI/PatI（フラグメント２）およびPstI/ApaI（フラグ
メント３）部位によって輪郭が描かれる（５′〜３′ま
での番号を付けた）３種類のフラグメントであった。増
幅反応において、各対の二つのオリゴヌクレオチドは、
18〜24ヌクレオチドの伸長にわたって互いに相補的であ
った。したがって、それぞれのオリゴヌクレオチドはも
う一方の鋳型としても役立った。
これらのオリゴヌクレオチドプライマーの呼称および
それらの配列を定義する対応する配列番号は以下の通り
であった。
オリゴヌクレオチド 配列番号 2588 33 2589 34 2232 35 2445 36 2446 37 2447 38 2523 39 2580 40 2642 41 2646 42 フラグメント１の合成は、２回のPCR増幅を必要とし
た。プライマー2588および2599の最初のPCR生成物を、
オリゴヌクレオチド2232および2445による２回目の増幅
に供して、フラグメント１を生成した。したがって、最
終フラグメント１は、その５′末端にのところに、SalI
部位に続いて翻訳開始配列（コダック、上記）および抗
キャンパス−１抗体（ライヒマン、上記）に対応するリ
ーダーペプチドをコードしている配列を含んだ。フラグ
メント１配列は、SmaI部位によって伸長し且つ人間化重
鎖の可変部のアミノ酸残基１〜42のコーディング配列を
含んだ。
フラグメント２は、５′および３′末端のそれぞれSm
aIおよびPstI部位を含む人間化重鎖の残基42〜82をコー
ドした。フラグメント１および２を独特のSmaI部位にお
いて結合させ、そしてベクター中のSalIおよびPstI部位
間のブルースクリプト（KS）ベクター中にサブクローン
化してプラスミドpBS1−２を生成した。
フラグメント３は、可変ドメインの残りのアミノ酸
（残基81〜121）をコードし且つ可変部の３′末端によ
っておよびヒトIgG4不変部のコーディング配列の30個の
ヌクレオチドによってPstI部位から伸長した。独特のAp
aI部位は、フラグメント３におけるIgG4不変配列の16個
のヌクレオチド中に位置した。フラグメント３の合成
も、２回の増幅反応を必要とした。プライマー2523およ
び2580の最初のPCR生成物を、プライマー2642および264
6による２回目の増幅に供して、フラグメント３を生成
した。
最初の重鎖発現ベクターを製造するために、プラスミ
ドp24BRHをApaIおよびSacIによって切断し、そしてIgG4
ゲノムDNAを有するApaI/SacIフラグメントを単離した。
フラグメント３を、プラスミドp24BRHから単離されたフ
ラグメント上の共通ApaI部位に対して連結させた。次
に、得られた（完全なIgG4不変部をコードしているIgG4
DNAに対して結合したh25D2H−１可変部の残基81〜121
を包含する）PstI/SacIフラグメントを、PstIおよびSac
Iによって予め切断されたブルースクライブプラスミド
に対して連結して、pAS6と称するプラスミドを生じた。
次に、IgG4ゲノムDNAをcDNAと置換した。最初に、pS
V.SportベクターのPstIおよびNotI部位間の挿入されたI
gG4 cDNAを含むプラスミドを、cDNAの上流のベクター中
のPstI部位でおよびIgG4 cDNA中のBstEII部位で切断し
た。このプラスミドは以下のように構築された。
無関係の人間化抗体の完全な重鎖可変部（VH）に対応
するオリゴヌクレオチドプライマーは、標準法によって
合成された。これらのオリゴヌクレオチドの呼称および
それらの配列を定義する対応する配列番号は下記の通り
であった。
オリゴヌクレオチド 配列番号 B2474CC 43 B2419CC 44 B2420CC 45 B2475CC 46 B2477CC 47 B2479CC 48 対のオリゴヌクレオチドB2474CCおよびB2419CCと、B2
420CCおよびB2475CCと、B2477CCおよびB2479CCとを、熱
変性させ、アニールし、そしてTaqポリメラーゼまたはp
fu（ストラタジーン、ラホヤ、CA）と一緒にインキュベ
ートした。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）において、各
対の二つのオリゴヌクレチオドは、約24〜30個のヌクレ
オチドによって互いに相補的であった。したがって、そ
れぞれのオリゴヌクレオチドはもう一方の鋳型として役
立った。
PCRは、18サイクル実施した後、VH1、VH2およびVH3と
称する３種類のVHの逐次的セグメントに対応する３種類
の得られたDNAフラグメントを、アガロースゲル中で電
気泳動させ且つ電気溶出によって精製した。
３種類のVH DNAフラグメントの相対順序、クローニン
グのための制限部位および用いられたクローニングベク
ターpSV.Sportのマルチクローニング部位地図は下記の
通りであった。
フラグメントVH1を酵素EcoRIおよびSpeIで制限し且つ
ベクターpSV.Sport中にクローン化した。次に、フラグ
メントVH2を、SpeIおよびXbaI部位での方向性挿入によ
ってpSV.Sport中のVH1に対して結合した。フラグメント
VH3を、EcoRI/XbaI−SalI/ApaI/SstIフラグメントとし
てpSV.Sport中に別個にクローン化した。３種類のフラ
グメントをDNA配列決定によって実証した。
無関係の抗体の完全長さのVHcDNAは、下記に更に十分
に記載されるように、VH3をγ4 H鎖不変部（CH）のゲノ
ムのDNAに対して結合した後、VH3−CHフラグメントをVH
1−VH2フラグメントに対して結合することによって組み
立てられた。
重鎖の合成および分泌を促進するために、リーダーペ
プチドのコーディング配列をDNA中に挿入した。このリ
ーダーのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、抗キャン
パス−１抗体（ライヒマンら、上記）のリーダーのもの
であった。
完全長さの抗体Ｈ鎖をコードしているDNAを構築する
ために、ApaI制限切断および連結を用いて、VH合成cDNA
をヒトγ４不変部ゲノムDNA（ATCC57413）と結合させ
た。この手順は、VH3を含むプラスミドpSV.SportをNotI
で消化した後、クレノウDNAポリメラーゼ（ベーリンガ
ー・マンハイム）で処理してブラント末端を生じること
によって開始された。得られたDNAをエタノール沈殿さ
せ、再懸濁させ、そしてApaIで消化した。この制限プラ
スミドDNAを、ゲノムγ４不変部のApaI/SjaI制限フラグ
メントと連結した。
次に、VH3−CHゲノムDNAをXbaI/HindIIIフラグメント
として切取り且つVH1−VH2を既に含んでいるpSV.Sport
中に挿入し、それによって完全長さの重鎖DNAの組み立
てを完了した。
次の操作において、ヒトγ４不変部cDNAをゲノムDNA
に置換えるように設計し且つ構築した。これは、標準法
によって合成された６種類のオリゴヌクレオチドPCRプ
ライマーを用いて達成された。これらのオリゴヌクレオ
チドの呼称およびそれらの配列を定義する対応する配列
番号は以下の通りであった。
オリゴヌクレオチド 配列番号 B2491CC 49 B2498CC 50 B2499CC 51 B2597CC 52 B2598CC 53 B2656CC 54 プライマーB2491CC、B2499CCおよびB2598CCは、γ４
不変部cDNAのプラス鎖に対応した。プライマーB2498C
C、B2597CCおよびB2656CCはマイナス鎖に対応した。ヒ
トγ４ゲノムDNAを鋳型として用いて、完全なγ４不変
部コーディングcDNAを包含する３種類の逐次的二本鎖DN
AフラグメントをPCRによって生成した。
３種類のCH DNAセグメント、クローニングのための制
限部位および用いられたプライマーは以下の通りであっ
た。
セグメントＡを、SalI/EcoRI制限フラグメントとして
pUC19中にクローン化した。セグメントＣをSalI/XhoI−
NotI制限フラグメントとしてpSV.Sport中にクローン化
した。EcoRI−XhoI/SalIフラグメントとしてセグメント
Ｂを、既にセグメントＣを含んでいるpSV.Sport中にク
ローン化した。３種類全部のセグメントをDNA配列決定
によって実証した。
γ4 cDNAは、セグメントＡをPstIおよびEcoRIによっ
て切取り且つこのフラグメントを、既にセグメントＢお
よびＣを含んでいるpSV.Sport中にクローン化すること
によって組み立てられた。ヒトγ4 CH cDNAの制限地図
およびpSV.Sportマルチクローニング部位におけるその
相対位置は下記の通りである。
γ4 CH cDNAをSalI・・・HindIIIフラグメントとして
切取り、前記の完全長さのＨ鎖構築物中のゲノムγ４フ
ラグメントに置換えた。最終生成物は、前記のように切
断されたpSVSPORT−１ベクターであった。
次に、プラスミドpAS6をPstIによって直線状にし、そ
してIgG4配列の範囲内でBstEIIによって部分的に消化し
た。PstI部位（アミノ酸残基81〜121）およびIgG4 cDNA
からBstEII部位（残基122〜191））までの可変部のコー
ディング配列のセグメントを含むフラグメントを単離
し、そしてIgG4 cDNAを含むpSV.Sport中のPstIおよびBs
tEII部位間にサブクローン化した。pAS7と称する構築物
は、５′PstI部位および３′XbaI部位に隣接した完全な
IgG4 cDNAに対して結合した可変部の残基81〜12を包含
した。
プラスミドpAS7をPstIおよびXbaIによって切断し、そ
して（可変部およびIgG4不変部 cDNAの残基81〜121を含
む）フラグメントを、（フラグメント１−２を含む）ベ
クターpBS1−２中のPstIおよびXbaI部位間にサブクロー
ン化した。次に、pDA5と称するこのベクターをSacIによ
って直線状にし、そして平滑末端を残す条件下において
T4 DNAポリメラーゼで処理した。h25D2H−１重鎖の完全
なコーディング領域をSalI消化後に単離し、そしてSalI
およびSmaIによって予め切断されたベクターpSRSに対し
て連結した。pSh25D2H−１と称する最終プラスミドを図
５に図示する。
h25D2H−１重鎖の４種類の変異型（h25D2−２〜h25D2
−５と称する）を構築した。４種類の変異型中に組込ま
れたアミノ酸変化を図６に示しており、そこにおいてア
ミノ酸残基は標準的な一文字略語を用いて示され、そし
て抗体25D2のCDR1、２および３の範囲の配列並びに変異
型は、抗体LAYの配列と並べられている。示されていな
い残基は、抗体LAY中の対応する位置のものであった。
更に別の重鎖変異型はいずれも、プラスミドpDA5から
のDNA制限エンドヌクレアーゼフラグメントを、望まし
い突然変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチドカセットに
置換えることによって構築された。それぞれのカセット
において、タンパク質配列をコードするように選択され
たヌクレオチド配列は、若干のコドンがアミノ酸変更を
組込み且つ陽性の形質転換細胞の選択に関する独特の制
限エンドヌクレアーゼ切断を更に導入するように変更さ
れたことを除き、元の変型において用いられたコドンを
維持した。
h25D2H−２を構築するために、「サイレント」NheI部
位を有する3112（配列番号:55）および3116（配列番号:
56）と称するオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオ
チドカセットを用いて、pDA5中のBamHI/SmaI DNAフラグ
メントを置換し、新規のプラスミドをpKM21と称した。h
25D2H−３を生成するために、pKM21のDNAをNheIおよびS
maIで切断してCDR1を解放した。次に、このNheI/SmaI C
DR1 DNAフラグメントを、オリゴヌクレオチド3117（配
列番号:57）および3118（配列番号:58）を含むオリゴヌ
クレオチドカセットで置換して、h25D2H−３配列を含む
pKM23を生成した。
ベクターpKM21およびpKM23をSalIおよびSmaIで切断
し、そして変更されたCDR1配列を含むフラグメントを単
離し且つ引き続き用いて、ベクターpSh25H−１中の対応
するCDR1 DNAフラグメントを置換した。h25D2H−２およ
びh25D2H−３重鎖をコードしている得られた発現ベクタ
ーをそれぞれpSh25H−２およびpSh25H−３と称した。
h25D2H−４コーディング配列を構築するために、プラ
スミドpKM23をMscIおよびPstIによって切断して、CDR2
を包含するDNAフラグメントを解放した。同様に、プラ
スミドpKM21をMscIおよびPstIによって製造して、h25D2
H−５コーディング配列を構築した。変更されたCDR2を
包含するオリゴヌクレオチド3119（配列番号:59）およ
び3120（配列番号:60）を含むオリゴヌクレオチドカセ
ットを、両方のプラスミド中のMscIおよびPstI間に挿入
して、h25D2H−４およびh25D2H−５をそれぞれ生成し
た。
得られたプラスミドをSaCIによって消化し、そして平
滑末端を残す条件下においてT4 DNAポリメラーゼで処理
した。h25D2H−４およびh25D2H−５重鎖のコーディング
領域SalI切断後に単離し、そしてSalIおよびSmaIによっ
て予め消化されたベクターpSRS中にサブクローン化し
た。最終ベクターを、それぞれpSh25H−４およびpSh25H
−５と称した。
人間化抗体の発現および精製 人間化抗体DNA全部を、エレクトロポレーションによ
ってCOS7細胞中にトランスフェクトし、そしてトランク
フェクションの４時間後に、培地を血清不含培地に取替
えた。細胞を血清不含培地中において３日間増殖させた
後、培地を採取した。多量の人間化抗体を得るために、
h25D2−１およびh25D2−４抗体を産生した安定なCHO細
胞系を樹立した。
適当な重鎖プラスミド（それぞれpSh25H−１およびpS
h25H−４）を、pKM20軽鎖プラスミドと10:1の比率でCHO
DXB11細胞中に共トランスフェクトさせた。ヒポキサン
チンおよびチミジン飢餓に対する耐性に関して選択され
た約40クローンの内、50％を越えるものがヒトIgG4エリ
ザ検定におけるh25D2−１抗体発現に関して陽性と検査
された。
最大量の抗体h25D2−１を生産するクローンの12種類
を、メトトレキセート媒介DNA増幅に供した。これらの
クローンの内の（h25D2−１＃１、＃７、＃15、＃17、
＃18および＃21と称する）６種類を、100〜250nMメトト
レキセートの存在下の増殖に関して選択した。これらの
クローンによって発現された抗体濃度は、エリザに基い
て約200〜700ng/106個細胞／日であると推定された。ク
ローン＃17クローンをローラーボトル中の増加させて、
精製および特性決定のための多量のh25D2−１抗体を得
た。
h25D2−４プラスミドを用いてトランスフェクトされ
た約40クローンを、更に、ヒポキサンチンおよびチミジ
ン飢餓に対する耐性に関して選択した。これらのクロー
ンの約30％が、ヒトIgG4エリザ検定における抗体発現に
関して陽性と検査された。陽性クローンを5nMメトトレ
キセート存在下で増殖させた。h25D2−４クローンの内
の（クローン＃7Aと称する）１種類の抗体濃度は、IgG4
エリザによって約50〜100ng/106個細胞／日であると推
定された。このクローンをローラーボトル培養中に増加
させて、精製および特性決定のための多量のh25D2−４
抗体を製造した。
ローラーボトル培養中のCHO細胞クローンによって産
生された抗体を含む血清不含状態調節培地を上記のよう
に連続的に採取した。状態調節培地中の抗体を、プロテ
インＧ−セファロース（登録商標）クロマトグラフィー
によって部分的に精製した。SDS−PAGEの還元による抗
体の分析は、高純度（少なくとも約90％）を示した。一
連のエリザ検定による抗体の分析は、それらがヒトｋお
よびγ４不変部双方を含むことを示した。
実施例X.抗体特性決定 親和定数 人間化重鎖遺伝子の５種類の変異体全部を別個に、pK
20軽鎖ベクターを用いてCOS7細胞中に共にトランスフェ
クトさせた。血清不含状態調節培地を72時間後に採取し
且つ濃縮した。親和定数は、上記のように、表５に示さ
れた結果を用いて決定された。
表５で示したように、ヒトIL−４に対する結合に関す
る人間化抗体h25D2−１、h25D2−３およびh25D2−４の
親和性は、天然ラット25D2抗体の場合と同様であった。
抗体h25D2−２およびh25D2−５抗体の親和性は更に低か
った。
競合的結合分析 人間化抗体変異体h25D2−１およびh25D2−４を更に特
性決定するために、人間化抗体およびラット抗体25D2を
用いて競合的結合検定を前記のように実施した。結果
は、室温において、抗体h25D2−１が、125I−hIL−４に
対する結合に関して抗体25D2と競合する場合に抗体25D2
よりも有効性が３倍少なかったことを示した。抗体h25D
2−４は、同検定において抗体25D2よりも有効性が約100
倍少なかった。しかしながら、同検定を４℃で実施した
場合、人間化抗体h25D2−１は、競合検定において天然
の抗体と同程度に有効であり、そして抗体h25D2−４は
有効性が２倍少ないだけであった。
受容体結合阻害 人間化抗体h25D2−１およびh25D2−４抗体を、ジジョ
アCJ細胞系で発現された組換え体hIL−４受容体に対す
る放射性標識hIL−４の結合を阻害する能力に関して前
記のように検定した。一定濃度の放射性標識hIL−４を
用いて、受容体結合の50％阻害を引起こすのに必要とさ
れる抗体h25D2−１およびh25D2−４の濃度（IC50）は、
それぞれ0.5〜1.0および1.0〜2.0nMであると計算され
た。天然の25D2抗体のIC50は、0.5〜1.0nMであると確認
された。
生殖系イプシロンモーター活性の阻害 ジジョアC12細胞は、生殖系ε転写物プロモーターに
対して機能的に結合したヒト成長ホルモン受容体遺伝子
の多数の内在性コピーを含む。このプロモーターはIL−
４によって誘導可能である［ロスマン（Rothman）ら、
J.Exp.Med.168:2385（1988）］。
抗体h25D2−１およびびh25D2−４が、生殖系εプロモ
ーターのヒトIL−４による誘導体を阻止しうるかどうか
を決定するために、前記のジジョアC12細胞を用いて検
定を行なった。抗体h25D2−１およびびh25D2−４のIC50
値は、野生型抗体25D2観察された20〜40pMの範囲と比較
して、それぞれ約120および600pMであることが分かっ
た。
ハイブリドーマ寄託 ハイブリドーマIC1.11B4.6およびMP4.25D2.11を、そ
れぞれ1987年９月29日および1988年９月１日、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、
MD,米国（ATCC）に、それぞれ受託番号ATCC HB9550およ
びATCC HB9809として寄託した。これらの寄託は、特許
手続き上の微生物の寄託に関するATCCの承認に基いて与
えられる条件に基いて行なったものであり、それによっ
て、寄託は、米国成文法35条122および米国規制基準37
条1.14に従って米国特許商標局長に対して利用可能にさ
せるものであることおよび米国特許証の公的発行に対し
て利用可能にさせるものであることが保証され、それに
よって寄託が維持されることが必要とされる。寄託され
た菌株の入手可能性は、いかなる政府のその特許法によ
る代理権に基いて付与された権利に違反して本発明を実
施する許可として解釈されるべきではない。
本発明の多数の修正および変更は、当業者に明らかに
なるように、本発明の精神および範囲を逸脱することな
く行なうことができる。本明細書中に記載された具体的
な実施態様は、単に実施例として与えられており、本発
明は特許請求の範囲によってのみ制限されるものであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 21/08 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 レ，ハング・ブイ アメリカ合衆国ニュージャージー州 07866，ロックアウェイ，ヴァレー・ヴ ュー・ドライヴ 75 (72)発明者 ミラー，ケネス アメリカ合衆国ニュージャージー州 08820，エディソン，ヒデン・ヴァレ ー・ドライヴ 411 (72)発明者 マルゴロ，ニコラス・ジェイ アメリカ合衆国ニュージャージー州 07946，ミリントン，ローリング・ヒ ル・ドライヴ 99 (72)発明者 グエン，ハン アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02146，ブルックリン，チャペル・スト リート 20，アパートメント 105―エ イ (72)発明者 ピアス，マイケル アメリカ合衆国ワシントン州98115，シ アトル，トゥエンティサード・アヴェニ ュー・ナンバー・イースト7033 (72)発明者 ティンダル，スティーブン アメリカ合衆国ニュージャージー州 07940，マディソン，バーンズデール・ ロード 40 (72)発明者 ザヴォドニ，ポール・ジェイ アメリカ合衆国ニュージャージー州 07092，マウンテンサイド，セントラ ル・アヴェニュー 279 (56)参考文献 特表 平３−503118（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，86［24］（1989）ｐ. 10029−10033

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記の配列： （ｉ）配列番号32の残基１−121; からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプ
    チド。
  2. 【請求項２】請求項１記載のポリペプチドをコードする
    単離されたDNA。
  3. 【請求項３】請求項２記載のDNAを含む組換えベクタ
    ー。
  4. 【請求項４】請求項３記載の組換えベクターを含む宿主
    細胞。
  5. 【請求項５】請求項４記載の宿主細胞をDNAが発現する
    条件下で培養することを含む、ポリペプチドの製造方
    法。
  6. 【請求項６】ヒトインターロイキン−４に特異的に結合
    する、請求項１記載のポリペプチドを含む単鎖ポリペプ
    チド。
  7. 【請求項７】配列番号２により規定されるアミノ酸配列
    またはそのサブ配列をさらに含む、請求項６記載の単鎖
    ポリペプチド。
  8. 【請求項８】非イムノグロブリンポリペプチドをさらに
    含む、請求項６記載の単鎖ポリペプチド。
  9. 【請求項９】ヒトインターロイキン−４に特異的に結合
    し、次のいずれかのアミノ酸配列： （ｉ）配列番号27の残基１−107; （ii）配列番号32の残基１−121; を有する重鎖および／または軽鎖可変領域を含む、ヒト
    化モノクローナル抗体。
  10. 【請求項１０】ヒト化モノクローナル抗体の製造方法で
    あって、請求項９記載のヒト化モノクローナル抗体の重
    鎖および軽鎖可変領域をコードするDNAを含む組換えベ
    クターを含有する宿主細胞を、DNAが発現する条件下で
    培養することを含む方法。
  11. 【請求項１１】生理学的に許容しうるキャリヤーならび
    に： （ａ）請求項６記載の単鎖ポリペプチド：および （ｂ）請求項９記載のヒト化モノクローナル抗体； からなる群より選択されるヒトインターロイキン−４ア
    ンタゴニストを含む医薬組成物。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU691464B3 (en) * 1997-11-28 1998-05-14 Gordon, Scott A. Apparatus for supporting golf clubs
US6619475B2 (en) * 2000-06-26 2003-09-16 David Chang Golf bag with honeycomb cell structure
JP3355327B1 (ja) 2001-12-20 2002-12-09 進造 上野 アイアンのフェイス保護用具
US6877604B2 (en) * 2002-10-16 2005-04-12 Ogio International, Inc. Ergonomic golf bag top and club separator

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1849610A (en) * 1928-02-16 1932-03-15 Edmund Quincy Moses Golf bag
US2114870A (en) * 1937-06-05 1938-04-19 Calkins Harold Stuart Golf bag and accessory therefor
US2879819A (en) * 1956-04-26 1959-03-31 John S Turnbull Golf club protecting and separating devices
US2860679A (en) * 1956-09-28 1958-11-18 Louis L Kouke Rack insert for golf bags
GB917556A (en) * 1958-12-08 1963-02-06 Leonard Tupling Improvements in golf-bags
US3554255A (en) * 1968-10-30 1971-01-12 North American Forwarding Corp Adapter for golf bag
DE2220493A1 (de) * 1971-04-28 1973-02-01 Brunswick Corp Unterteileinrichtung fuer golfschlaeger
GB2068741B (en) * 1980-01-07 1983-06-08 Isabel J R Golf club bags
US4332283A (en) * 1980-08-18 1982-06-01 Ajay Enterprises, Inc. Device for supporting and protecting golf clubs
US4383563A (en) * 1981-07-28 1983-05-17 Kirchhoff Jr Christian H Golf bag
GB2130102B (en) * 1982-09-02 1986-06-25 Philip John Iline Golf bag
US5135107A (en) * 1991-12-09 1992-08-04 Ingraham Clifford R Golf bag with golf club separators

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６［２４］（１９８９）ｐ．１００２９−１００３３

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