JP2813063B2 - サイトカイン合成抑制性因子、そのアンタゴニストおよびそれらの使用方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、概して、免疫系不均衡、特に、体液性およ
び細胞性免疫応答に関わる不均衡に関係した疾患を治療
するための方法および組成物に関する。更に、本発明
は、免疫系に含まれたある種のサイトカイン（cytokine
s）の合成を、治療効果を得るために調節することがで
きるタンパク質およびそれらのアンタゴニストを包含す
る。

背景 抗原に対する免疫応答は、主として、遅延型過敏症
（DTH）の現象によって例示される細胞性かまたは抗体
の産生によって例示される体液性であるものに分類され
る。細胞性免疫は腫瘍の拒絶並びに多数のウイルス性、
細菌性、原生動物性および真菌性感染からの回復に重要
なパラマウントから成る。対照的に、体液性免疫応答
は、毒素および侵入生物を循環から除去するのに最も有
効な免疫形態である。種々の抗原に対して、これらの２
種類の応答の一方または他方が相互に排他的な方式で支
配的であることが多いこと、およびある種の疾患、例え
ば、らい病、リーシュマニア症およびある種の自己免疫
の苛酷さは、一方の種類の応答の他方にまさる不適当な
支配によることがあるということが観察された。モスマ
ン（Mosmann）ら、Immunol.Today、８巻、223〜227頁
（1987）；モスマンら、Ann.Rev.Immunol.、７巻、145
〜173頁（1989）；パリッシュ（Parish）、Transplant.
Rev.、13巻、35〜66頁（1972）；およびリュウ（Lie
w）、Immunol.Today、10巻、40〜45頁（1989）。更に、
サイトカインのセットがDTH反応および体液性免疫応答
に別個に関係していることが観察され［シェール（Che
r）ら、J.Immunol.、138巻、3688〜3694頁（1987）；お
よびモスマンら（上記に引用、1987年および1989
年）］、これらの種類の応答に関係した疾患は、サイト
カインの関連セットの不適当な産生によって引き起こさ
れると考えられる。

例えば、主要な根拠により、γインターフェロン（IF
N−γ）の過度の産生が、自己免疫疾患に関係した主組
成適合性複合体（MHC）に関与することが示唆される。
フックス（Hooks）ら、New Enland J.Med.、301巻、５
〜８頁（1979）（自己免疫に相関して上昇したIFN−γ
の血清濃度）；バシャム（Basham）ら、J.Immunol.、13
0巻1492〜1494頁（1983）（IFN−γはMHC遺伝子生産物
発現を増加させることができる）；バタツォ（Battazz
o）ら、Lancet.、1115〜1119（11/12/83）（ある種の自
己免疫形態に相関した異常なMHC遺伝子生産物発現）；
フックスら、Ann.N.Y.Acad.Sci.、301巻、21〜32頁（19
80）（SLE患者の症状の苛酷に相関した一層高いIFN−γ
濃度、およびインターフェロンの活性を増大させるヒス
タミン放出を、抗インターフェロン血清によって阻害す
ることができる）；およびイワタニ（Iwatani）ら、J.C
lin.Endocrin.and Metabol.、63巻、695〜708頁（198
6）（HLA−DR発現を誘発する白血球凝集素感作Ｔ細胞の
能力が除去された抗IFN−γ単クローン性抗体）。過剰I
FN−γがMHC遺伝子生産物の不適当な発現を引起こし、
それが順次に、細胞がMHC生産物を不適当に発現し且つ
その生産物の前後関係で自己抗原を示している組織に対
して自己免疫反応を引起こすということが仮定される。

臨床的寄生生物学の分野において、最近、IFN−γお
よびIL−２の濃度が、原生動物性感染であるリーシュマ
ニア症の進行および／または緩和において重要な因子で
あることが観察された。特に、適当な濃度のIFN−γの
存在は、細胞内の無べん毛型を除去するための感染した
マクロファージの活性化に不可欠であると考えられる。
マウエル（Mauel）およびベヒン（Behin）、コーエン
（cohen）ら監修、Immunology of Parasitic Ifections
（ブラックウェル（Blackwell）、ロンドン、1982）。
そして疾患のネズミモデルにおいて、高濃度のIFN−γ
および低濃度のIL−４はリーシュマニア症の緩和に関係
しているが、低濃度のIFN−γおよび高濃度のIL−４は
その進行に関係していることが示された。ハインツェル
（Heinzel）ら、J.Exp.Med.、169巻、59〜72頁（198
9）。

前記のことを考慮して、免疫応答の一方の種類の支配
を他方に変えることができる、特に、治療に必要とされ
るIFN−γおよび／または他のサイトカインの合成をそ
れぞれ抑制または増大させることができる入手可能な物
質があると好都合であると考えられる。このような物質
は、不適当または不充分な免疫応答、例えば組織拒絶、
リーシュマニア症および他の寄生生物疾患に関係した疾
患並びにMHC関連免疫疾患、例えば慢性関節リウマチ、
全身性エリテマトーデス（SLE）、重症筋無力症、イン
スリン依存性真性糖尿病、甲状腺炎等の治療に極めて好
都合であると考えられる。

発明の要約 本発明は、哺乳動物のサイトカイン合成抑制性因子
（CSIF）、CSIF類似体、CSIFペプチドおよびCSIFアンタ
ゴニストに関する。それは、CSIF活性を示すポリペプチ
ドをコードする核酸並びにそれら自体のポリペプチド、
それらのアゴニスト類似体および／またはアンタゴニス
ト類似体、それらの生産方法および、サイトカイン不均
衡に関係した疾患、特に不適当な種類の免疫応答へと導
く疾患を治療するためのそれらの使用方法を含む。本発
明は更に、支配的細胞性免疫応答または支配的体液性免
疫応答をそれぞれ選択的に誘発するためのCSIFまたはそ
のアンタゴニストの単独またはワクチンアジュバントと
しての使用を含む。好ましくは、CSIFアンタゴニスト
は、CSIFの生物学的活性を阻害することができる単クロ
ーン性抗体から誘導される。本発明の核酸は、（１）本
明細書中で開示されたクローン化された相補的DNA（cDN
A）配列に対するそれらの相同によってまたはそれらの
配列を用いて検出可能なハイブリッド形成するそれらの
能力によって、および（２）核酸によってコードされた
ポリペプチドに与えられたCSIF活性についての機能的検
定によって定義される。本明細書中で用いられる、タン
パク質またはポリペプチドに関する「CSIF活性」という
用語は、そのタンパク質またはポリペプチドが、下記に
記載した検定において下記のサイトカイン、すなわち、
IFN−γ、インターロイキン−２（IL−２）、リンフォ
トキシン、インターロイキン−３（IL−３）または顆粒
球マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）の少な
くとも１種類の産生水準を阻害するかまたは実質的に減
少させることができるということを意味する。

本発明の好ましい実施態様は、下記のアミノ酸配列に
よって定義される読み取り枠の成熟ヒトCSIFである。

但し、Ｌ−アミノ酸の標準一文字記号（下記を参照さ
れたい）は、Ｎ末端メチオニンから開始して左から右へ
と記載されている。更に好ましくは、成熟ヒトCSIFは下
記のアミノ酸配列によって定義される。

これらの配列において、その間隔は単に読み取りの都
合上のものである。標準一文字コードをここではアミノ
酸用に用いる。

本発明は、一部分は、CSIF活性を有するタンパク質を
発現することができるcDNAの発見およびクローニングに
基づくものである。したがって、（マウスCSIF遺伝子を
有する）pcD（SRα）−F115並びに（それぞれヒトCSIF
遺伝子を有する）pH5CおよびpH15Cで示されるこの種の
クローンのいくつかはアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（American Type Culture Collection）
（ATCC）、メリーランド州、ロックビルに、それぞれ寄
託番号68027、68191および68192として寄託された。

図面の簡単の説明 図１に、種々の量のCSIFで処理された若干のマウスＴ
細胞クローンにおけるIFN−γ合成抑制の程度について
の用量−反応の関係を図示する。

図２は、哺乳動物発現ベクターpH5CおよびpH15Cの主
要な特徴を図示する図である。

図３に、プラスミドTAC−RBS−hCSIFのRBS−ATGポリ
リンカー領域を図示する。

図４に、pH15CのcDNA挿入部分のヌクレオチド配列を
図示する。

発明の詳細な説明 本発明は、pH5C、pH15CおよびpcD（SRα）−F115のcD
NA挿入部分の最大の読み取り枠の成熟ポリペチドまたは
タンパク質並びにそれらのアンタゴニストを含む。分泌
されたタンパク質について、読み取り枠は、通常、Ｎ末
端でシグナルペプチドに共有結合した成熟または分泌さ
れた生産物からポリペプチドをコードする。シグナルペ
プチドは開裂した後に成熟または活性ポリペプチドを分
泌する。開裂部位は、経験的な法則、例えばフォン・ハ
イン（von Heijne）、Nucleic Acids eRsearch、14巻、
4683〜4690頁（1986）からの高度な正確さによって予測
することができ、シグナルペプチドの正確なアミノ酸組
成はその機能に対して重要であるとは考えられない。例
えば、ランドール（Randall）ら、Science、243巻、115
6〜1159頁（1989）；カイザー（Kaisaer）ら、Scienc
e、235巻、312〜317頁（1987）。したがって、成熟タン
パク質は、pH5C、pH15CおよびpcD（SRα）−F115のcDNA
挿入部分によって定義される読み取り枠によってコード
されたものとは全く異なるシグナルペプチドをコードす
るベクターによって容易に発現される。

I.CSIF cDNAsの入手および発現 本明細書中で用いられる「有効な相同性」という用語
は、ヌクレオチド配列が本発明のcDNAクローンか誘導さ
れたハイブリダイセーションプローブによって検出され
ることが可能であることを意味する。CSIF活性をコード
する核酸を検出するのに必要な相同の正確な数値測定は
いくつかの因子に依存し、例えば（１）標的核酸に関係
した非CSIFをコードする配列に対するプローブの相同、
（２）ハイブリダイセーション条件の緊縮、（３）一重
鎖プローブかまたは二重鎖プローブを用いるかというこ
と、（４）RNAプローブまたはDNAプローブを用いるとい
うこと、（５）プローブの非特異的結合を減少させるの
に用いられる測定値、（６）プローブを標識するのに用
いられる方法の性質、（７）プローブ中のグアニジン塩
基およびシトシン塩基部分、（８）プローブおよび標的
の間の不適正分布、（９）プローブの大きさ等である。
好ましくは、有効な相同性核酸配列は、本発明のcDNAに
対して少なくとも90％相同性である。最も詳しくは、有
効な相同性核酸配列は、cDNAが、実施例に記載されたハ
イブリダイセーションプロトコルを用いて、pcD（SR
α）−F115、pH5C、pH15Cまたはそれらの同等物のcDNA
挿入部分から構築されたプローブによって単離されるこ
とができるものであり、偽陽性シグナルが数個しかな
い、例えば100個未満である。このようなハイブリダイ
セーションのための条件を選択する場合の指標を与える
広範囲の文献があり、例えばヘイムス（Hames）ら、Nuc
leic Acid Hybridization:A Practical Approach（アイ
アールエル・プレス（IRL Press）、ワシントン、コロ
ンビサ特別区、1985）；グレイ（Gray）ら、Proc.Natl.
Acad.Sci.80巻、5842〜5846頁（1983）；カファトス（K
afatos）ら、Nucleic Acids Research、７巻、1541〜15
52頁（1979）；サムブルック（Sambrook）ら、Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual、第２版（コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Ha
rbor Laboratory）、ニューヨーク、1989）；およびベ
ルツ（Beltz）ら、Meth.in Enzymol.、100巻、266〜285
頁（1983）；他数件である。

本明細書で用いられる場合の用語としての相同は、２
種類のヌクレオチド（またはアミノ酸）配列の間の類似
性の目安である。相同は、（可能ならば不均等な長さ
の）２種類の配列を整列させた後の適正塩基の部分また
は百分率として示される。整列という用語は、サンコフ
（Sankoff）およびクルスカル（Kruskal）によってTime
Warps 第１章、ストリング（String）監修およびMacr
omolecules:The Theory and Practice of Sequence Com
parison（アディソン・ウェスリー（Addison−Wesle
y）、レディング、MA、1983）によって定義された意味
で用いられる。おおよそ、２種類の配列は、その２種類
の配列の間の適正塩基の数を、両方の配列中に最小数の
「ブランク」または「ゼロ」を挿入することで最大限に
して最大のオーバーラップを引き起こすことによって整
列される。２種類の配列が与えられると、それらの相同
を計算するためのアルゴリズムが入手可能である。例え
ば、ニードレアム（Needleham）およびヴンシュ（Wunsc
h）、J.Mol.Biol.、48巻、443〜453頁（1970）；および
サンコフおよびクルスカル（上記に引用）、23〜29頁。
更に、商業的サービスおよびソフトウェア包装品がこの
ような比較を行うために入手可能である。例えば、イン
テリジェネティクス・インコーポレーテッド（Intellig
enet−ics,Inc.）（カリフォルニア州、パロ・アル
ト）；およびユニバーシティ・オブ・ウィスコンシン・
ジェネティクス・コンピューター・グループ（Universi
ty of Wisconsin Genetics Computer Group）（ウィス
コンシン州、マディソン）である。

本発明のcDNAを有するベクターの制限エンドヌクレア
ーゼ断片は、（ニックトランスレーションなどの標準法
を用いて、例えば、サムブルックら、上記引用を参照さ
れたい）プローブを構築するのに用いられ、CSIFを産生
すると思われる細胞系の（再度、標準法によって構築さ
れる）ゲノムまたはcDNAライブラリーを低ハイブリダイ
セーション緊縮でスクリーニングする。標準スクリーニ
ング法を用いる。例えばグルンスタイン（Grunstein）
ら、Proc.Natl.Arcad.Sci.、72巻、3961〜3965頁（197
5）；またはベントン（Benton）ら、Science、196巻、1
80〜183頁（1977）若しくはウー（Woo）、Methods in E
nzymology、68巻、389〜396頁（1979）がある。或い
は、ライブラリーを、配列がpcD（SRα）−F115、pH5C
およびpH15CのcDNA挿入部分のヌクレオチド配列から測
定される標識オリゴヌクレオチドプローブを用いてスク
リーンすることができる。このようなプローブは商業的
に入手可能なDNA合成機、例えばアプライド・バイオシ
ステムズ（Applied Biosystems）381A型で、標準法、例
えばゲイト（Gait）、Oliogonucleotide Synthesis:A P
ractical Approach（アイアール・プレス、ワシント
ン、コロンビア特別区、1984）を用いて合成することが
できる。どちらの場合にも、プローブは少なくとも18〜
30塩基の長さであるのが好ましい。更に好ましくは、プ
ローブは少なくとも50〜200の塩基の長さである。ハイ
ブリダイセーションプローブを用いてライブラリー構築
の前にCSIF mRNAの候補源をスクリーンすることもでき
る。

広範囲の単細胞および多細胞性発現システム（すなわ
ち、宿主発現ベクター組合わせ）を用いて本発明のタン
パク質を生産することができる。可能な種類の宿主細胞
として、制限されないが、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物
等が挙げられる。特異的発現システムの選択および／ま
たは変更を行うための指標を与える多くの評論が入手可
能であり、例えばいくつか挙げると、ボーア（Boer）お
よびシェパード（Shepard）、「大腸菌の外来遺伝子発
現を最適化するための方法（Strategies for Optimizin
g Foreign Gene Expression in Esherichia coli）」20
5〜247頁、クルーン（Kroon）監修、Gene:Structure an
d Expression（ジョン・ウィリー・アンド・サイズ（Jo
hn Wiley ＆ Sons）、ニューヨーク、1983）に、いくつ
かの大腸菌発現システムが評論されており；バナリー
（Banerji）ら、Genetic Engineering、５巻、19〜31頁
（1983）に、哺乳動物細胞のトランスフェクションおよ
びトランスフォーメーションの方法が論評されており；
レツニコフ（Reznikoff）およびゴールド（Gold）監
修、Maximizing Gene Expression（バタワース（Batter
worths）、ボストン、1986）に、大腸菌、酵母および哺
乳動物細胞での形質発現において選択された問題が論評
されており；そしてスィリー（Thilly）、Mammalian Ce
ll Technol−ogy（バタワース、ボストン、1986）に、
哺乳動物発現システムが論評されている。同様に、特異
的cDNAおよび発現調節配列を結合および／または操作し
て、本発明で用いるのに適当な発現ベクターを生成する
および／または修正するための技法および条件を記載す
る多くの論評が入手可能であり、例えば、サムブルック
ら（上記に引用）である。

大腸菌発現システムは、本明細書中に参考文献として
後述される、リッグス（Riggs）による米国特許第4,43
1,739号明細書に開示されている。大腸菌の高発現に特
に有用な原核生物プロモーターはtacプロモーターであ
り、本明細書中に参考文献として後述される、ボーアに
よる米国特許第4,551,433号明細書に開示されている。
分泌発現ベクターも大腸菌宿主用に入手可能である。特
に有用なのは、pIN−III−ompAベクターであり、グレイ
ベ（Ghrayeb）らによるEMBO J.、３巻、2437〜2442頁
（1984）に開示されており、それによると、転写される
cDNAは、ompAタンパク質のシグナルペプチドをコードし
ている大腸菌OmpA遺伝子の部分に融合され、それが、順
次に、細菌の細胞周辺腔に分泌される成熟タンパク質を
生じる。米国特許第4,336,336号明細書および同第4,33
8,397号明細書にも、原核生物のための分泌発現ベクタ
ーが開示されている。したがって、これらの文献は参考
文献として後述される。

細菌の多数の菌株が原核生物発現ベクターに適当な宿
主であり、大腸菌の菌株、例えばW3110（ATCC第27325
番）、JA221、C600、ED767、DH1、LE392、HB101、X1776
（ATCC第31244番）、X2282、RR1（ATCC第31343番）、MR
CI;枯草菌（Bacillus subtilis）菌株；他の腸内細菌、
例えばネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）また
は霊菌（Serratia marcescens）および各種シュードモ
マス属（Pseudomonas）が挙げられる。原核生物タンパ
ク質の発現に有用な大腸菌K12 X1776などの細菌菌株を
誘導するための一般的な方法は、カーティス三世（Curt
is III）による米国特許第4,190,495号明細書に開示さ
れている。したがって、この特許は参考文献として後述
される。

原核生物および真核生物に加えて、多細胞性生物から
誘導される細胞から成る発現システムを用いて本発明の
タンパク質を生産することもできる。特に興味深いの
は、哺乳動物発現システムであり、その翻訳後プロセッ
シング機構が生物学的に活性な哺乳動物タンパク質を生
産すると考えられることによる。数種類のDNA腫瘍ウイ
ルスが哺乳動物宿主用ベクターとして用いられた。特に
重要なのは、細菌複製調節配列に結合させたSV40の複
製、転写および／または翻訳調節配列から成る多数のベ
クターであり、例えば、オカヤマ（Okayama）およびベ
ルク（Berg）によって開発され、Mol.Cell.Biol.、２
巻、161〜170頁（1982）およびMol.Cell.Biol.、３巻、
280〜289頁（1983）で開示され、そしてタケベ（Takeb
e）ら、Mol.Cell.Biol.、８巻、466〜472頁（1988）で
改良されたpcDベクターである。したがって、これらの
文献は参考文献として本明細書中に後述される。他のSV
40基材哺乳動物発現ベクターとして、カオフマン（Kauf
man）およびシャープ（Sharp）によるMol.Cell.Biol.、
２巻、1304〜1319頁（1982）およびクラーク（Clark）
ら、米国特許第4,675,285号明細書に開示されたものが
挙げられ、これら双方の文献は参考文献として本明細書
中に後述される。通常、サル細胞が、前記のベクターに
好ましい宿主である。この種のSV40 ori配列および完全
なＡ遺伝子を含むこの種のベクターは、（非自律的に複
製するプラスミドよりも高い複写数および／または安定
な複写数を与えるために）サル細胞中で自律的に複製す
ることができる。更に、SV40 ori配列を含み、完全なＡ
遺伝子を含まないベクターは、グルツマン（Gluzma
n）、Cell、23巻、175〜182頁（1981）に記載され且つA
TCC（寄託番号CRL1651）から入手可能であるCOS7サル細
胞中で（安定ではないが）高い複写数まで自律的に複製
することができる。前記のSV40基材ベクターは、宿主細
胞DNA中に組込むことによって、他の哺乳動物、例えば
マウスＬ細胞を形質転換することができる。

多細胞生物は、CSIFの生産用宿主として役立つことも
でき、例えば、昆虫幼虫：マエダ（Maeda）ら、Natur
e、315巻、592〜594頁（1985）およびAnn.Rev.Entomo
l.、351〜372頁（1989）；およびトランスジェニック
（transgenic）動物：ジェニッシュ（Raenisch）、Scie
nce、240巻、1468〜1474ページ（1988）である。

II.CSIFのインビトロ検定法 CSIF活性は、同系の抗原提示細胞（APCs）および抗原
に対する暴露によって、IFN−γ、リンフォトキシン、I
L−２、IL−３およびGM−CSFから成る群の１種類以上の
サイトカインを合成する誘発されたヘルパーＴ細胞の集
団においてこれらの群での少なくとも１種類のサイトカ
インの合成を阻害する性質である。好ましくは、APCs
は、それらが複製することはできないが、それらの抗原
処理機構は機能的に残っているように処理される。これ
は、Ｔ細胞と混合する前に、APCsに、例えば約1500〜30
00R（γ線またはＸ線）を照射することによって好都合
に行われる。

或いは、サイトカイン抑制は、一次または、好ましく
は二次混合リンパ球反応で検定してもよく、この場合、
同系APCsを用いる必要はない。MLRsは当該技術分野で周
知である。例えば、ブラドリー（Bradley）、162〜166
頁、ミッシェル（Mishell）ら監修、Selected Methods
in Cellular Immunology（フリーマン（Freeman）、サ
ン・フランシスコ、1980）；およびバティスト（Battis
to）ら、Meth.in Enzymol.、150巻、83〜91頁（198
0）。簡単に、２種類の集団の同種異系リンパ球を混合
するが、一方の集団を、混合する前に、例えば照射によ
って処理して増殖を防止した。好ましくは、細胞集団
は、補足培地、例えば、10％ウシ胎児血清を含むRPMI16
40中、細胞約２×106個/mlの濃度で調製される。対照お
よび試験培養物双方のために、検定用集団をそれぞれ0.
5ml混合する。二次MLR用に、一次MLRの７日後に残って
いる細胞を、新たに調製され照射された刺激細胞によっ
て再刺激する。CSIFを含むと思われる試料を試験培養物
に加えて同時に混合してもよく、対照および試験培養物
双方のサイトカイン産生について、混合後１〜３日間検
定することができる。

CSIF検定のための得られるＴ細胞集団および／または
APC集団に、ディサベート（DiSabato）ら監修、Meth.in
Enzymol.、108巻（1984）に十分に記載されている当該
技術分野で周知の技法を用いる。好ましいCSIF検定用AP
Csは末梢血液単球である。これらは、例えば、下記に記
載の標準法を用いて得られ、ボイム（Boyum）、Meth.in
Enzymol.、108巻、88〜102頁（1984）；メイジ（Mag
e）、Meth.in Enzymol.、108巻、118〜132頁（1984）；
リトヴィン（Litvin）ら、Meth.in Enzymol.、108巻、2
98〜302頁（1984）；ステュベンソン（Stevenson）、Me
th.in Enzymol.、108巻、242〜249頁（1989）；および
ロメイン（Romain）ら、Meth.in Enzymol.、108巻、148
〜153頁（1984）があり、これらの文献は参考文献とし
て後述される。好ましくは、CSIF検定においてヘルパー
Ｔ細胞を用い、これは、最初に末梢血液からリンパ球を
分離し、次に、商業的に入手可能な抗CD4抗体、例え
ば、米国特許第4,381,295号明細書に記載され且つオル
ト・ファーマソイティカル・コーポレーション（Ortho
Pharmaceu−tical Corp.）から入手可能なOKT4を用い
て、例えばパニング（panning）または流量血球計算に
よってヘルパー細胞を選択することによって得られる。
必要な技法は、ボイム（Boyum）、Scand.J.Clin.Lab.In
vest.、21巻（増補97）、77頁（1968）;Meth.in Enzymo
l.、108巻（上記に引用）；およびブラム（Bram）ら、M
eth.in Enzymol.、121巻、737〜748頁（1986）で十分に
開示されている。一般的には、PBLsは新鮮血液からフィ
コール−ハイパーク（Hypaque）密度勾配遠心法によっ
て得られる。

各種抗原を検定で用いることができ、例えば、カサガ
イのヘモシアニン（KLH）、ニワトリγ−グロブリン等
である。更に好ましくは、検定において、抗原の代りに
ヘルパーＴ細胞を、抗CD3単クローン性抗体、例えば米
国特許第4,361,549号明細書に開示されたOKT3で刺激す
る。

対照および試験試料中のサイトカイン濃度を、標準生
物検定法および／または免疫化学検定法によって測定す
る。特異的サイトカインのための免疫化学検定法の構成
は、当該技術分野で周知であり、精製サイトカインが入
手可能である場合、例えば、カンプベル（Campbell）、
Monoclonal Antibody Technology（エルセヴィア（Else
vier）、アムステルダム、1984）；ティッセン（Tijsse
n）、Practice and Theory of Enzyme Immunoassays
（エルセヴィア、アムステルダム、1985）；米国特許第
4,486,530号明細書が、論題についての広範囲の文献の
例である。ヒトIL−２、ヒトIL−３およびヒトGM−CSF
用のエライザ（ELISA）キットはジェンザイム・コーポ
レーション（Genzyme Corp.）（ボストン、MA）から商
業的に入手可能であり；ヒトIFN−γ用エライザキット
は、エンドジェン・インコーポレッテッド（Endogen,In
c.）（ボストン、MA）から商業的に入手可能である。ヒ
トリンフォトキシンに特異的な多クローン性抗体はジェ
ンザイム・コーポレーションから入手可能であり、これ
をヒトリンフォトキシン用ラジオイムノアッセイで用い
ることができ、例えばチャード（Chard）、An Introduc
tion to Radioimmunoassay andRelated Techniques（エ
ルセヴィア、アムステルダム、1982）がある。

上記に挙げたサイトカインの生物検定法を用いてCSIF
活性を測定することもできる。ヒトリンフォトキシンの
ための生物検定法、アガワール（Aggawal）、Meth.in E
nzymol.、116巻、441〜447頁（1985）およびマテュー
（Matthews）ら、221〜225頁、クレメンス（Clemens）
ら監修、Lymphokines and Interferons:A Practical Ap
proach（IRLプレス、ワシントン、コロンビア特別区、1
987）で開示されている。ヒトIL−２およびGM−CSFは、
ATCCから寄託番号TIB214およびCCL246としてそれぞれ入
手可能な因子依存性細胞系であるCTLL−２およびKG−１
を用いて検定することができる。ヒトIL−３は、例え
ば、メトカーフ（Metcalf）、The Hemopoietic Colony
Stimulating Factors（エルセヴィア、アムステルダ
ム、1984）に記載されたように、軟寒天培地での広範囲
の造血細胞コロニーの形成を刺激するその能力によって
検定することができる。IFN−γは抗ウイルス検定によ
って定量化することができ、例えばメージャー（Meage
r）、129〜147頁、クレメンスら監修（上記に引用）で
ある。

更に、サイトカイン産生をmRNA分析によって測定する
ことができる。サイトカインmRNAは、ホワイト（Whit
e）ら、J.Biol.Chem.、257巻、8569〜8572頁（1982）お
よびジルスピー（Gillespie）ら、米国特許第4,483,920
号明細書で記載されたように、細胞質ドットハイブリダ
イセーションによって測定することができる。他の方法
として、精製RNAを用いるドットブロッティングが挙げ
られ、例えばヘイムズ（Hames）ら監修、Nucleic Acid
Hybrid−ization A Practical Approach（IRLプレス、
ワシントン、コロンビア特別区、1987）第６章がある。
通常、細胞質ドットハイブリダイセーションは、細胞ま
たは組織試料からのmRNAをニトロセルロースなどの固相
支持体上に固定し、DNAプローブをその固定されたmRNA
に対してハイブリッド形成させて、そして固相支持体に
非特異的に結合したプローブ配列を除去するかまたはmR
NAとの不敵正なハイブリッドを形成することを行い、標
的mRNAsとほぼ完全なハイブリッドを形成するプローブ
配列のみが残るようにする。残っているDNAプローブの
量は、固相支持体に固定された標的mRNAの数の目安であ
る。残っているDNAプローブの量は、その標識によって
生じたシグナルによって測定される。いくつかの標準法
が、一重鎖および二重鎖核酸断片を標識するのに利用可
能である。それらには放射性標識の組み込み、例えばハ
ーパー（Harper）ら、Chromosoma、83巻、431〜439頁
（1984）；蛍光標識の直接結合、例えばスミス（Smit
h）ら、Nucleic Acids Rsearch、13巻、2399〜2412（19
85）およびコノリー（Connolly）ら、Nucleic Acids Rs
earch、13巻、4485〜4502（1985）；および核酸断片を
免疫化学的にまたは他のアフィニティー反応によって検
出可能にするそれらの種々の化学的修飾、例えばチェン
（Tchen）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.、81巻、3466〜3470
頁（1984）；リチャードソン（Richardson）ら、Nuclei
c Acids Rsearch、11巻、6167〜6184（1983）；ランガ
ー（Langer）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.、78巻、6633〜6
637頁（1981）；ブリガティ（Brigati）ら、Virology、
126巻、32〜50頁（1983）；ブローカー（Broker）ら、N
ucleic Acids Rsearch、５巻、363〜384（1978）；およ
びベイアー（Bayer）ら、Mathods of Biochemical Anal
ysis、26巻、１〜45頁（1980）が挙げられる。

好ましくは、Ｔ細胞からのmRNAを、下記のプロトコル
によってプローブに対するハイブリダイセーション用に
固定する。単離されたＴ細胞を、溶解緩衝液に［0.14モ
ルNaCl、1.5ミリモルMgCl2、10ミリモルトリス−HCl、p
H8.6、0.5％ノンイデト（Nonidet）Ｐ−40（例えば、シ
グマ（Sigma）からの非イオン性洗剤）］中、４℃で最
終濃度が細胞１×108個/mlで懸濁させることによって溶
解させる。懸濁液を10秒間撹拌し、核をペレットする
（13,000g、2.5分間）。次に、得られる細胞質溶解物
を、20×SSC［１×SSCは、0.15モルNaCl、0.015モルク
エン酸三ナトリウム（標準クエン酸塩）］0.3容量およ
び37％（w/w）ホルムアルデヒド0.2容量が入っている1.
5mlの滅菌試験管に移す。次に、その混合物を60で15分
間インキュベートし且つ少量ずつに分けて−70℃で貯蔵
する。分析用に、各試料15mlを、96ウェルの平底微量滴
定プレート［ファルコン（Falcon）、ベクトン・ディッ
キンソン（Becton Dickinson）、カルフォルニア州、オ
クスナード］に15×SSCを0.1ml入れる連続三倍稀釈によ
って滴定する。各稀釈物を、濾紙［ワットマン（Whatma
n）3mmChr、ワットマン・インコーポレーテッド（Whatm
an Inc.）、ニュー・ジャージー州、クリフトン］上に
支持したナイトラン（Nytran）のシート［シュライヒャ
ー・アンド・シュエル（Schleicher and Schuell）、ニ
ュー・ハンプシャー州、キーンから入手可能な変性ナイ
ロン支持体；細孔度0.45mm］に96倍ミニフォルド（Mini
fold）装置（シュライヒャー・アンド・シュエル）を用
いて吸収させる。次に、ナイトラン紙を焼き（80℃、２
時間）、そして50％ホルムアミド［BRL、ゲイサーズバ
ーグ（Gaithersberg）、MD］、６×SSC、50mg/mlの大腸
菌tRNA（シグマ）、それぞれ0.2％（w/v）のフィコール
（分子量400,000）、ポリビニルピロリドンおよびウシ
血清アルブミン」（BSA）から成るプレハイブリダイセ
ーション溶液で処理する。プローブを、プレハイブリダ
イセーション溶液中、プローブ約50ng/mlの濃度でナイ
トラン支持体に適用する。ハイブリダイセーションに続
いて、支持体を２×SSC中でそれぞれ室温で15分間２回
洗浄し、次に、２×SSC/0.5％SDS中でそれぞれ60℃で30
分間で２回洗浄する。次に、支持体を、増感スクリーン
を用いてフィルムに露出させ且つレーザーデンシトメー
ター［例えば、ウルトロスキャン（Ultroscan）XL、エ
ルケイビー・インストゥルメンツ・インコーポレーテッ
ド（LKB Instruments Inc.）、ゲイサーズバーグ、MD］
を用いて走査することによって定量する。細胞質ドット
ハイブリダイセーションの感度が不十分な場合、好まし
くは、RNAを最初にPBLsから抽出した後にブロッティン
グする。例えば、RNAは、チャーグウィン（Chirgwin）
らによってBiochemistry、18巻、5294〜5299頁（1979）
で開示されたチオシアン酸グアニジウム法によって抽出
することができる。

いくつかの場合において、CSIF活性について試験され
る試料は、予め処理して、検定の妨げとなると思われる
所定のサイトカインを除去しなければならない。例え
ば、IL−２は、ある種の細胞においてIFN−γの産生を
増大させる。したがって、検定に用いられるヘルパーＴ
細胞に応じて、IL−２は試験される試料から除去されて
いなければならないことがある。このような除去は、試
料を標準抗サイトカインアフィニティーカラムに通過さ
せることによって行うのが好都合である。

III.CSIFに特異的な単クローン性抗体およびアンタゴニ
スト 好ましくは、本発明のアンタゴニストはヒトCSIFに特
異的な抗体から誘導される。更に好ましくは、本発明の
アンタゴニストは、ヒトCSIFに特異的な断片または結合
性組成物を含む。抗体は、ジスルフィド架橋によって互
いに結合したポリペプチド鎖のアッセンブリーを含む。
Ｌ鎖およびＨ鎖と称される２種類の主要なポリペプチド
鎖が抗体の主要構造クラス（イソタイプ）全部を構成し
ている。Ｈ鎖およびＬ鎖双方は、可変領域および定常領
域と称される部分に更に分けられる。Ｈ鎖は単一の可変
領域および三つの異なる定常領域を含み、Ｌ鎖は単一の
（Ｈ鎖のもとは異なる）可変領域および単一の（Ｈ鎖の
ものとは異なる）定常領域を含む。Ｈ鎖およびＬ鎖の可
変領域は抗体結合特異性に関与している。

本明細書中で用いられる「Ｈ鎖可変領域」という用語
は、（１）長さがアミノ酸110〜125個であるポリペプチ
ドであって、（２）そのアミノ酸配列が、本発明の単ク
ローン性抗体のＨ鎖のアミノ酸配列に対応して、Ｈ鎖の
Ｎ末端アミノ酸から開始しているポリペプチドを意味す
る。同様に、「Ｌ鎖可変領域」という用語は、（１）長
さがアミノ酸95〜115個であるポリペプチドであって、
（２）そのアミノ酸配列が、本発明の単クローン性抗体
のＬ鎖のアミノ酸配列に対応して、Ｌ鎖のＮ末端アミノ
酸から開始しているポリペプチドを意味する。

本明細書中で用いられる「単クローン性抗体」という
用語は、ヒトCSIFに特異的に結合することができる免疫
グロブリンの均一集団を意味する。

本明細書中で用いられる「結合性組成物」という用語
は、２種類のポリペプチド鎖、すなわち、（１）操作に
関係した場合に、ヒトCSIFに対する結合アフィニティー
が高いコンホーメーションをとるものおよび（２）ヒト
CSIFに特異的な単クローン性抗体を産生するハイブリド
ーマから誘導されるものを含む組成物を意味する。「操
作に関係した」という用語は、２種類のポリペプチド鎖
を、種々の方法によって、例えば、FabまたはFvなどの
本来の抗体断片の組合わせによってまたは遺伝子工学に
よりカルボキシル末端でシステインを含有するペプチド
リンカーによって結合させるために、互いに相対して配
置することができることを示すという意味である。通
常、２種類のポリペプチド鎖はヒトCSIFに特異的な単ク
ローン性抗体のＬ鎖可変領域およびＨ鎖可変領域に対応
する。好ましくは、本発明のアンタゴニストはヒトCSIF
に特異的な単クローン性抗体から誘導される。CSIFを阻
害するかまたは中和することができる単クローン性抗体
は、標準CSIF生物検定においてCSIFに誘発される作用、
例えばIFN−γ合成抑制を阻害するそれらの能力によっ
て選択される。

本発明のハイブリドーマは周知の方法によって生産さ
れる。通常、その方法では、不滅化細胞系と、所望の抗
体を産生するＢリンパ球との融合を行う。或いは、不滅
の抗体産生細胞系を生じるための非融合方法が可能であ
り且つ本発明の範囲内になるが、例えばウイルスによっ
て誘発される形質転換であり、キャサリー（Casali）
ら、「Ｂリンパ球の抗原特異的選択およびEBVによる形
質転換による単クローン性抗体（Human Monoclonals fr
om Antigen−Specific Selection of B Lymphocytes an
d Transformation by EBV）」、Science、234巻、476〜
479ページ（1986）がある。不滅化細胞系は、通常、形
質転換された哺乳動物細胞、特に齧歯類動物、ウシおよ
びヒト起源のミエローマ細胞である。ラットまたはマウ
スのミエローマ細胞系を、便宜上および入手可能性上用
いることが最も多い。標的抗原を注射された哺乳動物か
ら適当なリンパ球を入手する技法は周知である。通常、
ヒト起源の細胞が望ましい場合には末梢血リンパ球（PB
Ls）を用いるかまたは、非ヒト哺乳動物源が望ましい場
合には脾臓細胞もしくはリンパ節細胞を用いる。宿主哺
乳動物に反覆用量の精製抗原を注射し、その哺乳動物で
所望の抗体産生細胞を生じさせた後にそれらを不滅化細
胞系との融合用に集める。融合のための技法も当該技術
分野で周知であり、通常、細胞と融合剤、例えばポリエ
チレングリコールとを混合することを行う。ハイブリド
ーマは、HAT選択などの標準法によって選択される。こ
れらのハイブリドーマの中から、所望の抗体を分泌する
もの、すなわち、ヒトCSIFに特異的なものを、標準免疫
検定法、例えばウェスターン法、エライザ、ラジオイム
ノアッセイ、CSIF中和能等によってそれらの培地を検定
することによって選択する。抗体は、標準タンパク質精
製法を用いて培地から回収され、例えば、テュッセン
（Tijssen）、Practice and Theory of Enzyme Immunoa
ssays（エルセヴィア、アムステルダム、1985）］があ
る。上記の方法のいずれを行う場合にも、指標として多
数の文献が入手可能であり、例えば、コーラー（Kohle
r）ら、Hybridoma Techniques（コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク、1980）；テ
ュッセン、Practice and Theory of Enzyme Immunoassa
ys（エルセヴィア、アムステルダム、1985）；カンプベ
ル（Campbell）、Monoclonal Antibody Technology（エ
ルセヴィア、アムステルダム、1985）；ハレル（Hurrel
l）、Monoclonal Hybridoma Anti−bodies:Techniques
and Applications（シーアールシー・プレス（CRC Pres
s）、ボカ・ラトン、FL、1982）；等がある。次に、ヒ
トCSIFに特異的な単クローン性抗体を産生するハイブリ
ドーマに、上記に記載したCSIF検定を用いる第二のスク
リーンを行って、CSIFの生物学的活性を阻害するかまた
は中和することができるものを選択する。

抗体断片の使用および生産も周知であり、例えば、Fa
b断片：テュッセン、Practice and Theory of Enzyme I
mmunoassays（エルセヴィア、アムステルダム、1985）;
Fv断片：ホフマン（Hochman）ら、Biochemistry、12
巻、1130〜1135頁（1973）、シャロン（Sharon）ら、Bi
o−chemistry、15巻、1591〜1594頁（1976）およびエー
リッヒ（Ehrlich）ら、米国特許第4,355,023号明細書；
および抗体1/2分子：オーディトァ・ハーグレイブス（A
uditore−Hargreaves）、米国特許第4,470,925号明細書
がある。

本発明のハイブリドーマの特徴を示す抗体および抗体
断片も、メッセンジャーRNAを抽出し、cDNAライブラリ
ーを構築し、そして抗体分子の断片をコードするクロー
ンを選択することによる組換え体手段によって生産する
ことができ、例えば、ウォール（Wall）ら、Nucleic Ac
ids Research、５巻、3113〜3128頁（1978）；ザクト
（Zakut）ら、Nucleic Acids Research、８巻、3591〜3
601頁（1978）；キャビリー（Cabilly）ら、Proc.Natl.
Acad.Sci.、81巻、3273〜3277ページ（1984）；ボス（B
oss）ら、Nucleic Acids Research、12巻、3791〜3806
頁（1984）；アムスター（Amster）ら、Nucleic Acids
Research、８巻、2055〜2065頁（1980）；ムーア（Moor
e）ら、米国特許第4,642,334号明細書；スケラ（Serr
a）ら、Science、240巻、1038〜1041（1988）；および
フース（Huse）ら、Science、246巻、1275〜1281（198
9）がある。特に、この種の技法を用いて、ある種の結
合領域が別の種の抗体の非結合領域と結合して免疫原性
を低減させている内部特異的単クローン性抗体を産生す
ることができ、例えば、リュー（Liu）ら、Proc.Natl.A
cad.Sci.、84巻、3439〜3443ページ（1987）がある。

IV.精製および薬剤組成物 本発明のポリペプチドが可溶性形態で、例えば形質転
換された酵母または哺乳動物細胞の分泌生産物として示
される場合、それらを、当該技術分野の標準法にしたが
って精製することができ、例えば、硫酸アンモニウム沈
殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、電気泳
動、アフィニティークロマトグラフィーおよび／または
類似のものであり、例えば、「酵母精製および関連技術
（Enzyme Purification and Related Techniques）」、
Methods in Enzymology、22:233〜577頁（1977）および
スコープス・アール（Scopes,R.）、Protein Purificat
ion:Principles and Practice（スプリンガー・フェア
ラーク（Springer−Verlag）、ニューヨーク、1982）で
このような精製での指標が与えられる。同様に、本発明
のポリペプチドが不溶性形態、例えば集塊、封入体また
は同種のものとして示される場合、それらを、当該技術
分野の標準法によって精製することができ、例えば、遠
心分離によって破壊された宿主細胞から封入体を分離
し、その封入体をカオトロピック剤および還元剤で可溶
化し、可溶化された混合物を稀釈し、そしてカオトロピ
ック剤および還元剤の濃度を低下させてポリペプチドが
生物学的に活性なコンホーメーションをとるようにする
ことである。後者の方法は、参考文献として後述される
下記の文献で開示されており、ウィンクラー（Winkle
r）ら、Biochemistry、25:4041〜4045頁（1986）；ウィ
ンクラーら、Biotechnology、3:992〜998頁（1985）；
コース（Koths）ら、米国特許第4,569,790号明細書；お
よび欧州特許出願第86306917.5号明細書および同第8630
6353.3号明細書がある。

本明細書中で用いられる「有効量」は、自己免疫条件
の症状を回復させるのに十分な量を意味する。特定の患
者に対する有効量は、治療される自己免疫条件、患者の
全身的な健康、投与方法、副作用の苛酷さ等の状態のよ
うな因子に応じて変化してもよい。通常、CSIFは、有効
量のCSIFおよび薬剤担体を含む薬剤組成物として投与さ
れる。薬剤担体は、本発明の組成物を患者に与えるのに
適当な何らかの相溶性無毒性物質であることができる。
概して、このような薬剤の非経口投与に有用な組成物は
周知であり、例えば、Remington′s Pharmaceutical Sc
ience、第15版（マック・パブリッシング・カンパニー
（Mack Publishing Company）、ペンシルバニア州、イ
ーストン、1980）がある。或いは、本発明の組成物を、
移植可能なまたは注射可能な薬剤供給システムによって
患者の体内に導入してもよく、例えば、アーコート（Ur
quhart）ら、Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.、24巻、199
〜236頁（1984）；ルイス（Lewis）監修、Controlled R
elease of Pesticides and Pharmaceuticala（プレナム
・プレス（Plenum Press）、ニューヨーク、1981）；米
国特許第3,773,919号明細書；米国特許第3,270,960号明
細書；等がある。

非経口的に投与される場合、CSIFは薬剤担体に関係し
た注射可能な単位剤形（液剤、懸濁剤、乳剤）で処方さ
れる。このような担体の例は、規定生理食塩水、リンゲ
ル液、デキストロース溶液およびハンクス液である。固
定油およびオレイン酸エチルなどの非水性担体も用いる
ことができる。好ましい担体は５％デキストロース／生
理食塩水である。担体は少量の添加剤、例えば、緩衝剤
および保存剤などの等張性および化学的安定性を増大さ
せる物質を含んでもよい。CSIFは、約５〜20μg/mlの範
囲の濃度で集塊および他のタンパク質を実質的に含まな
い精製された形態で処方されるのが好ましい。好ましく
は、CSIFは、一日当り約50〜800μｇの範囲の量（すな
わち、約１〜16μg/kg/日）が与えられるように連続注
入によって投与される。毎日の注入速度は副作用および
血球数を監視することによって変化してもよい。

CSIFは、CSIF遺伝子を有する発現ベクターによって一
時的にトランスフェクションされるかまたは安定的に形
質転換された哺乳動物細胞の培養物上澄みから精製する
ことができる。好ましくは、CSIFは、pcD発現ベクター
によって一時的にトランスフェクションされたCOS7細胞
の培養物上澄みから精製される。pcDによるCOS7細胞の
トランスフェクションは下記の通りに進行し、すなわ
ち、トランスフェクションの前日に、COS7サル細胞約10
6個を、10％ウシ胎児血清および２ミリモルグルタミン
を含むダルベッコ変性イーグル培地（DME）中の個々の1
00mmプレート上に播種する。トランスフェクションを行
うには、培地を各プレートから吸引し且つ50ミルモルト
リス−HCl、pH7.4、400mg/mlのDEAE−デキストランおよ
びプラスミドDNA50μｇを含むDME4mlで置き換える。プ
レートを37℃で４時間インキュベートした後、DNA含有
培地を除去し、そしてプレートを血清不含DME5mlで２回
洗浄する。DMEをプレートに戻して加え、次に、37℃で
更に３時間インキュベートする。プレートをDMEで１回
洗浄した後、４％ウシ胎児血清、２ミリモルのグルタミ
ン、ペニシリン（100U/リットル）およびストレプトマ
イシン（100μg/リットル）を標準濃度で含むDMEを加え
る。次に、細胞を37℃で72時間インキュベートした後、
CSIFの精製用に増殖培地を集める。或いは、トランスフ
ェクションを実施例に記載のエレクトロポレーション
（electroporation）によって行うことができる。トラ
ンスフェクション用プラスミドDNAは、カサダバン（Cas
adaban）およびコーエン（Cohen）、J.Mol.Biol.、138
巻、179〜207頁（1980）に記載された大腸菌MC1061また
は類似の生物中のCSIFcDNA挿入部分を含むpcD（SRα）
を増殖させることによって得られる。プラスミドDNA
を、例えば、マニアティス（Maniatis）ら、Molecular
Cloning:A Laboratory Manual（コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク、1982）の標
準法によって培養物から単離する。

本発明のアンタゴニストが抗体から誘導される場合、
通常、それらは非経口的に、好ましくは静脈内に投与さ
れる。この種のタンパク質またはペプチドアンタゴニス
トは免疫原性であることがあるので、それらは、通常の
IV投与セットによってかまたはトマシ（Tomasi）ら、米
国特許第4,732,863号明細書に記載の皮下デポーから徐
々に投与されるのが好ましい。非経口的に投与される場
合、抗体および／または断片は、前記の記載したよう
に、薬剤担体に関係した注射可能な単位剤形で処方され
る。抗体は、集塊、他のタンパク質、内毒素等を実質的
に含まない精製された形態で、濃度約５〜30mg/ml、好
ましくは10〜20mg/mlで処方されるのが好ましい。好ま
しくは、内毒素濃度は2.5EU/ml未満である。

アンタゴニストの投与養生法の選択は、いくつかの因
子に依存し、例えば、アンタゴニストの血清回転率、治
療される疾患に関係したCSIFの血清濃度、アンタゴニス
トの免疫原性、標的CSIFの利用可能性（例えば、非血清
CSIFを阻害する場合）、CSIFの１種類または複数のレセ
プターに対するCSIF対アンタゴニストに対するCSIFの相
対アフィニティー等が挙げられる。好ましくは、投与養
生法は、副作用の容認可能な水準と一致して患者に与え
られるアンタゴニストの量を最大限にする。したがっ
て、与えられるアンタゴニストの量は、特定のアンタゴ
ニストおよび治療される症状の苛酷さに部分的に依存す
る。適当な用量を選択する場合の指標は、抗体の治療目
的の使用についての文献で見出され、例えば、バッハ
（Bach）ら、第22章、フェローン（Ferrone）ら監修、H
andbook of Monoclonal Antibodies（ノージス・パブリ
ケーションズ（Noges Publications）、ニュー・ジャー
ジー州、パーク・リッジ、1985）；およびラッセル（Ru
ssell）、303〜357頁、およびスミス（Smith）ら、365
〜389頁、ハーバー（Haber）ら監修、Antibodies in Hu
man Diagnosis and Therapy（レイブン・プレス（Raven
Press）、ニューヨー、1977）がある。好ましくは、ア
ンタゴニストが単クローン性抗体またはそれらの（結合
組成物を含む）Fab大の断片を含む場合は常に、その用
量は約１〜20mg/kg/日の範囲である。更に好ましくは、
用量は約１〜10mg/kg/日の範囲である。

V.遺伝子工学処理された突然変異体CSIFs 核酸配列および／またはアミノ酸配列の情報が本来の
タンパク質のために入手可能であるならば、本来の配列
中で何らかの突然変異をウイルスによって生じるための
種々の方法が入手可能となる。例えば、ショートル（Sh
ortle）、Science、229巻、1193〜1201頁（1985）；ツ
ォラー（Zoller）およびスミス（Smith）、Methods in
Enzymology、100巻、468〜500頁（1983）；マーク（Mar
k）ら、米国特許第4,518,584号明細書；ウェルズ（Well
s）ら、Gene、34巻、315〜323頁（1985）；エステル（E
stell）ら、Science、233巻、659〜663頁（1986）；ム
レンバッハ（Mullenbach）ら、J.Biol.Chem.、261巻、7
19〜722頁（1986）およびフェレッティ（Feretti）ら、
Proc.Natl.Acad.Sci.、83巻、597〜603頁（1986）。し
たがって、これらの文献参考文献として後述される。

天然のポリペプチドの突然変異タンパク質は、様々な
場合に望ましいことがある。例えば、望ましくない副作
用は、特に、その副作用活性が、所望の活性を有するポ
リペプチド部分とは異なるポリペプチド部分に関係して
いる場合に、ある種の突然変異タンパク質によって減少
すると考えられる。ある種の発現システムにおいて、本
来のポリペプチドはプロテアーゼによって分解されやす
いことがある。このような場合、その感受性配列を変化
させるアミノ酸の選択された置換および／または欠失
が、収量を有意に増大させることがあり、例えば、米国
特許出願第2173−804−Ａ号明細書では、ヒト組織プラ
スミノーゲン活性化因子の275位のArgがGlyまたはGluに
よって置換されている。突然変異タンパク質は、更に、
酸化、アシル化、アルキル化または他の化学的修飾を受
けやすいアミノ酸を除去することによって、精製方法で
の収量を増加させることができるしおよび／またはタン
パク質の有効寿命を増大させることができる。例えば、
メチオニンは容易に酸化されてスルホキシドを生成し、
多数のタンパク質では、それが生物学的活性の損失に関
係している。例えば、ブロート（Brot）およびワイスバ
ッハ（Weissbach）、Arch.Biochem.Biophys.223巻、271
頁（1983）。メチオニンは、生物学的活性の損失がほと
んどまたは全くない更に不活性なアミノ酸で置換するこ
とができることが多い。例えば、オーストラリア特許出
願第AU−Ａ−52451/86号明細書。細菌の発現システムで
は、コンホーメーションに必要がないシステイン残基を
除去または置換することによって収量を増大させること
ができることがある。例えばマーク（Mark）ら、米国特
許第4,518,584号明細書。好ましくは、カセット突然変
異誘発を用いて突然変異体タンパク質を生じさせる。合
成遺伝子は、遺伝子に沿っておよそ均一に間隔をおいた
制限エンドヌクレアーゼ部位の配列によって構築され、
これらの制限エンドヌクレアーゼ部位は、遺伝子が適当
なベクターに挿入されている場合でも特有なままである
ように選択される。この特有な制限部位は、遺伝子の断
片が好都合に削除されるかまたは望ましい突然変異をコ
ードする合成オリゴヌクレオチド（すなわち、「カセッ
ト」）で置換されることを可能にする。特有な制限部位
の数および分布の決定にはいくつかの因子を考慮する必
要があり、（１）発現に用いられるベクター中に前から
存在している制限部位、（２）種特異性かまたは属特異
性コドン処理が望ましいかどうかということ、（３）異
なる非ベクターの切断制限エンドヌクレアーゼの利用可
能な数（およびそれらの合成遺伝子内の多重度）および
（４）特有の制限部位の間に断片を合成することおよび
／または配列させることの便利さおよび確実性が挙げら
れる。

上記の方法は、本来のタンパク質配列においてアミノ
酸置換等を保存性にするのに好都合な方法である。本明
細書中で用いる「保存性」は、（ｉ）その変化がコンホ
ーメーション上可能な限り中立である、すなわち、突然
変異体ポリペプチドの三次構造の変化を、本来のタンパ
ク質と比較して最小にするように設計されていること、
および（ii）その変化が抗原として可能な限り中立であ
る、すなわち、突然変異体ポリペプチドの抗原決定基の
変化を、本来のタンパク質と比較して最小にするように
設計されていることを意味する。コンホーメーションの
中立性は生物学的活性を維持するのに望ましいし、抗原
の中立性は、本発明の化合物を用いて治療されている患
者または動物での免疫原性反応の誘発を避けるのに望ま
しい。変化したものがコンホーメーション上および抗原
として中立であるという絶対的な必然性をもって選択す
るのは困難であるが、コンホーメーション上および抗原
として中立である確率が高い変化を生じるように当業者
に指標を与えることができる法則が存在し、例えば、ア
ンフィセン（Anfisen）（上記に引用）；ベルツォフス
キ（Berzofsky）、Science、229巻、932〜940頁（198
5）；およびボーイ（Bowie）ら、Science、247巻、1306
〜1310頁（1990）がある。若干のより重要な法則とし
て、（１）疎水性残基の置換は、それらが他タンパク質
の内部に位置しているらしいので、抗原性の変化をほと
んど生じさせないらしいこと、例えば、ベルツォフスキ
（上記に引用）およびボーイら（上記に引用）（２）物
理科学的に類似の、すなわち、同義の残基の置換は、置
換するアミノ酸が置換されるアミノ酸と同じ構造的役割
を果たすことができるので、コンホーメーションの変化
をほとんど生じさせないらしいこと；および進化論的に
保存された配列の変化は、進化論的保存性によって、配
列が機能的に重要であることがあると示唆されるので、
有害なコンホーメーション上の作用を生じさせるらしい
こと；が挙げられる。突然変異タンパク質の配列を選択
するためのこのような基本的な法則に加えて、検定法
は、工学処理された分子の生物学的活性およびコンホー
メーションを確証するのに利用可能である。本発明のポ
リペプチドについての生物検定法は前記に十分に記載さ
れている。コンホーメーションの変化は、少なくとも２
種類の周知の検定法によって試験することができ、すな
わち、微量補体結合法が、例えば、ワッセルマン（Wass
erman）ら、J.Immunol.、87巻、290〜295頁（1961）ま
たはレヴィン（Levine）ら、Methods in Enzymology、1
1巻、928〜936頁（1967）でタンパク質の三次構造の進
化論的研究において広範に用いられ；そしてコンホーメ
ーション特異性単クローン性抗体のセットに対するアフ
ィニティーについては、例えば、ルイス（Lewis）ら、B
iochemistry、22巻、948〜954頁（1983）で用いられて
いる。

VI.ヒトCSIFペプチド抗体 本発明は、ヒトCSIFから誘導されたペプチドと、担体
および本発明のペプチドの間の共役から成る免疫原とを
含む。本明細書中で用いられる免疫原という用語は、免
疫応答を引起こすことができる物質を意味する本明細書
中で用いられる担体という用語は、本発明のペプチドに
化学的に共役した場合に、得られた共役によって免疫性
を与えられた宿主生物が共役したペプチドに特異的な抗
体を生じることを可能にする任意の物質を意味する。担
体として、赤血球、バクテリオファージ、タンパク質お
よび合成粒子、例えばアガロースビーズが挙げられる。
このましくは、担体はタンパク質であり、例えば血清ア
ルブミン、γ−グロブリン、カサガイのヘモシアニン、
サイログロブリン、オボアルブミン、フィブリノーゲン
または同種のものである。

本発明のペプチドは、標準法によって合成され、例え
ばスチュワート（Stewart）およびヤング（Young）、So
lid Phase Peptide Synthesis、第２版（ピアス・ケミ
カル・カンパニー（Pierce Chemical Company）、イリ
ノイ州、ロックフォード、1984）がある。好ましくは、
市販のペプチド合成機を用い、例えばアプライド・バイ
オシステムズ・インコーポレーテッド（Applied Biosys
tems Inc.）（フォスター・シティ、CA）の430A型であ
る。本発明のペプチドは、架橋ポリスチレン支持体上の
固相合成によって、カルボキシル末端基から開始し且つ
アミノ酸を段階的に、完全なペプチドが形成されるまで
加えて組立てられる。下記の文献が、合成の際に用いら
れる化学に対する指標であり、メリフィールド（Merrif
ield）、J.Amer.Chem.Soc.、５巻、2149頁（1963）；ケ
ント（Kent）ら、Peptides 1984の185頁、ラグナーソン
（Ragnarsson）監修（アルムクイスト・アンド・ウェク
セル（Almquist and Weksell）、ストックホルム、198
4）；ケントら、Peptide Chemistry 84の217頁、イズ
ミヤ（Izumiya）監修（プロテイン・リサーチ・ファウ
ンデーション・ビー・エイチ（Protein Research Found
ation,B.H.）、大阪、1985）；メリフィールド、Scienc
e、232巻、341〜347頁（1986）；ケント、Ann.Rev.Bioc
hem.57巻、957〜989頁（1988）；およびこれらの最後の
二つの文献で引用された文献がある。

固体状態の合成では、主として終結、欠失または修飾
ペプチドである合成副生成物を除去することが最も重要
である。大部分の副反応は、十分に特徴化された樹脂で
あるクリーン（clean）、クリーンアミノ酸誘導体、ク
リーン溶媒、並びに適当なカップリング方法、開裂方法
および反応条件の選択によって除去するかまたは最小限
にすることができ、例えばバラニー（Barany）およびメ
リフィールド、The Peptides、クロス（Cross）および
マイエンホーファー（Meienhofer）監修、２巻、１〜28
4頁（アカデミック・プレス（Academic Press）、ニュ
ーヨーク、1979）がある。カップリング反応を監視し
て、それらの反応が完了して、１個以上の残基を欠いて
いる欠失ペプチドが無くなるようになるまで進行するこ
とを確認することが重要である。定量的ニンヒドリン反
応はその目的に有用であり、サリン（Sarin）ら、Anal.
Biochem.、117巻、147頁（1981）がある。Na−ｔ−ブチ
ルオキシカルボル（ｔ−Boc）−アミノ酸を、鎖を組立
てる条件に対して安定であるが強酸に対して不安定であ
る適当な側鎖保護基と一緒に用いる。保護されたペプチ
ド鎖を組立てた後、保護基を除去し、そしてペプチドを
固定している結合を、チオエステル掃去剤存在下、無水
フッ化水素の低濃度、続いて高濃度を用いることによっ
て開裂させる。タム（Tam）ら、J.Amer.Chem.Soc.、105
巻、6442頁（1983）。用いることができる適当な側鎖保
護基は、問題のアミノ酸についての三文字の略号の後に
保護基を括弧に入れて表示され、Asp（OBzl）、Glu（OB
zl）、Ser（Bzl）、Thr（Bzl）、Lys（Cl−Ｚ）、Tyr
（Br−Ｄ）、Arg（NGTos）、Cys（４−MeBzl）およびHi
s（ImDNP）である（Bzlはベンジルであり;Tosはトルエ
ンスルホキシルであり;DNPはジニトロフェニルであり;I
mはイミダゾールであり;Zはベンジルオキシカルボニル
である）。残りのアミノ酸には側鎖保護基が存在しな
い。サイクル毎に、（ｔ−Boc Na）保護ペプチド樹脂
を、ジクロロメタン（DCM）［マレンクロット（Mallenc
krodt）］中、65％の（使用前に蒸留した）トリフルオ
ロ酢酸［イーストマン・コダック（Eastman Kodak）か
ら］に対して最初に１分間、続いて13分間暴露してNa保
護基を除去する。ペプチド樹脂をDCM中で洗浄し、ジメ
チルホルムアミド（DMF）（アプライド・バイオシステ
ムズ）中、10％のジイソプロピルエチルアミン（DIEA）
［アルドリッチ（Aldrich）］でそれぞれ１分間２回中
和する。中和はDMFで洗浄することによって行われる。
アミノ酸の対称無水物とのカップリングをDMF中で16分
間行う。対称無水物は、合成機で、DCM6ml中、２ミリモ
ルのアミノ酸を溶解させ、DCM2ml中、１ミリモルのジシ
クロヘキシルカルボジイミド（アルドリッチ）を加える
ことによって調製された。５分後に活性アミノ酸を別の
容器に移し、窒素ガスの連続流でパージすることによっ
てDCMを蒸発させる。DCMは、パージングの際の種々の段
階でDMF（全量6ml）によって置き換えられる。最初のカ
ップリン後、ペプチド樹脂を、DCM、DCM中10％DIEA、続
いて、DCMで洗浄する。再カップリングには、同じアミ
ノ酸および活性剤ジシクロヘキシルカルボジイミドを反
応容器に連続的に移す。現場での活性化および10分間の
カップリングの後、十分なDMFを加えて50％DMF−DCM混
合物を作り、カップリングを15分間続ける。アルギニン
をDMF中のヒドロキシベンゾトリアゾール（アルドリッ
チ）エステルとして60分間結合させた後、他のアミノ酸
と同じ方法で再結合させる。アスパラギンおよびグルタ
ミンをDMF中のヒドロキシベンゾトリアゾールエステル
としてそれぞれのカップリングに40分間２回結合させ
る。全部の残基について、第二のカップリング後に樹脂
を洗浄し、そして残留する未結合α−アミンをサリンら
（上記に引用）の定量的ニンヒドリン反応によって監視
するために、試料を自動的に採取する。

合成ペプチドを担体に結合させる一般的な方法は、い
くつかの文献に記載されている。例えば、ワルター（Wa
lter）およびドーリトル（Doolittle）、「合成ペプチ
ドに対する抗体（Antibodies Against Synthetic Pepti
des）」、セトロー（Setlow）ら監修、Genetic Enginee
ring、５巻、61〜91頁（プレナム・プレス（Plenum Pre
ss）、ニューヨーク、1983）；グリーン（Green）ら、C
ell、28巻、477〜487頁（1982）；ラーナー（Lerner）
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.、78巻、3403〜3407頁（198
1）；シミズ（Shimizu）ら、米国特許第4,474,754号明
細書；およびガンフィールド（Ganfield）ら、米国特許
第4,311,639号明細書がある。したがって、これらの文
献は参考文献として後述される。更に、ハプテンを担体
に結合させるのに用いられる方法は、前記で論及した方
法、例えば、テュッセン（Tijsseu）のPractice and Th
eory of Enzyme Immunoassays（エルセヴィア、ニュー
ヨーク、1985）の第８章の方法と本質的に同じである。
ペプチドを担体に結合させるための４種類の最も一般的
に用いられるスキームは、（１）例えば、カーガン（Ka
gan）およびグリック（Glick）、ジェフ（Jaffe）およ
びベアマン（Bahrman）監修、Methods of Hormone Radi
oimmunoassay、328〜329頁（アカデミック・プレス（Ac
ademic Press）、ニューヨーク、1979およびワルター
（Walter）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.、77巻、5197〜520
0頁（1980）に開示のアミノカップリング用のグルタル
アルデヒド；（２）ホー（Hoare）ら、J.Biol.Chem.、2
42巻、2447〜2453頁（1967）に開示のカルボキシル−ア
ミノカップリング用水溶性カルボジイミド；（３）バシ
リ（Bassiri）ら、ジェフおよびベアマン監修（上記に
引用）の46〜47頁およびワルターら（上記に引用）に開
示のチロシン−チロシン側鎖カップリング用ビス−ジア
ゾベンジジン（DBD）；および（４）キタガワ（Kitagaw
a）ら、J.Biochem.（東京）、79巻、233〜239頁（197
6）およびラーナーら、（上記に引用）に開示のシステ
イン（または他のスルフィドリル）−アミノ基をカップ
リングするためのマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル（MBS）；である。所定のペ
プチドをタンパク質担体にカップリングさせるのに適当
な方法を選択するための通則は下記の通り記述すること
ができる。すなわち、結合に関係する基は、配列におい
て１回だけ、好ましくは断片の適当な末端で生じなけれ
ばならない。例えば、BDBは、チロシン残基がその可能
な抗原性に選択された配列の主要部分で生じるならば用
いるべきではない。同様に、中央に位置したリシンはグ
ルタルアルデヒド法から除外され、アスパラギン酸およ
びグルタミン酸の発生はカルボジイミドの方法を妨げる
ことが多い。一方において、適当な残基を、それらが
「本来の」タンパク質配列で生じるにせよ生じないにせ
よ、結合部位として選択された配列断片のどちらの末端
にも配置することができる。アミノ末端基およびカルボ
キシル末端基と異なる内部断片は、それが、ポリペプチ
ド主鎖が連続している本来のタンパク質で見出される場
合の同じ配列とは、「非結合末端」でかなり異なってい
る。その問題は、α−アミノ基をアセチル化した後、そ
れにペプチドをそのカルボキシル末端基によって結合さ
せることにより、ある程度まで改善することができる。
担体タンパク質に対するカップリング効率は、合成の一
段階で放射性アミノ酸を用いることによってかまたは完
成したペプチドをチロシン残基のヨウ素化により標識す
ることによって調製された放射性標識ペプチドを用いる
ことによって好都合に測定される。ペプチド中のチロシ
ンの存在は、所望ならば、鋭敏なラジオイムノアッセイ
を行うことを更に可能にする。したがって、チロシン
は、それが本来のポリペプチドによって定義されたペプ
チド配列の一部分ではない場合、末端基として導入する
ことができる。

好ましい担体はタンパク質であり、好ましいタンパク
質担体として、ウシ血清アルブミン、ミオグロブリン、
オボアルブミン（OVA）、カサガイのヘモシアニン（KL
H）等が挙げられる。ペプチドは、リュー（Liu）ら、Bi
ochemistry、18巻、690〜697頁（1979）で開示のMBSに
よって、システインを介してKLHに結合させることがで
きる。ペプチドをリン酸塩緩衝生理食塩水（pH7.5）、
0.1モルホウ酸ナトリウム緩衝液（pH9.0）または1.0モ
ル酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）に溶解させる。ペプ
チドが溶解するpHを選択してペプチドの溶解性を最適に
する。可溶性ペプチドのための遊離システテイン含量
は、エルマン法（Ellman′s method）、エルマン（Ellm
an）、Arch.Biochem.Biophys.、82巻、7077頁（1959）
によって決定される。各ペプチドについて、10ミリモル
のリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）0.25ml中、4mgのKL
Hを、（ジメチルホルムアミドに溶解した）MBS0.7mgと
反応させ、室温で30分間撹拌する。KLHは30％を越える
ホルムアミドに不溶性であるので、MBSを滴加して、ホ
ルムアミドの局部的濃度が高くなりすぎないことを確実
にする。反応生成物であるKLH−MBSを、次に、50ミリモ
ルリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）で平衡にしたセフ
ァデックス（Sephadex）Ｇ−25に通過させて遊離MBSを
除去する。カラム溶出液の（OD280で監視された）ピー
ク画分からのKLHの回収率は約80％であると推定され
る。次に、KLH−MBSを、選択された緩衝液1ml中に溶解
したペプチド5mgと反応させる。pHを７〜7.5に調整し、
反応を室温で３時間撹拌する。カップリング効率は、放
射性ペプチドを用いて、リン酸塩緩衝生理食塩水に対す
る共役の試料の透析によって監視しされ、８％〜60％で
ある。ペプチド−担体の共役が利用可能になれば、多ク
ローン性抗体または単クローン性抗体が、例えば、カン
プベル（Campbell）、Monoclonal Antibody Technology
（エルセヴィア、ニューヨーク、1984）；ハレル（Hurr
ell）監修、Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniq
ues and Applications（CRCプレス、ボカ・ラトン、F
L、1982）；シュライアー（Schreier）ら、Hybridoma T
echniques（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー、ニューヨーク、1980）；米国特許第4,562,003
号明細書；等で開示の標準法によって生産される。特
に、米国特許第4,562,003号明細書は参考文献として後
述される。

多クローン性抗体および単クローン性抗体双方をエラ
イザによってスクリーンすることができる。他の固相免
疫検定でのように、試験は、プラスチックに対して非特
異的に吸着する巨大分子の性質に基づく。この反応の不
可逆性は、免疫学的活性を損失することなく抗原−抗体
複合体の生成を可能にし、このような複合体は非結合物
質から簡単に分離される。抗ペプチド血清を滴定するに
は、免疫に用いられたものとは異なる担体に対して共役
したペプチドを96ウェル微量滴定プレートのウェルに吸
着させる。次に、吸着した抗原を抗ペプチド血清の稀釈
液とウェル中で反応させる。非結合抗体を洗い落とし、
残留する抗原−抗体複合体を、免疫された動物のIgGに
特異的な抗体と反応させる。この第二の抗体をアルカリ
性ホスファターゼなどの酵素に共役させる。酵素基質が
加えられた場合に生じた可視的に着色した反応生成物
は、ウェルに抗ペプチド抗体が結合したことを示す。分
光光度計の読みを用いることによって、結合したペプチ
ド特異性抗体の量の更に満足のいく定量化が可能にな
る。高滴定量の抗血清により、10−３〜10−５の稀釈度
の直線状の滴定曲線が得られる。

実施例 下記の実施例は、本発明を例証するためのものであ
る。ベクターおよび宿主の選択並びに試薬の濃度、温度
および他の変数値は、本発明の方法を単に例示するため
のものであり、発明を制限すると考えるべきではない。

実施例I. マウスCSIFの生物学的活性 いくつかのＴ細胞クローンからのマウスCSIF含有上澄
みは、Ｔ細胞クローン（細胞５×106個/ml）を、血清不
含培地（フェノールレッドを欠いていて且つ0.05ミリモ
ルの２−メルカプトエタノールおよび20ミリモルのHEPE
Sを含むPRMI 1640）およびコンカナバリンＡ（５μg/m
l）中で24時間インキュベートすることによって得られ
た。クローンには細胞系が含まれており、米国特許第4,
613,459号明細書に記載されたD9;（下記に記載される）
D10;モスマン（Mosmann）ら、J.Immunol.、136巻、2348
〜2357頁（1986）に記載されたMB2−1;トニー（Tony）
ら、J.Exp.Med.、161巻、223頁（1985）に記載されたCD
C25およびCDC35;並びにM411−２およびm411−６であっ
た。Ｔ細胞上澄みは、チェルヴィンスキ（Cherwinski）
ら、J.Exp.Med.166巻、1229〜1244頁（1987）に記載さ
れた細胞系HDK−１においてIFN−γ合成を抑制するそれ
らの能力について検定された。各Ｔ細胞クローンからの
試料の連続二倍稀釈は、容量0.05mlの96ウェル平底微量
滴定トレイ中で調製された。HDK−１細胞（細胞５×104
個／ウェル）を、照射された（2500R）同系のAPCs（脾
臓細胞、５×105個／ウェル）および抗原（カサガイの
ヘモシアニン150μg/ml）と一緒に容量0.15mlで加え
た。オーハラ（Ohara）ら、Nature、351巻、333〜336頁
（1985）に記載された11B−11抗IL−４抗体（10μg/m
l）を、IL−４を含むことが予想される試料に加えた。3
7℃で24時間インキュベーション後、上澄みを集めて、4
0℃で１週間未満または80℃で更に長期間の間保存し
た。IFN−γの濃度を、ラット抗マウスIFN−γ単クロー
ン性抗体、XMG1.2およびアフィニティー精製ウサギ抗マ
ウスIFN−γ抗体を用いる二か所サンドイッチエライザ
によって検定した。図１に、IFN−γ合成の抑制度を対
照濃度の百分率として示す。

D10細胞によって産生されたCSIFを不完全に精製し且
つ２種類の異なるＴ細胞クローンに適用して、サイトカ
イン合成抑制の程度をCSIF濃度の関数として調べた。不
完全に精製されたCSIFは、下記のように調製された。す
なわち、１〜2.5リットルのバッチのコンカナバリンＡ
に誘発されたD10上澄みを、アミコン（Amicon）YM−５
膜（アミコン・コーポレーション（Amicon Corp.）、マ
サチューセッツ州、ダンバーズ）を用いて約10倍に濃縮
し、5mlのマンノース共役アガロースカラム（イー・ワ
イ・ラボラトリーズ（Ｅ−Y Laboratories）、カリフォ
ルニア州、サン・マテオ）に通過させ、続いて更に、も
う一度３〜５倍に濃縮して全部で30〜50倍に濃縮した。
次に、この材料を二段階の高速液体クロマトグラフィ
ー、すなわち、最初に、ヒドロキシルアパタイト基剤カ
ラム［バイオ・ゲル（Bio−Gel）HPHT、バイオ・ラド・
ラボラトリーズ（Bio−Rad Laboratories）、カリフォ
ルニア州、リッチモンド）で、そして次に、ゲル濾過カ
ラム［TSK−G 3000 SW、長さ60cm、エルケイビー・イン
ストゥルメンツ（LKB Instruments）、ゲイサーズバー
グ・MD］によって更に精製した。このような不完全に精
製されたCSIFのバッチの一つを分別して−80℃保持し、
CSIF活性の標準として用いた。最初に検定した場合、こ
の調製試料は、検定容量0.2ml中、1/200の稀釈度でIFN
−γ産生の抑制約50％を生じ、それゆえ、標準単位は、
標準CSIF調製試料の値を1000U/mlとすることによって定
義された。下記の各検定において、未知試料のCSIF活性
は、既知試料によるIFN−γ合成の抑制量を標準の量に
対して比較することによって定量化された。サイトカイ
ン合成の抑制について検定されたＴ細胞クローンは（前
記に記載された）HDK−１およびCell.Immunol.、97巻、
357頁（1986）に記載されたMD13−10であった。IL−３
およびGM−CSF濃度の検定では、不完全に精製されたCSI
Fを、抗IL−３および抗GM−CSFアフィニティーカラムに
それを通過させることによって更に処理した。0.1モルN
aCl、0.1モルHEPESおよび0.08モルCaCl2中の抗体を、４
℃で４時間静かに混合することによってアフィ・ゲル
（Affi−Gel）10（バイオ・ラド）に結合させた。１〜2
mlのカラムそれぞれに、結合した抗体約10〜20mgが含ま
れた。

下記の表に示したように、IFN−γ産生は両方のクロ
ーンにおいて抑制された。他のサイトカインのIL−２、
リンフォトキシン、IL−３およびGM−CSFの合成は、MD1
3−10細胞においてわずかな程度でしかまたは全く抑制
されなかった。

実施例II. D10細胞からのcDNAライブラリーの構築およ
びクローンpcD（SRα）−F115の単離 cDNAライブラリーは、ケイ（Kaye）ら、J.Exp.Med.、
158巻、836頁（1983）に記載されたD10細胞から抽出さ
れたmRNAからのpcD（SRα）ベクターにおいて、オカヤ
マ（Okayama）およびベルグ（Berg）、Mol.Cell.Bio
l.、2:161〜170頁（1982）および3:280〜289頁（1983）
の、そして更に、参考文献として後述される米国特許第
4,695,542号明細書で開示された方法にしたがって構築
された。cDNA挿入部分を有するpcD（SRα）ベクターは
大腸菌において増幅された。プラスミドDNAは、これら
の無作為に採取されたクローンのプールから抽出され且
つ下記に記載のCOS7サル細胞のトランスフェクションに
用いられた。次に、COS7培養物の上澄みのCSIF活性につ
いて試験した。COS細胞のトランスフェクションは下記
のように行った。すなわち、トランスフェクションの前
日に、COS7サル細胞約1.5×106個を、個々の100mmプレ
ート上の、５％ウシ胎児血清（FCS）および２ミリモル
グルタミンを含むダルベッコ変性イーグル培地（DME）
中に播種した。トランスフェクションを行うために、CO
S7細胞を、トリプシンと一緒にインキュベーションする
ことによってその皿から取出し、血清不含DME中で２回
洗浄し、そして血清不含DME中、細胞107個/mlに懸濁さ
せた。0.75ml部分をDNA20μｇと混合し且つ0.4cmの滅菌
エレクトロポレーションキュベットに移した。10分後、
細胞をバイオラドジーンパルサー（BioRad GenePulse
r）装置中、200ボルト、960μＦで振動させた。更に10
分後、細胞をキュベットから取出し、５％FCS、２ミリ
モルのグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンお
よびゲンタマイシンが入っているDME20mlに加えた。混
合物を100mmの組織培養皿４個に分取した。37℃、５％C
O2で12〜24時間後、培地を、１％FCSのみを含む同様の
培地で置き換え、インキュベーションを37℃、５％CO2
で更に72時間続けた後、培地を集め、CSIF活性について
検定した。続いて、pcD（SRα）−F115のcDNA挿入部分
の最大の読み取り枠の配列を下記の通り決定し、 そしてハイン（Heijne）アルゴリズムによって決定され
た成熟マウスCSIFタンパク質のアミノ酸配列は下記の通
りである。

実施例III. pcD（SRα）−F115から誘導されたプロー
ブを用いるヒトCSIF用のcDNAライブラリーのスクリーニ
ング:pH5CおよびpH15Cの単離 ヒトＴ細胞クローンから抽出されたmRNAからのpcD（S
Rα）において構築されたcDNAライブラリーは、オリゴ
ヌクレオチドの配列が成熟CSIFをコードするマウスCSIF
遺伝子の断片のコードおよび非コードストランドに対し
て相補的である70マーのオリゴヌクレオチドの集合を用
いてスクリーンされた。標準ハイブリダイゼーションプ
ロトコルを用い、例えば、150mmペトリ皿上で増殖した
細菌のコロニーをジーンスクリーン（GeneScreen）膜に
移し、放射性標識したオリゴヌクレオチドプローブを用
いて処理し、洗浄した後、Ｘ線フィルムに露出した。プ
ローブを、プローブの長さのための低緊縮条件下でハイ
ブリッド形成し、すなわち、標的核酸を５×SET（20×S
ETは３モルNaCl＋0.4トリス−Cl（pH7.8）＋20ミリモル
EDTAである）中、60℃でインキュベーションすることか
ら成るプレハイブリダイセーションに続いて、同じ条件
下でハイブリダイセーションを行い、そして５×SET中5
0℃で洗浄した。プラスミドpH5CおよびpH15Cを有する２
種類のクローンを同定した。双方のラスミドが、PHAで
刺激されたヒトPBLsにおけるIFN−γ合成を抑制するこ
とができるCOS7細胞のタンパク質を発現した。pH15Cのc
DNA挿入部分を図４に図示し、その最大読み取り枠のヌ
クレオチド配列を下記に示す。

実施例IV. CSIFに特異的な単クローン性抗体 雄のルイスラットを、COS7細胞で発現されたヒトCSIF
の半精製調製試料で免疫した。最初に、ラットを完全フ
ロイントアジュバント中約50μｇのヒトCSIFで免疫し、
完全フロイントアジュバンド中の同量の材料で２回追加
投与した。試験血液を採取した。被験動物にリン酸塩緩
衝生理食塩水中20μｇの最終の追加抗原を与え、４日後
にその脾臓を融合用に入手した。

ラットの脾臓細胞約３×108個を、等数のP3X63−AG8.
653マウスミエローマ細胞（ATCCから寄託番号CRL1580と
して入手可能）と融合する。3840個の微量滴定プレート
ウェルに5.7×104個／ウェルの親ミエローマ細胞を播種
する。融合およびそれに続いてハイブリッドを培養する
ための標準プロトコルを、例えばクレティン（Chretie
n）ら、J.Immunol.Meth.、117巻、67〜81ページ（198
9）で記載されたように行う。融合後12日目に上澄みを
採取し且つ間接エライザにより、CSIF COS7細胞におい
て産生されたヒトでコートされたPVCプレート上でスク
リーンする、ハイブリドーマJES3−19F1をこの方法で同
定し、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
に寄託した。

阻止抗体を産生するハイブリドーマを、最初にスクリ
ーンされたハイブリドーマから、PHAで刺激されたヒトP
BLsにおけるIFN−γ合成についてのCSIFに誘発された抑
制に対して反応に作用する抗体を産生するそれらの能力
によって選択する。

実施例V. 細胞宿主におけるヒトCSIFの発現 合成ヒトCSIF遺伝子を多数の化学的に合成された二重
鎖DNA断片から組立てて、TAC−RBS−hCSIFと称される発
現ベクターを形成する。クローニングおよび発現は、標
準細菌システム、例えば、ヴィエラ（Viera）およびメ
スィング（Messing）によってGene、19巻、259〜268頁
（1982）に記載された大腸菌Ｋ−12菌株であるJM101、J
M103等で行われる。制限エンドヌクレアーゼ消化および
リガーゼ反応は、標準プロトコル、例えば、マニアティ
ス（Maniatis）ら、Molecular Cloning:A Laboratory M
anual（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー、ニューヨーク、1982）を用いて行われる。

小規模のプラスミド調製試料にはアルカリ法（マニア
ティスら、上記に引用）を用いる。大規模の調製試料に
はアルカリ法の変法を用いて、開裂した溶解物から核酸
を沈殿させるのに等量のイソプロパノールを用いる。2.
5モルの冷酢酸アンモニウムによる沈殿を用いてRNAを除
去した後、塩化セシウム平衡密度遠心法および臭化エチ
ジウムによる検出を行う。

フィルターハイブリダイセーションにはワットマン
（Whatman）540フィルターサークルを用いてコロニーを
持ち上げた後、逐次的に、0.5モルNaOH、1.5モルNaCl;1
モルトリス−HCl、pH8.0、1.5モルNaClによる処理（そ
れぞれ２分間）；および80℃（30分間）での加熱を行う
ことによって溶解させ且つ固定する。ハイブリダイセー
ションは、６×SSPE、20％ホルムアミド、0.1％ドデシ
ル硫酸ナトリウム（SDS）、大腸菌tRNA100mg/ml、コー
マシー・ブリリアントブルー（Coomassie Brilliant Bl
ue）Ｇ−250（バイオ・ラド）100mg/ml中、42℃で６時
間行い、32P標識（キナーゼ作用による）合成DNAsを用
いる。（20×SSPEは、NaClを174g、EDTAを7.4gおよびNa
H2PO4・9H2Oを27.6g水800ml中に溶解させることによっ
て調製され、そのpHはNaOHを用いて7.4に調整し、容量
は１リットルに調整し、そして溶液をオートクレーブに
よって滅菌する。）フィルターを１×SSPE、0.1％SDSで
２回（室温で15分間）洗浄する。オートラジオグラフィ
ー［フジ（Fuji）RXフィルム］後、陽性のクローンを、
再増殖したコロニーとフィルター上の青色に染色された
コロニーとを一緒に配列させることによって定着させ
る。DNA、サンガー（Sanger）ら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.、74巻、5463頁（1977）のジデオキシ法によって配列
させる。ジデオキシ反応の鋳型は、M13mpベクターに再
クローン化された適当な領域の一重鎖DNAs［例えば、メ
スィング（Messing）ら、Nucleic Acids Res.、９巻、3
09頁（1981）］かまたは、ミニアルカリ法によって調製
され、0.2モルNaOHで変性され（室温で５分間）且つ２
容量のエタノールの添加により0.2モルNaOH、0.43モル
酢酸アンモニウムから沈殿した二重鎖DNAである。DNA
を、ホスホラミダイト化学によってアプライド・バイオ
システムズ（Applied Biosystems）380A合成機を用いて
合成する。合成、脱タンパク質、開裂および精製（7M
尿素 PAGE、溶離、DEAE−セルロースクロマトグラフィ
ー）を、380A合成機のマニュアルに記載されたように行
う。

クローン化される合成DNAsの相補的ストランド（各40
0ng）を混合し、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて反
応容量50ml中でホスホリル化する。このDNAを、適当な
制限酵素で消化されたベクターDNA1mgを用いて連結さ
せ、連結反応は容量50ml中、室温で４〜12時間である。
ホスホリル化の条件、制限酵素の消化、ポリメラーゼ反
応および連結反応については記載されている（マニアテ
ィスら、上記に引用）。コロニーは、（望ましい場合）
lacZ＋について、アンピシリン、イソプロピル−１−チ
オ−β−Ｄ−ガラクトシド（IPTG）（0.4ミリモル）お
よび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド（ｘ−gal）（40mg/ml）を補足し
たＬ寒天上でプレーティングすることによって評価され
る。

TAC−RBSベクターは、DNAポリメラーゼを用いてtacP
含有プラスミドpDR540［ファーマシア（Pharmacia）］
の単一のBamH I部位を補充することによって構築され
る。次に、これを、コンセンサス（cossensus）リボソ
ーム結合部位（RBS、GTAAGGAGGTTTAAC）をコードしてい
る二重鎖断片を形成する非ホスホリル化合成オリゴヌク
レオチド（ファーマシア）に連結させる。連結反応の後
に、混合物をホスホリル化し且つSst IリンカーATGAGCT
CATと再連結させる。次に、この複合体を、Sst Iおよび
EcoR Iを用いて開裂し、17bpの断片をポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（PAGE）によって単離し、そして（下記
に記載の）EcoR I−Sst I制限pUC19（ファーマシア）に
クローン化した。最終構造（TAC−RBSと称される）のRB
S−ATG−ポリリンカー領域の配列を図３に示す。

合成CSIF遺伝子を８段階でpUC19に組立てる。各段階
での欠失による挿入部分不含および／または挿入部分
を、段階１で挿入されたATG開始コドンによる枠内でpUC
19のlacZ（α）を保持することによってクローニング後
に検出することができる。欠失を含むクローンおよび／
または挿入部分の変化は、ｘ−galおよびIPTGを含むＬ
−アンピシリンプレート上の青色コロニーを評価するこ
とによって取り除くことができる。或いは、各段階での
挿入部分の配列を、例えば、ベーリンガー・マンハイム
（Boehringer Mannheim）から入手可能な小規模のプラ
スミドDNA調製試料での万能連続性プライマー（univers
al sequencing primer）を用いて容易に確証することが
できる。

段階１において、TAC−RBSベクターをSst Iで消化
し、T4−DNAポリメラーゼ（その３′−エキソヌクレア
ーゼ活性がSst I断片の３′−突出ストランドを消化し
てブラント末端断片を形成する）で処理し、そしてT4−
DNAポリメラーゼの失活後、EcoR Iで処理して、TAC−RB
S領域を含み且つブラント末端をATG開始コドンに有し、
その反対の末端にEcoR I断片を有する173bpの断片を形
成する。最後に、173bpのTAC−RBS断片を単離する。

段階２において、段階１で単離されたTAC−RBS断片を
EcoR I/Kpn Iで消化したプラスミドpUC19と、下記に示
すようにその上流末端にブラント末端を有し且つその下
流末端にKpn I断片に対応する付着端を有する合成断片1
A/Bと一緒に混合する。このKpn I末端はBstE II部位に
隣接し且つその下流にある。断片を連結して段階２のpU
C19を形成する。

段階３において、合成断片2A/Bおよび3A/B（下記に示
す）を、段階２のBstE II/Sma Iで消化したpUC19（増幅
および精製後）と混合し且つ連結して段階３のpUC19を
形成する。断片3A/Bの下流末端に、Sma Iブラント末端
を形成する余分の塩基が含まれることに注目されたい。
これらの余分の塩基は段階４で開裂される。更に、断片
2A/BRおよび3A/Bは、混合物によってアニールする相補
的な９残基の一重鎖末端を有し、2A/Bを有する上流BstE
II断片および3A/Bを有する下流ブラント末端を残して
連結してpUC19を形成する。

段階４において、段階３のAfl II/Xba Iで消化したpU
C19（増幅および精製後）を再精製し、合成断片4A/B
（下記に示す）と混合し且つ連結して段階４のpUC19を
形成する。

段階５において、段階４のXba I/Sal Iで消化したpUC
19（増幅および精製後）を、合成断片5A/B（下記に示
す）と混合し且つ連結して段階５のpUC19を形成する。
断片5A/BのSal I付着端は、段階６でのHpa Iによる消化
によって除去される。

段階６において、段階５のHpa I/Pst Iで消化したpUC
19（増幅および精製後）を、合成断片6A/B（下記に示
す）と混合し且つ連結して段階６のpUC19を形成する。

段階７において、段階６のCla I/Sph Iで消化したpUC
19（増幅および精製後）を、合成断片7A/B（下記に示
す）と混合し且つ連結して段階７のpUC19を形成する。

段階８において、段階７のMlu I/Hind IIIで消化した
pUC19（増幅および精製後）を、合成断片8A/Bおよび9A/
Bと混合し且つ連結して最終構造を形成する。最終構造
を、例えば、ATCCから寄託番号33876として入手可能な
大腸菌Ｋ−12菌株JM101に、標準法によって挿入する。
培養後、タンパク質をJM101細胞から抽出し、その抽出
物の稀釈物の生物学的活性について試験する。

（小文字は、塩基がその同じ部位での本来の配列の塩基
とは異なっていることを示す。） 実施例VI. ペプチドCENKSKAVEに特異的な抗体 オボアルブミン（OVA）50mgおよびミオグロブリン（M
YO）（例えば、シグマから入手可能）50mgをそれぞれ0.
1モル重炭酸ナトリウム10mlに溶解させ且つ0.12のヨー
ドアセトアミド溶液（ヨードアセトアミド88mgを0.1モ
ル重炭酸ナトリウム4ml中に溶解させた）1mlと、15mlの
ファルコンチューブ［ファルコン・プラスティクス（Fa
lcon Plastics）、カリフォルニア州、オックスナー
ド］等中、室温で１時間反応させる。各反応混合物を、
0.1モル重炭酸ナトリウム４リットルに対して4RCで一晩
中透析する。別個に、CENKSKAVE10mgを、4mlの試験管中
の0.1モルDTT（ジチオテイトール（dithiotheitol））
溶液（50ミリモルトリスおよび2.5ミリモルEDTAを含
み、pH8）2mlに溶解させ、37℃で一晩中インキュベート
した後、GF05ゲル濾過カラム（1.5×26.5cm）（LKB、ブ
ロンマ、スウェーデン）に適用し、そして0.015モル酢
酸および0.005モルβ−メルカプトエタノールから成る
ペプチド溶離緩衝液で溶離する。ペプチド含量が減少し
たそれぞれ約3.5mlの３種類の画分を、206nmでの光学濃
度によって同定し、採取し、プールし、ドライアイスで
凍結させ、そして一晩中凍結乾燥させる。同時に、OVA
およびMYOを透析から回収し、0.45マイクロメーターの
フィルターを介する濾過によって透明にする。OVAおよ
びMYOをそれぞれ、ヨード酢酸のＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル（NHIA）［レクター（Rector）ら、J.
Immunol.Meth.、24巻、321頁（1978）で開示された］を
テトラヒドロフラン（THF）（5mg/ml）に溶解させたも
の380マイクロリットルと一緒に混合し、室温で30分間
撹拌し、そしてPBS4リットル（H2O4リットル中にNaH2PO
4・H2Oを1.8g、Na2HPO4・H2Oを7.2gおよびNaClを34g）
に対して一晩中透析することによって活性化する。別個
に凍結乾燥したペプチドをホウ酸塩還元緩衝液（H2O1リ
ットル中にNa2B4O7・10H2Oが2g、NaClが17.4gおよびEDT
A−Na2が336mg、pHを濃HClで8.5に調整し、窒素下で15
分間脱酸素化した後、アスコルビン酸塩178mgを加え
る）5ml中で懸濁させる。透析されたヨードアセチル化O
VAおよびMYOを回収し、別個に、等量（好ましくは、2m
l）のペプチド含有ホウ酸塩還元緩衝液と混合し、そし
て室温で一晩中インキュベートする。得られる共役をSD
S−PAGE（12.5％、ゲル）によって分析する。溶液を含
む共役をPBSで1mg/mlまで稀釈し、滅菌濾過し、そして
免疫用に便宜容量（例えば、500マイクロリットル）に
分取しおよび／または４℃で貯蔵する。MYO共役に対す
る多クローン性抗血清をラットおよびウサギ（ニュージ
ーランドホライト）双方で産生させる。ウサギ用の免疫
計画は下記の通りである。すなわち、最初に（０週）、
血清試料10mlを対照として抽出する。１週間後（１
週）、ペプチド−担体共役0.5mlを完全フロイントアジ
ュバント0.5mlと混合し且つ腹腔内に注射する。３週間
後（４週）、ペプチド−担体共役0.5mlと不完全フロイ
ントアジュバント0.5mlとを混合したものから成る追加
抗原を与える。次の週（５週）に、再度、ペプチド−担
体共役0.5mlと不完全フロイントアジュバント0.5mlとを
混合したものから成る更に別の追加抗原を与え、続い
て、更にもう一度、同じ追加抗原を次の週（６週）に行
う。７週めに、血清20mlを被験動物から採取する。細胞
性画分から分離した後、血清を陽性の抗CENKSKAVE力価
についてエライザによって検定した。ラットの免疫は、
最初の注射がPBS0.15mlおよびペプチド−担体共役0.1ml
と、完全フロイントアジュバント0.75mlとを混合したも
のから成ること、追加抗原がPBS 0.15mlおよびペプチ
ド−担体共役0.1mlと、不完全フロイントアジュバント
0.75mlとを混合したものから成ること、そして血清２〜
3mlだけをラットから採血することを除いて同様に行わ
れた。再度、陽性の抗CENKSKAVE反応をエライザによっ
て検出する。

本発明の前記の実施態様の説明を例示および説明の目
的で与えてきた。それらは、開示された正確な形式に対
して徹底的であるかまたは本発明を制限するためのもの
ではなく、明らかに、前記の内容の見解において多数の
修正および変更が可能である。実施態様は、本発明の理
論を最もよく説明し、それによって当業者が種々の実施
態様においておよび種々の修正を用いて、予想される特
定の使用に適当であるように本発明を最もよく利用する
ことを可能にするために選択され且つ記載されたもので
あった。本発明の範囲は本明細書に添付の請求の範囲に
よって定義されるものである。

本出願人は、pcD（SRα）−Ｆ−115、pH5CおよびpH15
Cを有する大腸菌MC1061を、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション、メリーランド州、ロックビル、
米国（ATCC）に、それぞれ寄託番号68027、68191および
68192として別個に寄託した。これらの寄託は、特許目
的の培養物の寄託に関するATCCの条件に基づいて与えら
れる条件に基づいて行ったものであり、それによって、
寄託は、米国成文法35条22および米国規制基準37条1.14
に従って米国特許および商標局長に対して利用可能にさ
せるものであることおよび米国特許証の公的発行に対し
て利用可能にさせるものであることが保証され、それに
よって寄託が維持されることが必要とされる。寄託され
た菌株の入手可能性は、いかなる政府のその特許法によ
る代理権に基づいて付与された権利に違反して本発明を
実施する許可として解釈されるべきではない。

寄託は、微生物の寄託に関するブタペスト条約の要件
に従って修正された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＢ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８１９１ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８１９２ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１０４８７ 前置審査 (72)発明者 ボンド，マーサ・ダブリュー アメリカ合衆国カリフォルニア州94036, パロ・アルト，マッケラー・レーン 4229 (72)発明者 ヴィーラ，パウロ・ジェイ・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州94041, マウンテン・ヴュー，センター・ストリ ート 178，ナンバー18 (56)参考文献 特開 昭61−219395（ＪＰ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉ ｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏ ｌ．166，Ｎｏ２（1987）ｐ．571−576

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アミノ酸配列： を含むタンパク質、又は１若しくは数個のアミノ酸の付
   加、欠失、又は置換により得られるその変異体であっ
   て、ヒトにおけるサイトカインの合成を抑制する性質を
   有するタンパク質又は変異体。
2. 【請求項２】アミノ酸配列： を含む、請求項１のタンパク質。
3. 【請求項３】請求項１のタンパク質をコードする単離さ
   れた核酸。
4. 【請求項４】下記ヌクレオチド配列： の請求項３の核酸。
5. 【請求項５】請求項３の核酸を含む発現ベクター。
6. 【請求項６】請求項５の発現ベクターで形質転換された
   形質転換細胞。
7. 【請求項７】請求項１のタンパク質を産生させる方法で
   あって、 請求項１のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を
   含むベクターを構築する段階； 該ベクターで宿主細胞を形質転換する段階；及び 該ヌクレオチド配列の発現に適する条件下で該宿主細胞
   を培地中に維持する段階を含む方法。
8. 【請求項８】有効量の請求項１のタンパク質を含む、MH
   C連関免疫応答に関係する疾患の治療剤。
9. 【請求項９】細胞媒介免疫応答を抑制する、請求項８の
   治療剤。
10. 【請求項１０】体液性免疫応答を抑制する、請求項８の
    治療剤。
11. 【請求項１１】請求項２のタンパク質に特異的に結合す
    る単クローン性抗体。