ES2338756T3 - Un gen que codifica un homologo de glicoproteina p humana multifarmaco-resistente en el cromosoma 7p15-21 y usos del mismo. - Google Patents
Un gen que codifica un homologo de glicoproteina p humana multifarmaco-resistente en el cromosoma 7p15-21 y usos del mismo. Download PDFInfo
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Abstract
Una proteína, constituida por SEQ ID NO: 1.
Description
Un gen que codifica un homólogo de glicoproteína
P humana multifármaco-resistente en el cromosoma
7p15-21 y usos del mismo.
La invención se refiere a secuencias genéticas
que codifican proteínas que exhiben rasgos estructurales y
funcionales característicos de los miembros de la familia de la
glicoproteína P asociados con la
multifármaco-resistencia del cáncer, funciones
reguladoras inmunológicas, y funciones singulares en células madre
pluripotentes humanas y otras células tisulares progenitoras. La
invención abarca proteínas sustancialmente puras, tratamientos
terapéuticos y usos diagnósticos relacionados con estas
proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
La glicoproteína P, una bomba de eflujo de
fármacos dependiente de adenosina-trifosfato (ATP),
está sobreexpresada en células tumorales
multifármaco-resistentes (MDR). La misma reduce la
concentración intracelular de xenobióticos citotóxicos, reduciendo
con ello la eficacia de muchos regímenes quimioterapéuticos del
cáncer. La glicoproteína P pertenece a la superfamilia de
transportadores activos ABC (casete de fijación de ATP), y está
codificada por una familia de multigenes en los eucariotas
superiores. Los miembros de la familia de glicoproteínas P de
mamíferos pueden dividirse en tres clases. Las glicoproteínas P de
clase I y clase II confieren
multifármaco-resistencia, mientras que las
proteínas de clase III no lo hacen.
En los humanos, la glicoproteína P está
codificada por dos genes enlazados ("MDR1" y "MDR3") en el
cromosoma 7q21.1. MDR3 funciona como una translocasa lipídica y las
mutaciones en este gen están asociadas con colestasis intrahepática
familiar. MDR1 confiere resistencia a fármacos en las células de
ciertos cánceres. Además de estar sobreexpresada en las células del
cáncer, la glicoproteína P MDR1 se expresa ampliamente en los
tejidos humanos normales, predominantemente secretorios y
absorbentes, donde la misma funciona en diversos procesos
fisiológicos que incluyen diferenciación celular, proliferación
celular y supervivencia celular. En estos tipos de células
normales, la glicoproteína P funciona en la liberación o captura
transmembranal o de xenobióticos y ciertos fármacos terapéuticos,
pequeñas moléculas peptídicas, ciertos compuestos esteroidales, y
fosfolípidos.
La glicoproteína P es expresada también por
poblaciones de células linfoides de la médula ósea humana y la
sangre periférica. Específicamente, se ha demostrado que la
glicoproteína P se expresa en la membrana de células madre
pluripotentes, monocitos, células dendríticas, linfocitos T CD4+ y
CD8+, células agresoras naturales, y linfocitos B. En las células
inmunológicas, la glicoproteína P funciona en el transporte de
citoquinas y otras moléculas pequeñas, que son críticas para que se
produzcan las respuestas inmunológicas fisiológicas. El bloqueo
específico de la glicoproteína P puede suprimir la respuesta
inmunológica a aloantígenos y antígenos nominales. Sin embargo,
existe cierto grado de redundancia para la función de la
glicoproteína P en estos tipos de células, que apunta a la
existencia de moléculas afines adicionales no identificadas hasta
ahora.
Las células madre pluripotentes y otras células
progenitoras tisulares poseen también una actividad singular
semejante a la glicoproteína P, caracterizada por acumulación
intracelular reducida de colorantes fluorescentes, que permite el
aislamiento específico de estos tipos de células para usos
terapéuticos. No obstante, se cree que esta función no está mediada
por la glicoproteína P MDR1, sino más bien por un miembro de la
familia de glicoproteínas P afín, no identificado todavía.
A pesar del papel irrefutable de la
glicoproteína P MDR1 en la multifármaco-resistencia
del cáncer, los intentos de mejorar la quimioterapia por inhibición
de esta proteína han alcanzado sólo un éxito limitado. Así, puede
inferirse que existen proteínas homólogas que, como MDR1, son
capaces de hacer las células resistentes a los agentes
terapéuticos. Adicionalmente, puede inferirse que las proteínas MDR1
homólogas cumplen funciones semejantes a la glicoproteína P en los
tejidos humanos fisiológicos, en particular en células del sistema
inmunitario, células madre pluripotentes y células progenitoras
tisulares, donde existe cualquier redundancia para la función de la
glicoproteína P MDR1, o donde se sabe que la glicoproteína P MDR1 no
promueve la actividad observada asociada a la glicoproteína P.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención está dirigida a un nuevo miembro de
la familia de genes de glicoproteínas P humanas localizado en el
cromosoma 7p15-2, que codifican proteínas que
confieren el fenotipo multifármaco-resistente a las
células tumorales y/o atienden a funciones fisiológicas críticas en
los tejidos humanos normales.
Un examen de la estructura del nuevo gen indica
que el mismo codifica dos mitades homólogas semiautónomas, cada una
de ellas con sus propios dominios transmembranales y de fijación de
ATP. Por remodelación alternativa y expresión diferencial de genes
y/o modificaciones posteriores a la transcripción y posteriores a la
traducción, el nuevo gen de glicoproteína P puede codificar varias
glicoproteínas P distintas:
La proteína de SEQ ID NO: 1 (aminoácidos
1-659) está codificada por 14 exones (SEQ ID NO: 9)
del DNA genómico humano del clon AC005060 en el cromosoma
7p15-21 y está constituida por 5 dominios
transmembranales y un dominio de fijación de ATP.
La proteína de SEQ ID NO: 2 (aminoácidos
1-812) está codificada por 19 exones (SEQ ID NO: 10)
del DNA genómico humano de los clones contiguos AC002486 y AC005060
(AC002486 es el clon secuenciado a la izquierda del clon AC005060)
en el cromosoma 7p15-21 y está constituida por 5
dominios transmembranales y dos dominios de fijación de ATP, el
primero de los cuales está localizado en el lado
N-terminal del dominio transmembranal #1, y el
segundo en el lado C-terminal del dominio
transmembranal #5 de la proteína, en el lado opuesto de la membrana
plasmática. La proteína de SEQ ID NO: 2 puede expresarse también
como resultado de la trans-remodelación del mRNA
(SEQ ID NO: 9) que codifica la proteína de SEQ ID NO: 1 y el mRNA
(SEQ ID NO: 11) que codifica la proteína de SEQ ID NO: 3 descrita
más adelante. Adicionalmente, la proteína de SEQ ID NO: 2 puede
expresarse como resultado del procesamiento posterior a la
traducción de las proteínas de SEQ ID NO: 1 y NO: 3.
La proteína de SEQ ID NO: 3 (aminoácidos
1-131) está codificada por 6 exones (SEQ ID NO: 11)
del DNA genómico humano del clon AC002486 en el cromosoma
7p15-21 y está constituida por un solo dominio de
fijación de ATP, careciendo de dominios transmembranales.
La proteína de SEQ ID NO: 4 (aminoácidos
1-1058) está codificada por 20 exones (SEQ ID NO:
12) del DNA genómico humano de los clones contiguos AC002486 y
AC005060 en el cromosoma 7p15-21 y está constituida
por 8 dominios transmembranales y dos dominios de fijación de ATP,
el primero de los cuales está localizado entre los dominios
transmembranales #3 y #4, y el segundo en el lado
C-terminal de los dominios transmembranales #8, en
el lado opuesto de la membrana plasmática.
La proteína de SEQ ID NO: 5 (aminoácidos
1-1222) está codificada por 23 exones (SEQ ID NO:
13) de DNA genómico humano de los clones contiguos AC002486 y
AC005060 en el cromosoma 7p15-21 y está constituida
por 12 dominios transmembranales y dos dominios de fijación de ATP,
el primero de los cuales está localizado entre los dominios
transmembranales #7 y #8, y el segundo en el lado
C-terminal del dominio transmembranal #12, en el
lado opuesto de la membrana plasmática.
La proteína de SEQ ID NO: 6 (aminoácidos
1-1195) está codificada por 24 exones (SEQ ID NO:
14) de DNA genómico humano de los clones contiguos AC002486 y
AC005060 en el cromosoma 7p15-21 y está constituida
por 11 dominios transmembranales y dos dominios de fijación de ATP,
el primero de los cuales está localizado entre los dominios
transmembranales #6 y #7, y el segundo en el lado
C-terminal del dominio transmembranal #11, en el
lado opuesto de la membrana plasmática.
La proteína de SEQ ID NO: 7 (aminoácidos
1-541) está codificada por 10 exones (SEQ ID NO: 15)
de DNA genómico humano del clon AC002486 en el cromosoma
7p15-21 y está constituida por 7 dominios
transmembranales y un solo dominio de fijación de ATP, en el lado
C-terminal del dominio transmembranal #7.
La proteína de SEQ ID NO: 8 (aminoácidos
1-514) está codificada por 11 exones (SEQ ID NO: 16)
de DNA genómico humano del clon AC002486 en el cromosoma
7p15-21 y está constituida por 6 dominios
transmembranales y un solo dominio de fijación de ATP, en el lado
C-terminal del dominio transmembranal #6.
La multifármaco-resistencia del
cáncer puede resultar de la expresión de cualquiera de las proteínas
de SEQ ID NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7 y NO: 8.
Las proteínas codificadas por el gen 7p15-21 de
glicoproteína P de la presente invención pueden utilizarse como
marcadores para identificación de células que exhiben probablemente
multifármaco-resistencia y pueden servir como dianas
en el diseño de nuevas terapias para los pacientes de cáncer.
La glicoproteína P 7p15-21
confiere quimiorresistencia a múltiples agentes quimioterapéuticos,
con inclusión del cisplatino, por mediación del eflujo celular de
fármaco. Por tanto, el bloqueo específico de esta función de
eflujo, por ejemplo mediante inhibición de anticuerpos monoclonales
específicos, puede aumentar la acumulación intracelular de fármaco
y, como resultado, la toxicidad de los fármacos y la destrucción de
las células tumorales. Adicionalmente, dado que la glicoproteína P
7p15-21 es funcional en la proliferación de las
células tumorales, el crecimiento de los tumores puede inhibirse
terapéuticamente por administración de anticuerpos monoclonales
bloqueantes específicos, incluso en ausencia de agentes
quimioterapéuticos concurrentes. Entre las proteínas codificadas
por el gen de la glicoproteína P 7p15-21, las
proteínas de SEQ ID NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5 y NO: 6 son
distintas de las proteínas de SEQ ID NO: 7 y NO: 8 en el sentido de
que aquéllas se expresan selectivamente en ciertas células de
cáncer pero no en tejidos normales no cancerosos. Adicionalmente,
las proteínas de SEQ ID NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5 y NO: 6
se expresan preferentemente en aquellos cánceres que exhiben los
grados más altos de quimiorresistencia a los fármacos
quimioterapéuticos, tales como por ejemplo el melanoma humano
maligno. Debido a su expresión selectiva en ciertos cánceres pero no
en los tejidos normales, las proteínas de SEQ ID NO: 1, NO: 2, NO:
3, NO: 4, NO: 5 y NO: 6 pueden direccionarse terapéuticamente no
sólo por inhibición del eflujo de fármacos citotóxicos o la
inhibición de la proliferación tumoral por anticuerpos monoclonales
específicos, sino también por medios adicionales, que incluyen la
destrucción de las células específicas del tumor mediada por
anticuerpos monoclonales específicos conjugados a toxinas celulares,
o por administración terapéutica de preparaciones de vacuna
específicas del antígeno a los pacientes afligidos.
Las proteínas de SEQ ID NO: 7 y NO: 8
codificadas por el gen 7p15-21 pueden expresarse
también en ciertos tejidos humanos normales no cancerosos. La
invención proporciona por tanto usos adicionales relacionados con
la función de estas proteínas seleccionadas en tejidos fisiológicos.
Entre dichos tejidos normales, las proteínas de SEQ ID NO: 7 y SEQ
ID NO: 8 se expresan preferentemente a niveles altos en células
madre pluripotentes y otras células tisulares progenitoras, donde
aquéllas funcionan en el transporte transmembranal de xenobióticos
y otras moléculas pequeñas. La invención proporciona así medios para
detectar y enriquecer específicamente estas células madre y células
progenitoras a partir de mezclas de células y preparaciones en las
cuales están contenidas las mismas, por detección de las células
con anticuerpos monoclonales específicos marcados.
Las proteínas de SEQ ID NO: 7 y NO: 8 se
expresan también en cierto grado en la mayoría de otros tejidos
humanos normales, con inclusión de células del sistema inmunitario
tales como las células T, monocitos y células presentadoras de
antígeno diferenciadas, donde aquéllas funcionan en el eflujo de
citoquinas y la captura de moléculas pequeñas con inclusión de
péptidos y antígenos, cumpliendo así una función crítica para la
integridad de las respuestas inmunitarias normales. Cuando se
inhiben estas funciones, por ejemplo por bloqueo de anticuerpos
monoclonales específicos, la respuesta inmunitaria normal puede
modularse, lo cual se puede utilizar en la prevención y/o la
terapia del rechazo de aloinjertos en el trasplante clínico de
órganos, y también en diversas enfermedades autoinmunes tales como
la artritis reumatoide y la esclerosis múltiple. Adicionalmente,
cuando se expresa en células inmunitarias humanas y otros tejidos
humanos tales como el endotelio de la barrera hematoencefálica y
los epitelios del tracto gastrointestinal y el riñón, el bloqueo de
la proteína puede emplearse además terapéuticamente para alterar de
modo selectivo la captura y secreción, y por tanto la distribución
farmacológica, la farmacocinética y la eficacia terapéutica de
aquellos fármacos terapéuticos administrados por vía exógena que son
sustratos de dichas proteínas.
Se describen en esta memoria proteínas
sustancialmente puras constituidas esencialmente por la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:
4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. El
término "constituida esencialmente por" debe entenderse que
abarca proteínas que tienen exactamente las mismas secuencias de
aminoácidos, así como proteínas con secuencias insustancialmente
diferentes, como se evidencia por el hecho de que poseen las mismas
propiedades funcionales básicas. Una isoforma "sustancialmente
purificada" es una que se ha separado de otros componentes
biológicos acompañantes y comprenderá típicamente al menos 85% de
una muestra, prefiriéndose porcentajes mayores. Están disponibles
muchos medios para evaluar la pureza de una proteína en una
muestra, con inclusión de análisis por electroforesis en gel de
poliacrilamida, cromatografía y centrifugación analítica. Un método
preferido para evaluar la pureza es mediante transferencia Western
utilizando un anticuerpo dirigido contra epítopes de la
glicoproteína P 7p15-21 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:
2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID
NO: 7 o SEQ ID NO: 8. Se describen también "péptidos MDR" que
se definen en esta memoria como constituidos por un elemento de
secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, de al
menos 10 y preferiblemente al menos 15 ó 20 residuos. Éstos pueden
utilizarse en la generación de anticuerpos. Se estipula que un
péptido MDR no puede tener una secuencia que sea la misma que
cualquier serie de 10 a 15 residuos contiguos en la secuencia
LSGGQKQRIAIARAL (SEQ ID NO: 17). Estas proteínas y péptidos MDR
pueden administrarse también terapéuticamente a pacientes de cáncer
afligidos con tumores que expresan glicoproteína P
7p15-21, como una vacuna tumoral para provocar una
respuesta inmunitaria endógena dirigida contra estos tumores, a fin
de dar como resultado la destrucción de las células específicas del
tumor.
Se describe en esta memoria un anticuerpo
producido por un proceso que comprende el paso de administrar a un
animal hospedador una proteína codificada por SEQ ID NO: 1, SEQ ID
NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ
ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, o un péptido MDR como se ha descrito
arriba. La proteína o el péptido deben administrarse al animal en
una dosis suficiente para inducir la formación de anticuerpos. Los
anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. En el último
caso, los anticuerpos se producen preferiblemente por inyección de
una preparación farmacéuticamente aceptable en un ratón, seguido por
fusión de células del bazo del ratón con células de mieloma
utilizando métodos conocidos en la técnica. Los anticuerpos
obtenidos deberían fijarse selectivamente a las proteínas de SEQ ID
NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ
ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. En este contexto, fijación
selectiva significa que un anticuerpo tiene al menos una afinidad
100 veces mayor para una o más de esas proteínas que para cualquier
otra proteína encontrada normalmente en las células humanas.
Se describe en esta memoria un polinucleótido
sustancialmente puro constituido esencialmente por una secuencia de
nucleótidos que codifica las proteínas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:
2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID
NO: 7 o SEQ ID NO: 8, o un péptido MDR. Preferiblemente, el
polinucleótido está constituido esencialmente por la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID
NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16.
La invención incluye vectores de expresión que comprenden un
elemento codificante distinto constituido por estos polinucleótidos;
y células hospedadoras transformadas con tales vectores. Un
"elemento codificante distinto" hace referencia a la producción
de un vector de expresión responsable de la determinación de la
secuencia de aminoácidos de una proteína expresada. La invención
comprende la totalidad de dichos elementos que producen proteínas
correspondientes a las secuencias de aminoácidos que se muestran en
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:
5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, así como otras
proteínas que tienen sustancialmente la misma estructura y
función.
\newpage
Se describe una proteína recombinante producida
por células hospedadoras transformadas por un vector de expresión
como se ha expuesto anteriormente. La proteína recombinante puede
aislarse utilizando técnicas estándar, que incluyen cromatografía
de afinidad con anticuerpos contra los epítopes de la glicoproteína
P 7p15-21. Preferiblemente, el polinucleótido
utilizado en los vectores para expresar una glicoproteína P
recombinante de este tipo está constituido esencialmente por la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:
11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o
SEQ ID NO: 16. Oligonucleótidos complementarios a SEQ ID NO: 9, SEQ
ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:
14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16 y que tienen al menos 15
nucleótidos de longitud pueden utilizarse como inhibidores
antisentido. Éstos pueden administrarse a pacientes sometidos a
quimioterapia del cáncer a fin de aumentar la eficacia de los
fármacos citotóxicos. La transfección in vivo de células se
conoce desde hace muchos años y puede realizarse utilizando
vectores virales (véase v.g., U.S. 6.020.191); liposomas
(véase v.g., Nicolau, Meth. Enzymol. 149:
157-176 (1987)); DNA complejado con agentes que
facilitan la captura celular (véase v.g., U.S. 5.264.618; WO
98/14431); o incluso por simple inyección de DNA desnudo (véase
v.g., U.S. 5.693.622). Cualquiera de estos procedimientos
puede utilizarse para suministrar los oligonucleótidos antisentido
de la presente invención.
Se describe también un método para determinar si
una célula de cáncer responderá a las terapias orientadas a
invertir la multifármaco-resistencia por medida de
la expresión de los genes que codifican las proteínas de SEQ ID NO:
1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID
NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. Este método puede utilizarse
para detectar la existencia del fenotipo
multifármaco-resistente en células de cáncer o para
rastrear el desarrollo de multifármaco-resistencia a
lo largo del tiempo por monitorización de los cambios en la
expresión génica en células cultivadas.
Se proporciona adicionalmente un método de
determinación de si un compuesto de test inhibe la
multifármaco-resistencia en células causada por un
gen codificante de las proteínas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ
ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o
SEQ ID NO: 8. Este método comprende expresar un gen que codifica
uno o más de estos polipéptidos en células que por lo demás no son
multifármaco-resistentes, y exponer estas células a
uno o más fármacos citotóxicos en presencia de un compuesto de test.
Se mide la supervivencia celular después de la exposición, y los
resultados obtenidos se comparan con los de incubaciones realizadas
esencialmente del mismo modo pero en ausencia del compuesto de test.
Se llega a la conclusión de que el compuesto de test inhibe la
multifármaco-resistencia si la supervivencia celular
se reduce en un grado significativo en las incubaciones realizadas
en presencia del compuesto de test con relación a la observada en su
ausencia.
La invención está dirigida a un nuevo miembro de
la familia de glicoproteínas P de proteínas relacionadas con la
resistencia a los fármacos, a secuencias genéticas que codifican
esta proteína, a métodos de determinación de si una célula de
cáncer responderá a las terapias dirigidas a invertir la resistencia
a los fármacos mediada por la glicoproteína P, y a un método de
cribado de compuestos de test respecto a su capacidad para inhibir
multifármaco-resistencia. El nuevo gen de
glicoproteína P puede codificar las proteínas de SEQ ID NO: 1.
Debe entenderse que no sólo se describen
secuencias idénticas a las representadas, sino también secuencias
que son esencialmente iguales como se demuestra por el hecho de que
retienen las mismas características estructurales y funcionales
básicas. Por ejemplo, pueden utilizarse técnicas tales como la
mutagénesis orientada para introducir variaciones en la estructura
de una proteína. Se describen variaciones en la glicoproteína P
introducidas por este u otros métodos similares, con la condición
de que la proteína resultante retiene sus propiedades biológicas
básicas, en particularmente en lo que respecta a la inducción de
multifármaco-resistencia en células de
mamífero.
Las secuencias de DNA que codifican las
proteínas de la invención pueden obtenerse a partir de cualquier
fuente de tejido o célula en la cual se expresen las mismas. Por
ejemplo, pueden manipularse genéticamente líneas de células
cultivadas para expresar el gen de glicoproteína P utilizando
técnicas recombinantes o por exposición continua a agentes
quimioterapéuticos. Alternativamente, las secuencias pueden aislarse
de las células primarias obtenidas de tumores.
Están disponibles muchos métodos para
aislamiento de las secuencias de DNA, y pueden adaptarse para el
aislamiento del gen de glicoproteína P del cromosoma
7p15-21 (en lo sucesivo "cromosoma 7p")
(véase, v.g., Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (1989)).
Por ejemplo, un método consiste en cribar una biblioteca de cDNA
que se ha preparado por transcripción inversa de mRNA aislado de
tejidos o células que expresan el gen. La biblioteca puede
prepararse a partir de, por ejemplo, tejido de melanocitos o de
testículo humano, y pueden sintetizarse sondas para cribado basadas
en las secuencias que se representan en el Listado de Secuencias.
Las sondas tienen preferiblemente al menos 14 nucleótidos de
longitud y se seleccionan óptimamente de una región que se cree es
exclusiva para el gen de la glicoproteína P del cromosoma 7p.
Como alternativa, la amplificación de una
secuencia deseada puede realizarse por la reacción en cadena de la
polimerasa ("PCR") del RNA inverso transcrito. Iniciadores para
la PCR pueden construirse utilizando las secuencias que se
representan en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID
NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO:
16, y la confirmación de la presencia del cDNA de la glicoproteína
P del cromosoma 7p puede obtenerse por la secuenciación de los
productos amplificados.
La expresión de proteína recombinante puede
inducirse en una célula hospedadora por transformación de la misma
con un vector de expresión apropiado. El vector debería contener
señales de transcripción y traducción reconocibles por el
hospedador junto con la secuencia estructural deseada,
preferiblemente en forma bicatenaria, en un enlace operativo. Por
ejemplo, la secuencia de DNA de la glicoproteína P debería estar
posicionada de tal modo que las secuencias reguladoras presentes en
el vector controlen la síntesis de mRNA y se produzca proteína que
tenga la secuencia deseada.
Preferiblemente, el ácido nucleico que codifica
la glicoproteína P de la invención se expresa en células eucariotas,
especialmente en células de mamífero. Dichas células son capaces de
promover las modificaciones posteriores a la traducción necesarias
para asegurar que la proteína recombinante es estructural y
funcionalmente la misma que la proteína aislada de, por ejemplo,
células tumorales multifármaco-resistentes. Ejemplos
de células de mamífero que se sabe proporcionan modificación
apropiada posterior a la traducción de proteínas clonadas incluyen,
inter alia, células NIH-3T3, células CHO,
células HeLA, células LM(tk-), y análogas. Promotores
eucariotas que se sabe controlan la expresión de genes
recombinantes se utilizan preferiblemente para dirigir la
transcripción del DNA de la glicoproteína P del cromosoma 7p, y
pueden incluir el del gen de metalotioneína I del ratón, el
promotor TK del Herpesvirus, el promotor temprano de CMV y el
promotor temprano de SV40. La transcripción puede estar dirigida
también por promotores procariotas, tales como los capaces de
reconocer la polimerasa T4, los promotores P_{R} y P_{L} del
bacteriófago lambda, y los promotores trp, recA, choque térmico y
lacZ de E. coli.
Pueden introducirse vectores de expresión en las
células hospedadoras por métodos tales como precipitación con
fosfato de calcio, microinyección, electroporación o transferencia
viral, y pueden seleccionarse células que expresan la secuencia de
proteínas recombinante por métodos conocidos en la técnica. La
confirmación de la expresión puede obtenerse por amplificación PCR
de secuencias de glicoproteína P utilizando iniciadores
seleccionados de las secuencias que se muestran en SEQ ID NO: 9, SEQ
ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:
14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16.
La proteína recombinante puede purificarse
utilizando métodos estándar bien conocidos en la técnica. Dichos
métodos pueden incluir filtración, precipitación, cromatografía y
métodos electroforéticos. La pureza puede evaluarse por realización
de la electroforesis en un gel de poliacrilamida y visualización de
las proteínas utilizando metodología estándar de tinción. La
transferencia Western puede realizarse también utilizando un
anticuerpo para la glicoproteína P del cromosoma 7p.
La invención está dirigida también a anticuerpos
generados contra la proteína P del cromosoma 7p. El proceso para
producir tales anticuerpos puede implicar o bien inyectar la
glicoproteína P 7p propiamente dicha en un animal apropiado o
inyectar péptidos antigénicos cortos construidos para corresponder a
diferentes regiones de la proteína. Estos péptidos deberían tener
al menos 5 aminoácidos de longitud y preferiblemente, deberían
seleccionarse de regiones que se consideran exclusivas de la
glicoproteína P 7p. Métodos para generación y detección de
anticuerpos son bien conocidos en la técnica, y se exponen en
referencias tales como: Harlow, et al., Antibodies, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988);
Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself
Discrimination, (1982); Kennett et al., Monoclonal
Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological
Analyses, (1980); y Campbell, "Monoclonal Antibody
Technology", en Laboratory Techniques in Biochemistry and
Molecular Biology, (1984).
El término "anticuerpo", como se utiliza en
esta memoria, debe entenderse que incluye moléculas intactas así
como fragmentos que retienen su capacidad para fijar antígeno, tales
como los fragmentos Fab y F(ab')_{2}. El término
"anticuerpo" se define también en esta memoria como haciendo
relación tanto a anticuerpos monoclonales como a anticuerpos
policlonales. Los anticuerpos policlonales se derivan de los sueros
de animales inmunizados con un antígeno de la glicoproteína P del
cromosoma 7p. Los anticuerpos monoclonales para la proteína pueden
prepararse utilizando la tecnología del hibridoma, como se expone en
referencias tales como: Kohler, et al., Nature
256:495 (1975); y Hammerling, et al., en:
Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,
Elsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981). En general,
esta tecnología implica inmunizar un animal inmunocompetente,
típicamente un ratón, sea con la glicoproteína P intacta del
cromosoma 7p o con un fragmento derivado de la misma. Se extraen
luego esplenocitos del animal inmunizado y se fusionan con células
de mieloma adecuadas, tales como células SP_{2}O. Después de
ello, las células de hibridoma resultantes se mantienen
selectivamente en medio HAT y se clonan luego por dilución limitada
(Wands, et al., Gastroenterology, 80:
225-232 (1981)). Las células obtenidas por dicha
selección se ensayan luego para identificar clones que secreten
anticuerpos capaces de fijar la glicoproteína P del cromosoma
7p.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de
la invención pueden utilizarse para detectar la presencia de la
glicoproteína P del cromosoma 7p en cualquiera de una diversidad de
inmunoensayos. Por ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos en
radioinmunoensayos o en ensayos inmunométricos, conocidos también
como ensayos de "dos sitios" o "sándwich" (véase Chard,
"An Introduction to Radioimmune Assay and related Techniques,"
en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology, North Holland Publishing Co., NY (1978)). En un ensayo
inmunométrico típico, una cantidad de anticuerpo sin marcar se fija
un soporte sólido que es insoluble en el fluido sometido a test,
tal como sangre, linfa, extractos celulares y análogos. Después de
la fijación inicial del antígeno al anticuerpo inmovilizado, se
añade una cantidad de un segundo anticuerpo marcado detectablemente
(que puede ser o no el mismo que el primero) a fin de permitir la
detección y/o cuantificación de antígeno fijado (véase, v.g.
Radioimmune Assay Method, Kirkham, et al., Ed. pp.
199-206, E&S y Livingstone, Edimburgo (1970)).
Muchas variaciones de estos tipos de ensayos se conocen en la
técnica y pueden emplearse para la detección de la glicoproteína P
7p.
Los anticuerpos para la glicoproteína P del
cromosoma 7p pueden utilizarse también en procedimientos de
purificación (véase en general, Dean et al.,
Affinity Chromatography, A Practical Approach, IRL Press
(1986)). Típicamente, el anticuerpo se inmoviliza en una matriz
cromatográfica tal como Sepharosa, 4B. La matriz se introduce luego
como relleno en una columna y la preparación que contiene la
glicoproteína P del cromosoma 7p se hace pasar a su través en
condiciones que promueven la fijación, v.g., condiciones
bajas en sal. La columna se lava luego, y la proteína se eluye
utilizando tampón que promueve la disociación del anticuerpo,
v.g., un tampón que tiene un pH o concentración de sal
alterados. La proteína eluida puede transferirse a un tampón, por
ejemplo por diálisis, y almacenarse después de ello o utilizarse
directamente. Pueden utilizarse también anticuerpos en
transferencia Western para la detección de la glicoproteína P del
cromosoma 7p en una muestra. Para estos tipos de ensayos, puede
utilizarse un anticuerpo que o bien se ha desarrollado
específicamente para reaccionar con la glicoproteína P del
cromosoma 7p o que reacciona con un epítope de la proteína.
La detección de la glicoproteína P del cromosoma
7p puede utilizarse para determinar si las células tumorales son
multifármaco-resistentes. Análogamente, la detección
de cambios en la expresión de la glicoproteína P puede ser útil en
la predicción del desarrollo de
multifármaco-resistencia en las células. El cDNA de
esta glicoproteína P puede ser útil en el diseño de iniciadores
para PCR de diagnóstico, diseño de sondas para transferencia
Northern de diagnóstico, ensayos de protección de RNAsas, y para el
diseño de los oligonucleótidos antisentido complementarios al cDNA
predicho para uso en estrategias de direccionamiento de genes para
la inversión de la multifármaco-resistencia. Se
contemplan usos diagnósticos y terapéuticos tanto in vitro
como in vivo para secuencias de nucleótidos antisentido para
la glicoproteína P del cromosoma 7p.
La secuencia de aminoácidos primaria y la
estructura proteínica de la glicoproteína P del cromosoma 7p pueden
utilizarse en la producción de anticuerpos monoclonales (mAbs) que
pueden emplearse en la diagnosis y terapia del cáncer
multifármaco-resistente. Por ejemplo, péptidos
sintéticos que se asemejan a secuencias nativas de aminoácidos de
dominios extracelulares particulares como se determinan por
predicción de topología de membrana pueden ser útiles para
desarrollar mAbs inhibidores dirigidos contra epítopes
extracelulares de la glicoproteína P del cromosoma 7p.
Adicionalmente, secuencias peptídicas sintéticas de
10-20 meros derivadas de la secuencia primaria de
aminoácidos no incluidas en las secuencias de bucle extracelular
arriba mencionadas pueden ser útiles en el desarrollo de
anticuerpos monoclonales específicos de diagnóstico. Pueden
emplearse mAbs específicos en el análisis diagnóstico por FACS,
transferencia Western, e inmunohistoquímica. Tales mAbs pueden
emplearse también para usos diagnósticos in vivo, donde
pueden utilizarse mAbs conjugados a un marcador para evaluar la
carga tumoral, la localización del tumor o la masa residual tumoral
después de quimioterapia o terapia quirúrgica de tumores que
expresan la glicoproteína P
7p15-21.
7p15-21.
Pueden utilizarse también mAbs específicos para
propósitos terapéuticos en pacientes de cáncer. En particular,
aquéllos pueden administrarse para invertir la resistencia
multifármaco del cáncer en pacientes que reciben agentes
quimioterapéuticos que son sustratos para el eflujo de glicoproteína
P 7p, v.g., cisplatino. Adicionalmente, pueden utilizarse
terapéuticamente mAbs específicos en pacientes de cáncer para
destrucción de las células especificas del tumor, sea administrados
en una forma no conjugada, que da como resultado la destrucción del
tumor mediada por el sistema inmunitario, o en una forma conjugada
con una toxina celular (por ejemplo conjugada a yodo reactivo o
toxinas químicas), dando como resultado la destrucción directa de
las células específicas del tumor.
Pueden utilizarse también mAbs específicos para
propósitos terapéuticos distintos de la resistencia del cáncer a
multifármacos. Basándose en la función inmunorreguladora predicha de
la glicoproteína P 7p, estos mAbs pueden administrarse a pacientes
a fin de prevenir y/o tratar el rechazo de trasplantes de órganos,
así como diversas enfermedades autoinmunes tales como artritis
reumatoide y esclerosis múltiple. Adicionalmente, dado que las
glicoproteínas P funcionan en la captura, excreción y distribución
específica de tejido de una diversidad de compuestos farmacológicos
y químicos, y se han visto implicadas en mecanismos de
biodisponibilidad oral, función de la barrera hematoencefálica y
mecanismos de excreción renal, hepática y biliar de diversos
fármacos, pueden administrarse mAbs específicos terapéuticamente
para alterar la farmacocinética y la disponibilidad de dichos
fármacos terapéuticos que son sustratos para la función de trasporte
mediada por la glicoproteína P 7p.
Las composiciones y métodos de la presente
invención pueden tener cierto número de usos en además de los arriba
descritos. Por ejemplo, se sabe que las células madre pluripotentes
y células progenitoras tisulares tales como células madre
hematopoyéticas, células neuroprogenitoras y células progenitoras
musculares poseen actividades de eflujo afines a la glicoproteína P
para pequeñas moléculas y colorantes fluorescentes. La glicoproteína
P del cromosoma 7p puede jugar un papel en el transporte de dichos
sustratos, y puede servir por tanto como marcador para el
aislamiento de tales células madre y células progenitoras mediante,
por ejemplo, análisis FACS. Asimismo, dado que la glicoproteína P
MDR1 parece estar implicada en la diferenciación celular, la
proliferación celular, la supervivencia celular, y ciertas
respuestas inmunitarias, la glicoproteína P del cromosoma 7p,
debido a su homología con la glicoproteína P MDR1, se espera que
juegue también un papel en dichas funciones fisiológicas. Así pues,
las secuencias del gen de la glicoproteína P y de la proteína del
cromosoma 7p pueden ser útiles en la modulación de las alteraciones
patofisiológicas de estas funciones relacionadas con MDR.
Dado que actualmente está produciéndose nueva
información de secuencias genómicas a un ritmo rápido por el
proyecto del genoma humano, las bases de datos que contienen dicha
información genómica contienen potencialmente secuencias de
miembros no identificados hasta ahora de la familia de
glicoproteínas P. Los miembros de la familia de glicoproteínas P de
mamífero comparten secuencias de aminoácidos y epítopes de proteínas
característicos, y asumen conformaciones similares. Por ello, se ha
realizado una investigación basada en homología de proteínas en un
intento de identificar nuevos genes codificantes de glicoproteínas
P. Se han utilizado herramientas bioinformáticas de analítica de
genes y analítica de proteínas para caracterizar ulteriormente la
secuencia de ácido nucleico y la estructura predicha de las
proteínas de los genes candidato identificados. Específicamente, se
ha utilizado la aplicación tblastn del National Center for
Biotechnology Information (NCBI) para comparar las secuencias de
aminoácidos conservadas derivadas de la estructura conocida de la
glicoproteína P MDR1 humana con la base de datos de la secuencia
de nucleótidos de homo sapiens no redundante del NCBI
traducida dinámicamente en todos los marcos de lectura. Se ha
utilizado la secuencia de firma común a los miembros de la familia
de transportadores ABC, una secuencia de aminoácidos
15-meros LSGGQKQRIAIARAL (SEQ ID NO: 17), para
identificar secuencias de DNA genómico humanas codificantes de
estructuras de proteínas homólogas. Se han empleado también
secuencias conocidas de aminoácidos hexámeros de tres epítopes de
fijación de anticuerpos monoclonales (mAb) específicos de
glicoproteína P.
Los clones de DNA genómico humano identificados
de la manera arriba descrita se cribaron respecto a contaminación
con vectores utilizando el programa VecScreen. Adicionalmente, se
sometieron estos clones a mapeado sistemático de homología
utilizando secuencias de aminoácidos 20-meros
solapantes contiguas derivadas de la estructura de la proteína
humana MDR1 y el programa de búsqueda tblastn. Se compararon las
secuencias de DNA genómico candidato que codificaban secuencias de
aminoácidos homólogas con secuencias de marco de lectura abierto
(ORF) predichas en cada clon de DNA utilizando el programa NCBI ORF
Finder (Altschul, et al., Nucleic Acids Res.
25: 3389-402 (1997)). Se analizaron luego las
secuencias de DNA homólogas que contenían ORFs genómicos utilizando
el paquete de software NetGene2 a fin de predecir sitios de
remodelación de intrones en los genes candidato (Brunak et
al., J. Biol. 220: 49-65
(1991)).
Se generó una secuencia de DNA por transcripción
conceptual lineal de estructuras predichas de exones de DNA
adyacentes. Utilizando este enfoque, se identificaron dos clones
genómicos humanos adyacentes solapantes, CTA-367017
(AC002486, de 79611 pares de bases de longitud) y
CTB-86D3 (AC005060, de 120169 pares de bases de
longitud, secuenciado a la derecha) como formando parte de una isla
sin anclaje de orientación desconocida en el cromosoma
7p15-21. Se encontró que estos clones solapantes
contienen una secuencia génica que codifica un nuevo miembro de la
familia de glicoproteínas P humanas.
Con objeto de determinar si la estructura génica
predicha se expresaba en tejidos humanos, la secuencia de cDNA
generada se comparó con la base de datos humana NCBI dbest de
marcadores de secuencia expresados (EST) no redundantes, como ha
sido descrito por Altschul et al., y se identificaron varios
ESTs complementarios a exones predichos del clon genómico AC002486.
Se diseñaron luego iniciadores de la reacción en cadena de
polimerasa (PCR) basados en información de secuencias disponible en
la base de datos del National Center for Biotechnology Information
(NCBI) y el análisis bioinformático que se ha descrito arriba.
Utilizando estos iniciadores oligonucleotídicos específicos de
genes y la técnica PCR sobre RNA mensajero total (mRNA) transcrito
inversamente aislado de varias líneas de células de cáncer humanas y
tejidos humanos normales, con inclusión de la línea de células del
melanoma humano G3661, la línea de células del carcinoma de mama
MCF-7, la línea de células del carcinoma de células
escamosas SCC25, la línea de células de leucemia U937, y células
mononucleares de sangre periférica (PBMC) normales, se amplificaron
secuencias de cDNA derivadas del nuevo gen de glicoproteína P
7p15-21 y los productos PCR se secuenciaron
subsiguientemente utilizando el método de terminación de cadenas
didesoxi en ambas cadenas.
La estructura intrón-exón de
varios productos génicos codificados por el gen de glicoproteína P
7p15-21 se determinó por comparación de clones de
cDNA predichos y secuenciados con información de secuencias genómica
del locus del gen de glicoproteína P 7p15-21
(clones AC002486 y AC005060) como se muestra en SEQ ID NO: 9, SEQ
ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:
14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16. Se generaron luego estructuras
de proteínas codificadas por el nuevo gen 7p15-21
por traducción conceptual de aminoácidos de las secuencias
oligonucleotídicas predichas de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID
NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15
y SEQ ID NO: 16, como se muestra en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ
ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y
SEQ ID NO: 8. Estas secuencias de aminoácidos se compararon luego
con la secuencia peptídica no redundante del NCBI respecto a
homología de secuencia utilizando el programa blastp del NCBI. Las
secuencias de aminoácidos predichas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7
y SEQ ID NO: 8 se clasificaron también utilizando el Sistema de
Clasificación de Familias de Proteínas
PIR-International (Barker, et al.,
Nucleic Acids Res. 28: 41-4 (2000);
Huang et al., Nucleic Acids Res. 28:
273-6 (2000)). Se determinaron las características
funcionales potenciales de las proteínas predichas por análisis
comparativo de la composición primaria de aminoácidos y por
utilización del paquete de software TMHMM1.0 para predicción de la
formación transmembranal de hélices en proteínas de mamífero
(Sonnhammer et al., Ismb. 6: 175-82
(1998)).
El nuevo gen 7p15-21 de
glicoproteína P puede codificar varias isoformas de glicoproteína P
distintas que exhiben 68% de homología de secuencia a la vez con
MDR1 y MDR3 humanas. Se encontró un grado similar de homología con
isoformas respectivas de ratón y hámster de estos genes humanos. El
análisis de la secuencia primaria de aminoácidos sugiere que la
glicoproteína P del cromosoma 7p15-21 puede expresar
el epítope de fijación de mAb C32 y
anti-glicoproteína P, pero no el epítope C219
conservado en todas las restantes isoformas de glicoproteína P
conocidas (Georges et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
87: 152-6 (1990)).
La predicción estructural reveló que el gen
7p15-21 de glicoproteína P codifica isoformas de
glicoproteína P que exhiben similitudes estructurales pero también
diferencias distintivas comparadas con miembros conocidos de la
familia de glicoproteína P como se describe por Georges et
al. Por ejemplo, la proteína de SEQ ID NO: 2 contiene dos
dominios de fijación de ATP que están localizados en lados opuestos
de la membrana plasmática, proporcionando un dominio de fijación de
ATP extracelular único que se predice fijará ATP extracelular.
Basándose en estas diferencias distintivas, se predice que la
glicoproteína P 7p15-21 está implicada no sólo en
eflujo de moléculas pequeñas, sino que algunas de sus isoformas son
funcionales también en la captura de moléculas pequeñas dependiente
de energía. El sistema de clasificación PIR confirmó que la
glicoproteína P del cromosoma 7p15-21 descubierta
es un miembro de la familia de proteínas de
multifármaco-resistencia y la familia de
superfamilias de homología de la casete de fijación de ATP.
El análisis PCR utilizando iniciadores
específicos de genes demostró que el cDNA codificante de las
proteínas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:
4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, que implica en cada caso exones
codificados en el clon genómico AC005060, se expresaba
preferentemente en células del melanoma humano pero no en la
mayoría de los otros cánceres testados, al contrario que los cDNAs
codificantes de las proteínas de SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, que
se encontró se expresaban en la mayoría de los cánceres examinados
y también en tejidos humanos fisiológicos. Esto pone de manifiesto
que un subconjunto de productos del gen de glicoproteína P
7p15-21 pueden direccionarse selectivamente en
ciertos cánceres que exhiben grados particularmente altos de
quimiorresistencia, tales como el melanoma humano.
Para evaluar la expresión y función de la
glicoproteína P 7p15-21 y el efecto de la modulación
específica sobre la función de transporte y la quimiorresistencia,
se generaron anticuerpos policlonales contra los péptidos MDR
CGTSLILNGEPGYTI (SEQ ID NO: 18) y RFGAYLIQAGRMTPEGC (SEQ ID NO: 19),
correspondientes a distintos epítopes de bucles extracelulares de
la glicoproteína P 7p15-21, por inyección de ratones
con estos péptidos antigénicos conjugados a la sustancia portadora
KLH. A fin de evaluar la expresión superficial de la glicoproteína P
7p15-21 de las células tumorales humanas, se
realizó una inmunotinción superficial indirecta y citometría de
flujo monocolor de células recién cosechadas. Para valorar los
efectos de la inhibición de P-gp
7p15-21 sobre el eflujo de tintes fluorescentes
mediado por P-gp, se incubaron células tumorales con
Ab policlonal de anti-7p15-21 de
glicoproteína P seguido por adición de calceína-AM y
medidas seriadas subsiguientes de fluorescencia celular por
citometría de flujo.
Estos estudios demostraron que la glicoproteína
P se expresa en células tumorales, y que el epítope RFGAYLIQA
GRMTPEGC (SEQ ID NO: 19) contenido en las proteínas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, se expresa preferentemente en el melanoma humano a niveles altos, mientras que el epítope CGTSLILNGEPGYTI (SEQ ID NO: 18) contenido también en SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, se expresa también en otros tipos de cánceres humanos y en células humanas normales. Los anticuerpos contra el epítope CGTSLILNGEPGYTI (SEQ ID NO: 18) inhibían a la vez la captura de colorante y asimismo el eflujo de colorante dependiente del tipo de célula, indicando una función dual de los diversos productos génicos de la glicoproteína P 7p15-21 en estos procesos distintos. Estos anticuerpos aumentaban también la citotoxicidad celular del cisplatino en ensayos específicos de destrucción de células en el melanoma y asimismo en el cáncer de mama entre otros, indicativos de su utilidad terapéutica potencial en el tratamiento de pacientes de cáncer.
GRMTPEGC (SEQ ID NO: 19) contenido en las proteínas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, se expresa preferentemente en el melanoma humano a niveles altos, mientras que el epítope CGTSLILNGEPGYTI (SEQ ID NO: 18) contenido también en SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, se expresa también en otros tipos de cánceres humanos y en células humanas normales. Los anticuerpos contra el epítope CGTSLILNGEPGYTI (SEQ ID NO: 18) inhibían a la vez la captura de colorante y asimismo el eflujo de colorante dependiente del tipo de célula, indicando una función dual de los diversos productos génicos de la glicoproteína P 7p15-21 en estos procesos distintos. Estos anticuerpos aumentaban también la citotoxicidad celular del cisplatino en ensayos específicos de destrucción de células en el melanoma y asimismo en el cáncer de mama entre otros, indicativos de su utilidad terapéutica potencial en el tratamiento de pacientes de cáncer.
Se sabe que ciertos cánceres exhiben
reordenación cromosómica en la región 7p15-21, y
dichas mutaciones pueden asociarse con la aparición del fenotipo
MDR. Esto aumenta la posibilidad de que la reordenación génica en
estos cánceres sea potencialmente resultado de la formación de
episomas y minicromosomas dobles (DM) durante el proceso de
amplificación génica de la glicoproteína P 7p15-21
bajo tensiones mutagénicas tales como la quimioterapia. Se sabe que
las células que expresan multifármaco-resistencia
mediada por MDR1 sufren tales transposiciones cromosómicas y
formación de cromosomas DM (Scehoenlein et al., Mol. Biol.
Cell 3:507-20 (1992); Mickley et al., J.
Clin. Invest. 99:1947-57 (1997); Knutsen et
al., Genes Chromosomes Cancer 23:44-54 (1998)).
Así pues, los productos génicos de la glicoproteína P del cromosoma
7p15-21 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:
3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 pueden sobreexpresarse
selectivamente en ciertas células de cáncer, contribuyendo con ello
a la resistencia adquirida a los fármacos de dichas células de
cáncer en tanto que se mantienen silenciosos en las células
normales. Este patrón de expresión diferencial puede emplearse en
la detección e inversión de la
multifármaco-resistencia de las células tumorígenas
de mamífero.
<110> The Brigham and Women's Hospital,
Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Un Gen que Codifica un Homólogo de
Glicoproteína P Humana Multifármaco-Resistente en el
Cromosoma 7p15-21 y Usos del Mismo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 81994/268611
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 659
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 812
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1058
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Nota
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (66)..(66)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> xaa en la posición 66 representa
cualquier L-aminoácido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1222
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Nota
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (230)..(230)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 230 representa
cualquier L-aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1195
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 541
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Nota
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (230)..(230)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 230 representa
cualquier L-aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 514
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2066
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2856
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1175
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3177
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Nota
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (198)..(198)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n en la posición 198 representa
cualquier nucleótido (A, T, C o G)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3702
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
<22i> Nota
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (723)..(723)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n en la posición 723 representa
cualquier nucleótido (A, T, C o G)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3621
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2021
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Nota
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (723)..(723)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n en la posición 723 representa
cualquier nucleótido (A, T, C o G)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1940
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> péptido sintético
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<212> PRT
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<213> péptido sintético
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<400> 19
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Claims (16)
1. Una proteína, constituida por SEQ ID NO:
1.
2. Un proceso para preparación de un
anticuerpo, que comprende el paso de administrar la proteína de la
reivindicación 1 a un animal no humano capaz de producir dicho
anticuerpo.
3. Un anticuerpo que se fija preferentemente a
la proteína de la reivindicación 1.
4. Un polinucleótido sustancialmente puro que
codifica la proteína de la reivindicación 1.
5. Un vector para expresión de una
glicoproteína P, que comprende un elemento codificante distinto
constituido por el polinucleótido de la reivindicación 4.
6. Una célula hospedadora transformada con el
vector de la reivindicación 5.
7. Una glicoproteína P recombinante constituida
por SEQ ID NO: 1 producida por la célula hospedadora de la
reivindicación 6.
8. El polinucleótido de la reivindicación 4, en
donde dicho polinucleótido está constituido por la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID NO: 9.
9. Un oligonucleótido que actúa como inhibidor
antisentido de la expresión de la glicoproteína P, que tiene una
longitud de al menos 15 nucleótidos y está constituido por una
secuencia complementaria a al menos 15 nucleótidos contiguos en SEQ
ID NO: 9.
10. Un vector para expresión de proteína, que
comprende un elemento codificante distinto constituido por el
polinucleótido de la reivindicación 8.
11. Una célula hospedadora transformada con el
vector de la reivindicación 10.
12. Un método de determinación de si una célula
de cáncer responderá a una terapia orientada a invertir la
multifármaco-resistencia, que comprende el paso de
medir la expresión de un gen que codifica una proteína que tiene
SEQ ID NO: 1.
13. El método de la reivindicación 12, en donde
dicha expresión se determina utilizando amplificación PCR de mRNA
transcrito inversamente.
14. El método de la reivindicación 12, en donde
dicha expresión se determina utilizando el anticuerpo de la
reivindicación 3.
15. Un método de determinación de si un
compuesto de ensayo inhibe la
multifármaco-resistencia causada por un gen que
codifica una proteína de SEQ ID NO: 1, comprendiendo dicho
método:
- (a)
- expresar dicho gen en células que por lo demás no son multifármaco-resistentes;
- (b)
- exponer dichas células a uno o más agentes citotóxicos en presencia de dicho compuesto de test;
- (c)
- medir la supervivencia celular después de exposición de dichas células a dichos uno o más agentes citotóxicos y comparar los resultados obtenidos con los de células incubadas esencialmente del mismo modo con dichos uno o más agentes citotóxicos pero en ausencia de dicho compuesto de test; y
- (d)
- deducir que dicho compuesto de test inhibe la multifármaco-resistencia si la supervivencia celular se reduce en un grado significativo por incubación de células en presencia de dicho compuesto de test con relación a la supervivencia de las células en incubaciones realizadas en ausencia de dicho compuesto de test.
16. El método de la reivindicación 15, en el
cual dicho gen tiene la SEQ ID NO: 9.
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