CN1317569A

CN1317569A - 制备哺乳动物细胞激动素合成抑制因子的方法

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Publication number: CN1317569A
Application number: CN01112406A
Authority: CN
Inventors: 蒂莫菲·R·莫斯曼; 凯文·W·穆尔; 马塔·W·邦德; 保罗·J·M·比埃拉
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1989-06-28
Filing date: 1990-06-27
Publication date: 2001-10-17
Anticipated expiration: 2005-06-27
Also published as: CN1198642C; DE69033143T2; KR920701437A; HU216310B; DK0567450T3; ES2132068T3; NO915115D0; KR0183035B1; NO915115L; EP0567450B1; CA2062763C; GR3030404T3; FI107926B; HK1008834A1; IL94878A0; NO301718B1; ATE180833T1; HK1040493B; CN1318589C; JPH04502560A

Abstract

本发明提供的细胞激动素合成抑制因子(CSIF)的哺乳动物基因和蛋白质能抑制与延迟型超敏反应有关的细胞激动素的合成，并与拮抗剂一起可用于治疗与细胞激动素不平衡有关的疾病，例如利什曼病和其它寄生虫感染，以及包括产生过量干扰素－γ引起的与MHC有关的自免疫疾病的某些免疫紊乱。

Description

制备哺乳动物细胞激动素合成抑制因子的方法

本申请是申请日为1990年6月27日，申请号为90106678.8，发明名称为“细胞激动素合成抑制因子、其拮抗物及其使用方法”的发明专利申请的分案申请。

本发明一般涉及治疗与免疫系统不平衡、尤其是包括体液和细胞免疫反应不平衡的疾病的方法和组合物。本发明还包括能够调节包含于免疫系统中的某些细胞激动素的合成的蛋白质及其拮抗物，以获得治疗效果。

对抗原的免疫反应可分为以细胞免疫为主的，其实例为迟发型过敏性(DTH)现象，或以体液免疫为主的，其实例为产生抗体。细胞免疫性对于瘤的抑制以及对于从许多病毒、细菌、原虫以及真菌感染中恢复是最重要的。然而，体液免疫反应对从循环中消除毒素和侵入的生物体是最有效的免疫形式。已发现，对不同抗原，这两种反应的一种或另一种经常以相互排斥的状态占优势，还发现某些疾病例如麻风、利什曼原虫病和某些形式的自身免疫的严重性可能起因于一种反应不适当地比另一种反应占优势，参见Mosmann等，Immunol.Today，第8卷，第223-227页(1987)；Mosmann等，Ann.Rev.Immunol.，第7卷，第145-173页(1989)；Parlsh,Transplant.Rev.第13卷，第35-66页(1972)；以及Liew,Immunol.Today，第10卷，第40-45页(1989)。还发现，细胞激动素组分别与DTH反应和体液免疫反应有关，参见Cher等，J.Immounol.，第138卷，第3688-3694页(1987)；以及Mosmann等(1987和1989，如上所引述)，据认为与这些种类的反应有关的疾病是由有关的细胞激动素组的不适当生产引起的。

例如，大量事实表明r干扰素(IFN-r)的过量产生会引起与主要组织相容性复合体(MHC)有关的自身免疫疾病：参见Hooks等，New England J.Med.，第301卷，第5-8页(1979)，(与自身免疫性有关的IFN-r的血清含量提高)Basham等，J.Immunol.，第130卷，第1492-1494页(1983)(IFN-r会增加MHC基因产物的表达；Battazzo等，Lancet，第1115-1119页(11/12/83)(与某些形式的自身免疫性有关的异常MHC基因产物的表达)；Hooks等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，第301卷，第21-32页(1980)(与SLE患者的疾病的较高严重性有关的较高IFN-r含量，干扰素的组胺释放增强的活性可被抗干扰素血清抑制)；以及Iwatani等，J.Clin Endocrin.and Metabol.，第63卷，第695-708页(1986)(抗IFN-r单克隆抗体消除了白细胞凝集素激发的T细胞诱导HLA-DR表达的能力)。假定过量IFN-r引起MHC基因产物的不适当表达，该基因产物本身又引起对组织的自身免疫反应，组织的细胞不适当地表达MHC产物并在该产物的范围内显示自身抗原。

在临床寄生物学领域中最近观察到，IFN-r和IL-2含量是原虫感染即利什曼原虫病的增进和/或消退的重要因素。尤其是，足够含量的IFN-r的存在对活化感染的巨噬细胞以消除细胞内的无鞭毛体看来是必须的，参见Mauel和Behin,Cohen等编辑的Immunology of Parasitic Infections(Blackwell,London,1982)。此外，在疾病的鼠模型中发现，IFN-r的高含量和IL-4的低含量伴随着消退，而IFN-r的低含量和IL-4的高含量伴随着利什曼原虫病的增进，参见Heinzel等，J.Exp.Med.，第169卷，第59-72页(1989)。

由上述可以看出，按照疗法要求，分别获得能把一种免疫反应的优势转移到另一种上去，特别是能抑制或增强IFN-r和/或其它细胞激动素的合成的药剂是有利的。这些药剂特别有助于治疗伴随不适当或不充份免疫反应的疾病，比如组织排斥、利什曼原虫病和其它寄生性疾病，以及MHC伴随的免疫紊乱，包括风湿性关节炎、全身红斑性狼疮(SLE)、重症肌无力、依赖于胰岛素的糖尿病、甲状腺炎等等。

本发明的目的是提供哺乳动物细胞激动素合成抑制因子(CSIF)、CSIF的类似物、CSIF肽、以及CSIF拮抗物。它包括显示CSIF活性的多肽的核酸编码、以及多肽本身、其激动剂的和/或拮抗物的类似物、其制备方法、以及使用它们治疗伴随细胞激动素不平衡的疾病，尤其是导致不适当免疫反应的一类疾病的方法。本发明还包括单独地或作为疫苗助剂使用CSIF或其拮抗物分别有选择地导致细胞免疫反应占优势或体液免疫反应占优势。较好的是，CSIF的拮抗物来源于能够妨碍CSIF生物活性的单克隆抗体。本发明的核酸被以下两点所限定：(1)它们对这里所述的克隆互补DNA(cDNA)序列的同系性，或它们对具有这里所述的克隆互补DNA(cDNA)序列形成可检测的杂种的能力，以及(2)施加于用核酸编码的多肽上的CSIF活性的功能测定。这里涉及蛋白质或多肽的术语“CSIF活性”是指蛋白质或多肽能够抑制或大大降低下述测定中至少一种下述细胞激动素的产量：IFN-r、白细胞介素-2(IL-2)、淋巴细胞毒素、白细胞介素-3(IL-3)、或粒细胞-巨噬细胞群体刺激因子(GM-CSF)。

本发明的较佳实施方案是由下述氨基酸序列定义的开放读码的成年人CSIF：

MHSSALLCCL VLLTGVRASP GQGTQSENSC THFPGNLPNM

LRDLRDAFSR VKTFFQMKDQ LDNLLLKESL LEDFKGYLGC

QALSEMIQFY LEEVMPQAEN QDPDIKAHVN SLGENLKTLR

LRLRRCHRFL PCENKSKAVE QVKNAFNKLQ EKGIYKAMSE

FDIFINYIEA YMTMKIRN，其中L-氨基酸的标准单字母符号(参见下文)从N-末端甲硫氨酸开始由左至右列出：更佳的是，成年人CSIF由下述氨基酸序列定义：

SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMK

DQLDNLLLKE SLLEDFKGYL GCQALSEMIQ FYLEEVMPQA

ENQDPDIKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKA

VEQVKNAFNK LQEKGIYKAM SEFDIFINYI EAYMTMKIRN.

在这些序列中，间隔仅仅是为了方便读者。这里对氨基酸使用标准单字母编码：

A Ala丙氨酸 M Met甲硫氨酸

C Cys半胱氨酸 N Asn天冬酰胺

D Asp天冬氨酸 P Pro脯氨酸

E Glu谷氨酸 Q Gln谷氨酰胺

F Phe苯丙氨酸 R Arg精氨酸

G Gly甘氨酸 S Ser丝氨酸

H His组氨酸 T Thr苏氨酸

I Ile异亮氨酸 V Val缬氨酸

K Lys赖氨酸 W Trp色氨酸

L Leu亮氨酸 Y Tyr酪氨酸

本发明部分地是以能够表达具有CSIF活性的蛋白质的cDNA的发现和无性繁殖为基础。因此，几种被表示为pcD(SRα)-F115(带有小鼠CSIF基因)、以及pH5C和pH15C(每种均带有人CSIF基因)的这样的克隆体已储存在American Type Culture Collection(ATCC),Rockville,MD，登记号分别为68027、68191和68192。

图1表示在几个用不同量CSIF处理的小鼠T细胞克隆中IFN-r合成抑制程度的剂量-反应关系。

图2表示哺乳动物表达载体pH5C和pH15C的主要特征。

图3表示质粒TAC-RBS-hCSIF的RBS-ATG多联接区域。

图4表示pH15C的cDNA插入物的核苷酸序列。

本发明包括pH5C、pH15C、pcD(SRα)-F115的cDNA插入物的最大开放读码的成熟多肽或蛋白质、实际上同源的cDNA及其拮抗物。对于分泌的蛋白质，开放读码通常编码由在其N-末端与信号肽共价连接的成熟的或分泌的产物组成的多肽。信号在成熟的或活性的多肽分泌之前被裂解。裂解位点可以由经验规则，例如Von Heijne,Nucleic Acids Research，第14卷，第4683-4690页(1986)高度精确地估计出，而且信号肽的精确氨基酸组份对其功能而言看来并不严格，例如Randall等，Science，第243卷，第1156-1159页(1989)；Kaiser等，Science，第235卷，第312-317页(1987)。因此，成熟蛋白质可由为信号肽编码的载体很容易地表达，这与被用pH5C、pH15C、以及pcD(SRα)-F115的cDNA插入物所定义的开放读码所编码的非常不同。

Ⅰ．CSIF cDNA的获得和表达

这里的术语“实际上同源”指核苷酸序列能够通过由本发明的cDNA克隆得出的杂交探针而被测定出来。测定为确定CSIF活性编码的核酸所必须的同系性的确切数值取决于如下几个因素：(1)探针与伴随目标核酸的非CSIF编码序列的同系性，(2)杂交条件的严格性，(3)是使用单股探针还是双股探针，(4)是使用RNA探针还是DNA探针，(5)为降低探针的非特定结合所采取的测量法，(6)用于标记探针的方法的性质，(7)在探针中胍和胞嘧啶碱的含量，(8)探针和目标之间的失配的分布，(9)探针的大小，等等。较佳的是，实际上同源的核酸序列至少百分之九十(90％)与本发明的cDNA是同源的。最特别的是，实际上同源的核酸序列是这样的序列，其cDNA使用在实施例中描述的错误正信号不多于几个，例如少于100个的杂交规程，可被由pcD(SRα)-F115、pH5C、pH15C或其同等物的cDNA插入物构成的探针所分离。有大量的文献为选择这些杂交的条件提供了指导，例如：Hames等，Nucleic AcidHybridization:A Practical Approach(IRL Press,Washington,D.C.,1985)；Gray等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第80卷，第5842-5846页(1983)；Kafatos等，Nucleic Acids Research，第7卷，第1541-1552页(1979)； Sambrook等，Molecular.Cloning:A LaboratoryManual，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory,New York,(1989)；以及Beltz等，Meth.in Enzymol.，第100卷，第266-285页(1983)。

这里使用的术语“同系性”是两个核苷酸(或氨基酸)序列之间类似性的变量。同系性可用在两个序列(长度可能不同)被校准后匹配碱(或氨基酸)的份数或百分数来表示。术语“校准”的意义是指在Time Warps,String Edits,and Maoromolecules:Theory and Practice of Sequence Comparison(Addison-Wesley,Reading,MA,(1983)的第一章由Sankoff的Kruskal所定义的。大致地说，两个序列可通过使两个序列之间匹配碱(或氨基酸)的数目达到最大而把最小数目的“空白”或“无效”碱插入任一序列以达到大约最大重叠来校准。对给定的两个序列，可用下述算法计算其同系性，例如Needleham和Wunsch,J.Mol.Biol.,第48卷，第443-453页(1970)；以及Sankoff和Kruskal(如上所述)第23-29页。而且还可以得到进行这些比较的商业服务和软件包，例如Intelligenetics,Inc.(PaloAlto,CA)；以及University of Wisconsin Genetics ComputerGroup(Madison Wisconsin)。

使用带有本发明的cDNA载体的限制性核酸内切酶片段建立探针(使用比如缺口转译的标准技术，例如参见如上引述的sambrook等引文如上)筛选有怀疑生产CSIF的细胞类型的低杂交严紧型基因组或cDNA库(也用标准技术建立)。使用标准筛选程序，例如Grunstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第72卷，第3961-3965页(1975)；或者Benton等，Science，第196卷，第180-183页(1977)或Woo,Methodsin Enzymology，第68卷，第389-396页(1979)。另一方面，基因库可用序列由pcD(SRα)-F115、pH5C和pH15C的cDNA插入物的核苷酸序列所确定的，经标记的低核苷酸探针筛选。这种探针可用商业上可得到的DNA合成器，例如Applied Biosystems 381A型，使用标准技术，例如Gait,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,(IRL Press,Washington D.C.,1984)来合成。在任一情况下，探针至少18-30个碱基长是较好的。探针为至少50-200碱基长更好。也可以使用杂交探针在基因库建立之前筛选CSIF mRNA的候选来源。

可使用很大范围的单细胞和多细胞表达体系(即宿主-表达载体结合物)生产本发明的蛋白质。宿主细胞的可能类型包括，但并不限定于细菌、酵母、昆虫、哺乳动物，等等。有许多评述可以指导具体表达体系的选择和/或修饰，仅举几例，在Kroon编辑的Genes:Structure and Expression(John Wiley & Sons,NewYork,1983)第205-247页中，de Boer和Shepard,"Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression inEscherichia coli"评述了几种E.coli表达体系；Kucherlapati等，Critical Reviews in Biochemistry，第16卷，第4期，第349-379页(1984)以及Banerji等，Genetic Engineering，第5卷，第19-31页(1983)评述了转染和转化哺乳动物细胞的方法；Reznikoff和Gold编辑的Maximizing GeneExpression(Butterworths,Boston,1986)评述了在E.coli，酵母，以及哺乳动物细胞中基因表达的选定课题；以及Thilly,Mammalian Cell Technology(Butterworths,Boston,1986)评述了哺乳动物表达体系。此外，还可得到许多描述连接和/或操作具体cDNA的技术和条件以及表达对照序列以便制造和/或修饰适用于本发明的表达载体的评述，例如Sambrook等(如上引述)。

Riggs在美国专利4431739中公开了一种E.coli表达体系，该文列入本发明的参考文献。对在Ecoli中的高表达特别有用的原核启动子是由Boer在美国专利4551433中公开的tac启动子，该文列入本发明的参考文献。分泌表达载体也可用于E.coli宿主。特别有用的是由Ghrayeb等在EMBOJ。第3卷，第2437-2442页(1984)中公开的pIN-Ⅲ-ompA载体，其中把将被转录的cDNA融合到编码ompA蛋白质信号肽的E.coli OmpA基因的部分中，ompA蛋白质本身又使成熟蛋白质被分泌到细菌的周质空间。关国专利4336336和4338397也公开了对原核生物细胞的分泌表达载体。这些文献也列入本发明的参考文献。

大量细菌菌株都是原核表达载体的合适宿主，包括E.coli菌株，比如W3110(ATCCNO.27325)、JA221、C600、ED767、DH1、LE392、HB101、X1776(ATCC NO.31244)、X2282、RR1(ATCC NO.31343)MRCI；枯草杆菌(Bacillussubtilis)菌株；以及其它肠杆菌科例如鼠伤寒沙门氏菌或粘质沙雷氏菌、以及假单胞菌属的各个种。CurtisⅢ在美国专利4190495中公开了获得用于真核蛋白质表达的衍生细菌菌株，例如E.coli K12X1776的一般方法。把该专利列作本文参考。

除了原核和真核微生物外，也可使用包含由多细胞生物得到的细胞的表达体系以生产本发明的蛋白质。特别有意义的是哺乳动物表达体系，因为其转译后的处理机理更易于生产生物活性的哺乳动物蛋白质。现已使用几种DNA肿瘤病毒作为哺乳动物宿主的载体，包含偶联到细菌复制对照序列上的SV40复制、转录、和/或转译对照序列的大量载体是特别重要的，例如pcD载体，它是由Okayama和Berg培养并公开在Mol.Cell.Biol，第2卷，第161-170页(1982)和Mol.Cell.Biol.，第3卷，第280-289页(1983)上，并由Takebe等改进，参见Mol.Cell.Biol.，第8卷，第466-472页(1988)。这些文献列作本文参考。其它以SV40为基础的哺乳动物表达载体包括那些由Kaufman和Sharp公开在Mol.Cell.Biol.，第2卷，第1304-1319页(1982)上的，以及由Clark等公开在美国专利4675285上的，两篇文献也列作本发明参考。猴细胞通常是上述载体的最佳宿主。含有SV40ori序列和完整A基因的这些载体可以自动地在猴细胞中复制(比非自动复制质粒可得到更高的复制数和/或更稳定的复制数)。而且，含有SV40ori序列而没有完整A基因的载体可在COS7猴细胞中自动地复制达到高的复制数(但不稳定)，参见Gluzman,Cell，第23卷，第175-182页(1981)，并可以由ATCC得到(登记号CRL1651)。上述SV40基载体也能够通过整合到宿主细胞DNA中转化其它哺乳动物细胞，比如小鼠L细胞。

多细胞生物也可用作生产CSIF的宿主，例如昆虫幼虫，见Maeda等，Nature，第315卷，第592-594页(1985)和Ann.Rev.Entomol.，第351-372页(1989)；以及基因转移动物，见Jaenisch,Science，第240卷，第1468-1474页(1988)。

Ⅱ、CSIF的离体测定

CSIF活性是在T辅助细胞总体中在由IFN-r、淋巴毒素、IL-2、IL-3以及GM-CSF组成的组内抑制至少一种细胞激动素合成的性能，该辅助细胞通过暴露在同源抗原表露细胞(APC)和抗原下而被诱导合成一种或多种这些细胞激动素。较佳的是，把APC进行处理使之不能复制，但使其抗原处理机理仍然有效。这可在与T细胞混合之前通过辐照APC，例如用大约1500-3000R(r或X辐射)而容易地实现。

另一方面，细胞激动素的抑制可在混合淋巴细胞初级反应，更好是在混合淋巴细胞次级反应(MLR)时测定，在这种情况下不必使用同源APC.MLR是在本领域中熟知的，例如Bradley在Mishell等编辑的Selected Methods in CellularImmunology(Freeman San Francisco,1980)，第162-166页；以及Battisto等，Meth.in Enzymol.，第150卷，第83-91页(1987)中所述。简言之，把两群异源淋巴样细胞混合，其中一群在混合前已被处理，例如通过辐射处理以避免增殖。较佳的是，在补给性培养基中以浓度大约2×10⁶个细胞/毫升制备细胞群体，例如带有10％胎牛血清的RPMI 1640。对于对比的和试验培养物而言，每群混合0.5毫升用于测定。对于次级MLR，用新制备的受辐射刺激的细胞再次刺激在初始MLR中保留7天之后的细胞。可在混合时把怀疑含有CSIF的样品加到试验培养物中，在混合后1至3天可测定对比的和试验的培养物的细胞激动素的产生。

获得用于CSIF测定的T细胞群和/或APC群可使用本领域熟知的技术，这些技术在DiSabato等编辑的Meth.in Enzymol.，第108卷，(1984)中进行了详尽描述。用于最佳CSIF测定的APC是周边血单核细胞。这些可使用标准技术获得，例如在Boyum,Meth.in Enzymol.，第108卷，第88-102页(1984)；Mage,Meth.in Enzymol.，第108卷，第118-132页(1984)；Litvin等，Meth.in Enzymol.，第108卷，第298-302页(1984)；Stevenson,Meth.in Enzymol.，第108卷，第242-249页(1989)；以及Romain等，Meth.in Enzymol.，第108卷，第148-153页(1984)中所述，以上均作为本文参考。较佳的是，把辅助T细胞用于CSIF测定中，辅助T细胞可通过首先把淋巴细胞与周边血分离，然后使用商业上可得到的抗CD4抗体，例如在美国专利4381295中所述并可从Ortho PharmaceuticalCorp.得到的OKT4，通过随动摄影或流动血细胞计数分选辅助细胞。在Boyum,Scand.J.Clin.Lab.Invest.，第21卷(Suppl.97)，第77页(1968)；Meth.in Enzymol.,第108卷，(如上所述)，以及Bram等，Meth.in Enzymol.，第121卷，第737-748页(1986)中已对必需的技术进行了详尽描述。一般地说，可通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从新鲜血液中获得PBL。

在测定中可使用各种抗原，例如Keyhole钥匙血蓝蛋白(KLH)、鸡r-球蛋白等。更佳的是，在测定中用抗CD3单克隆抗体代替抗原，用例如在美国专利4361549中公开的OKT3刺激辅助T细胞。

用标准生物和/或免疫化学分析测定对比的和试验样品中的细胞激动素浓度。当可以得到经纯化的细胞激动素时，对特定细胞激动素的免疫化学分析测定的设计是本领域所熟知的，例如Campbell,Monoclonal Antibody Technology(Elsevier,Amsterdam,1984)；Tijssen,Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier,Amsterdam,1985)；以及美国专利4486530是本课题大量文献中的典型例子。人IL-2、人IL-3、以及人GM-CSF的ELISA试剂盒可以从Genzyme Corp.(Boston,MA)买到；人IFN-r的ELISA试剂盒可以从Endogen,Inc.(Boston,MA)买到。对人淋巴细胞毒素有特异性的多克隆抗体可从Genzyme Corp.得到，它可用于人淋巴细胞毒素的放射免疫测定中，例如Chard,An Introduction to Radioimmumnoassayand Related Techniques(Elsevier,Amsterdam 1982)。

上面所列的细胞激动素的生物测定也可用于确定CSIF的活性。人淋巴细胞毒素的生物测定已公开于Aggarwal,Meth.inEnzymol.，第116卷，第441-447页(1985)，以及Matthews等在Clemens等编辑的Lymphokines and Interferons:A Practical Approach(IRL Press,Washington,D.C.,1987)的第221-225页。人IL-2和GM-CSF可用从ATCC得到的登记号分别为TIB214和CCL246的依赖于细胞系因子的CTLL-2和KG-1测定。人IL-3可用其在软琼脂培养物中刺激大范围造血细胞菌落形成的能力来测定，例如Metcalf,The Hemopoietic Colony Stimulating Factors(Elsevier,Amsterdam,1984)中所述。INF-r可用抗病毒测定来定量，例如Meager在Clemens等编辑(如上所述)的第129-147页所述。

细胞激动素的生产也可用mRNA分析测定。细胞激动素mRNA可用胞质点杂交测量，比如White等，J.Biol.Chem.,第257卷，第8569-8572页(1982)以及Gillespie等，美国专利4483920所述。这些文献作为本文参考。其它方法包括用纯化的RNA的点印法，例如Hames等编辑的NucleicAcid Hybridization A Practical Approach(IRL Press,Washington,D.C.,1985)，第6章。一般地说，胞质点杂交包括把mRNA从细胞或组织样品中固着在固相载体例如硝化纤维上，把DNA探针杂交到固定的mRNA上，以及除去非特定地结合到固相载体上的探针序列或与mRNA形成错配的杂种，从而只保留与目标mRNA形成基本上完全杂种的探针序列。留下的DNA探针的量是固定到固相载体上的目标mRNA的数目的度量。留下的DNA探针的量可通过其标记物产生的信号来测定。已有几种标准技术可标记单股和双股的核酸片段。它们包括引入放射性标记物，例如Harper等，Chromosoma第83卷，第431-439页(1984)；直接附着萤光标记物，例如Smith等，NucleicAcids Research，第13卷，第2399-2412页(1985)，和Connolly等，Nucleic Acids Research，第13卷，第4485-4502页(1985)；以及对核酸片段的各种化学修饰能使它们通过免疫化学方法或其它亲和反应方法测定出来，例如Tchen等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第81卷，第3466-3470页(1984)；Richardson等，Nucleic Acids Research，第11卷，第6167-6184页(1983)；Langer等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第78卷，第6633-6637页(1981)；Brigati等，Virology，第126卷，第32-50页(1983)；Broker等，Nucleic Acids Research，第5卷，第363-384页(1978)；以及Bayer等，Methods of BiochemicalAnalysis，第26卷，第1-45页(1980)。

较佳的是，为了杂交，通过下面的描述把来自T细胞的mRNA粘附到探针上。把分离的T细胞经在4℃，以最终浓度1×10⁸个细胞/毫升悬浮在溶胞缓冲液(0.14M NaCl,1.5mM MgCl₂,10mM Tris-HClPH8.6,0.5％Nonidet P-40(一种非离子洗涤剂，例如由Sigma得到的))中而溶解。把悬浮液涡漩10秒种并且细胞核成团(13000克，2.5分钟)。然后把所得胞质溶解产物转移到无菌的含有0.3体积20×SSC(1×SSC=0.15M NaCl,0.015M柠檬酸三钠(标准柠檬酸盐))和0.2体积37％(重量/重量)甲醛的1.5毫升试管中。然后把混合物在60℃培育15分钟并以等分试样贮存在-70℃。为进行分析，把每个样品15毫升经在15×SSC中连续三倍稀释到0.1毫升96-凹陷式平底微量滴定盘(Falcon,BectonDickinson,Oxnard,CA)中滴定。每次稀释使用96同步Minifold设备(Schleicher and Shuell)吸到支持在滤纸(Whatman3mm Chr,Whatman Inc.,Clifton,NJ)上的一片Nytran(一种可由Schleicher and Schuell,Keene NH得到的改进的尼龙支持物；0.45毫米孔径)上。然后把Nytran纸烘干(80,2小时)，并用含有50％甲酰胺(BRL,Gaitherburg,MD)6XSSC、50毫克/毫升E.coli tRNA(Sigma)、以及菲可尔液(ficoll)(分子量=400000)、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清清蛋白(BSA)各0.2％(重量/体积)的预杂交溶液处理。把探针施于Nytran载体上，浓度为大约50毫微克探针/毫升预杂交溶液。杂交之后，把载体于室温下在2×SSC中洗涤两次，每次15分钟，然后在2×SSC/0.5％SDS中在60℃洗涤两次，每次30分钟。然后使用增强屏将载体暴露于胶片上，并使用激光光密度计(例如Ultroscan XL,LKB Instruments Inc.,Gaitherburg,MD)扫描测定其数量。如果胞质点杂交缺少足够的灵敏性，较佳的是在印迹之前首先从PBL中提取RNA。例如可使用Chirgwin等在Biochemistry，第18卷，第5294-5299页(1979)公开的硫氰酸胍法提取RNA。

在有些情况下，必须把欲测定CSIF活性的样品预处理以去除会干扰测定的预先确定的细胞激动素。例如，IL-2增加了某些细胞中IFN-r的生产。因此由于在测定中使用辅助T细胞，必须把IL-2从被测定样品中除去。这种去除可使样品通过标准抗细胞激动素的亲和柱而很容易地完成。

Ⅲ、CSIF特异性单克隆抗体和拮抗物

较佳的是，本发明的拮抗物来源于人CSIF特异性抗体。更佳的是，本发明的拮抗物含有人CSIF特异性片段或结合组合物。抗体含有由二硫化物桥连接在一起的多肽链的组合。被称为轻链和重链的两种主要多肽链组成了抗体的全部主要结构类型(同型抗原)重链和轻链均被进一步分为称为变化区和恒定区的亚区。重链包含一个变化区和三个不同的恒定区。而轻链包含一个变化区(不同于重链的变化区)和一个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的变化区对于抗体的结合特异性是可反应的。

这里术语“重链变化区”是指一种多肽，(1)其长度为110至125氨基酸，以及(2)其氨基酸序列与本发明的单克隆抗体的重链的氨基酸序列一致并从重链的N末端氨基酸开始。同样，术语“轻链变化区”是指一种多肽，(1)其长度为95至115氨基酸，以及(2)其氨基酸序列与本发明的单克隆抗体的轻链的氨基酸序列一致并从轻链的N末端氨基酸开始。

这里术语“单克隆抗体”是指能够特定地结合到人CSIF上的免疫球蛋白的均匀群体。

这里术语“结合组合物”是指含有两个多肽链的组合物，该多肽链(1)当操作上联系时，呈现对人CSIF具有高的结合亲和力的构象，以及(2)来自于产生人CSIF特异性单克隆抗体的杂种瘤。术语“操作上联系”是指两个多肽链通过各种方式使得对结合来说放置得彼此相关，包括通过在天然抗体片段中相结合的方式，比如Fab或Fv，或者通过在羧基末端经遗传工程设计的含半胱氨酸多肽衔接物的方式。一般地，两个多肽链与人CSIF特异性单克隆抗体的轻链变化区和重链变化区相一致。较佳的是，本发明的拮抗物来自于人CSIF异性的单克隆抗体。通过在标准CSIF生物测定法中抑制CSIF诱导作用，例如抑制IFN-r合成能力选择能够阻断或中和CSIF的单克隆抗体。

本发明的杂种瘤可用熟知的技术生产。通常，该方法包括把不灭细胞系与产生所要求抗体的B-淋巴细胞融合。另一方面，为生产产生不灭抗体的细胞系的非融合技术则是可能的，并包含于本发明的范围内，例如病毒诱导的转化：Casali等，"Human Monoclonalsfrom Antigen-Specific Selection of B Lymphocytes andTransformation by EBV",Science，第234，第476-479页(1986)。不灭细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛、以及人的骨髓瘤细胞，最通常的是由于方便和容易得到而使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。从注射有目标抗原的哺乳动物中获得适当淋巴细胞的技术是熟知的，一般地，当需要人细胞时，使用周边血淋巴细胞(PBL)，或者当需要非人哺乳动物时使用脾脏细胞或淋巴节细胞。对宿主哺乳动物以重复剂量注射纯化过的抗原，并先使哺乳动物生产所需要的产生抗体的细胞，然后收获这些细胞以用于与不灭细胞系融合。融合技术也是本领域所熟知的，一般包括把细胞与融合剂比如聚乙二醇混合。用标准方法比如HAT选择法选择杂种瘤。从这些杂种瘤中，经用标准免疫测定，比如Western印迹、ELISA、RIA、CSIF中和能力等等，测定其培养基来选择分泌要求的抗体，即人CSIF特异性抗体的杂种瘤。可使用标准蛋白质纯化技术，比如Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier，Amsterdam,1985)，从培养基中回收抗体。现有许多文献可指导使用上述任何技术，例如Kohler等，HybridomaTechniques(Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1980)；Tijssen,Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier,Amsterdam,1985)；Campbell,MonoclonalAntibody Technology(Elsevier,Amsterdam,1984)；Hurrell,Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications(CRC Press,Boca Raton,FL,1982)；等等。然后使用上述CSIF测定法对生产人CSIF特异性单克隆抗体的杂种瘤进行第二次筛选，以便选择能阻断或中和CSIF生物活性的杂种瘤。

抗体片段的使用和生产也是公知的，例如Fab片段：Tijssen,Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier,Amsterdam,1985)；和Fv片段：Hochman等，Biochemistry,第12卷，第1130-1135页(1973),Sharon等，Biochemistry，第15卷，第1591-1594页(1976)以及Ehrlich等，美国专利4355023；以及抗体半分子：Auditore-Hargreaves，美国专利4470925。

也可以采用重组体方法生产本发明的杂种瘤所特有的抗体和抗体片段，即提取信使RNA、建立CDNA库、并选择编码抗体分子片段的克隆，例如Wall等，Nucleic Acids Research,第5卷，第3113-3128页(1978)；Zakut等，Nucleic Acids Research，第8卷，第3591-3601页(1980)；Cabilly等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第81卷，第3273-3277页(1984)；Boss等，Nucleic AcidsResearch，第12卷，第3791-3806页(1984)；Amster等，Nucleic Acids Research，第8卷，第2055-2065页(1980)；Moore等，美国专利4642334；Skerra等，Science，第240卷，第1038-1041页(1988)；以及Huse等，Science，第246卷，第1275-1281页(1989)。特别是，可使用这些技术生产种间单克隆抗体抗体，其中一个物种的结合区与另一物种的抗体的非结合区结合以降低免疫原性，例如Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第84卷，和3439-3443页(1987)。

Ⅳ、提纯和药物组合物

当以溶解形式表达本发明的多肽时，例如作为转化酵母或哺乳动物细胞的分泌产物，可以按照本领域的标准程序把它们提纯，包括硫酸铵沉淀、离子交换色谱法、凝胶过滤法、电泳、亲和色谱法和/或等等步骤，例如“Enzymt Purification and RelatedTechniques,”Methods in Enzymology,22:233-577(1977)，以及Scopes,R.,Protein Purification:Principlesand Practice(Springer-Verlag,Nev York,1982)为这些提纯提供了指导。另外，当以非溶解形式表达本发明的多肽时，例如作为凝集体、包涵体等等，可以按照本领域的标准程序将它们提纯，包括用离心法把包涵体与破裂的宿主细胞分离，用离液序列高的试剂和还原剂溶解包涵体、稀释溶解的混合物、和降低离液序列高的试剂和还原剂的浓度以便使多肽呈生物活性构象。后者的程序公开于下述文献中，也系本文参考文献：Winkler等，Biochemistry,25:4041-4045(1986)；Winkler等，Biotechnology,3:992-998(1985)；Koths等，美国专利4569790；以及欧州专利申请86306917.5和86306353.3。

这里“有效量”是指足以改进自身免疫病理状况的症状的量。对具体患者的有效量取决于被处理的自身免疫病理状况的状态、患者的综合健康状况、给药方法、副作用的严重性等因素而可以改变。一般地，CSIF以含有有效量的CSIF和药物载体的药物组合物形式给药。药物载体可以是任何适合于把本发明的组合物传递给患者的可配伍的无毒物质。一般地说，这些药物中用于胃肠外给药的组合物是熟知的，例如Remington′s Pharmaceutical Science，第15版，(Mack Publishing Company,Easton,PA1980)。另一方面，本发明的组合物也可用可植入的或可注射的药物传递体系引入患者体内，例如Urquhart等，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，第24卷，第199-236页(1984)；Lewis编辑，Contrclled Release of Pesticides and Pharmaceuticals(Plenum Press,New York,1981)；美国专利3773919；美国专利3270960；等等。

当胃肠外给药时，将CSIF配制成体随药物载体的单元剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳状液)。这些载体的实例是生理盐水、Ringer溶液、葡萄糖溶液、以及Hank溶液。也可以使用菲水载体比如固定油和油酸乙酯。较佳载体是5％葡萄糖/盐水。载体可含有少量添加剂，比如增强等渗性和化学稳定性的物质，例如缓冲剂和防护剂。较佳的是，CSIF以基本上无聚集团和其它蛋白质的纯态配制成浓度范围大药为5至20微克/毫升。另外较佳的是，CSIF用连续注入方式给药，使得每日提供量的范围大约为50-800微克(即大约1-16微克/千克/日)。每日注入率则根据监测副作用和血细胞计数而改变。

CSIF可由被带有CSIF基因的表达载体所暂转染或稳定转化的哺乳动物细胞的培养物上清液中提纯。较佳的是，CSIF由被pcD表达载体所暂转染的COS7细胞的培养物上清液中提纯。用pcD转染COS7细胞按如下方法进行：在转染前一天，把大约10⁶ COS7猴细胞在含有10％胎牛血清和2mM谷氨酰的Dulbecco改进的Eagle培养基(DME)中接种到单个100毫升培养皿内。为实现转染把培养基从每个培养皿中抽出并用4ml含有50mM tris-HCl pH7、4、400毫克/毫升DEAE-Dextran和50微克质粒DNA的DME代替。把培养皿在37℃培育4小时，然后除去含DNA的培养基，并用5ml无血清DME洗涤两次。把DME加回到培养皿中，然后将培养皿再在37℃培育3小时。把培养皿用DME洗涤一次，之后以标准浓度加入含有4％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、毒霉素(100U/L)和链霉素(100微克/升)的DME。然后将细胞在37℃培育72小时，然后为提纯CSIF收集生长培养基。另外，转染可经过实施例中所述的电穿孔实现。用于转染的质粒DNA可通过生长由Casadaban和Cohen,J.Mol.Biol.，第138卷，第179-207页(1980)所描述的在E.ColiMC1061或类似生物中含有CSIF cDNA插入物的pcD(SRα)来实现。用标准技术从培养物中分离质粒DNA，例如Maniatis等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory, New York,1982)。

当本发明的拮抗物来自抗体时，它们一般是胃肠外给药，较佳是静脉内给药。由于这种蛋白质或肽拮抗物可以是免疫性的，所以它们最好是或者通过常规Ⅳ给药装置，或者由皮下储存方式缓慢给药，例如Tomasi等在美国专利4732863中所述。如上所述，当胃肠外给药时，把抗体和/或片断配制成与如上所述药物载体相结合的单元剂量可注射形式。抗体较佳是以基本上无聚集物、其它蛋白质、内毒素等等的纯态配制成浓度大约为5至30毫克/毫升，更佳是10至20毫克/毫升。较佳的是，内毒素的含量小于2.5EU/毫升。

拮抗物给药制度的选择取决于几个因素，包括拮抗物的血清转换率、伴随被治疗的病况的CSIF的血清含量、拮抗物的免疫性、靶CSIF的可及性(例如如果要阻塞非血清CSIF时)、CSIF对其受体-CSIF对拮抗物的相对亲合性、等等。较佳的是，按照可接受的副作用的程度，给药制度使传递给病人的拮抗物的量达最大。因此，所传递的拮抗物的量部分地取决于特定拮抗物和被治疗的病理状况的严重性。选择合适剂量的说明可在有关抗体治疗用途的文献中找到，例如Bach等在Ferrone等编辑的Handbook of Monoclonal Antibodies(Noges Publication,ParkRidge,NJ,1985)的第22章；在Haber等编辑的Antibodiesin Human Diagnosis and Therapy(Raven Press,New York,1977)中，Russell，第303-357页，以及Smith等，第365-389页。较佳的是，一当拮抗物包含单克隆抗体或其Fab校准的片段(包括结合组合物)，剂量的范围为每日大约1-20毫克/千克。更佳的是，剂量范围为每日大约1-10毫克/千克。

Ⅴ、遗传工程突变体CSIF

一旦可以得到一种天然蛋白质的核酸序列和/或氨基酸序列的信息，那么就可得到实质上按天然序列有效产生任何突变的各种技术，例如Shortle,Science，第229卷，第1193-1201页(1985)； Zoller和Smith,Methods in Enzymology，第100卷，第468-500页(1983)；Mark等，美国专利4518584；Wells等，Gene，第34卷，第315-323页(1985)； Estell等，Science，第233卷，第659-663页(1986)；Mullenbach等，J.Biol.Chem.，第261卷，第719-722页(1986)，以及Feretti等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第83卷，第597-603页(1986)。这些文献作为本文参考。

在许多情况下需要天然多肽的突变蛋白质。例如用某些突变蛋白质可降低不希望的副作用，特别是当副作用活性和与希望的活性的多肽部分不同的多肽部分相联系时。在某些表达体系中，天然多肽可能对蛋白酶降解是敏感的。在这些情况下，所选择的能改变敏感序列的氨基酸的替代和/或取代会大大增加产率。例如英国专利申请2173804-A，其中在人组织血纤维蛋白溶酶原激体的275位处的Arg被Gly或Glu取代。突变蛋白质也可在提纯程序中增加产率和/或通过消除易于氧化、酰化、烷基化、或其它化学修饰的氨基酸而延长蛋白质的贮存期限。例如，甲硫氨酸容易受到氧化而形成亚砜，在许多蛋白质中它伴随着生物活性的损失，例如Brot和Weissbach,Arch.Biochem.Biophys.，第223卷，第271页(1983)。甲硫氨酸经常被惰性更大的氨基酸替代而很少损失或不损失生物活性，例如澳大利亚专利申请AU-A-52451/86。在细菌表达体系中，通过消除或替代构象上不重要的半胱氨酸残基有时可增加产率，例如Mark等，美国专利4518584。

较佳的是使用基因盒诱变生产突变体蛋白质。合成基因用沿着基因几乎均匀分布的核酸内切限制酶序列的位点构建；即使当基因插入到适当的载体中时也应选择这些核酸内切限制酶位点使保持单一性。单一的核酸内切限制酶位点使得基因的节片被容易地切去，并用为希望的突变编码的合成寡核苷酸(即“基因盒”)替代。确定单一限制位点的数目和分布必须考虑几个因素，包括(1)先于在表达中使用的载体的限制位点，(2)是希望使用种特异还是属特异的密码子，(3)可得到的不同的非载体切割核酸内切限制酶的数目(以及它们在合成基因内的多重性)，以及(4)在各单一限制位点间各节片的合成和/或排序的方便和可靠性。

上述技术是一种按天然蛋白质序列实现保守氨基酸替代等的方便的方法。这里“保守”是指(ⅰ)变更在构象上尽可能是中性的，即目的是与天然蛋白质相比在突变体多肽的三级结构上产生最小的变化，以及(ⅱ)变更在抗原上尽可能是中性的，即目的是与天然蛋白质相比在突变体多肽的抗原定子中产生最小的变化。为保持生物活性需要构象中性，而为避免在用本发明的化合物治疗的病人或动物中引起免疫反应则需要抗原中性。虽然难于绝对可靠地挑选哪一个可供选择的对象是在构象上和抗原上将是中性的，但存在着一些可以指导本技术领域中的善通技术人员高儿率地制造出在构象上和抗原上为中性的变体的法则，(如Anfisen(上面引证的)；Berzofsky,Science,Vol.229,pgs.932-940(1985)，和Bowie et al,Science.Vol.247,pgs.1306-1310(1990))。一些较重要的法则包括：(1)置换疏水残基不太可能产生抗原性的变化，因为这些残基可能位于蛋白质的内部(如Berzofsky(上面引证的)和Bowie etal(上面引证的)；(2)生理化学上相似的，即同义的残基的置换也较少可能地产生构象上的改变，因为进行取代的氨基酸可以起到与被取代的氨基酸相同的结构上的作用；(3)保守的进化序列的变更可能产生有害的构象上的作用，因为进化的保守性意味着这些序列在功能上是重要的。除了这种用于选择突变蛋白质序列的基本法则之外，检测可确定生物的活性及设计的分子的构象。对本发明的多肽的生物检测在前面已作了较充分的描述。构象的变更至少可用两个熟知的测定法来进行检测：微补偿固定法(如Wassermanet al.,J.Immunol.,Vol.87,pgs.290-295(1961),或Levine et al.Methods in Enzymology,Vol.11.pgs.928-936(1967))，该法被广泛地用于蛋白质三结构进化研究；和对一组构象特殊的单克隆抗体的亲和性(如Lewis et al.,Biochemistry,Vol.22,pgs.948-954(1983)。

Ⅵ、人CSIF肽抗体

本发明包括由人CSIF衍生的肽，和含有载体和本发明的肽之间的接合体的免疫原。本文所用的术语“免疫原”指的是能引起免疫反应的物质。本文所用的术语“载体”，指的是当其化学地接合到本发明的肽上时，可使因该接合而得以免疫的受体生物体产生专对该接合肽的抗体的任何物质。载体包括红血细胞、噬菌体、蛋白质和诸如琼脂糖珠之类的合成粒子。载体最好是蛋白质，如血清清白白，r-球蛋白，锁孔戚形血兰蛋白、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、血纤维蛋白或其同类物。

本发明的肽用常规技术(如Stewart and Young,Solid PhasePeptide Sythesis,2nd Ed.(Pierce Chemical Company,Rockford.1L.1984))合成。最好使用市售的肽合成器(如model 430A of Applied Biosystems,Inc.(Foster City.CA))。本发明的肽是通过将在交联的聚苯乙烯载体上的固相合成物集合而成的，集合自羧基末端残基开始，然后逐步添加氨基酸，直到形成完整的肽。下列文献是对在合成期间所用的化学知识的指导：Merrified.J.Amer.Chem.Soc.,Vol.85.pg.2149(1963)；Kentet al.,pg 185.in Peptides 1984,Ragnarsson.Ed.(Almquist and Weksell.Stockholm,1984)；Kent et al.,pg.217 in Peptide Chemistry 84,Izumiya,Ed(ProteinResearch Foundation,B.H.Osaka,1985)；Merrifield,Science,Vol.232,pgs.341-347(1986)；Kent,Ann Rev.Biochem.,Vol.57,pgs.957-989(1988)，而参考文献引证在最后两篇文献中。

在固态合成中，最重要的是消除合成副产物，这主要是终止，缺失或修饰肽。大多数副反应可以通过使用纯净的，性能良好的树脂、纯净的氨基酸衍生物、纯净的溶剂，及通过选择合适的偶联和分裂方法及反应条件而被消除或减至最小(如Barany andMerrifield.The Peptides,Cross and Meienhofer.Eds.,Vol.2,pgs 1-284(Academic Press New York,1979)。重要的是监测偶联反应以确定它们是否进行至完成，从而避免缺一个或多个残基的缺失肽。定量茚三酮反应对此目的是有用的(见Sarin et al.Anal.Biochem,Vol,117.pg 147(1981))。使用带有对链组合条件稳定，而对强酸不稳定的合适的支链保护基团的Na-t-丁氧羰基(t-Boc)-氨基酸。被保护的肽链组合后，除去保护基，然后在有硫酯清除剂存在的条件下，通过使用浓度先低后高的无水氟化氢使肽结合键裂开(见Tam et al.J.Amer.Chem.Soc.,Vol.105.pg.6442(1983))，可被采用的适宜的支链保护基团用所讨论的氨基酸的三个缩写字母及括号中的保护基表示：Asp(OBzL).Glu(OBzL).Set(BzL).Thr(BzL).Lys(Cl-Z).Tyr(Br-Z).Arg(NGT os).Cys(4-MeBzl).以及His(ImDNP).(Bzl=苄基；Tos=甲苯磺基氧；DNP=二硝基苯基；Im=咪唑。Z=苄氧基羰基)。剩下的氨基酸没有支链保护基。每次将(t-Boc Na)-保护的肽-树脂暴露于65％的三氟乙酸(得自Eastman Kodak)(使用前蒸馏)的二氯甲烷(DCM),(Mallenckrodt)溶液中：先暴露1分钟，然后暴露13分钟，以排除Na-保护基团。在DCM中洗涤该肽-树脂，再用10％的二异丙基乙胺(DIEA)(Aldrich)的二甲基甲酰胺(DMF)(Applied Biosystems)溶液中和两次，每次1分钟。通过用DMF洗涤接着进行中和。用DMF中的氨基酸的对称酐进行偶联16分钟。在合成器中通过将2mmol的氨基酸溶于6ml的DCM中，然后加入在2ml DCM中的1mol的二环己基碳化二亚胺(Aldrich)而制成该对称酐。5分钟后，将活化的氨基酸移到一个单独的容器中，并用连续的氮气流吹扫将DCM蒸发掉。在吹扫的各阶段，用DMF(共6ml)取代DCM，首次偶联后，用DCM,10％的DIEA的DCM溶液，再用DCM洗涤该肽-树脂。为了再偶联，将同样的氨基酸和活化剂，二环己基碳化二亚胺顺次地移到该反应容器中。在原地活化和偶联10分钟后，添加足量的DMF，结果制成50％的DMF-DCM混合物，然后使该偶联持续15分钟。精氨酸以一种羟基苯并三唑(Aldrich)的酯的形式在DMF中被偶联60分钟，然后在同样的条件下，作为其它的氨基酸的形式被再偶联。天冬酰胺和谷酰胺，作为羟基苯并三唑的酯，在DMF中被偶联两次，每次40分钟。所有的残基而言，在第二次偶联后，该树脂都要冲洗，为用定量茚三酮反应(Sarin et al(前面已引证)监测残留的未偶联的α-胺，自动地取出一个样品。

将合成肽连接到载体上的通用技术已在几篇文献中讲到，如，Walter and Doolittle,"Antibodies Against SyntheticPepti des",in Setlow et al.eds.,Genetic Engineering,Vol.5,pgs.61-91(Plenum Press,N.Y.,1983)；Green et al.Cell,Vol.28,pgs,477-487(1982)；Lerner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.78,pgs.3403-3 407(1981)；Shimizu et al.,U.S.Patent4,474,754；及Ganfield et al.,U.S.Patent 4,311,639。相应地这些文献经引证已被接合入本之中。将半抗原连接于载体所用的技术基本上与上述所引证的技术相同(如Chapter 20 in Tij-sseu′s Practice and theory of Enzyme Immunoassays Elsevier.New York,1985))。将肽与载体连接的四种最通用的系统是：(1)用于氨基偶联的戊二醛(如于Kagan and Glick.in Jaffeand Behrman,eds.Methods of Hormone Radioimmunoassay.pgs.328-329(Academic Press.N.Y.1979)和Walter etal.Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.77,pgs 5197-5200(1980)中所公开的)；(2)用于羰基与氨基偶联的水溶碳化二亚胺(由Hoare等公开于J.Biol.Chem.,Vol.242,pgs:2447-2453(1967)；(3)用于酪氨酸与酪氨酸支链偶联的双一偶氮联苯胺(DBD)，(如公开于Bassiriet al.,pgs.46-47,in Jaffe and Behrman,eds(前已引证)和Walter et al(前已引证)；(4)用于半胱氨酸(或其它的硫氢基)与氨基偶联的马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)(如公开于Kitagawa et al.,J.Biochem(TOKYO)Vol,79,pgs.233-239(1976)，和Lerner et al(前已引证)。选择一种将给定的肽偶联到蛋白质载体上的合适的方法的通用法则可表述如下：包含在连接物中的基团只应在该序列中出现一次，最好是出现在该片段的适宜的端部。例如，如果一个酪氨酸残基出现在一个序列(该序列是因其潜在的抗原特性而被挑选的)的主要部分，则不应使用BDB。类似地，位于中心的赖氨酸不容于戊二醛法，而且天冬氨酸和谷氨酸的存在也经常排斥碳化二亚胺法。另一方面，可将合适的残基置于作为连接位点的，经选择的序列的片段的任一端，而不论它们是否出现在“天然”蛋白质序列之中。与氨基和羧基的终端不同的内片段，将在“末连接端”处与在天然蛋白质中发现的同样的序列显著地不同，在该天然蛋白质中，多肽的主链是连续的。这个问题在一定程度上可通过将α-氨基乙酰化，然后借助于羧基末端与肽连接而得以补救。与载体蛋白质偶联的效率，可通过使用放射性示踪肽而方便地得以测定，而该放射性示踪肽既可通过使用合成过程中的一个阶段中的一种放射性氨基酸来制备，也可通过使由于酪氨酸残基碘化而完成的肽示踪来制备。如果愿意，在肽中的酪氨酸的存在还可使人们建立起一种灵敏的放射性免疫检测法。因此，如果酪氨酸不是被天然多肽限定的肽序列的部分，则它就可以作为终端残基而引入。

优选的载体是蛋白质，而较好的蛋白质载体包括：牛血清清蛋白、肌球蛋白、卵清蛋白(OVA)，锁孔戚形血兰蛋白(KLH)及其类似物。通过半胱氨酸，靠MBS可将肽连接到KLH上(如公开于Liu et al.,Biochemistry,Vol.18,pgs.690-697(1979)中)。将这种肽溶于磷酸盐缓冲盐水(pH7.5)0.1M的硼酸钠缓冲液(pH9.0)或1.0M的乙酸钠缓冲液(pH4.0)。选择溶解肽的pH值，以得到最佳的肽溶解度。可溶肽的游离半胱氨酸的含量用Ellman的方法确定(见Ellman,Arch.Biochem.Biophy.,Vol.82,pg7077(1959))。对于每种肽而言，都是将在0.25ml的10mM的磷酸钠缓冲液(pH7.2)中的4mg KLH与0.7mg的MBS(溶于二甲基甲酰胺中)进行反应，并在室温下搅动30分钟。滴加MBS以确保甲酰胺的局部浓度不致太高，因为KLH在＞30％的甲酰胺中是不溶的。然后使反应产物KLH-MBS通过由50mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G-25，以除去游离的MBS。从该柱的洗脱物的峰值馏分(由OD280监测)中回收的KLH的回收率估计约为80％。然后将KLH-MBS与溶于1ml的所选的缓冲液中的25的5mg肽反应。将pH值调到7-7.5，在室温下将反应物搅动3小时。通过结合物样品对磷酸盐缓冲盐水的透析，用放射性肽来监测偶联效果，其范围为8-60％。一旦获得了肽-载体的结合体，就可用常规技术生产出多克隆或单克隆抗体(如公开于Campbell,Monoclonal Antibody Technology(Elsevier,New York,1984)；Hurrell,ed.Monoclonal HybridomaAntibodies:Techniques and Applications(CRC Press,BocaRaton,FL,1982)；Schreier et al.Hybridoma Techniques(Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1980),U.S.Patent 4,562,003；或类似文献)。其中特别将U.S.Patent4,562,003经引证而结合入本文中。

多克隆和单克隆抗体均可用ELISA筛选。如其它的固相免疫测定一样，本试验也是以大分子非特定地吸附于塑料的倾向为基础的。这种反应的不可逆性，不损失免疫活性，使抗原-抗体复合体得以通过将其从未结合的原料中简单地分离出来而形成。为滴定抗肽血清，将结合在载体(该载体与用于免疫的载体不同)上的肽吸取到96井的滴定皿的井中。然后使被吸取的抗原在池中与稀释的抗肽血清反应。将未结合的抗体洗去，使剩下的抗原-抗体复合体与专用于经免疫的动物的IgG抗体反应。将该二次抗体与一种酶，例如碱性磷酸酶结合。在添加酶底物时而产生的可见的有色反应产物示出哪一个井已接上了抗肽抗体。使用分光光度计读数可更好地给已接上专用的肽抗体的量进行定量。高滴定抗血清产生一条在10^-3-10^-5稀释度之间的线性滴定曲线。

实施例

下列实施例用于说明本发明。所选择的载体和宿主以及试剂的浓度、温度及其它变量的值仅用作本发明的例证，而不被视为本发明的限制。实施例1 小鼠CSIF的生物活性

通过将T细胞克隆(5×10⁶)个细胞/ml)在无血清培养基(缺酚红和含0.05m M2-巯基乙醇及20m MHEPES的RPMI1640)和伴刀豆球蛋白A5ug/ml中培养24小时而获得含小鼠CSIF的得自若干T细胞克隆的上清液。该克隆包括细胞系，D9(述于U.S.Patent 4,613,459),D10(述于下面)，MB2-1(述于Mosmann et al.J.Immunol.,Vol.136,pgs 2348-2357(1986),CDC25和CDC35(述于Tony et al.J.Exp.Med.,Vol.161,pg.223(1985)及M411-2和M411-6。测定该T细胞上清液在细胞系HDK-1中抑制IFN-r合成物的能力(如在Cherwinski,et al,Exp.Med.,Vol.166,pgs.1229-1244(1987)中所述)。在96井的平底微滴定浅盘中制备一系列二倍稀释度的取自每种T细胞克隆的样品稀释液，其体积为0.05ml。将HDK-1细胞(5×10⁴个细胞/井)随经辐照的(2500R)同源的APC(5×10⁵细胞/井的脾细胞)和抗原(锁孔戚形血兰蛋白，150μg/ml)一起加入到0.15ml的容积中。将11B11抗-IL-4抗体(10μg/ml)(如在Ohara et.al.Nature,Vol.315,pgs.333-336(1985)中所述)加到估计含IL-4的样品中。于37℃培养24小时后，收集上清液，并在4℃保存不到一周的时间，或在80℃保存更长时间。通过使用一种大鼠的抗鼠IFN-r单克隆抗体，XMG1.2，和亲合性-提纯的免的抗-鼠IFN-r抗体的两位点多层结构的ELISA测定IFN-r的含量。图1示出了以对照物含量百分数表示的IFN-r合成的抑制程度。

将由D10细胞产生的CSIF部分地提纯，并施用到两种不同的T细胞克隆上，以检查作为CSIF浓度的函数的细胞激动素合成的抑制程度。制备部分地提纯的CSIF的方法如下：用Amicon YM-5膜(Amicon Corp.Danvers,MA)将1-2.5L儿批伴刀豆球蛋白A-诱发的D10上清液浓缩约10倍，再通过一个5ml的与甘露糖接合的琼脂糖柱(E-YLaboratories.SanMateo.CA)然后再浓缩3-5倍，即总的浓度为原来的30-50倍。然后用高性能的液体色谱法分两步进一步地提纯该原料：首先涂在以羟基磷灰石为基的柱上(Bio-Gel HPHT,Bio-RadLaboratories,Richmond,CA)，然后再涂在硅胶过滤柱上(TSK-G3000SW,60cm长，LKB Instruments,Gaithersburg,MD)。将这样一批部分提纯的CSIF等份保存在-80℃下，并将之用作CSIF活性的一种标准。当一开始测定时，这种制剂在1/200的稀释度下，在0.2ml的测定容积中引起了大约50％的对产生IFN-r的抑制。这样，该标准单位是通过规定1000U/ml为标准CSIF制剂来定义的。在后面每次测定中，未知样品的CSIF活性的定量，是通过IFN-r合成物被未知样品抑制的程度与该标准样品的比较而完成的。用于抑制细胞激动素合成的被测定的T细胞克隆是HDK-1(上面已述)和MD13-10(述于Cell.Immunol.,Vol.97,pg.357(1986))。为测定IL-3和GM-CSF的含量，使这种经部分提纯的CSIF在抗-IL-3和抗-GM-CSF。亲合性的柱上通过而得以被进一步地处理。在4℃时，通过轻柔地混合4小时，将在0.1M NaCl 0.1M的HEPES和0.08M的CaCl₂中的抗体偶联到Affi-Gel 10(Bio-Rad)上。每1-2ml的柱大约含10-20mg的已偶联的抗体。

如下表所示，IFN-r的产生在两种克隆中被抑制。在MD13-10细胞中，其它的细胞激动素，IL-2，淋巴细胞毒素、IL-3和GM-CSF的合成也被抑制到较低的程度，或被抑制到完全没有的程度。

表细胞系细胞激动素对照合成量(％)

14U/ml 42U/ml 125U/mlHDK-1 IFN-r 47.6 29.1 18.6

IL-2 71.7 59.6 40.4

淋巴细胞毒素 41.9 45.1 42.8

IL-3 63.9 52.6 38.4

GM-CSF 86.9 79.1 66.8MD13-10 IFN-r 36.0 27.5 23.2

IL-2 88.2 109.3 96.0

IL-3 60.2 63.0 51.0

GM-CSF 109.0 119.9 97.6实施例Ⅱ 由D10细胞构建cDNA信息库及克隆

pcD(SRα)-F115的分离

一种cDNA信息库是在pcD(SRα)载体中，由自D10细胞中提取的mRNA，按照Okayama和Berg等人的方法构成的(上述D10细胞述于Kaye et al.J.Exp.Med.,Vol.158pg.836(1983))，上述方法见Mol.Cell,Biol.2:161-170(1982)及3:280-289(1983)，而且该方法已公开于U.S.Patent 4,695,542中，该文献已经引征结合于本文中)。带有cDNA插入物的pcD(SRα)载体在E.coli中被放大。从这些随机挑选的克隆库中提取质粒DNA，并用于转染COS7猴细胞(如下所述)。然后测定COS7培养物的上清液的CSIF活性。按下述方法转染COS细胞；在转染前一天，在含5％

的胎牛血清(FCS)和2mM谷氨酰胺的Dulbecco改进的Eagle培养基中将约1.5×10⁶ COS7猴细胞接种到单个的100mm平皿上。为完成此转染，通过用胰蛋白酶培养从该皿中取出COS7细胞，然后在无血清DME中洗两次、在无血清DME中悬浮至10⁷个细胞/ml。将0.75ml的等分试样与20μg的DNA混合，然后转移到0.4cm的无菌穿孔杯中。10分钟后，Bio Rad基因脉冲装置中，以200伏，960μF使该细胞脉动。再过10分钟后，从该杯中取出细胞，再加到20ml的含5％FCS,2mM谷氨酰胺、青霉素、链霉素和庆大霉素的DME中。将混合物等分于4个100mm的组织培养皿中。12-24小时后，在37℃、5％CO₂下，用仅含1％FCS的类似的培养基取代该培养基，然后在37℃,5％CO₂下继续再培养72小时，此后收集该培养基并测定CSIF活性。接着pcD(SRα)-F115的cDNA插入物的最大开放读码放确定于下：5′-ATGCCTGGCT CAGCACTGCT ATGCTGCCTG CTCTTACTGA CTGGCATGAG

GATCAGCAGG GGCCAGTACA GCCGGGAAGA CAATAACTGC ACCCACTTCC

CAGTCGGCCA GAGCCACATG CTCCTAGAGC TGCGGACTGC CTTCAGCCAG

GTGAAGACTT TCTTTCAAAC AAAGGACCAG CTGGACAACA TACTGCTAAC

CGACTCCTTA ATGCAGGACT TTAAGGGTTA CTTGGGTTGC CAAGCCTTAT

CGGAAATGAT CCAGTTTTAC CTGGTAGAAG TGATGCCCCA GGCAGAGAAG

CATGGCCCAG AAATCAAGGA GCATTTGAAT TCCCTGGGTG AGAAGCTGAA

GACCCTCAGG ATGCGGCTGA GGCGCTGTCA TCGATTTCTC CCCTGTGAAA

ATAAGAGCAA GGCAGTGGAG CAGGTGAAGA GTGATTTTAA TAAGCTCCAA

GACCAAGGTG TCTACAAGGC CATGAATGAA TTTGACATCT TCATCAACTG

CATAGAACCA TACATGATGA TCAAAATGAA AAGCTAA -3′；

并且用规则确定的成熟鼠的CSIF蛋白质的氨基酸序列如下：

QYSREDNNCT HFPVGQSHML LELRTAFSQV KTFFQTKDQL

DNILLTDSLM QDFKGYLGCQ ALSEMIQFYL VEVMPQAEKH

GPEIKEHLNS LGEKLKTLRM RLRRCHRFLP CENKSKAVEQ

VKSDFNKLQD QGVYKAMNEF DIFINCIEAY MMIKMKS.实施例Ⅲ 用自pcD(SRα)-F115衍生的探针筛选人CSIF

的cDNA信息库：pH5C和pH15C的分离

用收集的70链节寡核苷酸筛选自人T细胞克隆提取的mRNA，在pcD(SRα)中构成的cDNA信息库，其序列与编码的成熟CSIF的鼠CSIF基因断片编码或非编码链互补。标准的杂交方法被使用，如在150mm陪氏培养皿上生长的细菌菌落被移植到基因筛选膜上，用放射性示踪的寡核苷酸探针处理，洗涤、然后在X-射线胶片上曝光。在对探针长度约束不严的条件下，使探针杂交：包括在60℃,于5×SET(20×SET是3M NaCl+0.4Tris-HCl(pH7.8)+20mM EDTA)中培养靶核酸的预杂交，接着在同样的条件下进行杂交，并在50℃，在5×SET中洗涤，带有质粒pH5C和pH15C的两个克隆被鉴定。两种质粒都表达了在COS7中的能在PHA-刺激的人PBL中抑制IFN-r合成的蛋白质。pH15C的cDNA插入物被图解于图4中，它的最大开放读码的核苷酸序列如下：5′-ATGCACAGCT CAGCACTGCT CTGTTGCCTG GTCCTCCTGA CTGGGGTGAG

GGCCAGCCCA GGCCAGGGCA CCCAGTCTGA GAACAGCTGC ACCCACTTCC

CAGGCAACCT GCCTAACATG CTTCGAGATC TCCGAGATGC CTTCAGCAGA

GTGAAGACTT TCTTTCAAAT GAAGGATCAG CTGGACAACT TGTTGTTAAA

GGAGTCCTTG CTGGAGGACT TTAAGGGTTA CCTGGGTTGC CAAGCCTTGT

CTGAGATGAT CCAGTTTTAC CTGGAGGAGG TGATGCCCCA AGCTGAGAAC

CAAGACCCAG ACATCAAGGC GCATGTGAAC TCCCTGGGGG AGAACCTGAA

GACCCTCAGG CTGAGGCTAC GGCGCTGTCA TCGATTTCTT CCCTGTGAAA

ACAAGAGCAA GGCCGTGGAG CAGGTGAAGA ATGCCTTTAA TAAGCTCCAA

GAGAAAGGCA TCTACAAAGC CATGAGTGAG TTTGACATCT TCATCAACTA

CATAGAAGCC TACATGACAA TGAAGATACG AAACTGA -3′.实施例Ⅳ 专对CSIF的单克隆抗体

用以COS7细胞表达的人CSIF半提纯制剂使一支Lewis雄大鼠免疫。用大约50μg的在弗罗因德氏完全佐剂中的人CSIF使该鼠第一次免疫，然后用同量的在弗罗因德氏不完全佐剂中这种物质增强两次。取检测用血。该动物被给予磷酸盐一缓冲盐水中的25μg的最后加强，4天后获得用于融合的脾。

将大约3×10⁸个大鼠脾细胞与同数的p3×63-AG8.653小鼠骨髓瘤细胞(自ATCC以登记号CRL1580可得)融合。以每井5.7×10⁴个亲代骨髓瘤细胞给3840微滴平板井接种。接着进行融合和培养杂种的标准程序(如述于Chretien et al.J.Immunol.Meth.,Vol.117,pgs.67-81(1989))。融合12天后收集上清液，然后在用产生于CSIF中的人COS7细胞涂覆的PVC板上用间接ELISA进行筛选。用这种方式鉴定杂交瘤JES3-19FI，并保存在American Type Culture Collection。

产生阻断抗体的杂交瘤从开始被筛选出的杂交瘤中，按其产生在PHA-激致的人PBL中抗CSIF-诱发的抑制IFN-r合成的抗体的能力进行选择。实施例Ⅴ 人CSIF在细菌宿主中的表达

由许多化学合成的双链DNA断片组合成合成的人CSIF基因，从而形成一个特指TAC-RBS-hCSIF的表达载体。在标准的细菌体系中，例如E.coli K-12菌株JM101、JM103或类似物中(述于Viera and Messing.inGene,Vol.19,pgs.259-268(1982))进行克隆和表达。使用标准程序进行核酸内切限制酶消化和连接酶的反应(该程序例如是Maniatis et al.,Molecual Cloning:ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory.New York,1982)。

这种碱性法(Maniatis et al，前已引证)被用于小规模的制备质粒。为大规模制备，使用该碱法的一种变型，在其中一份等容积的异丙醇被用于从该透明的溶解产物中沉淀出核酸。在氯化铯平衡密度离心分离和用溴乙锭检查之前，带有冷的2.5M乙酸铵的沉淀被用于取出RNA。

为进行过滤杂交，将Whatman540滤环用于提出菌落，这些菌落随后被溶解。经用0.5M NaOH,1.5M NaCl 1MTris-HCl(pH8.0),1.5M NaCl(每次2分种)连续处理而被固定，然后在80℃加热(30分种)。在6×SSPE,20％甲酰胺，0.1％十二烷基硫酸钠，100mg/ml E.coli tRNA,100mg/ml考马斯亮兰G-250(Bio-Rad)中，温度为42℃，时间为6小时，使用³²P-标记的(Kinased)合成DNA(在800ml水中溶解174g NaCl,7.4gEDTA和27.6g NaH2PO4.9H2O而制成20×SSPE；用NaOH将pH值调到7.4，体积调到1升，并用高压灭菌法使溶液灭菌)杂交。用1×SSPE,0.1％SDS将过滤器洗两次(15分钟、室温)。放射自显影后(Fuji RX胶片)，通过将再生的菌落与染成兰色的菌落一起排列在该滤器上而将阳性菌落找出。用双脱氧法使DNA排序(见Sanger et al.Proc.Natl.Acad,Sci.,Vol.74,pg5463(1977)。双脱氧反应的模板既可是经再次克隆在M13mp载体中的相关区域内的单链DNA(例如Messing et al.Nucleic Acids Res.,Vol.9,pg.309(1981))，也可是按微碱性法制备的和用0.2M NaOH(5分钟，室温)变性的及通过添加2体积乙醇而从0.2M NaOH,1.43M乙酸铵中沉淀出的双链DNA。按照使氨基磷酸酯化学，使用Applied Biosystems 380A合成器合成DNA。按照380A合成器说明书所述完成合成，去保护，分裂和提纯(7M尿素PAGE，洗脱、DEAE-纤维素色谱)。

将欲被克隆的合成DNA的各互补链(每个400ng)相混，然后在50ml的反应容积内用多核苷酸激酶进行磷酸化。这种DNA与1mg经用适当的限制酶消化的载体DNA连接，连接是在50ml容积内，在室温下用4-12小时进行的。磷酸化限制酶消化聚合酶反应和连接条件已经叙述(Maniatis等，上文已述)。通过沉积在用氨苄青霉素，导丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)(0.4mM)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷(X-gal)(40mg/ml)补偿的L琼脂上，进行lacZ+菌落计数(当需要时)。

将DNA聚合酶填充在tacp-承载的质粒pDR 540(Pharmacia)的单个BamHⅠ位点构建TAC-RBS载体。然后将此载体连接到未磷酸化的合成寡核苷酸(Pharmacia)上，形成一种使编码同感核糖体结合位点的双链断片(RBS,GTAAGGA GGTTTAAC)。连接后将该混合物磷酸化，并再与SstⅠ衔接体ATGAGCTCAT连接。然后用SstⅠ和EcoRⅠ将该复合体分解，而该173bp断片通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)而分离，并被克隆到EcoRⅠ-SstⅠ-限制的pUC19(Pharmacia)(如后所述)。最终构建的RBS-ATG-聚衔接物区的序列(被称为TAC-RBS)示于图3。

用八个步骤将合成的CSIF基因组合成一个pUC19质粒。克隆后，通过用插在步骤1中的ATG起始密码子维持在密码中的pUC19的lacZ(α)基因可检测每步骤无缺失的插入物和/或插入物。通过对在含有x-gal和IPTG的L-氨苄青霉素的平皿上的兰菌落进行计数，可以将有缺失和/或插入变化的克隆滤出。另外在每个步骤，在小规模质粒DNA制剂上使用通用顺序引子可迅速地确定插入物的序列(所说制剂例如可得自BoehringerMannheim)。

在步骤1中，用SstⅠ将TAC-RBS载体消化，用T4DNA聚合酶对其处理(其3′-核酸外切酶活性消化SstⅠ切段的3′-突出链，结果形成钝端断片)，T4DNA聚合酶钝化后，用EcoRⅠ对其处理而形成含有TAC-RBS区和具有在ATC起始密码子上的钝端和在相对端的EcoRⅠ切段的173bp断片。最后，将该173bpTAC-RBS断片分离。

在步骤2中，将步骤1的被分离的TAC-RBS断片与EcoRⅠ/KpnⅠ消化的质粒pUC19及合成断片1A/B混合，如于后所示，该断片在其上游末端具钝端，而在其下游末端具有与KpnⅠ切段相应的交叉端。这个KpnⅠ端与BstE11位点的下端相邻。将该断片连接以形成步骤2的pUC19。

在步骤3中，将合成断片2A/B和3A/B(示于后)与步骤2的BstEⅡ/Smal消化的pUC19(放大和纯化后)相混合，然后连接以形成步骤3的pUC19。注意：断片3A/B的下游末端含有形成Smal钝端的一些额外的碱基。这些额外的碱基在步骤4中被分开。断片2A/B和3A/B还具有互补的9残基单链端并通过混合对合，留下2A/B的上游BstEⅡ切段和3A/B的下游钝端以连接成该pUC19。

在步骤4中，将步骤3的Aflll/XbaⅠ消化的pUC19(放大和纯化后)经再提纯、与合成断片4A/B(示于后)混合、然后连接形成步骤4的pUC19。

在步骤5中，将步骤4的XbaⅠ/SalⅠ消化的pUC19放大与合成断片)与合成断片5A/B(示于后)混合，并连接形成步骤5的pUC19。注意：断片5A/B的SalⅠ交叉端在步骤6中通过用HPaⅠ消化而除去。

在步骤6中，将步骤5的HPaⅠ/PstⅠ消化的pUC19(放大和纯化后)与合成断片6A/B(示于后)混合，再连接形成步骤6的pUC19。

在步骤7中，将步骤6的ClaⅠ/SphⅠ消化的pUC19(放大和纯化后)与合成断片7A/B(示于后)混合并连接成步骤7的pUC19。

在步骤8中，将步骤7的MluⅠ/HindⅢ消化的pUC19(放大和纯化后)与合成断片8A/B和9A/B混合并连接形成此最终结构。将此最终结构用常规技术插入E.coli K-12菌株JM101(如可从ATCC按登记号33876得到)。培养后，从JM101细胞中提取蛋白质，并测试提取物稀释液的生物活性。AGCCCAGGCC AGGGCACCCA GTCTGAGAAC AGCTGCACCC ACTTC-TCGGGTCCGG TCCCGTGGGT CAGACTCTTG TCGACGTGGG TGAAG-CCAGGtAACC ggtacGGTCCaTTGG c

断片1A/BGtAACCTGCC TAACATGCTT CGAGATCTCC GAGATGCCTT CAGCA-

GACGG ATTGTACGAA GCTCTAGAGG CTCTACGGAA GTCGT-GAGTGAAGAC TTTCTTTCTCACTTC

断片2A/B

CAAATGAAGG ATCAGCTGGA CAACTTGTTc TtAAGTGAAAGAAA GTTTACTTCC TAGTCGACCT GTTGAACAAg AaTTC

断片3A/BGAGTCCTTGC TGGAGGACTT TAAGGGTTAC CTGGGTTGCC AAGCC-CTCAGGAACG ACCTCCTGAA ATTCCCAATG GACCCAACGG TTCGG-TTGTCTGAGA TGATCCAGTT TTAtAACAGACTCT ACTAGGTCAA AATaGAtC

断片4A/BCTaGAGGAGG TGATGCCCCA AGCTGAGAAC CAAGACCCAG ACATC-GAtCTCCTCC ACTACGGGGT TCGACTCTTG GTTCTGGGTC TGTAG-AAGGCGCATG TtAACgTTCCGCGTAC AaTTGcagct

断片5A/BAACTCCCTGG GGGAGAACCT GAAGACCCTC AGGCTGAGGC TACGG-TTGAGGGACC CCCTCTTGGA CTTCTGGGAG TCCGACTCCG ATGCC-CGCTGTCATC GATctgcaGCGACAGTAG CTAg

断片6A/BCGATTTCTTC CCTGTCAAAA CAAGAGCAAG GCCGTGGAGC AGGTG-TAAAGAAG GGACAGTTTT GTTCTCGTTC CGGCACCTCG TCCAC-AAGAAcGCgT gcatgTTCTTgCGcA c

断片7A/BCGCGTTTAAT AATAAGCTCC AAGACAAAGG CATCTACAAA GCCAT-

AAATTA TTATTCGAGG TTCTGTTTCC GTAGATGTTT CGGTA-GAGTGAGTTT GACCTCA

断片8A/B

ATCTTCATCA ACTACATAGA AGCCTACATG ACAAT-CTCAAACTG TAGAAGTAGT TGATGTATCT TCGGATGTAC TGTTA-GAAGATACGA AACTGACTTCTATGCT TTGACTtcga

断片9A/B(印刷体小写字母标志着与在同位上的天然序列不同的碱基)实施例Ⅵ 专对CENKSKAVE-肽的抗体

将50mg卵清蛋白(OVA)和50mg肌球蛋白(MYO)(如可取自Sigma)分别溶于10ml 0.1M的碳酸氢钠中，并在室温下，于15ml Falcon试管(Falcon Plastic,Oxnard,CA)或类似物中与1ml 0.12的碘乙酰胺溶液(88mg碘乙酰胺溶于4ml 0.1M碳酸氢钠)反应1小时。将每种混合物于4RC对4升0.1M碳酸氢钠透析一夜。分别地，在4ml试管中将10mgCENKSKAVE溶于2ml 0.1M的二硫苏糖醇)溶液(含50mM Tris和2.5mM的EDTA,pH值为8)中，在37℃培养一夜；然后施于GF05凝胶滤柱(1.5×26.5cm)(LKB,Bromma.Sweden)上，再用含0.015M乙酸和0.005Mβ-巯基乙醇的肽洗脱缓冲液洗脱。将含还原肽的每份约为3.5ml的三份馏分在206nm用光密度鉴定，然后被收集，汇集，在干冰中冷冻并冷冻干燥一整夜。同时由透析物中回收OVA和MYO，并通过0.45微米过滤器过滤澄清。通过与溶在四氢呋喃(THF)(5mg/ml)中的380μl碘乙酸的N-羟基丁二酰酯(NHIA)分别混合(由Rector等人公开于J.Immunol.Meth.,Vol.24,pg321(1978))，在室温下搅动30分钟，对4升PBS(1.8g NaH2PO4-H2O,7.2g NaH2PO4-H2O；和溶于4升水中的34g NaCl)透析一夜而使OVA和MYO活化。分别地，使冷冻干燥的肽重悬浮于5ml硼酸盐还原缓冲液(2g Na2B4O7.1OH2O，17.4g NaCl和336mg EDTA-Na2溶于1升水，用浓HCl将pH值调到8.5，在氮气中去氧15分钟，其后添加178mg抗坏血酸)中。将经透析的碘乙酸化的OVA和MYO回收，分别与等体积的(最好是2ml)的含此肽的硼化物还原缓冲液混合，在室温下培养一夜。将所得的结合体用SDS-PAGE(12.5％凝胶)分析。将含溶液的该结合体用PBS稀释到1mg/ml，再进行无菌过滤并等分成便于免疫的体积(例如500微升)，和/或在4℃贮存。在大鼠和免(New Zealand White)二者中产生抗MYO结合体的多克隆抗血清。对兔的免疫程序如下：开始(周O)提取10ml血清试样作对照试样。一周后(周1)将0.5ml肽-载体结合体与0.5ml弗罗因德氏完全佐剂混合并注射到腹膜内。三周后(周4)得到由0.5ml肽-载体结合物与0.5ml弗罗因德氏完全佐剂混合而构成的助促进剂。下一周(周5)再次得到另一个由0.5ml肽-载体结合体与0.5ml弗罗因德氏完全佐剂混合而构成的助促进体。再下一周(周6)也得到另一个完全相同的助促进体。在周7，从该动物身上抽取20ml血清。分离出细胞部分后，由ELISA测定血清阳性抗-CEN-KSKAVE值。除开始的注射液由0.15ml PBS和0.1ml肽-载体结合体与0.75ml弗罗因德氏完全佐剂的混合物构成，助促进体由0.15ml PBS和0.1ml肽-载体结合体与0.75ml F弗罗因德氏完全佐剂的混合物构成，并仅从该大鼠身上抽取2-3ml血清外，大鼠的免疫以类似于上述的程序进行。

本发明上述的实施例的描述一直是为解释和说明的目的而提供的，不打算是详尽的或将本发明精确地限于这种公开形式，并且很明显，按照上述说明，很多改变和变化是可能的。为了最好地解释本发明的原则，以借此能使本领域中的普通技术人员，以各种实施方式和用各种改进-这些方式和改进对予期的特殊用途是适宜的-来更好地利用本发明。本发明的范围打算用附于本文的权利要求书来限定。

申请人已将带有pcD(SRα)-F115、pH5C和pH15C的E.coli MC1061在American Type CultureCollection.Rockville.MD。USA(ATCC)，以登记号68027、68191和68192分别寄存。这些寄存物按ATCC′Sagreement for Culture Deposit for PatentPurposes所提供的条件制备，这些条件将使遵循35 USC122和37CFR1.14者从美国专利和商标局可得到这些寄存物，并使公众根据要求保存该寄存物的美国专利出版物得到这些寄存物。该被寄存的菌落的可获得性不被解释为对违犯任何政府的行政部门根据专利法所授的权利的许可。

该寄存物已经改进以符合Budapest Treaty on the Depositionof Microorganisms的要求。

Claims

1．一种制备哺乳动物细胞激动素合成抑制因子的方法，该方法包括培养含有表达载体的宿主细胞，所述表达载体含有一种核酸，该核酸(a)编码具有细胞激动素合成抑制因子活性的多肽，并且(b)在5×SET存在下，在60℃下或相等条件下，与一种或几种来源于cDNA插入物pcD(SRα)-F115、pH5C或pH15C的探针形成可检测的杂交物，所述插入物保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号分别为68027、68191和68192，所述宿主细胞的培养是在使所述核酸表达的条件下进行的。

2．权利要求1的方法，其进一步包括从宿主细胞中分离细胞激动素合成抑制因子。

3．权利要求1或2的方法，其中所述宿主细胞是细菌细胞或哺乳动物细胞。

4．权利要求1或2的方法，其中所述因子选自下列氨基酸序列限定的开放读码的成熟多肽：

MHSSALLCCL VLLTGVRASP GQGTQSENSC THFPGNLPNM

LRDLRDAFSR VKTFFQMKDQ LDNLLLKESL LEDFKGYLGC

QALSEMIQFY LEEVMPQAEN QDPDIKAHVN SLGENLKTLR

LRLRRCHRFL PCENKSKAVE QVKNAFNKLQ EKGIYKAMSE

FDIFINYIEA YMTMKIRN，

或其保留了细胞激动素合成抑制因子活性的突变蛋白。

5．权利要求1或2的方法，其中所述因子具有如下氨基酸序列：

SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFPQMK

DQLDNLLLKE SLLEDFKGYL GCQALSEMIQ FYLEEVMPQA

ENQDPDIKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKA

VEQVKNAFNK LQEKGIYKAM SEFDIFINYI EAYMTMKIRN，

或其保留了细胞激动素合成抑制因子活性的突变蛋白。

6．权利要求1或2的方法，其中所述因子具有如下氨基酸序列：

QYSREDNNCT HFPVGQSHML LELRTAFSQV KTFFQTKDQL

DNILLTDSLM QDFKGYLGCQ ALSEMIQFYL VEVMPQAEKH

GPEIKEHLNSL GEKLKTLRMR LRRCHRFLPC ENKSKAVEQV

KSDFNKLQDQ GVYKAMNEFD IFINCIEAYM MIKMKS，

或其保留了细胞激动素合成抑制因子活性的突变蛋白。

7．权利要求1或2的方法，其进一步包括制备含有6-30个氨基酸残基的多肽，所述多肽具有与成熟的人细胞激动素合成抑制因子的亚序列相同的序列，所述成熟的人细胞激动素合成抑制因子含有如下氨基酸序列：

SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMK

DQLDNLLLKE SLLEDFKGYL GCQALSEMIQ FYLEEVMPQA

ENQDPDIKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKA

VEQVKNAFNK LQEKGIYKAM SEFDIFINYI EAYMTMKIRN。