FI107926B - Sytokiinin synteesiä inhiboiva faktori, sen antagonistit ja näiden käyttömenetelmät - Google Patents

Description

107926

Sytokiinin synteesiä inhiboiva faktori, sen antagonistit ja näiden käyttömenetel-mät. - Cytokinsyntesen inhiberande faktor, dess antagonist och deras använd-ningsförfarande.

5 Keksinnön kohteena ovat proteiinit ja näiden antagonistit, jotka kykenevät säätelemään immuunijärjestelmään osallistuvien tiettyjen sytokiinien synteesiä.

Esillä olevan keksinnön kohteena on nisäkkään sytokiinin synteesiä inhiboiva faktori (CSIF), CSIF-analogit, CSIF-peptidit ja CSIF-antagonistit. Se käsittää 10 polypeptidejä, joilla CSIF-aktiivisuus, koodaavat nukleiinihapot sekä itse polypep-tidit, näiden agonistiset ja/tai antagonistiset analogit ja näiden valmistusmenetelmät. CSIF:n antagonistit ovat mieluummin peräisin monoklonaalisista vasta-aineista, jotka kykenevät salpaamaan CSIF.n biologisen aktiivisuuden. Keksinnön nukleiinihapot määrittyvät (1) niiden homologiasta tässä esitettyihin kloonattuihin 15 komplementti-DNA (cDNA)-sekvensseihin tai niiden kyvystä muodostaa näiden kanssa detektoitavia hybridejä, ja (2) CSIF-aktiivisuuden funktionaalisista määrityksistä sovellettuna nukleiinihappojen koodaamiin polypeptideihin. Tässä yhteydessä käytettynä nimitys "CSIF-aktiivisuus" proteiinin tai polypeptidin yhteydessä tarkoittaa, että tämä proteiini tai polypeptidi kykenee inhiboimaan tai oleellisesti • · 20 pienentämään ainakin jonkin seuraavan sytokiinin muodostumista jäljempänä • · φ *· Ί kuvatuissa menetelmissä: IFN-, interleukiini-2 (IL-2), lymfotoksiini, interleukiini-3 (IL-3) tai granulosyytti-makrofaagipesäkkeitä stimuloiva faktori (GM-CSF).

• · · • · · • · · [..* Eräs hyvänä pidetty keksinnön suoritusmuoto on valmis ihmisen CSIF, jonka • · · ’** * 25 avoimen lukukehyksen määrittelee seuraava aminohapposekvenssi:

MHSSALLCCL VLLTGVRASPGQGTQSENSC THFPGNLPNM

• · ·

LRDLRDAFSR VKTFFQMKDQ LDNLLLKESL LEDFKGYLGC

!**·· QALSEMIQFY LEEFMPQAEN QDPDIKAHVN SLGENLKTLR

O 30 LRLRRCHRFL PCENKSKAVE QVKNAFNKLQ EKGIYKAMSE

:**·.. FDIFINYIEA YMTMKRIN , » • ♦ • · · • · · • · 2 107926 jossa yksikirjaimiset standardisymbolit (kts. jäljempänä) L-aminohapoille on lueteltu vasemmalta oikealle alkaen N-terminaalisesta metioniinista. Vieläkin mieluummin valmiin ihmisen CSIF.n määrittelee seuraava aminohapposekvenssi:

5 SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMK

DQDLNILLLKE SLLEDKFGYL GCQALSEMIQ FYLEEVMPQA ENQDPDIKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENSKSKA VEQVKNAFNK LQEKGIYKAM SEFDIFINYI EAYMTMKIR N.

10 Näissä sekvensseissä välit on annettu ainoastaan helpottamaan lukijaa.

Aminohapoille on käytetty yksikirjaimista standardikoodia: A Ala Alaniini M Met Metioniini C Cys Kysteiini N Asn Asparagiini 15 D Asp Asparagiinihappo P Pro Proliini E Glu Glutamiinihappo Q Gin Glutamiini F Phe Fenyylialaniini R Arg Arginiini G Gly Glysiini S Ser Seriini H His Histidiini T Thr Treoniini • · 20 I Ile Isoleusiini V Vai Väliini • · II· *· *j K Lys Lysiini W Trp Tryptofaani L Leu Leusiini Y Tyr Tyrosiini

• I I

• · * • · ·

Keksintö perustuu osaltaan CSIF-aktiivisuutta omaavien proteiinien ekspressoimi- • · · *·* * 25 seen kykenevien cDNA-lajien löytämiseen ja kloonaamiseen. Useita tällaista . klooneja, joille on annettu nimiksi pcD(SR0)-F115 (jossa on hiiren CSIF-geeni), ja pH5C ja pH15C (joissa kummassakin on ihmisen CSIF-geeni), on siten tallennet- • · *:·' tu ATCC (American Type Culture Collection)-kokoelmaan, Rockville, MD, vastaa-

• I

: *·· vasti tunnusnumeroilla 68027, 68191 ja 68192.

C: 30 ♦*·.. Piirustuksissa: ♦ • · • # · • Il • ♦

Kuvio 1 on annos/reaktio-suhde IFN- :n synteesin inhibitiolle useissa hiiren T-so-luklooneissa, jotka on käsitelty eri CSIF-määrillä.

3 107926

Kuvio 2 on kaavio, joka esittää nisäkäsekspressointivektoreiden pH5C:n ja pH15C:n pääasiallisia ominaisuuksia.

Kuvio 3 esittää TAC-RBS-hCSIF-plasmidin RBS-ATG-polylinkkerialuetta.

5

Kuvio 4 esittää pH15C:n cDNA-insertin nukleotidisekvenssiä.

Keksintö sisältää pH5C:n, pH15C:n, pcD(SR0)-F115:n cDNA-inserttien ja efek-tiivisesti homologisten cDNA-lajien suurimpien avointen lukukehysten valmiit 10 polypeptidit tai proteiinit sekä näiden antagonistit. Eristetyillä proteiineilla avoin lukukehys tavallisesti koodaa polypeptidiä, joka muodostuu valmiista tai eristetystä tuotteesta, joka on kovalenttisesti sitoutunut N-päässään signaalipeptidiin. Ennen valmiin tai aktiivisen polypeptidin erittymistä signaalipeptidi lohkaistaan pois. Lohkaisukohta voidaan ennustaa suurella tarkkuudella empiirisistä sään-15 nöistä, esimerkiksi Heijne, Nucleic Acids Research, Voi. 14, s. 4683-4690 (1986) eikä signaalipeptidin täsmällinen aminohappokoostumus näytä olevan sen toiminnalle kriittinen, esimerkiksi Randall et ai. Science, Voi. 243, s. 1156-1159 (1989); Kaiser et ai. Science, Voi. 235, s. 312-317 (1987). Valmiita proteiineja koodaavat . siten helposti signaalipeptidit, jotka ovat varsin erilaisia kuin pH5C:n, pH15C:n ja • · 20 pcD(SRa)-F115:n cDNA-inserttien määrittelemän avoimen lukukehyksen koodaa- ** ‘i mat.

• · I I « ***. 1. CSIF-cDNA:ien saanti ia ekspressointi • « • m • * * ’ 25 Tässä yhteydessä käytettynä nimitys "efektiivisesti homologinen" tarkoittaa, että . keksinnön mukaisesta cDNA-kloonista saatu hybridisointikoetin kykenee detektoi- ... maan tämän nukleotidisekvenssin. Täsmällinen numeerinen mitta homologialle, « · *.’* joka tarvitaan detektoimaan CSIF-aktiivisuutta koodaavat nukleiinihapot, riippuu • · ϊ ’·* useista tekijöistä, mukaanlukien (1) koettimen homologiasta ei-CSIF:a koodaaviin ··· 30 sekvensseihin, jotka liittyvät kohteena oleviin nukleiinihappoihin, (2) hybridisointi-:*·.. olosuhteiden stringenttiydestä, (3) siitä, käytetäänkö yksisäikeisiä tai kaksisäikei-siä koettimia, (4) siitä, käytetäänkö RNA- tai DNA-koettimia, (5) toimenpiteistä, joihin on ryhdytty koettimen epäspesifisen sitoutumisen pienentämiseksi, (6) 4 107926 koettimen leimaamiseen käytetyn menetelmän laadusta, (7) guanidiini- ja syto-siiniemästen osuudesta koettimessa, (8) koettimen ja kohteen välisten yhteenso-pimattomuuskohtien jakaantumisesta, (9) koettimen koosta, ja vastaavista. Efek-tiivisesti homologinen nukleiinihapposekvenssi on mieluummin vähintään 90-pro-5 senttisesti homologinen keksinnön mukaisen cDNA:n kanssa. Vieläkin tarkemmin sanoen efektiivisesti homologinen nukleiinihapposekvenssi on sekvenssi, jonka cDNA voidaan eristää pCD(SRa)-F115:n, pH5C:n, pH15C:n cDNA-insertistä tai sen ekvivalentista rakennetun koettimen avulla käyttämällä esimerkeissä kuvattua hybridisointiprotokollaa ilman, että vääriä positiivisia signaaleja on muutamaa 10 enempää, esimerkiksi alle 100. Kirjallisuudessa on laajasti neuvottu tällaisten hybridisointiolosuhteiden valintaa, esimerkiksi Hames et ai. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1985); Gray et al, Proc. Natl. Acad. Sei., Vol. 80, s. 5842-5846 (1983); Kafatos et al, Nucleic Acids Research, Vol. 7, s. 1541-1552 (1979); Sambrook et al, Molecular Cloning: A La-15 boratory Manual, 2. painos (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989); ja Beltz et al, Meth. in Enzymol., Vol. 100, s. 266-285 (1983), muutama mainitaksemme.

. Tässä käytettynä nimitys homologia mittaa kahden nukleotidisekvenssin (tai « · 20 aminohapposekvenssin) keskinäistä samankaltaisuutta. Homologia ilmoitetaan • · « * *| yhteensopivien emästen (tai aminohappojen) osuutena tai prosenttimääränä sen jälkeen, kun kaksi sekvenssiä (tavallisesti eripituista) on sovitettu. Sovittamis- • » · nimitystä käytetään Sankoffin ja Kruskal'in määrittelemässä merkityksessä, kap- • · ... pale yksi kirjassa: Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory • · · * 25 and Practice of Sequence Comparison (Addison-Wesley, Reading, MA, 1983).

. Karkeasti sanottuna kaksi sekvenssiä sovitetaan maksimoimalla yhteensopivien '...* emästen (tai aminohappojen) lukumäärä kahden sekvenssin välillä, jolloin laite- T taan mahdollisimman pieni määrä "blankoemäksiä" tai "nollaemäksiä" jompaan • · • *” kumpaan sekvenssiin maksimaalista päällekkäisyyttä varten. Annetulle kahdelle • · · 30 sekvenssille on olemassa algoritmeja, joilla niiden homologia lasketaan, esimer-kiksi Needleham ja Wunsch, J. Mol. Biol., Voi. 48, s. 443-453 (1970); ja Sankoff and Kruskal (viitattu edellä) s. 23-29. Tällaisten vertailujen suorittamiseen on saatavissa myös kaupallisia palveluita ja ohjelmapaketteja, esimerkiksi Intelligenetics, 5 107926

Inc. (Palo Alto, CA); ja University of Wisconsin Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin).

Vektoreiden, joissa on keksinnön mukaisia cDNA:ia restriktioendonukleaasifrag-5 mentteja käytetään rakentamaan koettimia (käyttämällä standarditekniikoita, kuten nick-translaatiota, esimerkiksi kts. Sambrook et ai., viitattu edellä), joilla seulotaan CSIF:n tuottajaksi epäillyn solutyypin genomi-tai cDNA-kirjastoja (jälleen rakennettu standarditekniikoilla) käyttämällä alhaisia hybridisointistringent-tiyksiä. Käytetään normaaleja seulontamenetelmiä, esimerkiksi Grunstein et ai., 10 Proc. Natl. Acad. Sei., Voi. 72, s. 3961-3965 (1975); tai Benton et ai. Science,

Voi. 196, s. 180-183 (1977) tai Woo, Methods in Enzymology, Voi. 68, s. 389-396 (1979). Kirjastot voidaan vaihtoehtoisesti seuloa leimatuilla oligonukleotidkoetti-milla, joiden sekvenssit määräytyvät pcD(SRa)-F115:n, pH5C:n ja pH15C:n cDNA-inserttien nukleotidisekvensseistä. Tällaiset koettimet voidaan syntetisoida 15 kaupallisesti saatavilla DNA-syntetisointilaitteilla, esimerkiksi Applied biosystems model 381A:lla, käyttämällä vakiomenetelmiä, esimerkiksi Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, (IRL Press, Waashington D.C., 1984). Kummassakin tapauksessa on suotavaa, että koetin on vähintään 18-30 emästä. Vieläkin mieluummin koettimen pituus on vähintään 50-200 emästä. Hybridisointikoettimil- • · 20 la voidaan myös seuloa mahdollisia CSIF mRNA-lähteitä ennen kirjaston raken- i i « *· *| tamista.

• · • · ·

Keksinnön mukaisten proteiinien tuottamiseen voidaan käyttää monia erilaisia ].,* yksisoluisia tai monisoluisia ekspressointi-systeemejä (s.o. isännän ja ekspres-• · · ’** * 25 sointivektorin yhdistelmiä). Mahdollisia isäntäsolutyyppejä ovat bakteerit, hiivat, . hyönteiset, nisäkkäät ja vastaavat, näihin kuitenkaan rajoittumatta. Saatavissa on ]..* monia katsausartikkeleita, jotka neuvovat spesifisten ekspressointisysteemien • · *;** valintoja ja/tai modifiointeja, esimerkiksi muutama mainitaksemme, de Boer ja ·· : *·· Shepard "Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli", • ·· 30 s. 205-247, kirjassa Kroon, toim. Genes: Strucutre and Expression (John Wiley & Sons, New York, 1983), katsaus useisiin E. coli'n ekspressointisysteemeihin; m

Kucherlapati et ai., Critical Reviews in Biochemistry, Voi. 16, Issue 4, s. 349-379 (1984), ja Banerji et ai. Genetic Engineering, Voi. 5, s. 19-31 (1983) katsaus menetelmistä, joilla transfektoidaan ja transformoidaan nisäkässoluja; Reznikoff 6 107926 ja Gold, eds., Maximizing Gene Expression (Butterworths, Boston, 1986) katsaus valittuihin aiheisiin geenien ekspressoinnista E. coli-, hiiva- ja nisäkässoluissa; ja Thilly, Mammalian Cell Technology (Butterworths, Boston, 1986) katsaukset nisäkkäiden ekspressointisysteemeihin. Samoin on saatavissa monia katsausar-5 tikkeleita, joissa on kuvattu tekniikoita ja olosuhteita, joilla yhdistetään ja/tai manipuloidaan spesifisiä cDNA-lajeja ja ekspressoinnin kontrollisekvenssejä niin, että saadaan ja/tai muunnetaan ekspressointivektoreita, joita voidaan käyttää esillä olevan keksinnön mukaisesti, esimerkiksi Sambrook et ai (viitattu edellä).

10 Riggs on esittänyt erään E. coli'n ekspressointisysteemin US-patentissa 4,431,739, joka tässä mainitaan viitteenä. Eräs erityisen hyödyllinen prokaryootti- nen promoottori E. coli'ssa tapahtuvaa voimakasta ekspressointia varten on tac- promoottori, jonka de Boer on esittänyt US-patentissa 4,551,433, joka tässä mainitaan viitteenä. E. coli-isäntiin on saatavissa myös eritysekspressointivekto- 15 reita. Erityisen hyödyllisiä ovat pIN-HLompA-vektorit, Ghrayeb et ai., kirjassa EMBO J., Voi. 3, s. 2437-2442 (1984),!joissa transkriptoitava cDNA fuusioidaan E. coli OmpA-geenin osaan, joka koodaa ompA-proteiinin signaalipeptidiä, joka vuorostaan saa valmiin proteiinin erittymään bakteerin periplasmiseen tilaan.

. Myös US-patenteissa 4,336,336 ja 4,338,397 on esitetty eritysekspressointivekto-• ♦ *;**! 20 reita prokaryooteille. Nämä julkaisut ovat siten mukana viitteenä.

• ♦ · • · · • ·

Lukuisat bakteerikannat sopivat isänniksi prokaryoottisia ekspressointivektoreita * ♦ · **:·* varten, mukaanlukien E. Coli-kannat, kuten W3110 (ATCC n:o 27325), JA221, C600, ED767, DH1, LE392, HB101, X1776 (ATCC n:o 31244), X2282, RR1 • · · ** * 25 (ATCC n:o 31343) MRCI; Bacillus subtilis-kannat; ja muut enterobakteerit, kuten , Salmonella typhimurium tai Serratia mareescens ja eri Pseudomonas-lajit. Curtis !..* Ill on US-patentissa 4,190,495 tuonut esiin yleisiä menetelmiä, joilla saadaan • · 7 eukaryoottisten proteiinien ekspressoinnissa hyödyllisiä bakteerikantoja, kuten ·· : *·· E. coli K12 X1776. Tämä patentti on tässä siten mainittu viitteenä.

C: 30

Prokaryoottisten ja eukaryoottisten mikro-organismien lisäksi keksinnön mukais-ten proteiinien tuottamiseen voidaan käyttää myös ekspressointisysteemejä, jotka käsittävät monisoluisesta organismista saatuja soluja. Erityisen mielenkiintoisia ovat nisäkkäiden ekspressointisysteemit,.koska niiden translaation jälkeinen pro- 7 107926 sessointikoneisto tuottaa todennäköisemmin biologisesti aktiivisia nisäkäsprote-iineja. Useita DNA-kasvainviruksia on käytetty vektoreina nisäkäsisännille. Erityisen tärkeitä ovat ne lukuisat vektorit, jotka sisältävät SV40:n replikaatio-, transkriptio- ja/tai translaation kontroilisekvenssejä kytkettyinä bakteereiden replikaa-5 tion kontrollisekvensseihin, esimerkiksi Okayama'n ja Berg'in kehittämät pcD-vek-torit, julkaistu artikkeleissa: Mol. Cell. Biol., Voi. 2, s. 161-170 (1982) ja Mol. Cell. Biol., Voi. 3, s. 280-289 (1983), ja joita on parantanut Takebe et ai, Mol. Cell. Biol. Voi. 8, s. 466-472 (1988). Nämä julkaisut ovat tässä siten mainittu viitteenä. SV40-pohjaisiin nisäkkäiden ekspressointivektoreihin kuuluvat Kaufman'in ja 10 Sharp'in, Mol. Cell. Biol., Voi. 2, s. 1304-1319 (1982), ja Clarkin et ai., US-patentti 4,675,285, esiintuomat vektorit, jotka kummatkin julkaisut on tässä yhteydessä mainittu viitteenä. Apinan solut ovat tavallisesti suositeltuja isäntiä edellä mainituille vektoreille. Nämä vektorit, jotka sisältävät SV40 ori-sekvenssejä ja ehjän A-geenin, voivat replikoitua autonomisesti apinan soluissa (jolloin saadaan suu-15 rempi kopiomäärä ja/tai stabiilimpia kopiomääriä kuin ei-autonomisesti replikoitu-villa plasmideilla). Vektorit, jotka sisältävät SV40 ori-sekvenssejä ilman ehjää A-geeniä, voivat lisäksi replikoitua autonomisesti suureksi kopiomääräksi (mutta ei stabiilisti) COS7-apinasoluissa, joita vektoreita on kuvannnut Gluzman, Cell,

. Voi. 23, s. 175-182 (1981) ja joita on saatavissa ATCCista (tallennusnumero CRL

• · 20 1651). Nämä SV40-pohjaiset vektorit kykenevät myös transformoimaan muita • · · * *| nisäkässoluja, kuten hiiren L-soluja, integroitumalla isäntäsolun DNA:an.

• · • ·*··' . -• · · *’*. CSIF-faktorin tuotannon isäntinä voivat toimia myös monisoluiset organismit, • · ... esimerkiksi hyönteisten toukat, Maeda et ai, Nature, Voi. 315, s. 592-594 (1985) • · · * 25 ja Ann. Rev. Entomol., s. 351-372 (1989); ja transgeeniset eläimet, Jaenisch,

Science, Voi. 240, s. 1468-1474 (1988).

• · • · · • * *·* II. CSIF:n in vitro määritykset • · • · • · · • ·· 30 CSIF-aktiivisuus on ominaisuus, joka inhiboi vähintään yhden sytokiinin synteesiä joukossa, johon kuuluvat IFN-, lymfotoksiini, IL-2, IL-3 ja GM-CSF, T-auttajasolu-:/.{ jen populaatiossa, kun solut on indusoitu syntetisoimaan yhtä tai useampaa näitä sytokiineja altistamalla tämä syngeenisille APC-soluille (antigen presenting cells) ja antigeenille. APC-solut käsitellään parhaiten niin, että ne eivät kykene replikoi- 8 107926 tumaan, mutta että niiden antigeenin prosessointilaitteista pysyy toimintakykyisenä. Tämä tehdään tarkoituksenmukaisesti säteilyttämäilä APC-soluja, esimerkiksi noin 1500-3000 R annostuksella (gamma- tai röntgensäteily) ennen sekoittamista T-solujen kanssa.

5

Sytokiinin inhibitio voidaan vaihtoehtoisesti määrittää primäärisissä tai mieluummin sekundäärisissä sekalymfosyyttireaktioissa (MLR), missä tapauksessa ei tarvitse käyttää syngeenisiä APC-soluja. MLR-reaktiot ovat alalla yleisesti tunnettuja, esimerkiksi Bradley, s. 162-166, kirjassa Mishell et ai, toim. Selected Methods in 10 Cellular Immunology (Freeman, San Francisco, 1980); ja Battisto et al, Meth. in Enzymol., Vol. 150, s. 83-91 (1987). Lyhyesti sanottuna sekoitetaan kaksi populaatiota allogeenisia lymfoidisoluja, joista toinen populaatio on käsitelty ennen sekoittamista, esimerkiksi säteilyttämäilä lisääntymisen estämiseksi. Solupopulaatioiden konsentraatioksi tehdään mieluummin noin 2 x 106 solua/ml täydennetyssä 15 alustassa, esimerkiksi RPMI 1640-alustassa, jossa on 10 % vasikansikiöseeru-mia. Sekä kontrolleja että testiviljelmiä varten sekoitetaan määritykseen 0,5 ml kumpaakin populaatiota. Sekundääristä MLR-reaktiota varten juuri valmistettujen, säteilytettyjen stimulaattorisolujen avulla stimuloidaan uudelleen soluja, jotka ovat . jäljellä 7 päivän kuluttua primäärisessä MLR-reaktiossa. Näyte, jonka epäillään • · 20 sisältävän CSIF-faktoria, voidaan lisätä testiviljelmiin sekoitushetkellä ja sekä • > · * *; kontrollit että testiviljelmät voidaan määrittää sytokiinin tuoton suhteen 1-3 päi vää sekoittamisen jälkeen.

: : r • · · [,.* Tehtäessä CSIF-määrityksiin T-solupopulaatiota ja/tai APC-populaatioita käyte-• · · *** * 25 tään alalla yleisesti tunnettuja tekniikoita, joita on täydellisesi kuvattu kirjassa: . DiSabato et ai, toim. Meth. in Enzymol/, Voi. 108 (1984). Hyvänä pidetyssä CSIF- !..* menetelmässä APC-solut ovat periferiaveren monosyyttejä.

• · ·· · ·· : *·* Nämä saadaan käyttämällä standardimenetelmiä, esimerkiksi tekniikoita, joita ··· !...: 30 ovat kuvanneet: Boyum, Meth. in Enzymol., Vo. 108, s. 88-102 (1984); Mage, Meth. in Enzymol., Voi. 108, s. 118-132 (1984); Litvin et ai., Meth. in Enzymol., Voi. 108, s. 298-302 (1984); Stevenson, Meth. in Enzymol., Voi. 108, s. 242-249 (1989); ja Romain et ai, Meth. in Enzymol,, Voi. 108, s. 148-153 (1984), jotka julkaisut on mainittu viitteenä. CSIF-määrityksissä käytetään mieluummin auttaja- 9 107926 T-soluja, jotka saadaan ensin erottamalla lymfosyyttejä periferiaverestä ja sen jälkeen valitsemalla, esimerkiksi huuhtelu- tai virtaussytometrin avulla auttajasolut käyttämällä kaupallisesti saatavissa olevaa anti-CD4-vasta-ainetta, esimerkiksi US-patentissa 4,381,295 kuvattua OKT4:a, joka on saatavissa Ortho Pharma-5 ceutical Corp.-yhtiöltä. Tarvittavat tekniikat on täydellisesti esitetty julkaisuissa: Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest., Voi. 21 (Suppl. 97), s. 77 (1968); Meth. in Enzymol., Voi. 108 (viitattu edellä), ja Bram et ai. Meth. in Enzymol., Voi. 121, s. 737-748 (1986). Yleisesti sanoen PBL-solut saadaan tuoreesta verestä Ficoll-Hypaque-tiheysgradienttisentrifugoinnin avulla.

10

Menetelmässä voidaan käyttää monia erilaisia antigeenejä, esimerkiksi KLH:a (Keyhole limpet hemocyanin), pöllön -glöbuliinia tai vastaavaa. Vieläkin mieluummin menetelmässä stimuloidaan antigeenin asemasta auttaja-T-soluja anti-CD3 monoklonaaiisella vasta-aineella, esimerkiksi US-patentissa 4,361,549 esitetyllä 15 OKT3:lla.

Sytokiinin konsentraatiot kontrollinäytteissä ja testinäytteissä mitataan normaaleilla biologisilla ja/tai immunologisilla menetelmillä. Immunokemiallisten määritysten rakentaminen spesifisille sytokiineille on alalla yleisesti tunnettua, kun • · · 20 puhdistettua sytokiiniä on saatavissa, esimerkiksi Campbell, Monoclonal Antibody ·· ml". Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Tijssen, Practice and Theory of • ·

Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); ja US-patentti 4,486,530 • · · ovat esimerkkejä aihetta koskevasta laajasta kirjallisuudesta. Kaupallisesti on • · t...< saatavissa ELISA-kittejä ihmisen IL-2:lle, ihmisen IL-3:lle ja ihmisen GM-CSF:lle • · « 25 Genzyme Corp. (Boston, MA)-yhtiöltä; ja ELISA-kitti ihmisen IFN-y:lle on saatavis-sa kaupallisesti Endogen, Inc. (Boston, MA)-yhtiöltä. Ihmisen lymfotoksiinille • · ...t spesifisiä polyklonaalisia vasta-aineita on saatavissa Genzyme Corp.:lta, joita [·* voidaan käyttää ihmisen lymfotoksiinin radioimmunomääritykseen, esimerkiksi • · *· [' Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques (Elsevier, *···* 30 Amsterdam, 1982).

• · • · • »· • V·* CSIF-aktiivisuuden määrittämiseen voidaan myös käyttää edellä lueteltuja syto-kiinien biologisia määrityksiä. Eräs biologinen määritys ihmisen lymfotoksiinille on esitetty julkaisuissa: Aggarwal, Meth. in Enzymol., Voi. 116, s. 441-447 (1985), ja 10 107926

Matthews et ai. s. 221-225, kirjassa: Aggarwal, Meth. in Enzymol., Voi. 116, s. 441-447 (1985), ja Matthews et ai, s. 221-225, kirjassa Clemens et ai, toim., Lymphokines and Interferons: A Practical Approach (/IRL Press, Washington, D.C., 1987). Ihmisen IL-2 ja GMCSF voidaan määrittää faktorialisteisilla solulin-5 joilla CTLL-2 ja KG-1, jotka on saatavissa ATCC-kokoelmasta vastaavasti tailen-nusnumeroilla TIB 214 ja CCL 246. Ihmisen IL-3 voidaan määrittää sen kykynä stimuloida hyvin erilaisten hematopoeettisten solupesäkkeiden muodostumista pehmeissä agar-viljelmissä, kuten esimerkiksi kuvannut Metcalf, The hemopoietic Colony Stimulating Factors (Elsevier, Amsterdam, 1984). γ-interferoni voidaan 10 kvantitatisoida virustenvastaisilla määrityksillä, esimerkiksi Meager, s. 129-147, kirjassa Clemens et ai, toim. (viitattu edellä).

Sytokiinin tuotto voidaan myös määrittää mRNA-analyysin avulla. Sytokiini-mRNA:t voidaan mitata sytoplasmisen dot-hybridisoinnin avulla White'n et ai., 15 J.Biol.Chem., Voi. 257, s. 8569-8572 (1982), ja Gillespie'n et ai., US-patentti 4,483,920, kuvaamalla tavalla. Nämä julkaisut on siten mainittu viitteenä. Muihin tapoihin kuuluu dot blotting-menetelmä käyttämällä puhdistettua RNA:a, esimerkiksi kappale 6, kirjassa Hames et ai., toim,, Nucleic Acid Hybridization A Practical . Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1985). Yleisesti sanoen sytoplasmisessa • · * Γ*. 20 dot-hybridisoinnissa ankkuroidaan solun tai kudosnäytteen mRNA kiinteäfaasisen • · · * · · * ! tukiaineen päälle, esimerkiksi nitroselluloosalle, hybridisoidaan DNA-koetin ank- • · kuroituun mRNA:an ja poistetaan koetinsekvenssit, jotka ovat sitoutuneet epäspe- • · · ’**. sifisesti kiinteäfaasiseen tukiaineeseen tai jotka muodostavat yhteensopimattomia • · hybridejä mRNA:n kanssa, jolloin jäljelle jää vain koetinsekvenssejä, jotka muo- i · * 25 dostavat oleellisesti täydellisiä hybridejä kohde-mRNA-lajien kanssa. Jäljelle . jäänyt DNA-koettimen määrä toimii mittana kiinteäfaasiselle tukiaineelle ankkuroi- • · tuneen kohde-mRNA:n lukumäärälle. Jäljelle jäänyt DNA-koettimen määrä määri- *** tetään sen markkerin muodostaman signaalin avulla. Yksi- ja kaksisäikeisten ·· i " nukleiinihappofragmenttien leimaamiseen on käytettävissä useita standarditeknii-• *· *···' 30 koita. Näihin kuuluvat radioaktiivisten markkereiden mukaanlaittaminen, esimer-kiksi Harper et ai., Chromosoma, Voi. 83, s. 431-439 (1984); fluoresoivien mark-:’\i kereiden suora kiinnittäminen, esimerkiksi Smith et ai., Nucleic Acids Research,

Voi. 13, s. 2399-2412 (1985), ja Connolly et ai., Nucleic Acids Research, Voi. 13, s. 4485-4502 (1985); ja nukleiinihappofragmenttien erilaiset kemialliset modifioin- 11 107926 nit, jotka tekevät ne detektoitaviksi immunokemiallisesti tai muiden affiniteettireak-tioiden kautta, esimerkiksi Tchen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., Voi. 81, s. 3466-3470 (1984); Richardson et ai., Nucleic Acids Research, Voi. 78, s. 6167-6184 (1983); Langeretal., Proc. Natl. Acad. Sei., Voi. 78, s. 6633-6637 (1981); Brigati 5 et ai., Virology, Voi. 126, s. 32-50 (1983); Broker et ai., Nucleic Acids Research, Voi. 5, s. 363-384 (1978); ja Bayer et ai., Methods of Biochemical Analysis, Voi. 26, s. 1-45 (1980).

T-soluista saatu mRNA ankkuroidaan hybridisointia varten koettimeen mieluum- 10 min seuraavan protokollan mukaisesti. Eristetyt T-solut lyysataan suspendoimalla lyysauspuskuriin (0,14 M NaCI, 1,5 mM MgCI2,10 mM Tris-HCI pH 8,5, 0,5 %

Nonidet P-40 (ioniton detergentti, esimerkiksi Sigma-yhtiöltä)) 4°C:ssa 1x108 solua/ml loppukonsentraatiossa. Suspensiota vorteksoidaan 10 sekuntia ja tumat pelletoidaan (13.000 g, 2,5 min.). Saadut sytoplasmalysaatit siirretään sen jälkeen

15 steriiliin 1,5 ml:n putkeen, joka sisältää .0,3 tilavuutta 20x SSC:a (1x SSC=0,15 M

NaCI, 0,015 M trinatriumsitraatti (suolaliuossitraatti-standardi)) ja 0,2 tilavuutta 37-prosenttista (paino/paino) formaldehydiä. Sen jälkeen seosta inkuboidaan 15 minuuttia 60°C:ssa ja säilytetään erinä -7.0°C:ssa. Analyysiä varten titrataan . 15 ml kutakin näytettä kolminkertaisena laimennussarjana 15x SSC:ssa 96-kai- • · 20 voiselle tasapohjaiselle mikrotiitterilevylle (Falcon, Becton Dickinson, Oxnard, CA) • ·^ · * I 0,1 mhssa. Jokainen laimennos viedään imun avulla Nytran-kalvolle (modifioitu nailontuki, saatavissa Schleicher and Schuell, Kenne, NH, yhtiöltä; huokoskoko • · · ***. 0,45 mm, joka on tuettu suodatinpaperin päälle (Whatman 3 mmChr, Whatman

Inc., Clifton, NJ) käyttämällä 96-paikkaista Minifold-laitetta (Schleicher and • · * * 25 Schuell). Sen jälkeen Nytran-paperi paistetaan (80°C, 2 tuntia) ja käsitellään esihybridisointiliuoksella, jossa on 50 % formamidia (BRL, Gaithersburg, MD) 6x SSSC, 50 mg/ml E. coli tRNA (Sigma), 0,2 % (paino/tilavuus) sekä fikollia T (mp.= 400.000), polyvinyylipyrrolidonia että naudanseerumialbumiinia (BSA).

• · i Koetinta laitetaan Nytran-tukiaineen päälle esihybridisointiliuoksen noin 50 mg ··· i...: 30 koetin/ml konsentraattina. Hybridisoinnin jälkeen tukiaine pestään kaksi kertaa 15 minuutin ajan kulloinkin huoneen lämpötilassa 2x SSC.ssa, tämän jälkeen kaksi s\j kertaa 30 minuutin ajan kulloinkin 60°G:ssa 2x SSC/0,5 % SDS:ssa. Tämän jälkeen tuki valotetaan filmille käyttämällä tehostusverkkoa ja kvantitatisoidaan skannaamalla lasertiheysmittarilla (esimerkiksi Ultroscan XL, LKB Instruments 12 107926

Inc., Gaithersburg, MD). Jos sytoplasmisella dot-hybridisoinnilla ei päästä riittävään herkkyyteen, on suositeltavaa uuttaa RNA ensin PBL-soluista ennen blok-kausta. RNA voidaan esimerkiksi uuttaa Chirgwin'in et ai., Biochemistry, Voi. 18, s. 5294-5299 (1979), esittämällä guanidiniumtiosyanaatti-menetelmällä.

5

Eräissä tapauksissa on CSIF-aktiivisuuden suhteen testattavat näytteet esikäsitel-tävä mahdollisesti määritystä häiritsevien sytokiinien poistamiseksi. Esimerkiksi IL-2 lisää γ-interferonin tuottoa eräissä soluissa. Määrityksessä käytetyistä auttaja-T-soluista riippuen on siten IL-2 ehkä poistettava testattavasta näytteestä.

10 Tällaiset poistamiset suoritetaan tarkoituksenmukaisesti johtamalla näyte normaalin anti-sytokiini-affiniteettipylvään läpi.

III. CSIFille spesifiset monoklonaaliset vasta-aineet ia antagonistit 15 Keksinnön mukaiset antagonistit ovat mieluummin peräisin ihmisen CSIF:lle spesifisistä vasta-aineista. Vieläkin mieluummin keksinnön mukaiset antagonistit sisältävät ihmisen CSIF:lle spesifisiä fragmentteja tai sitomisseoksia. Vasta-aineet muodostuvat yhdistelmästä polypeptidiketjuja, joita disfulfidisillat yhdistävät toisiin- .·. sa. Kaksi suurta polypeptidiketjua, joita kutsutaan kevyeksi ketjuksi ja raskaaksi * *·· .·. : 20 ketjuksi, muodostavat kaikki vasta-aineen tärkeimmät rakenneluokat (isotyypit).

• i • ·

Sekä raskaat ketjut että kevyet ketjut on edelleen jaettu pienempiin alueisiin, joita • · . .·. kutsutaan muuttuviksi alueiksi ja vakioalueiksi. Raskaat ketjut esittävät yhden muuttuvan alueen ja kolme erilaista varoaluetta, ja kevyet ketjut käsittävät yhden muuttuvan alueen (eri kuin raskaassa ketjussa) ja yhden vakioalueen (eri kuin • * 25 raskaan ketjun alueet). Raskaan ketjun ja muuttuvan ketjun muuttuvat alueet ovat syynä vasta-aineen sitoutumisen spesifisyyteen.

• •t • · ··· Tässä yhteydessä käytettynä nimitys "raskaan ketjun muuttuva alue" tarkoittaa • · polypeptidiä (I), joka on 110-125 aminohappoa pitkä ja (2) jonka aminohapposek- • · *:** 30 venssi vastaa keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen raskaan ketjun ·· : *·· tätä aluetta alkaen raskaan ketjun N-terminaalisesta aminohaposta. Samoin • · :.**i nimitys "kevyen ketjun muuttuva alue" tarkoittaa polypeptidiä (I), joka on 95-115 aminohappoa pitkä ja (2) jonka aminohapposekvenssi vastaa keksinnön mukai- 13 107926 sen monoklonaalisen vasta-aineen kevyen ketjun tätä aluetta alkaen kevyen ketjun N-terminaalisesta aminohaposta.

Tässä yhteydessä käytettynä nimitys "monoklonaalinen vasta-aine" viittaa immu-5 noglobuliinien homogeenisiin populaatioihin, jotka kykenevät spesifisesti sitoutumaan ihmisen CSIF-faktoriin.

Tässä yhteydessä käytettynä nimitys "sitoutumisseos" tarkoittaa seosta, joka käsittää kaksi polypetpidiketjua (1) jotka toiminnallisesti liittyneinä ottavat konfor-10 maation, jolla on suuri sitoutumisaffiniteetti ihmisen CSIF-faktoriin ja (2) jotka ovat peräisin hybridomasta, joka tuottaa ihmisen CSIF:lle spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita. Nimitys "toiminallisesti liittynyt" osoittaa, että nämä kaksi polypepti-diketjua voidaan asettaa toistensa suhteen eri tavalla tapahtuvaa sitoutumista varten, mukaanlukien liittymällä natiiviin vasta-aineen fragmenttiin, kuten Fab- tai 15 Fv-fragmenttiin, tai geneettisesti rakennettujen kysteiinipitoisten peptidilinkkerei-den avulla karboksyylipäissä. Normaalisti nämä kaksi polypeptidiketjua vastaavat ihmisen CSIFille spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen kevyen ketjun muuttuvaa aluetta ja raskaan ketjun muuttuvaa aluetta. Keksinnön mukaiset antagonistit .·. on mieluummin saatu ihmisen CSIFille spesifisistä monoklonaalisista vasta-ai-• · · 20 neista. Monoklonaaliset vasta-aineet, jotka kykenevät salpaamaan tai neutraloi- • · maan CSIF-faktorin, valitaan niiden kyvyn avulla inhiboida CSIF.n indusoimia • · . .·. vaikutuksia normaaleissa CSIF-biomäärityksissä, esimerkiksi kykynä inhiboida *·* * γ-interferonin synteesiä.

• · ··· • · · • · * 25 Keksinnön mukaiset hybridomat valmistetaan yleisesti tunnetuilla tekniikoilla. Tavallisesti menetelmä käsittää ikuiseksi tekevän solulinjan fuusioinnin B-lymfo- • · .···, syytin kanssa, joka tuottaa halutun vasta-aineen. Vaihtoehtoisesti mahdollisia ,*·” ovat fuusioon perustumattomat tekniikat, joilla muodostetaan ikuisia vasta-ainetta ·*...” tuottavia solulinjoja, ja myös nämä sisältyvät esillä olevan keksinnön piiriin, esi- • · **;·* 30 merkiksi viraalisesti indusoitu transformaatio: Casali et ai., "Human Monoclonals ·· : *·· from Antigen-Specific Selection of B Lymphocytes and Transformation by EBV", • ·

Science, Vol. 234, s. 476-479 (1986). Ikuiseksi tekevät solulinjat ovat tavallisesti transformoituja nisäkässoluja, erityisesti jyrsijä-, nauta- ja ihmisperäisiä myeloo-masoluja. Useimmiten käytetään rotan tai hiiren myeloomasolulinjoja niiden help- 14 107926 pouden ja saatavuuden vuoksi. Tekniikat, joilla kyseisiä lymfosyyttejä saadaan kohdenatigeenillä indusoiduista nisäkkäistä, ovat yleisesti tunnettuja. Yleensä käytetään joko periferiaveren lymfosyyttejä (PBL), jos halutaan ihmisperäisiä soluja, tai pernasoluja tai imusolmukesoluja, jos halutaan muita nisäkäslähteitä 5 kuin ihmisiä. Isäntänisäkäs injisoidaan toistuvasti puhdistetun antigeenin annoksilla ja nisäkkään annetaan muodostaa haluttua vasta-ainetta tuottavia soluja, ennen kuin nämä kerätään ja fuusioidaan ikuiseksi tekevän solulinjan kanssa. Myös fuusiointitekniikat ovat alalla yleisesti tunnettuja. Yleensä näissä sekoitetaan solut fuusiointiaineen, kuten polyetyleeniglykolin kanssa. Hybridomat valitaan 10 vakiomenetelmillä, kuten HAT-selektoinnin avulla. Näistä hybridomista valitaan ne, jotka erittävät haluttua vasta-ainetta, so. ihmisen CSIF-faktorille spesifistä vasta-ainetta, analysoimalla niiden viljelyalusta normaalien immunomääritysten avulla, kuten Western blotting-menetelmällä, ELISA:lla, RIA:lla, CSIF:n neutra-lointikyvyn avulla tai vastaavasti. Vasta-aineet otetaan talteen alustasta käyttä-15 mällä normaaleja proteiinien puhdistustekniikoita, esimerkiksi Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985). Käytettävissä on monia viitteitä, jotka neuvovat edellä mainittujen tekniikoiden soveltamista, esimerkiksi Kohler et ai., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, . New York, 1980); Tijssen, Practice and,Theory of Enzyme Immunoassays (Else- ♦ ♦ « · » ***. 20 vier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, • · · ; J Amsterdam, 1984); Hurrell, MonoclonalHybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); ja vastaavat. Hybridomat, jotka * · · ***. tuottavat ihmisen CSIF:lle spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita, seulotaan sen • · ... jälkeen toisen kerran käyttämällä edellä kuvattuja CSIF-määrityksiä ja valitaan « · · * 25 hybridomat, jotka kykenevät salpaamaan tai neutraloimaan CSIF:n biologisen aktiivisuuden.

• ♦ ··· . , • · T Myös vasta-aineiden fragmenttien käyttäminen ja muodostaminen on yleisesti • · i *** tunnettua, esimerkiksi Fab-fragmentit: Tijssen, practice and Theory of Enzyme

• M

*···* 30 Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); ja Fv-fragmentit: Hochman etr ai.

Biochemistry, Voi. 12, s. 1130-1135 (1973), Sharon et ai., Biochemistry, Voi. 15, :\j s. 1591-1594 (1976) ja Ehrlich et ai., US-patentti 4,355,023; ja vasta-aineen puolimolekyylit: Auditore-Hargreaves, US-patentti 4,470,925.

15 107926

Keksinnön mukaisille hybridomille tunnusomaista vasta-aineita ja vasta-ainefrag-mentteja voidaan myös valmistaa rekombinanttitekniikalla uuttamalla lähetti-RNA, rakentamalla cDNA-kirjasto ja valitsemalla kloonit, jotka koodaavat vasta-ainemo-lekyylin segmenttejä, esimerkiksi Wall et ai., Nucleic Acids Research, Voi. 5, s.

5 3113-3128 (1978); Zakut et ai., Nucleic Acids Research, Voi. 8, s. 3591-3601 (1980); Cabilly et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., Voi. 81, s. 3273-3277 (1984); Boss et ai., Nucleic Acids Research, Voi. 12, s. 3791-3806 (1984); Amster et ai., Nucleic Acids Research, Voi. 8, s. 2055-2065 (1980); Moore et ai., US-patentti 4,642,334; Skerra et ai, Science, Voi. 240, s. 10389-1041 (1988); ja Huse et ai, Science, Voi. 10 246, s. 1275-1281 (1989). Tarkemmin sanoen tällaisia tekniikoita voidaan käyttää tuottamaan keskenään spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita, joissa jonkin lajin sitomisaiue on yhdistetty toisen lajin vasta-aineen ei-sitovan alueen kanssa niin, että immunogeenisyys pienenee, esimerkiksi Liu et ai., Proc. natl. Acad. Sei., voi. 84, s. 3439-3443 (1987).

15 IV. Puhdistaminen

Kun esillä olevan keksinnön mukaiset polypeptidit ekspressoidaan liukoisessa muodossa, esimerkiksi transformoitujen hiiva- tai nisäkässolujen erittyneenä tuot- • · · 20 teenä, ne voidaan puhdistaa alan normaaleilla menetelmillä, joihin kuuluu sellai- ·· set vaiheet kuin ammoniumsulfaattisaostus, ioninvaihtokromatografia, geelisuoda- • · . .·. tus, elektroforeesi, affiniteettikromatografia ja/tai vastaavat, esimerkiksi "Enzyme • * * .!!!: Purificaiton and Related Techniques", Methods in Enzymology, 22:233-577 • « (1977), ja Scopes, R., Protein Purificaiton: Principles and Practice (Springer- • · · 25 Verlag, New York, 1982) neuvovat tällaisia puhdistustapoja. Samalla tavoin kuin keksinnön mukaiset polypeptidit ekspressoidaan liukenemattomassa muodossa, • « .···, esimerkiksi aggregaatteina, inkluusio-osasina tai vastaavina, ne voidaan puhdis- taa alan standardimenetelmillä, mukaanlukien erottamalla inkluusio-osaset hajo- • · tetuista isäntäsoluista sentrifugoimalla, liuentamalla inkluusio-osaset kaotrooppi- • · **:** 30 silla ja pelkistävillä aineilla, laimentamalla liuennettu seos ja alentamalla kaotroop-·· : *·· pisen aineen ja pelkistimen konsentraatiota niin, että polypeptidi saa biologisesti • · aktiivisen konformaation. Jälkimmäisiä.menetelmiä on esitetty seuraavissa julkaisuissa, jotka on mainittu tässä yhteydessä viitteenä: Winkler et ai, Biochemistry, 25: 4041-4045 (1986); Winkler et ai, Biotechnology, 3: 992-998 (1985); Koths et 16 107926 ai, US-patentti 4,569,790; ja eurooppalaiset patenttihakemukset 86306917.5 ja 86306353.3.

CSIF voidaan puhdistaa nisäkässolujen, jotka on väliaikaisesti transfektoitu tai 5 stabiilisti transformoitu CSIF-geenin sisältävällä ekspressointivektorilla, viljelysu-pernatanteista. Mieluummin CSIF puhdistetaan COS 7-solujen, jotka on väliaikaisesti transfektoitu pcD ekspressointivesktörilla, viljelysupernatanteista. COS 7-solujen transfektointi pcD:lla tapahtuu seuraavasti. Yksi päivä ennen transfek-tointia siirrostetaan noin 106 COS 7 apinafeolua yksittäisille 100 mm maljoille DME 10 (Dulbecco's modified Eagle-alustaan)jossa on 10 % vasikansikiöseerumia ja 2 mM glutamiinia. Transfektoinnin suorittamista varten alusta imetään kultakin maljalta ja korvataan 4 ml:lla DME-alustäa, jossa on 50 mM tris.HCI pH 7,4 puskuria, 400 mg/ml DEAE-dekstraania ja 50 pg plasmidi-DNA:a. Maljoja inkuboi-daan 4 tuntia 37°C:ssa, minkä jälkeen DNA-pitoinen alusta poistetaan ja maljat 15 pestään kaksi kertaa 5 ml.lla seerumitonta DME-alustaa. DME lisätään takaisin maljoille, joita sen jälkeen inkuboidaan vielä 3 tuntia 37°C:ssa. Maljat pestään kerran DME.IIa, minkä jälkeen lisätään DME-alustaa, joka sisältää 4 % vasikansikiöseerumia, 2 mM glutamiinia, penisillriiiiä (100 μ/Ι) ja streptomysiiniä (100 pg/l) standardikonsentraatioissa. Tämän jälkeen soluja inkuboidaan 72 tuntia 37°C:- * · · 20 ssa, minkä jälkeen kasvualusta otetaan talteen CSIF:n puhdistamista varten.

·· J Transfektointi voidaan vaihtoehtoisesti suorittaa esimerkeissä kuvatulla elektropo-• * . raatiolla. Transfektointeihin tarvittava plasmidi-DNA saadaan kasvattamalla • · · pcD(SRa):a, jossa on CSIF cDNA-insertti, E. coli MC1061-kannassa Casadaban'- • ♦ in ja Cohen'in, J. Mol. Biol., Voi. 138, s. 179-207 (1980), kuvaamalla tavalla tai • · · 25 vastaavassa organismissa. Plasmidi-DNA eristetään viljelmistä standarditeknii-koilla, esimerkiksi Maniatis et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold • · .···, Spring Harbor Laboratory, New York; 1982).

* «·« ·· • ♦ : ** V. Geneettisesti rakennetut mtuantti-CSlF:it ··· -1 1 1 ..... 1 *·:·! 30 : *·· Heti, kun natiiville proteiinille on saatavissa informaatiota nukleiinihapposekvens-• # V*: sistä ja/taminohapposekvenssistä, käytettävissä on monia erilaisia tekniikoita käy tännöllisesti katsoen minkä tahansa mutaation aikaansaamiseen natiivisissa sekvenssissä, esimerkiksi Shortle, kirjassa Science, Voi. 229, s. 1193-1201 (1985; 17 107926

Zoller ja Smith, Methods in Enzymology, Vol. 100, s. 468-500 (1983); Mark et al., US-patentti 4,518,584; Wells etal., in Gene, Vol. 34, s. 315-323 (1985); Estell et al., Science, Vol. 233, s. 659-663 (1986); Mullenbach et al., J. Biol. Chem., Vol. 261, s. 719-722 (1986), ja Feretti et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 83, s. 597-603 5 (1986). Nämä julkaisut on siten mainittu tässä yhteydessä viitteenä.

Luonnon polypeptidin muteiinit voivat olla monissa olosuhteissa toivottavia. Esi-emrkiksi epäsuotavia sivuvaikutuksia voidaan pienentää tiettyjen muteiinien avulla, erityisesti, jos sivuvaikutuksen aktiivisuus liittyy polypeptidin eri osaan kuin ha-10 luttu aktiivisuus. Eräissä ekspressointisysteemeissä voi natiivi polypeptidi olla altis proteaasin hajottavalle vaikutukselle. Aminohappojen valitut substituutiot ja/tai deleetiot, jotka muuttavat näitä alttiita sekvenssejä, voivat tällaisissa tapauksissa merkittävästi parantaa saantoja, esimerkiksi brittiläinen patenttihakemus 2173-804-A, jossa ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattorin Arg-asemassa 275 on 15 korvattu Glyilia tai Glu:lla. Muteiinit voivat myös parantaa puhdistusmenetelmien saantoja ja/tai pidentää proteiinien säilytyksenkestävyyksiä poistamalla aminohapot, jotka ovat alttiita hapettumiselle, asylöitumiselle, avioitumiselle tai muille kemiallisille modifikaatioille. Esimerkiksimetioniinit hapettuvat helposti muodostaen sulfoksideja, mihin monissa proteiineissa liittyy biologisen aktiivisuuden häviä- • · · V\ 20 minen, esimerkiksi Brot ja Weissbach, Arch. Biochem. Biophys., Voi. 223, s. 271 * ·· (1983). Metioniinit voidaan usein korvata inertimmillä aminohapoilla niin, että • « biologista aktiivisuutta häviää vähän tai ei lainkaan, esimerkiksi australialainen • · · M'”; patenttihakemus AU-A-52451/86. Bakteeriperäisissä ekspressointisysteemeissä • · t...# voidaan saantoja joskus parantaa poistamalla tai korvaamalla konformationaali-« · · 25 sesti epäoleellisia kysteiiniryhmiä, esimerkiksi Mark et ai., US-patentti 4,518,584.

• · #...e Mutanttiproteiinien muodostamiseen käytetään mieluummin kasettimutageneesia.

*1* Rakennetaan synteettinen geeni, jonka.sekvenssissä on restriktioendonukleaasi- • # : ” kohtia suurin piirtein tasavälein pitkin geeniä; nämä restriktioendonukleaasikohdat • · *·;·* 30 valitaan niin, että ne pysyvät ainutkertaisina myös silloin, kun geeni on insertoitu : *·· sopivaan vektoriin. Nämä ainutkertaiset restriktiokohdat mahdollistavat geenin segmenttien tarkoituksenmukaisen irtileikkaamisen ja korvaamisen synteettisillä oligonukleotideillä, (so. "kaseteilla"), jotka koodaavat haluttuja mutaatioita. Ainutkertaisten restriktiokohtien lukumäärän ja jakaantumisen määrittämiseen liittyy 18 107926 useiden seikkojen huomioonottaminen, mukaanlukien (1) jo olemassa olevat restriktiokohdat ekspressoinnissa käytettävässä vektorissa, (2) halutaanko käyttää lajispesifistä tai sukuspesifistä kodon ia, (3) saatavissa olevien erilaisten vektoria katkaisemattomien restriktioendonukleaasien määrä (ja niiden monikerrat 5 synteettisessä geenissä) ja (4) helppous ja luotettavuus, jolla ainutkertaisten restriktiokohtien väliset segmentit syntetisoidaan ja/tai sekvensoidaan.

Edellä mainittu tekniikka on tarkoituksenmukainen tapa konservatiivisten amino-happosubstituutioiden ja vastaavien tekemiseen natiivin proteiinin sekvenssissä.

10 "Konservatiivisella" tarkoitetaan tässä yhteydessä (i) että muutokset ovat konfor-mationaalisesti mahdollisimman neutraaleja, so. tehty niin, että mutanttipolypepti-dien tertiäärisessä rakenteessa tapahtuu mahdollisimman vähän muutoksia verrattuna natiiviin proteiiniin ja (ii) että muutokset ovat antigeenisesti mahdollisimman neutraaleja, so. tehty niin, että mutanttipolypeptidien antigeenideterminan-15 teissä tapahtuu mahdollisimman vähän muutoksia natiiviin proteiiniin verrattuna. Konformationaalinen neutraalisuus on toivottavaa biologisen aktiivisuuden säilymisen kannalta, ja antigeeninen neutraalisuus on toivottavaa, jotta vältettäisiin immunogeenisten reaktioiden laukaiseminen potilaissa tai eläimissä, joita on hoidettu keksinnön mukaisilla yhdisteillä· Vaikkakin on vaikeaa absoluuttisella • · · 20 varmuudella valita, mitkä vaihtoehdot ovat konformationaalisesti ja antigeenisesti * ·· neutraaleja, on olemassa sääntöjä, joiden avulla alan ammattimiehet voivat tehdä • · muutoksia, joilla on suuri mahdollisuus olla konformationaalisesti ja antigeenisesti • · · neutraaleja, esimerkiksi Anfisen (viitattu edellä); Berzofsky, Science, Voi. 229, • · ..... s. 932-940 (1985); ja Bowie et ai, Science, Voi. 247, s. 1306-1310 (1990). Eräitä • · · 25 kaikkein tärkeimpiä sääntöjä ovat: (1) hydrofobisten ryhmien korvaaminen aiheut- ..... taa vähemmän todennäköisesti muutoksia antigeenisyydessä, koska ne todennä- • · ..... köisemmin sijaitsevat proteiinin sisäosassa, esimerkiksi Berzofsky (viitattu edellä) ja Bowie et ai. (viitattu edellä); (2) fysiokemiallisesti samankaltaisten, so. synonyy-misten ryhmien korvaaminen aiheuttaa vähemmän todennäköisesti konformatio- • · *···* 30 naalisia muutoksia, koska korvaavalla aminohapolla voi olla sama rakenteellinen {**·· tehtävä kuin korvatulla aminohapolla; ja (3) kehityksellisesti konservoituneiden • · !/·· sekvenssien muuttaminen aiheuttaa todennäköisesti haitallisia konformaatiovai- kutuksia, koska kehityksellinen säilyminen viittaa siihen, että sekvenssit voivat olla funktionaalisesti tärkeitä. Näiden muteiinisekvenssien selektoinnin perussääntö- 19 107926 jen lisäksi on käytettävissä määritysmenetelmiä, joilla varmistetaan rakennettujen molekyylien biologinen aktiivisuus ja kohformaatio. Konformaatiomuutoksia voidaan testata ainakin kahdella yleisesti tunnetulla menetelmällä: Mikrokomple-menttifiksaatio-menetelmä, esimerkiksi Wasserman et ai., J. Immunol., Voi. 87, s. 5 290-295 (1961), tai Levine et ai. Methods in Enzymology, Voi. 11, s. 928-936 (1967) käytetään laajalti proteiinien evoluutiotutkimuksissa; ja affiniteettejä konformaatiospesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden ryhmille, esimerkiksi Lewis et ai., Biochemistry, Voi. 22, s. 948-954 (1983).

10 VI. Ihmisen CSIF-peptidivasta-aineet f

Keksintö käsittää peptidit, jotka ovat peräisin ihmisen CSIF-faktorista, ja immuno-geenit, jotka käsittävät konjukaatteja kantajien ja keksinnön mukaisten peptidien välillä. Tässä yhteydessä käytettynä nimitys "immunogeeni" viittaa aineeseen, 15 joka kykenee aiheuttamaan immuunireaktion. Nimitystä "kantaja" käytetään tässä yhteydessä viittaamaan mihin tahansa aineeseen, joka kemiallisesti keksinnön mukaiseen peptidiin konjugoituna, mahdollistaa isäntäorganismin immunisoinnin saadulla konjugaatilla niin, että muodostuu konjugoidulle peptidille spesifisiä vasta-aineita. Kantajiin kuuluvat punaiset verisolut, bakteerifaagit, proteiinit ja 20 synteettiset partikkelit, kuten agaroosihelmet. Kantajat ovat mieluummin proteiine-ja, kuten seerumialbumiini, gamma-globuliini, KLH (keyhole limpet hemocyanin), tyroglobuliini, ovalbumiini, fibrinogeeni.ja vastaava.

• · · • · · • · · ·· r · ·

Keksinnön mukaiset peptidit sysnteisoidaan standarditekniikoilla, esimerkiksi v : 25 Stewart ja Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. painos (Pierce Chemical

Company, Rockford, IL, 1984). Mieluummin käytetään kaupallista peptidien ♦ syntetisointilaitetta, esimerkiksi Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA)-yhtiön ··♦ *...: mallia 430A. Keksinnön mukaiset peptidit kootaan kiinteässä faasissa tapahtuvan synteesin avulla ristisidotulle polystyreenitukiaineelle alkamalla pääteaseman kar- :***: 30 boksyyliryhmästä ja lisäämällä askelittaan aminohappoja, kunnes koko peptidi on ··· muodostettu. Seuraavissa viitteissä on opastettu synteesissä käytettyä kemiaa: \#. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., Voi. 85, s. 2149 (1963); Kent et ai., s. 185, kirjas- • ·♦ sa Peptides 1984, Ragnarsson, toim. (Almquist ja Weksell, Tukholma, 1984);

Kent et ai., s. 217, kirjassa Peptide Chemistry 84, Izumiya, toim. (Protein 20 107926

Research Foundation, B.H. Osaka, 1985); Merrifield, Science, Vol. 232, s.

341-347 (1986); Kent, Ann. Rev. Biocbem., Vol. 57, s. 957-989 (1988), ja näissä kahdessa viimeisessä viitteessä mainitut julkaisut.

5 Kiinteässä tilassa tapahtuvassa synteesissä on erittäin tärkeää poistaa synteesin sivutuotteet, jotka ovat pääasiallisesti terminaatio-, deleetio- tai modifikaatiopepti-dejä. Useimmat sivureaktiot voidaan poistaa tai minimoida käyttämällä puhtaita, hyvin karaketerisoituja hartseja, puhtaita aminohappojohdoksia, puhtaita liuottimia ja valitsemalla oikeat kytkentä- ja lohkaisumenetelmät ja reaktio-olosuhteet, esi-10 merkiksi Barany ja Merrifield, The Peptides> Cross ja Meienhofer, toim., Voi. 2, s. 1-284 (Academic Press, New York,;1979)· Kytkentäreaktioiden seuraaminen on tärkeää, jotta voitaisiin todeta, ovatko ne edenneet loppuun asti, jolloin vältetään yhdestä tai useammasta ryhmästä poisjäävät deleetiopeptidit. Kvantitatiivinen ninhydriinireaktio on tässä tarkoituksessa hyödyllinen: Sarin et ai., Anal. Biochem. 15 Voi. 117, s. 147 (1981). Na-t-butyylioksikarbonyyli (t-Boc)-aminohappoja käytetään sopivien sivuketjuja suojaavien ryhmien kanssa, jotka ovat stabiileja ketju-koosteen olosuhteissa, mutta labiileja vahvoilla hapoilla. Suojatun peptidiketjun kokoamisen jälkeen suojaryhmät poistetaan ja peptidin ankkurointisidos katkaistaan käyttämällä alhainen konsentraatio vedetöntä fluorivetyä ja sen jälkeen 20 korkea konsentraatio tioesteri-sieppacinJäsnäollessa: Tam et ai., J. Amer. Chem. Soc., Voi. 105, s. 6442 (1983). Sopivat sivuketjun suojaryhmät, joita voidaan *"*·· käyttää, on annettu kyseessä olevan aminohapon kolmikirjaimisella lyhennyksellä, jota suojaryhmä seuraa suluissa: Asp.(QBzl), Glu(OBzl), Ser(Bzl), Thr(Bzl), Lys(CI-Z), Tyr(Br-Z), Arg(NGTos), Cys(4-MeBzl) ja His(lmDNP). (Bzl = bentsyyli, • · · v · 25 Tos = tolueenisulfoksyyli; DNP = dinitrofenyyli; Im “ imidatsoli; Z = bentsyylioksi- karbonyyli). Jäljelle jääneissä aminohapoissa ei ole sivuketjun suojaryhmiä. Jokai- “*** sessa syklissä (t-BoC Na)-suojattu peptidihartsi altistetaan 65-prosenttiselle • « · trifluorietikkahapolle (Eastman Kodak) (tislattu ennen käyttöä) dikloorimetaanissa * (DCM), (Mallenckrodt): Ensin 1 minuutin ajan ja sen jälkeen 13 minuuttia Na-suo- ;***: 30 jaryhmän poistamiseksi. Peptidihartsi pestään DCM:ssa ja neutraloidaan kaksi ··· ..* kertaa 10-prosenttisella di-isopropyylietyyliamiinilla (DIEA) (Aldrich) dimetyyliform-

• M

s, . amidissa (DMF) (Applied Biosystems), kulloinkin 1 minuutin ajan. Neutraloinnin • · · jälkeen pestään DMF:lla. Kytkentä suoritetaan aminohapon symmetrisen anhydri-din kanssa DMF:ssa 16 minuutin aikana. Symmetrinen anhydridi valmistetaan 21 107926 syntetisointiiaitteessa liuottamalla 2 mmol aminohappoa 6 ml:aan dikloorimetaa-nia ja lisäämällä 1 mmol disykloheksyylikarbodi-imidiä (Aldrich) 2 ml:ssa DCM:a.

5 minuutin kuluttua aktivoitu aminohappo siirretään erilliseen astiaan ja DCM haihdutetaan jatkuvan typpikaasupuhalluksen avulla. DCM korvataan DMF:lla 5 (yhteensä 6 ml) eri vaiheissa puhaltamisen aikana. Ensimmäisen kytkennän jälkeen peptidihartsi pestään DCM:lla, 10-prosenttisella DIEAilla DCM:ssa ja sen jälkeen DCM:lla. Uudelleenkytkentää varten siirretään sama happoja aktivointi-aineena toimiva disykloheksyylikarbodi-imidi peräkkäin reaktioastiaan. In situ tapahtuvan aktivoinnin ja 10 minuutin kytkennän jälkeen lisätään niin paljon dime-10 tyyliformamidia, että saadaan 50-prosenttinen DMF-DCM-seos ja kytkentää jatketaan 15 minuuttia. Arginiini kytketään hydroksibentsotriatsoli (Aldrich)-esterinä dimetyyliformamidissa 60 minuutin ajan ja sen jälkeen kytketään uudelleen samalla tavoin kuin muut aminohapot. Asparagiini ja glutamiini kytketään kaksi kertaa hydroksibentsotriatsoliestereinä dimetyyliformamidissa, kulloinkin 40 mi-15 nuutin kytkentäajan kuluessa. Kaikkien ryhmien tapauksessa hartsi pestään toisen kytkennän jälkeen ja automaattisesti otetusta näytteestä seurataan jäljelle jäänyttä kytkeytymätöntä α-amiinia kvahtitativiisen ninhydridiini-reaktion avulla, Sarin et ai. (viitattu edellä). ky^ ·.·.· 20 Synteettisten peptidien kantajaan kytkennän yleistekniikkaa on kuvattu useissa • · kirjallisuusviiteissä, esimerkiksi Walter ja; Doolittle, "Antobodies Against Synthetic

Peptides", kirjassa Setlow et ai., toim. :Genetic Engineering, Voi. 5, s. 61-91

Ml·* (Plenum Press, N.Y., 1983); Green et aLGell, Voi. 28, s. 477-487 (1982); Lerner et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., Voi. 78, s^ 3403-3407 (1981); Shimizu et ai., US- : 25 patentti 4,474,754; ja Ganfield et ai., USrpatentti 4,311,639. Nämä julkaisut on siten mainittu tässä yhteydessä viitteenä. ^Lisäksi tekniikat, joilla kytketään hap- teeneja kantajiin, ovat oleellisesti samoja kuin edellä mainitut tekniikat, esimerkik- si kappale 30 Tijsseu'in kirjassa Practice and Theory of Enzyme Immunoassays ·*·,, (Elsevier, New York, 1985). Neljä kaikkein yleisimmin käytettyä suunnitelmaa .*··. 30 peptdin kantajaan kiinnittämiseksi ovat (.1) glutaraldehydi aminon kytkentää var- ··· ./ ten, esimerkiksi Kagan and Glick, kirjassa Jaffe and Behrman, toim. Methods of • · · \# . Hormone Radioimmunoassays, s. 328-329 (Academic Press, N.Y., 1979), ja ” Walter et ai. Proc. Nat. Acad. Sei., Voi. 77, s. 5197-5200 (1980); (2) vesiliukoiset karbodi-imidit karboksyylin kytkemiseksi aminoon, esimerkiksi Hoare et ai., 22 107926 J. Biol. Chem., Vol. 242, s. 2447-2453 (1967); (3) bis-diatsobentsidiini (DBD) tyrosiinin kytkemiseksi tyrosiinisivuketjuun, esimerkiksi Bassiri et a!., s. 46-47, kirjassa Jaffe ja Behrman, toim. (viitattu edellä), ja Walter et ai. (viitattu edellä); ja (4) maleimidobentsoyyli-N-hydroksisukkinimidiesteri (MBS) kysteiinin (tai 5 muiden sulfhydryylien) kytkemiseksi aminoryhmiin, esimerkiksi Kitagawa et ai., J. Biochem. (Tokio), Voi. 79, s. 233-239 (1976) ja Lerner et ai. (viitattu edellä). Yleissääntö, jolla valitaan sopiva menetelmä tietyn peptidin kytkemiseksi prote-iinikantajaan, voidaan ilmoittaa seuraavasti: Kiinnittämiseen liittyvän ryhmän tulisi esiintyä vain kerran sekvenssissä, mieluummin segmentin oikeassa päässä.

10 Esimerkiksi bis-diatsobentsidiiniä ei tulisi käyttää, jos sekvenssin pääosassa, joka on valittu potentiaalisen antigeenisen luonteensa vuoksi, esiintyy tyrosiiniryhmä. Samoin keskellä sijaitsevat lysiinit sulkevat pois glutaraldehydimenetelmän ja asparagiini- ja glutamiinihappojen esiintymisen sulkevat usein pois karbodi-imidi-tien. Toisaalta sopivia ryhmiä voi sijaita valitun sekvenssisegmentin kummassa 15 päässä tahansa kiinnityskohtina, riippumatta siitä, esiintyykö niitä "natiivissa" pro-teiinisekvenssissä. Amino-ja karboksipäiden vastaisesti sisäiset segmentit eroavat merkittävästi "kiinnittymättömässä päässä" samasta sekvenssistä, jollaisena se on natiivissa proteiinissa, kun polypeptidirunko on jatkuva. Ongelmalta voidaan jossakin määrin välttyä asetyloimalla α-aminohappo ja sen jälkeen kiinnittämällä ·.·): 20 peptidi karboksipäänsä avulla. Kytkennän tehokkuus kantajaproteiiniin voidaan tarkoituksenmukaisesti mitata käyttämällä:radioaktiivisesti leimattua peptidiä, joka ·:··: on valmistettu joko käyttämällä yhdessä^synteesivaiheessa radioaktiivista amino- happoa tai leimaamalla valmiiksi tehty.peptidi jodaamalla tyrosiiniryhmä. Tyrosii-nin mukanaolo peptidissä mahdollistaa myös haluttaessa herkän radioimmuno-·,· · 25 menetelmän kehittämisen. Tyrosiini voidaan sen vuoksi liittää pääteryhmänä, jos se ei ole osa natiivin polypeptidin määrittelemästä peptidisekvenssistä.

***** • · · *...: Proteiinit ovat suositeltuja kantajia, ja suositeltuihin proteiinikantajiin kuuluvat naudanseerumialbumiini, myoglobuliini, pvalbumiini (OVA), KLH (keyhole limpet .***. 30 hemocyanin) ja vastaavat. Peptidit voidaan kytkeä KLH-proteiiniin MBS:n avulla • · « kysteiinien kautta Liu'n et ai., Biochemistry, Voi. 18, s. 690-697 (1979), kuvaamal- • ·« \ . la tavalla. Peptidit liuotetaan fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (pH 7,5), • ♦ · * * 01 M natriumboraattipuskuri (pH 9,0) tai 1,0 M natriumasetaattipuskuri (pH 4,0).

Peptidin liukoisuus optimoidaan peptidin liuottamiseen valitun pH-arvon avulla.

107926 • *'v -- V : 23

Vapaan kysteiinin määrä liukoisia peptidejä varten määritetään Ellman'in menetelmällä, Ellma, Arch. Biochem. Biophys., Voi. 82, s. 7077 (1959). Jokaisen peptidin tapauksessa saatetaan 4 mg KLH:a 0,25 ml.ssa 10 mM natriumfosfaattipus-kuria (pH 7,2) reagoimaan 0,7 mg:n kanssa MBS-esteriä (liuotettu dimetyyliforma-5 midiin) ja sekoitetaan 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. MBS:n tipottain tapahtuvalla lisäämisellä varmistetaan, että formamidin paikallinen konsentraatio ei ole liian korkea, koska KLH on liukenematon yli 30-prosenttiseen formamidiin.

Sen jälkeen reaktiotuote, KLH-MBS, johdetaan vapaan MBS:n poistamiseksi Sephadex G-25:n läpi, joka on tasapäinöitettu 50 mM natriumfosfaattipuskurilla 10 (pH 6,0). Pylvään huippujakeista (seuranta optisella tiheydellä OD 280) KLH:n talteenotoksi arvioidaan noin 80 %. Sen jälkeen KLH-MBS saatetaan reagoimaan 5 ml:n kanssa peptidiä, joka on liuotettu 1 ml:aan valittua puskuria. pH säädetään arvoon 7 - 7,5 ja reaktiosta sekoitetaan 3 tuntia huoneen lämpötilassa. Kytkennän tehokkuutta seurataan radioaktiivisen peptidin avulla dialysoimalla konjugaatin 15 näyte fosfaattipuskuroitua suolaliuosta vasten. Se ulottui 8-60 %. Kun peptidi-kantajakonjugaatti on käytettävissä, valmistetaan polyklonaalisia tai monoklonaali-sia vasta-aineita standardimenetelmillä, esimerkiksi Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, New ΥθΓΐφΤ1984); Hurrell, toim. Monoclonal Hybrido-ma Antibodies: Tehniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); ..:): 20 Schreier et al. Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); US-patentti 4,562,003; tai vastaavasti. Erityisesti US-patentti 4,562,003 on *:*·: mainittu tässä yhteydessä viitteenä.

• ♦ · ♦ · · ··· *:**: Sekä polyklonaaliset että monoklonaaliset vasta-aineet voidaan seuloa ELISA- :T: 25 menetelmällä. Kuten muutkin kiinteän faasin immunomääritykset, testi perustuu makromolekyylien taipumukseen adsorboitua epäspesifisesti muoviin. Tämän *:**: reaktion irreversibiilisyys ilman immunologisen aktiivisuuden häviämistä mahdol- *”): listaa antigeeni-vasta-aine-kompleksien muodostamisen ja tällaisten kompleksien :\ yksinkertaisen erottamisen sitoutumattomasta aineesta. Antipeptidiseerumin .·*·. 30 titraamiseksi adsorboidaan peptidi, joka on konjugoitu erilaiseen kantajaan kuin ··· ..· mitä immunisoinnissa on käytetty, 96-kaivoisen mikrotiitterilevyn kaivoihin. Sen • · *. jälkeen annetaan adsorboidun antigeenin reagoida kaivoissa anti-peptidiseerumin « « · • ·* ’ ’ laimennusten kanssa. Sitoutumaton vasta-aine pestään pois ja jäljelle jääneiden antigeeni-vasta-aine-kompleksien annetaan reagoida immunisoidun eläimen 24 107926

IgGille spesifisen vasta-aineen kanssa. Tämä toinen vasta-aine konjugoidaan entsyymiin, kuten alkaliseen fosfataasiin. Näkyvä värillinen reaktiotuote, joka muodostuu entsyymisubstraattia lisättäessä, osoittaa, missä kaivoissa on sitoutuneita antipeptidi-vasta-aineita. Peptidille spesifisen vasta-aineen sitoutunut määrä 5 voidaan paremmin saada selville määrällisesti käyttämällä spektrofotometrin lukemia. Korkeatiitteriset antiseerumin antavat suoran titrauskäyrän laimennusvälille 10"3 ja 10'5.

ESIMERKIT

10

Seuraavat esimerkit havainnollistavat esillä olevaa keksintöä. Vektoreiden ja isäntien valinnat sekä reagenssien konsentraatio, lämpötilat ja muiden muuttujien arvot on annettu ainoastaan esimerkkeinä esillä olevan keksinnön mukaisesta soveltamisesta, eikä niitä tule pitää keksintöä rajoittavina.

15 ; -

Esimerkki I. Hiiren CSIF:n biologiset aktiivisuudet

Useista T-soluklooneista saatiin hiiren CSIF-faktoria sisältäviä supernatantteja inkuboimalla T-soluklooneja (5 x 106 solua/ml) 24 tuntia seerumittomassa alustas- .j'‘: 20 sa (RPMI 1640 ilman fenolipunaista, mutta sisältää 0,05 mM 2-merkaptoetanolia ja 20 mM HEPES) ja konkanavaliini A:a (5} pg/ml). Näihin klooneihin kuuluivat *:**: seuraavat solulinjat: D9, kuvattu US-pätentissa 4,613,459, D10 (kuvattu jäljempä- nä), MB2-1, kuvattu lehdessä Mosmann et ai. J. Immunol., Voi. 136, s. 2348-2357 (1986), CDC25 ja CDC35, kuvattu lehdessä Tony et ai. J. Exp. Med. Voi. 161, s.

v : 25 223 (1985), ja M411-2 ja M411-6. T-solUjen supernatanteista määritettiin niiden kyky alentaa γ-interferonin synteesiä solulinjassa HDK-1, kuvattu lehdessä *ϊ*·ί Cherwinski, et ai. J. Exp. Med., Voi. 166; S. 1229-1244 (1987). Kunkin T-soluk- loonin näytteistä valmistettiin kaksinkertaiset sarjalaimennukset 96-kaivoisissa ( tasapohjaisissa mikrotiitterilevyissä tilavuuden ollessa 0,05 ml. HDK-1-soluja .**·. 30 (5 x 104 solua/kaivo) sekä säteilyettyjä (2500 R) syngeenisiä APC-soluja (perna- ··· soluja 5 x 105 solua/kaivo) ja antigeeniä (KLH, keyhole limpet hemocyanin « · · \#. 150 pg/ml) lisättiin 0,15 ml. Näytteisiin, joiden epäiltiin sisältävän IL-4:a, lisättiin • · · 11B11 anti-IL-4-vasta-ainetta (10 pg/ml), kuvattu julkaisussa Ohara et ai., Nature, Voi. 315, s. 333-336 (1985). Inkuboitiin 24 tuntia 37°C:ssa, minkä jälkeen super- .. .25 107926 natantit otettiin talteen ja pidettiin 4°C:ssa alle viikon tai -80°C:ssa pidempiä aikoja. IFN-γιη määrät analysoitiin kaksipuolisella kerros-ELISA-menetlemällä käyttämällä rotan anti-hiiri IFN-y-monoklonaalista vasta-ainetta, XMG1.2, ja affiniteetti-puhdistettua kaniinin anti-hiiri-IFN-y-vasta-ainetta. IFN-γ.η synteesin inhibitio on 5 esitetty kuviossa 1 prosentteina kontrolliarvoista.

D10-solujen tuottama CSIF puhdistettiin osittain ja vietiin kahteen eri T-solukloo- niin tarkoituksella tutkia sytokiinin synteesin inhibitiota CSIF:n konsentraation funktiona. Osittain puhdistettu CSIF valmistettiin seuraavasti: 1 - 2,5 litran erät 10 konkanavaliini A:Ha indusoitua D10-supernatanttia väkevöitiin noin 10-kertaiseksi käyttämällä Amicon YM-5-membraaneja: (Amicon Corp-, Danvers, MA), johdettiin 5 ml:n mannoosi-konjugoidun agaroosipylvään läpi (E-Y Laboratories, San Mato, CA) ja sen jälkeen edelleen väkevöitiin vielä 3-5-kertaiseksi niin, että loppukon- sentraatio oli 30-50-kertainen. Tämä materiaali puhdistettiin edelleen kahdessa 15 vaiheessa suuren suroituskyvyn nestekromatografian avulla: Ensiksi hydroksyyli- apatiitti-pohjaisen pylvään läpi (Bio-GelHPHT, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) ja sen jälkeen geelisuodatuspylvään-läpi (TSK-G 3000 SW, pituus 60 cm, LKB Instruments, Gaithersburg, MD). Yhtä tällaista osittain puhdistettua CSIF- panosta pidettiin erinä -80°C:ssa ja käytettiin CSIF-aktiivisuuden standardina.

20 Alussa määritettynä tämä valmiste inhiboi noin 50 % γ-interferonin muodostumis- ta 1/200 laimennoksena 0,2 ml:n määritystilavuudessa, ja siten standardiyksiköksi *:*·: määriteltiin antamalla CSIF-standardivalmisteelle arvoksi 1000 U/ml. Kussakin jäljempänä esitetyssä määrityksessä kvantatisoitiin CSIF-aktiivisuus tuntematto- *:**: missä näytteissä vertaamalla tuntemattoman näytteen IFN-y:n synteesiä inhiboi- :T: 25 vaa vaikutusta standardiin. T-solukloonit,:jöista sytokiinin synteesin inhibitio määritettiin, olivat HDK-1 (kuvattu edellä) ja MD13-10, kuvattu julkaisussa Cell.

*:**: Immunol., Voi. 97, s. 357 (1986). IL-3- ja .GM-CSF-pitoisuuksien määrittämistä ·;;> varten käsiteltiin osittain puhdistettu C$>!F edelleen johtamalla se anti-IL-3- ja anti- GM-CSF-affiniteettipylväiden läpi. Vasta^aineet 0,1 M NaCI, 0,1 M HEPES, ja .**·. 30 0,08 M CaCI2-liuoksissa kytkettiin Affi-Gel 10:een (Bio-Rad) 4°C:ssa varovasti ·♦· sekoittaen 4 tuntia. Kukin 1 - 2 ml:n pylväs sisälsi noin 10 - 20 mg kytkettyä vasta- • · • · · *. . ainetta.

• ♦ · • ·♦ • ♦ 26 107926 IFN-γιη tuotto estyi kummassakin kloonissa, kuten näkyy seuraavasta taulukosta. Muiden sytokiinien, so. IL-2:n, lymfotoksiinin, IL-3:n ja GM-CSF:n, synteesi inhiboitu! vähemmän tai ei lainkaan MD13-10-soluissa.

5 TAULUKKO

Solulinja_Sytokiini_ % kontrollin synteesitasosta_ _14 U/ml 42 U/ml_125 U/ml HDK-1 IFN-y 47,6 29,1 18,6 IL-2 71,7 59,6 40,4 10 lymfotoksiini 41,9 45,1 42,8 IL-3 63,9 52,6 38,4 GM-CSF 86,9 79,1 66,8 MD13-10 IFN-y 36,0 27,5 23,2 15 IL-2 _ 88,2 109,3 96,0 IL-3 60,2 63,0 51,0 _GM-CSF_109,0_119,9_97,6 . Esimerkki II. cDNA-kiriaston rakentaminen D10-soluista ia pcD(SRg)-F115-kloo- • · 20 nin eristäminen • · · • ·· • · CDNA-kirjasto rakennettiin D10-soluista saadusta mRNA:sta pcD(SRa)-vektoris- • · · ***. sa, kuvattu lehdessä Kaye et ai, J. Exp. Med., Voi. 158, s. 836 (1983) Okayama'n !..* ja Bergin, Mol. Cell. Biol. 2: 161-170 (1982) ja 3: 280-289 (1983), menetelmän • · * • · · * 25 mukaisesti, esitetty myös US-patentissa 4,695,542, joka tässä yhteydessä on . mainittu viitteenä. cDNA-inserttejä sisältävät pcD(SRa)-vektorit monistettiin • · .....

... e. coli'ssa. Plasmidi-DNA uutettiin näiden mielivaltaisesti valittujen kloonien yhdis- • m *:* tetyistä lähteistä ja sillä transfektoitiin jäljempänä kuvatulla avalla COS 7-apina- ·· : ’·· solut. COS 7-viljelmien supernatantit testattiin sen jälkeen CSIF-aktiivisuuden ·«·

30 suhteen. COS-solut transfektoitiin seuraavasti: 1 päivä ennen transfektointia :*·.. siirrostettiin noin 1,5 x 106 COS 7-apinasolua yksittäisille 100 mrrv.n maljoille DME

(Dulbecco's modified Eagle)-alustaa, joka sisälsi 5 % vasikan sikiöseerumia (FCS) ja 2 mM glutamiinia. Transfektoinnin suorittamista varten poistettiin COS

27 107926 7-solut maljoilta inkuboimalla trypsiinin kanssa, pestiin kaksi kertaa seerumitto-massa DME-alustassa ja suspendoitiin 107 solua/ml konsentraatiossa seerumitto-maan DME-alustaan. 0,75 ml:n suuruinen erä sekoitettiin 20 pg:n kanssa DNA:a ja siirrettiin steriiliin 0,4 cm elektroporaatiokyvettiin. 10 minuutin kuluttua soluja 5 passitettiin BioRad Gene Pulser-yksikössä 200 voltin jännitteellä ja 960 pF kapasitanssilla. Seuraavan 10 minuutin kuluttua solut poistettiin kyvetistä ja lisättiin 20 ml:aan DMe-alustaa, joka sisälsi 5 % vasikansikiöseerumia, 2 mM glutamiinia, penisilliiniä, streptomysiiniä ja gentamysiiniä. Seos jaettiin neljälle 100 mm kudos-viljelymaljalle. Seosta pidettiin 12 - 24 tuhtia 37°C:ssa, 5 % C02, minkä jälkeen 10 alusta korvattiin samalla alustalla, joka sisälsi vain 1 % vasikansikiöseerumia, ja inkubointia jatkettiin vielä 72 tuntia 37pCissa, 5 % COz, minkä jälkeen alusta otettiin talteen ja siitä määritettiin CSIF-aktiivisuus. Tämän jälkeen pCD(SRa)-F115:n cDNA-insertin suurimman avoimen lukukehyksen sekvenssin määritys antoi tulokseksi: 15

51- ATGCACAGCT CAGCACTGCT CTGTTGCCTG GTCCTCCTGA CTGGGGTGAG

GGCCAGCCCA GGCCAGGGCA CCCAGTCTGA GAACAGCTGC ACCCACTTCC

GAGGCAACCT GCCTAACATG CTTCGAGATC TCCGAGATGC CTTCAGCAGA

GTGAAGACTT TCTTTCAAAT GAAGGATCAG CTGGACAACT TGTTGTTAAA 20 GGAGTCCTTG CTGGAGGACT TTÄÄGGÖTTA CCTGGGTTGC CAAGCCTTGT

V..: CTGAGATGAT CCAGTTTTAC CTGGAGGAGG TGATGCCCCA AGCTGAGAAC

CAAGACCCAG ACATCAAGGC GCATGTGAAC TCCCTGGGGG AGAACCTGAA ····· GACCCTCAGG CTGAGGCTAC GGCGCTGTCA TCGATTTCTT CCCTGTGAAA

. .·. ACAAGAGCAA GGCCGTGGAG CAGGTGAAGA ATGCCTTTAA TAAGCTCCAA

25 GAGAAAGGCA TCTACAAAGC CATGAGTGAG TTTGACATCT TCATCAACTA

CATAGAAGCC TACATGACAA TGAAGATACG AAACTGA -3'

• · I

• · ·

Heijne'n algoritmilla määritetty hiiren valmis CSIF-proteiinin aminohapposekvenssi on seuraavanlainen: ··· V 30

f*.. QYSREDNNCT HFPVGQSHML LELRTAFSQV KTFFQTKDQL

•\ J DNILLTDSLM QDFKGYLGCQ ALSEMIQFYL VEVMPQAEKH

:**. GPEIKEHLNS LGEKLKTLRM RLRRCHRFLP CENKSKAVEQ

« · · VKSDFNKLQD QGVYKAMNEF DIFINCIEAY MMIKMKS.

• · 35 28 107926

Esimerkki III. cDNA-kiriastoien seulominen ihmis-CSIF:n suhteen käyttämällä pcD(SRaVF115:sta saatuja koettimia: pH5C:n ia pH15C:n eristäminen 5 cDNA-kirjasto, joka oli rakennettu ihmisen T-solukloonista uutetusta mRNA:sta pcD(SRa):ssa, seulottiin kokoelmalla 70-mer oligonukleotidejä, joiden sekvenssit olivat komplementtisia valmista CSIF:a koodaavan hiiren CSIF-geenin fragmentin koodaavien ja ei-koodaavien säikeiden kanssa. Hybridisoinnissa käytettiin stan-dardiprotokollia, esimerkiksi 150 mm petrimaljoilla kasvatetut bakteeripesäkkeet 10 siirrettiin GeneScreen-membraaneille, käsiteltiin radioaktiivisesti leimatuilla oligo-nukleotidikoettimilla, pestiin ja sen jälkeen valotettiin röntgenfilmillä. Koettimet hybridisoitiin alhaisen stringenttiyden olosuhteissa koettimien pituuden suhteen: esihybridisoinnissa inkuboitiin nukleiinihappokohteita 5X SETrssa (20X SET on 3 M NaCI + 0,4 Tris-CI (pH 7,8) + 20 mM EDT) 60°C:ssa, minkä jälkeen hybridi-15 soitiin samoissa olosuhteissa ja pestiin 5X SET:ssa 50°C:ssa. Tunnistettiin kaksi kloonia, joissa oli plamsidit pH5Cja pH15C. Molemmat plasmidit ekspressoivat COS 7-soluissa proteiineja, jotka kykenivät inhiboimaan IFN-γιη synteesin PHAilla stimuloiduissa ihmisen PBL-soluissa. pH15C:n cDNA-insertti on esitetty kuviossa 4 ja sen suurimman avoimen lukukehyksen nukelotidisekvenssi on annettu seu- . 20 raavassa: ··« • · • · · • t • ·

·:··: 5'- ATGCACAGCT CAGCACTGCT CTGTTGCCTG GTCCTCCTGA CTGGGGTGAG

. GGCCAGCCCA GGCCAGGGCA CCCAGTCTGA GAACAGCTGC ACCCACTTCC

GAGGCAACCT GCCTAACATG cttcgagatc tccgagatgc cttcagcaga

25 GTGAAGACTT TCTTTCAAAT GAAGGATCAG CTGGACAACT TGTTGTTAAA

*.! ** GGAGTCCTTG CTGGAGGACT TTAÄGGGTTA CCTGGGTTGC CAAGCCTTGT

CTGAGATGAT CCAGTTTTAC CTGGAGGAGG TGATGCCCCA AGCTGAGAAC

·:··: CAAGACCCAG ACATCAAGGC GCATGJGAAC TCCCTGGGGG AGAACCTGAA

.·1·. GACCCTCAGG CTGAGGCTAC GGCGQTGTCA TCGATTTCTT CCCTGTGAAA

*·1 30 ACAAGAGCAA GGCCGTGGAG CAGGTGAAGA ATGCCTTTAA TAAGCTCCAA

··

: ’** GAGAAAGGCA TCTACAAAGC CATGAGTGAG TTTGACATCT TCATCAACTA

*·.1,.1· CATAGAAGCC TACATGACAA TGAAGATACG AAACTGA -3' • · • · • · · · • · · • ·· • · 29 107926

Esimerkki IV. CSIF.IIe spesifiset monoklonaaliset vasta-aineet

Lewis-urosrotta immunisoidaan COS7-soluissa ekspressoidun ihmisen CSIF:n puolittain puhdistetuilla valmisteilla. Rotta immunisoidaan ensin noin 50 pgilla 5 ihmisen CSIF:a Freund'in täydellisessä apuaineessa ja immunisointia tehostetaan kaksi kertaa samalla ainemäärällä Freund'in epätäydellisessä apuaineessa. Verta valutetaan testeihin. Eläimelle annetaan viimeinen 25 pg suuruinen tehostusan-nos fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa ja neljän päivän kuluttua poistetaan perna fuusiontia varten.

10

Noin 3x10® rotan pernasyyttiä fuusioidaan yhtä suuren määrän kanssa P3X63-AG8.653 hiiren myeloomasoluja (saatavissa ATCC-sta taliennusnumerolla CRL 1580). 3840 mikrotiitterilevyn kaivoa siirrostetaan 5,7 x 104 parenteraalisella mye-loomasolulla/kaivo. Fuusioinnissa ja myöhemmässä hybridien viljelyssä noudate-15 taan standardiprotokollia, esimerkiksi Chretien et ai, J. Immunol. Meth., Voi. 117, s. 67-81 (1989). 12 päivän kuluttua fuusioinnin jälkeen supernatantit kerätään ja sulotaan epäsuoralla ELISA-menetelmällä PVC-maljoilla, jotka on päällystetty COS7-soluissa tuotetulla ihmisen CSIF:lla. Tällä tavoin tunnistettiin Hybridoma JES3-19FI, joka tallennettiin American Type Culture Collection-kokoelmaan.

-.0 20 • · V*i Aluksi seulotuista hybridomeista valitaan.blokkaavia vasta-aineita tuottavat hybri-domat niiden kyvyn perusteella tuottaa vasta-aineita, jotka vaikuttavat CSIFrlla indusoidun IFN-y.n synteesin inhibition vastaisesti PHA:lla stimuloiduissa ihmisen PBL-soluissa.

»M

« * · _ _ ·.· · 25

Esimerkki V. Ihmisen CSIF:n ekspressointi bakteeri-isännässä • · M·

Synteettinen ihmisen CSIF-geeni kootaan useasta kemiallisesti syntetisoidusta kaksisäikeisestä DNA-fragmentista niin, että muodostuu ekspressointivektori, 30 jolle annetaan nimeksi TAC-RBS-hCSIF, Kloonaus ja ekspressointi suoritetaan ♦ ·· * :·* normaalissa bakteerisysteemissä, esimerkiksi E. coli K-12-kannassa JM101, • · · [·.: JM103 tai vastaavassa, kuvannut Viera ja Messing, julkaisussa Gene, Voi. 19, • ·· s. 259-268 (1982). Pilkkomiset restriktioendo-nukleaasilla ja ligaasireaktiot suori- ; 30 107926 tetaan käyttämällä standardiprotokollia, esimerkiksi Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).

Pienimittaisiin plasmidien valmistamisiin käytetään alkalimenetelmää (Maniatis 5 et ai., viitattu edellä). Suurimittaisiin valmistuksiin käytetään alkalimenetelmän muunnelmaa, jossa nukleiinihapot saostetaan kirkastetusta lysaatista yhtä suurella isopropanolitilavuudella. RNA poistetaan saostamalla kylmällä 2,5 M ammo-niumasetaatilla ennen kalsiumkloriditäsapäino-tiheyssentrifugointia ja detektointia etidiumbromidilla.

10

Suodatinhybridisointeja varten käytetään, pyöreitä Whatman 540-suodattimia pesäkkeiden nostamiseen, jotka sen jälkeen lyysataan ja kiinnitetään käsittelemällä peräkkäin seuraavilla: 0,5M NaOH, 1..5M; 1M Tris.HCI pH 8,9,1,5M NaCI (kukin 2 min.); ja kuumentamalla 80°C:ssa (30 min.). Hybridisoinnit suoritetaan 15 6 tunnin aikana 42°C:ssa 6xSSPE:ssa, 20 % formaamidi, 0,1 % natriumdodekyyli- sulfaatti (SDS), 100 mg/ml E. coli tRNA.dOO mg/ml Coomassie Brilliant Blue G-250 (Bio-Rad) käyttämällä 32P-leimattuja (kinasoitu) synteettisiä DNA-molekyy-lejä. (20xSSPE valmistetaan liuottamalla 174 g NaCl.a, 7,4 g EDTA:a ja 27,6 g NaH2P04.9H20:a 800 ml:aan vettä; pH säädetään arvoon 7,4 NaOH:lla, tilavuus • · '·'··' 20 säädetään 1 litraksi ja liuos steriloidaan autoklavoimalla). Suodattimet pestään • · · • *| kaksi kertaa (15 minuuttia, huoneen lämpötilaan), IxSSOEm 0,1 % SDS:lla.

Autoradiografian (Fuji RX-filmi) jälkeen positiiviset pesäkkeet paikallistetaan sovit- • · · **:·[ tamalla uudelleenkasvatetut pesäkkeet yhteen siniseksi värjäytyneiden pesäkkei- \m* den kanssa suodatti-milla. DNA sekvensoidaan dideoksi-menetelmällä, Sanger 25 et ai. Proc. natl. Acad. Sei., Voi. 74, s. 5463 (1977). Dideoksi-reaktioiden templaa- tit ovat joko uudelleen M13mp-vektoreihin rkloonattujen kyseisten alueiden yksisäi- [ keisiä DNA-molekyylejä, esimerkiksi Messing et ai. Nucleic Acids Res., Voi. 9, • · ·;·* s. 309 (1981), tai kaksisäikeinen DNA, joka on valmistettu minialkalimenetelmällä

| *·· ja denaturoitu 0,2M NaOH:lla (5 min., huoneen lämpötila) ja saostettu 0,2M

··· 30 NaOH, 1,43M ammoniumasetaatista lisäämällä 2 tilavuutta etanolia. DNA synte-tisoidaan fosforiamidaattikemian avulla käyttämällä Applied Biosystems 380A-syntetisointilaitteita. Synteesi, suojauksenpoisto, pilkkominen ja puhdistaminen • · (7M urea PAGE, eluointi, DEAE-selluloosakromatografia) tehdään 380A-synteti-sointilaitteen käsikirjassa kuvatulla tavalla.

31 107926

Kloonattavien synteettisten DNA-molekyylien komplementtiset säikeet (kutakin 400 ng) sekoitetaan ja fosforyloidaan polynukleotidikinaasilla 50 ml reaktiotilavuu-dessa. Tämä DNA ligatoidaan 1 mg kanssa vektori-DNA:a, joka on pilkottu sopivilla restriktioentsyymeillä, ja ligaatiot suoritetaan 50 ml tilavuudessa huoneen 5 lämpötilassa 4-12 tunnin aikana. Fosforyloinnin, restriktioentsyymipilkkomisten, polymeraasireaktioiden ja ligaation olosuhteita on kuvattu (Miniatis et ai., viitattu edellä). Pesäkkeet valitaan lacZ+:n avulla (näin haluttaessa) maljaamalla L-agaril-le, joka on täydennetty ampisilliinilla, isopropyyli-1-tio-beta-D-galaktosidaasilla (PTG) (0,4 mM) ja 5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-beta-D-galaktopyranosidilla (x-gal) 10 (40 mg/ml). ;··.·.

TAC-RBS-vektori rakennetaan täyttämällä DNA-polymeraasilla tacP:n sisältävän plasmidin pDR540 (Pharmacia) ainut BamHI-kohta. Sen jälkeen tämä ligatoidaan fosforyloimattomiin synteettisiin oligonukleotideihin (Pharmacia), jotka muodosta-15 vat kaksisäikeisen fragmentin, joka koodaa konsensus-ribosomin sitoutumiskohtaa (RBS, GTAAGGAGGTTTAAC). Ligatoinnin jälkeen seos fosforyloidaan ja ligatoidaan uudelleen Sstl-linkkerin ATGAGCTCAT.n kanssa. Sen jälkeen tämä kompleksi pilkotaan Sstklla ja EcoRklla ja:173 bp fragmentti eristetään polyakryy-liamidigeelieleketroforeesin avulla (PAGE) ja kloonataan EcoRI-Sstl-pilkottuun 20 pUC19-plasmidiin (Pharmacia) (kuvattu jäljempänä). Valmiin rakennelman (käyte-’*·*’· tään nimitystä TAC-RBS) RBS-ATG-polylinkkerialueiden sekvenssio on esitetty * * kuviossa 3.

« · * • · · ··· .·';· ' * Synteettinen CSIF-geeni kootaa pUC19-plasmidiin kahdeksassa vaiheessa.

*·* * 25 Jokaisessa vaiheessa voidaan kloonauksen jälkeen löytää deleetioita ja/tai insert- tejä sisältämättömiä inserttejä säilyttämällä pUC19:n lacZ(a)-geeni kehyksessä * ’ vaiheessa I insertoidun ATG-aloituskodonin kanssa. Deleetio- ja/tai insertiomuu- ··· • 9 ·;*’ toksia sisältävät kloonit voidaan erottaa etsimällä siniset pesäkkeet L-ampisilliini- j**·. maljoilla, jotka sisältävät x-gal:n ja IPTG:n. Vaihtoehtoisesti voidaan jokaisessa 30 vaiheessa vahvistaa inserttien sekvenssit käyttämällä universaalia sekvensointi-primeeriä pienimittaisissa plasmidi-DNA-valmisteissa, joita esimerkiksi on saata-j\: vissa Boehringer Mannheim-yhtiöltä.

9 9 32 107926

Vaiheessa 1 TAC-RBS-vektori pilkotaan SstLIIa, käsitellään T4 DNA-polymeraa-silla (jonka 3'-eksonukleaasiaktiivisuus pilkkoo Sstl-palojen 3'-ylipitkät säikeet muodostaen tasapäisiä fragmentteja) ja T4 DNA-polymeraasin deaktivoinnin jälkeen käsitellään EcoRI:lla. Näin muodostuu 173 bp fragmentti, joka sisältää 5 TAC-RBS-alueen ja jossa on tasapitkä pää ATG-aloituskodonissa ja vastakkaisessa päässä EcoRI-pala. Lopuksi eristetään 173 bp TAC-RBS-fragmentti.

Vaiheessa 2 sekoitetaan vaiheessa 1 eristetty TAC-RBS-fragmentti EcoRI/Kpnl-digestoidun plasmidin pUC19 ja synteettisen fragmentin 1A/B kanssa, jolla frag-10 mentilla on, kuten alla on esitetty, tylppä pää ylävirran päädyssä ja porrastettu pääty, joka vastaa KpnMeikkausta alavjrran päädyssä. Tämä Kpnl-pääty on BstEII-kohdan vieressä ja siitä alavirtaan. Fragmenttnit on ligatoitu muodostamaan vaiheen 2 pUC19.

15 Vaiheessa 3 sekoitetaan synteettinen fragmentti 2A/B ja 3A/B (esitetty jäljempänä vaiheen 2 BstEII/smal-pilkotun pUC19:n kanssa (monistamisen ja puhdistamisen jälkeen) ja ligatoidaan niin, että muodostuu vaiheen 3 pUC19. Huomattakoon, että fragmentin 3A/B myötävirran pää sisältää ylimääräisiä emäksiä, jotka muodostavat Smal-tasapään. Nämä ylimääräiset emäkset katkaistaan pois vaiheessa 20 4. Myös fragmenteissa 2A/B ja 3A/B on komplementtiset 9 ryhmän yksisäikeiset « · · ‘ · * j päät, jotka liittyvät yhteen sekoitettaessa, jolloin vastaviraan jää 2A/B:n BstEII- pala ja myötävirtaan 3A/B tasapää, joilla ligatoidaan pUC19:ksi.

• » · • · · »«·

Vaiheessa 4 puhdistetaan uudelleen vaiheen 3 Aflll/Xbal:lla pilkottu pUC19 (mo- • « · 25 nistamisen ja puhdistamisen jälkeen), sekoitetaan synteettisen fragmentin 4A/B kanssa (esitetty jäljempänä) ja ligatoidaan niin, että muodostuu vaiheen 4 pUC19.

• · ·· · ·;·* Vaiheessa 5 sekoitetaan vaiheen 4 Xbal/sall:lla pilkottu pUC19 (monistamisen ja ·· • *·· puhdistamisen jälkeen) synteettisen fragmentin 5A/B kanssa (esitetty jäljempänä) • · · 30 ja ligatoidaan niin, että muodostuu vaiheen 5 pUC19. Huomattakoon, että frag-mentin 5A/B Sall-eripitkä pää poistetaan pilkkomalla vaiheessa 6 Hpahlla.

• · • · · • «· • · 33 107926

Vaiheessa 6 sekoitetaan vaiheen 5 Hpal/Pstl-pilkottu pUC19 (monistamisen ja puhdistamisen jälkeen) synteettisen fragmentin 6A/B kanssa (esitetty jäljempänä) ja ligatoidaan, jolloin muodostuu vaiheen 6 pUC19.

5 Vaiheessa 7 sekoitetaan vaiheen 6 Clal/Sphl:lla pilkottu pUC19 (monistamisen ja puhdistamisen jälkeen) synteettisen fragmentin 7A/B kanssa (esitetty jäljempänä) ja ligatoidaan, jolloin muodostuu vaiheen 7 pUC19.

Vaiheessa 8 sekoitetaan Mlul/Hindlll:lla pilkottu pUC19 vaiheesta 7 (monistami-10 sen ja puhdistamisen) jälkeen synteettisten fragmenttien 8A/B ja 9A/B kanssa ja ligatoidaan, jolloin muodostuu lopullinen rakenne. Tämä rakennelma insertoidaan normaalien tekniikoiden avulla E. coli K-12-kantaan JM101, saatavissa esimerkiksi ATCCista tallennusnumerolla 33876. Viljelyn jälkeen proteiini uutetaan JM101-soluista ja biologinen aktiivisuus testataan;uutteiden laimennuksista.

15 AGCCCAGGCC AGGGCACCA GTCTGAGAAC AGCTGCACCC ACTTC-TCGGGTCCGG TCCCGTGGGT CAGACTGTTG TCGACGTGGG TGAAG- CCAGGtAACC ggtac 20 GGTCCaTTGG c

*···* Fragmentti 1A/B

• · t • · t · j GtAACCTGCC TAACATGCTT CGAGATCTCC GAGATGCCTT CAGCA- ·:·«: 25 gcgg attgtgcgaa gctcjagagg ctctacggaa gtcgt- ♦ ·· • · · • * « * gagtgaagac tttcttt

CTCACTTC

Fraamentti 2A/B

·*· 1" 30 ·· • · • ·* •

CAAATGAAGG ATCAGGTGGA CAACTTGTTc TtAAG

TGAAAGAAA GTTTACTTCC TAGTCGACCT GTTGAACAAg AaTTC

• « • ·* • ·

\*·: 35 Fraamentti 3A/B

34 107926 GAGTCCTTGC TGGAGGACTT TAAGGGTTAC CTGGGTTGCC AAGCC- CTCAGGAACG ACCTCCTGAA ATTCCCAATG GACCCAACGG TTCGG- TTGTCTGAGA TGATCCAGTT TTAt

5 AACAGACTCT ACTAGGTCAA AATaGAtC

Fragmentti 4A/B

GtaGAGGAGG TGATGCCCCA AGCTGAGAAC CAAGACCCAG ACATC- 10 GatCTCCTCC ACTACGGGGT TCGACTCTTG GTTCTGGGTC TGTAG- AAGGCGCATG TtAACg TTCCGCGTAC AaTTGcagct

15 Fragmentti 5A/B

AACTCCCTGG GGGAGAACCT GAAGAGCCTC AGGCTGAGGC TACGG- TTGAGGGACC CCCTCTTGGA CTTCTGGGAG TCCGACTCCG ATGCC- 20 CGCTGTCATC GATcatgca GCGACAGTAG CTAg

«.·.! Fragmentti 6A/B

• · · · * ·· • · ·:··: CGATTTCTTC CCTGTCAAAA caagagcaag gccgtggagc aggtg- . ;·; 25 TAAAGAAG GGACAGTTTT GTTCTGCTTC CGGCACCTGC TCCAC- ··· • · AAGAAcGCgT gcatg *·* * TTCTTgCGcA c

Fragmentti 7A/B 30 ··· \..J CGCGTTTAAT AATAAGCTCC AAGACAAAGG CATCTACAAA GCCAT- AAATTA TTATTCGAGG TTCTGTTTCC GTAGATGTTT CGGTA- • ·· ♦ #*· • ·

’·:** GAGTGAGTTT GAC

Γ*·· 35 CTCA

:’*.i Fragmentti 8A/B

35 107926 ATCTTCATCA ACTACATAGA AGCCTACATG ACAAT-CTCAAACTG TAGAAGTAGT TGATGTATCT TCGGATGTAC TGTTA- GAAGATACGA AACTGA 5 CTTCTATGCT TTGACTtcga

Fragmentti 9A/B

(Pienet kirjaimet osoittavat, että emäs ei ole sama kuin natiivin sekvenssin emäs 10 samassa kohdassa)

Esimerkki VI. CENKSKAVE-peptidille spesifiset vasta-aineet 50 mg ovalbumiinia (OVA) ja 50 mg myoglobuliinia (MYO) (esimerkiksi saatavissa 15 Sigma-yhtiöltä) liuotetaan erikseen 10 ml:aan 0,1 M natriumbikarbonaattia ja saatetaan reagoimaan 1 ml kanssa 0,12 jodiasetamidiliuosta (88 mg jodiasetami-dia liuotettuna 4 ml:aan 0,1 M natriumbikarbonaattia) 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa 15 ml Falcon-putkessa (Falcon Plastics, Oxnard, CA) tai vastaavassa. Kumpikin reaktioseos dialysoidaan yön yli 4 litraa vasten 0,1 M natriumbikar-20 bonaattia 4RC:ssa. Erikseen liuotetaan 10 mg CENKSKVAE:a 2 ml:aan 0,1 M DTT (ditiotreitol)-liuos Qossa 50 mM Tris ja 2,5 mM EDTA pH-arvossa 8) 4 ml * · putkessa, inkuboidaan 37°C:ssa yön yli; ja sen jälkeen viedään CF05 geelisuoda- ♦ tuspylvääseen (1,5 x 26,5 cm) (LKB, Bromma, Ruotsi) ja eluoidaan peptidiliuos-puskurilla, joka sisältää 0,015 M etikkahappoa ja 0,005 M beta-merkaptoetanolia. 25 Kolme noin 3,5 ml:n jaetta, jotka sisältävät pelkistetyn peptidin, tunnistetaan ·*· : optisen tiheyden avulla 206 mM:ssa, otetaan talteen, yhdistetään, pakastetaan kuivajäähän ja lyofilisoidaan yön yli. Syvävälin OVA ja MYO otetaan talteen dia-lyysistä ja kirkastetaan suodattamalla 0,45 mikrometrin suodattimien läpi. OVA ja ·*« MYO aktivoidaan sekoittamalla kummankin kanssa 380 mikrolitraa jodietikkaha- 30 pon N-hydroksisukkinimidiesteriä (N H IA) (Rector et ai., J. Immunol. Meth., Voi.

24, s. 321 (1978)), joka on liuotettu tetrahydrofuraaniin (THF) (5 mg/ml), sekoite- :·! ^ taan 30 minuuttia huoneen lämpötilassa ja dialysoidaan yön yli 4 litraa vasten : PBS:a (1,8 g NaH2P04-H20, 7,2 g Na2HPQ4.H20 ja 34 g NaCI 4 I H20:ssa. Lyofi- • · lisoitu peptidi suspensoidaan erikseen uudelleen 5 ml:aan boraatti-pelkistyspus- 36 107926 kuria (2 g Na2B4O7.10H2O, 17,4 g NaCI, ja 336 mg EDTA-Na21 I H20:ssa, pH säädetty arvoon 8,5 väkevällä suolahapolla, hapenpoisto typen avulla 15 minuutin aikana, minkä jälkeen lisätään 178 mg askorbaattia). Dialysoidutjodiasetyloidut OVA ja MYO otetaan talteen, sekoitetaan erikseen yhtä suurien tilavuuksien 5 kanssa (mieluummin 2 ml) boraatti-pelkistyspuskuria, joka sisältää peptidin, ja inkuboidaan yön yli huoneen lämpötilassa. Saadut konjugaatit analysoidaan SDS-PAGE:lla (12,5-prosenttinen geeli). Konjugaatin sisältävä liuos laimennetaan PBS:lla 1 mg/ml:ksi, steriilisuodatetaan ja jaetaan sopiviin tilavuuksiin (esimerkiksi 500 mikrolitraa) immunisointeja varten, ja/tai säilytetään 4°C:ssa. Polyklonaaliset 10 antiseerumit MYO-konjugaattia vastaan tuotetaan sekä rotissa että kaniineissa (New Zealand White). Immunisointiaikataulu kaniineille on seuraava: Aluksi (viikko 0) otetaan 10 ml seeruminäyte kontrollina. Yhden viikon kuluttua (viikko 1) sekoitetaan 0,5 ml peptidi-kantajakonjugaattia 0,5 ml:n kanssa Freund'in täydellistä apuainetta ja injisoidaan I.P. Kolme viikkoa myöhemmin (viikko 4) annetaan 15 tehostusannos, jossa on 0,5 ml peptidi-kantajakonjugaattia sekoitettuna 0,5 ml:n kanssa Freund'in epätäydellistä apuainetta. Seuraavalla viikolla (viikko 5) annetaan uusi tehostusannos, joka jälleen sisältää 0,5 ml peptidi-kantajakonjugaattia sekoitettuna 0,5 ml:n kanssa Freund'in epätäydellistä apuainetta. Tämän jälkeen annetaan vielä yksi identtinen tehostusannos seuraavalla viikolla (viikko 6). Viikol-.j*: 20 la 7 eläimestä valutetaan 20 ml seerumia. Solujakeen erottamisen jälkeen seeru-:/.{ mistä määritetään ELISA:lla positiivinen anti-CENKSKAVE-tiitteri. Rottien immu-*:**: nisointi tapahtui samalla tavoin paitsi, että alkuinjisointi sisältää 0,15 ml PBS:a ja 0,1 ml peptidi-kantajakonjugaattia sekoitettuna 0,75 ml:n kanssa Freund'in täydel-*:*·: listä apuainetta, tehostusannokset sisälsivät 0,15 ml PBS:a ja 0,1 ml peptidi-kan- :T: 25 tajakonjugaattia sekoitettuun 0,75 ml kanssa Freund'in epätäydellistä apuainetta, ja rotasta valutetaan vain 2 - 3 ml seerumia. Positiivinen anti-CENKSKAVE-reak- *“*: tio detektoidaan jälleen ELlSA-menetelmällä.

• · · • · • · ·

Keksinnön edellä olevia suoritusmuotoja on kuvattu keksinnön havainnollistamista .*··. 30 ja kuvaamista varten. Niiden ei ole tarkoitus olla täydellisiä tai rajoittaa keksintö • · * ./ juuri esitettyihin nimenomaisiin muotoihin, ja luonnollisesti edellä annettujen tieto- • · · . jen valossa on mahdollista tehdä monia modifikaatioita ja muutoksia. Suoritus-• · · * * muodot ja valittiin, jotta voitaisiin parhaiten selittää keksinnön periaatteet ja näin mahdollistaa se, että muut alan ammattimiehet kykenisivät parhaiten hyödyntä- 37 107926 mään keksintöä eri suoritusmuodoissa ja käyttämällä erilaisia modifikaatioita, jotka sopivat kuhunkin aiottuun tiettyyn käyttöön. Keksinnön piirin määrittelevät patenttivaatimukset.

5 Hakijat ovat erikseen tallentaneet E. coli MC1061:n, jossa on pcD(SRa)-F115, pH5C ja pH15C, American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC)-kokoelmaan vastaavasti tallennusnumeroilla 68027, 68191 ja 68192. Nämä tallennukset tehtiin ATCC:n Culture Deposit for Patent Purposes-sopimuksen mukaisesti, joka takaa, että tallennukset ovat US Commissioner of Patents and 10 Trademarks:n käytettävissä 35 USC 122:n ja 37 CFR 1,14:n käytettävissä ja US-patentin myöntämisen jälkeen yleisön käytettävissä. Tämä edellyttää myös, että tallennuksia ylläpidetään. Tallennetun kannan saatavuutta ei tule ymmärtää siten, että se antaisi lisenssin keksinnölle vastoin jonkin hallituksen patenttilakien-sa mukaisesti suomia oikeuksia.

15

Tallennukset on tehty vastaamaan mikro-organismien tallentamista koskevan Budapestin sopimuksen vaatimuksia.

• · • · · • · · • · • · · • ·· • · • · ♦ · · • · · ··· • · ··♦ • · « • · · • S1···'!'.·- • · ·♦· ♦ · ··· ·· • · • ·· ··· ♦ · • · • · · • · • · • · · · • » · • ·· • 1

Claims (29)

1. 38 107926
2. 1. Eristetty nisäkäs-nukleiinihappo, tunnettu siitä, että se (a) kykenee koodaamaan polypeptidiä, jolla on sytokiinin synteesiä inhiboivan 5 faktorin aktiivisuutta, ja (b) kykenee muodostamaan detektoitavan hybridin yhden tai useamman koettimen kanssa, jotka ovat peräisin pcD(SRa)-F115:n (ATCC 68027), pH5C:n (ATCC 68191) tai pH15C:n (ATCC 68192) cDNA-inserteistä, 5X SET:n läsnäollessa 60°C:ssa tai vastaavissa olosuhteissa. 10
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty nukleiinihappo, tunnettu siitä, että mainittu faktori kykenee inhiboimaan tai oleellisesti vähentämään ainakin yhden sytokiinin tuotannon tason, joka sytokiini on valittu ryhmästä IFN-γ, IL-2, IL-3, lymfotoksiini ja GM-CSF solupopulaatiossa, joka on indusoitu syntetisoimaan yhtä 15 tai useampaa näistä sytokiineistä.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen eristetty nukleiinihappo, tunnettu siitä, että mainitut solut ovat T-avustajasoluja.
5. 4. Eristetty nukleiinihappo, tunnettu siitävettä se on ainakin 90-prosenttisesti • · :.*·· homologinen vektorin, joka on valittu joukosta, johon kuuluvat pcD(SRa)-F115 (ATCC 68027), pH5C (ATCC 68191) ja pH15C (ATCC 68192), cDNA-insertin suurimman avoimen lukukehyksen valmiin polypeptidin koodausalueen kanssa. • · ··· v : 25 5. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen nukeliinihappo, tunnettu siitä, että se on peräisin nisäkässolulähteestä. • · • « ·
6. 6. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen eristetty nukleiinihappo, tunnettu siitä, että mainittu faktori on ihmisen sytokiinisynteesi-inhibiittorifaktori. • ·· _ _ : : 30 • · · :·! 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen eristetty nukleiinihappo, tunnettu siitä, että • · · .·. : mainittu faktori on avoimen lukukehyksen omaava valmis polypeptidi, jonka mää- • · rittelee aminohapposekvenssi: 39 107926 MHSSALLCCL VLLTGVRASP GQGTQSENSC THFPGNLPNM LRDLRDAFSR VKTFFQMKDQ LDNLLLKESL LEDFKGYLGC QALSEMIQFY LEEVMPQAEN QDPDIKAHVN SLGENLKTLR LRLRRCHRFL PCENKSKAVE QVKNAFNKLQ EKGIYKAMSE 5 FDIFINYIEA YMTMKIRN.
7. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen eristetty nukleiinihappo, tunnettu siitä, että mainitun faktorin aminohapposekvenssi on:
8. 10 SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMK DQLDNLLLKE SLLEDFKGYL GCQALSEMIQ TYLEEVMPQA ENQDPDIKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKA VEQVKNAFNK LQEKGIYKÄM SEFDIFINYI EAYMTMKIRN.
9. 9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen eristetty nukleiinihappo, tunnettu siitä, että faktori on hiiren sytokiinisyhteesi-inhibiittorifaktori.
10. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen eristetty nukleiinihappo, tunnettu siitä, että mainitun faktorin aminohapposekvenssi on: • · · :**. 20 • · · QYSREDNNCT HFPVGQSHML LELRTAFSQV KTFFQTKDQL DNILLTDSLM QDFKGYLGCQ ALSEMIQFYL VEVMPQAEKH GPEIKEHLNSL GEKLKTLRMR LRRCHRFLPC ENKSKAVEQV • · KSDFNKLQDQ GVYKAMNEFD IFINCIEAYM MIKMKS. • * · 25
11. 11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty nukleiinihappo, tunnettu siitä, että .···. se sisältää koodaavan sekvenssin ··· ·· « · • ·♦ ··· • * ’*:** 30 AGCCCAGGCC AGGGCACCGA GTCTGAGAAC AGCTGCACCC • · : *·* ACTTCCCAGG CAACCTGCCT AACATGCTTC GAGATCTCCG • « AGATGCCTTC AGCAGAGTGA AGACTTTCTT TCAAATGAAG GATCAGCTGG ACAACTTGTT GTTAAAGGAG TCCTTGCTGG 40 107926 AGGACTTTAA GGGTTACCTG GGTTGCCAAG CCTTGTCTGA GATGATCCAG TTTTACCTGG AGGAGGTGAT GCCCCAAGCT GAGAACCAAG ACCCAGACAT CAAGGCGCAT GTGAACTCCC TGGGGGAGAA CCTGAAGACC CTCAGGCTGA GGCTACGGCG 5 CTGTCATCGA TTTCTTCCCT GTGAAAACAA GAGCAAGGCC GTGGAGCAGG TGAAGAATGC CTTTAATAAG CTCCAAGAGA AAGGCATCTA CAAAGCCATG AGTGAGTTTG ACATCTTCAT CAACTACATA GAAGCCTACA TGACAATGAA GATACGAAAC
12. 12. Ilmentämisvektori, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin edellä olevan patent tivaatimuksen mukaisen nukleiinihapon.
13. 13. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 12 mukaisen ilmentämisvektorin. 15
14. 14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on bakteerisolu tai nisäkässolu.
15. 15. Menetelmä valmistaa nisäkkään sytokiinisynteesi-inhibiittorifaktoria, tunnettu • · *"*! 20 siitä, että menetelmässä viljellään patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen isän- t * · * | täsolu olosuhteissa, jossa nukeliinihappo ilmentyy. • · • · ·
16. 16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi • · ... sisältää vaiheen, jossa sytokiinisynteesi-inhibiittorifaktori erotetaan isännästä. i · t 25 . 17. Antigeeninen polypeptidi, jolla on syto ki in isy n teesi-i n h ib i itto rifakto ri akti viteetti, • · ... tunnettu siitä, että sitä käytetään menetelmässä jossa valmistetaan mainitun *Γ polypeptidin vastaista vasta-ainetta. • · • ♦ • ·· ··· *...· 30 18. Antigeeninen polypeptidi, jolla on s,ytokiinin synteesiä inhiboivan faktorin aktiivisuus, tunnettu siitä, että se on valittu avoimen lukukehyksen valmiista V*: polypeptideistä, joita määrittelee aminohapposekvenssi: 41 107926 MHSSALLCCL VLLTGVRASP GQGTQSENSC THFPGNLPNM LRDLRDAFSR VKTFFQMKDQ LDNLLLKESL LEDFKGYLGC QALSEMIQFY LEEVMPQAEN QDPDIKAHVN SLGENLKTLR LRLRRCHRFL PCENKSKAVE QVKNAFNKLQ EKGIYKAMSE
17. 5 FDIFINYIEA YMTMKIRN, tai sen muteiini, jossa mainittua polypeptidiä on käytetty menetelmässä mainitun polypeptidin vastaisen vasta-aineen valmistamiseksi.
18. 19. Antigeeninen polypeptidi, jolla on sytokiinin synteesiä inhiboivan faktorin aktiivisuus, tunnettu siitä, että sen aminohapposekvenssi on: SPGQGTQSEN βΟΤΗΡΡβΝΕΡ NMLRDLRDAF SRVKTFFQMK DQLDNLLLKE SLLEDFKGYL GCQALSEMIG FYLEEVMPQA
19. 15 ENQDPDIKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKA VEQVKNAFNK LQEKGIYKAM SEFDIFINYI EAYMTMKIRN, tai sen muteiini, jossa mainittua polypeptidiä on käytetty menetelmässä mainitun polypeptidin vastaisen vasta-aineen väliiriistamiseksi. *···: 20 • · • · · '· 1j 20. Antigeeninen polypeptidi, jolla on sytokiinin synteesiä inhiboivan faktorin aktiivisuus, tunnettu siitä, että silla on aminohapposekvenssi: • · · • · ♦ • e · ’S": QYSREDNNCT HFPVGQSHML LELRTAFSQV KTFFQTKDQL ··· !·ί : 25 DNILLTDSLM QDFKGYLGGQ ALSEMIQFYL VEVMPQAEKH GPEIKEHLNSL GEKLKTLRMR LRRCHRFLPC ENKSKAVEQV KSDFNKLQDQ GVYKAMNEFD IFINCIEAYM MIKMKS, • · ··· ·· : '·· tai sen muteiini, jossa mainittua polypeptidiä on käytetty menetelmässä mainitun • ·· 30 polypeptidin vastaisen vasta-aineen valmistamiseksi. • · • · • ·♦ • · • I · · 42 107926
20. 21. Vasta-aine, tunnettu siitä, että se erityisesti sitoutuu jonkin patenttivaatimuksen 17-20 mukaisen nisäkkään sytokiinin synteesiä inhiboivaan faktoriin ja sitä käytetään in vitro.
21. 22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen vasta-aine, tunnettu siitä, että se kykenee inhiboimaan mainitun nisäkkään sytokiinin synteesiä inhiboivan faktorin biologisen aktiivisuuden.
22. 23. Antigeeninen polypeptidi, joka sisältää 6-30 aminohapporyhmää, jolla on 10 sekvenssi, joka on identtinen ihmisen sytokiinisynteesiä inhiboivan faktorin sekvenssiin, joka sisältää aminohapposekvenssin: SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMK DQLDNLLLKE SLLEDFKGYL GCQALSEMIQ FYLEEVMPQA 15 ENQDPDIKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKA VEQVKNAFNK LQEKGIYKAM SEFDIFINYI EAYMTMKIRN.
23. 24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen antigeeninen polypeptidi, tunnettu siitä, että se sisältää 6-12 aminohapporyhmää, jossa on sekvenssi, joka on identtinen ·.·.! 20 aminohapposekvenssin osasekvenssin kanssa: • · • · · * · · • · SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMK • * · • · · ···
24. 25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen antigeeninen polypeptidi, tunnettu siitä, ··· : 25 että se sisältää sekvenssin RDLRDA. *s": 26. Patenttivaatimuksen 24 mukainen antigeeninen polypeptidi, tunnettu siitä, ·«· että se sisältää 6-12 aminohapporyhmää, jolla on sekvenssi, joka on identtinen φ aminohapposekvenssin 30 • · · :·; LEEVMPQAEN QDPDIKAHVN SLGEN • ·* • · • · · • · · osasekvenssin kanssa. 43 107926
25. 27. Patenttivaatimuksen 24 mukainen antigeeninen polypeptidi, tunnettu siitä, että se sisältää sekvenssin ENQDPD.
26. 28. Patenttivaatimuksen 24 mukainen antigeeninen polypeptidi, tunnettu siitä, 5 että se sisältää 6-12 aminohapporyhmää, jolla on sekvenssi, joka on identtinen aminohapposekvenssin CHRFLPCENK SKAVEQVKNA FNK 10 osasekvenssin kanssa.
27. 29. Patenttivaatimuksen 24 mukainen antigeeninen polypeptidi, tunnettu siitä, että se sisältää sekvenssin ENKSKA......
28. 30. Patenttivaatimuksen 24 mukainen antigeeninen polypeptidi, tunnettu siitä, että se sisältää sekvenssin CENKSKAVE. • · • · · ··· • · • · ♦ * ·· • · • · · · • · · M· • 1 »2 • · · • · · • · • · · • · ··· ·· • · • · · ··· • · • · • · · • · • · • ·· t · • · · • ·· 2 • · 44 107926