JPH03503118A

JPH03503118A - ヒト　インターロイキン４に対するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ

Info

Publication number: JPH03503118A
Application number: JP63509356A
Authority: JP
Inventors: アフヘラムズ，ジョン・エス; クレティヤン，イザベル; リー，フランク・ディー; パース，マイケル・ケイ
Original assignee: シェリング・バイオテック・コーポレーション
Priority date: 1987-10-26
Filing date: 1988-10-21
Publication date: 1991-07-18
Anticipated expiration: 2009-12-07
Also published as: DE3886760T2; ZA887987B; CN1176391A; AU2782789A; WO1989003846A2; PT88847B; JPH0698020B2; DK169627B1; EP0314402A2; IL88145A0; DK101890A; EP0314402A3; WO1989003846A3; CN1032816A; ES2061736T3; CA1335653C; KR930008112B1; MY108526A; IE883213L; DE3886760D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト　゛インターロイキン４　に対するモノクローナル抗体および該抗体を産生ずるハイブリドーマ発明の分野本発明は一般にモノクローナル抗体およびそれに関連するハイブリドーマに関し、さらに詳しくはヒト　インターロイキン４に特異的な抗体に関するものである。

てクローン化され特徴が明らかにされた。ＩＬ−４は多機能性の高いリンホカインであり多くの異なる免疫成分に影響を与える。これはＴ細胞成長因子活性（ＴＣＧＦ）およびＢ細胞成長因子活性を有する。これはインターロイキン２（ＩＬ −２）のＴＣＧＦ活性および顆粒球−マクロファージのコロニー刺激因子（ＧＭ −Ｃ５Ｆ）のコロニー形成活性を強める。

これはＩ　ｇＧ＋およびＩｇＥを優先的に生産することを誘導し、またヒト　リンパ球クラスＩＩ　　ＤＲ抗原の発現を誘導する。これらの活性はいくつかの可能な治療の用途、たとえばＩＬ−２抗腫瘍療法のｔ；めの強化剤として、ＧＭ− Ｃ５Ｆ−刺激化された骨髄再生のＩ；めの強化剤として、またはペアリン７オサイト（ｂｓｒｅ　Ｉｙ朧ｐｂｏｃｙｔｅ）症候群を治療するための薬剤としての用途、を提案する、トウレイン（Ｔｏｉｒｘｉｎｅ）、Ｌｉａｅｅｔ、　ｐ（ｓ、　３１９−３２１（ＦＣｂｒｍｓｒ７７．１０１）；トウレイン（Ｔｏａｒｉｉａｅ）およびベトウェル（ｌｅｔｉｅｌ）ＩＩ＋＋ｍｓ＋＋ＩｍｍａｎｏｌｏＨｙ４ｏ１．Ｌｐｌｓ、　１４７−１５３　（１９Ｎ）；およびサリバンら（Ｓｗｌｌｉｖｘｍ）、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉ＋ｖｅｓｔ、、　Ｖｅｌ−７ＬＰｇｓ、７５−７！（＋９８５）。

ＩＬ−４のＩｇＥ誘導活性はアレルギー症を患う人々に重要な結果をもたらす可能性がある。ＩＬ−４に対する拮抗剤が得られるならば、グルココルチコイドステロイドの使用、（これは特に長期使用に際して多くの有害な副作用を持つ：グツドマンおよびギルマン（Ｇｏｏｄ＋ｕｎ　ｓａｄＧｉｌｌｍａａ）、Ｔｈｅ　Ｐｈｘｒｍｘｃｏｌｏｌｉｃ＊ｌ　Ｂｘｓｉｓ　ｏｒ　Ｔｂｅｒｓｐｅｎｔｉｅｓ。

６＋ｈ　Ｅｄ、（ＬｃＭｉｌｌｉｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　ｅｏｍｐｉｎｙ、　Ｎｅｗ　Ｙａｒｋ。

１９８０））に代わるひとつの可能性を与える。特に　ヒト　インターロイキン４に特異性のあるモノクローナル抗体の強力なブロッキングは、抗イデイオタイプ抗体を生産することにより拮抗剤を構成する手段を提供する、たとえば米国特許４，７３１，２３７、またはミモトープ（ｍｉ＋ａｏｔｏｐ＊）スクリーニングにより、にとえばギーセン等（Ｇｅｙｓｓｎ）。

Ｊ、Ｉｍｎｕｎｏｌ、　Ｍｅｊｈ、４ａ１．ＩＯ２，ｐｇｓ、２５９−２７４（１９ｇ７）；またはＰＣＴ特許出願　Ｎｏ　８６１０Ｑ９９１およびＷｏ　８６１０６４８？。

薬剤を用いた治療において重要な観点は、患者の血中または他の体液中濃度のレベルを予測および／またはモニターすることが可能であることである。モノクローナル抗体はこの目的に広く用いられる二Ｉことえばスプリンガ−（５ｐｒｉＢｅｒ）、　ｅｄ、、バイオサイエンスおよび医学におけるハイブリドーマ技術（ｆｌｙｂｒｉｄｏｎｕ　Ｔｓｃｂ＋＋ｏｌｏｇｙ　１Ｉｌｔｈｅ　Ｅｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　ｓｎｄ　　ＭＣｄｉｅｉＩｌｅ）　（ＰＩｅｎ＋ｕｉ　Ｐｒｅｓｓ　Ｎ、Ｙ、ｌ９ｇ５）；オヨび米国特許４．５Ｎ、００３．４，４８６，５３０および４，２５５．３２９゜ＩＬ−４のような、遺伝子工学的タンパク質の生産においては、発現したタンパク質を、形質転換した宿主細胞および／またはそのカルチャー上清から分離することが大きな問題である。しばしば分離手順には、組成物を一回もしくはそれ以上免疫吸体カラムに通さなければならない。このようなカラムの最も重要な要素は、精製したいタンパク質に特異性のあるモノクローナル抗体である。

このようなモノクローナル抗体はまた、特別な手順、たとえば”ウェスタンブロッティングで精製の達成度を測定するにも用いることができる、バーネッテＣＢ＋＋ｒｎｃｔｔｅ）。

Ａｎｘｌ、Ｂｉｏｃｂｅｍ、、Ｖｏｌ、１１２．ｐ（ｓ、１９５−２０３　（１９Ｎ）。

前述の理由によりＩＬ−４に特異的なモノクローナル抗体および／まＩ；はポリクローナル抗体の入手可用性は、現行の精製法を改良したり、血液、尿などの体液中のＩＬ−４濃度をモニタリングする手段を供給することにより、医学的および獣医学的な応用に利用できることが明らかである。

発明の概要本発明はヒトＩＬ−４の検出、精製、測定および／または阻害に有用な化合物および組成物を提供する。この化合物および組成物はヒト　ＩＬ−４に特異的なハイブリドーマ産生由来のモノクローナル抗体である。この発明の化合物および組成物はハイブリドーマそのもの、ハイブリドーマ産生モノクローナル抗体、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域ポリペプチド、およびＬ鎖が自然のジスルフィド結合でＨ鎖に結合しているものからなる半量体、Ｆ（より）ｚフラグメント、Ｆｖフラグメント等の、モノクローナル抗体の７ラグメントを含む。この発明はまた、上記の化合物及び組成物を用いて、検出、精製、及びヒｌ−ＩＬ−４の濃度を測定する方法、およびこれらの方法を実施するためのキットを含む。特に、この発明はハイブリドーマＩＣ１，１ｌＢ４．６およびＭＰ４．ｎ５Ｄ２．１＋およびそのモノクローナル抗体および誘導生産物を含む。

本発明の組成物はヒｌ−ＩＬ−４の作用剤および拮抗剤としても有用となるであろう。特に抗ＩＬ−４抗体に拮抗的なフラグメント、例えば、　ＭＰ４．２５ＤＩ１１のモノクローナル抗体はアトピー性疾患を治療するための治療剤として有用である。

本発明はまた、ハイブリドーマＩＣ１，１１Ｂ４．６およびＭＰ４．２５Ｄｌｌ＋より抽出しｌ；メツセンジャー　ＲＮ　Ａ　（ｍＲＮＡ）も含む。このようなりａＲＮＡは、ＩＣ１，１ｌＢ４．６およびＭＰ４．２ＳＤ２．ｌ＋抗体の７ラグメントを、バクテリア、酵母、ま！；はその他の宿主の中でクローニングおよび発現する際に有用である。

抗体はジスルフィド結合で一緒ｌこ繋がっているポリペプチドの集合体より成る。ふたつの主要なポリペプチド鎖はＬ鎖、Ｈ鎖と呼ばれ、抗体のすべての主要な構造上クラス（１ｓｏｊｙｐｅ）を形成する。Ｈ鎖とＬ鎖は双方とも可変領域および定常領域と呼ばれるサブ領域に、さらに分けられる。Ｈ鎖はひとつの可変領域および３つの異なる定常領域から成り、Ｌ鎖はひとつの可変領域（Ｈ鎖のものとは異なる）およびひとつの定常領域（Ｈ鎖のものとは異なる）より成る。二のＨＭおよびＬｌｌｌの可変領域は、抗体の結合特異性を担うものである。

ここで用いｆ−Ｈ鎖可変領域はひとつのポリペプチドを意味し、（１）これは＋１０から１２５のアミノ酸鎖長であり、（υこのアミノ酸配列は、本発明のモノクローナル抗体のＨ鎖に対応し、Ｈ鎖のＮ末端アミノ酸から始まる。同様にＬ鎖可変領域とはポリペプチドを意味し、（１）これは９５からＩＩ５のアミノ酸鎖長であり、（２）このアミノ酸配列は、本発明のモノクローナル抗体のＨ鎖に対応し、Ｌ鎖のＮ末端アミノ酸から始まる。

Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ）２．およびＦｖという用語は標準的な免疫学的意味で使用されている：例えば、フレイン（Ｋｌｅｉｎ）。

Ｈｈ　Ｅｄ、　（Ｂｌｓｃｋｙｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　０ｘｆｏｒｄ。

１９８６）。

ここで使用している”モノクローナル抗体”という用語はヒト　ＩＬ−４に特異的に結合することのできる免疫グロブリの均一な集合体を呼ぶ言葉である。ヒト　ＩＬ−４は、０）ヒト　ＪＬ−４にあるシングルポリペプチド鎖より成るペプチド抗原決定基、（２）ヒト　！Ｌ−４ボー４ポリペプチド配の特別な接触より成る構造的な抗原決定基　（３）翻訳後に部分的または全体的に炭水化物のような分子構造の物が、ヒト　ＩＬ−４に共有結合することよりなる翻訳後の抗原決定基等より成るひとつ以上の抗原決定基を持つ可能性があると解釈されている。本発明の抗体はひとつもしくはそれ以上のこのような決定基に対応しうる。

ここで使用している”結合組成物”とは、ふたつのポリペプチド鋼からなる組成物、即ち、（＋）機能的に会合し、ヒｌ−　　ＩＬ−４に高い親和性のある構造を帯び、且つ（２）ハイブリドーマが生産する、ヒト　ＩＬ−４に特異的なモノクローナル抗体から誘導されたペプチド鎖の組み合わせを意味する。”機能的に会合する”という言葉の意味は、さまざまな手段により、例えばＦｉｂまたはＦｖのような天然の抗体フラグメントのようなふたつのポリペプチド鎖が結合するために互いに位置することなどを含み、またはカルボキシ末端に遺伝子工学的に作成したシスティンを含むペプチドリンカ−の方法による。通常このふたつのポリペプチド鎖は、ヒト　ＩＬ−４に特異的なモノクローナル抗体のＬ鎖可変領域およびＨ鎖可変領域に相当する。

図の簡単な説明第１図はグリコジル化されていないヒトＩＬ−４をバクテリアの宿主中で発現させるためｌこ適当な発現ベクターの模式図であり；第２図はヒトＩＬ−４の最終精製段階においての、２１５ｎｍの吸収パターンを表し；第３図Ａおよび第３図Ｂはそれぞれ、”’　Ｉ　−ＣＨｏ　ＨｕｌＬ−４のＤｘｕｄｉ細胞への結合阻害を示す。

発明の詳細な説明本発明のハイプリドーマは周知の技術により生産される。通常その過程には、所望の抗体を生産するＢ−リンパ球と、不滅化したセルラインとの融合が含まれる。あるいは、抗体産生不滅化セルラインを作成するために、非融合法も可能であり、この発明の範囲に含まれる、例えば、ウィルスで誘導した形質転換：カサリ等（Ｃｓｓ＆ｌｉ）　、”８９７８球の抗原特異性で得られるヒトのモノクローン細胞およびＥＢＶによる形質転換（Ｉｌａｓｉａｍ　Ｍａｍｏｃｌｏ＋ｕｌｓ　ｆｒｏｍＡｎｉｉｇＣｎ−５ｐｅｃｉｆｉｃ　５ｓｌｃｃ目ｏｎ　ｏｆ　Ｂ　Ｉｙｍｐｂｏｃ７ｔｓｓ　５ａｄＴｒｓｎｓｆｏｒ＋＋＋１ｔｉｏｎ　　ｂｙ　　ＥＢＶ″）、５ｃＩ＝ａｃｅ、Ｖｏｌ、２３４．ｐＨ，４７＆−４７９（１９ｇ６）、不滅化したセルラインは通常、哺乳動物、特にげっし動物のミエローマ細胞、ウシ、およびヒトを起源とする形質転換された細胞である。最も頻繁には、便利さと入手のし易さから、ラットまたはマウスミエローマ細胞が使用されている。

目的の抗原を注射しｔ；哺乳動物から適切なリンパ球を得る方法はよく知られている。一般的には、ヒトを起源とした細胞を所望するのであれば、抹消血リンパ球（ＰＢＬｓ）が用いられ、ヒトではない哺乳動物種を所望するのであれば、牌臓ｍｇｓまたはリンパＷＪ細胞が用いられる。宿主だセルラインに融合させるために収穫される前に、所望の抗体を生産する細胞を作り出すようにされる。融合に関する技術についても文献等で広く知られており、一般的には細胞をポリエチレングリコールなどの融合剤と一緒に混合する操作を含む。ハイリドーマは、１（ＡＴ選択法などの標準的な方法で選択する。これらのハイブリドーマの中から、所望の抗体を分泌するものは、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどの標準的なイムノアッセイ法でそれらの培養液をアッセイして選択される。

抗体は、標準的なタンパク質精製技術、例えば、チジュセン（Ｔｉｊｓｓｅａ）エンザイムイムノアッセイの実際と理論（！’ｒｘｃｔｉｃｅ　ａｄｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｌ　Ｅ＋＋ｘｙｍｓ　Ｉ＋ｉ＋＊ｕｍｏｓｓｓ＊ｙｓ）（Ｅｌｓｅｖｉｅｔ、Ａｍｓｔｅｒｄｓｍ、１９１５）の方法を使用して培養液より回収される。上記技術を応用するＩ；めのガイダンスについては、数多くの文献を入手できる：例えば、コーラ−等（Ｋｏｈｌｅｒ）、バイブリド−技術（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｂｎｉｑｎｅｓ）（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉＩＩｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒｓｊｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８０）；チジュセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）エンザイムイムノアッセイの実際と理論（ＥＩｓ！ｖｉ＊ｒ、ＡｍｓｌＣｒｄｓｍ、１９８５）；カンプベＪしくＣａＢｂｓｌｌ）、モノクローナル抗体技術（Ｍｏ＋＋ｏｃｌｏｎｓｌ　Ａ＋＋ｔｉｂｏｄｙＴｅｃｂｎｏｌｏｇｙ）　（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａ＋＊ｓｔｅｒｄｓｍ、ｌり！４）；　ファージル（Ｈ＋＋ｒｒｅｌ＋）モノクローナルハイプリドーマの抗体二技術と応用（ＭａａａｃｌＯｎＪｌ　ｌｌｙｂｒｉｄｏｍａ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｔｓｅｂ＋＋ＩＩＬＩ＋＋ｅｓ＊＋ｄ　ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＸＣＲＣＰｒ！ｓｓ、Ｂｏｅａ　Ｒａｊｏｎ、ＦＬ、１９８２）およびその他。

抗体フラグメントの使用および作成に関しても周知である；例えば、Ｆｅｂフラグメントについては：チジュセン（Ｔｉｊｓｓｃ＋＋）、（エンザイムイムノアッセイの実際と理論）（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍ５ｔ！ｒｄａｍ、　＋９０）；およびＦｖフラグメントについては：ホフマン等（Ｈｏｃｈ＋ｍａｎ）、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋１ｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、１２゜１１ｇ５．ｌｌ３Ｇ−１１３５（＋９７３）、シャーロン等（Ｓｈａｒｏｍ）　。

Ｂｉｏｃｂｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、１５．Ｂｓ　１５９１−１９５４　（１９７６）および工−リッヒ等（Ｅｈｒｌｉｃｈ）、米国特許４，３５５，０２３．および抗体の半量体については二オーディトレーハーグリーベス（ＡｎｄｉＬｏｒｅ−Ｌｒ（ｒｅａｖ！ｓ）、米国特許４，４７０．９Ｎ。さらに本発明の化合物および組成物は、周知の技術により二重特異抗体を構築するためにも使用できる：たとえばハイブリドーマのさらに再度の融合（すなわちクワドローマ（ｑａｓｌｒｏ■ａｓ）と呼ばれているものを形成する）：リーディング（Ｒｃｓｄｉｕ）、米国特許４，４７４．４９３；または半量体の化学的再会合による；ブレンナン等（Ｉｌｒｅ＋＋ｍｓｍ）、５ｃｉｅｎｃｅ。

Ｖｏｌ、Ｂ９．ｐｌｓ、１１−Ｈ（１９１５）。

本発明のハイリドーマおよびモノクローナル抗体は、遺伝子組み替えで製造しＩ；成熟ヒトＩＬ−４のグリコジル化されたタイプもしくはグリコジル化されてないタイプのどちかに対して生産される。一般的にグリコジル化されていないタイプのヒト　ｆＬ−４はＥ、Ｃｏ１１中で生産され、グリコジル化されたタイプのものは哺乳動物の宿主細胞、例えばＣｖｌ又はサルのＣＯ５細胞、マウスＬ細胞などの中で生産される。遺伝子組み換えで生産された成熟ヒＩ−ＩＬ−４は、標準的な手順を用いて、発現ベクターを宿主細胞に導入して生産される；例えば、マニアチス等（Ｍｓ＋＋１ｉｔｉｓ）。

モレキュラークローニング：ラボラトリ−マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｕ：＾Ｌ＊ｂｏｒｘｔｏｒｙ　Ｍａ＋ｕ＋＊ｌ）　（ＣｏｌｄＳｐｒＩＩｌｔ　ｌ１ｉｒｂｏｒ　Ｌｓｂｏｒｘｔｏｒｙ、Ｎ＊ｖ　Ｙｏｒｋ、１９ｇ２）；オカヤマおよびバーブ（Ｏｋｘｙａｍｘ　ｓａｄ　Ｂｅｒｇ）、Ｍｏ１．ｃｅｌｌ、Ｂｉｏ１４ｏ１．！。

ｐｇｓ、ｌ６ｌ−１ｙｅ　（＋９ｕ）およびＶｏｌｊ、ｐｌｓ、２８Ｇ−２０（１９０）；バーマー（Ｈｉｍｅｒ）、　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｏｔｉｎｅｅｒｉｎ（、ｖｏｌ、２．ｐｔｓ、Ｂ５−１００　（＋９１０）および米国特許ｔ、ｓａｉ、３ｏｉＨカウフマン等（Ｋａｕｆｍｉｎ）、Ｍｏ　Ｉ　、Ｃｅ　ｌ　１．Ｂｉｏ　ｌ　、Ｖｏ　ｌ　、Ｌｐｔｓ、　ＨＯ４−１３１９（ＩＨＤ；等である。

一度所望タンパク質をコードするヌクレオチド配列が知られるか、まｔ；はさもなければ入手できれば、バクテリアまたは哺乳動物物の発現ベクターの構築は、文献などで周知である。例えばデポワーＣＤｅＢｅｅｒ）は、米国特許４．５１１．４８の中でバクテリアの発現ベクターに使用されるプロモーターを開示し；ゲデル等（Ｇ・ｅｄｄｅｌ）は米国特許４，６０１，９８０の中で、およびリッグス（Ｒ４ｇｒｓ）は米国特許４．４Ｈ，７３９はの中で［、（＋ｌｉの発現システムによる哺乳動物のタンパク質の生産を開示し；リッグス（上述）、フェレティ等（Ｆｒｒｒｅ＋＋ｊ）、　Ｐｒｏｅ、ＬＨ，Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｖｏｌ、Ｄ　ＩＩ！５゜５９９−［０３（１９８６）、スグロウト等（Ｓｐｒｏｉｔ）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲｔｓｅａｒｃｈ、　Ｖｏｌ、＋３．ｐ（ｓ、２９５９−Ｈ）７　（ｈａｓ）、およびムーレンバッハ等（Ｍｕｌｌｅａｂａｃｈ）、　Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｂｒｍ、４ｏ１１６１．ｐＨｓ。

７１９−７０（１９８６）、はバクテリア内での発現のためにどのように合成遺伝子を構築するかを開示している。それゆえｔ二これらの文献の向合によって本明細書に含まれている。

成熟ヒト　ＩＬ−４のアミノ酸配列はヨコタ（Ｙｏｋｏｒｘ）等（上述）によって、開示されて８りまだヨコタ（Ｙｏｋａｆｇ）等（上述）によって記載されたｐｅＤベクターが運ぶとトＩＬ−４をコードしているｃＤＮＡはｆｆ１ｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、　ＡｍｅｒｉｅａａτｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｅ４ｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されている：寄託番号６７０２９、多くのバクテリア発現ベクターおよび宿主は、市販されており、まｌ；はＡＴＣＣを通じて入手できる。好ましくは、宿主動物を免疫するヒｌ−ＩＬ−４は、すでに述べたｐｃＤベクターによって暫時にトランスフェクションされた、ｃｏｓ、ｃｗｔ　、またはマウスＬｍ胞の培養上清から単離される。本発明のハイプリドーマに特徴的な抗体および抗体７ラグメント、＠１こｉｃｌ、ＩＩＢ４．６は、メツセンジャー ■Ａの抽出、ｃＤＮ＾ライブラリーの構築、この抗体分子の部分をコードしているクローンの選択、による遺伝子工学的な手段を用いて生産することもでさる：例えばウオール等　（Ｗｓｌｌ）　、Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ’ｄ　ｆｆ１ｅｓｅ＊ｒｅｂ、ｌ’ｏ１．５　ｐｘｓ。

３＋１３−３１２３　（＋９７０：ザルスト等（Ｚｘｌｓｌ）、Ｎ＋＋ｅｌｓｉｅ　Ａｃ１ｄＲｅｓｅ＊ｒｅｂ４ｏ１．１．ｐＨｓ、　３５９１−３６０１　（１９ｇ１１）Ｈカビリー等（Ｃａｂｉｌｌｙ）、　　Ｐｒａｅ、Ｎａ口、Ａｃ１ｄ、Ｓｃｉ、４ｏ１．ｇｌ、ｐｌｓｊ２７３−３２７７　（１９Ｎ）；ポス等（Ｂｏｓｓ）、Ｎｕｃｌ！ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅｘｒｅｂ、Ｖｏｌ−１２、ｐｇｓ、’３７９１−３８０６（１９８４）アムスター等（Ａｍｓｔｅｒ）、Ｎｎｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｖｏｌ、８．ｐｇｓ、２０５５ −２０６５　（１９８０）；およびモーア等（Ｍｏａｒｅ）、米国特許４．６４２４３４゜特にこのような技術は異種間のモノクローナル抗体、その中には一種に対する結合領域がもう一種の抗体の非結合領域とつながっているものを生産するのにも利用できる；たとえばリウー等（Ｌｉａ）、　Ｐｒａｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｖｏｌ、ｇ４．ｐｌｓ１４３９−３４４３　（１９８７）。

モノクローナル抗体を精製および測定に利用することはよく知られている、例えばアクィニティクロマトグラフイー似ついては、アフィニティークロマトグラフィｍ：等（Ｓｅｃｂｅｒ）、Ｎａ（ａｒｅ、Ｖｏｌ、２ＢＳ、ｐｔｓ、４４６− ４５０　ＣＩｅ８Ｏ，および米国特許４，４２３．１４７：８ＪＣびヨーロッパ持許出Ｉｆ　０１９０７ＩＩ（＋３　Ａｕｇａｓｔ　ｌ９Ｈ６’）：８よびイムノアッセイ技術：チジュセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）（上述）；米国特許４，４ｊ６，５３０；およびバーネッテ（ＢａｒｎｅｔｔｅＸ上述）。アフイニティクロマトグラ７４−は、ヒトｒｔ−＜発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションした細胞の培養上澄のようなサンプルからＩＬ−４を抽出しヒトＩｔ−４を精製するためＩこ使用できる。このような精製過程をここでは免疫精製プロセスと呼んでいる。典型的には、これには、ヒト　ＪＬ−４に特異的なモノクローナル抗体が共有結合で結合している同相支持体（ここでは“免疫吸着体”と呼ぶ）が採用され、これはサンプルが通過するカラムまたはチャンバーに置かれる。サンプルからのヒトＩＬ−４は、この結合したモノクローナル抗体の結合部位に良く結合し、一方サンプルの残りの物質はカラムもしくはチャンバーから洗い出される。ヒト　ＩＬ−４はその後、標準的な技術、たとえば低いｐＨ、高濃度の塩、などでこの免疫吸着体から溶出される。

”ツーサイト”（Ｔｗｏ　５ｉｄｅ）または”サンドイッチ“イムノアッセイは、本発明において好んで用られるイムノアッセイである、例えば、米国特許４，４１６，５３０にて開示されている。ゆえにこの特許は参考により編入される。

このようなアッセイは、少なくとも一方の抗体がＩＣ１，１ＩＢ４．６により生産されるような本発明のモノクローナル抗体より成る抗−ＩＬ−４抗体のふたつの異なる組み合わせの使用を要する。このふｔ；つの組み合わせのうちのひとつは固相支持体の表面についている。この結合している抗体はその後ヒトＩＬ−４が含まねていると予想されるサンプルにさらされる。！Ｌ−４分子はこの固相に固定された抗体に結合する。第二抗体の組み合わせが、結合している　ＩＬ−４に添加され、そしてこの第二抗体は第一抗体の組み合わせが結合した抗原決定基とは別のひとつもしくはそれ以上の抗原決定基と結合する。このＩＬ−１はその後、第二抗体と関係する間接的または、直接的なシグナル−形成手段により検出される。例えば、第二抗体は、酵素、希土類キレータ−１または有機色素等のシグナル形成部分と直接結合させておくことができる。または、第二抗体はさらに加えた抗体を通してまたはアビジン−ビオチン化合物のような親和性の高い複合物を通してひとつもしくはそれ以上のシグナル形成部分と間接的に結合させることができる。

ＩＬ−４濃度の定量的な測定は、サンプルが形成したシグナルとヒト　ＩＬ−４を既知の濃度で含むＩＬ−４スタンダードが形成するシグナルを比較して行われる。

本発明はイムノアッセイ、特にサンドイッチアッセイに用いる試薬のキットを含む。そのようなキットは（１）固相支持体（２）モノクローナルであり、ヒト！Ｌ−４の第一の抗原決定基に結合できる第一抗体（３）ヒｌ−ＩＬ−４の第二の抗原決定基に結合できるモノクローナル抗体である群から選択される第二抗体、およびヒトＩＬ−４に特異的なポリクローナル抗体（ここではポリクローナル抗体組成物と呼ばれる）かつ（４）この３つの抗体のいずれかひとつと結合したシグナル形成手段を含む。個別の実施様態によって、キットは、３種の抗−ＩＬ− ４抗体タイプの使用について２つの選択枝を有する、すなわち第−抗原決定基に特異的なモノクローナル抗体および第二抗原決定基に特異的なモノクール抗体とポリクローナル抗体組成物との使用、または、第一もしくは第二抗原決定基に特異的な七ツクローナル抗体とポリクローナル抗体組成物である。この抗体は溶液状でも乾燥状態でもよい。この抗体の組み合わせの一つは、キットを使用する時に固相支持体の表面に添加することもできうるし、あらかじめ同相支持体につけておくことも可能である。シグナル形成手段は、ふたつの抗体のタイプのどちらかひとつにあらかじめ結合させておくか、または使用前にひとつもしくはそれ以上の成分、例えばバッファー、抗体−酵素結合体、酵素基質、と組み合わせることが必要である。多くのりイブのシグナル形成手段が入手でき、キットのひとつもしくはそれ以上の成分を構成できる。さまざまのシグナル形成手段がチジセン（Ｔｉｊｓｓｅ＋＋Ｘ上述）によって開示されている。本発明のキットは、さらに次のような試薬、例えば固相表面の非特異的吸着を減らすｔ；めのブロッキング剤、洗浄剤、酵素基質等をも含みうる。この固相表面は、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン等のタンパクＸｔ−固定化するのに適した素材でできたマイクロタイタープレート、ミクロスフェア等で形成されうる。固相表面をもつこのような物質をここでは”支持体手段”と呼ぶ。好ましくは、蛍光または有色産物の形成を触媒する酵素がこのシグナル形成手段の成分である。さらに好ましくは、この酵素は、パーオキシダーゼ、アルカリ７オスフアターゼ、およびベータガラクトシダーゼのグループの中から選択される。これらの酵素の基質および反応条件は文献にて明らかである；例えばチジセン（Ｔｉｊｓｓｅｏ）（上述）。

本発明で述べる組成物は、直接ＩＬ−４関連疾患に対する薬剤組成物としても使用できる。作用薬としての効用を持つモノクローナル抗体（または、それらの結合フラグメント）より成る薬剤組成物は、ＩＬ−４活性を強めるｊ；めに使用できる。または、拮抗薬としての効用を持つモノクローナル抗体（または、それらの結合７ラグメント）１ｉ、ＩＬ−４活性を抑制するために使用でさる。このような組成物は、本発明のモノクローナル抗体またはそれらの結合７ラグメントの少なくとも一つを、薬学的に効果的なキャリアー中に治療に有効な量で含んでいる。薬学的なキャリアーは、この発明の！ｌｌ初物患者に与える際ｇこ適当な生体適合性がある非毒性な任意のものである。滅菌水、アルコール、脂質、ワックスおよび生体に不活性な固体等がキャリアーに含まれる。薬学的に受は入れられる補助薬（バッファー試薬、分散剤）もこの薬剤組成物に組み込まれうる。一般的に、このような薬剤の非経口適用として有効な組成物は周知である；例えば、Ｒ５ｍ１Ｂｔｏｎ’　ｓＰｈａｒｍａｃｅｌｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、１５ｔｈ　Ｅｄ、（Ｎｉｃｋ　ＰｕｂｌｉｓｂｉＢＣｏｍｐａｎｙ、Ｅｘｓｊｏｎ、　ＰＡ、１９８０）。もうひとつの方法として、本発明の組成は薬剤埋没運搬システムによって患者の体に導入されうる。；たとえば、ウルクノ為ルト等（Ｕｒｑｕｂｉｒｔ）。

以下の実施例は本発明を説明するために供する。試薬の濃度、温度、その他の変更可能な値は、ベクターおよび宿主の選択と同様、本発明の例示のために示しただけであり、本発明の制限を考慮したものではない。

発現ベクターｐｃＤ−ヒト−ＩＬ−４及び宿主細胞ＣＯ５７はそれぞれアメリカン　セルカルチャー　コレクション（ＡＴＣＣ）から寄託番号６７ＯＮおよびＣＲＬ　１６５１として入手できる。このｐｃＤ−ヒトーＩＬ−４クローンは増幅され、プラスミドＤＮＡは精製され、その後にＣＯ５７に遺伝子導入するために標準的な遺伝子導入の手順が用いられた：約ｌ　Ｘ　Ｉ　Ｇ　’のＣＯ５７細胞が、ダルベツコの改良イーグル培地ＤＭＥ、　１０％胎児子牛血清、および４ｍＭＬ−グルタミンを含むＩＯｈ＋＋ｎ、組織培養プレートに接種される。接種約２４時間後、この培地はプレートから吸引除去され、細胞は無血清バッフ　ｙ　 −（５０ｍＭ　トリス）ＤＭＥで２回洗浄される。各々のプレートに４ｍｌの無血清バッファーＤＭＥ（４ｍＭのし一グルタミを含む）、８０マイクロリツトルのＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒｓｎ。

および５マイクログラムのｐｃＤ−ヒト−ＩＬ４　ＤＮＡが加えられる。この細胞はこの混合液の中で４時間、３０℃でインキュベートされ、この混合液が吸引除去され、細胞は無血清バッファーＤＭＥにて１回洗浄される。洗浄後、各々のプレートに４＋ａＭＬ−グルタミンを含む５１のＤＭＥ、１００μＭクロロキン、および２％胎児子牛血清が加えられ、細胞は３時間インキュベートされた後、無血清バッファーＤＭＥにて２回洗浄される。次に４鵬ＭＬ−グルタミンを含むＤＭＥ５１および４％胎児子牛血清を含む５１のＤＭＥが加えられ、細胞は３７ ℃で１時間インキュベートされる。その後に、細胞はＤＭＥまたはＰＢＳで１− ３回洗浄され、５１の無血清ＤＭＥ（４ｍＭのし一グルタミンを含む）が加えられて５日後に培養上清か採り入れられるまで３７℃でインキュベーＡ、精製のための生物学的活性測定実施例１．に従って生産された上清からヒトＩＬ−４を精製する過程でＩＬ−４活性を測定するためにＴ細胞成長因子（丁ＣＧＦ）活性が用いられた。ＴＣＧＦ活性のためのいくつかの標準的な活性測定法が報告されている。：たとえばデボス等（Ｄｅｖｏｓ）、Ｎ＋＋ｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄ　ｌｅｓ＠１ｒｃｌ＋４ｏ１．１１．ｐｌｓ、４３０７−４３２３　（１９ｇ３）；チーアマン等（Ｔｂ＋＋ｒｍａｎ）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、ＲｅｓｐｏｎｓｓＭｏｄｉｌｉｔｒｓ、　Ｖｏｌ、５．ｐｇｓ、８５−１０７　（＋９０）　；およびロバート−ガロ７等（Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ、第９章、ガロアＥｄ、成長および成熟因子（Ｇｒｏｖｔｂ　ａｎｄ　Ｍ＊ｔｕｒｓｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒｓ）　（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、＋９８４）。一般的にこの丁ＣＧＦ活性測定は、ＴＣＧＦ因子が末梢１９２３球またはＩＬ−２依存性Ｔ細胞ラインの増殖を促進する能力に基ずく：例えば、ギリス等（Ｇｉｌｌｉｓ）Ｊ、　Ｉｍｍｎｎｏｌ、４ｏ１．１２０　ｐ（ｓ、２０！７　（１９Ｎ）。増殖は標準的な方法、たとえばトリチウム標識されたチミジンの取り込みまたは比色定量法により測定できる：モスマン（Ｍｏｓｍａｎ＋＋）、　Ｊ、Ｉｍｍｎｎｏｌ、Ｍｅｔｂ、、Ｖｏｌ、ｆ＋Ｓ、ｐ（ｓ、５５−６３（１９８３）。ヒト　ＩＬ−４ＴＣＧＦの活性測定は、次のように行われた：健康者より得ｔ；血液をヘパリン処理した試験管に入れ、フィコールハイバック（Ｆｉｃｏｌｌ−［１ｙｐａｑｕｅ）を重層した；例えば、１５１の遠心用試験管の中に３ｍ＋１のフィコールハイバックに対して５ｍｌの血液を入れた。３０００Ｘ（，２０分遠心した後、境界層にある細胞を吸引採取し、１０％胎児子牛血清、５０μＭ２−メルカプトエタノール、２０Ｊｔ／＊ｌフイトヘマアグルチニン（ＰＨＡ）およびリコンビナントヒトＩＬ−２を含むＲＰＭＩ　１６４０組成の成長培地で希釈された。３７℃で５−１０日インキュベートした後、このＰＨＡ−刺激末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）は洗浄され、２日間の比色定量に使われた（モスマン上述）、　ＩＬ−４標準（ｐｃＤ−ヒト−Ｔ１．−４を遺伝子導入したＣＯ５７細胞由来の上溝）または被験用フラクシヨンは、上述の成長培地をもちいて、連続的に２倍希釈して９６−ウェルのトレイの中で最終容量が５０メ！／ウエルとなるようにした。５０７１１のＰＢＡ−刺激末梢リンパ球が約４−１１０’細胞／ｍｌで各ウェルに添加され、トレイは、３７℃で２日間インキュベートされた。細胞の成長はその後モスマン（上述）の方法にて測定された。

ここで用いている１ユニツトとは、１ウエル（０、１ｍ１）あたり４８時間中に２ＸＩＯ’のＰＥＡ−刺激末梢リンパ球の増殖を最大５０％刺激する因子の量である。

Ｂ、精製精製は陽イオンクロマトグラフィー、ゲル濾過、および逆相高圧液体クロマトグラフィーを連続的に使用して行った。すべての操作は４°Ｃで行った。

ＣＯ３７細胞は遠心により除去され、その上清は限外濾過によって１０倍に濃縮され、次の操作まで＝ＩＱ℃にて保存された。ＩＬ−４の力価は、このタンパク質が、フィトヘマアグルチニンで誘導されたヒト末梢血リンパ球の増殖を刺激する能力として測定して決定した、すなわち上述した標準活性測定法をもちいたＴＣＧＦ活性による。

ＴＣＧＦ活性を約１０’　−１０’ｏｎｉｊｓ／ｍｌ、タンパク質含量を１ト２Ｇｍ（／ｍｌで持つ、濃縮したＣＯ５７上清は、５０＋ｓＭ　ＨＥＰＥＳナトリウム塩、ｐＨ７゜０の溶液を２４時間中に２度交換して透析した（各交換液の容量は濃縮液の約１０−１５倍である）。

透析物は、あらかじめ５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳナトリ９ム塩、ｐＨ７，０で平衡化したＳ−セファロース（流速：０．２ｍｌ／ｓｉｎ、）のカラム（ｌｘ１５ｃｍ）に添加した。このカラムは、ＩＳカラム体積の平衡化バッファーで洗浄され、その後５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳナトリウム塩、　ｐＨ７，０溶液にＯから０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む、２０力ラム体積分の直線ＮａＣｌ塩濃度勾配で溶出した。この溶出は５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳナトリウム塩、Ｏ，ＳＭ塩化ナトナトリウムＨ７，０の５力ラム体積分の溶液をもちいてアイソクラチックに終了した。二つの別のバッチから、１．５＋ｍｌおよびｉ、ｂ＋ｌの画分が集められた。ＩＬ −４の活性は、両方のクロマトグラフィーにおいて、３００ｍＭないし５００ｍＭのＮｌＣｌで溶出された。

ＩＬ−４力価を含む２つのＳ−セファロースからの画分は各々総量として９．ｈ＋ｌおよびＩＯ，ｆｉ＋ｉｌに合わせられｔ；。双方の容量ともアミコンＶＭＳメンプラン（排除分子量：５００Ｇ）を使用して限外濾過により１．９＋ｓｌに濃縮された。この段階でのタンパク質回収量は、約８０％であった。この濃縮しｔ：ＩＬ−４溶液は、あらかじめ５０ｍＭ　ＩＩＥＰＥｓ、　０．４Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７，０で平衡化したセファデックスＧ−１００カラム（＋、］Ｘ５８ｃｍ）に添加され、このカラムは、同バッファーで、流速０．ｌＳ＋ｉｌ／分にて溶出された。全部で５０画分（１，０ｍｌ／画分）が集められ、ＩＬ−４の力価が分析された。生物学的活性のあるピークは、見かけ上の分子量２！、０００ダルトンと測定されｔ；。このセファデックスＧ−１００は、見かけ上の分子量決定のために、ウシ血清アルブミン（ａｓ、ｏｏｏダルトン）、カーボニック　アンヒドラーゼ（３０，０００ダルトン）、およびチトクロームＣ（１１，７（ｔｏダルトン）を用いて検量線を作成した。

ＩＬ−４活性を含むセファデックスＧ−１００カラムからの画分は減圧下で３− ４倍に濃縮され、Ｖｙｄａｅ　Ｃ−４ガードカラム（４，６ｘ２０ｍｍ）に注入された。０．１％（ｖ／ｖ）　）リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中でＯから７２％のアセトニトリルの直線勾配を３５℃、流速１．０ｍｌ／分および１５分間でカラムに形成した。結果として保持時間７．３．２．８．７分の３つのピークが２１４１で検出された（それぞれ第２図の　ピーク１，２．３）。ピーク２（溶出時間８．２分）の４０μｌを凍結乾燥し、１０％の胎児子牛血清を含む最小必須培地に再溶解した。この溶液はＴＣＧＦ陽性反応を示した。ピーク２の３００μｍを乾燥するため蒸発させ、０．１％（Ｗ／Ｖ）（７）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）２００４１に再溶解した。２μｍの水溶液を２００μｍの１％（Ｖ／Ｖ）ＴＦＡで希釈し再クロマトグラフィーを行った。このサンプルはＨＰＬＣではＨ５＋＋麿で単一ピークが示された。ピーク２の装置は約７ｘｌＯ”ｏｎｉ＋ｓ／Ｈの活性を示しＩ；。

ＴＲＰＣｌｌと表されるＥ、ｃｏｌｉ発現ベクターは標準的な方法、例えばマニアチス等（Ｍｓｎｉａｔｉｓ）モレキュラークローニング：ラボラトリ−マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｕ：Ａ　ｔａｂｏｒｓｔｏｒｙ　ＭｘｎｎｘｌＸＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｇ　ｌ１ｉｒｂｘｒ　Ｌ龜ｂｏｒｘｔｏｒｙ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８りで開示、で構築した。

ＴＲＰＣ目ベクターは、合成共通ＲＢＳフラグメントをす１１リンカ−（ＡＴＧＣＡＴ）につなぎ、できたフグメントを月１１で制限酵素処理したｐＭＴＩｌｂｅ（これはあらかじめＣ１１１部位を含むように修飾されている）の中にクローニングして構築した。　ｐＭＴＩｌｂｃは小さくて（２，３キロベース）高コピーであり、ｒＶＸプラスミドのＥｃｏＲ１１１１ｉｎｄｌポリリンカー領域をもつｐＢＲ３２２のＡＭＰ”、ＴＥＴ’誘導体である（マニアチス等によって記述さている、上述）。これは、　ｐＭＴＩＩｈｃをＥｃｏＲＩおして、Ｃｌａｌ部位をもつように修飾されている。

ＴＲＰＣ１１構造物からのひとつの形質転換体は、２つのｃ１！１部位ではさまれた一列に並んだＲＢＳ配列をもっていた。

このプラスミドを匡１で消化し、Ｂａｌ工３１ヌクレアーゼ旭理をし、ＥｃｏＲＩ制限処理をし、すべての４種類のデオキシヌクレオチド３リン酸の存在下で↑ （ポリメラーゼ処理をして、」１部位のひとつ、およびＲＢＳ配列の第２コピーの部分を除去した。この結果できた３Ｏ−４０ｂｐ７ラグメトは、ポリアクリルアミド電気泳動で回収し、シリエ１制限処理したｐＵｃ１２にクローニングしｔ：。次に、ｐＫｃｌｏ＋由来のＨ８ｂｐのＥ、Ｃｏ１１■已をもつ貼工にＩフラグメントにコルス等（Ｎｉｃｈｏｌｓ）により　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｒｙ＋ｎｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、ＩＯｌ　ｐｃ。

＋５５　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｆ’ｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、　　１９０）に記載）をＥｃｏＲＩ部′位にクローニングして、ＴＲＰＣｌｌの構築を完成さた。これは第１図に示されている。

７１１ＰＣＩ＋は、まず始めにＣｌ１ｌおよびｌ＊ｍＨＩで消化され、精製されて、その後にｐｅＤ−１２５（ＡＴＣＣ寄託番号６７０２９）のＥｃｏＲＶ５’ −ＣＧ　　ＡＴＧ　　ＣＡＣＡＡＧ　　ＴＧＣＧＡＴ　　−３’ＴＡＣＧＴＧ　　　ＴＴＣＡＣＧ　　　ＣＴＡを含む標準的なライゲーション溶液中で混合し、ヒトＩＬ〜４　ｃＤＮＡのためのベクターとして採月された。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＡＨｇｕはＭ準的な塩化カルシウム法をもちいて、このライゲージ３ン溶液で直接形質転換され増殖され、プレートにまかれた。ＩＬ−４ｃＤＮＡが組み込まれているコロニーは、ラベルしたオリゴヌクレオチドプローブを使用し選択した。形質転換体はＬ−培地中で培養され、ＩＬ−４は構成的に発現された。

Ｅ、ｃｏｌｉ、＾Ｉｏｎ　（Ｉｏｎ−）　　（エール大学Ｅ、ｃｏｌｉ遺伝子センター、Ｎｅｗ　Ｂｘｖｅｎ、　ＣＴより入手）を１１規模で培養し、０Ｄｓｉａ”２　（約１．６ｘｌＤ’ｃｅｊｌ／ｍりとなるまで成長させた。

細胞は、４℃、４５ＤＯＸｊにて１５分間遠心し、収穫した。沈殿は、５０ｔｎＭ　Ｎ５Ｃ１，ＩａＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、８よびＯ，ＩａＭフェニルメチルスルフェニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含ム５ｆ）ｍＮト！Ｊ　ス／＜　７７７−ＰＨ８，０，３０ｍ１７：再懸濁させた。ＥＤＴＡ８よびＰＭＳＦは、精製前ｌこヒトＩＬ−４を分解するかもしれないグロテアーゼ活性を阻害するために加えた。次ｌ：細胞は、超音波処理Ｃ７０ワットで５０パルス（５０％））され、２５．ＤＯＯＪ、　１５分間、４℃で遠心されノ；。この沈殿の主要タンパク質成分は、電気泳動的に分離した沈殿物（これはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ｊ；可溶であり、クーマシーブルーにて染色される）ゲルバンドパターンを陰性のコントロールと比較して、ＩＬ−４であることが示さｔ” ｔｆこ。

この上清を除去し、た後、沈殿物は５Ｍグアニジン塩酸、２ｍＭグルタチオン、（還元型）、および０．２ｍＭグルタチオン（酸化型）を含む、トリスバッファー溶液（５ｈ＋Ａｉ　Ｔｒｉｓ。

５０ｍＭ　ＮｘＣｌ、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．ＩｍＭ　ＦＭＳＦ、　ＰＨ８，Ｏ；沈殿物１グラムあたり９量Ｉ）に再懸濁した。室ａｔこで１時間後、２ｒｘＭグルタチオン（還元型）、　０．２麿Ｍグルタチオン（酸化型）を含む、トリスバッファー溶液、ｐＲｌ、ｏで１＝９に希釈された。

この希釈、透析、濃縮操作中に生じた沈殿はいつでも先に進む前に遠心にて除去された。総容積を３１のリン酸バッファー溶液で３回昼夜透析した。この透析物（すなわち透析ハックに残っている物）は、アミフンＹＭ５フィルターで濃縮され（最終濃度８Ｈ／１１）、ゲル濾過クロマトグラフィー（カラム：　Ｐ２Ｏ（ＢｉｏＲｌｄ）、　１．５Ｘ９０ｃＩｌ；　ＰＢＳ溶出バッファー；流速：　８ｍｌ／ｂｒ）に供されｔ；。両分は１５分間隔で回集された。画分２３−３７がプールされ、さらに逆相１１ＰＬｃにて分析された。この分析ｌこより、プールした画分には、９５％純度のヒトＩＬ−４が含まれていた。１リツトルのカルチャー（ふたつのＱＤ、、。）からのヒトＪＬ−４の回収量は２＋Ｂであり、比活性で５ｘｌＯ’ａ＋＋ｉｔｓ／Ｂであった。

実施例　Ｖ、　　ハイブリドーマＩＣ１，目Ｂ４．６の生産雄のルイスラットは、１１の完全７０インドアシュパンｌ−（ＣＦＡ）で乳化した】１のヒトＩＬ− ４溶液にて腹腔内に免疫された。このヒト　ＩＬ−４溶液は、１０ｍ１）リス− 塩酸、０、り＝詔塩化ナトリウム、ｐＨ７，４の溶液中に、ヒト　ＩＬ−４を１４Ａｌｌ／瓜１の濃度で含む。このヒトＩＬ−４は、実施例Ｉおよび２に従って生産され、２ＸＩＯ’ｕｉｊｔｓ／ｍｌの比活性をもっていた。初回免疫から２週間後に、このラットは再び１重ｌのＣＦＡで乳化された、ヒトＩＬ−４溶液を腹腔内に注射された。第２回の注射からコカ月後Ｉ：、このラットは１１のヒトＩＬ−４溶液（１５＊ｇ）を静脈内ｌこブースター投与された。このブースター投与から４日後に、ラットは殺され、血液夕は回収されて、肺臓は融合のために取り出された。肺臓細胞は、マウスのミエローマ＃Ｉ胞、Ｐ３Ｘ６３−ＡｇＢ、６５３（ム丁ＣＣＣＲＬＩ５８Ｇ）とポリエチレングリコールＣＰＥＧンを用いて１；１の割合で融合され１＝。この細胞懸濁液（３，５ＸｌＯ’細胞／ｍｌ：　ＩＩＡＴ培地中）は、４０枚の９６−ウェルプレートに分注されｌ；。１０日後に、ハイブリドーマの上溝は、ヒトＩＬ− ４が直接固定化されているマイクロタイタープレート（間接ＥＬＩｓＡ）、または家兎抗−ヒトＩＬ−４の固定化ポリクローナルＩｇＧ画分に結合しているヒトＩＬ−４に結合する能力が試験されｔ：。結合しＩ；抗体は、標準的方法を用いて、バーオキンダーゼー結合ヤギ抗ラット免疫グロブリンによって検出された。

ＩＬ−４と反応する、ハイブリドーマが分泌している抗体は、限定希釈法によってクローン化された。

ＩｃＩ、１ＩＢ４．６は、このような手順で選択された、ひとつの該当するハイブリドーマである。ＩＣ１，１ＬＢ４．６からの抗体はＩｇＧ、あアイソタイプであると判断された。このハイブリドーマは、保存でき、（例えば、１０％ＤＭＳＯを含むカルチャー培地中で一７０℃）、標準的な哺乳動細培養胞技術（例えば、１ｍＭグルタミンおよび５０ｍＭ　２−メルカプトエタノールで補充しｆ＝Ｉｏ％胎児子牛血清を含むＲＦＭ＋　１６４０）を使って培養できる。

実施例■、　　ハイブリドーマＭＰ４．２５ＤＩ＋の生産ハイブリドーマの収集がおこなわれ、それらの抗体は、結果的に実施例Ｖと同じ方法でヒ）　ＩＬ−４に対する特異性がスクリーニングされた。このハイブリドーマの回収物の中から、それらの抗体がヒ）　ＩＬ−４のＴＣＧＦ活性をブロックする能力があるかどうか、標準的なｉｓ　ｖｉｔｒｏアッセイ（実施例■に開示）にてさらにスクリーニングされた。

ＭＰ４．２５＋１１１１によって生産された抗体は、ブロッキングモノクローナルと同定された中で、最も高いブロッキング活性を持つものとして選択された。

ＭＰ４．２５Ｄ２．１＋によって生産された抗体は、ラットＩｇＧいと判断された。

実施例■　　　ヒトｆＬ−４のサンドイッチアッセイ１００μｌの家兎ポリクローナル抗−ヒトＩＬ−４抗体はぐプロティンＡアフィニティーカラムで精製した。　ＰＢＳ中１０μｔ／ｍｌの抗体）ポリ塩化ビニル製の９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウェルの表面上に３７°Ｃで２時間吸着される（　ＰＢＳは、蒸留水１リツトル中にＬｏｇの塩化ナトリウム、０．２ｇのに１１２１’０４，２．９ｇのＮ１２ＨＰＯ４・１Ｈ１ｔＯ１および０．２２の塩化カリウムを含む。このｐＢは、７．４である）。このプレートは、ＰＢＳ−Ｔｖｔｅｌ１２０　（Ｔｖｅｅｎ　２０を！リットルあたり０．５量Ｉ加えるほかは、Ｆｉｌｓと全く同じように調製）で未吸着の抗体を除去するために洗い、精製された１、ｃｏｌｉ−生産ヒｌ−ＩＬ−４の２連の連続希釈溶液（ＰＢＳ中）を、ＩＬ−４の濃度が１１００Ｏｐ／＋ｌから＋ｓｐに／１と減少するようにウェルの２つの１２ウ工ル列に置く。次のサンプルが、残りのウェルにのせられた：（１）ヒトＴ細胞クローン、例えば、ＣＩＬｙｌ”！−／９（ＡＴＣＣＣＲＬ　８１７９）からの培養上清（２）ｐｃＤ−ヒトＩＬ−４で遺伝子導入されたＣＯ５７細胞の培養上清、（３）ｃｏｓ　７が生産した精製ＩＬ−４を異なる濃度で含むヒト血清および（４）ヒトＩＬ−１σ、　ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＦＮ−７、１ＦＮ−σ ２ｂ、ＧＭ−Ｃ５Ｆ、ＢＳＦ−２を含むサンプル。すべてのサンプルは、室温で２時間インキュベートされた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｔで洗浄した後、ＩＣ１，１１Ｂ４．８のカルチャー由来の１：１０希釈上清が各ウェルに加えられ（１００μ ｍ／マ＊ｌＩ）　、室温で１時間インキュベートされた。

インキュベーションの後、このプレートは洗浄され、バーオキンダーゼー結合ヤギ抗−ラット抗体が添加され、室温で１時間インキュベートされ、その後洗浄された。

次にパーオキシダーゼの基質ＡＢＴＳが添加され、このヒトＩＬ−４の濃度は、ウェルの中の吸光度を手段として決定した。この結果では、ヒト血清中東なくともＳｆｌ　ｐｇ／ｍｌの濃度で、哺乳細胞−生産ヒトＩＬ−４が活性測定され、またこの測定では、先に述べたいかなるリンホカインも検出されない。

下記の表Ａ及び第３Ａ図では、１ｌＢ４　Ｆ（ｉｂ）、　ＩＩＧ、および組上溝（精製していない抗体）は、”Ｊ−ＨａｌＬ−４のＤ＊ｕｄｉ細胞への結合を阻害する活性を示す。すべての３つの調製物が結合を最大７０％阻害しｔ；。コントロールモノクローナル抗体ＧＬＩＩ？　Ｆ（ａｂ）、　ＩｓＧ、および組上溝は、結合には、影響を与えなかった（このコントロール抗体は、同じイディオタイプの非関連抗原に対する）。５０％の結合阻害を形成するためには、精製１１Ｂ４　ＩＩＧまたはＦ（ｓｂ）の濃度としては、１０−１０＋Ｉｎｓ／ｍｌが要求された。

下記の表Ｂ及び第３Ｂ図では、同アッセイに於いて、２５Ｄ２．ｌｌ　Ｆ（ｉｂ）の結合阻害能を示している。この調製では９０％の阻害を示し、最大阻害の５０％は１Ｏ−１ｓｏ／ｍｌで認められｔ二。

ｗｃＳＡ図及び第３Ｂ図においてＸ−軸はＢ／履１（対数値）、Ｙ−軸は阻害パーセント表す。

この寅験では、　Ｈ＋＋ＩＬ−４はチャイニーズハムスター卵巣ｍ胞内で調製され、下記の表においては、ＣＨＯ−Ｈ＋＋ＩＬ−４と示されている。

表Ａ１１Ｂ４による”’１−ＣＨＯ−ＨｕｌＬ−４のＤＡ［ｌＤＩ細胞への結合阻害サンプル　ｎｇ／■ｌ　結合　　サンプル　Ｂ／ｍｌ　　結合パーセント　　　　　　　　パーセント１１８４Ｆ（＆ｂ）　　ｌ　　２８．１　　１１Ｂ４１ｇＧ　　　Ｉ　　　Ｏｌｏ　　２５．３４　　　　　　　　　ｔｏ　　　１１．７１００　　Ｓ４．２８　　　　　　　　ＩＮ　　　７１．０！１０００　６７．９４　　　　　　　５００　　７３．６６１００００　６４．５６　　　　　　１０００　　６９．５４１１Ｂ４上清ｔｏ　　　ＯＣｌｌ１７　Ｆ（ｘｂ）　Ｉ　　　０１０（１４５，１ＩＱ　　　２．４１０００　　６７．９　　　　　　　１００　　０２５００　　７４．３　　　　　　　１０００　　３．７５０００　　７３．６　　　　　　１００Ｎ　　　５．１ＧＬｌ１７　ＩＩＧ　　Ｉ　　　ＯＧＬ１１７上溝１０　　７．５１０　　０　　　　　　　　１００　　４．７１００　　１．１１　　　　　　１０００　　０１０００　　０　　　　　　　２５Ｈ５，５表ＢＨＤ２．Ｉｌ’　Ｆ（ａｂ）７ラグメントによる１２’ｌ−Ｃｌｌ０−ｂｌＬ− ４のＤｉＤＩ細胞への結合阻害Ｂ／ｅｌ　　阻害パーセント　　ｎ（／ｍｌ　　阻害パーセント３０００　　　　９０　　　　　　１５　　　　　５４．１１５００　　　　９０　　　　　　１０　　　　　３０．７５１０００　　　　　ｇ４ｙ、ｓ　　　　　ＩＬ５以上の本発明の実施態様の記述は、説明および描写の目的で提供されＩ；。これらは、網羅的記載ではないし、また本発明を開示された態様そのものに限定することを意図してはおらず、明らかに上述の観点から多くの修飾および変更が可能である。この実施態様は、本発明の原理および具体的な応用を最も良く説明し、それゆえ他の、当業者がこの発明を意図する特定の用途に適するように、さまざまな具体例および修飾で最良ｌ；利用することを可能ならしめるように選ばれ、記述された。この発明の範囲はこれから述べる請求の範囲によって限定される。

出願人ハハイブリドー？　ＩＣ１，１ＩＢ４．６およびＭＰ４．２５Ｄ！。

１工を　Ａｓｅｒｉｃｕ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｌ＋１ｊｕｒｓ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　　、Ｒｏｅｋｖｉｌｌｅ。

ＭＤ、ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に、それぞれ寄託番号ＨＢ９５５０８よび１１８９ｇ０９で寄託しＩ；ｏ　これらの寄託は、特許を目的とした、細胞の寄託のためのＡＴＣＣの合意の下に提供された条件下で行われこの条件によれば、この寄託がアメリカの特許庁長官に３５　ＵＳＣＩ２２およびび３７　ＣＦＲ１，１４の規定に従って入手できるようにされ、まｔ；米国特許の発行後は公衆に入手できるようにされる。さらに前記条件は、この寄託が維持されることも必要としている。この寄託した株の利用は、指定国の政府の権威の下に特許法に従って与えられた権利に反して、本発明を実施するための実施権であると解釈されるべきではない。

浄書（内容に変更なしツ第３Ａ図１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ８８１０３６３１、発明の名称ヒト　インターロイキン４に対するモノクローナル抗体名　称　　シエリング・バイオチック・コーポレーション４、代理人住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区電話３２７０−６６４１〜６６４６５、補正命令の日付　　平成　２年　１月２２日　（発送日）国際調査報告一−嚇−＾−ａ＋ｍ＋ｔ・　ＰＣＴ／ＩＪＳ　８８１０３６３１

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヒトーインターロイキン−４に特異的なモノクローナル抗体。
２．非グリコシル化ヒトインターロイキン−４に特異的な請求項１に記載のモノクローナル抗体。
３．グリコシル化ヒトインターロイキン−４に特異的な請求項１に記載のモノクローナル抗体。
４．ハイブリドーマｌＣ１．ｌｌＢ４．６によって生産される請求項３に記載のモノクローナル抗体。
５．ヒトインターロイキン−４の生物化学的活性を阻止できる請求項１に記載のモノクローナル抗体。
６．ハイブリドーマ　ＭＰ４．２５Ｄ２．１１によって生産される請求項５に記載のモノクローナル抗体。
７．ヒトインクーロイキン−イに特異的なモノクローナル抗体を分泌できるハイブリドーマ。
８．非グリコシル化ヒトインターロイキン−イに特異的なモノクローナル抗体を分泌できる請求項７に記載のハイブリドーマ。
９．グリコシル化ヒトインターロイキン−イに特異的なモノクローナル抗体を生産できる請求項７に記載のハイブリドーマ。
１０．１Ｃ１．１１Ｂ４．６またはＭＰ４．２５Ｄ２．１１である請求項９に記載のハイブリドーマ。
１１．ヒトインターロイキン−４に特異的なモノクローナル抗体の軽鎖可変領域よりなるポリペプチド。
１２．ハイブリドーマ１Ｃ１．１１Ｂ４．６またはハイブリド−マ　ＭＰ４．２５Ｄ２．１１によって生産されるモノクロール抗体の軽鎖可変領域よりなる請求項１１に記載のポリペプチド。
１３．ヒトインターロイキン−４に特異的なモノクローナル抗体の重鎖可変領域よりなるポリペプチド。
１４．ハイブリドーマ１Ｃ１．１１Ｂ４．６またはハイブリドーマＭＰ４．２５Ｄ２．１１により生産されるモノクローナル抗体の重鎖可変領域よりなる請求項１３に記載のポリペプチド。
１５．ヒトインターロイキン−４に特異的なモノクローナル抗体由来の重鎖および軽鎖可変領域よりなるヒトインターロイキン−４に特異的な結合組成物。
１６．ハイブリドーマ１Ｃ１．１１Ｂ４．６またはハイブリドーマＭＰ４．２５Ｄ２．１１により生産されるモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域よりなる請求項１５に記載の結合組成物。
１７．ヒトインターロイキン−４の第一抗原決定基に特異的な第一モノクローナル抗体を提供し；ヒトインクーロイキン−４に特異的なポリクローナル抗体組成物およびヒトインターロイキン−４の第一抗原決定基とは異なる第二抗原決定基に特異的な第二モノクローナル抗体の群より選択された第二抗体を提供し；それぞれ第一抗体または第二抗体いずれかの量に単純に関連する強さのシグナルをつくるために、第一モノクローナル抗体または第二抗体のいずれかに機能的に結合できるシグナル形成手段を提供し；抗体−支持体結合体を形成するたりに、第一モノクローナル抗体または、第二抗体いずれかを支持手段に固定化し；サンプル中のヒトインターロイキン−４が抗体−支持体結合体に結合するように、サンブルと抗体−支持体結合体を接触させ；抗体−支持体結合体が第二抗体を含んでいるときは、機能的にシグナル形成手段がついている第一モノクローナル抗体と抗体−支持体結合体に結合しているヒトインターロイキン−４を接触させ；または抗体−支持体結合体が第一モノクローナル抗体を含んでいるときは、機能的にシグナル形成手段がついている第二抗体と抗体−支持体結合体に結合しているヒトインターロイキン−４を接触させ；そしてシグナル形成手段により形成されるシグナルの量を測定する；ことからなる、ヒトインターロイキン−４が含まれていると思われるサンプルの中のヒトインターロイキン−４の存在を検出する方法。
１８．上記抗体−支持体結合体は、ヒトインターロイキンー４に特異的な上記第一モノクローナル抗体を含みおよび上記第二抗体は上記ヒトインターロイキン− ４に特異的なポリクローナル抗体組成物である請求項１７に記載の方法。
１９．上記第一モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ１Ｃ１．１１Ｂ４．６またはハイブリドーマＭＰ４．２５Ｄ２．１１により生産されるモノクローナル抗体である請求項１８に記載の方法。
２０．上品抗体−支持体結合体は、ヒトインターロイキンー４に特異的な上記第二抗体を含みおよび第二抗体は上記ヒトインターロイキン−４に特異的なポリクローナル抗体組成物である請求項１７に記載の方法。
２１．上記第一モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ１Ｃｌ．１１Ｂ４．６またはハイブリドーマＭＰ４．２５Ｄ２．１１により生産されるモノクローナル抗体である請求項１７に記載の方法。
２２．ヒトインターロイキン−４を含むと思われるサンブル中のヒトインターロイキン−４の存在を検出するキットであって；ヒトインターロイキン−４の第一抗原決定基に特異的な第一モノクローナル抗体；ヒトインターロイキン−４に特異的なポリクローナル抗体組成物およびヒトインクーロイキン−４の第一抗原決基とは異なる第二抗原決定基に特異的な第二モノクローナル抗体から選択された群より選択された第二抗体；支持体手段；およびシグナル形成手段；より成る上記キット。
２３．上記第一抗体は、ハイブリドーマ１Ｃｌ．１１Ｂ４．６またはハイブリドーマＭＰ４．２５Ｄ２．１１により生産されるモノクローナル抗体であり、上記第二抗体は、ヒトインターロイキン−４に特異的な上記ポリクローナル抗体組成物である請求項２２に記載のキット。
２４．シグナル形成手段は、機能的に第一モノクローナル抗体に結合した酵素であり、その酵素は、バーオキシダーゼ、ベーターガラトシダーゼ、およびアルカリフォスファターゼより成る群から選択される請求項２３に記載のキット。
２５．ヒトインクーロイキン−４を含むサンプルからヒトイターロイキン−４を、ヒトインターロイキン−４に特異的なモノクローナル抗体よりなる免疫吸着体カラムを通して抽出する免疫精製方法。
２６．上記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ１Ｃ１．１１Ｂ４．６またはＭＰ４．２５Ｄ２．１１により生産される請求項２５に記載の免疫精製方法。