JPH04502560A - サイトカイン合成抑制性因子、そのアンタゴニストおよびそれらの使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 サイトカイン合成抑制性因子、そのアンタゴニストおよびそれらの使用方法発明 の分野 本発明は、概して、免疫系不均衡、特に、体液性および細胞性免疫応答に関わる 不均衡に関係した疾患を治療するための方法および組成物に関する。更に、本発 明は、免疫系に含まれたある種のサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）の合成を 、治療効果を得るために調節することができるタンパク質およびそれらのアンタ ゴニストを包含する。

背景 抗原に対する免疫応答は、主として、遅延型過敏症（ＤＴＨ）の現象によって例 示される細胞性かまたは抗体の産生によって例示される体液性であるものに分類 される。細胞性免疫は腫瘍の拒絶並びに多数のウィルス性、細菌性、原生動物性 および真菌性感染からの回復に重要なパラマウントから成る。対照的に、体液性 免疫応答は、毒素および侵入生物を循環から除去するのに最も有効な免疫形態で ある。種々の抗原に対して、これらの２種類の応答の一方または他方が相互に排 他的な方式で支配的であることが多いこと、およびある種の疾患、例えば、らい 病、リーシュマニア症およびある種の自己免疫の苛酷さは、一方の種類の応答の 他方にまさる不適当な支配によることがあるということが観察された。モスマ： 、ｚ（Ｍｏｓｍａｎｎ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｔｏｄａｙ、　８巻、２２３−２ ２７頁（１９８７）；モスマンら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ　、７巻、 １４５−１７３頁（１９８９）；バリッシュ（Ｐａｒｉｓｈ）、Ｔｒａｎｓｐｌ ａｎｔ、Ｒｅｖ、　、１３巻、３５〜６６頁（１９７２）；およびリュウ（Ｌｉ ｅｗ）、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｔｏｄａｙｓ　１０巻、４０〜４５頁（１９８９）、 更に、サイトカインのセットがＤＴＨ反応および体液性免疫応答に別個に関係し ていることが観察され［シエール（Ｃｈｅｒ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、１ ３８巻、３６８８〜３６９４頁（１９８７）；およびモスマンら（上記に引用、 １９８７年および１９８９年）］、これらの種類の応答に関係した疾患は、サイ トカインの関連セットの不適当な産生によって引き起こされると考えられる。

例えば、主要な根拠により、γインターフェロン（ＩＦＮ−γ）の過度の産生が 、自己免疫疾患に関係した主組織適合性複合体（ＭＨＣ）に関与することが示唆 される。フックス（Ｈｏｏｋｓ）ら、Ｎｅｗ　Ｅｎｌａｎｄ　Ｊ、Ｍｅｄ、、３ ０１巻、５〜８頁（１９７９）（自己免疫に相関して上昇したＩＦＮ−γの血清 濃度）；パシャム（Ｂａｓｈａｍ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、１３０巻、１ ４９２〜１４９４頁（１９８３）（ＩＦＮ−７はＭＭＣ遺伝子生産物発現を増加 させることができる）：バタッｔ（Ｂａｔｔａｚｚｏ）ら、Ｌａｎｃｅｔ、　、 １１１５〜１１１９　（１１／１２／８３）（ある種の自己免疫形態に相関した 異常なＭＭＣ遺伝子生産物発現）；フックスら、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ。

、３０１巻、２１〜３２頁（１９８０）（ＳＬＥ患者の症状の苛酷に相関した一 層高いＩＦＮ−γ濃度、およびインターフェロンの活性を増大させるヒスタミン 放出を、抗インターフェロン血清によって阻害することができる）；およびイヮ タ：−（Ｉｗａｔａｎ　ｉ）ら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、ａｎｄ　Ｍ ｅｔａ　ｂ　ｏ　］　、　、６３巻、６９５〜７０８頁（１９８６）（ＨＬＡ− ＤＲ発現を誘発する白血球凝集素感作Ｔ細胞の能力が除去された抗ＩＦＮ−γ単 りローン性抗体）。過剰ＩＦＮ−γがＭＨＣ遺伝子生産物の不適当な発現を引起 こし、それが順次に、細胞がＭＨＣ生産物を不適当に発現し且つその生産物の前 後関係で自己抗原を示している組織に対して自己免疫反応を引起こすということ が仮定される。

臨床的寄生生物学の分野において、最近、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の濃度が、 原生動物性感染であるリーシュマニア症の進行および／または緩和において重要 な因子であることが観察された。特に、適当な濃度のｒＦＮ−γの存在は、細胞 内の無べん電型を除去するための感染したマクロファージの活性化に不可欠であ ると考えられる。マウエル（Ｍａｕｅｌ）およびベヒン（Ｂｅｈｉｎ）、コーエ ン（Ｃｏｈｅｎ）ら監修、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＰａｒａｓｉｔｉｃＩ ｎｆ　ｅｃｔ　１ｏｎｓ　（ブラックウェル（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）、ｏンドン 、１９８２）。そして疾患のネズミモデルにおいて、高濃度のＩＦＮ−γおよび 低濃度のＩＬ−４はリーシュマニア症の緩和に関係しているが、低濃度のＩＦＮ −γおよび高濃度のＩＬ−４はその進行に関係していることが示された。ハイン ツエル（Ｈｅｉｎｚｅｌ）ら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　、１６９巻、５９〜７２ 頁（１９８９）。

前記のことを考慮して、免疫応答の一方の種類の支配を他方に変えることができ る、特に、治療に必要とされるＩＦＮ−γおよび／または他のサイトカインの合 成をそれぞれ抑制または増大させることができる入手可能な物質があると好都合 であると考えられる。このような物質は、不適当または不十分な免疫応答、例え ば組織拒絶、リーシュマニア症および他の寄生生物疾患に関係した疾患並びにＭ ＨＣ関連免疫疾患、例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ ）、重症筋無力症、インスリン依存性真性糖尿病、甲状腺炎等の治療に極めて好 都合であると考えられる。

発明の要約 本発明は、哺乳動物のサイトカイン合成抑制性因子（ＣＳＩＦ）　、ＣＳ　ＩＦ 類似体、Ｃ５ＩＦペプチドおよびＣ３ｌＦアンタゴニストに関する。それは、Ｃ ３ｌＦ活性を示すポリペプチドをコードする核酸並びにそれら自体のポリペプチ ド、それらのアゴニスト類似体および／またはアンタゴニスト類似体、それらの 生産方法および、サイトカイン不均衡に関係した疾患、特に不適当な種類の免疫 応答へと導く疾患を治療するためのそれらの使用方法を含む。本発明は更に、支 配的細胞性免疫応答または支配的体液性免疫応答をそれぞれ選択的に誘発するた めのＣ３ｌＦまたはそのアンタゴニストの単独またはワクチンアジュバントとし ての使用を含む。好ましくは、Ｃ３ｌＦアンタゴニストは、Ｃ５ＩＦの生物学的 活性を阻害することができる単クローン性抗体から誘導される。本発明の核酸は 、（１）本明細書中で開示されたクローン化された相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ） 配列に対するそれらの相同によってまたはそれらの配列を用いて検出可能なハイ ブリッド形成するそれらの能力によって、および（２）核酸によってコードされ たポリペプチドに与えられたＣ３ｌＦ活性についての機能的検定によって定義さ れる。本明細書中で用いられる、タンパク質またはポリペプチドに関するｒｃｓ ＩＦ活性Ｊという用語は、そのタンパク質またはポリペプチドが、下記に記載し た検定において下記のサイトカイン、すなわち、ＩＦＮ−γ、インターロイキン −２（ＩＬ−２）、リンフォトキシン、インターロイキン−３（ＩＬ−３）また は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の少なくとも１種類 の産生水準を阻害するかまたは実質的に減少させることができるということを意 味する。

本発明の好ましい実施態様は、下記のアミノ酸配列によって定義される読み取り 枠の成熟ヒトＣ５ＩＦである。

但し、Ｌ−アミノ酸の標準−文字記号（下記を参照されたい）は、Ｎ末端メチオ ニンから開始して左から右へと記載されている。更に好ましくは、成熟ヒトＣ３ ｌＦは下記のアミノ酸配列によって定義される。

これらの配列において、その間隔は単に読み取りの都合上のものである。標準− 文字コードをここではアミノ酸用に用いる。

Ａ　Ａｌａ　アラニン　ＭＭｅｔ　メチオニンＣＣｙｓ　システィン　Ｎ　Ａｓ ｎ　アスパラギンＤ　Ａｓｐ　アスパラギン酸　Ｐ　Ｐｒｏ　プロリンＥ　Ｇｌ ｕ　ブタミン酸　Ｑ　Ｇｌｕ　グルタミンＦ　Ｐｈｅ　フェニルアラニン　ＲＡ ｒｇ　アルギニンＧ　Ｃ，ｌｙ　グリシンＳ　Ｓｅｒ　セリンＨＨｉｓ　ヒスチ ジン　Ｔ　Ｔｈｒ　トレオニンＴ　ｌｉｅ　イソロイシン　ＶＶａｌ　パリンＫ 　Ｌｙｓ　リシン　ＷＴｒｐ）リブトファンＬ　Ｌｅｕ　ロイシン　Ｙ　Ｔｙｒ 　チロシン本発明は、一部分は、Ｃ３ｌＦ活性を有するタンパク質を発現するこ とができるｃＤＮＡの発見およびクローニングに基づくものである。したがって 、（マウスＣ５ＩＦ遺伝子を有する）ｐｃＤ　（ＳＲα）−Ｆ１１５並びに（そ れぞれヒトＣ５ＩＦ遺伝子を有する）ｐＨ５ＣおよびｐＨ１５ｃで示されるこの 種のクローンのいくつかはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ ｍｅ　ｒ　ｉ　ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（ ＡＴＣＣ）、メリーランド州、ロックビルに、それぞれ寄託番号６８０２７．６ ８１９１および６８１９２として寄託された。

図面の簡単な説明 図１に、種々の量のＣ５ＩＦで処理された若干のマウスＴ細胞クローンにおける ＩＦＮ−γ合成抑制の程度についての用量−反応の関係を図示する。

図２は、哺乳動物発現ベクターｐＨ５ＣおよびｐＨ１５ｃの主要な特徴を図示す る図である。　゛ 図３に、プラスミドＴＡＣ−ＲＢＳ−ｈＣＳ　ＩＦのＲＢＳ−ＡＴＧポリリンカ ー領域を図示する。

図４に、ｐＨ１５ｃのｃＤＮＡ挿入部分のヌクレオチド配列を図示する。

発明の詳細な説明 本発明は、ｐＨ５ＣＳｐＨ１５ｃおよびｐｃＤ（ＳＲα）−Ｆ１１５のｃＤＮＡ 挿入部分の最大の読み取り枠の成熟ポリペプチドまたはタンパク質並びにそれら のアンタゴニストを含む。分泌されたタンパク質について、読み取り枠は、通常 、Ｎ末端でシグナルペプチドに共有結合した成熟または分泌された生産物から成 るポリペプチドをコードする。シグナルペプチドは開裂した後に成熟または活性 ポリペプチドを分泌する。開裂部位は、経験的な法則、例えばフォノ・バイン（ ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

１４巻、４６８３〜４６９０頁（１９８６）からの高度な正確さによって予測す ることができ、シグナルペプチドの正確なアミノ酸組成はその機能に対して重要 であるとは考えられない。例えば、ランドール（Ｒａｎｄａｌｌ）ら、５ｃｉｅ ｎｃｅ、２４３巻、１１５６〜１１５９頁（１９８９）：カイザー（Ｋａｉｓｅ ｒ）ら、Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ、２３５巻、３１２〜３１７頁（１９８７）。した がって、成熟タンパク質は、ｐＨ５Ｃ，ｐＨ１５ｃおよびｐｃＤ（ＳＲα）−Ｆ ｉ１５のｃＤＮＡ挿入部分によって定義される読み取り枠によってコードされた ものとは全く異なるシグナルペプチドをコードするベクターによって容易に発現 される。

１、Ｃ５ＩＦ　ｃＤＮＡｓの入手および発現本明細書中で用いられる「有効な相 同性」という用語は、ヌクレオチド配列が本発明のｃＤＮＡクローンか誘導され たハイブリダイゼーションブローブによって検出されることが可能であることを 意味する。Ｃ５ＩＦ活性をコードする核酸を検出するのに必要な相同の正確な数 値測定はいくつかの因子に依存し、例えば（１）標的核酸に関係した非Ｃ３ｌＦ をコードする配列に対するプローブの相同、（２）ハイブリダイゼーション条件 の緊縮、（３）−重鎖プローブかまたは二重鎖プローブを用いるかということ、 （４）ＲＮＡプローブまたはＤＮＡプローブを用いるかということ、（５）プロ ーブの非特異的結合を減少させるのに用いられる測定値、（６）プローブを標識 するのに用いられる方法の性質、（７）プローブ中のグアニジン塩基およびシト シン塩基部分、（８）プローブおよび標的の間の不適正分布、（９）プローブの 大きさ等である。好ましくは、有効な相同性核酸配列は、本発明のｃＤＮＡに対 して少なくとも９０％相同性である。最も詳しくは、有効な相同性核酸配列は、 ｃＤＮＡが、実施例に記載されたノ＼イブリダイセーンヨンプロトコルを用いて 、ｐｃＤ（ＳＲα）−Ｆ１１５、ｐＨ５Ｃ。

ｐＨ１５ｃまたはそれらの同等物のｃＤＮＡ挿入部分から構築されたプローブに よって単離されることができるものであり、偽陽性シグナルが数個しかない、例 えば１００個未満である。このようなハイブリダイゼーションのための条件を選 択する場合の指標を与える広範囲の文献があり、例えばヘイムス（Ｈａｍｅｓ） ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ　Ｐｒａｃｔ ｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（アイアールエル・プレス（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ） 、ワシントン、コロンビア特別区、１９８５）；グレイ（Ｇ　ｒ　ａ　ｙ）ら、 Ｐ　ｒ　ｏ　ｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　、８０巻、５８４２〜５８４６頁（１９８３） ：力７７トス（Ｋａｆａｔｏｓ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ、７巻、１５４１〜１５５２頁（１９７９）：サムプルツク（Ｓａｍｂｒ 。

ｏｋ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭ ａｎｕａｌ、第２版（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃ。

ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、＝ニーＥｌ−り 、１９８９）；およびベル７（Ｂｅｌｔｚ）ら、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ ｌ。

、１００巻、２６６〜２８５頁（１９８３）；他数件である。

本明細書で用いられる場合の用語としての相同は、２種類のヌクレオチド（また はアミノ酸）配列の間の類似性の目安である。相同は、（可能ならば不均等な長 さの）２種類の配列を整列させた後の適正塩基の部分または百分率として示され る。整列という用語は、サンコツ（Ｓａｎｋｏｆｆ）およびクルスカル（Ｋｒｕ ｓｋａｌ）によってＴｉｍｅ　Ｗａｒｐｓ　第１章、ストリング（Ｓｔｒｉｎｇ ）監修およびＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｔｈｅ　Ｔｈｅｏｒｙ　ａｎｄＰ ｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ（アデイソン ・ウニスリー（Ａｄｄ　ｉ　ｓ　ｏｎ−Ｗｅ　ｓ　１　ｅｙ）　、レデイング、 ＭＡ、１９８３）によって定義された意味で用いられる。おおよそ、２種類の配 列は、その２種類の配列の間の適正塩基の数を、両方の配列中に最小数の「ブラ ンク」または「ゼロ」を挿入することで最大限にして最大のオーバーラツプを引 き起こすことによって整列される。２種類の配列が与えられると、それらの相同 を計算するためのアルゴリズムが入手可能である。例えば、二一ドレアム（Ｎｅ ｅｄｌｅｈａｍ）およびヴンシｓ　（Ｗｕｎｓｃｈ）、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 、４８巻、４４３〜４５３頁（１９７０）；およびサンコツおよびクルスカル（ 上記に引用）、２３〜２９頁。更に、商業的サービスおよびソフトウェア包装品 がこのような比較を行うために入手可能である。例えば、インテリジエネテイク ス・インコーホレーテッド（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔ−ｉｃｓ、Ｉｎｃ、）（ カリフォルニア州、パロ・アルド）：およびユニバーシティ・オブ・ライスコン シン・ジエネテイクスｅＤ：／ピユータ−・グループ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　 ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ ）（ライスコンシン州、マデイソン）である。

本発明のｃＤＮＡを有するベクターの制限エンドヌクレアーゼ断片は、にツクト ランスレーションなどの標準法を用いて、例えば、サムプル１．りら、上記引用 を参照されたい）プローブを構築するのに用いられ、Ｃ３ｌＦを産生ずると思わ れる細胞系の（再度、標準法によって構築される）ゲノムまたはｃＤＮＡライブ ラリーを低ハイブリダイゼーション緊縮でスクリーニングする。標準スクリーニ ング法を用いる。例えばグルンスタイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）ら、Ｐ　ｒ　ｏ 　ｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　、７２巻、３９６１〜３９６５頁（１９７５） ；またはベントン（Ｂｅｎｔｏｎ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、１９６巻、１８０〜１ ８３頁（１９７７）若しくはウー（Ｗｏｏ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ ｍＯｌｏｇｙ、６８巻、３８９〜３９６頁（１９７９）がある。或いは、ライブ ラリーを、配列がｐＣＤ（ＳＲα）−Ｆ１１５、ｐＨ５ＣおよびｐＨ１５ｃのｃ ＤＮＡ挿入部分のヌクレオチド配列から測定される標識オリゴヌクレオチドプロ ーブを用いてスクリーンすることができる。このようなプローブは商業的に入手 可能なりＮＡ合成機、例えばアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　 Ｂｉｏｓｙｓ　ｔｅｍｓ）３８１Ａ型で、標準法、例えばゲイト（Ｇａｉｔ）、 ０１ｉｏｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃ ａｌＡｐｐｒｏａｃｈ　（アイアール・プレス、ワシントン、コロンビア特別区 、１９８４）を用いて合成することができる。どちらの場合にも、プローブは少 なくとも１８〜３０塩基の長さであるのが好ましい。更に好ましくは、プローブ は少なくとも５０〜２００塩基の長さである。ハイブリダイセーションブローブ を用いて、ライブラリー構築の前にＣ３ｌＦ　ｍＲＮＡの候補源をスクリーンす ることもできる。

広範囲の単細胞および多細胞性発現システム（すなわち、宿主発現ベクター組合 わせ）を用いて本発明のタンパク質を生産することができる。可能な種類の宿主 細胞として、制限されないが、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物等が挙げられる。

特異的発現システムの選択および／または変更を行うための指標を与える多くの 論評が入手可能であり、例えばいくつか挙げると、ボーア（Ｂｏｅｒ）およびシ よバード（Ｓｈｅｐａｒｄ）、「大腸菌の外来遺伝子発現を最適化するための方 法（Ｓｔｒａｔｅｇｆｅｓ　ｆｏｒ　Ｏｐｔｆｍｉｚｊｎｇ　Ｆｏｒｅｉｇｎ　 Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｊ ２０５〜２４７頁、クルーン（Ｋｒｏｏｎ）監修、Ｇｅｎｅ：５ｔｒｕｃｔｕｒ ｅａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｊｏｎ　（ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏ ｈｎ　Ｗｊ　Ｉ　ｅｙ　＆　５ｏｎｓ）　、＝ユーヨーり、１９８３）ｌ：、イ くつカッ大腸菌発現システムが論評されており；バナリー（Ｂａｎｅｒｊｉ）ら 、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒ】ｎｇ、５巻、１９〜３１頁（１９８３） に、哺乳動物細胞のトランスフェクションおよびトランスフォーメーションの方 法が論評されており；レツニコフ（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ）およびゴールド（Ｇｏ ｌｄ）監修、Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（バタワ ース（ＢａｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓＬボストン、１９８６）に、大腸菌、酵母およ び哺乳動物細胞での形質発現において選択された問題が論評されており：そして スイリー（１ｈｉｌｌｙ）、Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌ］　Ｔｅｃｈｎｏｌ− ｏｇｙ（バタワース、ボストン、１９８６）に、哺乳動物発現システムが論評さ れている。同様に、特異的ｃＤＮＡおよび発現調節配列を結合および／または操 作して、本発明で用いるのに適当な発現ベクターを生成するおよび／または修正 するための技法および条件を記載する多くの論評が入手可能であり、例えば、サ ムプルツクら（上記に引用）である。

大腸菌発現システムは、本明細書中に参考文献として後述される、リッグス（Ｒ ｉｇｇｓ）による米国特許第４，４３１，７３９号明細書に開示されている。

大腸菌の高発現に特に有用な原核生物プロモーターはｔａｃプロモーターであり 、本明細書中に参考文献として後述される、ボーアによる米国特許第４．　５５ １゜４３３号明細書に開示されている。分泌発現ベクターも大腸菌宿主用に入手 可能である。特に有用なのは、ｐ　ｌＮ−１１Ｉ−ｏｍｐＡベクターであり、ブ レイブ（Ｇｈｒａｙｅｂ）らによるＥＭＢＯＪ、、３巻、２４３７〜２４４２頁 （１９８４）に開示されており、それによると、転写されるｃＤＮＡは、ｏｍｐ Ａタエ　ンバク質のシグナルペプチドをコードしている大腸菌ＯｍｐＡ遺伝子の 部分に融合され、それが、順次に、細菌の細胞周辺腔に分泌される成熟タンパク 質を生じる。米国特許第４，３３６，３３６号明細書および同第４，３３８．３ ９７号明細書にも、原核生物のための分泌発現ベクターが開示されている。した がって、これらの文献は参考文献として後述される。

細菌の多数の菌株が原核生物発現ベクターに適当な宿主であり、大腸菌の菌株・ 、例、ｔばＷ３１１０　（ＡＴＣＣ第２７３２５番）　、ＪＡ２２１、Ｃ６００ ＳＥＤ７６７、ＤＨＩ、ＬＥ３９２、ＨＢＩＯＩ、Ｘ１７７６　（ＡＴＣＣ第３ １２４４番）、Ｘ２２８２、ＲＲＩ　（ＡＴＣＣ第３１３４３番）、ＭＲＣＩ； 枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｊｌｉｓ）菌株：他の腸内細菌、例えばネ ズミチフス菌（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）または霊１！ ｆ（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａ　ｒ　ｃ　ｅ　ｓ　ｃ　ｅ　ｎ　ｓ）および各種シュ ートモマス属（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａＳ）が挙げられる。原核生物タンパク質の 発現に有用な大腸菌に１２　Ｘ１７７Ｔ　６などの細菌菌株を誘導するための一 般的な方法は、カーティス三世（Ｃｕｒｔｉｓ　ＩＩＩ）による米国特許第４， １９０，４９５号明細書に開示されている。

したがつて、この特許は参考文献として後述される。

原核生物および真核生物に加えて、多細胞性生物から誘導される細胞から成る発 現システムを用いて本発明のタンパク質を生産することもできる。特に興味深い のは、哺乳動物発現システムであり、その翻訳後プロセッシング機構が生物学的 に活性な哺乳動物タンパク質を生産すると考えられることによる。数種類のＤＮ Ａ腫瘍ウィルスが哺乳動物宿主用ベクターとして用いられた。特に重要なのは、 細菌複製調節配列に結合させたＳＶ４０の複製、転写および／または翻訳調節配 列から成る多数のベクターであり、例えば、オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）および ベルク（Ｂ　ｅ　ｒ　ｇ）によって開発され、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　 、２巻、１６１〜１７０頁（１９８２）およびＭｏ１．Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｌ、 　、３巻、２８０〜２８９頁（１９８３）で開示され、そしてタケベ（Ｔａｋｅ ｂｅ）ら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ　、８巻、４６６〜４７２頁（１９８８ ）で改良されたｐｃＤベクターである。したがって、これらの文献は参考文献と して本明細書中に後述される。他のＳＶ４０基材哺乳動物発現ベクターとして、 カオフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）によるＭｏ１．Ｃ ｅ１１．Ｂｉ。

１２．２巻、１３０４〜１３１９頁（１９８２）およびクラーク（Ｃｌ　ａ　ｒ 　ｋ）ら、米国特許第４，６７５，２８５号明細書に開示されたものが挙げられ 、これら双方の文献は参考文献として本明細書中に後述される。通常、サル細胞 が、前記のベクターに好ましい宿主である。この種のＳＶ４０　ｏｒｉ配列およ び完全なＡ遺伝子を含むこの種のベクターは、（非自律的に複製するプラスミド よりも高い複写数および／または安定な複写数を与えるために）サル細胞中で自 律的に複製することができる。更に、ＳＶ４０　ｏｒｉ配列を含み、完全なＡ遺 伝子を含まないベクターは、グルラマン（Ｇ］ｕｚｍａｎ）、Ｃｅ　ｌ　Ｌ　２ ３巻、１７５〜１８２頁（１９８１）に記載され且つＡＴＣＣ（寄託番号ＣＲＬ １６５１）から入手可能であるＣ０Ｓ７サル細胞中で（安定ではないが）高い複 写数まで自律的に複製することができる。前記の５Ｖ４Ｑ基材ベクターは、宿主 細胞ＤＮＡ中に組込むことによって、他の哺乳動物、例えばマウスＬ細胞を形質 転換することができる。

多細胞生物は、Ｃ３ｌＦの生産用宿主として役立つこともでき、例えば、昆虫幼 虫　マエダ（Ｍａｅｄａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３１５巻、５９２〜５９４頁（１ ９８５）およびＡｎｎ、Ｒｅｖ、Ｅｎｔｏｍｏｌ、　、３５１〜３７２頁（１９ ８９）：およびトランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）動物：ジエニッシ ュ（Ｊａｅｎｉｓｃｈ）、５ｃｉｅｎｃｅ、２４０巻、１４６８−１４７４ペー ジ（１９８８）である。

ＪＴ、Ｃ５ＩＦのインビトロ検定法 ＣＩＦ活性は、同系の抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）および抗原に対する暴露によっ て、ＩＦＮ−γ、リンフォトキシン、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦか ら成る群の１種類以上のサイトカインを合成する誘発されたヘルパーＴ細胞の集 団においてこれらの群での少なくとも１種類のサイトカインの合成を阻害する性 質である。好ましくは、ＡＰＣｓは、それらが複製することはできないが、それ らの抗原処理機構は機能的に残っているように処理される。これは、Ｔ細胞と混 合する前に、ＡＰＣｓに、例えば約１５００〜３０００Ｒ（γ線またはＸ線）を 照射することによって好都合に行われる。

或いは、サイトカイン抑制は、−次または、好ましくは二次混合リンパ球反応で 検定してもよく、この場合、同系ＡＰＣｓを用いる必要はない。ＭＬＲｓは当該 技術分野で周知である。例えば、ブラドリ−（Ｂｒａｄ　１ｅｙ）　、１６２〜 １６６頁、ミツシェル（Ｍｉｓｈｅｌｌ）ら監修、５ｅｌｅｃｔｅ、ｄ　Ｍｅｔ ｈ。

ｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（フリーマン（Ｆ　ｒ　 ｅ　ｅｍａｎ）、サン・フランシスコ、１９８０）；およびパティスト（Ｂａｔ ｔｉｓ混合する前に、例えば照射によって処理して増殖を防止した。好ましくは 、細胞集団は、補足培地、例えば、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０ 中、細胞約２Ｘ１０６個／ｍｌの濃度で調製される。対照および試験培養物双方 のために、検定用集団をそれぞれ０．５ｍｌ混合する。二次ＭＬＲ用に、−次Ｍ ＬＲの７日後に残っている細胞を、新たに調製され照射された刺激細胞によって 再刺激する。Ｃ３ｌＦを含むと思われる試料を試験培養物に加えて同時に混合し てもよく、対照および試験培養物双方のサイトカイン産生について、混合後１〜 ３日間検定することができる。

Ｃ３ｌＦ検定のための得られるＴ細胞集団および／またはＡＰＣ集団に、ディサ ベート（ＤｉＳａｂａｔｏ）ら監修、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　、ｉ 記に記載の標準法を用いて得られ、ボイム（Ｂｏｙｕｍ）、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅ ｎｚｙｍｏｌ、　、１０８巻、８８〜１０２頁（１９８４）；メイン（Ｍａｇｅ ）、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　、ｌＱ８巻、１１８〜１３２頁（１９ ８４）；リトヴイン（Ｌｉｔｖｉｎ）　ら、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、 、１０８巻、２９８〜３０２頁（１９８４）；ステユベンソン（Ｓｔ６ｖｅｎｓ ｏｎ）、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　、１０８巻、２４２〜２４９頁（ １９８９）；およびロメイン（Ｒｏｍａ　ｉ　ｎ）ら、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚ ｙｍｏｌ、　、１０８巻、１４８〜１５３頁（１９８４）があり、これらの文献 は参考文献として後述される。好ましくは、Ｃ３ｌＦ検定においてヘルパーＴ細 胞を用い、これは、最初に末梢血液からリンパ球を分離し、次に、商業的に入手 可能な抗ＣＤ４抗体、例えば、米国特許第４，３８１．２９５号明細書に記載さ れ且つオルト・ファーマソイティ力ルーコーポレーシｓン（Ｏｒｔｈｏ　Ｐｈａ ｒｍａｃｅｕ−ｔｉｅａｌ　Ｃｏｒｐ、）から入手可能な０ＫＴ４を用いて、例 えばパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）または流量血球計算によってヘルパー細胞を選 択することによって得られる。必要な技法は、ポイム（Ｂｏｙｕｍ）　、５ｃａ ｎｄ、Ｊ、Ｃ１ｉｎ、Ｌａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、　、２１巻（増補９７）、７７頁 （１９６８）；Ｍｅｔｈ。

ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　、１０８巻（上記に引用）：およびプラム（Ｂｒａｍ ）ら、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　、１２１巻、７３７〜７４８頁（１ ９８６）で十分に開示されている。一般的には、ＰＢＬｓは新鮮血液からフィコ ール−ハイバーク（Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配遠心法によって得られる。

各種抗原を検定で用いることができ、例えば、カサガイのヘモシアニン（ＫＬＨ ）、ニワトリγ−グロブリン等である。更に好ましくは、検定において、抗原の 代りにヘルパーＴ細胞を、抗ＣＤ３単クローン性抗体、例えば米国特許第４゜３ ６１．５４９号明細書に開示された０ＫＴ３で刺激する。

対照および試験試料中のサイトカイン濃度を、標準生物検定法および／または免 疫化学検定法によって測定する。特異的サイトカインのための免疫化学検定法の 構成は、当該技術分野で周知であり、精製サイトカインが入手可能である場合、 例えば、カンブベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉ− ｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（エルセヴイア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、アム ステルダム、１９８４）、ティソセン（Ｔｉ　ｊｓｓｅｎ）、Ｐｒａｃｔｉｃｅ 　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ、ｙｓ（ ｊ−ルセヴイア、アムステルダム、１９８５）；米国特許第４．４８６．５３０ 号明細書が、論題についての広範囲の文献の例である。ヒトＩＬ−２、ヒトＩＬ −３およびヒトＧＭ−ＣＳＦ用のエライザ（ＥＬＩＳＡ）キットはジエンザイム ・コーボレーシｇ：、ｚ（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｒｐ、）（ボストン、ＭＡ）か ら商業的に入手可能であり；ヒトＩＦＮ−γ用エライザキットは、エンドジエン ・インコーボレッテッド（Ｅｎｄｏｇｅｎ、Ｉｎｃ、）（ボストン、ＭＡ）から 商業的に入手可能である。ヒトリンフォトキシンに特異的な多クローン性抗体は ジェンザイム・コーポレーションから入手可能であり、これをヒトリンフォトキ シン用ラジオイムノアッセイで用いることができ、例えばチャード（Ｃｈａｒｄ ）、Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａ ｙ　ａｎｄＲｅｌａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（エルセヴイア、アムステル ダム、１９８２）がある。

上記に挙げたサイトカインの生物検定法を用いてＣ３ｌＦ活性を測定することも できる。ヒトリンフォトキシンのための生物検定法は、アガワール（Ａｇｇａｗ ａｌ）、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　、１１６巻、４４１〜４４７頁（ １９８５）およびマチニー　（Ｍａ　ｔ　ｔ　ｈ　ｅｗｓ）ら、２２１〜２２５ 頁、クレメンス（Ｃｌｅｍｅｎｓ）ら監修、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ　ａｎｄ　 Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ ブレス、ワシントン、コロンビア特別区、１９８７）で開示されている。ヒトＩ Ｌ−２およびＧＭ−Ｃ３Ｆは、ＡＴＣＣから寄託番号ＴｌＢ２１４およびＣＣＬ ２４６としてそれぞれ入手可能な因子依存性細胞系であるＣＴＬＬ−２およびＫ Ｇ−１を用いて検定することができる。ヒトＩＬ−３は、例えば、メトカーフ（ Ｍｅｔｃａｌｆ）、Ｔｈｅ　Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｏ１ｏｎｙ　Ｓｔｉｍ ｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒｓ　（エルセヴイア、アムステルダム、１９８４ ）に記載されたように、軟寒天培地での広範囲の造血細胞コロニーの形成を刺激 するその能力によって検定することができる。ＩＦＮ−γは抗ウイルス検定によ って定量化することができ、例えばメージャー（Ｍｅａｇｅｒ）　、１２９〜〕 ４７頁、タレメンスら監修（上記に引用）である。

更に、サイトカイン産生をｍＲＮＡ分析によって測定することができる。サイト カインｍＲＮＡは、ホワイト（Ｗｈ　ｉ　ｔ　ｅ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、、２５７巻、８５６９〜８５７２頁（１９８２）およびジルスピー（Ｇｉｌｌ ｅｓｐ　ｉ　ｅ）ら、米国特許第４，４８３，９２０号明細書で記載されたよう に、細胞質ドットハイブリダイゼーションによって測定することができる。他の 方法として、精製ＲＮＡを用いるドツトブロッティングが挙げられ、例えばヘイ ムズ（Ｈａｍｅｓ）ら監修、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄ−ｉｚａ ｔｉｏｎＡ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬプレス、ワシント ン、コロンビア特別区、１９８７）第６章がある。通常、細胞質ドットハイブリ ダイゼーションは、細胞または組織試料からのｍＲＮＡをニトロセルロースなど の固相支持体上に固定し、ＤＮＡプローブをその固定されたｍＲＮＡに対してハ イブリッド形成させて、モして固相支持体に非特異的に結合したプローブ配列を 除去するかまたはｍＲＮＡとの不敵正なハイブリッドを形成することを行い、標 的ｍＲＮＡ５とほぼ完全なハイブリッドを形成するプローブ配列のみが残るよう にする。

残っているＤＮＡプローブの量は、固相支持体に固定された標的ｍＲＮＡの数の 目安である。残っているＤＮＡプローブの量は、その標識によって生じたシグナ ルによって測定される。いくつかの標準法が、−重鎖および二重鎖核酸断片を標 識するのに利用可能である。それらには放射性標識の組み込み、例えばハーバ− （Ｈａｒｐｅｒ）ら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ、８３巻、４３１〜４３９頁（１９ ８４）；蛍光標識の直接結合、例えばスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ　Ｒｓｅａｒｃｈ、１３巻、２３９９〜２４１２　（１９８５）およ びフノリ−（Ｃｏｎｎｏ　ｌ　ｌｙ）　ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｓ ｅａｒｃｈ１１３巻、４４８５〜４５０２　（１９８５）；および核酸断片を免 疫化学的にまたは他のアフィニティー反応によって検出可能にするそれらの種々 の化学的修飾、例えばジエン（Ｔｃｈｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、　、８１巻、３４６６〜３４７０頁（１９８４）：リチャードソン（ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）　ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｓｅａｒｃｈ、 １１巻、６１６７〜６１８４　（１９８３）：ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）ら、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　、７８巻、６６３３〜６６３７頁（１９ ８１）；ブリガティ（Ｂｒ　ｉｇａ　ｔ　ｉ）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１２６巻 、３２〜５０頁（１９８３）ニブローカー（Ｂｒｏｋｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ　Ｒｓｅａｒｃｈ、５巻、３６３〜３８４　（１９７８）；およびベ イアー（Ｂａｙｅｒ）　ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　 Ａｎａｌｙｓｉｓ、２６巻、１〜４５頁（１９８０）が挙げられる。

好ましくは、Ｔ細胞からのｍＲＮＡを、下記のプロトコルによってプローブに対 するハイブリダイゼーション用に固定する。単離されたＴ細胞を、溶解緩衝液［ ０，１４モルＮａＣＬ　１．５ミリモルＭｇＣｌ２．１０ミリモルトリス−ＨＣ Ｌ　ｐＨ，８，６，０，５％ノンイデト（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０（例えば、 シグマ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）からの非イオン性洗剤）］中、４℃で最終濃度が細胞 １×１０８個／ｍ＋で懸濁させることによって溶解させる。懸濁液を１０秒間撹 拌し、核をベレットにする（１３．０００ｇ、２．５分間）。次に、得られる細 胞質溶解物を、２０ＸＳＳＣ［ｌＸ５ＳＣは、０．１５モルＮａＣＬ　０８０１ ５モルクエン酸三ナトリウム（標準クエン酸塩）１０．３容量および３７％（Ｗ ／Ｗ）ホルムアルデヒド０．　２容量が入っている１、５ｍｌの滅菌試験管に移 す。次に、その混合物を６０で１５分間インキュベートし且つ少量ずつに分けて 一７０℃で貯蔵する。分析用に、各試料１５ｍ１を、９６ウエルの平底微量滴定 プレート［ファルコン（Ｆａ　１　ｃｏｎ）　、ベクトン・デイツキンソン（Ｂ ｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、カリフォルニア州、オクスナード］に１５ ＸＳＳＣを０．１ｍｌ入れる連続二倍稀釈によって滴定する。各稀釈物を、濾紙 ［ワ・メトマン（ｗｈａ　ｔｍａｎ）３ｍｍＣｈ　ｒ、ワットマン・インコーポ レーテ・ノド（Ｗｈａｔｍａｎ　Ｉｎｃ、）、二ニー・シャーシー州、クリフト ン］上に支持したナイトラン（Ｎｙｔｒａｎ）のソート［シュライヒヤー・アン ド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）、−ニー・／ ’ンブシャー州、キーンから入手可能な変性ナイロン支持体：細孔度０．４５ｍ ｍ］に、９６倍ミニフォルト（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ）装置（シュライヒヤー・アン ド・シュエル）を用いて吸収させる。次に、ナイトラン紙を焼き（８０℃、２時 間）、そして５０％ホルムアミド［ＢＲＬ、ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒ ｓｂｅｒｇ）、ＭＤ］、６ｘＳＳＣ，５０ｍｇ／ｍｌの大腸菌ｔＲＮＡ（シグマ ）、それぞれ０．　２％（ｗ　／　ｖ　）のフィコール（分子量４００，０００ ）、ポリビニルピロリドンおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）から成るプレハ イブリダイゼーション溶液で処理する。プローブを、プレハイブリダイゼーショ ン溶液中、プローブ約５０　ｎ　ｇ／ｍ　ｌの濃度でナイトラン支持体に適用す る。ハイブリダイモーションに続いて、支持体を２ＸＳＳＣ中でそれぞれ室温で １５分間２回洗浄し、次に、２ＸＳＳＣ１０，５％ＳＤＳ中でそれぞれ６０℃で ３０分間２回洗浄する。次に、支持体を、増感スクリーンを用いてフィルムに露 出させ且つレーザーデンシトメーター［例えば、ウシトロスキャン（Ｕｌｔｒｏ ｓｃａｎ）ＸＬ、エルケイビー・インストウルメンツ・インコーホレーテッド（ ＬＫＢ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ、）、ゲイサーズバーグ、ＭＤ］を用 いて走査することによって定量する。細胞質ドットハイブリダイゼーションの感 度が不十分な場合、好ましくは、ＲＮＡを最初にＰＢＬｓから抽出した後にブロ ッティングする。例えば、ＲＮＡは、チャーブウィン（Ｃｈ　ｉ　ｒｇｗｉｎ） らによってＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８巻、５２９４〜５２９９頁（１９７ ９）で開示されたチオシアン酸グアニジウム法によって抽出することができる。

いくつかの場合において、Ｃ５ＩＦ活性について試験される試料は、予め処理し て、検定の妨げとなると思われる所定のサイトカインを除去しなければならない 。例えば、ＩＬ−２は、ある種の細胞においてＩＦＮ−γの産生を増大させる。

したがって、検定に用いられるヘルパーＴ細胞に応じて、ＩＬ−２は試験される 試料から除去されていなければならないことがある。このような除去は、試料を 樟準抗すイトカインアフィニティー力ラムに通過させることによって行うのが好 都合である。

１１１、Ｃ］Ｆに特異的な単クローン性抗体およびアンタゴニスト好ましくは、 本発明のアンタゴニストはヒトＣ３ｌＦに特異的な抗体から誘導される。更に好 ましくは、本発明のアンタゴニストは、ヒトＣ３ｌＦに特異的な断片または結合 性組成物を含む。抗体は、ジスルフィド架橋によって互いに結合したポリペプチ ド鎖のアッセンブリーを含む。Ｌ鎖およびＨ鎖と称される２種類の主要なポリペ プチド鎖が抗体の主要構造クラス（イソタイプ）全部を構成している。Ｈ鎖およ びＬ鎖双方は、可変領域および定常領域と称される部分に更に分けられる。Ｈ鎖 は単一の可変領域および三つの異なる定常領域を含み、Ｌ鎖は単一の（Ｈ鎮のも のとは異なる）可変領域および単一の（Ｈ鎮のものとは異なる）定常領域を含む 。Ｈ鎖およびＬ鎮の可変領域は抗体結合特異性に関与している。

本明細書中で用いられるｒＨＩ可変領域」という用語は、（１）長さがアミノ酸 １１０〜１２５個であるポリペプチドであって、（２）そのアミノ酸配列が、本 発明の単クローン性抗体のＨ鎖のアミノ酸配列に対応して、Ｈ鎖のＮ末端アミノ 酸から開始しているポリペプチドを意味する。同様に、ｒＬｔＪ可変領域」とい う用語は、（１）長さがアミノ酸９５〜１１５個であるポリペプチドであって、 （２）そのアミノ酸配列が、本発明の単クローン性抗体のし鎖のアミノ酸配列に 対応して、ＬｔｉｌｌのＮ末端アミノ酸から開始しているポリペプチドを意味す る。

本明細書中で用いられる「単クローン性抗体」という用語は、ヒトＣ３ｌＦに特 異的に結合することができる免疫グロブリンの均一集団を意味する。

本明細書中で用いられる「結合性組成物」という用語は、２種類のポリペプチド 鎖、すなわち、（１）操作に関係した場合に、ヒトＣ３ｌＦに対する結合アフィ ニティーか高いコンホーメーションをとるものおよび（２）ヒトＣ３ｌＦに特異 的な単クローン性抗体を産生ずるハイブリドーマから誘導されるものを含む組成 物を意味する。「操作に関係した」という用語は、２種類のポリペプチド鎖を、 種々の方法によって、例えば、ＦａｂまたはＦｖなどの本来の抗体断片の組合わ せによってまたは遺伝子工学によりカルボキシル末端でンステインを含有するペ プチドリンカ−によって結合させるために、互いに相対して配置することができ ることを示すという意味である。通常、２種類のポリペプチド鎖はヒトＣ３ｌＦ に特異的な単クローン性抗体のＬ鎖可変領域およびＨ鎖可変領域に対応する。好 ましくは、本発明のアンタゴニストはヒトＣ３ｌＦに特異的な単クローン性抗体 から誘導される。Ｃ３ｌＦを阻害するかまたは中和することができる単クローン 性抗体は、標準Ｃ３ｌＦ生物検定においてＣ３ｌＦに誘発される作用、例えばＩ ＦＮ−γ合成抑制を阻害するそれらの能力によって選択される。

本発明のハイブリドーマは周知の方法によって生産される。通常、その方法では 、不滅化細胞系と、所望の抗体を産生ずる８９２３球との融合を行う。或いは、 不滅の抗体産生細胞系を注じるための非融合方法が可能であり且つ本発明の範囲 内になるが、例えばウィルスによって誘発される形質転換であり、キャサリー（ Ｃａｓａｌｉ）ら、「８９２３球の抗原特異的選択およびＥＢＶによる形質転換 によるヒト単クローン性抗体（Ｈｕｍａｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ　ｆｒｏｍ Ａｎｔｉｇｅｎ−８ｐｅｃｉｆｉｃ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂ　Ｌｙｍｐ ｈｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｂｙ　ＥＢＶ）Ｊ、 ５ｃｉｅｎｃｅ、２３４巻、４７６〜４７９ページ（１９８６）がある。不滅化 細胞系は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に濡歯類動物、ウシおよびヒ ト起源のミエローマ細胞である。ラットまたはマウスのミエローマ細胞系を、便 宜上および入手可能性上用いることが最も多い。標的抗原を注射された哺乳動物 から適当なリンパ球を入手する技法は周知である。通常、ヒト起源の細胞が望ま しい場合には末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）を用いるかまたは、非ヒト補乳動物源 が望ましい場合には牌臓細胞もしくはリンパ節細胞を用いる。宿主哺乳動物に反 復用量の精製抗原を注射し、その哺乳動物で所望の抗体産生細胞を生じさせた後 にそれらを不滅化細胞系との融合用に集める。融合のための技法も当該技術分野 で周知であり、通常、細胞と融合剤、例えばポリエチレングリコールとを混合す ることを行う。ハイブリドーマは、ＨＡＴ選択などの標準法によって選択される 。

これらのハイブリドーマの中から、所望の抗体を分泌するもの、すなわち、ヒト Ｃ５ＩＦに特異的なものを、標準免疫検定法、例えばウェスターン法、エライザ 、ラジオイムノアッセイ、Ｃ３ｌＦ中和能等によってそれらの培地を検定するこ とによって選択する。抗体は、標準タンパク質精製法を用いて培地から回収され 、例えば、テユッセン（Ｔｉ　ｊｓｓｅｎ）　、Ｐｒａｃｔ　ｉｃｅ　ａｎｄ　 Ｔｈｅ。

ｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ　（−１ルセヴイア、ア ムステルダム、１９８５）］がある。上記の方法のいずれを行う場合にも、指標 として多数の文献が入手可能であり、例えば、コーラ−（Ｋｏｈ　ｌ　ｅ　ｒ） ら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　（コールド・スプリング−ハ ーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク、１９８０）；テユッセン、Ｐｒａｃｔｉ ｃｅ　ａｎｄＴｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（ エルセヴイア、アムステルダム、１９８５）；カンブベル（Ｃａｍｐｂｅ　］　 ｌ）　、Ｍｏｎｏｃ　］ｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　 （エルセヴイア、アムステルダム、１９８５）；バレル（Ｈｕｒｒｅｌｌ）、Ｍ ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｈｙｂｒｉｃｌｏｍａ　Ａｎｔｉ−ｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃ ｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　（シーアールシー・プレ ス（ＣＲＣＰｒｅｓｓ）、ポカ・ラドン、ＦＬ、１９８２）；等がある。次に、 ヒトＣ５ＩＦに特異的な単クローン性抗体を産生ずるハイブリドーマに、上記に 記載したＣ３ｌＦ検定を用いる第二のスクリーンを行って、Ｃ５ＪＦの生物学的 活性を阻害するかまたは中和することができるものを選択する。

抗体断片の使用および生産も周知であり、例えば、Ｆａｂ断片：テユッセン、Ｐ ｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎ。

ａｓｓａｙｓ　（エルセヴイア、アムステルダム、１９８５）：Ｆｖ断片：ホフ マン（Ｈｏｃｈｍａｎ）ら、Ｂｊｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１２巻、１１３０〜１ １３５頁（１９７３）、シャロン（Ｓｈａｒｏｎ）ら、Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ、１５巻、１５９１〜１５９４頁（１９７６）およびエーリッヒ（Ｅｈｒｌ ｆｃｈ）ら、米国特許第４，３５５．０２３号明細書；および抗体１／２分子ニ オーディト７−　ハーグレイブス（Ａｕｄ　ｉｔｏｒｅ−Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ ）　、米国特許第４，４７０．９２５号明細書がある。

本発明のハイブリドーマの特徴を示す抗体および抗体断片も、メツセンジャーＲ ＮＡを抽出し、ｃＤＮＡライブラリーを構築し、そして抗体分子の断片をコード するクローンを選択することによる組換え体手段によって生産することができ、 例えば、ウオール（Ｗａｌｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｊｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ、５巻、３１１３〜３１２８頁（１９７８）：ザクト（Ｚａｋｕｔ）ら、Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、８巻、３５９１〜３６０１頁（ １９７８）：キャビンー（Ｃａｂｉｌｌｙ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　］、Ａｃ ａｄ。

５ｃｉ５．８１巻、３２７３〜３２７７ページ（１９８４）；ボス（Ｂｏｓｓ） ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１２巻、３７９１〜３８ ０６頁（１９８４）；アムスター（Ａｍｓｔｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｊ ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、８巻、２０５５〜２０６５頁（１９８０）；ムーア（ Ｍｏｏｒｅ）ら、米国特許第４，６４２，３３４号明細書；スヶラ（Ｓｋｅｒｒ ａ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４０巻、１０３８〜１０４１　（１９８８）；およ びツース（Ｈｕｓｅ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４６巻、１２７５〜１２８１　（ １９８９）がある。特に、この種の技法を用いて、ある種の結合領域が別の種の 抗体の非結合領域と結合して免疫原性を低減させている内部特異的単クローン性 抗体を産生ずることができ、例えば、リュ　（Ｌｉｕ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ。

Ｓｅｔ、、８４巻、３４３９〜３４４３ページ（１９８７）がある。

ＴＶ、精製および薬剤組成物 本発明のポリペプチドが可溶性形態で、例えば形質転換された酵母または哺乳動 物細胞の分泌生産物として示される場合、それらを、当該技術分野の標準法にし たがって精製することができ、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロ マトグラフィー、ゲル濾過、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィーおよ び／または類似のものであり、例えば、「酵素精製および関連技術（Ｅｎｚｙｍ ｅ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｓ）Ｊ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２２：２３３〜５７７ 頁（１９７７）およびスコープス・アール（Ｓｃｏｐｅｓ、Ｒ，）、Ｐｒｏｔｅ ｊｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔ ｉｃｅ（スブリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニ ューヨーク、１９８２）でこのような精製での指標が与えられる。同様に、本発 明のポリペプチドが不溶性形態、例えば集塊、封入体または同種のものとして示 される場合、それらを、当該技術分野の標準法によって精製することができ、例 えば、遠心分離によって破壊された宿主細胞から封入体を分離し、その封入体を カオトロピック剤および還元剤で可溶化し、可溶化された混合物を稀釈し、モし てカオトロピック剤および還元剤の濃度を低下させてポリペプチドが生物学的に 活性なフンホーメーションをとるようにすることである。後者の方法は、参考文 献として後述される下記の文献で開示されており、ウィンクラ−（Ｗｉｎｋｌｅ ｒ）　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ、２５　：　４０４１〜４０４５頁 （１９８６）１　；ウィンクラ−ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：９９２ 〜９９８頁（１９８５）；：ｌ−ス（Ｋｏｔｈｓ）ら、米国特許第４，５６９， ７９０号明細書；および欧州特許出願第８６３０６９１７．５号明細書および同 第８６３０６３５３゜３号明細書がある。

本明細書中で用いられる「有効量」は、自己免疫条件の症状を回復させるのに十 分な量を意味する。特定の患者に対する有効量は、治療される自己免疫条件、患 者の全身的な健康、投与方法、副作用の苛酷さ等の状態のような因子に応じて変 化してもよい。通常、Ｃ３ｌＦは、有効量のＣ３ＴＦおよび薬剤担体を含む薬剤 組成物として投与される。薬剤担体は、本発明の組成物を患者に与えるのに適当 な何らかの相溶性無毒性物質であることができる。概して、このような薬剤の非 経口投与に有用な組成物は周知であり、例えば、Ｒｅｍｊｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐ ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、第１５版（マツグ・パブリッシ ング喰カンパニー（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、ペン シルバニア州、イーストン、１９８０）がある。或いは、本発明の組成物を、移 植可能なまたは注射可能な薬剤供給システムによって患者の体内に導入してもよ く、例えば、アーコート（Ｕｒｑｕｈａｒｔ）ら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｈａｒｍ ａｃｏｌ、Ｔｏｘｉｃｏｌ　、２４巻、１９９〜２３６頁（１９８４）；ルイス （Ｌｅｗｉｓ）監修、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　ｏｆ　Ｐｅ５ｔ ｉｃｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ブレナム・プレス（ ＰＩｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８１）；米国特許第３．　７ ７３゜９１９号明細書、米国特許第３．２７０．９６０号明細書；等がある。

非経口的に投与される場合、Ｃ３ＴＦは薬剤担体に関係した注射可能な単位剤形 （液剤、懸濁剤、乳剤）で処方される。このような担体の例は、規定生理食塩水 、リンゲル液、デキストロース溶液およびハンクス液である。固定油およびオレ イン酸エチルなどの非水性担体も用いることができる。好ましい担体は５％デキ ストロース／生理食塩水である。担体は少量の添加剤、例えば、緩衝剤および保 存剤などの等強性および化学的安定性を増大させる物質を含んでもよい。Ｃ５１ Ｆは、約５〜２０μｇ／ｍ＋の範囲の濃度で集塊および他のタンパク質を実質的 に含まない精製された形態で処方されるのが好ましい。好ましくは、Ｃ５ＩＦは 、−日当り約５０〜８００μｇの範囲の量（すなわち、約１〜１６μｇ／ｋｇＺ 日）が与えられるように連続注入によって投与される。毎日の注入速度は副作用 および血球数を監視することによって変化してもよい。

Ｃ５ＩＦは、Ｃ５ＩＦ遺伝子を有する発現ベクターによって一時的にトランスフ ェクションされるかまたは安定的に形質転換された哺乳動物細胞の培養物上澄み から精製することができる。好ましくは、Ｃ３ｌＦは、ｐｃＤ発現ベクターによ って一時的にトランスフェクションされたＣＯ３７細胞の培養物上澄みから精製 される。ｐｃＤによるＣＯ３７細胞のトランスフェクションは下記の通りに進行 し、すなわち、トランスフェクションの前日に、Ｃ０Ｓ７サル細胞約１０６個を 、１０％０％ウシ胎清および２ミリモルグルタミンを含むダルベツコ変性イーグ ル培地（ＤＭＥ）中の個々の１００ｍｍプレート上に播種する。トランスフェク ションを行うには、培地を各プレートから吸引し且つ５０ミリモルトリスーＨＣ １、ｐＨ７，４，４００ｍｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストランオヨヒフラスミド ＤＮＡ５０μｇを含むＤＭＥ４ｍｌで置き換える。プレートを３７℃で４時間イ ンキュベートした後、ＤＮＡ含有培地を除去し、そしてプレートを血清不含ＤＭ Ｅ５ｍｌで２回洗浄する。ＤＭＥをプレートに戻して加え、次に、３７℃で更に ３時間インキュベートする。プレートをＤＭＥで１回洗浄した後、４％ウシ胎児 血清、２ミリモルのグルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／リツトル）およびスト レプトマイシン（１００μｇ／リットル）を標準濃度で含むＤＭＥを加える。

次に、細胞を３７℃で７２時間インキュベートした後、Ｃ３ｌＦの精製用に増殖 培地を集める。或いは、トランスフェクションを実施例に記載のエレクトロポレ ーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によって行うことができる。トラ ンスフェクション用プラスミドＤＮＡは、カサダバン（Ｃａｓａｄａｂａｎ）お よびコーエン（Ｃｏｈｅｎ）、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　、１３８巻、１７９〜 ２０７頁（１９８０）に記載された大腸菌ＭＣ１０６１または類似の生物中のＣ ３ｌＦｃＤＮＡ挿入部分を含むｐｃＤ（ＳＲα）を増殖させることによって得ら れる。プラスミドＤＮＡを、例えば、マニアナイス（Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　 ｓ）ら、ＭＯｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ ａｎｕａｌ（：＋−ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク 、１９８２）の標準法によって培養物から単離する。

本発明のアンタゴニストが抗体から誘導される場合、通常、それらは非経口的に 、好ましくは静脈内に投与される。この種のタンパク質またはペプチドアンタゴ ニストは免疫原性であることがあるので、それらは、通常のＩＶ投与セットによ ってかまたはトマシ（Ｔｏｍａｓ　ｉ）ら、米国特許第４，７３２．８６３号明 細書に記載の皮下デボ−から徐々に投与されるのが好ましい。非経口的に投与さ れる場合、抗体および／または断片は、前記の記載したように、薬剤担体に関係 した注射可能な単位剤形で処方される。抗体は、集塊、他のタンパク質、内毒素 等を実質的に含まない精製された形態で、濃度的５〜３０ｍｇ／ｍｌ、好ましく はｌＯ〜２０ｍｇ／ｍｌで処方されるのが好ましい。好ましくは、内毒素濃度は ２．５ＥＵ／ｍ１未満である。

アンタゴニストの投与養生法の選択は、いくつかの因子に依存し、例えば、アン タゴニストの血清回転率、治療される疾患に関係したＣ５ＩＦの血清濃度、アン タゴニストの免疫原性、標的Ｃ３ｌＦの利用可能性（例えば、非血清Ｃ３ｌＦを 阻害する場合）、Ｃ５ＩＦの１種類または複数のレセプターに対するＣ３ｌＦ対 アンタゴニストに対するＣ５ＩＦの相対アフィニティー等が挙げられる。好まし くは、投与養生法は、副作用の容認可能な水準と一致して患者に与えられるアン タゴニストの量を最大限にする。したがって、与えられるアンタゴニストの量は 、特定のアンタゴニストおよび治療される症状の苛酷さに部分的に依存する。

適当な用量を選択する場合の指標は、抗体の治療目的の使用についての文献で見 出され、例えば、バー／／’　（Ｂ　ａ　ｃ　ｈ）ら、第２２章、フエローン（ Ｆｅｒｒｏｎｅ）ら監修、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａ ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　（ノージス・パブリケーションズ（Ｎｏｇｅｓ　Ｐｕｂｌ ｉｃａｔｉｏｎＳ）、二ニー・シャーシー州、パーク・リッジ、１９８５）：お よびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）、３０３〜３５７頁、およびスミス（Ｓｍｉｔ ｈ）ら、３６５〜３８９頁、ハーバ−（Ｈａｂｅｒ）ら監修、Ａｎｔｉｂｏｄｉ ｅｓ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ（レイ ブン・プレス（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓン、ニューヨー、１９７７）がある。好 ましくは、アンタゴニストが単クローン性抗体またはそれらの（結合組成物を含 む）Ｆａｂ大の断片を含む場合は常に、その用量は約１〜２０ｍｇ／ｋｇ／日の 範囲である。更に好ましくは、用量は約１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。

■、遺伝子工学処理された突然変異体Ｃ３ＴＦｓ核酸配列および／またはアミノ 酸配列の情報が本来のタンパク質のために入手可能であるならば、本来の配列中 で何らかの突然変異をウィルスによって生じるための種々の方法が入手可能とな る。例えば、ジョートル（Ｓｈｏｒｔｌｅ）、５ｃｉｅｎｃｅ、２２９巻、１１ ９３〜１２０１頁（１９８５）；ツォラー（Ｚｏｌｌｅｒ）およびスミス（Ｓｍ ｉｔｈ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１００巻、４６８〜 ５００頁（１９８３）：７−り（Ｍａｒｋ）ら、米国特許第４，５１８，５８４ 号明細書；ウェルズ（Ｗｅ　Ｉ　ｌ　ｓ）ら、Ｇｅｎｅｓ３４巻、３１５〜３２ ３頁（１９８５）；エステル（Ｅｓｔｅｌｌ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３３巻、 ６５９〜６６３頁（１９８６）；ムレンバッハ（Ｍｕｌｌｅｎｂａｃｈ）ら、Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６１巻、７１９〜７２２頁（１９８６）およびフ ェレッティ（Ｆｅｒｅｔｔｉ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　 、８３巻、５９７〜６０３頁（１９８６）、したがって、これらの文献は参考文 献として後述される。

天然のポリペプチドの突然変異タンパク質は、様々な場合に望ましいことがある 。例えば、望ましくない副作用は、特に、その副作用活性が、所望の活性を有す るポリペプチド部分とは異なるポリペプチド部分に関係している場合に、ある種 の突然変異タンパク質によって減少すると考えられる。ある種の発現システムに おいて、本来のポリペプチドはプロテアーゼによって分解されやすいことがある 。このような場合、その感受性配列を変化させるアミノ酸の選択された置換およ び／または欠失が、収量を有意に増大させることがあり、例えば、英国特許出願 第２１７３−８０４−Ａ号明細書では、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の ２７５位のＡｒｇがＧｌｙまたはＧｌｕによって置換されている。突然変異タン パク質は、更に、酸化、アシル化、アルキル化または他の化学的修飾を受けやす いアミノ酸を除去することによって、精製方法での収量を増加させることができ るしおよび／またはタンパク質の有効寿命を増大させることができる。例えば、 メチオニンは容易に酸化されてスルホキシドを生成し、多数のタンパク質では、 それが生物学的活性の損失に関係している。例えば、ブロード（Ｂｒｏｔ）およ びワイスバッハ（Ｗｅｉ　５ｓｂａｃｈ）　、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ ｏｐｈｙｓ、　、２２３巻、２７１頁（１９８３）。メチオニンは、生物学的活 性（７）ｔｉ失がほとんどまたは全くない更に不活性なアミノ酸で置換すること ができることが多い。例えば、オーストラリア特許出願第ＡＵ−Ａ−５２４５１ ／８６号明細書。細菌の発現システムでは、コンホーメーションに必要がないシ スティン残基を除去または置換することによって収量を増大させることができる ことがある。

例えばマーク（Ｍａｒｋ）ら、米国特許第４，５１８，５８４号明細書。好まし くは、カセット突然変異誘発を用いて突然変異体タンパク質を生じさせる。合成 遺伝子は、遺伝子に沿っておよそ均一に間隔をおいた制限エンドヌクレアーゼ部 位の配列によって構築され、これらの制限エンドヌクレアーゼ部位は、遺伝子が 適当なベクターに挿入されている場合でも特有なままであるように選択される。

この特有な制限部位は、遺伝子の断片が好都合に削除されるかまたは望ましい突 然変異をコードする合成オリゴヌクレオチド（すなわち、「カセット」）で置換 されることを可能にする。特有な制限部位の数および分布の決定にはいくつかの 因子を考慮する必要があり、（１）発更に用いられるベクター中に前から存在し ている制限部位、（２）種特異性かまたは属特異性コドン処理が望ましいかどう かということ、（３）異なる非ベクター切断制限エンドヌクレアーゼの利用可能 な数（およびそれらの合成遺伝子内の多重度）および（４）特有の制限部位の間 に断片を合成することおよび／または配列させることの便利さおよび確実性が挙 げられる。

上記の方法は、本来のタンパク質配列においてアミノ酸置換等を保存性にするの に好都合な方法である。本明細書中で用いる「保存性」は、（ｉ）その変化がコ ンホーメーション上可能な限り中立である、すなわち、突然変異体ポリペプチド の三次構造の変化を、本来のタンパク質と比較して最小にするように設計されて いること、および（ｉ　ｉ）その変化が抗原として可能な限り中立である、すな わち、突然変異体ポリペプチドの抗原決定基の変化を、本来のタンパク質と比較 して最小にするように設計されていることを意味する。コンホーメーンヨンの中 立性は生物学的活性を維持するのに望ましいし、抗原の中立性は、本発明の化合 物を用いて治療されている患者または動物での免疫原性反応の誘発を避けるのに 望ましい。変化したものがコンホーメーション上および抗原として中立であると いう絶対的な必然性をもって選択するのは困難であるが、コンホーメーソヨン上 および抗原として中立である確率が高い変化を生じるように当業者に指標を与え ることができる法則が存在し、例えば、アンフィセン（Ａｎｆｉｓｅｎ）（上記 に引用）：ベルツォフスキ（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ）、５ｃｉｅｎｃｅ、２２９巻 、９３２〜９４０頁（１９８５）：およびボーイ（Ｂｏｗｉ　ｅ）ら、５ｃｉｅ ｎｃｅ、２４７巻、１３０６〜１３１０頁（１９９０）がある。若干のより重要 な法則として、（１）疎水性残基の置換は、それらが他タンパク質の内部に位置 しているらしいので、抗原性の変化をほとんど生じさせないらしいこと、例えば 、ベルツォフスキ（上記に引用）およびボーイら（上記に引用）（２）物理科学 的に類似の、すなわち、同義の残基の置換は、置換するアミノ酸が置換されるア ミノ酸と同じ構造的役割を果たすことができるので、コンホーメーションの変化 をほとんど生じさせないらしいこと；および進化論的に保存された配列の変化は 、進化論的保存性によって、配列が機能的に重要であることがあると示唆される ので、有害なコンホーメーション上の作用を生じさせるらしいこと：が挙げられ る。突然変異タンパク質の配列を選択するためのこのような基本的な法則に加え て、検定法は、工学処理された分子の生物学的活性およびコンホーメーションを 確証するのに利用可能である。本発明のポリペプチドについての生物検定法は前 記に十分に記載されている。コンホーメーションの変化は、少な（とも２種類の 周知の検定法によって試験することができ、すなわち、微量補体結合法が、例え ば、ワラセルマン（Ｗａ　ｓ　ｓ　ｅ　ｒｍａ　ｎ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ 、８７巻、２９０〜２９５頁（１９６１）またはレヴイン（Ｌｅｖｉｎｅ）ら、 Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１１巻、９２８〜９３６頁（１ ９６７）でタンパク質の三次構造の進化論的研究において広範に用いられ：そし てコンホーメーシタン特異性単クローン性抗体のセットに対するアフィニティー については、例えば、ルイス（Ｌｅｗｉ　ｓ）ら、Ｂｊｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ２２巻、９４８〜９５４頁（１９８３）で用いられている。

ｖＩ　ヒトＣ３ｌＦペプチド抗体 本発明は、ヒトＣ５ＩＦから誘導されたペプチドと、担体および本発明のペプチ ドの間の共役から成る免疫原とを含む。本明細書中で用いられる免疫原といとう 用語は、免疫応答を引起こすことができる物質を意味する本明細書中で用いられ る担体といとう用語は、本発明のペプチドに化学的に共役した場合に、得られた 共役によって免疫性を与えられた宿主生物が共役したペプチドに特異的な抗体を 生じることを可能にする任意の物質を意味する。担体として、赤血球、バクテリ オファージ、タンパク質および合成粒子、例えばアガロースビーズが挙げられる 。このましくは、担体はタンパク質であり、例えば血清アルブミン、γ−グロブ リン、カサガイのヘモシアニン、サイログロブリン、オボアルブミン、フィブリ ノーゲンまたは同種のものである。

本発明のペプチドは、標準法によって合成され、例えばスチュワード（Ｓ　ｔ　 ｅｗａ　ｒ　ｔ）およびヤング（Ｙｏｕｎｇ）、５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅ ｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版（ピアス・ケミカル・カンパニ　（Ｐ ｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、イリノイ州、ロック７ｔ− ド、１９８４）がある。好ましくは、市販のペプチド合成機を用い、例えばアプ ライド・バイオシステムズ・インコーホレーテッド（Ａｐｐｌｉｅｃｌ　Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓｌｎｃ、）（フォスター・ンティ、ＣＡ）の４３０Ａ型である。

本発明のペプチドは、架橋ポリスチレン支持体上の同相合成によって、カルボキ シル末端基から開始し且つアミノ酸を段階的に、完全なペプチドが形成されるま で加えて組立てられる。下記の文献が、合成の際に用いられる化学に対する指標 であり、５巻、２１４９頁（１９６３）；ケント（Ｋｅｎｔ）ら、Ｐｅｐｔｉｄ ｅｓ　１９８４の１８５頁、ラグナーソン（Ｒａｇｎａｒｓｓｏｎ）監修（アル ムクイスト・アンド・ウエクセル（Ａｌｍｑｕｉｓｔ　ａｎｄ　Ｗｅｋｓｅｌｌ ）、ストックホルム、１９８４）：ケントら、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ　８４の２１７頁、イズミヤ（ＩｚｕｍｉＶａ）監修（プロティン・リサー チ・ファウンデーション・ビー・エイチ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　 Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｂ、Ｈ，Ｌ大阪、１９８５）；メリフィールド、５ｃｉ ｅｎｃｅ。

２３２巻、３４１〜３４７頁（１９８６）：ケント、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｊｏｃ ｈｅｍ、、５７巻、９５７〜９８９頁（１９８８）；およびこれらの最後の二つ の文献で引用された文献がある。

固体状態の合成では、主として終結、欠失または修飾ペプチドである合成側主成 物を除去することが最も重要である。大部分の副反応は、十分に特徴化された樹 脂であるクリーン（ｃｌｅａｎＬクリーンアミノ酸誘導体、クリーン溶媒、並び に適当なカップリング方法、開裂方法および反応条件の選択によって除去するか または最小限にすることができ、例えばバラニー（Ｂａｒａｎｙ）およびメリフ ィールド、Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔ　１ｄｅｓ、クロス（Ｃｒｏｓｓ）およびマイエン ホー７ｙ　−（Ｍｅ　ｉ　ｅｎｈｏ　ｆ　ｅ　ｒ）監修、２巻、１〜２８４頁（ アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９ ７９）がある。カップリング反応を監視して、それらの反応が完了して、１個以 上の残基を欠いている欠失ペプチドが無くなるようになるまで進行することを確 認することが重要である。定量的ニンヒドリン反応はその目的に有用であり、サ リン（Ｓａｒｊｎ）ら、Ａｎａ］、Ｂｊｏｃｂｅｍ、　、１１７巻、１４７頁（ １９８１）がある。Ｎａ−ｔ−ブチルオキシカルポル（ｔ−Ｂｏｃ）−アミノ酸 を、鎖を組立てる条件に対して安定であるが強酸に対して不安定である適当な側 鎖保護基と一緒に用いる。保護されたペプチド鎖を組立てた後、保護基を除去し 、そしてペプチドを固定している結合を、チオエステル掃去剤存在下、無水フッ 化水素の低濃度、続いて高濃度を用いることによって開裂させる。タム（Ｔ　ａ 　ｍ）ら、Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　、１０５巻、６４４２頁（１９ ８３）、用いることができる適当な側鎖保護基は、問題のアミノ酸についての三 文字の略号の後に保護基を括弧に入れて表示され、Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）、Ｇｌ ｕ　（ＯＢｚｌ）、Ｓｅｔ　（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ　（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ　（ＣＩ −Ｚ）、Ｔｙｒ　（Ｂｒ−Ｚ）、Ａｒｇ　（ＮＧＴｏｓ）　、Ｃｙｓ　（４−Ｍ ｅＢｚ　ｌ）およびＨｉｓ　（ＩｍＤＮＰ）である（Ｂｚｌはベンジルであり； Ｔｏｓはトルエンスルホキシルであり：ＤＮＰはジニトロフェニルであり；Ｉｍ はイミダゾールであり；Ｚはベンジルオキシカルボニルである）。残りのアミノ 酸には側鎖保護基が存在しない。サイクル毎に、（ｔ−Ｂｏｃ　Ｎａ）保護ペプ チド樹脂を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）［マレンクＯット（Ｍａｌｌｅｎｃｋｒ ｏｄｔ）］中、６５％の（使用前ニ蒸留シタ）トリフルオロ酢酸［イーストマン ・コダック（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ）から］に対して最初に１分間、続い て１３分間暴露してＮａ保護基を除去する。ペプチド樹脂をＤＣＭ中で洗浄し、 ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（アプライド・バイオシステムズ）中、１０％ のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）［アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ） ］でそれぞれ１１分２２回中する。中和はＤＭＦで洗浄することによって行われ る。アミノ酸の対称無水物とのカップリングをＤＭＦ中で１６分間行う。対称無 水物は、合成機で、ＤＣＭ５ｍｌ中、２ミリモルのアミノ酸を溶解させ、ＤＣＭ ２ｍｌ中、１ミリモルのジシクロへキシルカルボジイミド（アルドリッチ）を加 えることによって調製された。５分後に活性アミノ酸を別の容器に移し、窒素ガ スの連続流でパージすることによってＤＣＭを蒸発させる。ＤＣＭは、パージン グの際の種々の段階でＤＭＦ　（全量６ｍ１）によって置き換えられる。最初の カップリン後、ペプチド樹脂を、ＤＣＭＳＤＣＭ中１０％Ｄ　Ｉ　ＥＡ、続いて 、ＤＣＭで洗浄する。再カップリングには、同じアミノ酸および活性剤ジシクロ へキシルカルボジイミドを反応容器に連続的に移す。現場での活性化および１０ 分間のカップリングの後、十分なりＭＦを加えて５０％ＤＭＦ−ＤＣＭ混合物を 作り、カップリングを１５分間続ける。アルギニンをＤＭＦ中のヒドロキシベン ゾトリアゾール（アルドリッチ）エステルとして６０分間結合させた後、他のア ミノ酸と同じ方法で再結合させる。アスパラギンおよびグルタミンをＤＭＦ中の ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルとしてそれぞれのカップリングに４０分 間２回結合させる。全部の残基について、第二のカップリング後に樹脂を洗浄し 、そして残留する未結合α−アミンをサリンら（上記に引用）の定量的ニンヒド リン反応によって監視するために、試料を自動的に採取する。

合成ペプチドを担体に結合させる一般的な方法は、いくつかの文献に記載されテ ィる。例えば、ワルター（Ｗａ　］　ｔ　ｅ　ｒ）およびドーリトル（Ｄｏｏｌ ｉｔｔＩｅ）、「合成ペプチドに対する抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａｇａｉ ｎｓｔＳｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）Ｊ、セトＣ＋　−（Ｓｅ　ｔ　 ］　ｏｗ）ら監修、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、５巻、６１〜９ １頁（プレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８ ３）；グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、Ｃｅ１ｌ、２８巻、４７７〜４８７頁（１９ ８２）；ラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、、７８巻、３４０３〜３４０７頁（１９８１）：シミズ（Ｓｈｉｍｉｚｕ） ら、米国特許第４．４７４．７５４号明細書；およびガンフィールド（Ｇａｎｆ ｉｅｌｄ）ら、米国特許第４．３１１，６３９号明細書がある。したがって、こ れらの文献は参考文献として後述される。更に、ハブテンを担体に結合させるの に用いられる方法は、前記で論及した方法、例えば、テユッセン（Ｔｉｊｓｓｅ ｕ）のＰｒａｃｔｉｃｅａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕ ｎｏａｓｓａｙｓ　（！ルセヴイア、ニューヨーク、１９８５）の第８章の方法 と本質的に同じである。ペプチドを担体に結合させるための４種類の最も一般的 に用いられるスキームは、（１）例えば、カーガン（Ｋａｇａｎ）およびグリツ ク（Ｃ１ｉｃｋ）、シェフ（Ｊ　ａ　ｆ　ｆ　ｅ）およびベア７：／　（Ｂｅｈ ｒｍａｎ）監修、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆＨｏｒｍｏｎｅ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎ ｏａｓｓａｙ、３２８へ３２９頁（アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　 Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９７９およびワルター（Ｗａ　］　ｔ　ｅ　ｒ ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、７７巻、５１９７〜５２００ 頁（１９８０）に開示のアミノカップリング用グルタルアルデヒド：　（２）ホ ー（Ｈｏａｒｅ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　、２４２巻、２４４７〜２４５ ３頁（１９６７）に開示のカルボキシルーアミノカップリング用水溶性カルボジ イミド、（３）バシリ（Ｂａｓｓｉｒｉ）ら、シェフおよびベアマン監修（上記 に引用）の４６〜４７頁およびワルターら（上記に引用）に開示のチロノン−チ ロシン側鎖カップリング用ビス−ジアゾベンジジン（ＤＢＤ）；および（４）キ タガワ（Ｋｉ　ｔａｇａｗａ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ（東京）、７９巻、２３ ３〜２３９頁（１９７６）およびラーナーら、（上記に引用）に開示のシスティ ン（または他のスルフィドリル）−アミノ基をカップリングするためのマレイミ ドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキソスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）：である。所 定のペプチドをタンパク質担体にカップリングさせるのに適当な方法を選択する ための通則は下記の通り記述することができる。すなわち、結合に関係する基は 、配列において１回だけ、好ましくは断片の適当な末端で生じなければならない 。例えば、ＢＤＢは、チロシン残基がその可能な抗原性に選択された配列の主要 部分で生じるならば用いるべきではない。同様に、中央に位置したりシンはグル タルアルデヒド法から除外され、アスパラギン酸およびグルタミン酸の発生はカ ルボジイミドの方法を妨げることが多い。一方において、適当な残基を、それら が「本来の」タンパク質配列で生じるにせよ生じないにせよ、結合部位として選 択された配列断片のどちらの末端にも配置することができる。アミノ末端基およ びカルボキシル末端基と異なる内部断片は、それが、ポリペプチド主鎖が連続し ている本来のタンパク質で見出される場合の同じ配列とは、「非結合末端」でか なり異なっている。その問題は、α−アミノ基をアセチル化した後、それにペプ チドをそのカルボキシル末端基によって結合させることにより、ある程度まで改 善することができる。担体タンパク質に対するカップリング効率は、合成の一段 階で放射性アミノ酸を用いることによってかまたは完成したペプチドをチロシン 残基のヨウ素化により標識することによって調製された放射性標識ペプチドを用 いることによって好都合に測定される。ペプチド中のチロシンの存在は、所望な らば、鋭敏なラジオイムノアッセイを行うことを更に可能にする。したがって、 チロシンは、それが本来のポリペプチドによって定義されたペプチド配列の一部 分ではない場合、末端基として導入することができる。

好ましい担体はタンパク質であり、好ましいタンパク質担体として、ウシ血清ア ルブミン、ミオグロブリン、オボアルブミン（ＯＶＡ）　、カサガイのヘモシア ニン（ＫＬＨ）等が挙げられる。ペプチドは、リュー（Ｌ　ｉ　ｕ）ら、Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉ　ｓ　ｔ　ｒｙｓ　１８巻、６９０〜６９７頁（１９７９）で開示の ＭＢＳによって、システィンを介してＫＬＨに結合させることができる。ペプチ ドをリン酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ７，５）　、０．１モルホウ酸ナトリウム緩 衝液（ｐＨ９゜０）または１．０モル酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，０）に溶 解させる。ペプチドが溶解するｐＨを選択してペプチドの溶解性を最適にする。

可溶性ペプチドのための遊離システテイン含量は、エルマン法（Ｅｌ１ｍａｎ’ 　ｓ　ｍｅｔｈ。

ｄ）、エルマン（Ｅｌ　］ｍａｎ）　、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈ ｙｓ。

、８２巻、７０７７頁（１９５９）によって決定される。各ペプチドについて、 １０ミリモルのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２）０．２５ｍ１中、４ｍｇ のＫＬＨを、（ジメチルホルムアミドに溶解した）ＭＢ３０．７ｍｇと反応させ 、室温で３０分間撹拌する。ＫＬＨは３０％を越えるホルムアミドに不溶性であ るので、ＭＢＳを滴加して、ホルムアミドの局部的濃度が高くなりすぎないこと を確実にする。反応生成物であるＫＬＨ−ＭＢＳを、次に、５０ミリモルリン酸 ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡にしたセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅ ｘ）Ｇ−２５に通過させて遊離ＭＢＳを除去する。カラム溶出液の（ＯＤ　２８ ０で監視された）ピーク画分からのＫＬＨの回収率は約８０％であると推定され る。次に、ＫＬＨ−ＭＢＳを、選択された緩衝液１ｍｌ中に溶解したペプチド５ ｍｇと反応させる。ｐＨを７〜７．５に調整し、反応を室温で３時間撹拌する。

カップリング効率は、放射性ペプチドを用いて、リン酸塩緩衝生理食塩水に対す る共役の試料の透析によって監視しされ、８％〜６０％である。ペプチド−担体 の共役が利用可能になれば、多クローン性抗体または単クローン性抗体が、例え ば、カンブベル（Ｃａｒｎｐｂｅｌｌ）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏ ｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏ　］　ｏｇｙ　（エルセヴイア、ニューヨーク、１９８４） ；バレル（Ｈｕｒｒｅｌり監修、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　 Ａｎｔｉｂ。

ｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣＲＣ プレス、ポカ・ラドン、ＦＬ、１９８２）；シュライア−（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ） ら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（＋−ルド・スプリング・ハー バ−・ラボラトリ−、ニューヨーク、１９８０）；米国特許第４．　５６２．　 ００３号明細書：等で開示の標準法によって生産される。特に、米国特許第４， ５６２．００３号明細書は参考文献として後述される。

多クローン性抗体および単クローン性抗体双方をエライザによってスクリーンす ることができる。他の固相免疫検定でのように、試験は、プラスチックに対して 非特異的に吸着する巨大分子の性質に基づく。この反応の不可逆性は、免疫学的 活性を損失することなく抗原−抗体複合体の生成を可能にし、このような複合体 は非結合物質から簡単に分離される。抗ペプチド血清を滴定するには、免疫に用 いられたものとは異なる担体に対して共役したペプチドを９６ウ工ル微量滴定プ レートのウェルに吸着させる。次に、吸着した抗原を抗ペプチド血清の稀釈液と ウェル中で反応させる。非結合抗体を洗い落とし、残留する抗原−抗体複合体を 、免疫された動物のＩｇＧに特異的な抗体と反応させる。この第二の抗体をアル カリ性ホスファターゼなどの酵素に共役させる。酵素基質が加えられた場合に生 じた可視的に着色した反応生成物は、ウェルに抗ペプチド抗体が結合したことを 示す。分光光度計の読みを用いることによって、結合したペプチド特異性抗体の 量の更に満足のいく定量化が可能になる。高滴定量の抗血清により、１０−３〜 １０−５の稀釈度の直線状の滴定曲線が得られる。

寒塵男 下記の実施例は、本発明を例証するためのものである。ベクターおよび宿主の選 択並びに試薬の濃度、温度および他の変数値は、本発明の方法を単に例示するた めのものであり、発明を制限すると考えるべきではない。

実施例Ｉ、　マウスＣ３ｌＦの生物学的活性いくつかのＴ細胞クローンからのマ ウスＣ３ｌＦ含有上澄みは、Ｔ細胞クローン（細胞５Ｘ１０６個／ｍ１）を、血 清不含培地（フェノールレッドを欠いていて且つ領　０５ミリモルの２−メルカ プトエタノールおよび２０ミリモルのＨＥＰＥＳを含むＰＲＭＪ　１６４０）お よびフンカナバリンＡ（５μｇ／ｍｌ）中で２４時間インキュベートすることに よって得られた。クローンには細胞系が含まれており、米国特許第４，６１３， ４５９号明細書に記載されたＤ９：　（下記に記載される）ＤＩＯ；モスマン（ Ｍｏｓｍａｎｎ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３６巻、２３４８〜２３５７頁 （１９８６）に記載されたＭＢ２−１　：　トニー（Ｔ　ｏ　ｎ　Ｖ）ら、Ｊ、 Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　、１６１巻、２２３頁（１９８５）に記載されたＣＤＣ２５ およびＣＤＣ３５；並びにＭ４１１−２およびｍ４１１−６であった。Ｔ細胞上 澄みは、チェルヴインスキ（Ｃｈｅｒｗｉｎｓｋｉ）　ら、ＪＥｘｐ、Ｍｅｄ、 　、１６６巻、１２２９〜１２４４頁（１９８７）に記載された細胞系ＨＤＫ− １においてＩＦＮ−γ合成を抑制するそれらの能力について検定された。各Ｔ細 胞クローンからの試料の連続二倍稀釈は、容量的　０５ｍ１の９６ウ工ル平底微 量滴定トレイ中で調製された。ＨＤＫ−１細胞（細胞５×１０４個／ウェル）を 、照射された（２５０ＯＲ）同系のＡＰＣｓ　（牌臓細胞、５×１０５個／ウェ ル）および抗原（カサガイのヘモシアニン１５０μｇ／ｍｌ）と−緒に容量的　 １５ｍ１で加えた。オーハラ（Ｏｈａｒａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３１５巻、３３ ３〜３３６頁（１９８５）に記載されたＩＩＢ−１１抗Ｉ　Ｌ−４抗体（１０μ ｇ／ｍｌ）を、ＩＬ−４を含むことが予想される試料に加えた。

３７℃で２４時間インキュベーション後、上澄みを集め、４０℃で１週間未満ま たは８０℃で更に長期間の間保持した。ＩＦＮ−γの濃享を、ラット抗マウスＩ ＦＮ−γ単りローン性抗体、ＸＭＧｌ、２およびアフィニティー精製ウサギ抗マ ウスＩＦＮ−γ抗体を用いる二か所サンドイッチエライザによって検定した。図 １に、ＩＦＮ−γ合成の抑制度を対照濃度の百分率として示す。

ＤＩＯ細胞によって産生きれたＣ５ＴＦを不完全に精製し且つ２種類の異なるＴ 細胞クローンに適用して、サイトカイン合成抑制の程度をＣ３ｌＦ濃度の関数と して調べた。不完全に精製されたＣ３ｌＦは、下記のようにｙ４製された。すな わち、１〜２．５リツトルのバッチのコンカナバリンＡに誘発された０１０上澄 みを、アミコン（Ａｍｉ　ｃｏｎ）ＹＭ−５膜（アミコン・コーポレーション（ Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、）、マサチューセッツ州、ダンバーズ）を用いて約１ ０倍に濃縮し、５ｍｌのマンノース共役アガロースカラム（イー・ワイ・ラボラ トリーズ（Ｅ−Ｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州、サン・マ テオ）に通過させ、続いて更に、もう一度３〜５倍に濃縮して全部で３０〜５０ 倍に濃縮した。次に、この材料を二段階の高速液体クロマトグラフィー、すなわ ち、最初に、ヒドロキシルアパタイト基剤カラム〔バイオ・ゲル（Ｂｊｏ−Ｇｅ ＤＨＰＨＴ、バイオ・ラド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔ 。

ｒｉｅｓ）、カリフォルニア州、リッチモンド）で、そして次に、ゲル濾過カラ ム［ＴＳＫ−Ｇ　３０００　ＳＷ、長さ６０ｃｍ、エルケイビー・インストウシ メンツ（ＬＫＢ　ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＬゲイサーズバーグ・ＭＤ］によって 更に精製した。このような不完全に精製されたＣ３ｌＦのバッチの−っを分別し て一８０℃で保持し、Ｃ３ｌＦ活性の標準として用いた。最初に検定した場合、 この調製試料は、検定容量０．２ｍｌ中、１／２００の稀釈度でＩＦＮ−γ産生 の抑制的５０％を生じ、それゆえ、標準単位は、標準Ｃ３ｌＦ調製試料の値を１ ０００Ｕ／ｍｌとすることによって定義された。下記の各検定において、未知試 料のＣ３ｌＦ活性は、既知試料によるＩＦＮ−γ合成の抑制量を標準の量に対し て比較することによって定量化された。サイトカイン合成の抑制について検定さ れたＴ細胞クローンは（前記に記載された）ＨＤＫ−１およびＣｅ１１．Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、　、９７巻、３５７頁（１９８６）に記載されたＭＤ１３−１０であ った。ＩＬ−３およびＧＭ−Ｃ３Ｆａ度の検定では、不完全に精製されたＣ３ｌ Ｆを、抗ＩＬ−３および抗ＧＭ−Ｃ３Ｆアフィニティーカラムにそれを通過させ ることによって更に処理した。１１モルＮａＣ１，０，１モルＨＥＰＥＳおよび ０．０８モルＣａＣｌ　２中の抗体を、４℃で４時間静かに混合することによっ てアフィ・ゲル（Ａｆ　ｆ　ｉ　−Ｇｅ　１）　１０　（バイオ・ラド）に結合 させた。１〜２ｍｌのカラムそれぞれに、結合した抗体約１０〜２０ｍｇが含ま れた。

下記の表に示したように、ＴＦＮ−γ産生は両方のクローンにおいて抑制された 。他のサイトカインのＩ　Ｌ−２、リンフォトキシン、Ｉ　Ｌ−３およびＧＭ− Ｃ３Ｆの合成は、ＭＤ１３−１０細胞においてわずかな程度でしかまたは全く抑 制されなかった。

細胞系　サイトカイン　対照合成濃度％１４Ｕ／ｍｌ　４２Ｕ／ｍｌ　１２５Ｕ ／ｍ１ＨＤＫ−１１ＦＮ−７４７，６２９，１１８，６１Ｌ−２７１，７５９， ６４０，４ リンフオトキシン　４１．９　４５．１　４２．８ＩＬ−３６３，９５２，６３ ８，４ ＧＭ−Ｃ３Ｆ　８６．９　７９．１　６６．８ＭＤ１３−１０ ＩＦＮ−γ　３６．０　２７．５　２３．２ＩＬ−２８８，２１０９，３９６， ０ ＴＬ−３６０，２６３，０５１，Ｏ ＧＭ−Ｃ３Ｆ　１０９．０　１．１９，９　９７．６実施例Ｉ１．　ＤＩＯ細胞 からのｃＤＮＡライブラリーの構築およびりｏ−ンｐ　ｃＤ　（ＳＲａ）　−Ｆ 　１１５の単離ｃＤＮＡライブラリーは、ケイ（Ｋａｙｅ）ら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍ ｅｄｌ、１５８巻、８３６頁（１９８３）に記載されたＤＩＯ細胞から抽出され たｍＲＮＡがらのｐｃＤ（ＳＲａ）ベクターにおいて、オカヤマ（Ｏｋａｙａｍ ａ）およびベルブ（Ｂｅｒｇ）、Ｍｏ１．Ｃｅ１　］。Ｂｉｏｌ　、２＋１６１ 〜１７０頁（１９８２）および３・２８０〜２８９頁（１９８３）の、そして更 に、参考文献として後述される米国特許第４．６９５．５４２号明細書で開示さ れた方法にしたがって構築された。ｃＤＮＡ挿入部分を有するｐｃＤ（ＳＲａ） ベクターは大腸菌において増幅された。プラスミドＤＮＡは、これらの無作為に 採取されたクローンのプールから抽出され且つ下記に記載のＣ０Ｓ７サル細胞の ）・ランスフェクションに用いられた。次に、ＣＯ５７培養物の上澄みのＣ３ｌ Ｆ活性について試験した。ＣＯ３細胞のトランスフェクションは下記のように行 った。すなわち、トランスフェクションの前日に、ＣＯ３７サル細胞約１．５Ｘ １０６個を、個々の１００ｍｍプレート上の、５％ウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ）お よび２ミリモルグルタミンを含むダルベツコ変性イーグル培地（ＤＭＥ）中に播 種した。トランスフェクションを行うために、ＣＯ３７細胞を、トリプシンと一 緒にインキュベーションすることによってその皿がら取出し、血清不含ＤＭＥ中 で２回洗浄し、そして血清不含ＤＭＥ中、細胞１０７個／ｍ＋に懸濁させた。０ ．７５ｍ１部分をＤＮＡ２０μｇと混合し且つ０．４ｃｍの滅菌エレクトロポレ ーションキュベツトに移した。１０分後、細胞をバイオラドシーンパルサー（Ｂ ｉｏＲａｄ　ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ）装置中、２００ボルト、９６０ｕＦで振動 させた。更に１０分後、細胞をキュベツトから取出し、５％ＦＣ３，２ミリモル のグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンが入って いるＤＭＥ２０ｍｌに加えた。混合物を１００ｍｍの組織培養皿４個に分取した 。３７℃、５％ＣＯ２で１２〜２４時間後、培地を、１％ＦＣＳのみを含む同様 の培地で置き換え、インキュベーションを３７℃、５％ＣＯ２で更に７２時間続 けた後、培地を集め、Ｃ５ＩＦ活性について検定した。続いて、ｐｃＤ　（ＳＲ ａ）−Ｆ１１５のｃＤＮＡ挿入部分の最大の読み取り枠の配列を下記の通り決定 し、そしてバイン（Ｈｅｉｊｎｅ）アルゴリズムによって決定された成熟マウス ｃｓＩＦタンパク質のアミノ酸配列は下記の通りである。

ＱＹＳＲＥＤＮＮＣＴ’　ＨＦＰＶＧＱＳ）（ＭＬ　ＩＪＥＬＲＴ廓ＱＶ　ＫＱ ＬＶＫＳＤＦＮＫＬＱＤ　ＱＧＶＹＫＡＭＮＥＦ　ＤＩＦＩＮＣＩＥＡＹ　陸ξ 心■Ｓ実施例Ｉ　Ｉ　１．　ｐｃＤ　（ＳＲａ）−Ｆ１１５から誘導されたプロ ーブを用いるヒトＣ５ＩＦ用のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングｐＨ５Ｃ およびｐＨ１５ｃの単離 ヒトＴ細胞クローンから抽出されたｍＲＮＡからのｐｃＤ（ＳＲａ）において構 築されたｃＤＮＡライブラリーは、オリゴヌレクオチチドの配列が成熟Ｃ３ｌＦ をコードするマウスＣ３ｌＦ遺伝子の断片のコードおよび非コードストランドに 対して相補的である７０マーのオリゴヌクレオヂドの集合を用いてスクリーンさ れた。標準ハイブリダイゼーションプロトコルを用い、例えば、１５０ｍｍベト リ皿上で増殖した細菌のコロニーをシーンスクリーン（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ） 膜に移し、放射性標識したオリゴヌクレオヂドブローブを用いて処理し、洗浄し た後、ＸＳ＊フィルムに露出した。プローブを、プローブの長さのための低緊縮 条件下でハイブリッド形成し、すなわち、標的核酸を５ｘＳＥＴ　（２０ｘＳＥ Ｔは３モルＮａＣｌ＋０．４）リス−ｃｌ　（ｐＨ７，８）＋２０ミリモルＥＤ ＴＡである）中、６０℃でインキュベーションすることから成るプレハイブリダ イゼーションに続いて、同じ条件下でハイブリダイセージクンを行い、そして５ ＸＳＥＴ中５０℃で洗浄した。プラスミドｐＨ５０およびｐＨ１５ｃを有する２ 種類のクローンを同定した。双方のプラスミドが、ＰＨＡで刺激されたヒトＰＢ ＬｓにおけるＩＦＮ−γ合成を抑制することができるＣＯ３７細胞のタンパク質 を発現した。ｐＨ１５ｃのｃＤＮＡ挿入部分を図４に図示し、その最大読み取り 枠のヌクレオチド配列を下記に示す。

ＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧ　ＡＣＡＴＣＡＡα’Ｌ　ＧＣＡＴＴＥＴＧＡＡＣ’＄　 ）ＪＳＡＡＣＣｒＧＡＡ実施例ＩＶ、　Ｃ５ｒＦに特異的な単りローン性抗体雄 のルイスラットを、Ｃ０Ｓ７細胞で発現されたヒトＣ３ｌＦの手積製調製試料で 免疫した。最初に、ラットを完全フロインドアジュバント巾約５０μｇのヒトＣ ３Ｉ　Ｆで免疫し、完全フロインドアジュバント中の同量の材料で２回追加投与 した。試験血液を採取した。被験動物にリン酸塩緩衝生理食塩水中２０μｇの最 終の追加抗原を与え、４日後にその膵臓を融合用に入手した。

ラットの膵臓細胞約３Ｘ１０８個を、等数のＰ３Ｘ６３−ＡＣ３，６５３マウス ミエローマ細胞（ＡＴＣＣから寄託番号ＣＲＬ１５８０として入手可能）と融合 する。３８４０個の微量滴定プレートウェルに５．７Ｘ１０４個／ウェルの親ミ エローマ細胞を播種する。融合およびそれに続いてハイプリントを培養するだめ の標準プロトコルを、例えばフレティン（Ｃｈｒｅｔｉｅｎ）ら、Ｊ、Ｔｍｍｕ ｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、　、１１７巻、６７〜８１ページ（１９８９）で記載された ように行う。融合後１２日目に上澄みを採取し且つ間接エライザにより、Ｃ３ｌ Ｆ　Ｃ０８７細胞において産生されたヒト　でコートされたＰＶＣプレート上で スクリーンする。ハイブリドーマＪＥＳ３−１９Ｆ１をこの方法で同定し、アメ リカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託した。

阻止抗体を産生ずるハイブリドーマを、最初にスクリーンされたハイブリドーマ から、ＰＨＡで刺激されたヒトＰＢＬｓにおけるＩＦＮ−γ合成についてのＣ３ ｌＦに誘発された抑制に対して反対に作用する抗体を産生ずるそれらの能力によ って選択する。

実施例Ｖ、　細菌宿主におけるヒ１−Ｃ３ｌＦの発現合成ヒトＣＩ　ＳＦ遺伝子 を多数の化学的に合成された二重鎖ＤＮＡ断片から組立てて、ＴＡＣ−ＲＢＳ− ｈＣ３Ｉ　Ｆと称される発現ベクターを形成する。クローニングおよび発現は、 標準細菌システム、例えば、ヴイエラ（Ｖｉｅｒａ）およびメスイング（Ｍｅｓ ｓｉｎｇ）によってＧｅｎｅ、１９巻、２５９〜２６８頁（１９８２）＋：記載 された大腸菌に一１２菌株であるＪＭｌｏｌ、ＪＭ１０３等で行われる。制限エ ンドヌクレアーゼ消化およびリガーゼ反応は、標準プロトコル、例えば、マニア ティス（Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎ ｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ＋　（：ｌ−ラド・スプリング・ハ ーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク、１９８２）を用いて行われる。

小規模のプラスミド調製試料にはアルカリ法（マニアティスら、上記に引用）を 用いる。大規模の調製試料にはアルカリ法の変法を用いて、開裂した溶解物がら 咳酸を沈殿させるのに等量のイソプロパツールを用いる。２．５モルの冷酢酸ア ンモニウムによる沈殿を用いてＲＮＡを除去した後、塩化セシウム平衡密度遠心 法および臭化エチジウムによる検出を行う。

フィルターハイプリダイセーションにはワットマン（Ｗｈａ　ｔｍａｎ）５４０ フイルターサークルを用いてコロニーを持ち上げた後、逐次的に、０．５モルＮ ａＯＨ，１，５モルＮａＣｌ；１モルトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０，１５モルＮ ａＣｌによる処理（それぞれ２分間）、および８０℃（３０分間）での加熱を行 うことによって溶解させ且つ固定する。ハイブリダイゼーシヨンは、５ＸＳＳＰ Ｅ、２０％ホルムアミド、０１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）　、大腸ｓ ｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ）Ｇ−２５０（バイオ・ラド）Ｌｏｏｍｇ ／ｍｌ中、４２℃で６時間行い、３２Ｐｌ識（キナーゼ作用による）合成りＮＡ ｓを用いる。（２０ＸＳＳＰＥは、ＮａＣ１を１７４ｇ、ＥＤＴＡを７．４ｇお よびＮａＨ２ＰＯ４・９Ｈ２０を２７６ｇｇａ００ｍ１中に溶解させることによ って調製され、そのｐＨはＮａＯＨを用いて７４に調整し、容量は１リツトルに 調整し、そして溶液をオートクレーブによって滅菌する）。フィルターを１、　 Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ、０１％ＳＤＳで２回（室温で１５分間）洗浄する。オート ラジオグラフィー［））（Ｆｕ　ｊ　１）ＲＸフィルム］後、陽性のクローンを 、再増殖したコロニーとフィルター上の青色に染色されたコロニーとを一緒に配 列させることによって定着させる。ＤＮＡを、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｐ ｒｏｃＮａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　、７４巻、５４６３頁（１９７７）のノ ブオキシ法によって配列させる。ジデオキシ反応の鋳型は、Ｍ１３ｍｐベクター に再クローン化された適当な領域の一重ＨＤＮＡｓ［例えば、メスイング（Ｍｅ ｓｓｉｎｇ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、９巻、３０９頁（１ ９８１）］かまたは、ミニアルカリ法によって調製され、０．２モルＮ　ａ　Ｏ Ｈで変性され（室温で５分間）且つ２容量のエタノールの添加により０．２モル ＮａＯＨ１０４３モル酢酸アンモニウムから沈殿した二重鎖ＤＮＡである。ＤＮ Ａを、ホスホラミダイト化学によってアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌ ｉｅｄ　Ｂｉ。

ｓｙｓ　ｔｅｍｓ）３８０Ａ合成機を用いて合成する。合成、脱タンパク質、開 裂および精製（７Ｍ　尿素　ＰＡＧＥ、溶離、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグ ラフィー）を、３８０Ａ合成機のマニュアルに記載されたように行う。

クローン化される合成りＮＡｓの相補的ストランド（各４００ｎｇ）を混合し、 ポリヌクレオチドキナーゼを用いて反応容量５０ｍ１中でホスホリル化する。こ のＤＮＡを、適当な制限酵素で消化されたベクターＤＮＡ１ｍｇを用いて連結さ せ、連結反応は容量５０ｍ１中、室温で４〜１２時間である。ホスホリル化の条 件、制限酵素の消化、ポリメラーゼ反応および連結反応については記載されてい る（マニアティスら、上記に引用）。コロニーは、（望ましい場合）ｌａｃＺ＋ について、アンピシリン、イソプロピル−１−チオーβ−Ｄ−ガラクトノド（Ｉ ＰＴＧ）（０，４ミリモル）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル− β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｘ−ｇａ　ｌ）（４０ｍｇ／ｍｌ）を補足したし 寒天上でブレーティングすることによって評価される。

ＴＡＣ−ＲＢＳベクターは、ＤＮＡポリメラーゼを用いてｔａｃＰ含有プラスミ ドｐＤＲ５４０［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］の単一のＢａｍＨＴ部 位を補充することによって構築される。次に、これを、コンセンサス（ｃｏｎｓ ｅｎｓｕｓ）リポソーム結合部位（ＲＢＳ、ＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＣ） をコードしている二重鎖断片を形成する非ホスホリル化合成オリゴヌクレオチド （ファーマノア）に連結させる。連結反応の後に、混合物をホスホリル化し且つ ５ｓｔｌリンカ−ＡＴＧＡＧＣＴＣＡＴと再連結させる。次に、この複合体を、 ５ｓｔｌおよびＥｃｏＲＩを用いて開裂し、１７３ｂｐの断片をポリアクリルア ミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって単離し、そして（下記に記載の）Ｅｃ。

Ｒ１−３ｓｔＩ制限ｐＵｃ１９（ファーマンア）にクローン化した。最終構造（ ＴＡＣ−ＲＢＳと称される）のＲＢＳ−ＡＴＧ−ポリリンカー領域の配列を図３ に示す。

合成Ｃ３ｌＦ遺伝子を８段階でｐＵｃ１９に組立てる。各段階での欠失による挿 入部分不含および／または挿入部分を、段階１で挿入されたＡＴＧ開始コドンに よる枠内でｐＵｃ１９のＩａｃＺ（α）を保持することによってクローニング後 に検出することができる。欠失を含むクローンおよび／または挿入部分の変化は 、ｘ−ｇａ！およびＩＰＴＧを含むＬ−アンビンリンプレート上の青色コロニー を評価することによって取り除くことができる。或いは、各段階での挿入部分の 配列を、例えば、ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ ｈｅｊｍ＞から入手可能な小規模のプラスミドＤＮＡ調製試料での万能連続性プ ライマー（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｐｒｉｍｅｒ）を用い て容易に確証することができる。

段階１において、ＴＡＣ−ＲＢＳベクターを５ｓｔＩで消化し、Ｔ４−ＤＮＡポ リメラーゼ（その３′−エキソヌクレアーゼ活性が５ｓｔＩ断片の３′−突出ス トランドを消化してプラント末端断片を形成する）で処理し、そしてＴ４−ＤＮ Ａポリメラーゼの失活後、ＥｃｏＲＩで処理して、ＴＡＣ−ＲＢＳ領域を含み且 つプラント末端をＡＴＧ開始コドンに有し、その反対の末端にＥｃｏＲＩ断片を 有する１７３ｂｐの断片を形成する。最後に、１７３ｂｐのＴＡＣ−ＲＢＳ断片 を単離する。

段階２において、段階１で単離されたＴＡＣ−ＲＢＳ断片を、ＥｃｏＲＩ／Ｋｐ ｎｒで消化したプラスミドｐＵｃ１９と、下記に示すようにその上流末端にプラ ント末端を有し且つその下流末端にＫｐｎ　ｌ断片に対応する付着端を有する合 成断片ＬＡ／Ｂと一緒に混合する。このＫｐｎｌ末端はＢｓ　ｔＥＩ　Ｉ部位に 隣接し且つその下流にある。断片を連結して段階２のｐＵｃ１９を形成する。

段階３において、合成断片２Ａ／Ｂおよび３Ａ／Ｂ（下記に示す）を、段階２の Ｂｓ　ｔＥＩ　Ｉ／Ｓｍａ　Ｉで消化したｐＵｃ１９　（増幅および精製ｉ＆） と混合し且つ連結して段階３のｐＵｃ１９を形成する。断片３Ａ／Ｈの下流末端 に、ＳｍａＩプラント末端を形成する余分の塩基が含まれることに注目されたい 。これらの余分の塩基は段階４で開裂される。更に、断片２Ａ／Ｂおよび３Ａ／ Ｂは、混合物によってアニールする相補的な９残基の一重鎖末端を有し、２Ａ／ Ｂを有する上流ＢｓｔＥＩＩ断片および３Ａ／Ｂを有する下流プラント末端を残 して連結してｐＵｃ１９を形成する。

段階４において、段階３のＡｆ　ｌ　Ｉ　Ｉ／Ｘｂａ　Ｉで消化したｐＵｃ１９ 　（増幅および精製後）を再精製し、合成断片４Ａ／Ｂ　（下記に示す）と混合 し且つ連結して段階４のｐＵｃ１９を形成する。

段階５において、段階４のＸｂａＩ／Ｓａ］Ｊで消化したｐＵｃ１９（増幅およ び精製後）を、合成断片５Ａ／Ｂ　（、下記に示す）と混合し且つ連結して段階 ５のｐＵｃ１９を形成する。断片５Ａ／Ｂの５ａｌＩ付着端は、段階６でのＨｐ ａＩによる消化によって除去される。

段階６において、段階５のＨｐａＩ／Ｐｓｔｌで消化したｐＵｃ１９　（増幅お よび精製後）を、合成断片６Ａ／Ｂ（下記に示す）と混合し且つ連結して段階６ のｐＵｃ１９を形成する。

段階７において、段階６のＣ］ａｌ／５ｐｈｌで消化したｐＵｃ１９　（増幅お よび精製後）を、合成断片７Ａ／Ｂ　（下記に示す）と混合し且つ連結して段階 ７のｐＵｃ１９を形成する。

段階８において、段階７のＭ］ｕＩ／ＨｉｎｄｌｌＴで消化したｐＵｃ１９（増 幅および精製後）を、合成断片８Ａ／Ｂおよび９Ａ／Ｂと混合し且つ連結して最 終構造を形成する。最終構造を、例えば、ＡＴＣＣから寄託番号３３８７６とし て入手可能な大腸菌に一１２菌株ＪＭＩＯＩに、標準法によって挿入する。培養 後、タンパク質をＪＭＩＯＩ細胞から抽出し、その抽出物の稀釈物の生物学的活 性について試験する。

断片ＩＡ／Ｂ 断片２　Ａ／Ｂ 断片３　Ａ／Ｂ 断片４Ａ／Ｂ 断片５　Ａ／Ｂ 断片６　Ａ／Ｂ 断片７　Ａ／Ｂ 断片８　Ａ／Ｂ ＣＴＴＣＴＡＴＧＣＴ　ＴＴＧＡＣＴｔｃｇａ断片９　Ａ／Ｂ （小文字は、塩基がその同じ部位での本来の配列の塩基とは異なっていることを オボアルブミン（ＯＶＡ）５０ｍｇおよびミオグロブリン（ＭＹＯ）（例えば、 シグマから入手可能）５０ｍｇをそれぞれ０１モル重炭酸ナトリウム１０ｍ１に 溶解させ且つ０．１２のヨードアセトアミド溶液（ヨードアセトアミド８８ｍｇ を０．　１モル重炭酸ナトリウム４ｍｌ中に溶解させた）１ｍｌと、１５ｍ１の ファルコンチューブ［ファルコン・プラスティクス（Ｆａｌｃｏｎ　Ｐｌａｓｔ ｉｃｓ）、カリフォルニア州、オソクスナード〕等中、室温で１時間反応させる 。

各反応混合物を、０．　１モル重炭酸ナトリウム４リツトルに対してＪＲＣで一 晩中透析する。別個に、ＣＥＮＫＳＫＡＶＥｌｏｍｇを、４ｍｌの試験管中の０ ゜１モルＤＴＴ　（ジチオティトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｅｉｔｏｌ））溶液（ ５０ミリモルトリスおよび２．５ミリモルＥＤＴＡを含み、ｐＨ８）２ｍｌに溶 解さす、３７℃で一晩中インキユベートした後、ＧＦＯ５ゲル濾過カラム（１， ５Ｘ２６．５ｃｍ）（ＬＫＢ、フロンマ、スウェーデン）ニ適用し、そしテ０． ０１５モル酢酸および０．００５モルβ−メルカプトエタノールから成るペプチ ド溶離緩衝液で溶離する。ペプチド含量が減少したそれぞれ約３．５ｍｌの３種 類の画分を、２０６ｎｍでの光学濃度によって同定し、採取し、プールし、ドラ イアイスで凍結させ、そして−晩生凍結乾燥させる。同時に、ＯＶＡおよびＭＹ Ｏを透析から回収し、０．４５マイクロメーターのフィルターを介する濾過によ って透明にする。ＯＶＡおよびＭＹＯをそれぞれ、ヨード酢酸のＮ−ヒドロキシ スクシンイミドエステル（Ｎ）（ＩＡ）［レフター（Ｒｅｃｔｏｒ）ら、Ｊ、Ｉ ｍｍｕｎｏ　］、Ｍｅ　ｔｈ、　、２４巻、３２１頁（１９７８）で開示された 〕をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（５ｍｇ／ｍｌ）に溶解させたちの３８０マ イクロリツトルと一緒に混合し、室温で３０分間撹拌し、そしてＰＢ３４リット ル（Ｈ２０４リットル中１．：Ｎａ）１２ＰＯ４−Ｈ２Ｏを１．８ｇ、Ｎａ２Ｈ Ｐ０４−Ｈ２Ｏを７゜２ｇおよびＮａＣ１を３４ｇ）に対して一晩中透析するこ とによって活性化する。

別個に凍結乾燥したペプチドをホウ酸塩還元緩衝液（Ｈ２０１リットル中にＮａ ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２０が２ｇ、ＮａＣ＋が１７．４ｇおよびＥＤＴＡ−Ｎａ２ が３３６ｍｇ５ｐＨを濃ＨＣＩで８．５に調整し、窒素下で１５分間脱酸素化し た後、アスコルビン酸塩１７８ｍｇを加える）５ｍＩ中で懸濁させる。透析され たヨードアセチル化ＯＶＡおよびＭＹＯを回収し、別個に、等量（好ましくは、 ２ｍ１）のペプチド含有ホウ酸塩還元緩衝液と混合し、そして室温で一晩中イン キユベートする。得られる共役を５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１２，５％、ゲル）によ って分析する。溶液を含む共役をＰＢＳで１ｍｇ／ｍ）まで稀釈し、滅菌＃過し 、そして免疫用に便宜容量（例えば、５００マイクロリツトル）に分取しおよび ／または４℃で貯蔵する。ＭＹＯ共役に対する多クローン性抗血清をラットおよ びウサギにュージーランドホワイト）双方で産生させる。ウサギ用の免疫計画は 下記の通りである。すなわち、最初に（０週）、血清試料１０ｍ１を対照として 抽出する。１週間後（１週）、ペプチド−担体共役０．５ｍｌを完全フロインド アジュバント０．５ｍｌと混合し且つ腹腔内に注射する。３週間後（４週）、ペ プチド−担体共役鎖　５ｍｌと不完全フロインドアジュバント０．５ｍｌとを混 合したものから成る追加抗原を与える。次の週（５週）に、再度、ペプチド−担 体共役０．５ｍｌと不完全フロインドアジュバント０．５ｍｌとを混合したもの から成る更に別の追加抗原を与え、続いて、更にもう一度、同じ追加抗原を次の 週（６週）に行う。７週めに、血清２０ｍ１を被験動物から採血する。細胞性画 分から分離した後、血清を陽性の抗ＣＥＮＫＳＫＡＶＥ力価についてエライザに よって検定した。ラットの免疫は、最初の注射がＰＢＳ０．１５ｍ１およびペプ チド−担体共役Ｑ、１ｍｌと、完全フロインドアジュバント０．７５ｍ１とを混 合したものから成ること、追加抗原がＰＢＳ　０．１５ｍ１およびペプチド−担 体共役０．１ｍｌと、不完全フロインドアジュバント０．７５ｍ１とを混合した ものから成ること、そして血清２〜３ｍｌだけをラットから採血することを除い て同様に行われた。再度、陽性の抗ＣＥＮＫＳＫＡＶＥ反応をエライザによって 検出する。

本発明の前記の実施態様の説明を例示および説明の目的で与えてきた。それらは 、開示された正確な形式に対して徹底的であるかまたは本発明を制限するための ものではなく、明らかに、前記の内容の見解において多数の修正および変更が可 能である。実施態様は、本発明の理論を最もよく説明し、それによって当業者が 種々の実施態様においておよび種々の修正を用いて、予想される特定の使用に適 当であるように本発明を最もよく利用することを可能にするために選択され且つ 記載されたものであった。本発明の範囲は本明細書に添付の請求の範囲によって 定義されるものである。

本出願人は、ｐｃＤ　（ＳＲａ）−Ｆ−１１５、ｐＨ５ＣおよびｐＨ１５ｃを有 する大腸菌ＭＣ１０６１を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、 メリーランド州、ロックビル、米国（ＡＴＣＣ）に、それぞれ寄託番号６８０２ ７．６８１９１および６８１９２として別個に寄託した。これらの寄託は、特許 目的の培養物の寄託に関するＡＴＣＣの条約に基づいて与えられる条件に基づい て行ったものであり、それによって、寄託は、米国成文法３５条１２２および米 国規制基準３７条１．１４に従って米国特許および商標局長に対して利用可能に させるものであることおよび米国特許証の公的発行に対して利用可能にさせるも のであることが保証され、それによって寄託が維持されることが必要とされる。

寄託された菌株の入手可能性は、いかなる政府のその特許法による代理権に基づ いて付与された権利に違反して本発明を実施する許可として解釈されるべきでは ない。

寄託は、微生物の寄託に関するブダペスト条約の要件に従って修正された。

Ｆｉｇｕｒｅ　２ 門　− ＡＡＴ　ＡＣＡ　ＡＡＡ　ＡＴＴ　ＡＧＯＣＧＧ　Ｇ（Ａ　ＴＧＧ　ＴＧＧ　０ ＧＧＡＧ　ＧＯＴ　ＧＡＧ　ＧＣＡ　ＡＧＡ　ＧＡＡ　ＴＴＧ□Ｔ　ＧＡＡ　Ｃ ＣＧＡＴ　ＡＴＯＡＴＧ　ＣＣＣｊ　ＯＴＧ　ＴＡＧ　ＴＣＯＡＧＣｊ　ＣＴＧ 　ＧＧＴＴＡ　ＴＴＣＡＡＴ　ＴＣＯＴＣＴ　ＧＧＧ　ＡＡＴ　ＧＴＴ　ＡＣＡ 　ＴＴＩＦｉｇｕｒｅ　４　（ｐａｒ コＯＧＯＡ　ＣＣＴＧＴＡ　ＡＴＯＣＣＡ　ＧＣＴＡＣＴ　ＴＧＧコＧ　ＡＧＧ 　ＡＧＡ　ＴＧＧ　ＡＡＧ　ＴＴＧ　ＯＡＧ　ＴＧＡ　ＧＣＴｆｆＴ　ＧＡＯＡ ＧＡ　ＧＣＡ　ＡＧＡ　ＣＴＣＴＧＴ　ＣＴＣＡＡＡＡＴＡ　ＧＡＡ　ＣｊＴＯ ＡＧＴ　ＴＴＴ　ＡＡＯＴＡＧ　ＡＡＴＧ ＡＣＡ　ＴＣＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　Ａ「ｔ５） 手続補正書 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９０１０３５５４ ２、発明の名称 サイトカイン合成抑制性因子、そのアンタゴニストおよびそれらの使用方法 ３、補正をする者 名　称　シェリングφコーポレーション４８代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号５、補正の対象 請求の範囲 （１）請求の範囲を次の通り補正する。

「１．　任意の他の哺乳動物タンパク質を実質的こ含まない哺乳動物サイトカイ ン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）合成抑制因子。

Ｆ　サイトカイン合成抑制因子をコードする単離された遺伝子。

主ユ　サイトカイン合成抑制因子活性を示すポリペプチドの連続核酸配列を用い てコードすることができる核酸であって、検出可能なハイブリッドを、ｐｃＤ　 （ＳＲａ）−Ｆ１１５、ｐＨ５Ｃまた；１ｐＨ１５ｃのｃＤＮＡ挿入部分から誘 導される１種類以上のプローブを用いて、５ｘＳＥＴ存在下６０℃でまたは同等 の条件で形成することができる前記の核酸。

土工　ヒトサイトカイン合成抑制因子活性を示すポリペプチドを生産する方法で あって、前記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から成るベクターを 構築し、そのヌクレオチド配列はベクターを有する宿主によって発現されること が可能であり且つそのヌクレオチド配列はアミノ酸配列 によって定義される読み取り枠の成熟ポリペプチドをコードする群より選択され ： そのベクターを宿主に取り込ませ：そしてその宿主を、前記のポリペプチド中に ヌクレオチド配列を発現させるのに適当な条件下の培地中で保持する： 段階から成る前記の方法。

５、ＭＨＣ関連免疫応答に関係した疾患を制御して患者を治療する方法であって 、有効量のヒトサイトカインの合成抑制因子を投与することから成る前記の方法 。

゛旦エ　患者の細胞性免疫応答を抑制する方法であって、有効量のヒトサイトカ イン合成抑制因子を投与することから成る前記の方法。

ヱエ　患者の体液性免疫応答を抑制する方法であって、有効量のヒトサイトカイ ン合成抑制因子に対するアンタゴニストを投与することから成る前記の方法。

し　宿主においてサイトカイン合成抑制因子タンパク質を発現することができる 発現ベクター。

主エ　ヒトサイトカイン合成抑制因子に対して特異的に結合する基クローン性抗 体。

１０、　６〜３０個のアミノ酸から成り、その配列が式 によって定義される成熟ヒトサイトカイン合成抑制因子のサブ配列（ｓｕｂ−ｓ ｅｑｕｅｎｃｅ）と同一であるペプチド、」 以上 国際調査報告 −−−・−・−ｍ−・−−・・−・−＋ｐＣ〒／Ｈζ口ｎ＃Ｊ］５ｓ４１１１１ Ｉ１．Ｉｌ、１．。、、１１．．１９．．１．。７１゜　ＰＣＴ／υＳ　９０１ ０３５５４

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．任意の他の哺乳動物タンパク質を実質的に含まない哺乳動物サイトカイン（ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）合成抑制因子。
2. ２．前記の哺乳動物サイトカイン合成抑制因子が、任意の他のヒトタンパク質を 実施的に含まないヒトサイトカイン合成抑制因子である請求項１に記載の化合物 。
3. ３．前記のヒトサイトカイン合成抑制因子が、アミノ酸配列【配列があります】 によって定義される読み取り枠の成熟ポリペプチドの群より選択される請求項２ に記載の化合物。
4. ４．前記のヒトサイトカイン合成抑制因子が、アミノ酸配列【配列があります】 によって定義される請求項３に記載の化合物。
5. ５．前記の哺乳動物サイトカイン合成抑制因子が、任意の他のマウスタンパク質 を実質的に含まないマウスサイトカイン合成抑制因子である請求項１に記載の化 合物。
6. ６．前記のマウスサイトカイン合成抑制因子が、アミノ酸配列【配列があります 】 によって定義される請求項５に記載の化合物。
7. ７．サイトカイン合成抑制因子をコードする単離された遺伝子。
8. ８．前記のサイトカイン合成抑制因子がヒトサイトカイン合成抑制因子である請 求項７に記載の化合物。
9. ９．前記の単離された遺伝子が、アミノ酸配列【配列があります】 によって定義される読み取り枠の成熟ポリペプチドをコードする請求項８に記載 の化合物。
10. １０．サイトカイン合成抑制因子活性を示すポリペプチドの連続核酸配列を用い てコードすることができる核酸であって、検出可能なハイブリッドを、ｐｃＤ（ ＳＲα）−Ｆ１１５、ｐＨ５ＣまたはｐＨ１５ＣのｃＤＮＡ挿入部分から誘導さ れる１種類以上のプローブを用いて、５×ＳＥＴ存在下６０℃でまたは同等の条 件で形成することができる前記の核酸。
11. １１．ｐｃＤ（ＳＲａ）−Ｆ１１５、ｐＨ５ＣおよびｐＨ１５Ｃから成る群より 選択されるベクターのｃＤＮＡ挿入部分の最大の読み取り枠の成熟ポリペプチド をコードする領域に対して少なくとも９０％相同である請求項１０に記載の核酸 。
12. １２．哺乳動物細胞源から誘導される請求項１０に記載の核酸。
13. １３．ヒトサイトカイン合成抑制因子活性を示すポリペプチドを生産する方法で あって、 前記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から成るベクターを構築し、 そのヌクレオチド配列はベクターを有する宿主によって発現されることが可能で あり且つそのヌクレオチド配列はアミノ酸配列【配列があります】 によって定義される読み取り枠の成熟ポリペプチドをコードする群より選択され ；そのベクターを宿主に取り込ませ；そしてその宿主を、前記のポリペプチド中 にヌクレオチド配列を発現させるのに適当な条件下の培地中で保持する； 段階から成る前記の方法。
14. １４．前記の培地および前記の宿主から前記のポリペプチドを分離する段階を更 に含む請求項１３に記載の方法。
15. １５．ＭＨＣ関連免疫応答に関係した疾患を制御して患者を治療する方法であっ て、有効量のヒトサイトカイン合成抑制因子を投与することから成る前記の方法 。
16. １６．前記の投与する段階として、一定量の前記のヒトサイトカイン合成抑制因 子を、一日当り約１〜１０μｇ／ｋｇ（前記の患者の体重）の範囲で静脈内に与 えることを含む請求項１５に記載の方法。
17. １７．患者の細胞性免疫応答を抑制する方法であって、有効量のヒトサイトカイ ン合成抑制因子を投与することから成る前記の方法。
18. １８．患者の体液性免疫応答を抑制する方法であって、有効量のヒトサイトカイ ン合成抑制因子に対するアンタゴニストを投与することから成る前記の方法。
19. １９．宿主においてサイトカイン合成抑制因子タンパク質を発現することができ る発現ベクター。
20. ２０．前記の宿主が哺乳動物である請求項１９に記載の発現ベクター。
21. ２１．前記のサイトカイン合成抑制因子がヒトサイトカイン合成抑制因子である 請求項２０に記載の発現ベクター。
22. ２２．ｐＨ５ＣおよびｐＨ１５Ｃから成る群より選択される請求項２１に記載の 発現ベクター。
23. ２３．前記の宿主が細菌である請求項１９に記載の発現ベクター。
24. ２４．前記のサイトカイン合成抑制因子がヒトサイトカイン合成抑制因子である 請求項２３に記載の発現ベクター。
25. ２５．ＴＡＣ−ＲＢＳ−ｈＣＳＩＦから成る請求項２４に記載の発現ベクター。
26. ２６．ヒトサイトカイン合成抑制因子に対して特異的に結合する単クローン性抗 体。
27. ２７．前記のヒトサイトカイン合成抑制因子が、アミノ酸配列【配列があります 】 によって定義される請求項２６に記載の単クローン性抗体。
28. ２８．ヒト合成抑制因子の生物学的活性を阻害することができる請求項２６に記 載の単クローン性抗体。
29. ２９．アミノ酸配列 【配列があります】 によって定義されるヒトサイトカイン合成抑制因子。
30. ３０．６〜３０個のアミノ酸から成り、その配列が式【配列があります】 によって定義される成熟ヒトサイトカイン合成抑制因子のサブ配列（ｓｕｂ−ｓ ｅｑｕｅｎｃｅ）と同一であるペプチド。
31. ３１．前記のサブ配列が、式 【配列があります】 によって定義される前記の成熟ヒトサイトカイン合成抑制因子の一部分において 生じる６〜１２個のアミノ酸から成る請求項３０に記載のペプチド。
32. ３２．アミノ酸配列ＲＤＬＲＤＡによって定義される請求項３１に記載のペプチ ド。
33. ３３．前記のサブ配列が、式 【配列があります】 によって定義される前記の成熟ヒトサイトカイン合成抑制因子の一部分において 生じる６〜１２個のアミノ酸から成る請求項３０に記載のペプチド。
34. ３４．アミノ酸配列ＥＮＱＤＰＤによって定義される請求項３４に記載のペプチ ド。
35. ３５．前記のサブ配列が、式 【配列があります】 によって定義される前記の成熟ヒトサイトカイン合成抑制因子の一部分において 生じる６〜１２個のアミノ酸から成る請求項３０に記載のペプチド。
36. ３６．アミノ酸配列ＥＮＫＳＫＡによって定義される請求項３５に記載のペプチ ド。