PT94514B - Processo para a producao de factor inibidor da sintese de citocinas, de seus antagonistas e metodos para a utilizacao dos mesmos - Google Patents

Description

As respostas imunes aos antiqénios são classificadas como sendo predominatemente «mediadas por células», exemplificado pelo fenómeno de hipersensibilidade do tipo retardado CDTH) ou «huiaorais», exemplificado pela produção de anticorpos, A imunidade mediada por células é particularmente importante na rejeição de tumores s na recuperação de muitas infecçSes causadas por vírus, bactérias, protozoários e fungos, Pelo contrário, uma resposta, imune humoral é a forma mais eficaz de imunidade para eliminar da circulação toxinas e organismos invasores. Observou— —se qu.e para diferentes antiqénios predomina uma ou outra destas algumas doenças, s,g» lepra, c 1<

ase ds resposti

clusivo e qus a qrav	íoade	de
hmaniose e alguns	tipos	d<=?
dominância inadequad	cl QS	ucns.
a outra, Mosmann et	al,	Iiíi*”

Rev,	Immunol	= , Vo1„ 7 5	pgsl4b-í/3 (198	9)3 Parish, i
Rev,	Vol, 13	, pgs, 33—66	í1972)3 e Liew,	ϊ mfiiuno 1. Today 5
Dp’S a	am—as < JW »5-1 \	1989), Foi	ainda observado	que séries de

munol, Today, Vol, 8, pgs, 223-227 (1987)3 Mosmann et al, Ann, Transplant, .nai estão sepe.rade.men te -associadas a reacções DHT e respostas imunes huroorais, Cher et al, J, immunol., Vol, Í38, oas,3688-3694 (1987)3 e Mosmann et al, » (1987 e py ?rido at

1989,

pensa—se que as doenças associadas a estas classes de resposta sejam provocadas pela produção inapropriada das séries associadas de citocinas»

Por exemplo, um grande número de dados sugerem que a produção excessiva de interferão gama <IFN-T) é responsável pelas doenças autoimunss associadas aos complexos ds histocompatibilidade ÍMHOs Hooks et si», New Enqland Hed., Vol. 3©í, pgs. 5-8 elevados de IFN-Γ no soro estão correiacionados com autoimunida.de) ; 1492— í 494 ί1983) C o

Basham et al«, u» I mmu.no 1», Vol. 1-30.· oqs»

IFN-T pode aumentar a expressão do produto do gene MHc); Battazza et al., Lancet, pgs» 1115—1119 <11/12/83) ex ureí isão absr produto do qsne NH8 está relacioní o a com

Ann» Ν. Y» Acad» algumas formas de autoimunidade)5 Hooks et Sc i» » Vol» 301, pgs» 21-32 (1980) (níveis ds IFN—Γ mais e estão relacionados com uma maior

8LE e a actividade potenciadora gravidade da doença em doentes da libertação de histamina do interferão pode ser inibida oor soro anti—interferão)3 e Iwatani índocrin» and Metabol

Vol» 33_s pgs»» 390-/08 <1986) <0 anticorpo monoclonal anti-IFN-Γ eliminou a capacidade de células T estimuladas com leucoaglutinina ρ-ara induzir a expressão de HLA—tJR)» Foi colocada a hipótese de oue o IFN—Γ em excesso causa a expressão inadequada dos produtos dos genes MHC que, por sua vez, provoca reacções autoimunss contra os tecidos cujas células estão a expressar inadequadamente os produtos ds MHC e apresentam os autcantigénios no contexto dos produtos»

Ma área da parasitologia clínica, foi observado recentemente que os níveis ds IFN-T e IL—2 são factores importantes na. progressão e/ou resolução da infecção pelo protozoário leishmaniose» Em particular, a presença de níveis adequados de IFN-T parece ser essencial à activação dos macrófagos infectados para eliminar os amastígotos intracelulares, Mattel ε Behin em Cohen et

al., eds», Immunology of Parasitic Infections íBlackwel 1, London, 1982)= E, nos modelos murinos ds. doença, mostrou-se que níveis elevados de IFN-Γ e níveis baixos ds IL-4 estão associados com a resolução, enquanto que níveis baixos de IFN-Γ e níveis altos de IL-4 estão -associados à progressão da leishmaniose, Heinzel et al, J= Exp= Hed=, vo.l» 169, 59-72 (1989) =

Face ao que foi dito, seria vantajoso ter agentes que pudessem desviar a dominância de uma classe de resposta imune para outra, e em particular que pudesse suprimir ou aumentar a síntese de IFN—Γ e/ou outras citocinas, respectivamente, conforme fôr necessário à terapia» Tais- agentes serão altamente vantajosos para o tratamento de doenças associadas a respostas imunes inapropriadas. ou inadequadas, como sejam rejeição de tecidos, leishmaniose e outras doenças provocadas por parasitas e rertur— baçSes imunes associadas ao MHC incluindo artrite reumatóide, lupus eritematoso sistémico (SLE), miastenia gravis, diabetes melitus dependente de insulina, tiróidite e similares»

SUMARIO DO INVENTO presente invento é dirigido à síntese de factor inibidor da síntese de citocinas de mamíferos CCSIF5, análogos de CSIF, peptideos de CSIF e antagonistas de CS1F» Ele inclui ácidos nucleicos codifícadores de polipeptideos com actividade de CSIF, assim como os próprios polipeptideo, seus análogos aqonisticos e/ou antagonisticos, métodos para a sua produção e métodos para a sua utilização no tratamento de perturbações associadas a desequilíbrios de citocinas» partieularmente osd que levam a uma. classe inadequada de resposta imune» 0 invento também inclui o uso de CSIF ou seus antagonistas, sozinhos oucomo adjuvante de vacinas, para selectivamente induzir uma resposta imune predominantemente celular ou uma resposta imune predominantemente

humoral, respectivamente. De preferência, os antagonistas de L'bIF são derivados de anticorpos monoclonais capazes de bloquearem a actividade biológica de CSXF. Us ácidos nucleicos do invento s’ão definidos íi> pela sua homologia com, ou pela sua capacidade para formar híbridos detestáveis com, as sequências de DNA complementar cionado ícDNA) aqui descritas e (2) pelos ensaios funcionais quanto á actividade de CSIF aplicados aos polipeptídeos codificados pelos ácidos nucleicos.

dade CSIF» como referência significa que a proteina substancialmente reduzir o nível de produção de pelo menos uma das seguintes citocinas nos ensaios descritos abaixos IFN-Γ,

Conforme aqui é usado o termo «activia uma proteína ou a um polipeptídeo ou polipeptídeo ê cpaz de inibir ou in ter1euc ina-2 ίILfactor estimulador (uM—Cbj— ? .

, iinfotoxina, dascolónias de interleucma-o (IL-oí ou q ranu1ocicos—macrõfaoos

Uma realização preferida do invento é um CSIF maduro humano com a grelha de leitura aberta definida pela sequência de •iSfn.LnOéiC 3.CIOS '3Çp 5SÇ-U6i

MHSSAL.LCCLVLLT6VRASPSQGTQSENSCTHFPGNLPNM LRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKSYLSC □ALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLR LRLRRCHRFLPCENKSKAVEBVKNAFNKLQEKSIYKAMSE FD Σ F ϊ ΝYIEAYMTMKIRN, em que os símbolos convencionais de uma só noácidos (ver abaixo) estão apresentados direita começando ns metionina N-terminal, te, o CSIF maduro humano é definido pela a tn i n oác i d os s letr

Ma i s segui a para os- L—ami— esquerda para a preferenc iaImen— nte sequência de

SPGGGTGSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMK DGLDNLLLKESLLEDFK8YLSC8ALSEMIQFYLEEVMPQA ENQDPDIKAHVN5LGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKA VEQVKNAFNKLQEKGIYKAKSEFDIFI NY Ϊ EA ΥίΤΓΜΚ Ϊ RN,

	Nestas	Bsqtfência.s?os espaços	são apenas por	convsniên-
cia do	lsitor« 0	codxqo convsncxonsi d	e uma	só letra é	aqui usado
para os	aminoácidoss
A	A1 -a	Alanina	M	het	Metionιna
c	Cis	Císteina	N	Asn	Asparagina
D	Asp	Ácido aspártico	P	Pro	Prolina
E	Glu	Ácido glufâmico	Q	Gin	Glutamina
F	Fen	Fenilalanina	R	Arg	Argίπina
G	Gli	Glicina	rn	Ser	Serina
H	H.’Ls	Histidína	y	Tre	Treonina
1	I le	Isoleucina	V	Vai	Vai ina.
£	Lis	Lisina	W	Trp	Triptofano
L	ί r-j ι	Leucina	Y	Tir	T irosina»

O invento baseia—se de cDNAs que sSo capazes de ex CSIF» Assim, vários desses (portador de um qene CSIF de port<

Type dor de um gene CSIF humano) foram deposi Cu 1 tu re Co 11 sc t ion í AT CC), Roc k v i 11 ε, MD 068027₅ 68191 ε 68192, respectivamente» em parte na descoberta e clonagem pressar proteínas- tendo actividade clones designados pcDÍSR«)-Fl15 ratinho) e pH5C e pHISC (cada um ados na American on^-! os números de

Breve Descrição das Figuras

A Figura í ilustra, uma relação de dose—resposta para o grau de inibição dai síntese em vários clones de células T deratinho tratados com diferentes quantidades ds CBIF.

A Figura 2 é um diagrama ilustrando as principais características dos vectores de expressão em mamíferos pH5C e pH15C.

A t-igura 3 ilustra a região RBS-ΑΤΒ-ροΙ ie.daptsdor do plasmídeo TAC-RBS-hCSIF»

A Figura 4 ilustra a sequência de nucleõtxdeos da inserção de cDNA do pHÍ5C«

DESCRInSB DETALHADA DO INVENTO invento inclui polipeptideos ou proteínas maduros das grelhas de leitura abertas mais longas- das inserções de cDNA de pH5C, pHiSC, pcDíSRa)~Fl15 e de cDNAs efectivamente homólogos, assim como seus antagonistas. Para proteínas secretadas, uma grelha de leitura aberta geralmente codifica um polipeptídeo que consiste num produto maduro ou secretado, ligado covalentemente ligado no seu extremo N a um peptídeo sinal. 0 peptídeo sinal clivado antes da secreção d sítio de clivagem pode ser poiipeptideo maouro ou activo previsto com um elevado grau de precisão a partir de reqras empíricas, e.q. von Reijne, Nucleic Acids Research, Vai»14 pgs» 4633—4690 (Í9S65 e a composição precisa de aminoácidos do peptídeo sinal para esta função, e»g=, Randall et al», n'ao oarece ser critico :4 a, pgs»

1156-1159 (i9S9)g Kaiser st al, Science, Vol» 235, pgs» 312-317 Í19S7)» Conseguentemente» as oroteinas maduras são facilmente

Science» Vol τ

expressas por vectores diferentes dos ρε 1 as i n s-e rç õe·

odificadores de polipeptídeos sinal muito edificados pela de cDNA de pHSC grelha de leitura ahert pH15C e pcDCSRcú-Fl 15 = definida ϊ „ Obtenção e Expressão de cDNAs de CSIt termo «efectivamente homólogo» conforme aqui é usado significa que a sequência de nucleotídeos è capas de ser detecta— da por uma sonda de hibridação derivada de um clone de cDMft do invento, A medida numérica exacta da homolo-qia necessária para nucleicos codificadores da activxdade CSIidetectar ácidos depende de vários setores incluindo <15 a homologia da sonda com não CSIF associadas com os ácidos nucleicos alvo, <25 a restrição das condições de hibridação, (3) se são empregues sondas de cadeia simples ou dupla, <45 se são empregues sondas de RNA ou DNA, <55 as medidas tomadas para reduzir -a ligação inespecifica da sonda, <65 a natureza do método usado para marcar a sonda, <75 a fracção de bases guanina e .tosina ru

Tida, <85 distriDuiçao dos desempareinamentos entre a sonda e o alvo, <95 o tamanho da sonda e similares. De preferência, uma sequência de -ãcido nuoleico efectivamente homóloga é pelo menos noventa por cento <90X5 homóloga do cDNA do invento.. Mais particularmente, uma sequêncii efectivamente homóloga é uma cujo cDIMA possa de ácido nucleico ?r isolado por uma sonda construída a partir de uma inserção de cDNfi ds pcDCSRa)•-•F1Í5, pH5C, pHlSCou um s-eu equivalente, usando o protocolo de hibridação descrito nos exemplos com não mais do que alguns sinais falsos positivos, e.g» menos de uma centena. Existe uma extensa literatura que proporciona orientação sobre a selecção de condições para tais hibridações, e»g= Hames et al, Nucleic Acid Hybridizations A Praticai Approach <IRL Press, Washington, D = C», Í9B55; Bray et al» Proc, Natl» Acad» Sei», Vol.8®, pos, 5842-5846

Nucleic A-cids Research. Vol pq?

u ι xnçj	= -ia α ί t	Labora Lo;· y
S. í_	York	, 1989); e
266_	285	(1983) só

Belts et al=, Meth« in Ensymol», Vol 1®0, pgs para referir alguns.

Homologia tal coso d termo ê aqui usado ê uma medida de semelhança entre duas sequências; de nucleotídeos (ou aminoãci— dos),·. A homologia é expressa como a fracção ou percentagem de bases (ou aminoácidos) íquais após as duas sequências (possivelmente ds tamanhos diferentes) terem sido alinhadas,, 0 termo alinhamento é usado no sentido definido por Sankoff e Kruskal no capítulo um de íime Warps, String Edits, e Macromolecul;

i ne

Theory and Practice of Sequence Comparison (Addison-Wesley,, Reading, MA, 1983),, Resumidaments, duas sequências são alinhadas tornando-se máximo o número de bases iguais (ou aminoácidos) entre as duas sequências com a inserção de um número mínimo de bases «brancas» ou «nulas» na sua sequência para tornar máxima a sobreposição. Dadas duas sequências, existem os algoritmos parai a determinação por computador da. sua homologia, e.g. Needleham

Wunsh, 3,·. Mo1. B i o,

48, pgs. 443-453 (1970); e Sankof

Kruskal (referido atrás) pgs. 23-29= Também existem serviços comerciais e «software»para fazer tais comparações, s.q, Intel1igenetics, Inc. (Paio Alto, CA); e University of Wisconsin

Benetics Computer Sroup (Madison, Wisconsin)

Os fragmentos obtidos com endonucleases de restrição dos vectores portadores de cDNA;

construir sondas (usando técnicas convencionais tais como «nick— -translation», e»g» ver Sambrook et al., referido atrás) para despiste ds bibliotecas ds DMA genómico e de cDNA ens condições de restrição de hibridação baixas (novamente construídas por técnido invento foram usados para

-í~.

cas convencionais) de um tipo celular suspeito de produzir CSIF.

ds despiste convencionais, e„g»

Foram usdos os processo

Grunscexn et âlε; (ί 975)í eu Ben ton

Proc. Natl. Acad. Sei., Vol. 72, pgs. 396Í-3965 7o 1 = 196= pqs= 1B©~ ί B3 (1977) c·.- .

isnct? e ou Woo, Methods. in Enzymology, Vol. 68, pgs«3S9-396 (1979) alternativa, ae bibliotecas podem ser despistadas co® oligonucleotídicas marcadas cujas -sequências são determinadas a partir das sequências de nucleotídeos das inserções de cDNA de pcD(SRa)-Fl15, pH5C e pH15C= Tais sondas podem ser sintetizadas nos sintetizadores de DNA comrcialmente disponíveis, e.g. Applied Biosystems modelo 381A, usando técnicas convencionais, e.g. Gait, Oligonucleotide Synthes-xss A Praticai Approach, CIRL Press, Washington D.C.,1984). Em ambos os casos prefere-se que a sonda tenha pelo menos ÍB-30 bases de comprimento. Mais preferencialmente a sonda tem pelo menos 50-20© bases de comprimento. As sondas de hihridação podem também ser usadas para o despiste de fontes candidatas de mRNA de CSIF antes da construção da biblioteca.

Como sondas

Para produzir ss proteínas do presente invento pode ser usada uma larga gama de sistemas de expressão unicelulares e muiticslulares (i.e. combinaçSas de hospedeiro-vector de expressão) . Os tipos possíveis de células hospedeiras incluem, mas não estão limitados a células de bactérias, leveduras, insectos, mamiferos e similares. Existem muitas- revisões que propocionam orientação na escolha e/ou modificações de sistemas de expressão específicos, e.g. para designar apenas- alguns, de Boer e Shepard, »Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli,» pgs. 205-247, em Kro-on, ed. Geness Structure and Expression (John Wiley & Sons, New York, 1983), revê vários sistemas de expressão para E. coli; Kucherlapati et al., Criticai Reviews in Biochemstry, vol. 16, Artigo 4, pgs. 349-379 C.Í984) e Banerji et al. Genetic Engineering, Vol. 5, pgs. 19—31 (1983) revê métodos para a transfecção e transformação de células de mamíferos », Maximizinq Gene Exoression (Butterworths.

Reznikoff

-e Sold. eds

Boston 5 1986) revê tópicos seleccionados ns expressão de genes em E„ coli. leveduras e células de mamífero? e Thilly, Mammalian Cell Tecrthology CButterworths, Boston, 1986) revê os sistemas de expressão para mamíferos» Igualmente, existem muitas revisões que descreveín técnicas e condiçSes para a ligação e/ou manipulação de cDNAs específicos e sequências de controle da expressão para criar e/ou modificar vectores de expressão adequados para usar com o presente invento, e.g. Sambrook et ai» (referido atrás)»

Riggs na Patente U.S. 4,431,739' descreve um sistema para expressão em E, coli, o qual é aqui incluido como referência» Um promotor procariótico particularmente útil para uma expressão elevada em E» coli é o promotor tac, descrito por de Boer na Patente U.S» 4,551,433 o qual é aqui incluido como referência. Existem também vectores- de expressão e secreção para hospedeiros E» coli» São particularmente úteis os vectores pIN-I I I-ompA , descritos por Shrayeb et al», em EMBO J», Vol »3, pgs» 2437-2442 (1984) em que o cDAN a ser transcrito é fundido com a fracção do gene Dmp-A de E» coli codificador do peptídeo sinal da proteína ompA que, por sua vez, faz com que a proteína madura seja secretada para o espaço periplasmático da bactéria» As Patentes U.S. 4,336,336 e 4,333,397 também descrevem vectores de expressão e secreção para procariotas» Assim, estas referências são são aqui incluídas como referência»

Numerosas estirpes de bactérias são hospedeiros adequados para vectores de expressão de procarióticos incluindo estirpes de E» coli, tais como W3Í10 (ATCC N2 27325), JA221» CÓ0O,ED767, DH1, LE392, HBiwí, X1776 CATCC NÇ 31244), X2282, RR1 CATCC nS 31343) MRCI? estirpes de Bacillus subtil is? ε outras enterobactereâceas tais como Salmonella typhimurium ou Serratia. marcescens e várias espécies de Pseudomonas» Ds métodos gerais para derivação das estirpes bacterianas, tais como E. coli K12 ρ

oteínas eucarióticas está descrito

X i 776>, úteis na e χ ρ por Curtis 111 ns aqui incluída como ressSo de Haxence ii» referência

Assim esta patente

Além dos micro-organismos procarióticos e eucarióticos, os sistemas de expressão compreendendo células derivadas de organismos multicslulares podem também ser empregues parei produzir proteínas do invento. É de interesse particular os sistemas de expressão em mamíferos devido à sua maquinaria de processamento pós-tradução produzir com maior probabilidade proteínas de mamífero biológicamente activas» Vários vírus de DNA produtores de tumores têm sido usados como vectores para hospedeiros mamíferos» São particularmente importantes os numerosos vectores que compreendem sequências de controle da repl.icação e/ou tradução do 8V40 acopladas a sequências ds rsplicação bacterian, e»g» os vectores pcD desenvolvidos por Okayama e Berg, descritos em Mol» Cell» Biol», Vol«2, pgs»161—170 (1982) ε Mol» Cell» Biol», Vol» 3,, pgs» 280-289 (1983) e melhoraal», rtei= Cexχ» Βίοι», vol8, pgs transcrição ontrole da dos por lakebe et

466-472 (1988). Assim estas referênc:

So aaui incluídas como referên— cia» Outros vectores de expressão ρ-ara mamíferos baseados em SV40 incluem os descritos por Kaufman e Sharp, em Mol» Cell» Biol», Vol» 2, pgs»1304-1319 (1982) e Clark st al», na Patente U»S„ 4,675, 285, ambos sendo aqui incluidos como referência» .As células ds macaco são geralmente os hospedeiros preferidos para os vectores referidos atrás» Tais vectores contendo as sequências ori de SV40 e um gene A intacto podem replicar-se autonomamente em células de macaco (para dar números ds cópias mais elevados e/ou mais estáveisdo que os plasmideos de replicação não autónoma)» Ainda, vectores vectores contendo as sequências ori de SV40 “S;;ê uis geneA incacco podem replicar se autonomamsnce para. dar um número de cópias elevadoCmas não estávelmente) em células C0S7 de ihSlSCD, DBSuritSS pOr toXUZiHân, Ctíi 1, vo.

-pgs í75-182 (1981)

e disponíveis na ATCC (MQ ds Acesso CRL 1651). Os baseados em SV40 são também capazes de transformar outras células de mamífero, com sejam as células L de

DNA da célula hospedeira.

-atinho, por integração no

Os organismos muiticelulares também podem servir como hospedeiros para a produção de CSIF. e.g. larvas de insectos, Maeda et al., Nature, Vol. 315, pgs. 529-594 (1985) e Ann. Rev. Entornei.= pgs. 351—372 CÍ989)» e animais transgènicos, Jaenisch, Science, Vol. 24(3, pgs. 1468—Í4/4 (Í98tí).

11= Ensaies m vitro par d Csll··

A actividade de CSIF é a propriedade de inibição da síntese de pelo menos uma citocina no grupo constituído por IFN-Γ, linfotoxina, IL-2, IL-3 e BM-CSF numa população de células

T auxiliares («helper») induzidas destaí an t iqén ios (APC-s) para sintetizareis uma ou mací a células apresentadoras dc C3 (''S' T © f~ *θ* O C £ SL por exposição . a singeneícas e a.ntigénií APC-s s-ão tratadas de modo a serem incapazes de repl icação mas a sua maquinaria, de processamento de antigénio permanece funcional. Isto é convenientemente conseguido irradiando as APCs, e.g cerca de 1500-3000 R (radiação gama ou X) antes de mistura as células T= ascom com

Como alternativa, a. inibição das citocinas pode ssr ensaiada em reacçoes de linfócitos mistos (MLR) primárias ou de preferência secundárias, em que não são necessárias APCs sinqe— neicas. MLRs são bem conhecidas no campo, e.g. Bradley, pgs.162— 166, em Misshell et al, eds, Sei ec ted Me t hod s in Cs-11 u 1 a r Immunology (Fresman, Sars Francisco, 1980)§ e Battisto et al. Meth, in Ensymol. , Vol. 15Θ, pgs. -33-91 (1987). Resumidamente, duas populações de células linfóides alogénicas são misturadas , ϊ

i»

uma das populações tendo sido préviamente tratada, antes da mistura para evitar a replicação, s.g, por irradiação. De preferência as populações celulares são preparadas numa concentração tíe aproximadamente 2 x 10“ células/ml em meio suplementado, e„g„ RPMI 1640 com í@% de soro fetal de vitela» Para ambas as culturastestemunha e a testar, mistura-se 0,5 ml de cada população para o ensaio, Para uma MLR secundária, as células que restam / o i as na MLR primária são.novamente ras irradiadas preparadas de CSIP pode ser adicionada às estimuladas ρο-r células estimuladofresco, ft amostra suspeita de ter a testar na altura da :ul fcurai mistura e ambas as culturas tetemunha e a testar podem ser ensaiadas quanto à produção de citocinas entre '1 s 3 dias após a mistura,

A obtenção de células ί e/ou populações de APC para ensaios emprega técnicas bem conhecidas que estão detalhadamente descritas em DiSatoato st al» eds», Meth»

η] >1 (19841. As APCs preferidas para o ensaio de CSIF sSo os monócitos periféricos do sangue, Estes são obtidos cionais, e»g» como descrito por Boyum, 108, pgs» 88-102 (1984); Mage, Meth» usanoo técnicas convenMeth» in Enzymol», Vol» in Enzymol»» Vol pgs» 1 Í8-I32 í 1984) ;L.itvin et al», Meth»in Enzymol,, Vol, 108,

98-.502 C19tí4>5 Stevsnson, Meth» in Enzymol

Voi »

108, pgs i, pgs

242-249 C1989)5 e Romainet al», Meth.in Enzymol», Vol» 108, pgs, 148-153 (1984), cujas referências são aqui incluídas como referência, De preferência, as células T auxiliares são usadas, nos ensaios CSIF, os quais sSo obtidos separando primeiro linfócitos do sangue periférico, depois seleccionando, e»g» por sedimentação ou citometria de fluxo, as células T auxiliares usando um anticorpo comercial anti—CD4, e»g« 0KT4 descrito na Patente U.S» 4,381,295 e vendido pela Ortho pharmaceutical Corp» As técnicas necessárias estão descritas detalhadamente em Boyum, Scand» J» 21 CSupl» 97), pg«77 (1968); Meth» in

Clin» Lab» liivest»« vol et al» , Meth» in modo geral, PBLs centrifugação em

•atrás) e sm — 74E> ( í 986) = angue fresco icol1-Hypaqu©

Enzymol», Vol. Í0S (referido Enzimol», Vol» Í21, pgs. 737 são obtidos a partir de s gradientes de densidade de F

Braffl De um por

Pode ser emprgue uma variedade de antigênios no ensaio, e.g. hemocianina de lapa. (KLH), Γ-globulina tí-e gaio ou similares» Mais preferencialmente,em vez do antigénio, as cxélulas T auxiliares são estimuladas com anticorpo monoclonal anti-CD3, e.g» 0KT3 descrito na patente LhS» 4.361,549, no ensaio»

As concentrações de ci Loc inas· nas amostras testemunha e

Uf:

itar medidas- por ensaios biológicos s/ou imunoquimicos convencionais» A construção de ensaios imunoquimicos para oitoei— nas específicas é bem conhecida quando ss dispõe da citocina pu r i f i c ada, e » g» Camρbe11„ íElseyier, Amsterdam, 1984)§

Monoclonal Antibody iechnology Theory of tnzyme Ifflmu.noa.ssa.ys (Elsevier, Amsterdam, 19tí5); e Patente LhS» 4,486,530 são exemplos da extensa literatura sobre o tema» Estão comercializados pela Benzyme Corp» (Boston, MA) os «kits» de ELISA para IL-2 humana, IL-3 humana e 8M-CSF humanos a Endogen» Inc» (Boston, MA) comercializa um

Anticorpos policlonâis para IFN-Γ para 1in fotox ina os quais podem ser d® HL ISA humana, podem ser adquiridos à Benzime Corp» usados num radioimunoensaio para linf o tox ina humana, e.g» Chard, An Introduction to Radioimunoassay and Related 7echniqu.es (Elsevier, Amsterdam, 1982).

Os ensaios biológicos das citocinas- referidas atrás podem também ser usados para determinar a actividade de CSIF» Um ensaio biológico para a linfotoxina humana está, descrito em ftggarwal, Msth» in Enzymol», Vol» 116, pgs» 441-447 (1985) e al» pqs» 221-225, em Clements et al» eds».

Matthews et

Lymphokines -and Iriterferonss A Praticai Approach CIRL press, Washington, E> = 8», 1987) » A IL-2 e SM-CSF humanos podem ssr testados con? as linhas dependentes dos fac tores- CTLL-2 e KG—1, que podem ser adquiridas à ATCC com os números de e CCL 246, respectivamente» A IL· sua capacidade para estimular a formação de uma larga gama ds colónias de células hematopoiéticas em culturas de agr mole, e»q Meager, pgs» 129-147, em Clemens et al, eds» (referido atrás)» ’S*»í5O I I.Í5 2X·4· huma.ua .pode ssr testada pela

A produção de citocinas- pode também ser determinada por análise de mRNA» Os mRNAs de citocinas podem ssr medidos por hibridação tíe pontos («dot hybridization») citoplasmáticos como descrito por White et al» »

Biol» Chem», Vo.l pqs» .6 0 ~8o72 (1982) e descrito por White et al». Patente LLS»

Assim, são aqui incorporadas estas referências como referência» Outras abordagens incluen? transferência de pontos usando RNA purificado, e»g» capitulo 6, em Hames st» al«, eds», Nucleic Acid Hybridization A Praticai Approach CIRL Press, Washington, D»C»,

1985)» Be um modo geral, a hibridação de pontos cítoplasmátiocos envolve a ancoragem de mRNA tíe uma célula ou -amostra de tecido a um suporte sólido, e»g» nitrocelulose, hibridação de uma sonda de DNA ao mRNA ancorado e remoção das sequências ds sonda inespecificamente ao suporte de fase sólida ou. formando erradamente emparelhados com o mRNA de modo a que permaneçam apenas as sequências ds sonda formadoras de híbridos substancialmente perfeitos com os mRNAs alvo» A quantidade de sonda de DNA que fica è uma medida do número de mRNA alvo ancorado ao suporte de fase sólida» A quantidade de sonda de DNA que permrtece ligada é determinada pelo sinal gerado pela sua marca» Existem várias técnicas convencionais para a marcação tíe fragmentas de ácido nucleico de cadeia, simples e dupla» Elas incluem incorporação de

1iqadas híbridos marcas radioactivas, e = q = Haroer et al

Chroroosoffla,

Vol μφ

431—4-59 C1984)| ligação directa de marcas fluorescentes.

e»g» Sffiith et al = , Mucleic Acide- Research, pgsd » 2-599-2412 (1985) e Connolly et al., Nucleic Acide Research, Vol. 13, pgs.

—ZtSíS··? < i CJPS 'i » ι·_;··..·^. \ X /uu# »4 várias modificações- químicas dos- fragmentos- de ácido nucleico que os tornam detectáveis imunoquimicamente ou por Proc» Naf1»

outras reac	çSes de afinidade,	e.g»	Tuhen	et al=,
Acad, Sei»,	Vol» 81, pgs» 3466-	-347®	(1984	-) s Richaj
Mucleic Aci	ds Research, Vol» 11	ς p'M o	6167-	6184 (19·
al», Proc,	Nati » Acad, Sei =,	Vol.	78,	pgs.6633-

Brigati st al== Virology, Vol. 126, pgs. -52-50 (1983); Broker st al», Mucleic Acide- Research, Vol et al», Methods of Biochemical C Í9B0).

5, pgs» -568—-584 ÍÍ97EA; e Bayer Analysis, Vol» 26, pgs» 1—45

De preferencia σ síKMA das- células T é ancorado para hibridação ã sonda através do protocolo que se segue» As- células isoladas são lisadas por ressuspensão num tampão d-e lise

M NaCl, 1,5 m!i MgCl.-,, 1® mM iris-HCl pH 8,6, 0,5% de Nonidet P-4®

C um detergente não iónico, e»g» da Sigma)) a 4°C numa concentração final de íxlO células/ml» A suspensão é agitada com vortex durante 10 seg» e os núcleos sedimentados C1-5 ®0© g, 2,5 min)» Os lisados citoplasmáticos resultantes são então transferidos para um tubo de 1,5 ml esterilizado contendo 0,3 volumes de 2®x SSC (lx SSc=0,15 M NaCl, 0,015 li citrato trissódico (citrato salino convencional)) e ©,2 volumes de formaldeido a 37% (p/p). A mistura foi então incubada a 6©^Dí --»o durante 15 min» e guardada em pequenas quantidades a -/© C» Para análise, 15 ml de cada amostra é titulado por diluiçSes seriadas de tr£'s vezes em 15x SSC numa placa de microtitulação d-e 96 cavidades de fundo plano (Falcon, Becton Dickinson, Oxnard, CA> em ©,í ml» Cada uma das diluições foi aplicada com sucção sobre uma folha de Nytr-an (um suporte de nylon modificado adquirido à Schleicher and Schuell, Keene, NH? 0,45 min de poro) apoiada sobre papel de filtro (Nhatman 3mmChr, Nhatman Inc», Clifton, Nu) utilizando um sistema Minifold de 96 ·* *

IB poços (Schleicher -and Schuell). 0 papel Nytran é então incubado a SO^C, 2 h e tratado com uma solução de pré-hibridação consistindo em 50a, de formamida <BRL_S Gaitherburg, MD) óx 33c, 50 mg/ml de tRNA d e E» sl-s fRin gma), Ficoll (ΡΜ=400 ©00), poliviní1pirrolidona e albumina do soro bovina (BSA) 0,2% íp/v) de cada. A sonda foi aplicada no suporte de Nytran numa concentração de aproximadamente 50 ng de sonda/ml de solução de prê-hibridação. Após hibridação, o suporte é lavado duas vezes durante 15 min de cada vezà temperatura ambiente em 2x SSC, depois duas vezes durante 30 min. cada a Ó0^UC em 2x SSC/0,5% SDS. 0 suporte é então exposto a filme usando um écran intensificador e quantificado por varrimento com um densitómetro de laser (e.q. Ultroscan XL, LKB Instruments Incu, Saitnrsburg, Muj« 3e a nibrxoaçâo por pontos do citoplasma não possuir sensibilidade suficiente, de preferencia o RNA é primeiro extraído dos PBLs antes da transferência. Por exemplo, o RNA pode ser extraído pelo método do tiociansto de guanidinio descrito por Chirgwin et al,, em Biochemstry, Vol. 18, pqs. 5294-5299 (1979).

Nalguns casos, as amostras a serem testadas quanto à actividade de CSIFdevem ser pré-tratadas para remover predeterminadas citocinas que possam interferir com o ensaio. Por exemplo, 1L-2 aumenta a produção de IFN—Γ nalgumas células. Assim dependendo das células T auxiliares usadas no ensaio, IL~2 pode ter de ser removido da amostra a ser testada. Tais remoções são convenientemente conseguidas passando a amostra numa coluna de afinidade anti—citocinas convencional.

III. Anticorpos Monoclonais e Antagonistas Específt para CSIF dos

De preferência, os antagonistas do invento são derivaan ticorpos espscí f icos para

CSIF humano

Mais

V3 preferencialmente, cs antagonistas do invento compreendem fragmentos ou composições de ligação especificas para o CSIF humano» Os anticorpos compreendem um conjunto de cadeias polipeptídicas ligadas umas às outras por pontes dissulfureto» Duas cadeias polipeptídicas principais, referidas como cadeia leve e cadeia pesada, constituem as principais classes estruturais (isotípo) do anticorpo» Tanto as cadeias pesadas como as leves são ainda divididas em sub-regiões referidas como regiões variáveis e regiões constantes» As cadeias pesadas compreendem uma única região variável e três regiões constantes diferentes e as cadeias leves compreendem uma única região variável (diferente da que está na cadeia pesada) e uma única região constante (diferente das da cadeia pesada)» As regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve são responsáveis pe2

H rr.

anticorpos» conforme aqui é usado, o termo «região variável da cadeia pesada» significa um polipeptideo Cl) que tem entre 11© e 125 aminoácidos de comprimento e C2) cuja sequência de aminoácidos corresponde à. da cadeia pesada de um anticorpo monoclonal do invento, começando no aminoácido N-terminal da cadeia pesada» Igualmente, o termo «região variável da cadeia leve»significa um polipeptideo (1) que tem entre 90 e 115 aminoácidos de comprimento e (2) cuja sequência de aminoácidos corresponde à da cadeia leve de um anticorpo monoclonal do invento, começando no aminoáeido N-terminal da cadeia leve»

Conforme aqui é usado o «antícoroo monoclonal»

Γ S T S í fe/*” dt

-se a populações homogéneas de imunoglobulinas que são capaz se ligarem específicamente a CSIF humana»

Conforme aqui é usado o termo «composição de ligação» sxgniTica uma compos :áo compreenoenoD duas

Ca.O

paiipeptídicas Cí) que₅ quando o pn= racional men te associadas..

assumem uma. εοητοΓίϋί tendo uma. elevada afinida.de de liqação para CSFI humano e (2) que* são derivadas de um hibridoma produtor γ/™· f para CalF humant a© âniiccrpcs cnonocionsis· espsciticos «operacionalmente associado» pretende indicar que as duas cadeias polipeptídicas podem ser posicionadas uma em relação à outra, para: ligação por uma variedade de métodos, incluindo por associação num fraqmento de anticorpo nativo, como seja Fab ou Fv ou por meio de adaptadores peptidiccs contendo císteina obtidos por engenharia, genética no extremo carboxilo, Nor mal mente, as dua.s cadeias polipeptídicas correspondem ã região variável da cadeia leve e è região variável da cadeia, pesada, de um anticorpo mono— clonal específico para CSIF humana... De preferência, os antagonistas do invento sã derivados de anticorpos monoclonais específicos para CSIF humano. Os anticorpos monoclonais capazes de bloquear ou neutralizar CSIF são seleccionados pela sua cs.pacida.de para, inibir efeitos induzidos por CSIF em bioensaios convencionais de CSIF, e.g. inibição da síntese de IFW-T.

i π vei i co são

Os hibridomas do bem conhecidas. Geralmente, linha celular imortalizada com um linfócito anticorpo pretendido. Como alternativa. também sao possíveis as técnicas de não fusão para a geração ds linhas celulares imortais produtoras de anticorpos e estão dentro do âmbito do presente invento, e.q, transformação induzida por víruss Casali et al.. ₅ «Human Monoclonais from Antigen-Specific Selection of B Lymphocv— tes and Transformation by EBV» Science, Vol» 234, pqs. 476-479 (1986). As linhas celulares imortalizadas são qeralmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma derivadas de roedores, bovinos ou humanos. Mais frequentemente, são empregues linhas celulares de mieloma de ratinho ou de rato de conveniência. As técnicas para por questões práticas e p r Od U Z1 d os po f teu η i c as o processo envolve a fusão de uma tí que produz o

>· ί ο ·\ obtenção de linfócitos adequados a partir de mamíferos injectados com o antigénio alvo são do conhecimento geral, Beralmente, são usados linfócitos do sangue periférico ÍPBLs) se se pretender células de origem humana ou células do baço ou dos nódulos linfáticos se forem usadas células de .mamíferos não humanos.

um mamífero hospedeiro é- injectado com doses repetidas do antigénio purificado e deixa-se que o mamífero gere as células produtoras de anticorpos pretendidas antes destas serem colhidas para a fusão com a linha celular imortalizadora. São também bem conhecidas as técnicas de fusão, que em geral envolvem a mistura, das células com um agente de fusão como seja polietilenoglicol. Os hibridomas são seleccionados por processos convencionais, como seja selecção em HAT, Entre estes hibridomas, são seleccionados os qus secretam o anticorpo pretendido, i.e» específicos para CSIF, testando o seu meio de cultura por imunoensaios convencionais, como seja transferências Westerns, ELISA, RIA, capacidade de neutralizar C-SIF ou similares, Qs anticorpos são recuperados do meio usando técnicas convencionais de pirificação de proteínas, e,g, TiJssen, Practice and

CElsevier, Amsterdam, 1985), Existem orientação na aplicação tíe qualquer tx ,, ffyuri-joma referidas, Kohler et

Theory of Enzyaie ímmunoassays muitas referências para uma das técnicas atrás Tsc hn i que-s C Co 1 d

Harbor Laboratory, New York, 1980)3 Tijssen, Practice and Sheory of Enzyme ímmunoassays CElsevier, Amsterdão,

Campbell,

Monoclonal Antibody Technoloqy CElsevier, Amsterdam,

Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodisss lechniques and Applications CCRC Press, Boca Raton, FL, 1982), e similares, Os hibridomas proetutores de antzcorpos utonocionsis especxficos oe Cuit- sao então sujeitos a. um segundo despiste usando os ensaios de CSIF descritos atrás para seleccionar ds capazes de bloquear ou neutralizar a actividade biológica de CSIF

A u t i 1 i z ac ão

geração de fragmentos de anticorpos também bem conhecida, e»g» fragmentos í-abs Enzyme Immunoassays (Elsevie-r, and

Theory of fragmentos Fvs Hochman —1135 (1973), Sbarort et ftmsceraara, , pgs» 1130pcc s.i 591—1594 et a 1» B i oc hemstry_? Va1. 12 al»Biocberastry, Vol »15, (1976) e- Ehrlich et al., Patente LkS« 4,355,023? e meias molécu las de anticorpos Auditore—Harareaves, Patente U.S. 4,470,925»

Os anticorpos e fragmentos de anticorpos característicos dos hiforidomas do invento podem ser também produzidos por meios recombinantes através da extracção de RNA mensageiro, construção de uma biblioteca de cDíMA e selecção de clones que codifiquem segmentos da molécula de anticorpo, e.g» Wall et al., Nucleic Acids Research, Vol,5 pgs» 3113-3123 al,, Nucleic Acids Research, Vol» 8, pgs»

Proc, Natl» Acad, Sei,, Vol» 81 (1978)? Zakut st { ooa

Cabilly et al (1984); Boss et al

Nucleic Acids Research, pgs, 3273-3277 Vol» 12, pgs»

Nucleic .Acids Research, Vol.U.

3791-3806 (1984)? Amster et al,, pgs 2055-2065 (1980)? Moore et

Skerra et al», Science, Vol, 24*0, pgs, 1038-1041 (1988)? e Huse et al», Science, Vol, 246, pgs» 1275-1281 (1989), Em particular, tais técnicas podem ser usadas para produzir anticorpos monoclonais interespecíficos, em que a região ds ligação de uma espécie é combinada com a região de não ligação do anticorpo de uma outra espécie para reduzir s imunogenicidade, e»g = Liu et al», Proc» Natl» Acad» Sei», Vol» 84, pgs»3439-3443 (1987),

r. c pgs_;

Patente U,

4,642,334;

IV» Purificação e Composições Farmacêuticas

Quando os polipeptídeos do presente invento são expressos na forma solúvel, por exemplo como um produto secretario de células transformadas de levedura ou de mamífero, eles podem ser purificados de acordo com processos convencionais, ;

incluindo c roma tcg ra fia α s cromatografia de passas.de de precipitação com sulfato de amónio, permuta iónica,filtração em gel, electroforese_; afinidade e/ou similares, e«g»

Techníques», Rethods in Enzymology, 22s233-577 (1977) e Scopes, R», Protein Purifications Principies and Practice íSpring-Verlag, New York, 1982) proporcionam orientação em tais purificações. Igualmente, guando os polxpeptxdeos do invento sao expressos na forma insolúvel, por exemplo como agregados, corpos de inclusão ou similares, eles podem ser purificados por processo convencionais, incluindo separação dos corpos de inclusão das célulashospedeiras rebentadas por centrifugação, solubilização dos corpos de inclusão com agentes caotrópicos e redutores, diluição da mistura solubilizada e diminuição da concentração do agente caotrópico e do -agente redutor de modo -a que o polopeptxdeo tome uma forma biológicamente activa» Estes últimos processos estão descritos nas seguintes- referências; Winkler et al» , 5» 4041-4045 (1986):; Winkler et al, Biotechnology,

Bi oc hem is t r y.

3.992—99S ÍÍ985)| Koths et -al , Patente U=S»4,369,790s e Pedidos de Patentes Europeias 86306917.5 e 86306353=3»

Conforme aqui e usaoo «quancioaoe BTicaz® sxgniTica uma quantidade uma quantidade suficiente para melhorar um sintoma ds um estado auto—imune» A quantidade eficaz para um doente particular ρο-de variar dependendo de factores tais como o estado do problema auto—imune a ser tratado, do estado geral do paciente, método de administração, gravidade dos efeitos secundários e similares» De um modo geral, CSIF é administrado como uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de CSIF s um veículo farmacêutico. UM veiculo farmacêutico pode ser qualixica adequada para a libertação ^ciente» Bera1mente, as composi— enteral de tais drogas são bem conhecidas, e»q= Remington^?s Pharmaceutical Science» 15â- Ed»

substSí»_ ia	compatível	não
c om pos i ç Ses	do invento	num
úteis para	adminscraç	‘ão

CMack Publishíng Company, Easton, PA Í980), Coso alternativa, as composições do invento podem ser introduzidas no corpo do doente através de de um sistema de libertação de fârmaco implantável ou injectável, e«g. Urquhart et al», Ann» Rev» Pharmacol» Toxicol», Vol» 24, pgs» í99-236 (1984)? Lewis, ed. Controlled Releass of Pesticídes and Pharmaceuticals CPlenum Press» New York, 1981); Patente U»S= 3,270,960; e similares»

Guando administrado p-arenteralmente, o CSiF é formulado numa de unidade de dosagem injectável (solução, suspensão, om um ve’culo farmacêutico » São exemplos fisiológico normal, solução dí emu 1 são) em assoe i aç ã? de tais veículos so solução de dextrose e solução de Hank» Também podem ser usdos veículos não aquosos tais como óleos fixados e olsato de etilo»

Um veículo preferido é 07. dextrose/'soro sIOÍOQlCO:

□ VSlCUiO pode conter quantidades mínimas de aditivos tais como substancias que aumentam a isotonicidade e estabilidade química, e»g», tampões e pressrvantes. 0 CSIF é forma purificada substancialmente proteínas numa concentração entre de preferência formulado na livre de aqrsqados e outras aproximadamente 5 e 20 pg/ml»

De preferência, CSIF é administrado por infusão continua

a que uma	quantidade	Π-5. Ç ctrul-S	de	apr·
libertado	por dia Ci»	t*? 3 d © V~ d ct	de	Í-Í6
infusão d	iária pode	v-sriar <	:om	basi

secundários e nas contagens de células, apro x imadamen ta

OU“ O'í uS BlOdu pg se j a

CSIF pode ser purificado a células de mamífero transitoriamente vel men te transformadas por um vector de ε gene CSIF» De preferência, cSIF é purífic nadantes de cultura de células COS 7 tr-an das pelo vector de expressão pcD» A trans partir dos sobrenadantes de transfectadas com ou estáxpressão portador de um ado a partir dos- sobresi tóriamente transfectafecção de cé1ulas COS 7 com pcD efectua-se como se segues Um dia antes da transfecção.

aproximadamente í® células COS 7 de macaco são semeadas em placas individuais de 100 mm em meio de Eagle modificação de Dulbecco (DME) contendo 10% de soro fetal de· vitela e glutamina 2 mM. Para fazer a transfecção, o meio é aspirado de cada placa e substituido por 4 ml de DME contendo 50 mM Tris.HCI ρΗ 7,4, 400mg/m! de DEAE—Dextran e 5® pg de DNA de plasmídeo. As placas são incubadas durante 4 horas a é removido e as placas lavadas t soro. Adiciona-se novamente DME incubadas durante mais 3 hrs a t-A'~f / U* S

meio c on ten d o	DNA
om 5 ml de DME	SSCT;
quais são então
Τ Ο Γ Ή i i í 1 *3 V -td d S.'~-	com
mtendo 4% ds	soro

fetal de vitela, glutamina 2 mM, penicilina CÍ0® U/LÍ e estreptomicina (10® pg/L) em condições- convencionais. As células são então incubadas durante 72 hrs a 37°C, após o que o meio de crescimento é colhido para purificação de CSIF. Como alternativa, a transfecção ρ-ode ser conseguida por electroporação como descrito nos Exemplos. □ DNA de plasmídeo para as transfscçSes é obtido MC1061portadora de pcDCSRa)tendo a descrito por Casadaban a Cohen. J.

Vol. 138= pgs. 179-207 C198®) ou organismos semelhantes. 0 DNA de plasmídeo é isolado a partir das culturas por técnicas convencionais, e.q. Maniatis et al=, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).

por crescimento de L. coli inserção de cDNA do CSIF.,

KiOí

Uma vez que tais proteínas ou

Quando os antagonistas do invento são derivados de anticorpos, eles são normalmente administrados parenteralmente, de preferência intravenosamente, peptídeos antagonistas podem ser imunoqénicos eles são preferen— cialmente administrados lentamente, por administração IV convencional ou a partir de um depósito subcutâneo, e.g. como ensinado por Tomasi et al, Patente U.S. 4,732,863= Quando administrados parenteralmente os -anticorpos e/ou fragmentos são formulados numa <

forma ds dosagem injectável em cêutico como descrito atrás» D lado na forma purificad outras proteinas, enrioto aproximadamente 5 a 30 preferência, os níveis d

associação com um veiculo nticorpo ê ds preferência farmaformua substanciaImente livre de agreg xinas e similares, em concentraçõe mg/ml, de preferência 10 a 20 mg/ml e endotox ina. são inferiores a 2,5 EU ados , s ds „ De /ml»

A selecção ds um regime de admnistração para, um antagonista depende de vários factores, incluindo a velocidade de regeneração do antagonista, no soro, o nível de CSIF no soro associado à perturbação a ser tratada, a imunogenicidade do antagonista, acesso do CSIF alvo <e»g„ se o CSIF sem ser do soro tiver -de ser bloqueado), a afinidade relativa do CSIF para o (s) seu (s) receptor íes) versus CSIF para o antagonista, e similares» ds preferência um regime de administração optimiza a quantidade de antagonista, libertado oara. o doente consistente com um nível aceitável de efeitos secundários» Assim, a quantidade an t-tóQíj” nista libertado depende em parte do antiqonista particular e da gravidade da situação a ser tratada» A orientação na selecção das doses adequadas é encontrada, na. 1 itera.tura sobre utilização anticorpos e»g» Bach et al», capítulo 22, em eds», Handbook of Monoclonal Antibodies (Noges terapêutica de

Ferrone et al»

Publications, Park Ridge, N3, 1985)? e Russell, pgs» 303-357. Smith et al», pgs» 365-389, em Haher et al», eds» Antibodies Huraan Diaqnosis and Therspy (Raven Press, New York, 1977)» e

in

De preferência sempre que o antagonista inclúa anticorpos monoclenais ou ssus fragmentos Fab (incluindo composições de ligação), a dose situana gama de aproximadamente 1 ma/Kq por dia.

Mais preferencialmente a dose situsa-se na gama de apróximadamente 1 a 10 mg/Kg por dia

V, uSlFs Mutantes Obtidos por Engenharia genética

Uma vez disponível a informação da sequência de ácido nucleico e/ou sequência de aminoàcidos para a proteína nativa ficam disponíveis várias técnicas para a produção ds virtualmente qualquer mutação na sequência nativa, e»g» Shortle» em Science,

Vol. 229, pgs» ί193-1201 (1985); Zoller

3iT£Í Lf i ,

Methods hnzymology, Vol, pgs,

U,S

Wells et (1985); Estell et al», Science, Vol (198-5); Ma4rk et al» em sjstíBj vol » c-4, pqs»

Pa ten t

Mullenbach et al e Feretti et al >J» Biul» Chem», vol» 261» py~-= /19-72:2 (1986)

Proc» Nati» Acad» Sei», Vol» 83 pgs 597—603 (1986). Assim» estas referências são aqui incluídas como referência»

Numa variedade de circunstâncias pode ssr desejável muteínas do polipeptídeo natural» Por exemplo, efeitos secundários indesejáveis podem ser reduzidos por certas muteínas, particularmente se a actividade do efeito secundário estiver associada a uma parte do polipeptídeo diferente da que tem actividade pretendida» Nalguns sistemas de expressão, o polipep— tídeo nativo pode ser susceptível à degradação por proteases. Em tais casos, substituições e/ou delecções selecionadas de aminoácidos que alterem as sequências susceptíveis podem aumentar significativamente os rendimentos, e=g, Pedido de Patente Britânica 2173-804-A onde Arg na posição 275 do activador do plasminogénio humano tipo tecido é substituído por Gli ou Glu» As muteínas podem também aumentar os rendimentos no;

cação e/ou aumentar a vida ds prateleira da;

nar os aminoàcidos susceptíveis de sofrerem oxidação, acilaçsc alquilação ou outras modificações químicas» Por exemplo as metioninas sofrem fácilmente oxidação para formar sulfóxidos, o qus em muitas proteínas está associado à perda de actividade

! f θ I	i ou G1u»	As
nos	processos	de
	proteínas	ao
'rem	oxidação,

biológica, e = g, Brot & Weissbach, Arch. Biochem, Biophys.₅ Vai, 223, pg, 271 (1983), Muitas vezes as metioninas podem ser substituídas por aminoácidos mais inertes com pouca ou nenhuma perda de actividade biológica, e»g, Pedido ds Patente Australiana AU-A··· -52451/86, Nos sitemas ds expressão bacterianos, os rendimentos podem por vezes ser aumentados pela eliminação ou substituiçãode resíduos de cisteína não essenciais para a conformação, e,g» Mark

Patente U,S« 4,518,584.

De preferência usa—se uma cassete de mutaqénese para juntar proteínas mutantes, Contruiu-se um gene sintético com uma sequência de sítios de endonucleases de restrição espaçadas mais ou menos uniformemente ao longo do gene; es-tes sítios de endonucleases de restrição são escolhidos de modo a serem únicos mesmo quando o gene é inserido num vector adequado. Os sítios de restrição únicos permitem que segmentos dos genes sejam facilmente removidos e substituídos com oligonucleotídsos sintéticos (i»e. «cassetes» que codifiquem as mutações pretendidas. A determinação do número e distribuição dos sítios ds restrição únicos tem em consideração vários factores incluindo Cí) sítios de restrição pré—existentes no v a ser empregue na expressão, (2) se se pretende a frequência de utilização de codões especa. ίica ne espécie ou especa, fica de género, co? o numero de endonucleases ds restrição disponíveis que não cortam o vector Ce suas mui tiplicidades- dentro do qene sintético) (4·) 5. convs* niência e facilidade de síntese e/ou sequenciação dos segmentos entre os sítios de restrição únicos,

A técnica atrás referida é um modo conveniente de efectuar substituições conservadoras de aminoácidos e similares na sequência da proteína nativa, «Conservadora» como aqui é usado significa Ci) que as alterações sejam o mais conformacionalments neutras possíveis, ou seja, destinam-se a produzir alterações ^y

mínimas na estrutura terciária dos polipeptídeos mutantes comparado com a proteína nativa e (ii) que as alterações são o mais possível antiqénicamente neutras, ou seja, destinado a produzir alterações mínimas nos determinantes antigénicos dos polipeptídeos mutantes comprado com conformacional é desejável a proteína nativa» A neutral idade íar =i a preservação da actividade

Lsiolóqica e a neutralidade antigénica é desejável para evitar a indução de respostas imunes em doentes ou animais tratados os compostos do invento» No entanto é difícil seleccionar com antigênicamente neutras, existem regras que podem guiar os familiarizados com a matéria para fazerem alterações que tenham altas probabilidades de serem conformacional e antigênicamente neutras» e»g = Anfisen (referido atrás)?, Berzofsky, Science, Vol»

229, pgs» V32—940 í 19S5) ; e Bowie et al, Science, Vol

C3) alteração de sequências evolutivamen men te p rod uz

13065-1310 (1990)» Algumas das regras mais importantes incluem (1) substituição ds resíduos hidrófobos produz provávelmente menos alterações na antigenicidade devido a estarem situados no interior da proteína, e»q„ Berzofsky (referido atrás) e Bowie eh al (referido atrás); (2) substituição de resíduos fisicoquimicamente semelhantes, i.e» sin-ànimos provávelmente produzem menos alterações conformacionais pois o aminoácido substituído pode desempenhar o mesmo papel estrutural do aminoácido substituído; e conservadasprovave1mais efeitos conformacionais prejudiciais pois a conservação evolutiva sugere sequências que podem sar funcionalmente importantes» Em adição às reqras básicas para a selecção de sequências de muteínas, existem ensaios para confirmar a actividade biológica e conformação das moléculas alteradas» Os ensaios biológicos para os polipeptídeos do invento estão descritos mais detalhadamente atrás» As alterações na conformação podem ser testadas por pelo menos dois ensaios bem conhecidos? o micrométodo ds fixação do complemento, e»g» Wasserm-an et al», J»

Wasserm-an

2'?δ~295 <1961) ou Levine et al = Methods ir:

pgs. 928-936 <1967) largamento usado nos ,s estruturas terciárias das- proteínas, e

Σ mmuno 1», Vo 1 = 87 , pgs Enzymology₅ Vol= 11, estudos evolutivos d afinidades para séries de anticorpos monoclonais específicos ds conformação, e.g, Lewis et al., Biochemstry, Vol. 22, pgs» y.q.R—954 ( χ 98.3 )

VI» Anticorpos contra Peptídeos de CSIr humano invento inclui peptídeos derivados de CSIF humano e imunogénios compreendendo conjugados entre veículos- e peptídeos do invento» 0 termo imunogénio como aqui é usado refere-se a uma substância que é capaz de provocar uma resposta imune» 0 termo veículo como aqui é usado refere-se a qualquer substância que quando conjugada quimicamente com um peptideo do invento permite que um organismo hospedeiro imunizado com o conjugado resultante produza anticorpos específicos do peptideo conjugado» Os veículos incluem eritrócitos, bacteriófagos, proteínas e sintéticas tais como esferas de agarose» De preferência, os v@xl.u1us ?xíâi-j pf o te í: nas, tais como albumina serxca, gama gloouix na, hemocianxna de lapa, tiroglobulina, ovalbumina, fibrínogénio ou similares» oa r tic u. i =r=>

Us peptídeos do invento são sintetizados por técnicas convencionais, btewart and ?ouno»

Solid Phase Peptide

Synthesis, 2s Ed» (Pierce Chemical Company, Rockforti, IL, 1984)= Ds preferência usa-se um sintetizador de peptídeos comercial, e.g» modelo 43DA da Applied Biosystems, Inc» (Foster City, CA), Os peptídeos do invento são montados por síntese em fase sólida num suporte de polistireno interligado começando no resíduo do extrema carboxilo e adicionando aminoácidos passo por passo até estar formado todo o peptideo. As refrências que se seguem servem de guia a quimica empregue durante a sínteses Merrifield, J.

Amer. Chem. Soc=, Vol. So, pg. 2149 (19035? Kent et ai, pg. Í3o, em Peptides 1984, Ragnarsson, Ed. Cftlmquistand Weksll, Stockholm, pg«217 em Peptide Chemstry 84. Izumiya, Ed. Foundation, B.H. Osaka, 1985)? Merifisld,

Science, Vol. 232, pgs.34í—347 (1986)? Kent, Ann» Rev. Biochem., Vol. 57, pgs» 957—989 (1988) e referências citadas nestas duas ú11imas re fertnc ias.

y

1984)| Kent et al» (Protein Research

A síntese em fase sólida é a mais importante para eliminar os produtos secundárias, os quais são principalmente peptídeos de terminação, delação ou modificação,

A maior parte secundárias podem ser elxmxnadas ou minimizadas usando resinas limpas e hem caracterizadas, derivados de aminoá— eidos sem contaminantes, solventes não contaminados e uma selecção de métodos de acoplamento e clivagem adequados e condiçSes de reacção correctas, e.g. Bar a

Cross e Meienhofer, Eds». Vol. 2» pg?

Merrifield, The Peptides. 1-284 (Academic Press, New

York, 1979). έ importante controlar as reacções de acoplamento para gecerminar se oâo totaímente d?

mooo evi isf peptídeos ds deleção sem um ou mais resíduos» A reacção quantitativa com ninidrina é útil para este fios Sarin et al» Anal» Biochem.» Vol. 117, pg» 147 (1981). Usaram-se Na-t-fautiloxicarbonil C tBoc)— aminoácidos com os- grupos protectores de cadeiaslaterais adequados estáveis nas condiçSes de formação da cadeia mas sensíveis proteg ida, os ancoragem do a ácidos fortes» Após montagem, da cadeia peptídica protectores são removidos e iq-açao oe peotídeo é clivada usando concentrações baixas depois altas de fluoreto de hidrogénio anidro na presença de um captador de tioésteress Tam et al», d. Amer» Chem» Soc», Vol» 105, pg. 6442 (1983). Os grupos protectores das cadeias laterais adequados- gue podem ser usados estão indicados pela abreviatura de três letras para o aminoácido em questão, seguido do grupo protector entre parêntesiss

Asp (Ob‘z 1) , ser (Bz í /

TreCBzl)

LisCCl-Z), TirCBr—Ζ), Arq(NGTos), Cis(4~Me3Bzl) e HisCImDNP)» (Bzl= benzilg Tos =tolueno sulfoxilo? DNF = dinitrofení15 Im imidazole? Z = benziloxicarbonilo)= Gs restantes aminoácidos não têm grupos protectores das cadeias laterais» Para cada ciclo a (t—Boc Na)-peptideo protegido—resina é exposto a ácido trifluoro— acético a 65 por cento (da Eastman Kodak) (destilado antes de usar) em diclorometano (DCM)» (Mal len.ckrodt) 5 primeira durante 1 minuto e depois durante 13 minutos para remover o grupo Na-protector» 0 peptideo—resina é lavado sm DMC s neutralizado duas vezes com diisopropiletilamina (DIEA) (Aldrich) a 10 por cento sis dimetilformamida (DMF) (Applied Biosystems), durante 1 minuto oe

A neutralização roi SByuidsi rf-í lavagem com dMF acoplamento é efectuado com o anidrido simétrico do aminoácido em DMF durante 16 minutos» Q anidrido simétrico é preparado no sintetizador dissolvendo 2 mmol do aminoácido em 6 ml de DMí ífíl de DCM» Após 5 minutos, o aminoácido activado é transferido ml oara um vaso separaao e o Dcn ê svaporaoo por gaseamento com uma. corrente contínua de azoto» 0 DCM é substituído por DMF (6 ml total) em várias fases durante o gaseamento» Após o primeiro acoplamento, a peptídeo-resina é lavada com DCM, í€> por cento de

DItA em DCM e aminoácido e t

DCM, ara > ac ο ρ1amen to» o mesmo agente de activacão, diciclo-bexilcarbodiimida, são transferidos sequenciadamente para o vaso de reacção» Após activação insitu e acoplamento durante 10 minutos, adiciona-se

DMt suficiente para fazer uma mistura a eo acoplamento continuou durante lo minutos» A arginina é acoplada como um éster de hidroxibenztriazole (Aldrich) em DMF durante minutos e depois novamente dos» h ãspsraçins e giutamxna αο 1 adi (copiadas duas ¹ c: ώ. sc c· ésteres de hidroxibenzotriazole en? DMF, 40 minutos para cada acoplamenro» Fara todos os res.»ouos« a resina £ lavada apôs o segundo acoplamento e uma amostra é retirada automáticamente para

controle da α-amina residual não acoplada por reacção quantitativa com ninidrina, Sarin st al» (referido atrás).

A técnica geral de ligação de peptídeos sintéticos a um veículo está descrita em várias referências, e.,g. Walter s Doolittle, «Antibodies Aqainst Synthetic Peptides», era Setlow st al», eds», Senetic Engineering, Vol. 5, pgs. 6Í-91 (Plenum Press, / (1982)?

N.Y», 1983), breen et al. Cell, Vol. 28=

Lerner et 3.1», ProcNatl. Acad. Sei», Vol. /8, pgs (1981)? Shimizu et al.₅ Patente U.S. 4,474,754? ε Sanfield et al., Patente U.S» 4,311,639» Assim, estas referências sao aqui incluídas como referência. Também as técnicas empregues para ligar haptenos a veículos são essencialmente

K.9~.

mesmas oa técnicas atrás referidas, e.g and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier,New York, 1985). Os quatro esquemas mais vulgarmente usados para a ligação de um polipeptídeo a um veiculo são (1) glutaraldeído para o acoplamento de aminas, e.g. como descrito por Kagan e Glick, em Jaffe e Behrssan, eds» Methods of Honsone Radioimmunoassays, pgs» 328—329 (Academic Press N.Y»., 1979) e Walter et al», Proc. Natl. Acad. Bei», Vol. 77, pqs.5197—520® (198®)? (2) carbodiimidas solúveis em água para acoplamento carboxilo e amina, e.g. como descrita por Hoare et al., J. Biol. Chem», Vol» 242, pgs» 2447—2453 (1967)| (3) bis-diazobenzidina (DBD) para acoplamento entre as cadeias laterais de tirosina, e.g. como descrito por Ba.ssiri et al., pgs. 46-47, em Jaffe e Behrraan, eds. (referido atrás) e Walter et al., (referido atrás)? e C4) éster de maleimidobenzoil-M-hidroxissuccinimida (MBS) para acoplamento de císteina (ou outros sulfidrilos) a qrupos amina, e.g» como descrito por Kitagawa st al., J= Biochem» (Tokyo), vol» 79, pgs=233-239 (1976) e Lerner ef al» (referido atrás). Uma regra, geral para a selecção de um método adequado para o acoplamento de um dado peptideo a. um veículo proteico pode ser estabelecida como se segues o capitulo 2® em iijsSsu· s rractioe grupo envolvido na deverá estar presente aoena sequência,

s uma ve de preferência no extremo adequado do segmento» por exemplo» BBB não deverá ser usado se ocorrer um resíduo tirosina na parte principal deuisa sequência escolhida pelo seu potencial carácter antigénico» De modo semelhante, as lisinas situadas centralmente excluem o método do glutaraldeído ε as ocorrências de ácido aspártico s glutâmico excluem frequentemente a abordagem da carbodiimida» Por outro lado podem ser colocados resíduos adequados num dos extremos de um segmento ds sequência escolhido como sítios de ligação, ocorram eles ou não na sequência da proteína nativa» Os segmentos internos, ao contrário dos extremos amina ε carboxilo, diferirão significativamente no «KXurtíiiiQ u ão ligado» da mesma sequência tal como é encontrado na proteína nativa onde o esqueleto polipeptidico é contínuo» 0 problema pode ser ultrapassado, até certo ponto.

pela acetilação do grupo <3—amina e depois ligação do peptídeo através do seu extremo carboxilo» A eficácia de acoplamento à proteína veiculo é convenientemente medida usando um peptídeo marcado radioactivamsnte, preparado usando um aminoácido ratíioactivo para um passo da síntese ou por marcação do peptídeo completo por iodinação de um resíduo tirosina» A presença de tirosina no peptídeo também permite estabelecer, caso ss pretenda, um ensaio radioimune sensível» Portanto a tirosina pode ser introduzida como um residuo terminal se não fizer parte da sequência definida pelo polipeptídeo nativo»

Os veículos preferidos são proteínas e as proteínas veículo preferidas incluem albumina do soro bovino, mioglobulins, ovaibumina COVA), hemocianina de lapa ÍKLH) e similares» Os polipeptídeos podem ser ligados a KLH através das císteinas por MBS conforme descrito por Liu et al», Biochemstry, Vol, IS, pgs»

690-697 (1979)= Os peptídeos são dissolvidos em tampão de fosfatos salino CpH 7,51, tampão borato de sódio ©₅i M CpH 9,0) ou :pH 4,0)» 0 pH para a dissolução do peptxdeo e escolhido ae Tarais

> Sí C \ · optimizar a solubilidade peptídeo» 0 teor em císteina livre para os peptídeos solúveis- é determinado pelo método de Ellman, Ellman» Arch,

Biophys», Vol» 82, pg 7077 (1757)» Para cada KLH em <3,25 ml de tampão fosfato ds sódio CpH mg de MBS (dissolvido -em dimetilf ormamida) e min» á temperatura ambiente» assegurar que a concentração do eivada, uma vez que KLH

Biochemo mq de? 0«7 peptídeo, 4 z=2) reage com agitado durante 30

MBS é adicionado gota a gota para local de formamida não seja demasia— e insolúvel em formamida o^Z» u produto de reacção, KLH—MBS, é então passado através de Sephadex 8-25 equilibrada com tampão fosfato ds sódio 50 mM CpH 6,0) para remover o MBS livre» A recuperação de KLH das fraccões do pico do eluato da coluna (controlado por DO280) ê calculado como sendo de aproximadamente S©%» KLH—MBS reaqe então com 5 mo de peptídeo dissolvido 25 em 1 ml do tampão escolhido» 0 -pH é ajustado a

7-7.,5 e a reacção é agitada durante 3· hr â temperatura ambiente» A eficiência de acoplamento é controlada com peptídeo radioactivo por diálise de uma amostra de conjugado contra tampão de fosfatos salino e variou entre 8°4 e óôX» Uma vez dispondo do conjugado peptídeo—veículo, são produzidos anticorpos- policlonais ou monoclonais usando técnicas convencionais, e»g» como descrito por Campbell, Monoclonal Antibody Technology CElsevier, New York, 1984); Hurrell, ed» Monoclonal Hybridoma Antíbodies? Techniques and Applications (CRC Press, Boca. Raton, FL, 1782) 5 Schreier et al» Hybridoma Techniques ÍCold Spring Harbor Laboratory, New York, 1780)s Patente LLS» 4,562,€K>3; ou similares, Em particular, a Patente U»S, 4,,502,003 é aqui incluída como referência,

Tanto os anticorpos policlonais como os monoclonais podem ser despistados por ELISA, Tal como nos outros imunoensaios em fase sólida, o teste baseia-se na tendência das ma.cromolécula.s para adsorverem inespecificamente ao plástico» A irreversibilidade desta reacção, sem perda da. activida.de imunológica, permite a

formação ds complexos antiqénio-anticorpo com uma simules separação de tais complexos do material ligado» Para titular o soro antipeptídeo, o peptídeo conjugado com um veículo diferente do usado na imunização foi adsorvido às cavidades de ds uma placa ds microtitulação de 96 cavidades» 0 antigénio adsorvido reagiu nas cavidades cooí com diluições do soro antipsptídeo» 0 anticorpo não ligado foi removido por lavagem e os restantes complexos ds antigénio anticorpo ficaram a reagir com anticorpo especifico para IqG do animal imunizado» Este segundo anticoroo é conjugado com uiiií

C‘_jiTiw seja osTatasB aicalins» Um pr odutu ds reacção corado produzida quando se adiciona substrato da enzima indica que quais as cavidades t«m anticorpos antipeptideos ligados» As leituras num espetrofotómetro permitem uma melhor quantificação da quantidade de anticorpo ligado especifico para □ peptídeo» Os anti-soros com títulos altos- dão uma curva de “?* cr titulação linear entre as diluições 10 e ÍO ^» uma curva

EXEMPLOS

Os exempxos que se guem bfybki

Λϋ.£ presente inventei. A selecção de vectares e hospedeiros a concentração de reagentes, temperaturas e os valores assim como de outras variáveis são apenas para exempl ίΐίε invento ε não devem ser considerados r a aplicação do presente orno limitantes do mesmo.

Exemplo I. Actividades Biolóqicas de CSIi- de Ratinho

Sobrenadantes contendo CSIF de ratinho de vários clones de células T obtidos por incubação de clones de células T (5 x Í0^W células/ml) em meio sem soro (RPMl 1640 sem vermelho de fenol ε contendo 2-mercaptoetanol 0,05 mM e 20 mM HEPES) e concanavali— na A (5 yq/ml) durante 24 horas. Os clones incluiram as linhascelulares D9 descrita na Patente U.S. 4,613,459, Dí€? (descrito abaixo) , MB2-Í descrito em Mosmann et al. , 3 = Immunol., Vol. Í36, p-gs. 2343-2357 (Í9S6), CDC25 e CDC35 descritos em Tony et al. , 3. Exp» ned., Vol. 161, pqs. 223 (1935) e M4ÍÍ—2 e M411—6. Os sobrenadantes das células T foram testados quanto à sua capacidade para suprimir a síntese de ΪΕΙΜ-Τ na linha celular HDK—1, descrito em Lherwinski, et al, 3. Exp.

1229-1244 (1987)= Preoararam—se diluições- seriadas- de duas vezesde cada um dos clones de células T em placas de microtitulação de poços de fundo plano num volume 0,05 ml. Num volume de 0,15 ml a adicionou—se célulasHDK—1 (5 x 10' células por cavidade) juntamente com APCs sinqeneicas irradiadas (2500 R) (células de baço a 5 x 10~ células por cavidade) e antigénio (hemocianina de lapa a 150 p.g/ml). 0 anticorpo 11811 anti-IL-4 (10 pg/ml), descrito em Ohara et al», Nsture, Vol. 3Í5, pqs. 333-336 CÍ985), nado a amostras suspeitas- suspeitas de conterem toi atíicioIL-4. Aoós incubação a 3/^uC durante 24 h, os sobrenadantes foram colhidos e mantidas a 4°C durante períodos- de pelo menos de uma semana ou a mais longos. Os níveis de IríM-T foram —8© durante períodos testados por ELISA anticorpo monocIona1 anticorpo de coelho a de, A Figura í mostra percentagem dos nívei

^ÍTl	sanduí	.che para dois	sítios usando um
ds	rato	antx-IS-Ν-Γ de	ratinho, XMGÍ-,2 e
nti·	-IFN-Γ	ds ratinho puri	ficado por afinida-

o grau de inibição da síntese de IFN-T como s da testemunha»

CsíIi- produzido por células Dl© foi parcialmente purificado e aplicado em dois clones diferentes de células T para examinar o grau de inibição da síntese de citocinas em função da concentração de CSIF, 0 CSIF parcialmente purificado foi preparado como ss- seques lotes de 1—2,5 L de sobrsnadante de Dl© induzidas com concanavalina A foram concentrados aproximadamente 1© vezes usando membranas Amicon YM-5 (Amicon Corp,, Danvers, MA), passado através de uma coluna ds 5 ml de agarose conjugada com manose ÍE—Y Laboratories, San Mateo, CA), depois ainda concentrado mais 3 a 5 vezes, para uma concentração tois.1 de 3©—Ό© vezes. Este material foi ainda purificado por dois passos de cromatografia líquida de alta resolução; primeiro numa; coluna de baseada em hidroxilapatite ÍBio-Gel HPHT, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) e depois numa coluna de filtração em gel (TSK—S 3000 8(4, 6© cm de comprimento, LKB Instruments, Gaithersburq, MD), Este lote de CSIF parcialmente purificado foi dividido em pequenas quantidades, guardado a -8©°C e usado como padrão da actividade de CSIF, Quando inicialmente testada esta preparação provocou aproximadamente 50% de inibição da produção de IFN-T numa diluição de 1/20© num volume de ensaio de ©,2 ml e portanto uma unidade padrão foi definida atribuindo um valor de 1©©© U/ml à preparação padrão de CSIF. Em cada u.m dos ensaios abaixo s. actividade de CSIF desconhecida nas amostras foi quantificada por comparação dos níveis de inibição da síntese de IFN—Γ com os do padrão, Os clones de células I que foram testados quanto ã inibição da síntese de citocinas foram HDK-1 (descrito atrás) e

MD1-5-10, descrito em Cell o ensaio dos níveis de IL cado foi ainda tratado anti-Gfi-CSF« Os anticorpo CaCl,-, foram acoplados a A suave durante 4 horas. Ca mente 10 a 20 mq de antic . Immunol.. Vol.

o* e LAsr o t_-u x por passagem por s em 0,1 rl NaC 1 _s 1t i—tíe 1 ífci (tíio—tí da coluna de 1-2 orpo acoplado.

V7, pg,35/ (1 F pareialment colunas de ©,1 M HEPES ad) a 4^DC com foi continha a

986). Para e purifiafinidade e 0,©8 M agitação proximadafoi nem

Como se mostra na iabela abaixo, a inibida em ambos os clones. A síntese das , linfotoxina, IL-3 e SM-CSF foi inibida sequer inibida nas células MD13—10.

produção de IFN-Γ outras citocinas, num grau menor ou

L-luhã Ct;	i Lí ϊ 3.	r Citocina	% do Nível	í“I ~ Ί~ pr» ϊ-i wi %«/ ώ ι : U C.	'“-ÒC	dp Controlo
			14 U / m 1	42 U/ml		125U/ml
HDK-1		IFN-Γ	a-7, o	29» 1		·{ O z. 2 u u
		IL-2	*7 ·? ~ / i - /	ςα Ã t-i 7 p O		40,4
		1infotoxí	na 41,9	45,1		'^1' 2 n d
		IL-3	5 ··	52 £ ò		38,4
		8M-CSF	06 Q u·λ_ί tj f	79,1		66,8
MD13-10		IFN-Γ	36,0			ητ --J AÍ.·.-1 AÍ.
		IL-2	m·—t Ou.- ?	109,3		96,0
		IL-3	60,2	6-5,0		51,0
		15 M *” C -3 F	1©9,0	119,9		97,6
Exemplo	11»	Construção de	ufiis B i h ϊ i o t.ec s.	de cDNA	d<=?	Células DÍ0 e
	Isolamento da Clone	pc D (S-Kc-t) —	Pí 1 J A. X	5

Uonstrulu-se uma biblioteca de cDNA no vector pcu(SRs) »owa 4-j.-, ,-i.-. células Dl®, descrito em Kaye et a partir al», 3» Exp, Med

Vol» 158, po 836 (Í983), de acordo com o método de Okayama e Berg, Mol» Cell» Biol» 2s161-1/0 (1982) e 280—289 (1983), também descrito na Patente U.S» 4,< aqui é incluido como referência» Os vsctores pcDCSRct ) portadores de inserções de cDNA foram amplificados em E» coli» 0 DNA dos plasmídeos foi extraído a partir de conjuntos destes clones repicados ao acaso e usado para transfectar células COS 7 de macaco como descrita abaixa» Os sohrenadantes das células COS 7 foram então testados quanto à actividade de CSIF» As células COS foram transfectadas coma se seques Um dia antes da transfecção,

Um dia

100 mm em meia de Eaqlé modificação de % de soro fetal de vitela CFCS) e 2mM a transfecção, as células COS 7 foram em placas individuais de Dulbecco (DME) contendo 5’ qlutamxna= Para BT@ctust removidas das placas por incubação com tripsina, lavadas duas vezes· sm DME sem soro s rsssuspsrtsas para 10 cé.lulas/ml sm Drfc sem soro» Uma amostra de ®,75 ml foi misturada com 20 pg ds i)NA s transferido para uma cuvets de electroporaçSo esterilizada de x-,4 cm. Após 1Θ minutos, as células foram submetidas a um pulso de 200 volts, 960 pF numa unidade BioRad Sene Fuiser. Apôs mais 10 minutos, as células foram removidas da cuvete e adicionaoas a 20ml de DME contendo 57. FCS, glutamina 2mM, penicilina, estreptomicina e gentamicina. A mistura foi distribuída por quatro placas de cultura de tecidos de 100 mm. Após 12-24 noras a 3/ L, 30. Cu.-,, o meio foi substituido por meio semelhante contendo apenas ll» FCb e a incubacão continuou durante mais 72 horas a' 37~C, 5% LU,,, após o que o meio foi colhido e testada quanto à actividade ds CSIF» Subsequentemente , a sequência da maior grelha de leitura aberta da inserção de cDNA do pcDCSRct)— 1115 fax determinaaa como S·© SSQUS 5

5’

ATGCCIGGCT

GATCAGCAGG

CAGTOGGCCA

GTGAAGACTT

OGACTCCITA

OGGAAATGAT

CATGGCCCAG

GAOCCIGAGG

ATAAGAGCAA

GACCAAGGTC

CATAGAAGCA

CAGCACIGCT

GGOCAGTACA

GAGOCACATG

TCTTTCAAAC

AIGCAGGACT

CCAGmTAC

AAATCAAGGA

AIGOGGCTGA

GGCAGTGGAG

TCTACAAGGC

TACATGATGA

ATGCIGOCIG

GCOGGGAAGA

CTOCTAGAGC

AAAGGACCAG

TTAAGGGTTA

CTGGTAGAAG

GCATTIGAAT

GGCGCIGTCA

CAGGTGAAGA

CATGAATGAA

TCAAAATGAA

CTCITACIOA CIGGCAIGAG CAATAACTGC ACOCACITOC TGOGGACIGC CITOAGCCAG CTCGACAACA TACTGCTAAC

CTTGGGITGC

TGATGCCOCA

TOCCTGGGIG

TOGATTTCTC

GTGATnTAA

ITTGACATCT

AAGCTAA

CAAGCCITAT

GGCAGAGAAG

AGAAGCTGAA

COCIUIGAAA

TAAGCTCCAA

TCATCAACTG

-3' ;

e a sequência de aminoácidos da proteina CSIF de ratinho madura determinada pelo algoritmo de Heijne e como se segue;

QYSREDNNCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQL DN ILLTBSLrÍQDFKG¥L.SCSALSEMIQFYLVEvMPQAEKH GPEI KEHLNSLGEKLKTLRMRLRRCHRFLPCENKSK A VEQ V

KSDFNKLQDQG VYKAMNEFD IFINCIEAYMMIKMK8,

Exemplo III, .Despiste das bibliotecas de cDNA relativamente a CSIF humano usando sondas derivadas de pc.D(SRp:)-FÍ 15; Isolamento ds pH5C e de pH15C

Construiu-se uma biblioteca de cDNA sm pcDÍSRa} a partir de mRNA extraído ds um clone de células T humanas e fez-se o seu despiste com uma colecção de oliqonucleotídeos 70—meros cujas sequências eram complementares das cadeias codificadoras ε não codificadoras do fraqmsnto do gene CSIF de ratinho codificador de CSIF madura» Usaram-se protocolos de hibridação convencionais, e,g= colónias bacterianas cultivadas sm placas ds Petri de 150 mm foram transferidas para membranas SeneScreen, tratadas com as sondas oligonucleotidicas marcadas radioactivamente, lavadas, depois expostas a filme de raios X» As sondas foram hibridadas em condiçSes de restrição baixa para'o tamanho das sondas: a pré-hibridação consistiu em incubação dos ácidos nucleicos alvos em 5x SET í20x SET é 3h1 NaCl ·*· 0₃4 Tris-Cl ípH 7_?8) + 20mi*í EDTA) a ó0^uC, seguido de hibridação nas mesmas condiçSes e lavagem em 5x SET a 50°C» Foram ,identificados dois clones portadores dos plasmideos pH5C e pH15C, Ambos os plasmideos expressaram proteínas em células COS 7 que foram capazes de inibir a síntese de IFN—Γ em PBLs humanos estimulados cora PHA»A inserção ds cDNA de pH15C está ilus' sua maior grelh

baixos = de leitura aberta está apresentad

S- ATGCACACCT goocagooca CAOGCAAOCT GIGAAGACTT GGAGTCCITG CTGAGAIGAT CAAGAOOCAG GAOCCTCAGG ACAAGAGCAA GAGAAAGGCA CATAGAAGCC

CAGCACIGCT

GGOCAGGGCA

GGCTAACATG

TCITTCAAAT

CTGGAGGACT

OCAGITITAC

ACATCAAGGC

CIGAGGCTAC

GGCOGTGGAG

TCTACAAAGC

TACATGACAA

CBjnGGCTG

OCCAOTIGA

CTTCGAGATC gaaggatcag

TTAAGGGTTA

CTGGAGGAGG

GCATGTGAAC

GGOGCIGICA

CAGOIGAAGA

CATGAGIGAG

7CAAGATACG

GICCIOCTGA

GAACAGCTGC

TCOGAGA7GC

CTGGACAACT

OCIOGGnGC

TGAIGCCOCA

T0CCTO3GGG

TOGAITICrr

ATGCCTITAA

TTTGACATCT

AAACTGA

CIGGQGTCSAG

AOOCACnCC

CHCAGCAGA

TGTIGTTAAA

CAAGGCTIur

AGCTGAGAAC

AGAACCIGAA

OOCTGTGAAA

TAAGCTCCAA

7CATCAACTA

4’ .

Exemplo IV. ftn t i co r pos moo oo 1 on -a i •=j esyfiL i tIC y?ara

Uni to Lewis macho foi muiiuadu prap3r=çcS5 expresso em células COS 7. 0 rato imadamente 5Ôpg de CSIF humano em dadas injecçSes de memória duas material em Adjuvante Incompleto .s de sangue para testar, A cada memória final de 25 pg em tampão as mias- tarde retirou-se o baço semi-purifiçadas de CSIF humano foi primeira imunizado com aprox Adjuvante Completo de Freund e vezes com a mesma quantidade de de Freund, Retiraram-se amostra animal foi dada uma injecção de de fosfatos salino e quatro di para a fusão,

Aproximadamente 3 X 1© ' esplenócitos de rato foram fundidos com um número igual de células de mieloma P3X63—AB8.Ó53 de ratinho (adquiridas à ATCC com o número de acesso CRL 158Θ),

3840 cavidades ds placas- ds microtitulacSoforam semeadas a 5,7 x 4

1©’ células de mieloma parental por cavidade. Sequiram~se protocolos convencionais para a fusão e subsequente cultura dos híbridos, e,q= como descrito oor Chretien st al, d₅ Immunol

Meth», Vol» 117» pgs» 67-81	(1989) » 12 ’di.âs‘ após a fusão	os
sobrenadantes foram colhidos.	e testados qor ELISA indirecta	em
placas de PVC revestidas com	CSIF humano produzido em céli	.ϊ 1 as
Γ;Π87 . Dj=<=>tj» mnrin irlpnHfirnn-	-se o hibridoma JES3-19FÍ que	'35?

depositou na American Type Culture Collection» foram

Us hibr se 1 ec i on ad oidomas produtores de anticorpos bloqueadores s a partir dos hibridomas despistados inicialmente quanto à sua capacidade par contrariem a inibição induzida por C PBLs humanos estimulados com PHA» produzir anticorpos que F da síntese de IFN—Γ em

Exemplo V

Expressão de CSIF humano num hospedeiro bac ter i ano

Um gene sintético de CSIF humano foi montado a partir de vários fragmentos de DNA de cadeia dupla, obtidos por síntese química, para formar um vector de expressão designado TAC-RBS' hCS1F = A clonaqem expressão foram· efectuadas num sistema :oli K—12 estirpe uMlVÍ, Messinq» em Gene, Vol» bacteriano convencional, por exemplo E,

JM103 ou similares, descrito por Viera e 19, pgs» 259-268 <1982/, restrição e‘ reacções com ligase foram efectuadas usando protocolos convencionais, e»g = Maniatis et ai». Molecular Clonings A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 19825»

Usou-se o método alcalino (Maniatis st al», referido atrãs) para as preparações de plasmídeos em pequena escala» Para as preparações em escala maior usou—se uma modificação do método alcalino no qual se usa um volume igual de isopropanol para precipitar os ácidos nucleicos do lisado clarificado» A precipitação com acetato de aisõnio 2,0 M foi usada para remover RNA

antes da centrifugação em gradientes de equilíbrio de cloreto de césio e detecção com brometo de etxdio»

Par-a nioritíacõeí em filtros usaram-se filtros circulares de Whatman 54® para reter colónias que foram então Usadas e fixadas por tratamentos sucessivos com NaOH 0,5 M, l,3íj NaCl? IM Tris..HCl pH8,0, í,5M NaCl (2 min cada) s e aquecimento a 80°C (30 min). As hibridações foram em òxSSPE, 20% formamida, @,1% dodeciIsulfato de sódio (SDS), ÍW mg/ml de tRNA de E. coli, 100 mg/ml de Coomassie Brilliant Blue S-250 (Bio-Rad) a 42’~'C durante ó hrs usando DNAs sintéticos marcados com f os f u rz 1 ados). CPreparou-se 2®xSSPE dissolvendo 174 g de Natl, 7,4 g de --m ww «ii de égua? o pH foi ajustado a 7,4 com NaOH, o volume foi ajustado a 1 litro e a solução foi esterilizada por autoclavagem)= Os filtros foram lavados duas vezes (15 min, à temperatura ambiente) com íxSSPE, 0,1% SDS» Após autorradiografia (filme Fuji RX), as colónias positivas foram localizadas alinhando as colónias que cresceram novamente com as colónias coradas de azul nos filtros» 0 DNA foi sequenciado pelo método didesoxi, Sanger et al», Proc» Natl -Acad» Sei», Vol» 74 = Os moldes para as reacções didesoxi sao DNAs de om interesse reelonados nos vectores

Núcleic Acids Res»» Vol- 9.

EDTA e 27,ó g de NaH^PQ^»9Η...Π em Stítí ml de ag pg cadeia simples ds reoiSss

MÍ3<jk .ρ» Nsssing et (1981) ou DNA de cadeia dupla preparado pelo mini-método alcalino e desnaturados com 0,2M NaOH (5 min, temperatura ambiente) e precipitados a partir de ®,2ij NaOH, acetato ds amónio 1,43N» pela adição de volumes de etanol» 0 DNA foi sintetizado usando síntese química de fosforamidetos com sintetizadores Applied Biosystems 380A. A sítese, desproteção, clivagem e purificação (PA8E em ureia 7H, eluição, cromatografia em DEAE-celulose) foram feitas como descrito no manual do sintetizados-^- 3BDA» clonados

As cadeias complementares de DNAs sintéticos a serem (4v@ ng de cada) foram misturadas com e fosfGriladas com polinucleotideo-cinase num volume de reacção de 5© ml. Este DNA foi ligado com í mq ds DMA vector digerido com enzimas de restrição adequadas e as ligações foram feitas num volume de 5© ml â temperatura ambiente durante 4 a Í2 hc-ras. A? fosforilação, digestões com enzimas de restrição, polimerases eligação foram já descritas (Maniatis et al =, referido atrás). Contaram—se as colónias lacZ·»· (quando desejável)semeando-as em agar L suplementado com ampicilina, isopropil-í-tio-beta-D-galactosido (IPiG) (©,4 mM) e 5-bromo-beta-D-galactopiranosido íx-gal) (4© mg/ml).

condições vector TAC-RBS foi construído por preenchimerd com

DMA-polimerase, do único sítio BamHI do plasmídeo pDR54© portador de tacP (Pharmacia), Este foi então ligado a oligonucleotídeos sintéticos não fosforilados (Pharmacia) que forma um DNA de cadeia dupla codificador de um sítio consensus ds ligação aos ribossomas (RBS, GTAASSAGSTTTAAC)« Após ligação, a mistura foi fosforilada e religada com o adaptador SstI complexo foi então clivado com SstI e EcoRI e o pb isolado por electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e clonado em pUCÍ9 (Pharmacia) cortado com EcoRI-SstI (como descrito abaixo), A sequência das regiões RBS-ATG-poli-adaptador da construção final (designada TAC-RBS) está apresentada na Figura em oito inserçõe* do pUC19

AitíAGCTcAT, τragmen co de

Este 1 / -5 □ gene dólr sintético foi moncaoo num pl· passos» Em cada passo as inserções sem foram dstectadas na mesma grelha d·

P^: s cicoagem mantendo o leitura do codão de inserido no passo ί, Eh e/ou inserção podem ser c1ones c on t endo a1teraçSes detectados pela observação da

SfflídeO uUCl9 de1eccõese/ou gene iacZís)-niciação ATS deleção colónias

azuis em piscas ds ampicilina contendo x~gal e IPiu» Como alter1 ító LiV {?.» èrfíii cada passo as sequências das inserções podí facilmente confirmadas usando um iniciador de iniciação universal em preparações ds DNA de plasmideo em pequena escala, e»g» que pode ser adquirido â Boehringer Nannheim»

No passo 1, vector TAC-RBS foi digerido com SstI,

DNA-paiimers.se de T4

r -So-5 d	í4 (cuja act
protuber	{Sn ts?s o * ccs
extremas	cerses) e
ΐΓ·3 t-B-dO	com EcoRI pa

o-aos corres com Ssr.

para de 173 pb contenda uma região TAC-RBS s tendo um extremo csrse no codão de iniciação AT6 e um corte de EcoRI no extremo oposto» Finalmente, isolou-se o fragmento TAC-RBS de Í73 pb.

No passo 2 o fragmento TAC-RBS isolado do passo 1 foi misturado com o plasmideo pUC19 digerido com EcoRI/ΚρηΙ e o fragmento sintético 1A/B que, como se mostra abaixo, tem um extremo a jusante correspondendo a a jusante» Este extremo Kpnl ρ,ίοΠ1.3.ΠΗ ίΛΙΓϊ cíX‘t.r*‘3itíO líjBc-IVu H um corte com Kpnlno ccu extremo a ê adjacente ao sítio BstEII e a jusante dele» Os fragmentos são ligados para formar o pUC19 do pô.sso 2«

No passo 3 os fragmentos sintéticos 2A/B e 3A/B Cmosdo passo 2 (após amplificação

om	i f d I. Q S r X d O	com Bs tfc. Ii/
	pu r i Τ x c -sç So) s	ligados
'SS	Q U.S Ο S X t rSíBQ	a j usan te

fragmento 3AZB contem bases extra que formam o extremo cerse Smal» Estas bases extre são clivadas no passo 4» Também os fragmentos 2A/B e 3A/B têm extremos de cadeia simples complementares de nove resíduos que emparelham quando misturados» deixando '•‘TV'

3Α/ΊΒ para ligação ao pUC19.

No passo 4 pUC-19 digerido (após amplificação e purificação) misturado com o fragmento sintético ligado para formar pUC19 do passo 4.

oom As 111 ζ Xuai foi novamente

4A/Β ( mos trado do pass»_í 3 purifiçado, abaixo) e

No passo 5 pUC19 digerido com Xbal/Sall do (após amplificação e purificação) foi misturado com o sintético 5A/B (mostrado abaixo) s ligada para formar o pUC19 do passo 5» Note-se gue o extremo coesivo Sall do fragmento 5A/B foi eliminado por digestão com Hpal no passo 6,

No passo ó pUCÍV digeri (após amplificação e purificação) sintético è-A/B (mostrado abaixo) ε passo 6 do com Hpal/PstI do foi misturada com o ligado para formar o

No passo 7 pUCí9 digerido c (após ampliiicação ε purificação) sintético 7A/B (mostrado abaixo) e passo z»

Clal/S«hl dc foi misturado CQia O ligado para formar o pâisteU -S fraqmento f ragmento pUCÍ9 do fragmen to pUC19 d «o

No passo		pUC19 d iqeri do	c om Μ1u/Hi ndIII do	passo 7
í após amo1i ficação	O	purificação) foi	misturado com os f?	'•agmen tos
sintéticos 8A/B e	9A.	ZB e ligado para	formar a construção	final, A

construção final foi inserida em E» coli K-l disponívelna ATCC com o número de acesso estirpe dri 1 ® 1, e.g. 876, por técnicas convencionais, Após cultura, a proteína foi -extraída das JMÍ0Í e diluições dos extractos foram tes-tadas células quanto à actividade biológica.

AGCCCAGGCC

TCBBBTCCBB

ABBbCAdCCa

TCCCBTBBBT

GTCTSABAAC

CABACTCTTB

ASCTGCACCC ACTTC TCBACBTBBB TBAAS·

CCAGtítAACC gg tac

BBT CCaT i BB c

Ft aQífifcíii Lo 1A>

StAACCTGCC

BACBS

TAACATGC!T AI Ttí iAuoAA

CGAGATCTCC

SCTCTABAGB

GAGATGCCTT CAGCA CTCTACBBAA BTCGT

BAGTGAAGAC

CTCACTTC

TTTCTTT t-ragmento 2A/B i GAAaGAAa

CAAATGAABG ATBAGCTGGA

GTTTACTTCC TAGTCGACCT

CAACTTGTTc TtAAG iABTCGACCi AaiTu

Fragmento 5A/B

GAGTuCI i BC	í SBPíBGAB IT	TAABtítíT i Ac	CTGSB-TTBCC	AAGCC
CTCAGGAACG	AcC S CCTGAA	ATTCCCAATG	GACCCAACGG	TTCGG
TTGTCTGASA	TBATCCAGTT	TTAt
AACAGACTCT	ACT AGGTCAA	AATaGAtC

Ό1

F raoisen to 4A / B

CIaGAGGAtíS GAtCTCCTCC

TGATGCCCCA ACT ACGGGGT « λ m-s» /«·. λ r. Λ λ .·**.

Htít-- ! oHohRi,

TCGACTCTTG

UAAtóHtítítíAS ACA7 C

GTTCTtáGGTC TíátAG

AAtítíCGCATG TTCCGCGTAC ί LAACy

AaTTGcaqct r v tíOíisen Lu 5AZ

AACTCCCT8G

TTGAGSGACC

GGGAGAACCT

CCCTCTTGBA

GAAGftCCCTC

C ΓΤu iGGG AG

AGGCTGA66C TCCSACTCCS

TACGG

CGCTGTCATC BCGACAGTAG

SAιctgca CTAq hraqffigitp óA/íá

CGATTTCTTC

T AAAGAAG

ClíT tíT CAftAft GtíAtíAGTTI7

CAAtíAtíCAftG

GTTCTCGTTC

GCOtíTtítíAtíC AGS i tí CGGCACCTCG TCCAC

HAGAHCGGEj Γ I TC 11qCGcA

CBCGTTTAAT

AAATTA

Fraqmento /AZ.8

AATAASCTCC

TTATTCSASS

TTCTSTTTCÍ lailtmlmaa

ST AGATGTTT

SGTASAGTGAGTTT BAC CTCA

Fragmento SA/B

C ITCAAACTB

ATCTTCATCA IABAAb' iABi

ACT ACATASA

ASCl; I ACATG

UÍ3Í3H ϊ 13 I hl..·

AC-AATi tí i T H“ tíAAGATACBA

CTTCTAT6CT

AACTGA FTGACTtcga f raqmento (As letras minúsculas indicam qus uma base difere da correspondente na sequência nativa).

Exemplo VI

Anticorpos específicos para o peptídeo

CENKSKAVE (e.q. ml de

5Θ mg de ovalbumina (OVi dquirida à Sigma) foram di: bicarbonato ds sódio 0_?l

solução de iodoacetamida	0.13 M (88 mg	d©	iodo
da em 4 ml de bicarbon,	ato de sódio	0gí	M)
temperatura ambiente num	tubo Falcon	d©	15ml

cetamida durante (Falcon bri

i) tí 50 mg ds «iiugíobulxna (SfY-O) .solvidas individualmente em 10 Me reagiram com i ml de uma dissolviΡ 1 -Scõ t i C a

Oxnard dializ

CA) ou similares, da durante a noite conc uma das misturas de reacção foi . 4 litros ds bicarbonato de sódio

Separamente, i© mg ds ChNKsKAVE foi dissolviam em

Ο.—.

, i M â 4 !_r = ml ds uma solução ds DTT íditiotreitol) €·,! M (contendo Tris mM e 2,5mM EDTA a pH8) num tubo ds 4 ml, incubado a 37^UC depois aplicado numa coluna ds filtração em gel SF®5 (1,5 x 26,5 cm) (LKB, Bromma, Sweden) e eluido com um tampão de eluição de peptídeos consistindo em ácido acético 0,015 M e beta-mercapto— etanol 0,005 M, Três fracções de aproximadamente contendo o peptídeo reduzido foram identificadas óptica a 206 nm, colhidas, reunidas, congeladas em neve carbónica e liofilizadas durante a noite,. Entretanto OVA e MYD foram recuperadas da diálise e clarificadas por filtração através de filtros de 0,45 micras, OVA e MYO foram activados misturando cada uma com 380 microlitros ds éster de hidroxi—succinimida do áucido iodoacético CNHIA) (descrito por Reetor et al», em J» Immunol, Meth., Vol, 24, pg. 321 í19787))dissoivido em tetra-hidrofurano (THF) (5 mg/ml), agitando durante 3® minutos â temperatura ambiente e diálise durante a noite contra 4 litros de PBS (1,8 g de iMaHbjFO,,— FL/O, 7,2 g de Na^HPO^^Of e 34 g de NaCl em 4 litros de Η.-,Ο) „ Ssparadamente o peptídeo liofilizado foi ressuspenso em 5 ml de tampão de redução borato (2 g de Na_?B4p^,ÍOH^O, 17,4 g de NaCl e 336 mg ds EDTA-Na^em um litro de água com o pH ajustado a concentrado, desoxigenado sob azoto durante 15 o que se adicionou 17S mq de ascorbato), As OVA e o© e

ml cada densidade

8,5 com HCl m i n utos, após

MYO iodoacstiladas dialisadas foram recuperadas, separadamente misturadas com iquais volumes (ds preferência 2 ml) de tampão de redução borato contendo o peptídeo e incubado durante a noite è. temperatura ambiente, Qs conjugados resultantes foram analisados por SDS-PAGE (gel de 12,57»), A solução contendo o conjugado foi diluida com PBS para í mg/ml, esterilizada por filtração e disxriouxda em volumes pequenos (e»g = 50® microlitros) para as imunizações e/ou guardada & 4~C= Produziram—se anti—soros poli— clonais contra o conjugado de MYO em ratos e em coelhos (New Zealand White)» □ protocolo de imunização para os coelhos é o

seguintes Inicialmente (semana 0) retirou-se uma amostra de soro para usar como testemunha» Uma semana mais tarde (semana 1) misturou-se ô,5 ml do conjugado peptídeo-veículo com ô,5 ml de Adjuvante Completo de Freund e injectou—se intraperitonealmente» Três semanas mais tarde (semana 4) deu—se uma injecção de memória consistindo em 0,5 ml de conjugado peptídeo-veículo misturado com 0,5 ml de -Adjuvante Incompleto de Freund» Na semana seguinte (semana 5 ) deu—ss uma outra injecção de memória», consistindo novamente em 0,0 ml do conjugado peptídeo-veiculo misturado com 0,5 ml de Adjuvante Incompleto de Freund, seguido ainda de- uma outra injecção de memória idêntica na semana seguinte (semana ó>» Na semana 7·,· tirou—ss 20 ml de soro ao animal» Após separação da fracção celular o -=>oro iui dos i t i vos an t i—CENKSKAVE» astsdo por ELISA quanto aos títulos procedeu se de modu semeinante para, a íhjuhizaçao de ratosexceptuando a injecção inicial consistir em 0,15 ml de PBS e O,! ml de conjugado -peptídeo-veículo misturado com 0,75 ml de Adjuvante Completo de Freund, as injecçSes de memória consistiram 0=15 ml de PBS e 0,1 ml de conjugado -peptídeo-veículo misturado com 0,75 ml de Adjuvante Incompleto de Freund e apenas 2—3 ml de soro foi retirado do rato» Novaments reacção positiva anti-CENKSKAVE= por i oh detec se um«

-As descrições das realizações precedentes do invento foram apresentadas apenas com fins ilustrativos e descritivos» Elas não -se destinam a ser exaustivas ou a limitar o invento às formas precisas aqui descritas e óbviamente muitas são possíveismuitas muitas modificações e variações- face aos ensinamentos dados·» As realizações foram escolhidas- e descritas de modo a explicar melhor os princípios- do inventa para permitir que outros familiarizados com a matéria o melhor utilizem em várias realizações- e com várias modificações conforme adequado à utilização com

particular contemplada» Pretende-se que o âmbito do invento seja definido pelas reivindicações apensas»

Os requerentes depositaram separadamente E„ coli MC1061 portadora de pcDC SRcO-Fl 15, pH5C e pH15C na. American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA ÍATCC) com os números ds acesso 68027, 68191 e 68192, respectivamente» Estes depósitos foram feitos em condiçSes requeridas pelo acordo da ATCC para o Depósito de Culturas para fins de Patentes, o qual assegura que os depósitos fiquem disponíveis para o US Commissioner of Patents and Trademarks correspondendo a 35 USC 122 e 37 CFR í»14 e ficarão disponíveis ao público quando da publicação de uma patente US, o que requere a manutenção dos depósitos» A disooni— bilidade da estirpe depositada não deve ser pensado com uma licença para executar o invento infringindo os direitos- reservados- à autoridade de qualquer governo de acordo com as suas leis sobre patentes»

Os depósitos foram modificados para estarem de acordo com os requesitos do Tratado de Budapeste sobre o Depósito de Mxc roorqanismos»

Claims (3)

1. REIVINDICACSES:

   Método para produção de um polipeptídec actividade de factor inibidor da síntes* i ua.ii tas.

   ren ao aracterizado por contprender os passos des :3o de

   b.i—· compreendendo uma sequência de nuc1eotídeos codif icsdora sequência de nucieotideos d o r eferido poli peρ t í deo, e capaz de ser expressa por

   SÍB um que a hospedeiro contendo o vector e em que a sequência de codifica polipeptídeos tendo actividade de factor síntese de citocinas?

   nucIeotídeos inibidor da incorporação do vector num -hospedeiros manutenção do hospedeiro num meio de cultura em condições adequadas à expressão da sequência de nucieotideos para dar o referido polipeptídeo» *c©rizãqq por poli pe ρ t í d eo ro..

   - Método de acordo com a reivindicação incluir ainda o passo de separação do do referido meio de cultura e do referido

   5_«& f referido nospedeiterizado por polipeptídeo de mamífero»

   - Método de incluir aindi su bs tan ciaimer acordo com a reivindicação ίcaraco pass-o ds isolamento do referido te livre de quaisquer outras proteínas

   4â» - Método de acordo ções 1 a 3, caracter.izado por síntese de citocinas de mamífero com qualquer uma uss t eivmdií_a o referido factor inibidor da sei- o í actor imoidor da. sxncese ds citocinas humano substancialmenLe livra da quaisquer outf as proteínas humanas.

   oã« — Método de acordo com a reivindicação 4. caracterizado oor a sequência de nucleotídeos ser seleccionada partir do grupo que· codifica polipeptídeos maduros da grelhai da- leitura aberta definida pela sequência de amino-âcidoss

   MHSSALLCCL

   LRDLRDAFSR

   QALSEMIQFY

   LRLRRCHRFL

   FDIFINYIEA

   VLLTGVRASP

   VKTFFQMKDQ

   LEEVMPQAEN

   PCENKSKAVE

   YMTMKIRN.

   GQGTQSENSC

   LDNLLLKESL

   QDPDIKAHVN

   QVKNAFNKLQ

   THFPGNLPNM

   LEDFKGYLGC

   SLGENLKTLR

   EKGIYKAMSE

   Método de acordo :om

   Sivinoic aç «u cara terizado por o referido factor ini humano ser definido pela sequência bidor da síntese de de aminoãcidoss citocina

   SPGQGTQSEN

   DQLDNLLLKE

   ENQDPDIKAH

   VEQVKNAFNK

   SCTHFPGNLP

   SLLEDFKGYL

   VNSLGENLKT

   LQEKGIYKAM

   NMLRDLRDAF

   GCQALSEMIQ

   LRLRLRRCHR

   SEFDIFINYI

   SRVKTFFQMK

   FYLEEVMPQA

   FLPCENKSKA

   EAYMTMKIRN

   7â= - Método de acordo com a reivindicação terizado por o referido factor inibidor da síntese de humano ser codificado pela sequência carac de DNA

   5'- ATGCACAG<CAGCACTGCT CTGTTGCCTG GTCGTCCTGA CTGGGGTGAG

   GGCCAGCCCA GGCCAGGGCA CCCAGTCTGA GAAGAGCTGC ACCCACTTCC

   CAGGCAACVT GCCTAACATG CTTCGAGATC TCCGAGATGC CTTCAGCAGA

   GTGAAGACTT tctttcaaat gaaggatcag ctgcacaact tgttgttaaa

   GGAGTCC'J'TG CTGGAGGACT TTAAGGGTTA CCTGGGTTGC CAAGCCTTGT

   CTGAGATGAT CCAGTTTTAC CTGGAGGAGG TGATGCCCCA AGCTGAGAAC

   CAAGACCCAG acatcaaggc gcatgtgaac tccctggggg agaacctgaa gaccctcagg ctgaggctac ggcgctgtca tcgatttctt ccctgtgaaa acaagagcaa ggccgtggag caggtgaaga atgcctttaa taagctccaa

   GAGAAAGCCA TCTACAAAGC CATGAGTGAG TTTGACATCT TCATCAACTA

   CATAGAAGCC tacatgacaa tgaagatacg aaactga -3’.

   ção i a 3 c i toeinas citocinas

   8â, - Método de acordo com qualquer uma das caracterizado por □ referido inibidor da de ísaniitero ssr um factor inibidor da de ratinho.

   ~ Método de acordo com a reivindicação r e i v i n d i c a— síntese ds síntese de caraccerizauo p-cr o referido factor inibidor da síntese de citocinas de ratinho ser definido pela sequência de aminoãcidoss

   QYSREDNNÇT HFPVGQSHML LELRTAFSQV KTFFQTKDQL DNILLTDSLM QDFKGYLGCQ ALSEMIQFYL VEVMPQAEKH GPEIKEHLNS LGEKLKTLRM RLRRCHRFLP CENKSKAVEQ VKSDFNKLQD QGVYKAMNEF DIFINCIEAY MMIKMKS.

   'J/

   103» — Método de acordo com a reivindicação rizado por o referido inibidor da síntese de citocina· ser definido pela sequência de aminoácidos5

   C -3. Γ«&C ds ratinho

   ATGCCTGGCT

   GATCAGCAGG

   CAGTCGGCCA

   GTGAAGACTT

   CGACTCCTTA

   CGGAAATGAT

   CATGGCCCAG

   GACCCTCAGG

   ATAAGAGCAA

   GACCAAGGTG

   CATAGAAGCA

   CAGCACTGCT

   GGCCAGTACA

   GAGCCACATG

   TCTTTCAAAC

   ATGCAGGACT

   CCAGTTTTAC

   AAATCAAGGA

   ATGCGGCTGA

   GGCAGTGGAG

   TCTACAAGGC

   TACATGATGA

   ATGCTGCCTG

   GC.CGGGAAGA

   CTCCTAGAGC

   AAAGGACCAG

   TTAAGGGTTA

   CTGGTAGAAG

   GCATTTGAAT

   GGCGCTGTCA

   CAGGTGAAGA

   CATGAATGAA

   TCAAAATGAA

   CTCTTACTGA

   CAATAACTGC

   TGCGGACTGC

   CTGGACAACA

   CTTGGGTTGC

   TGATGCCCCA

   TCCCTGGGTG

   TCGATTTCTC

   GTGATTTTAA

   TTTGACATCT

   AAGCTAA

   CTGGCATGAG

   ACCCACTTCC

   CTTCAGCCAG

   TACTGCTAAC

   CAAGCCTTAT

   GGCAGAGAAG AGAAGCTGAA CCCTGTGAAA TAAGCTCCAA TCATCAACTG -3' .

   llã» - Processo para a preparação de um ácido nuclsico qus codifica um polipsptídeo tendo actividade de factor inibidor da síntese de citocinas, caracterizado por compreender os passes des isolamento do mRNA que codifica pelo menos parte do referido polipeptideo a partir de uma linha de células adequada?

   construção a partir daí do cDNft? e inserção do referido cDMA num vector adequado, cracterizado por factores e por o

   Processo de acordo com a reivindicação o mRNA codificar um determinado número processo incluir os passos des

   1 , de inserção da referida biblioteca de ciíNft num vector adeauado?

   amplificação do referido vector num hospedeiro adequadetecção no referido hospedeiro de vectores expressando pelo menos uma parte do referido polipeptídeo;

   e selecção dos hospedeiros que transportam vectores expressando pelo menos uma parte do referido polipeptídeo»

   1 ·.’-*a λ rrocesso oe áuurdo clígi r ixfjLvínm-caça.Q lz, caracterizado por incluir ainda os passos tíe§ isolamento dos referidos hospedeiros de cDNA selecciondos codificando pelo menos uma parte do referido polipeptídeo?

   :ao menos uma parte do cadeia simples?

   das estirpes do referido DMA referido polipeptídeo para codificando pelo ;e obter DMA de procura de um mRNA de comprimento total codificando todo o polipeptídeo por hifaridaçao com o referido DMA? de cadeia simples 5 construção do cDNA a partir do cDlMA de comprimento total?

   e inserção do referido cDNA num vector adequado.

   ν

   14sL· — Processo de auurúa ι_·_ίίτ· a reivindicação 13, caracterizado por o DNA de cadeia simples e o mRNA de comprimento total pertencerem a espécies diferentes de mamíferos» i5é» — Processo de acordo com as reivindicações 13 ou 14, caracterizado por incluir ainda o passo des isolamento do DNA codificador de todo o peptídeo por clivagem do vector com nucleases de restrição adequadas» is

   Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações ií a 15, caracterizado por o cDNA codificar um peptídeo tendo actividade de factor inibidor de sintese de citocinas humano»

   17ã» — Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações íí a 15» caracterizado por o cDNA codificar um peptídeo tendo actividade de factor inibidor de sintese de citocinas de

   18ã» — Método de tratamento de um doente para controlar uma doença associada a uma resposta imune ligada a MHC, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade eficaz do factor inibidor da síntese de citocinas humano»

   19ã» — Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o referido passo de administração incluir a libertação intravenosa de uma quantidade do referido factor inibidor da sintese de citocinas humano na gama de aproximadamente i-í® pg/kg de peso do corpo do referido indivíduo»
2. 2®ã= - Método de supressão de uma resposta imune mediada por células num doente, caracterizado por compreender a o a.

   administração de uma quantidade efioaz de factor inibidor síntese de citocinas humano»

   211» — Método de supressão de uma. resposta imune humoral num indivíduo, caracterizado por compreender a administração ds uma. quantidade eficaz ds um antagonista do factor inibidor da sintese de citocinas humano»

   221» — Vector de expressão carcterizado por ser capaz de expressar uma. proteína factor inibidor da síntese de citocinas humano num hospedeiro»

   CSC ça.o

   231» - Vector ds expressão ds acordo com a reivindicairacterizado oor o referido hospedeiro ser mamífero»

   241» — Vector de expressão de acordo com a reivindicaearacterizado por o referido factor inibidor da sintese ser um factor inibidor da sintese de citocinas de ci zoe .ina humano»

   251» - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por ser seleccionado a partir dp qrupo constituido por pH5C e pH15C»

   ÇciU Zl ,

   261» — Vector de expressão de acorde? com s. reivindica:aracterizado por o referido hospedeiro ser bacteriano»

   2/1» - Vector de expressão de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por o referido factor inibidor da síntese de citocinas ser o factor inibidor da síntese de citocinas humano» •ί : V

   63 w y*' Á n y -¾.

   - V ' '%?>, i· <£2b l'#· ^,'3Xa*_ww._!»_?’·'’'' ’

   2Qã» — Vector de expressão de acordo com a.' reivindicacaracterizado oor consistir em TAC—RBS—hCSIF«

   29é, ~ A» ι ί. i co r pu monuu í us ia 1, especificamente ao factor inibidor fsiflíanu»

   -50S» ~ Anticorpo monoclonal ção 29, caracterizado por o referido de citocinas humano ser definido pela caracterizado por ss ligar da síntese de citocinas de acordo com a reivindica— factor inibidor da síntese seq uênc i s de a.m i n oác i d os- s

   SPGQGTQSEN

   DQLDNLLLKE.

   ENQDPDIKAH

   VEQVKNAFNK

   SCTHFPGNLP

   SLLEDFKGYL

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3. 5iâ« - Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindica— aracterizado por ser capaz de inibir a actividade biológica do factor inibidor aa ri» citocinas humano,

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