EA015351B1

EA015351B1 - Антагонисты il-17a и il-17f и способы их применения

Info

Publication number: EA015351B1
Application number: EA200800956A
Authority: EA
Inventors: Стивен Д. Левин; Марк В. Риксон; Зерен Гао
Original assignee: Займодженетикс, Инк.
Priority date: 2005-09-28
Filing date: 2006-09-28
Publication date: 2011-06-30
Also published as: IL189726A0; KR20080056241A; DE602006016965D1; DK1931697T3; AU2006294511B2; AU2006294511A1; CA2621623A1; HK1112927A1; EP1931697B1; PT1931697E; EA200800956A1; EP1931697A2; CY1110856T1; BRPI0616589A2; WO2007038703A2; JP2009510093A; PL1931697T3; US20070238658A1; ATE481424T1; WO2007038703A3

Abstract

Настоящее изобретение относится к антагонистам IL-17A и IL-17F. Антагонисты по изобретению основаны на IL-17RC одном или обоих IL-17RC и IL-17RA (IL-17RC/IL-17RA). Такие антагонисты служат, чтобы блокировать, ингибировать, уменьшать, противодействовать или нейтрализовать активность IL-17F, IL-17А или обоих IL-17A и IL-17F. IL-17A и IL-17F представляют собой цитокины, которые вовлечены в воспалительные процессы и человеческую болезнь. IL-17RA является рецептором для IL-17A, a IL-17RC является общим рецептором как для IL-17A, так и для IL-17F. Настоящее изобретение включает растворимые антагонисты IL-17A и IL-17F, также как методы их использования.

Description

Цитокины представляют собой растворимые маленькие белки, которые опосредуют многие биологические эффекты, включая регулирование роста и дифференцирование многих типов клеток (см., например, Ага1 е! а1., Апп. Кеу. Вюсйет. 59:783 (1990); Моктапп, Сигг. Θρίη. 1ттипо1. 3:311 (1991); Рои1 апб 8ебег, Се11, 76:241 (1994)). Белки, которые составляют группу цитокина, включают интерлейкины, интерфероны, колониестимулирующие факторы, факторы некроза опухоли и другие регулирующие молекулы. Например, человеческий интерлейкин-17 представляет собой цитокин, который стимулирует экспрессию интерлейкина-6, внутриклеточной молекулы адгезии 1, интерлейкина-8, колониестимулирующего фактора макрофагов-гранулоцитов и экспрессию простагландина Е2, и играет роль в предпочтительном созревании гематопоэтических предшественников СЭ34+ в нейтрофилы (Уао е! а1., 1. 1ттипо1. 755:5483 (1995); Гоаде/ е! а1., 1. Εχρ. Меб. 183:2593 (1996)).

Рецепторы, которые связывают цитокины, обычно состоят из одного или больше составных мембранных белков, которые связывают цитокин с высоким сродством и трансдуцируют этот случай связывания с клеткой через эндоплазматические участки определенных субъединиц рецептора. Рецепторы цитокина сгруппированы в несколько классов на основе общих черт в их доменах, связывающих внеклеточные лиганды.

Продемонстрированные ш у1уо активности цитокинов и их рецепторов иллюстрируют клинический потенциал других цитокинов, рецепторов цитокинов, агонистов цитокинов и антагонистов цитокинов и потребность в них. Например, продемонстрированные ш у1уо активности семейства провоспалительных цитокинов показывают огромный клинический потенциал антагонистов провоспалительных молекул и потребность в них.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1А и 1В являются графическими представлениями структуры экзона человеческого 1Ь-17К.Сх1 (последовательность 8ΕΟ ГО N0:2). Для тех аминокислот, где кодон сплайсирован экзон-интронным сочленением, сочленение перемещалось, включая весь кодон.

Фиг. 2 А и 2В являются графическими представлениями структуры экзона человеческого 1Ь-17К.Сх4 (последовательность 8Ε0 ГО N0:166).

Фиг. 3 является графическим представлением структуры экзона человеческого 1Б-17РА (последовательность 8Ε0 ГО N0:21).

Фиг. 4А и 4В являются графическими представлениями структуры экзона предпочтительного растворимого полипептида по настоящему изобретению, как описано здесь и в последовательностях 8Ε0 ГО N0:157 и 158. Этот растворимый полипептид включает экзоны из обеих последовательностей как человеческого 1Б-17К.А (последовательность 8Ε0 ГО N0:21), так и человеческого 1Ь-17К.Сх1 (последовательность 8Ε0 ГО N0:2).

Фиг. 5 представляет графическое представление обычного результата анализа, используя протокол, обрисованный в общих чертах в примере 33. График выполнен с применением программы Рпхт. Величины Υ представляют интенсивность флуоресценции (МН), нормализованную к максимуму и минимуму (100 и 0%) на основе только лиганда и контрольных лунок без лиганда/без растворимого рецептора, и, таким образом, вычисляют процент связывания лиганда с клетками. Программное обеспечение вычисляет 1С₅₀ для каждой кривой.

Детальное описание изобретения

Настоящее изобретение касается этих потребностей, предоставляя антагонисты к провоспалительным цитокинам 1Б-17А и 1Б-17Е. Конкретно, провоспалительные цитокины 1Б-17А и 1Ь-17Е имеют высокую степень подобия последовательностей, имеют много общих биологических свойств, оба произведены активированными Т-лимфоцитами. Они оба вовлечены как факторы, которые способствуют прогрессии различных аутоиммунных и воспалительных болезней, включая ревматоидный артрит и астму. Фактически, реагенты, которые отрицают функцию 1Б-17А. значительно повышают склонность и серьезность заболевания в нескольких мышиных моделях человеческой болезни. 1Б-17А опосредует свои эффекты через взаимодействие с рецептором его узнавания, рецептором 1Б-17 (1Ь-17К), но рецептор для 1Ь17Е еще не идентифицирован. Ранее, мы сообщили, что 1Ь-17К.С является рецептором как для 1Ь-17А, так и для 1Б-17Е и связывает оба с одинаково высоким сродством. 1Б-17К, с другой стороны, связывает 1Б-17А с высоким сродством, но 1Б-17Е связывает с очень низким сродством. Совместно с этим было показано, что растворимая форма 1Б-17Р блокирует связывание и передачу сигналов 1Б-17А в клетках, экспрессирующих каждый рецептор, но не мешает связыванию или функции 1Б-17Е на 1Ь-17КС.

Вмешательство 1Ь-17А было предложено как эффективная терапия нескольких аутоиммунных болезней, использующих антагонисты по настоящему изобретению, которые могут блокировать, ингибировать, уменьшать, противодействовать или нейтрализовать активность 1Ь-17А, 1Ь-17Е, или как 1Б-17А, так и 1Ь-17Е, которые включают растворимые 1Б-17РС и 1Ь-17РС/1Ь-17РА рецепторы, будут иметь преимущества перед методами лечения, которые предназначаются только для одного из этих двух цитокинов. Изобретение далее обеспечивает их применение при воспалительной болезни, также как близких составов и методов.

- 1 015351

А) Краткий обзор.

Заболевания, связанные с иммунной системой, и воспалительные болезни представляют собой проявление или последствие довольно сложных, часто многократно взаимосвязанных биологических путей, которые в нормальной физиологии важны, чтобы ответить на повреждение или рану, вызывать репарацию повреждения или раны, и устанавливают врожденную и приобретенную защиту против инородных организмов. Болезнь или патология встречаются, когда эти нормальные физиологические пути вызывают дополнительное повреждение или раны, либо как непосредственно относящиеся к интенсивности реакции, как следствию патологического регулирования, или чрезмерного возбуждения, как реакция на свое, либо как к их комбинации.

Хотя генез этих болезней часто включает многостадийные пути и часто многократные различные биологические системы/пути, вмешательство в критических точках в один или несколько из этих путей может иметь улучшающий или терапевтический эффект. Терапевтическое вмешательство может иметь место, как антагонизм вредного процесса/пути или как стимулирование полезного процесса/пути.

Много заболеваний, связанных с иммунитетом, известны и всесторонне изучены. Такие болезни включают иммуноопосредованные воспалительные болезни (такие как ревматоидный артрит, иммуноопосредованная почечная болезнь, гепатобилиарная болезнь, воспалительная болезнь кишечника (ВБК), псориаз и астма), неиммуноопосредованные воспалительные болезни, инфекционные болезни, болезни иммунодефицита, неоплазия и т.д.

Т-Лимфоциты (Т-клетки) являются важным компонентом иммунной реакции млекопитающих. Т-Клетки узнают антигены, которые связаны с аутомолекулой, закодированной генами в пределах главного комплекса гистосовместимости (ГКГС). Антиген может быть показан вместе с молекулами ГКГС на поверхности антигенпредставляющих клеток, вирусинфицированых клеток, раковых клеток, трансплантатов и т. д. Система Т-лимфоцитов устраняет эти измененные клетки, которые представляют угрозу для здоровья млекопитающего-хозяина. Т-Клетки включают клетки Т-хелперы и цитотоксические Т-клетки. Клетки Т-хелперы сильно разрастаются после узнавания комплекса антиген-ГКГС на антигенпредставляющей клетке. Т-Хелперы также секретируют много цитокинов, т.е. лимфокинов, которые играют центральную роль в активации В-клеток, цитотоксических Т-клеток и многих других клеток, которые участвуют в иммунной реакции.

Центральным событием и в гуморальной, и в клеточно-опосредованной иммунной реакции является активация и клональная экспансия клеток Т-хелперов. Активация Т-хелпера начинается взаимодействием рецептора Т-клетки РТК-СЭ3 комплекса с антиген-ГКГС на поверхности антигенпредставляющей клетки. Это взаимодействие вызывает каскад биохимических событий, которые побуждают оставшиеся Т-хелперы вступать в клеточный цикл (переход С0 в С1) и приводит к экспрессии рецептора высокого сродства к 1Ь-2 и иногда к 1Ь-4. Активированная Т-клетка прогрессирует через цикл пролиферации и дифференциации в клетки памяти или эффекторные клетки.

В дополнение к сигналам, опосредуемым через РТК, активация Т-клеток включает дополнительную костимуляцию, вызванную цитокинами, выделяемыми антигенпредставляющей клеткой или через взаимодействие с мембраносвязанными молекулами на антигенпредставляющей клетке и Т-клетке. Цитокины 1Ь-1 и 1Ь-6, как было показано, обеспечивают костимулирующий сигнал. Кроме того, взаимодействие между молекулой В7, экспрессируемой на поверхности антигенпредставляющей клетки, и молекулами СЭ28 и СТЬА-4, экспрессируемыми на поверхности Т-клетки, производит активацию Т-клетки. Активированные Т-лимфоциты экспрессируют увеличенное число клеточных молекул адгезии, таких как 1САМ-1, интегрины, УЪА-4, ЬРА-1, СЭ56 и т.д.

Пролиферация Т-клеток в смешанной лимфоцитной культуре или смешанной лимфоцитной реакции (СЛР) является установленным показанием способности соединения стимулировать иммунную систему. Во многих иммунных реакциях воспалительные клетки инфильтруются в участок раны или инфекции. Мигрирующие клетки могут быть нейтрофильными, эозинофильными, моноцитарными или лимфоцитарными, как может быть определено гистологической экспертизой поврежденных тканей. Ситгеи! Рго!осо1к ίη 1ттиио1оду, еб. Ιοίιη Е. Сойдаи, 1994, Ιοίιη \Убеу & 8ои5, 1пс.

Иммуннозависимые болезни могут лечиться подавлением иммунной реакции. Применение растворимых рецепторов и/или нейтрализация антител, которые ингибируют молекулы, имеющие иммуностимулирующую активность, было полезным в лечении иммунноопосредованных и воспалительных болезней. Молекулы, которые ингибируют иммунную реакцию, могут использоваться (белки непосредственно или через использование агонистов антитела), чтобы ингибировать иммунную реакцию и таким образом улучшить течение иммуннозависимой болезни.

Интерлейкин-17 (1Ь-17А) идентифицировали как клеточный ортолог белка, кодированного Т-лимфотропным вирусом герпеса (Негрек νίπ.15 8а1тш, Н8У) [см. Рои\тег е! а1., 1. 1ттиио1., 150 (12): 5445-5456 (1993); Уао е! а1., 1. 1ттиио1, 122 (12):5483-5486 (1995) и Уао е! а1. 1ттиш!у, 3 (6): 811-821 (1995)]. Последующая характеризация показала, что этот белок представляет собой сильный цитокин, действие которого может вызывать провоспалительные реакции в разных периферических тканях. 1Ь17А представляет собой дисульфидно-связанный гомодимерный цитокин приблизительно 32 кЭа, который синтезируется и секретируется только СЭ4+-активированными Т-клетками памяти (рассмотрено у

- 2 015351

Γοδδίοζ е! а1. 1п!. Веу. 1ттипо1., 16: 541-551 [1998]). Конкретно, 1Ь-17 синтезируется как предшественникполипептид из 155 аминокислот с Ν-концевой сигнальной последовательностью из 19-23 остатков и секретируется как дисульфидно-связанный гликопротеин. 1Ь-17А раскрыт в XVО 9518826 (1995), АО 9715320 (1997) и АО 9704097 (1997), так же как в патенте США № 6063372.

Несмотря на его ограниченное распределение в ткани, Ш-17А показывает плейотропные биологические активности на различных типах клеток. Ш-17А, как было найдено, стимулирует продукцию многих цитокинов. Это вызывает секрецию Ш-6, Ш-8, Ш-12, лейкозподавляющего фактора (ЫЕ), простагландина Е2, МСР-1 и ГКСФ прикрепленными клетками, такими как фибробласты, кератиноциты, эпителиальные и эндотелиальные клетки. У Ш-17А также есть способность вызвать поверхностную экспрессию 1САМ-1, пролиферацию Т-клеток и рост и дифференциацию человеческих клетокпредшественников СБ34.8ир.+ в нейтрофилы. Ш-17А был также вовлечен в метаболизм кости и, как предположено, играет важную роль в патологических состояниях, характеризуемых наличием активированных Т-клеток и продукцией ФНО-альфа, таких как ревматоидный артрит и ослабление костных имплантатов (Уап Вехооцеп е! а1., 1. Вопе Мтег. Век. 14: 1513-1521 [1999]). Активированные Т-клетки синовиальной ткани, полученной от больных ревматоидным артритом, как было найдено, секретируют более высокое количество Ш-17А, чем полученное от нормальных людей или больных остеоартритом (СкаЬаиб е! а1. ЛйкгйФ Вкеит. 42: 963-970 [1999]). Предполагалось, что этот провоспалительный цитокин активно способствует синовиальному воспалению в ревматоидном артрите. Кроме его провоспалительной роли Ш-17А, кажется, способствует патологии ревматоидного артрита еще одним механизмом. Например, Ш-17А, как было показано, вызывает экспрессию фактора дифференциации остеокластов (ФДО) мРНК в остеобластах (Ко!аке е! а1., 1. Скп. 1пуек!., 103: 1345-1352 [1999]). ФДО стимулирует дифференцирование клеток-предшественников в остеокласты, клеток, вовлеченных в резорбцию кости.

Так как уровень Ш-17А значительно увеличен в синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом, кажется, что образование остеокластов, вызванное Ш-17А, играет критическую роль в резорбции кости при ревматоидном артрите. 1Ь-17А, как также полагают, играет ключевую роль в определенных других аутоиммунных нарушениях, таких как рассеянный склероз (МаФкеуюшк е! а1. Ми11. 8с1ег, 5: 101-104 [1999]). Ш-17А, как далее показано, внутриклеточной передачей сигналов стимулирует приток Са.кир.2+ и снижение [цАМФ] в человеческих макрофагах (1оуапоу1С е! а1., 1. 1ттипо1., 160:3513 [1998]). Фибробласты, обработанные Ш-17А, вызывают активацию ΝΕ-.карра.В [Уао е! а1. 1ттипйу, 3:811 (1995), 1оуапоу1С е! а1., выше], в то время как макрофаги, обработанные им, активируют ΝΕ-.карра.В и митогенактивированные протеинкиназы (8ка1от-Вагек е! а1., 1. Вю1. Скет., 273:27467 [1998]).

Дополнительно, Ш-17А также разделяет подобные последовательности с цитокинподобным фактором 7 млекопитающих, который вовлекается в рост хряща и кости. Другие белки, с которыми полипептиды Ш-17А разделяют подобные последовательности, являются человеческим интерлейкинзависимым фактором, полученным из эмбриона (ΕΌΙΒΕ), и интерлейкином 20.

Совместимый с широким диапазоном эффектов Ш-17А, рецептор клеточной поверхности для Ш17А, как было найдено, широко экспрессируется во многих тканях и типах клеток (Уао е! а1. Су!окте, 9:794 [1997]). В то время как аминокислотная последовательность человеческого рецептора Ш-17А (Ш17В) (866 аминокислот) предсказывает белок с единственным трансмембранным доменом и длинным, 525 аминокислот, внутриклеточным доменом, причем последовательность рецептора уникальна и не подобна последовательности любого из рецепторов из семейства рецепторов цитокина/факторов роста. Это вместе с нехваткой подобия самого Ш-17А другим известным белкам указывает на то, что 1Ь-17А и его рецептор могут быть частью нового семейства сигнальных белков и рецепторов. Показано, что активность Ш-17А опосредуется через связывание его с уникальным рецептором поверхности клетки, причем предыдущие исследования показали, что контактирование Т-клеток с растворимой формой полипептидного рецептора Ш-17А ингибировала пролиферацию Т-клеток и продукцию Ш-2, вызванную фитогемоагглютином (ФГА), конканавалином А и моноклональным антителом анти-РТК (Уао е! а1., 1. 1ттипо1, 155:5483-5486 [1995]). Также есть значительный интерес в идентификации и характеристике новых полипептидов, имеющих гомологию с известными рецепторами цитокина, конкретно с рецепторами 1Ь17А.

Картина экспрессии Ш-17Е, кажется, подобна картине экспрессии Ш-17А в том, что она включает только Т-клетки, активированные СБ4+, и моноциты (§!агпе8 е! а1. 1. 1ттипо1. 167: 4137-4140 [2001]). Ш17Е, как было продемонстрировано, вызывает ГКСФ, Ш-6 и Ш-8 в фибробластах (Нуто\\йх е! а1., ЕМВО 1. 20:5322-5341 [2001]) и ΤΟΕ-β в эндотелиальных клетках (§1агпе8 е! а1. 1. 1ттипо1. 167: 4137-4140 [2001]). Недавно сообщалось, что 1Ь-23, цитокин, произведенный дендритной клеткой, может опосредовать продукцию как Ш-17А, так и Ш-17Е, прежде всего в Т-клетках памяти (Аддагоа1 е! а1. 1. Вю1. Скет. 278:1910-1914 [2003]).

Кроме того, избыточная экспрессия или повышенная регуляция как Ш-17А, так и Ш-17Е проявляется у людей, страдающих артритом и астмой (рассмотрено у Моке1еу е! а1. Су!окте Сго\\1к Еас!ог Веу. 14:155-174 [2003]). Что касается артрита, эти цитокины действуют в манере, характерной для деструкции хряща и суставов, которая связана с ревматоидным артритом или остеоартритом. Например, Ш-17А и 1Ь17Ε, как было продемонстрировано, увеличивают матриксную деградацию в суставных эксплантатах

- 3 015351 хряща через выделение гликозаминогликанов протеогликана хряща и фрагментов коллагена, ингибируя синтез новых протеогликанов и коллагенов (Са1 е! а1., СуЗокте 16:10-21 [2001]; Абит е1 а1., ΑγΙΗγιΙικ Вбеит. 44:2078-2083 [2001]).

Подобно 1Ь-17А, чрезмерная экспрессия 1Ь-17Е в мышах, как также было показано, увеличивает рекрутмент нейтрофилов легкого и приводит к повышенной экспрессии Тб1-связанных цитокинов в легком, включая 1Ь-6, ΙΕΝ-гамма, ΙΡ 10 и МЮ (§1атпе8 е1 а1. 1. 1ттипо1. 167: 4137-4140 [2001]). 16-17Е также повышенно активировался в Т-клетках от сенсибилизированных аллергеном астматиков (КатадисЫ е1 а1., 1ттипо1., 167:4430-4435 [2001]) и, как найдено, вызвал продукцию 1Ь-6 и 1Ь-8 в клетках нормального человеческого бронхиального эпителия (ΝΗΒΕ). В отличие от 1Ь-17А, 1Ь-17Е, кажется, ингибирует развитие кровеносных сосудов ίη νίίτο (81агпе§ е! а1. 1. 1ттипо1., 167: 4137-4140 [2001]).

мРНК 1Ь-17Е не была обнаружена Нозерн-блоттинг анализом в различных человеческих тканях, но резко индуцировалась при активации СЭ4+ Т-клеток и моноцитов. У мышей клетки Т62 и тучные клетки, как было найдено, экспрессируют 1Ь-17Е при активации. См. ЭитоШ. Ехрей Орш. Тбет. Ра1еп(5. 13 (3) (2003). Подобно 1Ь-17А, экспрессия 1Ь-17Е, как было также найдено, активируется интерлейкином 1Ь-23 у мышей.

Семейство цитокин/рецептор 1Ь-17, кажется, представляет уникальную сигнальную систему в пределах сети цитокинов, которая предложит инновационные подходы к манипуляции иммунными и воспалительными реакциями (ответами). Соответственно настоящее изобретение основано на открытии нового рецептора семейства 1Ь-17, 1Ь-17КС и его способности связывать как Ι6-17Α, так и 1Ь-17Е.

1Ь-17КС был первоначально идентифицирован, используя биоинформатический подход, чтобы искать белки, связанные с 1Ь-17КА и идентифицированные через кДНК, кодирующую белок 1Ь-17ВС, связанный с рецептором 1Ь-17. Несмотря на его очевидное подобие рецептору 1Ь-17 (1Ь-17КА), который связывается с прототипичным членом 1Ь-17А семейства 1Ь-17, и идентификацию пяти других членов семейства цитокина 1Ь-17, ранее не сообщалось об определенном лиганде для 1Ь-17ВС. Однако 1Ь-17А и 1Ь-17Е были идентифицированы как определенные лиганды для 1Ь-17ВС, как описано в заявке на патент США № 11/150533, поданной 10 июня 2005 г. и изданной как патент США № 20060002925. Конкретно, эти лиганды были идентифицированы с применением клеток почек детенышей хомячков (ПДХ), которые были устойчиво трансфицированы конструктом, кодирующим либо человеческий 1Ь-17КА (61Ь-17КА), либо 1Ь-17ВС (ЫЬ-17ВС). Экспрессия рецепторов на поверхности была подтверждена анализом ЕАС8 (анализ клеточным сортером с возбуждением флуоресценции), используя либо моноклональное антитело для ЫЕ-17КА. или поликлональную антисыворотку к ЫЕ-17К.С. Чтобы оценить связывание цитокина, биотинилированные формы человеческих Ш-17А, С, Ό, Е, и Е и стрептавидин, коньюгированный с флюорохромом, применяли, чтобы обнаружить связывание цитокина с трансфицированными клетками поточной цитометрией. Результаты ясно показали, что устойчиво трансфицированные клетки ПДХ, экспрессирующие 61Ь-17КА, ясно связывали человеческий Ш-17А (ЫЕ-17А), как ожидалось, затем как клетки, трансфицированные пустым вектором экспрессии, были не в состоянии связать какие-либо члены тестированного семейства Ш-17. Относительно слабое связывание человеческого Ш-17Е (ЫЕ-17Е) с бШ-ПКА-трансфицированными клетками также наблюдалось, но не было никакого значительного связывания других членов тестированного семейства Ш-17. Другие члены семейства Ш-17 были исследованы на связывание с ЫЕ-17ВС-трансфицированными клетками и отмечено, что эти клетки показали значительное связывание с ЫЕ-17Е. Кроме того, значительное связывание ЫЕ-17А с этими клетками было замечено, но не найдено никакого связывания ЫЕ-17С, Ό или Е. Эти данные доказали, что ЫЕ-17К.С был рецептором как для ЫЕ-17Е, так и для ЫЕ-17А.

Дополнительно, уровень флюоресценции в диапазоне концентраций цитокина был исследован, чтобы определить относительное сродство ЫЬ-17А и Е к ЫЬ-17КА и ЫЬ-17ВС. Сравнивая средние интенсивности флюоресценции индивидуальных цитокинов на каждом трансфектанте, отмечено, что ЫЕ-17А связывался намного лучше с ЫЬ-17КА, чем ЫЬ-17Е, но что оба цитокина, оказалось, связывались одинаково хорошо с ЫЕ-17КС-трансфицированными клетками. Интересно, что связывание цитокина с клетками, которые экспрессировали оба рецептора, оказалось, было совокупным, без признака кооперативности.

Затем специфичность этого связывания была исследована в попытке конкурировать за связывание с немеченым цитокином. Трансфицированные клетки ПДХ культивировали при фиксированной концентрации биотинилированного цитокина и увеличивающихся концентрациях немеченого цитокина, и количество связанного биотинилированного материала количественно определяли ЕАС8 анализом. Показано, что связывание обоих, ЫЕ-17А и Е, с ЫЕ-17К.С было специфическим, начиная с увеличивающихся концентраций немеченого цитокина, которому мешает связывание с биотинилированным материалом. Фактически, немеченые ЫЕ-17А и Е эффективно перекрестно конкурируют за связывание биотинилированных форм обоих цитокинов с ЫЕ-17ВС-трансфицированными клетками, предполагая, что эти два цитокина связывают ЫЕ-17К.С с похожим сродством, и что они связываются с перекрывающимися, если не идентичными участками. Немеченый ЫЕ-17А также эффективно конкурировал за связывание обоих биотинилированных ЫЬ-17А и Е с ЫЕ-17КА-трансфицированными клетками, в то время как немеченый ЫЕ-17Е не показал, по существу, способности конкурировать за связывание ЫЕ-17А с ЫЕ-17КА. Это

- 4 015351 указывает, что, хотя ЫЬ-17Г показал определенное связывание с ЫЬ-17КЛ, авидность этого взаимодействия, оказалось, была значительно ниже, чем взаимодействия ЫЬ-17Л и ЫЬ-17КЛ.

Исследования насыщенности связывания проведено, чтобы измерить сродство связывания ЫЬ-17Л и Г с ЫЬ-17КС и ЫЬ-17КЛ. Линии клеток ПДХ, устойчиво экспрессирующих ЫЬ-17КЛ или ЫЬ-17КС, культивировали с йодсодержащими ЫЬ-17Л или Г в условиях насыщения связывания, чтобы определить константы сродства каждого цитокина для каждого рецептора. ЫЬ-17А связывал как ЫЬ-17КЛ, так и ЫЬ-17КС с сопоставимым сродством (табл. 1). Конкретно, клетки ПДХ, трансфицированные указанным рецептором, использовались, чтобы установить величины К_б для ЫЬ-17 А и ЫЬ-17Р, как описано в методах. Показанные результаты являются средними величинами Кб, полученными из тройного определения.

		Таблица 1
Г......................... ”.........~ ~	:Ы1_-17А	ИИ-17Е ¹
ЫИ7КС (х1)	[о,6 пМ	11,0 пМ
КИ-17КА	1,9 пМ	1,5 пМ

Кроме того, сродство ЫЬ-17Р к Н1Ь-17КС очень подобно сродству Н1Ь-17А к этому рецептору (см. табл. 1 выше). Однако совместимое с результатами, полученными, используя биотинилированные цитокины, сродство ЫР-17Р к Н1Ь-17КА было примерно 1000-кратно ниже относительно измеренных других величин сродства. Это указывает, что Н1Ь-17А и Р связывают Н1Ь-17КС с подобными величинами сродства, но их величины сродства к ΗΙΡ-17ΚΛ резко отличаются.

Наблюдение, что Н1Ь-17КС связывал как Н1Ь-17А, так и Р, с высоким сродством, предполагает, что клетки, экспрессирующие Н1Ь-17КС, должны быть одинаково способны к отклику на Н1Ь-17А и Р. С другой стороны, так как Н1Ь-17КА связывал Н1Ь-17А с высоким сродством, а ЫР-17Р приблизительно в 1000 раз менее хорошо, выполнение состоит в том, что клетки, экспрессирующие Н1Ь-17КА, были в физиологических условиях, только реакцией на Н1Ь-17А. Ранее, было показано, что Н1Ь-17КА экспрессируется повсеместно, но его экспрессия, как сообщалось, была более высокой в кроветворных клетках при более низкой экспрессии в других тканях. Поэтому экспрессия Н1Ь-17КС изучалась, чтобы определить степень перекрывания в структурах экспрессии. Нозерн-блоттинг анализ показал, что Н1Ь-17КС экспрессировался при высоких уровнях в железистых тканях, таких как надпочечник, простата, печень и щитовидная железа, при неподдающейся обнаружению экспрессии в кроветворных тканях.

Чтобы далее исследовать экспрессию этих рецепторов в кроветворных клетках, связывание биотинилированных Н1Ь-17А и Р с мононуклеарными клетками периферической крови (МКПК) также исследовалось многопараметрическим РАС8 анализом. Результаты указали, что Н1Ь-17А связывался фактически со всеми исследованными субпопуляциями МКПК, затем как ЫР-17Р не показал поддающееся обнаружению связывание с любой из этих групп. Это совместимо со способностью Н1Ь-17КА связывать ЫЬ17А, но не ЫР-17Р, с высоким сродством и со способностью обнаруживать мРНК для Н1Ь-17КС в МКПК. Все вместе эти данные указывают, что 1Ь-17КС предпочтительно экспрессируется в некроветворных тканях, в то время как 1Ь-17КА предпочтительно экспрессируется в кроветворных клетках.

Высокое сродство связывания Н1Ь-17А и Р с Н1Ь-17КС-трансфицированными клетками предполагает, что эффективным лекарством могла быть растворимая форма Н1Ь-17КС. Такая молекула была эффективным антагонистом этих двух цитокинов. Чтобы проверить это непосредственно, растворимая форма человеческого Н1Ь-17КС была произведена как белок слитого фиброцита (Рс) и испытана на способность ингибировать связывание Н1Ь-17А и Р. Эти эффекты затем сравнивали с результатами, полученными с применением растворимой формы Н1Ь-17КА. Увеличивающиеся концентрации ЫР-17КС-1§ или ЫЬ17КА-1§ включались в реакции связывания, и анализ РАС8 использовался, чтобы оценить влияние растворимых рецепторов на связывание биотинилированных цитокинов с устойчиво трансфицированными клетками ПДХ. Растворимый Н1Ь-17КС ингибировал связывание и Н1Ь-17РА и Р до близкой степени, тогда как слитый белок Рс другого члена семейства 1Ь-17К, ΗΙΡ-17ΚΌ, не имел никакого эффекта. С другой стороны, растворимый Н1Ь-17КА эффективно блокировал связывание Н1Ь-17А, но не имел, по существу, никакого влияния на связывание ЫР-17Р. Подобные результаты были получены, исследуя связывание Н1Ь-17А с кроветворными клетками. Это связывание эффективно блокировало применение ЫР-17КА-1§ и ЫР-17КС-1§, но не ΗΙΡ-17ΚΌ-Ι§. Эти данные совместимы с результатами, полученными из измерений сродства, и указывают, что растворимые рецепторы ведут себя также, как их формы, фиксированные мембраной.

Как дополнительное исследование способности человеческого ЫР-17КС-1§ связываться с Н1Ь-17А и Р, сродство растворимого рецептора к этим цитокинам оценивали, используя анализ В1асоге. Растворимый ЫР-17ВС, связанный как с Н1Ь-17А, так и с Р, с высоким сродством (табл. 2), оказывая дополнительную поддержку идее использовать этот реагент как антагонист эффектов как Н1Ь-17А, так и Р, ΐη νίνο. Конкретно, растворимые рецепторы захватывались на чипы, и эксперименты по связыванию выполняли, как описано ниже.

- 5 015351

Таблица 2

ЫЫ7КС-1д	К_а (оп-га1е)	Κ_ά (оЯ-га1е)	К_о
тИ-17А		Νϋ
т11_17Е П1И7А	1,05Е+06 1.24Е+06	Νϋ 4.90Е-04 4.38Е-04	0,469пМ 0,352пМ
п11_17Е	9.91Е+05 1.11Е+06	4,31 Е-04 3.84Е-04	0,435пМ 0,346пМ
т1-17КА-1д	К_а (оп-га1е)	Κ_ά (оГС-га!е)
т1Ь17А	9,78Е+05 1.12Е+06	6.79Е-05 7.99Е-05	0,069пМ 0,072пМ
т1Ь17Р	Νϋ

Х1)=связывание не обнаружено.

Количество сплайс-вариантов у людей намного больше, поэтому авторы выполняли свои начальные эксперименты только на субпопуляции этих молекул. Молекулы, выбранные для этого анализа, также отличались по их включению или исключению из экзона 7, но, в отличие от мыши, все сплайс-варианты включали весь экзон 8. Криптический сплайс-акцептор, найденный в середине последовательности мышиного экзона 8, не присутствует в человеческом экзоне 8. Однако другие испытанные сплайс-варианты включали или исключали экзон 12 ЫЬ-17КС. Эти варианты обозначали ЫЬ-17КСх1 (идентичный по составу экзона мышиному х1 выше), ЫЬ-17КСх4 (идентичный по составу экзона мышиному х4 выше), ЫЬ17КСх2 и ЫЬ-17КСх7. Снова, эти сплайс-варианты быстро экспрессировались в клетки 293Р и испытавались на их способность связывать биотинилированные мышиные и человеческие 1Ь-17А и Р, результаты суммированы в табл. 3.

Таблица 3

	Ехопз¹	Су1окте ВтсПпд²
\/апап1	7 8 12	Ы1_-17А ЫИ7Е т11_-17А т1Ы7Е
Нитап 11_-17КСх4 11_-17КСх1 11_-17КСх2 11-17КСх7	+ + + - + + - + - + + -	+ + - + + + - -

¹ Обозначает экзоны, полностью включенные в транскрипт.

² (+) указывает поддающееся обнаружению, значительное связывание цитокина, как оценено значительным увеличением флюоресценции РАС8. (-) указывает на отсутствие значительного изменения флюоресценции.

Совместимый с экспериментами, представленными ранее, ЫЬ-17КСх1 связывался как с ЫЬ-17А, так и с Р, но, не связывался ни с одним цитокином мыши. ЫЬ-17КСх4 также связывался с обоими человеческими цитокинами, и как его мышиный двойник, он связывался с ш1Ь-17Р, но не с ш1Ь-17А. ЫЬ17КСх2 и х7 не в состоянии связываться с любым из четырех испытанных цитокинов, хотя они ясно экспрессировались на поверхности трансфицированных клеток, начиная с поликлональной антисыворотки против ЫЬ-17КС, меченых клеток СЭ8⁺ (данные не показаны). Эти результаты связывания честно повторялись в устойчиво трансфицированных клетках ПДХ также. Все вместе, эти данные поддерживают заключения относительно существенных участков белка 1Ь-17КС, нужных для связывания с человеческими цитокинами.

Многочисленные публикации включали 1Ь-17А и, в меньшей степени, 1Ь-17Р, как вносящие вклад в прогресс болезни и тяжесть коллагениндуцированного артрита (КИА) мышей и человеческого ревматоидного артрита. Была исследована экспрессия ш1Ь-17А и Р в суставах или лимфатических узлах дренирования (ЛУД) мышей, которых иммунизировали коллагеном, чтобы вызвать КИА. Анализ полимеразноцепной реакцией (ПЦР) в режиме реального времени ясно продемонстрировал, что оба цитокина активировались в обеих тканях в патологически измененных мышах относительно неиммунизированных контрольных групп, ясно указывая, что экспрессия коррелировала с болезнью. Кроме того, относительная экспрессия ш1Ь-17КА и ш1Ь-17КС также исследовалась в тех же самых тканях. Однако в этом случае не было воспроизводимой корреляции экспрессии ни одного рецептора с болезнью. Кроме того, что было очевидно, было несоответствие в экспрессии при сравнении ЛУД с некроветворной тканью (задняя нога). В согласии с предыдущими результатами, что касается экспрессии человеческих рецепторов, ш1Ь-17КА, как было найдено, более высоко экспрессируется в кроветворной ткани, а ш1Ь-17КС более высоко экспрессируется в некроветворной ткани. Эти данные предполагают, что экспрессия ш1Ь-17А и экспрессия ш1Ь-17Р коррелируют с болезнью, так что оба из необходимых рецепторов присутствуют в патологически измененной и нормальной ткани, и предполагают, что нейтрализация этих цитокинов может быть эффективной терапией, чтобы предотвратить развитие болезни.

- 6 015351

Соответственно родственным рецептором для ЕБ-17А и Р, как показано, является ЕБ-17КС. Особенно, ЫБ-17КС связывается с ЫЬ-17Л и Р с похожими величинами сродства. Так как эти два члена семейства 1Ь-17 имеют 55% идентичных последовательностей, поэтому, возможно, не удивительно, что они имеют одинаковые рецепторы. Однако ЫЬ-17КА связывает ЫЬ-17Л с высоким сродством, но связывает ЫТ-17Р со сродством, которое почти 1000-кратно ниже, предполагая, что в физиологических условиях ЫБ-17КА не будет связывать ЫТ-17Р. Применение состоит в том, что клетки, которые экспрессируют ЫТ-17КС, должны отвечать как на ЫТ-17Л, так и на Р, затем как клетки, которые экспрессируют только ЫБ-17КА, отвечают только на 1Ь-17Л. У этого различия есть потенциал, чтобы показать, как эти цитокины влияют на различные ткани. Через экспрессионный анализ показано, что, хотя ЕБ-17КА экспрессируется повсеместно, он более высоко экспрессируется в кроветворных клетках, затем как ЕБ-17КС имеет тенденцию экспрессироваться в некроветворных тканях без экспрессии в кроветворных клетках. В соответствии с этим, все субпопуляции мононуклеарных клеток человеческой периферической крови связывают ЫЬ-17Л, но не связывают ЫТ-17Р. Кроме того, это предполагает, что некроветворные ткани должны отвечать как на 1Ь-17Л, так и на Р, тогда как кроветворные клетки должны отвечать только на 1Ь-17Л.

Это исследование связывания цитокина с различными сплайс-вариантами 16-17ВС выявляет два участка рецептора, которые являются существенными для связывания цитокина, и есть тонкие различия в характеристиках связывания мышиных и человеческих цитокинов. Кроме того, эти характеристики согласуются для цитокинов независимо от вида исследованного рецептора. Как показано данными, представленными в табл. 3, экзон 12 и все экзоны 8 требуются для ЫЬ-17Л и Р, чтобы связываться с ЕБ-17КС, так как только эти цитокины связываются с человеческими х1 вариантами и человеческими х4 вариантами. Каждая из этих изоформ включает все экзоны 8 и экзон 12, хотя они отличаются относительно того, включается ли экзон 7 или нет. Это подразумевает, что экзон 7 необязателен для связывания человеческих цитокинов.

Важность генерирования антагониста как к функции 1Ь-17Л, так и к 1Ь-17Р кажется ясной из доступной информации, которая показывает сильную корреляцию между экспрессией 1Ь-17Л и Р и развитием многих аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Эти два цитокина вызывают другие воспалительные цитокины и хемокины, так же как матриксные металлопротеазы, которые способствуют деструкции коллагена и кости в аутоиммунном артрите. Этот реагент должен служить эффективным терапевтическим средством для ревматоидного артрита и в других воспалительных заболеваниях, в которых ЫЬ17А и Р играют роль.

Таким образом, растворимые формы человеческого ЕБ-17КС разработаны, чтобы служить антагонистом как к 1Ь-17А, так и к 1Ь-17Р. Терапевтически, эти растворимые полипептиды ЕБ-17КС эффективны. Однако из-за многочисленных факторов растворимый ЕБ-17КС легко не секретируется многочисленными и разными производящими системами, доступными в технике. И при этом не секретируется в адекватных количествах, необходимых в производственных целях. Таким образом, есть потребность в технике развивать антагонисты к 1Ь-17А и 1Ь-17Р, которые могут быть экспрессированы и секретированы в количествах, которые могут быть масштабированы для производства.

Соответственно настоящее изобретение отвечает этой потребности, обеспечивая антагонисты к 1Ь17А и 1Ь-17Р, которые могут быть экспрессированы и секретированы. Конкретно, настоящее изобретение основано на развитии и открытии ряда естественно не встречающихся растворимых молекул или растворимых полипептидов, которые связываются с, противодействуют и (или) блокируют связывание 1Ь-17А и 1Ь-17Р с их рецепторами. Эти растворимые полипептиды включают участки ЕБ-17КС. Эти растворимые полипептиды могут также включить участки как ЕБ-17КС, так и 1Ь-17КА (1Ь-17КС/1Ь-17КА).

Один такой предпочтительный вариант представлен на фиг. 4А и 4В, так же как в последовательностях 8ЕО ГО N0:157 и 158. Этот растворимый полипептид включает экзоны 1-6 человеческого ЕБ-17КА (последовательность 8Е0 Ш N0:21) и экзоны 8-16 человеческого 1Ь-17КСх1 (последовательность 8Е0 ГО N0:2). Более конкретно, этот растворимый полипептид сливают с молекулой фиброцита (Рс), такой как Рс5, как содержится в последовательностях 8Е0 ГО N0:157 и 158. Однако специалист в технике легко признал бы, что любая молекула Рс может быть использована, так же как любая другая молекула, которая приводила бы к димеризации.

Также антагонисты к активности 1Ь-17Р и 1Ь-17А, такие как 1Б-17КС и 1Ь-17КС/1Ь-17КА, растворимые рецепторы по настоящему изобретению, полезны в терапевтическом лечении воспалительных болезней, особенно как антагонисты как к ЕБ-17Р, так и к ЕБ-17А, по отдельности или вместе, в лечении болезней, включающих эти молекулы. Кроме того, антагонисты к активности ЕБ-17А и активности 1Ь17Р, такие как растворимые рецепторы по настоящему изобретению, полезны в терапевтическом лечении других воспалительных болезней, например, чтобы связывать, блокировать, ингибировать, снижать, противодействовать или нейтрализовать ЕБ-17Р и ЕБ-17А (или индивидуально или вместе), чтобы лечить псориаз, атопический и контактный дерматит, воспалительную болезнь кишечника (ВБК), синдром раздражения толстой кишки (СРК), колит, эндотоксемию, артрит, ревматоидный артрит, псориатический артрит, респираторное заболевание взрослых (АКО), септический шок, полиорганную недостаточность, воспалительное повреждение легкого, такое как астма, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), гиперреактивность дыхательных путей, хронический бронхит, аллергическую астму, бактери

- 7 015351 альную пневмонию, псориаз, экзему и воспалительную болезнь кишечника, такую как неспецифический язвенный колит и болезнь Крона, инфекцию НейсоЬасГет ру1оп, интраабдоминальные спайки и/или абсцессы как результаты перитонеального воспаления (т.е. от инфекции, раны и т.д.), системную волчанку, эритематоз (8ЬЕ), рассеянный склероз, системный склероз, нефротический синдром, отторжение аллотрансплантата органа, болезнь - пересаженная ткань против хозяина (6УНЭ). отторжение трансплантата почки, легкого, сердца, и т.д., артрит, вызванный стрептококковой клеточной оболочкой (8С^), остеоартрит, гингивит/периодонтит, герпетический стромальный кератит, рак, включая простату, почки, ободочную кишку, яичники, шейку матки, лейкоз, ангиогенез, рестеноз и болезнь Кавасаки.

Субъединицы рецепторов цитокина характеризуются многодоменной структурой, включающей домен, связывающий лиганд, и эффекторный домен, который обычно включается в трансдукцию сигнала. Мультимерные рецепторы цитокина включают мономеры, гомодимеры (например, рецептор фактора роста, полученного из тромбоцитов (ФРПТ, αα и ββ изоформы), рецептор эритропоэтина, МРЬ [рецептор тромбопоэтина] и рецептор колониестимулирующего фактора гранулоцитов (ГКСФ)), гетеродимеры, которых субъединицы каждая имеет лигандсвязывающий и эффекторный домены (например, рецептор ФРПТ, αβ изоформу) и мультимеры, имеющие составляющие субъединицы с непарными функциями (например, 1Ь-2, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-7 и рецепторы ГМ-КСФ). Некоторые рецепторные субъединицы являются общими у многих рецепторов. Например, субъединица АЮ2В, которая не может связывать лиганд самостоятельно, но включает внутриклеточный домен трансдукции сигнала, является компонентом рецепторов ГМ-КСФ и 1Ь-3. Много рецепторов цитокина могут быть помещены в одно из четырех близких семейств на основе их структур и функций. Гемопоэтические рецепторы класса I, например, характеризуются наличием домена, содержащего сохраненные остатки цистеина и мотив ^8X^8. Дополнительные домены, включая домены протеинкиназы; домены фибронектина типа III и домены иммуноглобулина, которые характеризуются дисульфидно-связанными петлями, присутствуют в определенных гемопоэтических рецепторах. Структура рецептора цитокина была рассмотрена Иг6а1, Апп. Иерог15 Меб. Сйет., 26:221-228, 1991 и Соктап, СуГокте, 5:95-106, 1993. Обычно считают, что при селективном давлении организмы приобретают новые биологические функции, новые члены семейства рецептора возникали из дублирования существующих генов рецептора, приводя к существованию мультигенных семейств. Члены семейства, таким образом, содержат остатки предкового гена, и эти характерные особенности могут эксплуатироваться при изоляции и идентификации дополнительных членов семейства.

Соответственно настоящее изобретение направлено на антагонисты ГЕ-17А и ΣΕ-17Ε, которые блокируют каждый соответствующий лиганд от связывания и/или передачи сигналов через соответствующий рецептор или рецепторы.

В предпочтительных вариантах такие антагонисты основаны на полипептидной структуре [Н-17НС, как изображено в фиг. 1-4. Рецептор ГЕ-17К.С имеет большое количество сплайс-вариантов, основанных на включении или исключении определенных экзонов. Как описано ниже, некоторые из этих экзонов требуются для связывания лиганда (ГЕ-17А и (или) ГЕ-17Е).

Настоящее изобретение базируется частично на открытии структурного подобия (домены) между ГЕ-17К.С и другими членами семейства ГЕ-17, такими как ГЕ-17КА. (последовательность 8ЕО ГО N0:21). Конкретно, три домена были идентифицированы.

1) Домен 1 (последовательность 8Е0 ГО N0:159 и 160) включает экзоны 8-10 из №-17^0. Это соответствует аминокислотным остаткам 193-276 из [Е-17ВСх1 (последовательность 8Е0 ГО N0:2) и аминокислотным остаткам 208-291 из ГО-ПКСХ· (последовательность 8Е0 ГО N0:166).

2) Домен 2 (последовательность 8Е0 ГО N0:161 и 162) включает экзоны 11-13 из ^-17^0 Это соответствует аминокислотным остаткам 277-370 из I^-17Κ.Сx1 (последовательность 8Е0 ГО N0:2) и аминокислотным остаткам 292-385 из ГО-ПКСХ· (последовательность 8Е0 ГО N0:166).

3) Домен 3 (последовательность 8Е0 ГО N0:163 и 164) включает экзоны 8-10 из ^-17^0 Это соответствует аминокислотным остаткам 371-447 из I^-17Κ.Сx1 (последовательность 8Е0 ГО N0:2) и аминокислотным остаткам 386-462 из ГО-ПКСХ· (последовательность 8Е0 ГО N0:166).

Таким образом, настоящее изобретение направлено на растворимые полипептиды Ш-ПКС на основе различных комбинаций экзонов, изображенных в фиг. 1. Конкретно, примеры этих растворимых полипептидов включают следующее.

1) Вариант 1210 (последовательности 8Е0 ГО N0:67 и 68), который включает экзоны 1-6 и 8-16 из человеческого I^-17Κ.Сx1, слитого с Ес10 (последовательности 8Е0 ГО N0:174 и 175) через линкер (последовательности 8Е0 ГО N0:176 и 177). Вариант 1210 также имеет препросигнальный пептид из оГРА (полипептидная последовательность, показанная в 8Е0 ГО N0:178). Ес5 или любой эквивалент, известный в технике, может также использоваться вместо Ес10.

2) Вариант 1390 (последовательности 8Е0 ГО N0:69 и 70), который включает экзоны 1-6 и 8-16 человеческого I^-17Κ.Сx1, слитого с Ес10 (последовательности 8Е0 ГО N0:174 и 175). Вариант 1390 также имеет нативную сигнальную последовательность, Ес5, или любой эквивалент, известный в технике, может также использоваться вместо Ес 10.

3) Вариант 1341 (последовательности 8Е0 ГО N0:71 и 72), который включает экзоны 1-6 мышиного

- 8 015351

1Ь-17КЛ и 8-16 человеческого 1Ь-17ВСх1, слитые с Ее10 (последовательности 8Е0 ГО N0:174 и 175) через линкер (последовательности 8Е0 ГО N0:176 и 177). Вариант 1341 также имеет сигнальный пептид мышиного ΙΕ-17ΒΆ (последовательность 8Е0 ГО N0:181). Ес5 или любой эквивалент, известный в технике, также может использоваться вместо Ес10.

4) Вариант 1342 (последовательности 8Е0 ГО N0:73 и 74), который включает экзоны 8-16 человеческого 1Ь-17КСх1, слитые с Ес10 (последовательности 8Е0 ГО N0:174 и 175) через линкер (последовательности 8Е0 ГО N0:176 и 177). Вариант 1342 также имеет сигнальный препропептид из οΐΡΆ (последовательность 8Е0 ГО N0:178). Ес5 или любой эквивалент, известный в технике, также может использоваться вместо Ес10.

5) Вариант 81 (последовательности 8Е0 ГО N0:77 и 78), который включает экзоны 1-7 человеческого ГО-17ВСх1, слитые с Ес5 (последовательности 8Е0 ГО N0:179 и 180). Вариант 81 также имеет нативную сигнальную последовательность. Ес10 или любой эквивалент, известный в технике, также может использоваться вместо Ес5.

6) Вариант 82 (последовательности 8Е0 ГО N0:81 и 82), который включает экзоны 1-8 человеческого ГО-17ВСх1, слитые с Ес5 (последовательности 8Е0 ГО N0:179 и 180). Вариант 82 также имеет нативную сигнальную последовательность. Ес10 или любой эквивалент, известный в технике, также может использоваться вместо Ес5.

7) Вариант 83 (последовательности 8Е0 ГО N0:85 и 86), который включает экзоны 1-9 человеческого ГО-17ВСх1, слитые с Ес5 (последовательности 8Е0 ГО N0:179 и 180). Вариант 83 также имеет нативную сигнальную последовательность. Ес10 или любой эквивалент, известный в технике, также может использоваться вместо Ес5.

8) Вариант 84 (последовательности 8Е0 ГО N0:89 и 90), который включает экзоны 1-10 человеческого ГО-17ВСх1, слитые с Ес5 (последовательности 8Е0 ГО N0:179 и 180). Вариант 84 также имеет нативную сигнальную последовательность. Ес10 или любой эквивалент, известный в технике, также может использоваться вместо Ес5.

9) Вариант 85 (последовательности 8Е0 ГО N0:93 и 94), который включает экзоны 1-11 человеческого 1Ь-17ВСх1, слитые с Ес5 (последовательности 8Е0 ГО N0:179 и 180). Вариант 86 также имеет нативную сигнальную последовательность. Ес10 или любой эквивалент, известный в технике, также может использоваться вместо Ес5.

10) Вариант 86 (последовательности 8Е0 ГО N0:97 и 98), который включает экзоны 14-16 человеческого 1Ь-17ВСх1, слитые с Ес5 (последовательности 8Е0 ГО N0:179 и 180). Вариант 86 также имеет нативную сигнальную последовательность. Ес10 или любой эквивалент, известный в технике, также может использоваться вместо Ес5.

11) Вариант 87 (последовательности 8Е0 ГО N0:101 и 102), который включает экзоны 11-16 человеческого 1Ь-17ВСх1, слитые с Ес5 (последовательности 8Е0 ГО N0:179 и 180). Вариант 87 также имеет нативную сигнальную последовательность. Ес10 или любой эквивалент, известный в технике, также может использоваться вместо Ес5.

12) Вариант 810 (последовательности 8Е0 ГО N0:105 и 106), который включает экзоны 7-16 человеческого ГО-17ВСх1, слитые с Ес5 (последовательности 8Е0 ГО N0:179 и 180). Вариант 810 также имеет нативную сигнальную последовательность. Ес10 или любой эквивалент, известный в технике, также может использоваться вместо Ес5.

13) Вариант 811 (последовательности 8Е0 ГО N0:109 и 110), который включает экзоны 1-7 и 14-16 человеческого ГО-17ВСх1, слитые с Ес5 (последовательности 8Е0 ГО N0:179 и 180). Вариант 811 также имеет нативную сигнальную последовательность. Ес10 или любой эквивалент, известный в технике, также может использоваться вместо Ес5.

14) Вариант 812 (последовательности 8Е0 ГО N0:113 и 114), который включает экзоны 1-7 и 11-16 человеческого 1Ь-17ВСх1, слитые с Ес5 (последовательности 8Е0 ГО N0:179 и 180). Вариант 81 также имеет нативную сигнальную последовательность. Ес10 или любой эквивалент, известный в технике, также может использоваться вместо Ес5.

15) Вариант 813 (последовательности 8Е0 ГО N0:117 и 118), который включает экзоны 1-13 человеческого 1Ь-17ВСх1 и экзоны 7-9 человеческого 1Ь-17КА , слитые с Ес5 (последовательности 8Е0 ГО N0:179 и 180). Вариант 813 также имеет нативную сигнальную последовательность. Ес10 или любой эквивалент, известный в технике, также может использоваться вместо Ес5.

16) Вариант 814 (последовательности 8Е0 ГО N0:121 и 122), который включает экзоны 1-6 мышиного 1Ь-17КА, экзоны 8-13 человеческого ГО-17ВСх1 и экзоны 7-9 мышиного 1Ь-17КА, слитые с Ес5 (последовательности 8Е0 ГО N0:179 и 180). Вариант 814 также имеет нативную сигнальную последовательность. Ес10 или любой эквивалент, известный в технике, также может использоваться вместо Ес5.

17) Вариант 1407 (последовательности 8Е0 ГО N0:139 и 140), который включает экзоны 1-10 человеческого 1Ь-17КА и экзоны 8-16 человеческого 1Ь-17ВСх1, слитые с Ес5 (последовательности 8Е0 ГО N0:179 и 180). Вариант 1407 также имеет нативную сигнальную последовательность из человеческого 1Ь-17ВС. Ес10 или любой эквивалент, известный в технике, также может использоваться вместо Ес5.

18) Вариант 1459 (последовательности 8Е0 ГО N0:151 и 152), который включает экзоны 1-6 и 8-16

- 9 015351 человеческого 1Ь-17ВСх1, слитые с Рс5 (последовательности 8ЕО ΙΌ N0:179 и 180) с замещением Ьеи21Л1а (по сравнению с 1Ь-17ВСх1). Вариант 1459 также имеет препро сигнальный пептид из οΐΡΆ (полипептидная последовательность, показанная в 8Е0 ΙΌ N0:178). Рс10 или любой эквивалент, известный в технике, также может использоваться вместо Рс5.

19) Вариант 1454 (последовательности 8Е0 ΙΌ N0:157 и 158), который включает экзоны 1-6 человеческого 1Ь-17КА и экзоны 8-16 человеческого 1Ь-17КСх1, слитые с Рс5 (последовательности 8Е0 ΙΌ N0:179 и 180). Вариант 1454 также имеет нативный сигнальный пептид из человеческого 1Ь-17ВЛ. Рс10 или любой эквивалент, известный в технике, также может использоваться вместо Рс5.

Вышеописанные варианты представляют только ограниченное число вариантов по настоящему изобретению. Специалист в технике мог бы легко и без неуместного экспериментирования разработать и испытать другие варианты 1Ь-17ВС и (или) 1Ь-17ВС/1Ь-17ВЛ, основанные на разработке по настоящей заявке и на определенных фиг.1-4, включенных здесь.

Например, другие сигнальные пептиды, которые могут применяться вместо раскрытых выше, включают: сигнальный пептид человеческого гормона роста (последовательности 8Е0 ΙΌ N0:168 и 169), переменную область тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина (УН 26-10) (последовательность 8Е0 ΙΌ N0:170 и 171) или человеческий СЭ33 (последовательность 8Е0 ΙΌ N0:172 и 173).

Среди других изобретений настоящее изобретение обеспечивает новое применение растворимых рецепторов по настоящему изобретению. Эти растворимые рецепторы могут базироваться исключительно на 1Ь-17ВС (обозначаемый 1Ь-17КС, или растворимый 1Ь-17КС, или кШ-ПКС, которые все могут использоваться здесь попеременно) или могут быть основаны на участках объединения 1Ь-17ВЛ с 1Ь17ИС (1Ь-17ВС/1Ь-17КА, или гибридный РС/РЛ ИС/ИЛ. или любые их вариации, которые могут использоваться здесь попеременно). Настоящее изобретение также обеспечивает растворимые полипептидные фрагменты и слитые белки 1Ь-17ВС и 1Е-17КС/1Ь-17КА для использования в человеческих воспалительных и аутоиммунных болезнях. Растворимые рецепторы по настоящему изобретению могут использоваться, чтобы блокировать, ингибировать, уменьшать, противодействовать или нейтрализовать активность либо 1Ь-17Р, либо 1Ь-17А, или как 1Ь-17А, так и 1Ь-17Р в лечении воспаления и воспалительных заболеваний, таких как псориаз, псориатический артрит, ревматоидный артрит, эндотоксемия, ВБК, СРК, колит, астма, отторжение аллотрансплантата, иммуноопосредованные почечные болезни, гепатобилиарные болезни, рассеянный склероз, атеросклероз, промотирование роста опухоли, или дегенеративная болезнь суставов и другие воспалительные состояния, раскрытые здесь.

Иллюстративная нуклеотидная последовательность, которая кодирует человеческий 1Б-17КС (1Ь17ИСх1), обеспечивается последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:1; закодированный полипептид показан в последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2. 1Б-17РС функционирует как рецептор для обоих 1Б-17А (последовательности 8Е0 ΙΌ N0:13 и 14) и 1Б-17Е (последовательности 8Е0 ΙΌ N0:15 и 16). 1Б-17РС может действовать как мономер, гомодимер или гетеродимер. Предпочтительно ГЕ-17КС действует как гомодимерный рецептор для ГЕ-17А и для ГЕ-17Р. Как описано в настоящем изобретении, либо мономерный, либо гомодимерный рецептор может включать только один ГЕ-17КС, или он может включать участки других рецепторов семейства ΙΕ-17, такие как ΙΕ-17ΡΛ ЦЬ-ПКСНЬ-ПКА). Также настоящее изобретение охватывает растворимые рецепторы, которые включают участки ГЕ-17КС в комбинации с ГБ-ПКА, ΙΕ-17ΡΕ или любым другим рецептором семейства ΙΕ-17. ГЕ-17КС может также действовать как гетеродимерная субъединица рецептора для цитокина, родственного ΙΕ-17. Например, ГЕ-17КС может образовывать гетеродимер с ГЕ-17КА или другим рецептором, подобным ΙΕ-17. ГЕ-17КС раскрыт в заявке на патент США 10/458647 и в заявке Χ7ΙΡ0 \У0 01/04304, которые обе включены здесь в их полноте ссылкой. Анализ человеческого клона кДНК, кодирующего ГЕ-17КС (последовательность 8Е0 ΙΌ N0:1), выявил открытую рамку считывания, кодирующую 692 аминокислотных остатка (последовательность 8Е0 ΙΌ N0:2), включающую предполагаемую сигнальную последовательность из приблизительно 20 аминокислотных остатков (аминокислотные остатки 1-20 из последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2), внеклеточный связывающий лиганд домен из приблизительно 431 аминокислотного остатка (аминокислотные остатки 21-452 из последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2; последовательности 8Е0 ΙΌ N0:3), трансмембранный домен из приблизительно 20 аминокислотных остатков (аминокислотные остатки 453-473 из последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2) и внутриклеточный домен из приблизительно 203 аминокислотных остатков (аминокислотные остатки 474-677 из последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2). Кроме того, связывающий лиганд домен представлен последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:22.

Еще одна иллюстративная нуклеотидная последовательность, которая кодирует вариантный человеческий ГЬ-ПВС, определяемый как ΙΕ-17ΒΕχ4, обеспечивается последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:165, кодированный полипептид показан в последовательности 8Е0 ΙΌ N0:166. Предсказанный сигнальный пептид представляет собой остатки 1-60 из последовательности 8Е0 ΙΌ N0:165 и 1-20 из последовательности 8Е0 ΙΌ N0:166; внеклеточный домен состоит из остатков 61-1401 из последовательности 8Е0 ΙΌ N0:165 и 21-467 из последовательности 8Е0 ΙΌ N0:166; трансмембранный домен состоит из остатков 1402-1464 из последовательности 8Е0 ΙΌ N0:165 и 468-488 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:166; и внутриклеточный домен состоит из остатков 1465-2121 из последовательности 8Е0 ΙΌ N0:165 и 489-707 из последовательности 8Е0 ΙΌ N0:166.

- 10 015351

Еще одна иллюстративная нуклеотидная последовательность, которая кодирует вариантный человеческий 1Ь-17КС, обозначаемый как 1Ь-17КС-1, обеспечивается последовательностью 8ЕО ГО N0:4, кодированный полипептид показан в последовательности 8Е0 ГО N0:5. 1Е-17КС-1 раскрыт в заявке на патент США 10/458647 и в заявке \У1Р0 \У0 01/04304, которые обе включены здесь в их полноте ссылкой. Секвенирование показало, что 1Ь-17КС-1 представляет собой укороченную форму полипептидного рецептора. Таким образом, 1Ь-17КС-1 испытывает недостаток в аминокислотных остатках 1-113 из последовательности 8Е0 ГО N0:2. Последовательность 8Е0 ГО N0:10 представляет аминокислотную последовательность полипептида 1Ь-17КС-1, которая включает ^концевой участок 1Ь-17КС.

Сравнение аминокислотных последовательностей 1Ь-17КС и Ш-17КС-1 также указало, что эти два полипептида представляют альтернативно сплайс-варианты. Аминокислотная последовательность 1Ь17ВС включает 17-аминокислотный сегмент (аминокислотные остатки 339-355 из последовательности 8Е0 ГО N0:2), которой отсутствует в 1Ь-17КС-1, в то время как в 1Е-17КС отсутствует после аминокислоты 479 13-аминокислотный сегмент, найденный в 1Ь-17КС-1 (аминокислотные остатки 350-362 последовательности 8Е0 ГО N0:5). Полипептид, который содержит оба аминокислотных сегмента, обеспечивается последовательностью 8Е0 ГО N0:11, в то время как последовательность 8Е0 ГО N0:12 представляет аминокислотную последовательность полипептида, у которого отсутствуют 13- и 17аминокислотные сегменты.

Еще одна иллюстративная нуклеотидная последовательность, которая кодирует вариантный человеческий 1Ь-17КС, обозначаемый как 1Ь-17КС-6, обеспечивается последовательностью 8Е0 ГО N0:23, кодированный полипептид показан последовательностью 8Е0 ГО N0:24. 1Е-17КС-6 содержит делецию 25 аминокислотных остатков по сравнению с 1Ь-17КС, как реализовано в последовательности 8Е0 ГО N0:2. Конкретно, 1Ь-17КС-6 не содержит аминокислотные остатки 94-118 из последовательности 8Е0 ГО N0:2. Анализ человеческого клона кДНК, кодирующего 1Ь-17КС-6 (последовательность 8Е0 ГО N0:23), показал наличие внеклеточного лигандсвязанного домена, содержащего приблизительно 427 аминокислотных остатков (аминокислотные остатки 1-427 последовательности 8Е0 ГО N0:24), трансмембранного домена, содержащего приблизительно 20 аминокислотных остатков (аминокислотные остатки 428-448 из последовательности 8Е0 ГО N0:24 и внутриклеточного домена из приблизительно 218 аминокислотных остатков (аминокислотные остатки 449-667 последовательности 8Е0 ГО N0:24).

Иллюстративная нуклеотидная последовательность, которая кодирует вариантный мышиный 1Ь17КС, обеспечивается последовательностью 8Е0 ГО N0:25; кодированный полипептид показан в последовательности 8Е0 ГО N0:26. Мышиный 1Ь-17КС функционирует как рецептор для обоих мышиного ГОПА (последовательность 8Е0 ГО N0:17 и 18) и мышиного ГО-17Е (последовательность 8Е0 ГО N0:19 и

20). Анализ мышиного клона кДНК, кодирующего 1Ь-17КС (последовательность 8Е0 ГО N0:25), выявил внеклеточный лигандсвязывающий домен из приблизительно 449 аминокислотных остатков последовательности 8Е0 ГО N0:27. Кроме того, лигандсвязывающий домен представлен последовательностью 8ЕО ГО N0:28.

Еще одна иллюстративная нуклеотидная последовательность, которая кодирует вариантный мышиный 1Ь-17КС, обеспечивается последовательностью 8Е0 ГО N0:29; кодированный полипептид показан в последовательности 8Е0 ГО N0:30.

Ген 1Ь-17КС находится в хромосоме 3р25-3р24. Как обсуждается ниже, эта область связана с различными нарушениями и болезнями.

Нозерн-блоттинг анализ указывает, что есть сильная экспрессия гена 1Ь-17КС в тканях щитовидной железы, надпочечника, простаты и печени и меньшая экспрессия в тканях сердца, тонкой кишки, желудка и трахеи. Напротив, есть слабая или нет никакой экспрессии в мозге, плаценте, легких, скелетных мышцах, почках, поджелудочной железе, селезенке, тимусе, яичнике, ободочной кишке, лейкоцитах периферической крови, спинном мозге, лимфатических узлах и костном мозге. Эти наблюдения показывают, что последовательность 1Ь-17КС может использоваться дифференцированно среди различных тканей.

Как описано ниже, настоящее изобретение обеспечивает изолированные полипептиды, включающие аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 90%, или больше чем на 95, т.е. на 96, 97, 98%, или больше чем на 99% либо больше идентична аминокислотной последовательности сравнения 21-692 из последовательности 8Е0 ГО N0:2, в которой изолированный полипептид специфично связывается с антителом, которое специфично связывается с полипептидом, включающим аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0:2. Настоящее изобретение также обеспечивает изолированные полипептиды, включающие аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или на по меньшей мере 90% идентична аминокислотной последовательности сравнения, выбранной из группы, состоящей из: (а) аминокислотных остатков 21-452 последовательности 8Е0 ГО N0:2, (Ь) аминокислотных остатков 21-435 последовательности 8Е0 ГО N0:10, (с) аминокислотных остатков 21-677 последовательности 8Е0 ГО N0:2 и (б) аминокислотных остатков 1-692 из последовательности 8Е0 ГО N0:2, в котором изолированный полипептид специфически связывается с антителом, которое специфично связывается с полипептидом, состоящим или из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0:2, или из аминокислотной последо

- 11 015351 вательности 8ЕО ΙΌ N0:10. Иллюстративные полипептиды включают полипептид, включающий аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:2, 10, 11 или 12.

Настоящее изобретение также обеспечивает изолированные полипептиды, включающие внеклеточный домен, в котором внеклеточный домен включает либо аминокислотные остатки 21-452 из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2, либо аминокислотные остатки 21-435 из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:10. Такие полипептиды могут далее включать трансмембранный домен, который находится в карбоксильном концевом положении относительно внеклеточного домена, в котором трансмембранный домен включает аминокислотные остатки 453-473 из последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2. Эти полипептиды могут также включать внутриклеточный домен, который находится в карбоксильном концевом положении относительно трансмембранного домена, в котором внутриклеточный домен включает либо аминокислотные остатки 474-677 из последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2, либо аминокислотные остатки 457-673 из последовательности 8Е0 ΙΌ N0:10, и необязательно, сигнальную секреторную последовательность, которая находится в аминном концевом положении относительно внеклеточного домена, в котором сигнальная секреторная последовательность включает кислотные остатки 120 из аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2.

Настоящее изобретение также включает вариантные полипептиды ΙΤ-17Κ0, в которых аминокислотная последовательность вариантного полипептида разделяет идентичность с аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:2, выбранной из группы, состоящей по меньшей мере из 70%-ной тождественности, по меньшей мере 80%-ной тождественности, по меньшей мере 90%-ной тождественности, по меньшей мере 95%-ной тождественности или больше чем 95%-ной тождественности, в которой любое различие между аминокислотной последовательностью вариантного полипептида и аминокислотной последовательностью 8Е0 №N0:2 происходит из-за одной или более консервативных замен аминокислот.

Кроме того, настоящее изобретение также обеспечивает изолированные полипептиды, как раскрыто выше, которые связывают ΙΤ-17Τ (например, человеческая полипептидная последовательность ΙΕ-17Τ, как показано в последовательности 8Е0 ΙΌ N0:16). Человеческая полинуклеотидная последовательность ΙΕ-17Τ показана в последовательности 8Е0 ΙΌ N0:15. Мышиная полинуклеотидная последовательность ΙΕ-17Τ показана в последовательности 8Е0 ΙΌ N0:19, а соответствующий полипептид показан в последовательности 8Е0 ΙΌ N0:20. Настоящее изобретение также обеспечивает изолированные полипептиды, как раскрыто выше, которые связывают ΙΤ-17Ά (например, человеческая полипептидная последовательность ΙΤ-17Ά, как показано в последовательности 8Е0 ΙΌ N0:14). Человеческая полинуклеотидная последовательность ΙΤ-17Ά показана в последовательности 8Е0 ΙΌ N0:13. Мышиная полинуклеотидная последовательность ΙΤ-17Ά показана в последовательности 8Е0 ΙΌ N0:17, а соответствующий полипептид показан в последовательности 8Е0 ΙΌ N0:18.

Настоящее изобретение также обеспечивает изолированные полипептиды и эпитопы, включающие по меньшей мере 15 смежных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 или 3. Иллюстративные полипептиды включают полипептиды, которые либо включают, либо состоят из последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 или 3, ее антигенного эпитопа или ее функционального фрагмента, связывающего ΙΤ-17Ά или ΙΤ-17Τ. Кроме того, настоящее изобретение также обеспечивает изолированные полипептиды, как раскрыто выше, которые связываются с, блокируют, ингибируют, уменьшают, противодействуют или нейтрализуют активность ΙΕ-17Ε или ΙΕ-17Ά.

Настоящее изобретение также включает вариантные полипептиды ΙΕ-17Κ0, в которых аминокислотная последовательность разделяет идентичность с аминокислотными остатками последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2, выбранными из группы, состоящей из по меньшей мере 70%-ной тождественности, по меньшей мере 80%-ной тождественности, по меньшей мере 90%-ной тождественности, по меньшей мере 95%-ной тождественности или больше чем 95%-ной тождественности, такой как 96, 97, 98 или больше чем 99% или больше тождественность, где любое различие между аминокислотной последовательностью вариантного полипептида и соответствующей аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0:2 происходит из-за одной или более консервативных замен аминокислот. Такие консервативные замены аминокислот описаны здесь. Кроме того, настоящее изобретение также обеспечивает изолированные полипептиды, как раскрыто выше, которые связываются с, блокируют, ингибируют, уменьшают, противодействуют или нейтрализуют активность ΙΕ-17Ε или ΙΕ-17Ά.

Настоящее изобретение далее обеспечивает фармацевтические составы, включающие фармацевтически приемлемый носитель и по меньшей мере один вектор экспрессии или рекомбинантный вирус, включающий такие векторы экспрессии. Настоящее изобретение далее включает фармацевтические составы, включая фармацевтически приемлемый носитель и полипептид или антитело, описанное здесь.

Настоящее изобретение также обеспечивает слитые белки, включающие полипептид ΙΕ-17Κ.0 и фрагмент иммуноглобулина. В таких слитых белках фрагментом иммуноглобулина может быть постоянная область тяжелой цепи иммуноглобулина, такая как человеческий фрагмент Ес. Настоящее изобретение далее включает изолированные молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют такие слитые белки.

- 12 015351

Эти и другие аспекты изобретения станут очевидными при отсылке к следующему подробному описанию. Кроме того, различная библиография идентифицируется ниже и включается ссылкой в их полноте.

В) Определения.

В описании, которое следует, многие термины широко используются. Следующие определения предоставлены, чтобы облегчить понимание изобретения.

Как используется здесь, нуклеиновая кислота или молекула нуклеиновой кислоты относится к полинуклеотидам, таким как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК), олигонуклеотидам, фрагментам, произведенным полимеразно-цепьевой реакцией (ПЦР), и фрагментам, произведенным любыми сшиванием, расщеплением, действием эндонуклеазы и действием экзонуклеазы. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть составлены из мономеров, которые являются естественно встречающимися нуклеотидами (такими как ДНК и РНК) или аналогами естественно встречающихся нуклеотидов (например, α-энантиомерными формами естественно встречающихся нуклеотидов), или их комбинацией. Модифицированные нуклеотиды могут иметь изменения во фрагментах сахаров и (или) пуринового или пиримидинового основания. Модификации сахаров включают, например, замену одной или более гидроксигрупп галогенами, алкильными группами, амино и азидогруппами, или сахара могут быть функционализированы как простые эфиры или сложные эфиры. Кроме того, весь сахарный фрагмент может быть заменен пространственно и электронно подобными структурами, такими как азасахара и карбоциклические аналоги сахаров. Примеры модификаций во фрагменте основания включают алкилированные пурины и пиримидины, ацилированные пурины или пиримидины, или другие известные гетероциклические заменители. Мономеры нуклеиновых кислот могут быть связаны фосфодиэфирными связями или аналогами таких связей. Аналоги фосфодиэфирных связей включают фосфоротиолат, фосфородитиолат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфороанилидат, фосфороамидат и т.п. Термин молекула нуклеиновой кислоты также включает так называемые пептидные нуклеиновые кислоты, которые включают естественно встречающиеся или модифицированные нуклеиновокислотные основания, присоединенные к полиамидному скелету. Нуклеиновые кислоты могут быть однонитевые или двухнитевые.

Термин комплемент молекулы нуклеиновой кислоты относится к молекуле нуклеиновой кислоты, имеющей комплементарную нуклеотидную последовательность и обратную ориентацию по сравнению с нуклеотидной последовательностью сравнения. Например, последовательность 5' АТОСАСООО 3' является комплементарной к 5' СССОТОСАТ 3'.

Термин выродившаяся нуклеотидная последовательность обозначает последовательность нуклеотидов, которая включает один или более выродившихся кодонов по сравнению с молекулой нуклеиновой кислоты сравнения, которая кодирует полипептид. Выродившиеся кодоны содержат различные триплеты нуклеотидов, но кодируют тот же самый аминокислотный остаток (т.е. триплеты ОАИ и ОАС, каждый кодирует Акр).

Термин структурный ген относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется в информационную РНК (иРНК), которая затем транслируется в аминокислотную последовательность, характеризующую определенный полипептид.

Изолированная молекула нуклеиновой кислоты является молекулой нуклеиновой кислоты, которая не включается в геномную ДНК организма. Например, молекула ДНК, которая кодирует фактор роста, который был отделен от геномной ДНК клетки, является изолированной молекулой ДНК. Другим примером изолированной молекулы нуклеиновой кислоты является химически синтезированная молекула нуклеиновой кислоты, которая не включается в геном организма. Молекула нуклеиновой кислоты, которая была изолирована из определенной частицы, меньше, чем полная молекула ДНК хромосомы из частицы.

Конструкт молекулы нуклеиновой кислоты является молекулой нуклеиновой кислоты, либо одно-, либо двухнитевой, которая была изменена человеческим вмешательством, так чтобы содержать сегменты нуклеиновой кислоты, объединенные и размещенные по соседству в порядке, не существующем в природе.

Линейная ДНК обозначает некольцевые молекулы ДНК, имеющие свободные 5' и 3' концы. Линейная ДНК может быть получена из замкнутых кольцевых молекул ДНК, таких как плазмиды, ферментативным расщеплением или физической разбивкой.

Комплементарная ДНК (кДНК) является однонитевой молекулой ДНК, которая образуется из матрицы мРНК ферментом обратная транскриптаза. Как правило, применяется праймер, комплементарный к участкам мРНК, для инициирования обратной транскрипции. Специалисты в технологии также применяют термин кДНК при обращении к двухнитевой молекуле ДНК, состоящей из такой однонитевой молекулы ДНК и комплементарной к ней нити ДНК. Термин кДНК также относится к клону молекулы кДНК, синтезируемому из матрицы РНК.

Промотор представляет собой нуклеотидную последовательность, которая направляет транскрипцию структурного гена. Как правило, промотор расположен в некодирующей 5' области гена, ближайшего к участку начала транскрипции структурного гена. Элементы последовательности в пределах промо

- 13 015351 торов, которые функционируют в инициировании транскрипции, часто характеризуются согласованностью нуклеотидных последовательностей. Эти промоторные элементы включают участки, связывающие РНК-полимеразу, последовательности ТАТА, последовательности СААТ, дифференционноспецифические элементы (Э8Е); МсСсйсс е! а1., Μοί. Εηάοοτίηοΐ., 7:551 (1993), элементы реакции циклического АМФ (СКЕ), элементы реакции сыворотки (8КЕ); Тте1ктап, 8еттатк ίη Сапсег Βίοί., 1:41 (1990), элементы реакции глюкокортикоида (СКЕ) и сайты связывания других факторов транскрипции, таких как СКЕ/АТЕ (О'КсШу е! а1., 1. Βίοί. Сйеш. 2957:19938 (1992)), АР2 (Ус е! а1., 1. Βίοί. Сйет. 269:25128 (1994)), 8Р1, белок связывания элемента реакции цАМФ (СКЕВ; ^οекеη, Сепе Ехрг. 3:253 (1993)) и октамерные факторы (см. в общем ΧνηΙδοη е! а1., ебк., Μοίесυίа^ Βίο1οβ\· οί 111е Сепе, 4111 еб. (Тйе Веп)атш/Ситтшдк РиЫЫипд САтрапу. 1пс. 1987) и Еета1дге и Κουκ^υ, Вюсйет. 1. 303:1 (1994)). Если промотор представляет собой индуцируемый промотор, то скорость транскрипции растет в ответ на индуцирующее средство. Напротив, скорость транскрипции не регулируется индуцирующим средством, если промотор представляет собой конститутивный промотор. Ингибируемые промоторы также известны.

Коровый промотор содержит существенные нуклеотидные последовательности для промоторной функции, включающие ТАТА-блок и начало транскрипции. По этому определению основной промотор может иметь или не может иметь поддающуюся обнаружению активность в отсутствие определенных последовательностей, которые могут усиливать активность или придавать тканеспецифическую активность.

Регуляторный элемент представляет собой нуклеотидную последовательностью, которая модулирует активность корового промотора. Например, регуляторный элемент может содержать нуклеотидную последовательность, которая связывается с клеточными факторами, позволяющими транскрипцию исключительно или избирательно в определенных клетках, тканях или органеллах. Эти типы регуляторных элементов обычно связываются с генами, которые экспрессируются клеточноспецифичным, тканеспецифичным или органелласпецифичным образом.

Усилитель представляет собой тип регуляторного элемента, который может увеличивать эффективность транскрипции, независимо от расстояния или ориентации усилителя относительно участка начала транскрипции.

Гетерологическая ДНК относится к молекуле ДНК или популяции молекул ДНК, которые не существуют естественно в пределах данной клетки-хозяина. Молекулы ДНК, гетерологичные к определенной клетке-хозяину, могут содержать ДНК, полученную из разновидности клетки-хозяина (т.е. эндогенная ДНК), пока такая ДНК хозяина соединяется с нехозяйской ДНК (т.е. экзогенной ДНК). Например, молекула ДНК, содержащая сегмент нехозяйской ДНК, кодирующий полипептид, реально связанный с сегментом ДНК хозяина, включающим промотор транскрипции, как полагают, является гетерологической молекулой ДНК. Наоборот, гетерологическая молекула ДНК может включать эндогенный ген, реально связанный с экзогенным промотором. Как другая иллюстрация, молекула ДНК, включающая ген, полученный из клетки дикого типа, как полагают, является гетерологической ДНК, если эта молекула ДНК вводится в мутантную клетку, у которой нет гена дикого типа.

Полипептид представляет собой полимер аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, произведенный естественно или синтетически. Полипептиды с меньше чем приблизительно 10 аминокислотными остатками обычно упоминаются как пептиды.

Белок представляет собой макромолекулу, включающую одну или более полипептидных цепей. Белок может также включить непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные заменители могут быть добавлены к белку клеткой, в которой белок производится, и будет меняться в зависимости от типа клетки. Белки определяются здесь на основе их аминокислотной структуры скелета; заменители, такие как углеводные группы, обычно не конкретизируются, но могут присутствовать тем не менее.

Пептид или полипептид, кодированный нехозяйской молекулой ДНК, является гетерологическим пептидом или полипептидом.

Клонирующий вектор представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, такую как плазмида, космида или бактериофаг, которые имеют способность реплицироваться автономно в клетке-хозяине. Клонирующие векторы обычно содержат один или небольшое количество участков узнавания рестрикционной эндонуклеазы, которые позволяют вставку молекулы нуклеиновой кислоты определимым способом без потери существенной биологической функции вектора, так же как нуклеотидную последовательность, кодирующую маркерный ген, который пригоден для использования в идентификации и селекции клеток, преобразованных клонирующим вектором. Маркерные гены обычно включают гены, которые обеспечивают устойчивость тетрациклина или устойчивость ампициллина.

Вектор экспрессии представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую ген, который экспрессируется в клетке-хозяине. Как правило, вектор экспрессии включает промотор транскрипции, ген и терминатор транскрипции. Экспрессия гена обычно помещается под контроль промотора и такой ген, как говорят, реально связан с промотором. Точно так же регуляторный элемент и коровый промотор реально связаны, если регуляторный элемент модулирует активность корового промотора.

- 14 015351

Рекомбинантный хозяин является клеткой, которая содержит гетерологическую молекулу нуклеиновой кислоты, такую как клонирующий вектор или вектор экспрессии. В настоящем контексте пример рекомбинантного организма представляет собой клетку, которая производит 1Ь-17ВС из вектора экспрессии. Напротив, 1Ь-17ВС может быть произведен клеткой, которая является естественным источником 1Ь-17ВС и у которой нет вектора экспрессии.

Интегральные трансформанты являются рекомбинантными клетками-хозяевами, в которых гетерологическая ДНК интегрировалась в геномную ДНК клеток.

Слитый белок является гибридным белком, экспрессированным молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидные последовательности по меньшей мере двух генов. Например, слитый белок может включать по меньшей мере часть полипептида 1Ь-17ВС, слитого с полипептидом, который связывается с матрицей сродства. Такой слитый белок обеспечивает средство выделять большие количества 1Ь-17К.С, используя афинную хроматографию.

Термин рецептор обозначает белок, ассоциированный с клеткой, который связывает биоактивную молекулу, которую называют лигандом. Это взаимодействие опосредует влияние лиганда на клетку. Рецепторы могут быть мембраносвязанными, цитозольными или ядерными; мономерными (например, рецептор тироид-стимулирующего гормона, бета-адренергический рецептор) или мультимерными (например, рецептор тромбоцитпроизводящего фактора роста (ТПФР), рецептор гормона роста, рецептор 1Ь-3, рецептор ГМ-КСФ, рецептор Г-КСФ, рецептор эритропоэтина и рецептор 1Ь-6). Мембраносвязанные рецепторы характеризуются многодоменной структурой, включающей внеклеточный лигандсвязывающий домен и внутриклеточный эффекторный домен, который обычно вовлекается в трансдукцию сигнала. В определенных мембраносвязанных рецепторах внеклеточный лигандсвязанный домен и внутриклеточный эффекторный домен располагаются в отдельных полипептидах, которые включают полный функциональный рецептор.

В общем, связывание лиганда с рецептором приводит к конформационному изменению в рецепторе, которое вызывает взаимодействие между эффекторным доменом и другой молекулой (молекулами) в клетке, которая, в свою очередь, приводит к альтерации метаболизма клетки. Метаболические события, которые часто связываются со взаимодействием лиганд-рецептор, включают генную транскрипцию, фосфорилирование, дефосфорилирование, увеличение продукции циклического АМФ, мобилизацию клеточного кальция, мобилизацию мембранных липидов, клеточную адгезию, гидролиз инозитлипидов и гидролиз фосфолипидов.

Растворимый рецептор представляет собой рецепторный полипептид, который не связывается с мембраной клетки. Растворимые рецепторы представляют собой обычно лигандсвязанные рецепторные полипептиды, которые испытывают недостаток в трансмембранных и цитоплазматических доменах и других связываниях с клеточной мембраной, таких как через гликофосфоинозит (ГФИ). Растворимые рецепторы могут включать дополнительные аминокислотные остатки, такие как метки сродства, которые предусматривают очистку полипептида или предусматривают места для прикрепления полипептида к субстрату, или последовательности константной области иммуноглобулина. Многие клеточноповерхностные рецепторы имеют естественные, растворимые двойники, которые производятся протеолизом или транслируются альтернативно сплайсированной мРНК. Растворимые рецепторы могут быть мономерными, гомодимерными, гетеродимерными или мультимерными, с мультимерными рецепторами, обычно не включающими больше 9 субъединиц, предпочтительно не включающими больше 6 субъединиц и наиболее предпочтительно не включающими больше 3 субъединиц. Рецепторные полипептиды, как говорят, существенно свободны от трансмембранных и внутриклеточных полипептидных сегментов, когда они не содержат достаточного количества этих сегментов, чтобы обеспечить мембранную фиксацию или трансдукцию сигнала, соответственно. Растворимые рецепторы рецепторов цитокина обычно включают внеклеточный цитокинсвязывающий домен, свободный от трансмембранного домена и внутриклеточного домена. Например, представительные растворимые рецепторы включают растворимые рецепторы для 1Ь-17КА, как показано в последовательностях 8Е0 ГО N0:167 (полинуклеотид) и 21 (полипептид). Это в пределах уровня специалиста в технологии выразить то, что последовательности известной последовательности рецептора цитокина включают внеклеточный цитокинсвязывающий домен, свободный от трансмембранного домена и внутриклеточного домена. Кроме того, специалист в технологии, используя генетический код, может легко определить полинуклеотиды, которые кодируют такие растворимые рецепторные полипептиды.

Термин секреторная сигнальная последовательность обозначает последовательность ДНК, которая кодирует пептид (секреторный пептид), который, как компонент большего полипептида, направляет больший полипептид по секреторному пути обмена клетки, в которой он синтезируется. Больший полипептид обычно расщепляют, чтобы удалить секреторный пептид во время транзита по секреторному пути.

Изолированный полипептид представляет собой полипептид, который существенно свободен от загрязняющих клеточных компонентов, таких как углевод, липид или другие напоминающие белок примеси, связанные с полипептидом в природе. Как правило, препарат изолированного полипептида содержит полипептид в высокоочищенной форме, т.е. по меньшей мере приблизительно 80% чистоты, по

- 15 015351 меньшей мере приблизительно 90% чистоты, по меньшей мере приблизительно 95% чистоты, больше 95% чистоты, такой как 96, 97 или 98%, или большей чистоты, или больше 99% чистоты. Один способ показать, что определенный белковый препарат содержит изолированный полипептид - появление единственной полосы после электрофореза белкового препарата в натрийдодецилсульфат (НДС) - полиакриламидном геле - и окрашивания геля Бриллиантовым Синим Кумасси. Однако термин изолированный не исключает наличия того же самого полипептида в альтернативных физических формах, таких как димеры или альтернативно гликозилированные или дериватизированные формы.

Термины аминоконцевой и карбоксиконцевой применяются здесь, чтобы обозначить положения в пределах полипептидов. Где контекст позволяет, эти термины применяют в отношении определенной последовательности или участка полипептида, чтобы обозначить близость или относительное положение. Например, определенная последовательность позиционированного карбоксиконца в последовательности сравнения в пределах полипептида располагается ближе к карбоксиконцу последовательности сравнения, но не обязательно в карбоксиконце полного полипептида.

Термин экспрессия относится к биосинтезу генного продукта. Например, в случае структурного гена экспрессия включает транскрипцию структурного гена в мРНК и трансляцию мРНК в один или более полипептидов.

Термин сплайс-вариант используют здесь, чтобы обозначить альтернативные формы РНК, транскрибированной из гена. Сплайс-вариация возникает естественно через использование альтернативных участков сплайсинга в пределах транскрибированной молекулы РНК, или реже между отдельно транскрибированными молекулами РНК, и может привести к нескольким мРНК, транскрибированным из того же самого гена. Сплайс-варианты могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин сплайс-вариант также используется здесь, чтобы обозначить полипептид, кодированный сплайс-вариантом мРНК, транскрибированной из гена.

Как используется здесь, термин иммуномодулятор включает цитокины, факторы роста стволовых клеток, лимфотоксины, костимуляторные молекулы, гематопоэтические факторы и другие и синтетические аналоги этих молекул.

Термин пара комплемент/антикомплемент обозначает неидентичные фрагменты, которые образуют нековалентно связанную, устойчивую пару при адекватных условиях. Например, биотин и авидин (или стрептавидин) являются прототипичными членами пары комплемент/антикомплемент. Другие типичные пары комплемент/антикомплемент включают пары рецептор/лиганд, антитело/антиген (или гаптен или эпитоп), полинуклеотидные пары сенсор/антисенсор и т. п. Когда желательна последующая диссоциация пары комплемент/антикомплемент, пара комплемент/антикомплемент имеет сродство связывания меньше 10⁹ М^-1.

Антиидиотипное антитело представляет собой антитело, которое связывается с переменной областью домена иммуноглобулина. В настоящем контексте антиидиотипное антитело связывается с переменной областью антитела аиб-1Ь-17КС и, таким образом, антиидиотипное антитело подражает эпитопу 1Ь-17КС.

Фрагмент антитела является участком антитела, таким как Р(аЬ')₂, Р(аЬ)₂, РаЬ', РаЬ и т.п. Независимо от структуры фрагмент антитела связывается с тем же самым антигеном, который узнается интактным антителом. Например, фрагмент моноклонального антитела анти-1Ь-17КС связывает с эпитопом 1Ь17КС.

Термин фрагмент антитела также включает синтетический или генно-инженерный полипептид, который связывается с определенным антигеном, таким как полипептиды, состоящие из переменной области легкой цепи, фрагменты Ру, состоящие из переменных областей тяжелых и легких цепей, рекомбинантная одиночная цепь полипептидных молекул, в которых легкие и тяжелые переменные области соединены пептидным линкером ('ксРу белки), и минимальные единицы узнавания, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область.

Химерное антитело представляет собой рекомбинантный белок, который содержит переменные домены и комплементарные определяющие области, полученные из антитела грызуна, в то время как остаток молекулы антитела получают из человеческого антитела.

Гуманизированные антитела представляют собой рекомбинантные белки, в которых области, определяющие мышиную комплементарность моноклонального антитела, передавались от тяжелых и легких переменных цепей мышиного иммуноглобулина в человеческий переменный домен. Конструкция гуманизированных антител для терапевтического использования у людей, которые получают из мышиных антител, таких как антитела, которые связываются с или нейтрализуют человеческий белок, находится в пределах навыка специалиста в технологии.

Как используется здесь, терапевтическое средство представляет собой молекулу или атом, который сопряжен с фрагментом антитела, чтобы произвести конъюгат, который полезен для терапии. Примеры терапевтических средств включают лекарства, токсины, иммуномодуляторы, хелатные комплексы, соединения бора, светочувствительные средства или краски и радиоизотопы.

Поддающийся обнаружению маркер представляет собой молекулу или атом, который может быть сопряжен с фрагментом антитела, чтобы произвести молекулу, полезную для диагноза. Примеры под

- 16 015351 дающихся обнаружению маркеров включают хелатные комплексы, светочувствительные средства, радиоизотопы, флуоресцентные средства, парамагнитные ионы или другие маркеры.

Термин метка сродства применяют здесь, чтобы обозначить полипептидный сегмент, который может быть присоединен ко второму полипептиду, чтобы предусмотреть очистку или обнаружение второго полипептида или обеспечить участки для присоединения второго полипептида к субстрату. В принципе, любой пептид или белок, для которого доступно антитело или другой определенный связывающий агент, могут использоваться как метка сродства. Метки сродства включают тракт полигистидина, белок А (№1ккоп е! а1., ЕМВ0 1., 4:1075 (1985); №1ккоп е! а1., МеЙюбк Еп/уто1., 198:3 (1991)), глютатион 8трансферазу (διηίΐΐι апб 1оЬпкоп, Сепе, 67:31 (1988)), метку сродства С1и-С1и (Сгиккептеуег е! а1., Ргос.

Асаб. 8с1. И8А, 82:7952 (1985)), вещество Р, пептид РЬАС (Норр е! а1., Вю!есЬпо1оду, 6:1204 (1988)), пептид, связывающий стрептавидин, или другой антигенный эпитоп или связывающий домен; см. в общем Рогб е! а1., Рго!ет Ехргеккюп апб РигШса!юп, 2:95 (1991). Молекулы ДНК, кодирующие метки сродства, доступны от коммерческих поставщиков (например, РНагшааа Вю!есй, Р1кса!агау, N1).

Голое антитело представляет собой целое антитело, в противоположность фрагменту антитела, который не спрягается с терапевтическим средством. Голые антитела включают поликлональные и моноклональные антитела, так же как определенные рекомбинантные антитела, такие как химерные и гуманизированные антитела.

Как используется здесь, термин компонент антитела включает как целое антитело, так и фрагмент антитела.

Иммуноконъюгат представляет собой конъюгат компонента антитела с терапевтическим средством или поддающимся обнаружению маркером.

Как используется здесь, термин белок слитого антитела относится к рекомбинантной молекуле, которая включает компонент антитела и полипептидный компонент 1Ь-17КС. Примеры белка слитого антитела включают белок, который включает внеклеточный домен 1Ь-17КС, и либо домен Рс, либо антигенсвязывающую область.

Целевой полипептид или целевой пептид представляет собой аминокислотную последовательность, которая включает по меньшей мере один эпитоп и которая экспрессируется на клетке-мишени, такой как опухолевая клетка, или клетка, которая несет антиген возбудителя инфекции. Т-Клетки узнают пептидные эпитопы, представленные молекулой основного комплекса гистосовместимости к целевому полипептиду или целевому пептиду, и обычно разлагают клетку-мишень или рекрутируют другие иммунные клетки к участку клетки-мишени, таким образом, убивая клетку-мишень.

Антигенный пептид представляет собой пептид, который будет связывать молекулу основного комплекса гистосовместимости (ОКГ) с получением комплекса ОКГ-пептид, который узнается Тлимфоцитом, таким образом, вызывая цитотоксическую реакцию лимфоцита после предоставления к Тклетке. Таким образом, антигенные пептиды способны связывать соответствующую молекулу основного комплекса гистосовместимости и вызывать цитотоксическую реакцию Т-лимфоцитов, такую как лизис клетки или определенное выделение цитокина против клетки-мишени, которая связывает или экспрессирует антиген. Антигенный пептид может быть связан в контексте молекулы основного комплекса гистосовместимости класса 1 или класса 11 на антигенпредставляющей клетке или на клетке-мишени.

В эукариотах РНК-полимераза катализирует транскрипцию структурного гена, чтобы произвести мРНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть разработана так, чтобы содержать матрицу РНКполимеразы, в которой РНК-транскрипт имеет последовательность, которая комплементарна к последовательности определенной мРНК. РНК-транскрипт называют антисенсорной РНК, а молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует антисенсорную РНК, называют антисенсорным геном. Молекулы антисенсорной РНК способны связываться с молекулами мРНК, приводя к ингибированию трансляции мРНК.

Антисенсорный олигонуклеотид, специфический для 1Ь-17КС или антисенсорный олигонуклеотид 1Ь-17КС представляет собой олигонуклеотид, имеющий последовательность, (а) способную образовывать устойчивый триплекс с участком гена 1Ь-17КС, или (Ь) способную образовывать устойчивый дуплекс с участком мРНК-транскрипта гена 1Ь-17КС.

Рибозим представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит каталитический центр. Термин включает ферменты РНК, аутосплайсинга РНК, саморасщепления РНК и молекулы нуклеиновой кислоты, которые выполняют эти каталитические функции. Молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует рибозим, называют ген рибозима.

Внешняя последовательность гида представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая направляет эндогенный рибозим, К-наза Р, к конкретному виду внутриклеточной мРНК, приводя к расщеплению мРНК К-назой Р. Молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует внешнюю последовательность гида, называют геном внешней последовательности гида.

Термин вариантный ген 1Ь-17КС относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является модификацией последовательности 8ЕО 1Ό N0:2. Такие варианты включают естественно встречающиеся полиморфизмы генов 1Ь-17КС, так же как синтетических генов, которые содержат консервативные замены аминокислот

- 17 015351 ной последовательности 8ЕО Ш N0:2. Дополнительные вариантные формы генов 1Ь-17КС представляют собой молекулы нуклеиновой кислоты, которые содержат инсерции или делеции нуклеотидных последовательностей, описанных здесь. Вариантный ген 1Ь-17КС может быть идентифицирован, например, определяя, гибридизируется ли ген с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность 8Е0 Ш N0:1 или 8Е0 Ш N0:4, или ее комлементом при строгих условиях.

Альтернативно, вариантные гены 1Ь-17КС могут быть идентифицированы сравнением последовательностей. Две аминокислотные последовательности имеют 100%-ную идентичность аминокислотных последовательностей, если аминокислотные остатки двух аминокислотных последовательностей являются теми же самыми, когда выровнены для максимального соответствия. Точно так же две нуклеотидные последовательности имеют 100%-ную идентичность нуклеотидных последовательностей, если нуклеотидные остатки двух нуклеотидных последовательностей являются теми же самыми, когда выровнены для максимального соответствия. Сравнения последовательности могут быть выполнены, используя стандартные программы, такие как программы, включенные в набор ЬА8ЕК.0ЕКЕ ЬютГогтабек. который производится 0ΝΛ8ΤΛΚ. (Майкоп, Уксопкю). Другие методы сравнения двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, определяя оптимальное выравнивание, известны специлистам в технологии (см., например, Регикк1 и Регикк1, 1и1сгис1 апй Νο\ν Вю1о§у: Тоо1к Гог Оепотк апй Мо1еси1аг Векеагск (А8М Ргекк, 1пс. 1997), Уи е1 а1. (ейк.). 'ТиГогтайоп 8ирегЫд^ау апй СотриСег ЭаИЬпке оГ №.1с1ек Ас1йк апй РгоСетк т МеСкойк ш Оепе ВюСескпокду, р. 123-151 (СРС Ргекк, 1пс. 1997), апй Вккор (ей.), Ошйе Ю Нитап Оепоте Сотрийпд, 2-пй Еййюп (Асайетк Ргекк, 1пс. 1998)). Конкретные методы определения идентичности последовательностей описаны ниже.

Независимо от определенного метода, используемого, чтобы идентифицировать вариантный ген 1Ь17К.С или вариантный полипептид 1Ь-17ВС, вариантный ген или полипептид, кодированный вариантным геном, может функционально характеризоваться способностью связываться специфично с антителом анти-1Ь-17ВС. Вариантный ген 1Ь-17ВС или вариантный полипептид 1Ь-17ВС могут также функционально характеризоваться способностью связываться с лигандом, например 1Ь-17А и (или) 1Ь-17Р, используя биологическую или биохимическую пробу, описанную здесь.

Термин аллельный вариант применяют здесь, чтобы обозначить любой из двух или больше альтернативных форм гена, занимающего тот же самый хромосомный локус. Аллельное изменение возникает естественно через мутацию и может закончиться фенотипическим полиморфизмом в пределах совокупностей. Генные мутации могут быть тихими (никакого изменения в кодированном полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин аллельный вариант также применяют здесь, чтобы обозначить белок, кодированный аллельным вариантом гена.

Термин ортолог обозначает полипептид или белок, полученный из одного вида, который является функциональной копией полипептида или белка другого вида. Различия последовательностей среди ортологов являются результатом видообразования.

Паралоги представляют собой различные, но структурно близкие белки, сделанные организмом. Паралоги, как полагают, возникают через дубликацию гена. Например, α-глобин, β-глобин и миоглобин являются паралогами друг друга.

Настоящее изобретение включает функциональные фрагменты генов 1Ь-17ВС. В пределах контекста этого изобретения функциональный фрагмент гена 1Ь-17ВС относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует участок полипептида 1Ь-17К.С, который является доменом, описанным здесь, или, по меньшей мере, специфично связывается с антителом анти-1Е-17ВС.

Из-за неточности стандартных аналитических методов молекулярные массы и длины полимеров, как понимают, являются приблизительными величинами. Когда такая величина будет выражена как примерно X или приблизительно X, установленная величина X, как будут понимать, будет иметь точность 10%.

С) Продукция полинуклеотидов или генов 1Ь-17ВА и 1Ь-17ВС.

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие человеческий ген 1Ь-17ВА или 1Ь-17ВС, или полинуклеотиды, кодирующие любой из растворимых полипептидов по настоящему изобретению, могут быть получены, производя скрининг человеческой кДНК или геномной библиотеки, используя полинуклеотидные зонды, основанные на последовательности 8Е0 Ш N0:1, 8Е0 Ш N0:4. Эти методы являются стандартными и известными и могут быть достигнуты, используя набор клонирования, доступный от коммерческих поставщиков; см., например (АикиЬе1 е1 а1. (ейк.), 81юг1 РгоСосок ш Мо1еси1аг Вю1оду, 3^гйЕййюп, ккп Уйеу & 8опк (1995); Уи е1 а1., МеСкойк ш Оепе ВюСескпокду, СРС Ргекк, 1пс 1997; Ау1у и Ьейег, Ргос. №11'1 Асай. 8ск И8А, 69: Т408 (1972); Ниупк еС а1., Сопкйисбпд апй 8сгеешпд с^NА МЬгагкк 1п λ§110 апй λ^ΐ11 1п ^NА С1ошпд: А Ргасйса1 Арргоаск, Уо1. 1, 01оуег (ей.), р. 49 (1ВЬ ргекк, 1985); Уи (1997) а! р. 47-52).

Молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют человеческий ген 1Ь-17ВА или 1Ь-17ВС, могут также быть получены, используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с олигонуклеотидными праймерами, имеющими нуклеотидные последовательности, которые основаны на нуклеотидных последова

- 18 015351 тельностях гена ГО-ПКА или Ш-ПКС или кДНК. Общие методы для библиотек скрининга с ПЦР предоставляются, например, Уи е1 а1., Ике оГ Ро1утегаке Сбат Кеасбоп Го 8сгееп РНаде ЫЬгапек ίη Мебюбк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1.15: РСК РгоЮсо1к: СиггепГ Мебюбк апб Аррбсабопк, \У1Ше (еб.). Нитапа Ргекк, Шс., 1993. Кроме того, методы применения ПЦР, чтобы выделять близкие гены, описаны, например, РгекГоп, Ике оГ ОедепегаГе 0бдопис1еоббе Рптег апб 1бе Ро1утегаке Сбат Кеасбоп Го С1опе Сепе Еатбу МетЬегк ш Мебюбк т Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1.15: РСК РгоГосо1к: СиггепГ МеГНобк апб Аррбсабопк, ХУНбе (еб.)., Нитапа Ргекк, Шс., 1993. В качестве альтернативы, ген ГО-ПКА или ГО-ПКС может быть получен синтезом молекул нуклеиновых кислот, используя взаимно праймирующие длинные олигонуклеотиды и нуклеотидные последовательности, описанные здесь (см., например, АикиЬе1 (1995)). Установленные методы, использующие полимеразную цепную реакцию, обеспечивают способность синтезировать молекулы ДНК длиной по меньшей мере две килобазы (Абапд еГ а1., Р1апГ Мо1ес. Вю1. 21:1131 (1993), ВатЬоГ еГ а1., РСК Мебюбк апб Арбсабопк, 2:266 (1993), Эб1оп еГ а1., Ике оГ 1бе Ро1утегаке Сбат Кеасбоп Гог Кар1б Сопкбисбоп оГ 8упГНебс Сепек ш Мебюбк т Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1.15: РСК РгоГосо1к: СиггепГ Мебюбк апб Аррбсабопк, \У11бе (еб.)., Нитапа Ргекк, Шс., (1993), апб Но1о\\'ас1шк еГ а1., РСК МеГНобк Арр1., 4:299 (1995)). Для обзоров по синтезу полинуклеотидов см., например, Сбск апб РакГегпак, Мо1еси1аг ВюГесбпо1о§у, Рппс1р1ек апб Арбсабопк оГ КесотЬшапГ ЭХА (А8М ргекк, 1994), Пакта еГ а1., Аппи. Кеу. Вюсбет., 53:323 (1984), апб Сбт1е еГ а1., Ргос. N<11'1 Асаб. 8сГ И8А, 87:633 (1990).

Ό) Продукция генных вариантов ГО-ПКА или ГО-ПКС.

Настоящее изобретение обеспечивает много молекул нуклеиновой кислоты, включая молекулы ДНК и РНК, которые кодируют полипептиды ГО-ПКА или I^-17КС, раскрытые здесь. Специалисты в технологии с готовностью признают, что ввиду вырождения генетического кода значительное изменение последовательности возможно среди этих полинуклеотидных молекул. Кроме того, настоящее изобретение также обеспечивает изолированные растворимые мономерные, гомодимерные, гетеродимерные и мультимерные рецепторные полипептиды, которые включают по меньшей мере часть I^-17КС, который является существенно гомологичным рецепторному полипептиду последовательности 8ЕО ГО N0:2. Таким образом, настоящее изобретение рассматривает молекулы нуклеиновой кислоты полипептидкодирующие ГО-ПКА I^-17КС, включая выродившиеся нуклеотиды последовательности 8Е0 ГО N0:1 или последовательности 8Е0 ГО N0:4 и их РНК эквиваленты.

Специалисты в технологии с готовностью признают, что ввиду вырождения генетического кода значительное изменение последовательности возможно среди этих полинуклеотидных молекул. Последовательность 8Е0 ГО N0:7 представляет собой выродившуюся нуклеотидную последовательность, которая охватывает все молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид Ш-ПКС последовательности 8Е0 ГО N0:2. Специалисты в технологии с готовностью признают, что вырожденная последовательность 8Е0 ГО N0:7 также обеспечивает все РНК последовательности, кодирующие последовательность 8Е0 ГО N0:2 заменой Т на и.

Таким образом, настоящее изобретение рассматривает молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид I^-17КС, включая нуклеотиды 154-2229 последовательности 8Е0 ГО N0:1 и их РНК эквиваленты. Точно так же I^-17КС-1 вырожденная последовательность 8Е0 ГО N0:6 также обеспечивает все РНК последовательности, кодирующие последовательность 8Е0 ГО N0:5 заменой Т на и.

Табл. 4 включает однобуквенные коды для обозначения положения выродившегося нуклеотида. Разрешение представляет собой нуклеотиды, обозначенные кодовой буквой. Комплемент указывает код комплементарного нуклеотида (нуклеотидов). Например, код Υ обозначает или С, или Т, а его комплемент К обозначает А или С, причем А комплементарно Т, а С комплементарно С.

- 19 015351

Нуклеотид	Разрешение
А	А
С	С
(3	С
Т	т
Е	А\|С
У	С\|Т
м	А\|С
к	СИТ
8	С\|С
νν	А\|Т
Н	А\|С\|Т
В	С\|О\|Т
V	А\|С\|С
ϋ	А\|С\|Т
N	А\|С\|С\|Т

Таблица 4

Комплемент	Разрешение
Т	Т
С	С
с	С
А	А
Υ	С\|Т
Е	А\|С
К	О\|Т
М	А\|С
8	С\|С
И	А\|Т
ϋ	А\|С\|Т
V	А\|С\|С
в	С\|(3\|Т
н	А\|С\|Т
N	А\|С\|С\|Т

Выродившиеся кодоны, охватывающие все возможные кодоны для данной аминокислоты, представлены в табл. 5.

Таблица 5

Аминокислота	Однобуквенный код	Кодоны	Выродившийся Кодон
Суз	С	ТСС ТОТ	ΤΟΥ
Зег	8	АСС АСТ ТСА ТСС ТСС ТСТ	ννδΝ
ТЬг	Т	АСА АСС АСС АКТ	АСЫ
Рго	Р	ССА ССС ССС ССТ	ссц
А1а	А	ССА ССС ССС ССТ	ССЫ
С1у	С	ССА ССС ССС ССТ	ΟΟΝ
Азп	N	ААС ААТ	ΑΑΥ
Азр	ϋ	САС САТ	ΟΑΥ
ΟΙυ	Е	САА САС	САР
С1п	Ω	САА САС	САЕ
Η13	Н	САС САТ	ΟΑΥ
Агд	К	АСА АСС ССА ССС ССС ССТ	ΜΟΝ
Ьуз	К	АААААС	ААЕ
Ме1	М	АТС	АТС
Не	1	АТА АТС АТТ	АТН
Ьеи	1	СТА СТС СТС СТТ ТТА ТТС	ΥΤΝ
Уа1	V	СТА СТС СТС СТТ	ΟΤΝ
РЬе	г	ТТСТТТ	ΤΤΥ
Туг	Υ	ТАС ТАТ	ΤΑΥ
Тгр	\Л/	ТСС	ТСС
Тег		ТАА ТАС ТСА	ТЕН
Азп\|Азр	в		ΕΑΥ
С1и\|С1л	Ζ		ЗАЕ
Любой	X		ΝΝΝ

Каждый специалист в технологии оценит, что некоторая неясность вносится в определение выродившегося кодона, представителя всех возможных кодонов, кодирующих аминокислоту. Например, выродившийся кодон для серина (\8Ν), при некоторых обстоятельствах, может кодировать аргинин (АОК), а выродившийся кодон для аргинина (ΜΟΝ), при некоторых обстоятельствах, может кодировать серин (ΑΟΥ). Подобные отношения существуют между кодонами, кодирующими фенилаланин и лейцин. Таким образом, некоторые полинуклеотиды, охватываемые выродившейся последовательностью, могут кодировать вариантные аминокислотные последовательности, но каждый специалист в технологии может легко идентифицировать такие вариантные последовательности, обращаясь к аминокислотной последовательности 8Б9 ГО N0:6. Вариантные последовательности могут быть легко проверены на функ циональные возможности, как описано здесь.

Различные виды могут показать предпочтительное применение кодона. В общем, см., ОгапШат е! а1., Νυοί. Αοίάδ Кез. 8:1893 (1980), Нааз е! а1., Сигг. Вю1., 6:315 (1996), \ат-НоЬзоп е! а1., Оепе, 13:355 (1981), Огоз^еап апб Р1егз, Оепе, 75:199 (1982), Но1т, Шс. Ас1бз Кез. 14:3075 (1986), 1кетига, I. Μοί. Βΐοΐ. 158:513 (1982), Зйагр и Ма!азз1, Сигг. Орт. Оепе!. Эеу. 4:851 (1994), Капе, Сигг. Орт. Вю!есИпо1., 6:494 (1995), апб Макпбез, М1сгоЫо1. Кеу., 60:512 (1996). Как используется здесь, термин предпочтительное

- 20 015351 применение кодона или предпочтительные кодоны является технологическим термином, относящимся к кодонам трансляции белка, которые наиболее часто используются в клетках определенного вида, таким образом, способствуя одному или нескольким представителям возможных кодонов, кодирующих каждую аминокислоту (см. табл. 5). Например, аминокислота треонин (Ткг) может быть кодирована АСА, АСС, ЛСС или АСТ, но в клетках млекопитающих АСС является обычно используемым кодоном; в других видах, например клетках насекомых, дрожжах, вирусах или бактериях, различные кодоны Ткг могут быть предпочтительными. Предпочтительные кодоны для определенного вида могут быть введены в полинуклеотиды по настоящему изобретению многими методами, известными в технологии. Введение предпочтительных последовательностей кодона в рекомбинантную ДНК может, например, увеличить продукцию белка, делая трансляцию белка более эффективной в пределах определенного клеточного типа или вида. Поэтому выродившиеся последовательности кодона, раскрытые здесь, служат матрицей для того, чтобы оптимизировать экспрессию полинуклеотидов в различных клеточных типах и видах, обычно используемых в технологии и раскрытых здесь. Последовательности, содержащие предпочтительные кодоны, могут быть проверены и оптимизированы для экспрессии в различных видах и проверены на функциональные возможности, как раскрыто здесь.

кДНК, кодирующая 1Ь-17ВА или 1Ь-17ВС, может быть изолирована многими методами, такими как зондирование полной или частичной человеческой кДНК или одним, или больше наборами выродившихся зондов, основанных на раскрытых последовательностях. кДНК может также быть клонирована, применяя полимеразную цепную реакцию с праймерами, разработанными из представительных человеческих последовательностей 1Ь-17ВА или 1Ь-17ВС, раскрытых здесь. Кроме того, кДНК библиотека может использоваться, чтобы трансформировать или трансфицировать клетки-хозяева, и экспрессия кДНК интереса может быть обнаружена антителом к полипептиду 1Ь-17ВА или 1Ь-17ВС.

Специалисты в технологии признают, что последовательность, раскрытая в 8ЕО ΙΌ NО:1, представляет единственную аллель человеческого 1Ь-17ВС и что аллельное изменение и альтернативный сплайсинг, как ожидают, будут иметь место. Аллельные варианты этой последовательности могут быть клонированы зондированием кДНК или геномными библиотеками из различных людей согласно стандартным процедурам. Аллельные варианты нуклеотидных последовательностей, раскрытых здесь, включая последовательности, которые содержат молчащие мутации и последовательности, в которых мутации приводят к изменениям в аминокислотной последовательности, находятся в рамках настоящего изобретения, так как являются белками, которые являются аллельными вариантами аминокислотных последовательностей, раскрытых здесь. Молекулы кДНК, произведенные из альтернативно сплайсированных мРНК, которые сохраняют свойства полипептида 1Ь-17ВС, включаются в рамки настоящего изобретения, так как являются полипептидами, кодированными такими кДНК и мРНК. Аллельные варианты и сплайсварианты этих последовательностей могут быть клонированы зондированием кДНК или геномными библиотеками от различных людей или тканей согласно стандартным процедурам, известным в технологии.

Используя методы, обсужденные выше, специалист в технологии может получить много полипептидов, кодирующих растворимый рецептор, который включает участок субъединицы рецептора 1Ь-17ВС, который является существенно гомологичным к последовательности 8ЕО ΙΌ NО:1 или 8ЕО ΙΌ NО:4 или который кодирует всю или фрагмент последовательности 8ЕО ΙΌ NО:2 или 8Е0 ΙΌ NО:5 или их аллельные варианты и сохраняют лигандсвязывающие свойства рецептора [И-17ВС дикого типа. Такие полипептиды могут также включать дополнительные полипептидные сегменты, как в целом раскрыто здесь.

В пределах определенных вариантов изобретения изолированные молекулы нуклеиновой кислоты могут гибридизироваться при строгих условиях с молекулами нуклеиновой кислоты, включающими нуклеотидные последовательности, раскрытые здесь. Например, такие молекулы нуклеиновой кислоты могут гибридизироваться при строгих условиях с молекулами нуклеиновой кислоты, включающими нуклеотидные последовательности 8Е0 ΙΌ NО:1 или 8Е0 ΙΌ NО:4 или с молекулами нуклеиновой кислоты, включающими нуклеотидные последовательности, комплементарные к 8Е0 ΙΌ NО:1 или 8Е0 Ш NО:4, или их фрагменты.

В общем, строгие условия выбирают так, чтобы они были приблизительно на 5°С ниже, чем тепловая точка плавления (Т.пл.) для определенной последовательности при определенной ионной силе и рН. Т.пл. представляет собой температуру (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% целевой последовательности гибридизируется с хорошо подобранным зондом. После гибридизации молекулы нуклеиновой кислоты могут быть промыты, чтобы удалить негибридизированные молекулы нуклеиновой кислоты при строгих условиях или при очень строгих условиях; см., например, ЗатЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 8есопб Ебйюп (Со1б 8ргтд НагЬог Ргекк, 1989); Аи8иЬе1 е! а1. (ебк.), Сиггеп! Рго!осок ш Мо1еси1аг С1ошпд (1окп Айеу апб 8оп§, Ичс. 1987); Вегдег и К1тте1 (ебк.), Сшбе !о Мо1еси1аг С1ошшд Тес11пк|ие5 (Асабетю Ргекк, Шс. 1987); апб Ае1тиг. Сп! Веу.Вюскет. Мо1. Вю1. 26:227 (1990)). Программное обеспечение секвенирования, такое как ОЬЮО 6.0 (Ь8В; Ьопд Ьаке, ΜΝ) и Рптег Ргет1ег 4.0 (Ргет1ег Вюкой !п(егпа(1опа1; Ра1о А1!о, СА), так же как сайты в Интернете, являются доступными инструментами для анализа данной последовательности и вычисления Т.пл., основанное на определенных пользователем критериях. Это вполне в пределах способности специалиста, чтобы приспосо

- 21 015351 бить гибридизацию и промывку для использования с определенным полинуклеотидным гибридом.

Настоящее изобретение также обеспечивает изолированные полипептиды 1Б-17КА или 1Ь-17КС, которые имеют существенно подобные идентичности последовательностей к полипептидам последовательностей 8ЕС) ΙΌ N0:2 (1Ь-17КС) и 8ЕС) ΙΌ N0:21 (1Ь-17КЛ), или их ортологи. Термин существенно подобная идентичность последовательности использован здесь, чтобы обозначить полипептиды, имеющие по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, таких как 96, 97, 98 или больше 95% идентичности последовательности с последовательностями, показанными в последовательности 8ЕС) ΙΌ N0:2, или их ортологами. Например, вариантные и ортологические рецепторы 1Б-17КА или 1Б-17КС могут использоваться, чтобы произвести иммунную реакцию и развести перекрестно-реагирующие антитела к человеческим 1Ь-17КЛ или 1Ь-17КС. Такие антитела могут быть гуманизированы и модифицированы, как описано здесь, и использованы терапевтически для лечения псориаза, псориатического артрита, БВК, БРК, колита, эндотоксемии, так же как в других терапевтических применениях, описанных здесь.

Настоящее изобретение также рассматривает вариантные молекулы нуклеиновой кислоты 1Б-17КА или 1Б-17КС, которые могут быть идентифицированы, используя два критерия: определение подобия между кодированным полипептидом с аминокислотной последовательностью 8ЕС) ΙΌ N0:2 (1Б-17КС) и 8ЕС) ΙΌ N0:21 (ГБ-17КЛ) и гибридизационный анализ. Такие варианты включают молекулы нуклеиновой кислоты: (1) которые остаются гибридизированными с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность 8ЕС) ΙΌ N0:1 или 8ЕС) ΙΌ N0:4 для ББ-17КС (или его комплемента) при строгих условиях промывки, в которых строгость промывки эквивалентна 0,5х-2х 88С с 0,1% 8Ό8 при 55-65°С, и (2) которые кодируют полипептид, имеющий по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или больше 95%, таких как 96, 97, 98 или 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью 8ЕС) ΙΌ N0:2. Альтернативно, варианты ΙΕ17КС могут характеризоваться как молекулы нуклеиновой кислоты: (1) которые остаются гибридизированными с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность 8ЕС) ΙΌ N0:1 или 8ЕС) ΙΌ N0:4 (или его комплемент) при очень строгих условиях промывки, в которых строгость промывки эквивалентна 0,1х-0,2х 88С с 0,1% 8Ό8 при 50-65°С, и (2) которые кодируют полипептид, имеющий по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или больше 95%, таких как 96, 97, 98 или 99% или больше идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью 8ЕС) ΙΌ N0:2.

Процент идентичности последовательности определяют обычными методами; см., например, Л1НсЬи1 е! а1., Ви11. МаШ. Βίο., 48:603 (1986), и НешкоББ и НешкоББ, Ргос. N1'1 Асаб. 8с1. И8Л, 89:10915 (1992). Кратко, две аминокислотные последовательности выравниваются, чтобы оптимизировать показатели выравнивания, используя штраф за открытие делеции 10, штраф за продолжение делеции 1 и матрицу подсчета ВБ08иМ62 НешкоББ и НешкоББ (там же), как показано в табл. 6 (аминокислоты указаны стандартными однобуквенными кодами). Процент идентичности затем вычисляют, как ([Общее количество идентичных пар]/[длина более длинной последовательности плюс количество гэпов, введенных в более длинную последовательность, чтобы выровнять эти две последовательности])· 100.

Таблица 6

А	К	N	ϋ С	о	Е С	Н	I	1>	к	м	г	Р	3	Т	И	Υ V
А 4
К -1	5
N -2	0	б
ϋ -2	-2	1	6
С 0	-3	-3	-3 9
Ω -1	1	0	0 -3	5
Е -1	0	0	2 -4	2	5
С 0	-2	0	-1 -3	-2	-2 6
Н -2	0	1	-1 -3	0	0 -2	8
I -1	-3	-3	-3 -1	-3	-3 -4	-3	4
Ь -1	-2	-3	-4 -1	-2	-3 -4	-3	2	4
К -1	2	0	-1 -3	1	1 -2	-1	-3	-2	5
М -1	-1	-2	-3 -1	0	-2 -3	-2	1	2	-1	5
Е -2	-3	-3	-3 -2	-3	-3 -3	-1	0	0	-3	0	6
Р -1	-2	-2	-1 -3	-1	-1 -2	-2	-3	-3	-1	-2	-4	7
3 1	-1	1	0 -1	0	0 0	-1	-2	-2	0	-1	-2	-1	4
Т 0	-1	0	-1 -1	-1	-1 -2	-2	-1	-1	-1	-1	-2	-1	1	5
И -3	-3	-4	-4 -2	-2	-3 -2	-2	-3	-2	-3	-1	1	-4	-3	-2	11
Υ -2	-2	-2	-3 -2	-1	-2 -3	2	-1	-1	-2	-1	3	-3	-2	-2	2	7
V 0	-3	-3	-3 -1	-2	-2 -3	-3	3	1	-2	1	-1	-2	-2	0	-3	-1 4

- 22 015351

Специалисты в технологии оценят, что есть много установленных алгоритмов, доступных, чтобы выровнять две аминокислотные последовательности. Алгоритм поиска подобия РА8ТА Реагюп и Ь1ртап представляет собой подходящий метод выравнивания белков для определения уровня идентичности, разделенного аминокислотной последовательностью, раскрытой здесь, и аминокислотной последовательностью предполагаемого варианта 1Й-17КС. Алгоритм РА8ТА описан Реагтоп и Ыртап, Ргас. N31'1 Асаб. 8с1. И8А, 85:2444 (1988) и Реаг^^ Ме111. Εηζутοί. 183:63 (1990). Кратко, РА8ТА сначала характеризует подобие последовательности, идентифицируя области, разделенные последовательностью под вопросом (например, последовательность 8ЕО ГО N0:2 или 8Е0 ГО N0:3) и тестовой последовательностью, которая имеет или самую высокую плотность идентичности (если переменная к!ир=1), или пары идентичности (если к!ир=2), не рассматривая консервативные аминокислотные замены, инсерции или делеции. Десять областей с самой высокой плотностью идентичности затем повторно пересчитывают, сравнивая подобие всех спаренных аминокислот, используя матрицу замены аминокислот, и концы областей урезают, с включением только тех остатков, которые вносят вклад в самый высокий счет. Если есть несколько областей с показателями, больше, чем урезанная величина (вычисленная по предопределенной формуле, основанной на длине последовательности и величине к!ир), то урезанные начальные области исследуются, чтобы определить, могут ли области соединяться с получением приблизительного выравнивания с гэпами. Наконец, самые высокие области подсчета двух аминокислотных последовательностей выравниваются, используя модификацию алгоритма Недлемана-Вюнша-Селлерса (№еб1етап и νυ^Λ, 1. Μο1. Βίο1. 48:444 (1970); 8е11егк, 81АММ 1. Арр1. МаШ., 26:1%1 (1974)), который учитывает аминокислотные инсерции и делеции. Иллюстративные параметры для анализа РА8ТА: к!ир=1, штраф за открытие делеции=10, штраф за продолжение делеции=1 и матрица замены=Β^О8υΜ62. Эти параметры могут быть введены в программу РА8ТА, изменяя файл матрицы подсчета (8МАТК1Х), как объяснено в приложении 2 из Реалюп, Ме111. Εηζутο1. 183:63 (1990).

РА8ТА может также использоваться, чтобы определить идентичность последовательности молекул нуклеиновой кислоты, используя отношение, как раскрыто выше. Для сравнений нуклеотидных последовательностей величина к!ир может изменяться от одного до шести, предпочтительно от трех до шести, наиболее предпочтительно три, с другим набором параметров, как описано выше.

Настоящее изобретение включает молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид, имеющий консервативные аминокислотные замены по сравнению с аминокислотной последовательностью, раскрытой здесь. Например, могут быть получены варианты, которые содержат одну или более аминокислотные замены последовательностей 8Е0 ГО N0:2 или 21, в которых алкиламинокислота в аминокислотной последовательности ГО-17КА или ГО-17КС заменяется на алкиламинокислоту, ариламинокислота в аминокислотной последовательности ГО-17КА или ГО-17КС заменяется на ариламинокислоту, серосодержащая аминокислота в аминокислотной последовательности ГО-17КА или ГО-17КС заменяется на серосодержащую аминокислоту, гидроксисодержащая аминокислота в аминокислотной последовательности ГО-17КА или ГО-17КС заменяется на гидроксисодержащую аминокислоту, кислотная аминокислота в аминокислотной последовательности ГО-17КА или ГО-17КС заменяется на кислотную аминокислоту, основная аминокислота в аминокислотной последовательности ГО-17КА или ГО-17КС заменяется на основную аминокислоту, или двухосновная монокарбоновая аминокислота в аминокислотной последовательности ГО-17КА или ГО-17КС заменяется на двухосновную монокарбоновую аминокислоту. Среди общих аминокислот, например, консервативная замена аминокислоты иллюстрируется заменой среди аминокислот в пределах каждой из следующих групп: (1) глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин, (2) фенилаланин, тирозин и триптофан, (3) серин и треонин, (4) аспартат и глутамат, (5) глютамин и аспарагин, (6) лизин, аргинин и гистидин. Таблица Β^О8υΜ62 представляет собой матрицу замены аминокислот, полученную из приблизительно 2000 местных многократных выравниваний сегментов белковых последовательностей, представляющих очень консервативные области больше чем 500 групп близких белков (Иеткей и ^πίΚοίΓ Ргос. Νη1'1 Асаб. 8ск И8А, 59:10915 (1992)). Соответственно частоты замены Β^О8υΜ62 могут использоваться, чтобы определить консервативные замены аминокислот, которые могут быть введены в аминокислотные последовательности по настоящему изобретению. Хотя возможно проектировать замены аминокислот, основанные исключительно на химических свойствах (как обсуждено выше), язык консервативная замена аминокислоты предпочтительно относится к замене, представленной величиной Β^О8υΜ62 больше чем -1. Например, замена аминокислоты консервативна, если замена характеризуется величиной Β^О8υΜ62 0, 1, 2 или 3. Согласно этой системе предпочтительные консервативные замены аминокислот характеризуются величиной Β^О8υΜ62 по меньшей мере 1 (например, 1, 2 или 3), в то время как более предпочтительные консервативные замены аминокислоты характеризуются величиной Β^О8υΜ62 по меньшей мере 2 (например, 2 или 3). Определенные варианты ГО-17КС характеризуются наличием по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или больше 95%, такой как 96, 97, 98 или 99% или большей идентичности последовательности с соответствующей аминокислотной последовательностью (например, последовательностью 8Е0 ГО N0:2 или 21), в которой изменение в аминокислотной последовательности происходит из-за одной или больше консервативных замен аминокислоты.

- 23 015351

Консервативные аминокислотные изменения в гене 1Ь-17КА. или 1Ь-17ВС могут быть введены, например, заменой нуклеотидов, перечисленных в последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1 или 4, на нуклеотиды. Такие варианты консервативной аминокислоты могут быть получены олигонуклеотид-специфическим мутагенезом, линкерсканирующим мутагенезом, мутагенезом, использующим полимеразную цепную реакцию, и т.п. (см. АикиЬе1 (1995); и МсРйеткои (еб.), И1гес!еб Ми!адеиек1к: А Ргасбса1 Арргоасй (1ВЬ Ргекк, 1991)). Вариантный полипептид 1Ь-17ВС может быть идентифицирован по способности специфично связывать антитела анти-1Ь-17ВС.

Белки по настоящему изобретению могут также включить не встречающиеся в природе аминокислотные остатки. Не встречающиеся в природе аминокислотные остатки включают, без ограничения, транс-3-метилпролин, 2,4-метанопролин, цис-4-гидроксипролин, транс-4-гидроксипролин, Νметилглицин, аллотреонин, метилтреонин, гидроксиэтилцистеин, гидроксиэтилгомоцистеин, нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколиновую кислоту, тиазолидинкарбоновую кислоту, дегидропролин, 3- и 4метилпролин, 3,3-диметилпролин, трет-лейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4азафенилаланин и 4-фторфенилаланин. Несколько методов известны в технологии для включения не встречающихся в природе аминокислотных остатков в белки. Например, ш ν Иго система может применяться, в которой нонсенс-мутации подавляют, используя химически аминоацилированные супрессорные тРНК. Методы синтеза аминокислот и аминоацилированных тРНК известны в искусстве. Транскрипция и трансляция плазмид, содержащих нонсенс-мутации, обычно выполняются в бесклеточной системе, включающей экстракт Е.сой 830 и коммерчески доступные ферменты и другие реагенты. Белки очищают хроматографией; см., например, ВоЬепкои е! а1., 1. Сйет. 8ос. 113:2122 (1991), Е11таи е! а1., Ме!йобк Еи7уто1., 202:301 (1991), Сйиид е! а1., 8с1еисе, 259:806 (1993), аиб Сйиид е! а1., Ргос. №11'1 Асаб. 8сЕ И8А, 90:10145 (1993).

Во втором методе перевод выполнен в овоцитах Хеиорик микроинъекцией мутированной мРНК и химически аминоацилированных супрессорных тРНК (ТигсаШ е! а1., 1. Бю1. Сйет. 277:19991 (1996)). В пределах третьего метода, клетки Е.со11 культивируются в отсутствие естественной аминокислоты, которая должна быть заменена (например, фенилаланин), и в присутствии желательной не встречающейся в природе аминокислоты (например, 2-азафенилаланина, 3-азафенилаланина, 4-азафенилаланина и 4-фторфенилаланина). Не встречающуюся в природе аминокислоту включают в белок вместо его естественной копии. См., Ко1бе е! а1., Вюсйет., 33:7470 (1994). Естественно встречающиеся аминокислотные остатки могут быть преобразованы в не встречающиеся в природе аминокислоты химической модификацией 1и У1!го. Химическая модификация может быть объединена с сайт-специфическим мутагенезом, чтобы далее расширить диапазон замен (^уии и Ктсйатбк, Рто!ет 8сЕ, 2:395 (1993)).

Аминокислотные остатки 1Ь-17КА или 1Ь-17К.С могут быть заменены на ограниченное число неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые кодируются генетическим кодом, на не встречающиеся в природе аминокислоты и неестественные аминокислоты.

Существенные аминокислоты в полипептидах по настоящему изобретению могут быть идентифицированы согласно методикам, известным в технологии, таким как сайт-специфический мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Сииитдйат и Уэллс, 8с1еисе, 244:1081 (1989), Вакк е! а1., Ргос. №11'1 Асаб. 8с1. И8А, 58:4498 (1991), СоотЬк аиб Согеу, 81!е-б1гес!еб Ми!адеиек1к аиб Рто!еш Еидшееттд т Рго!ешк: Аиа1ук1к аиб Пеыди, Аиде1е!б (еб.), р. 259-311 (Асабетю Ргекк, 1ис. 1998)). В последней методике единственные мутации аланина вводятся в каждый остаток молекулы, и проистекающие мутантные молекулы проверяют на биологическую активность, чтобы идентифицировать аминокислотные остатки, которые важны для активности молекулы. См. также, Нб!ои е! а1., 1. Вю1. Сйет. 277:4699 (1996).

Хотя секвенирование может использоваться, чтобы далее определить лигандсвязывающие области 1Ь-17КА или 1Ь-17ВС, аминокислоты, которые играют роль в связывающей активности 1Ь-17КА или 1Ь17ВС (таком как связывание 1Ь-17ВС с 1Ь-17А или 1Ь-17Е, или 1Ь-17КА с 1Ь-17А), могут также быть определены физическим анализом структуры, как определено такими методами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, электронная дифракция или маркировка фотосродства, в соединении с мутацией предполагаемого контактного сайта аминокислот; см., например, бе Уок е! а1., 8с1еисе, 255:306 (1992), 811111Ι1 е! а1., 1. Мо1. Вю1. 224:899 (1992), аиб №1обаует е! а1., ЕЕВ8 Ье!!., 309:59 (1992).

Конкретно, три области идентифицированы.

1) Домен 1 (последовательности 8ЕО ΙΌ N0:159 и 160) включает экзоны 8-10 из 1Ь-17ВС. Это соответствует аминокислотным остаткам 193-276 из 1Ь-17ВСх1 (последовательность 8ЕО ΙΌ N0:2) и аминокислотным остаткам 208-291 из 1Ь-17ВСх4 (последовательность 8Е0 ΙΌ N0:166).

2) Домен 2 (последовательности 8Е0 ΙΌ N0:161 и 162) включает экзоны 11-13 из 1Ь-17ВС. Это соответствует аминокислотным остаткам 277-370 из ГЕ-17ВСх1 (последовательность 8Е0 ΙΌ N0:2) и аминокислотным остаткам 292-385 из ΙΕ-17Κ£χ4 (последовательность 8Е0 ΙΌ N0:166).

3) Домен 3 (последовательности 8Е0 ΙΌ N0:163 и 164) включает экзоны 8-10 из ΙΕ-17ΒΕ. Это соответствует аминокислотным остаткам 371-447 из ΙΕ-17ΚΠχ1 (последовательность 8Е0 ΙΌ N0:2) и аминокислотным остаткам 386-482 из ΙΕ-17Κ£χ4 (последовательность 8Е0 ΙΌ N0:166).

Многократные замены аминокислот могут быть сделаны и испытаны, используя известные методы мутагенеза и скрининга, такие как раскрыты Ве1бйаат-01кои аиб 8аиег (8с1еисе, 241:53 (1988)) или Во\\зе

- 24 015351 и 8аиег (Ргос. №!'1 Аса4. 8с1. И8А, 86:2152 (1989)). Кратко, эти авторы раскрывают методы для одновременно рандомизации двух или больше положений в полипептиде, селекции функционального полипептида и последующего секвенирования мутагенетического полипептида, чтобы определить спектр допустимых замен в каждом положении. Другие методы, которые могут использоваться, включают показ бактериофага (например, Ьоитап е! а1., Вюсйет. 30:10832 (1991), Ьа4пег е! а1., И8А Ра!еп! N0. 5223409, Нике, международная публикация XV0 92/06204 и регионспецифический мутагенез (ЭегЬубиге е! а1., Сепе, 46:И5 (1986) и №г е! а1., ОНА, 7:127 (1988)). Кроме того, Ю-ПВС или ΙΕ-17ΚΛ, маркированные биотином или ФИТЦ, могут использоваться для экспрессионного клонирования лигандов ГЕ-17КС.

Варианты раскрытых нуклеотидных или полипептидных последовательностей ΙΕ-ΠΕί.' или ГЬ17РА могут также быть произведены через тасование ДНК, как раскрыто 8!еттег, №11иге. 370:389 (1994), 8!еттег, Ргос. №11'1 Аса4.8с1. И8А, 97:10747 (1994) и международная публикация ν0 97/20078. Кратко, вариантные молекулы ДНК производятся ίπ νί(Γ0 гомологической рекомбинацией случайной фрагментации родительской ДНК, за которой следует повторная сборка, используя ПЦР, приводя к случайно вводимым точечным мутациям. Эта техника может быть изменена при использовании семейства родительских молекул ДНК, таких как аллельные варианты или молекулы ДНК из различных видов, чтобы вводить дополнительную вариабельность в процесс. Выбор или скрининг на желательную активность, за которым следуют дополнительные повторения мутагенеза и анализ, предусматривает быстрое развитие последовательностей выбором желательных мутаций при одновременном выборе против вредных изменений.

Методы мутагенеза, как раскрыто здесь, могут быть объединены с автоматизированными методами скрининга высокой пропускной способности, чтобы обнаружить активность клонированных, мутагенизированных полипептидов в клетках-хозяевах. Мутагенизированные молекулы ДНК, которые кодируют биологически активные полипептиды, или полипептиды, которые связываются с антителами анти-ΙΕ17РС или анти-ЕЕ-ПКА, могут быть выделены из клеток-хозяев и быстро секвенированы, применяя современное оборудование. Эти методы позволяют быстрое определение важности индивидуальных аминокислотных остатков в полипептиде интереса и могут быть применены к полипептидам неизвестной структуры.

Настоящее изобретение также включает функциональные фрагменты полипептидов ΙΕ-17Κ£ или ΙΕ-ΠΗΛ и молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие такие функциональные фрагменты. Эти функциональные фрагменты могут либо связывать лиганд или лиганды (т.е. как ΙΕ-ΠΑ так и ΙΕ-17Ρ) по отдельности или вместе. Обычный делеционный анализ молекул нуклеиновой кислоты может быть выполнен, чтобы получить функциональные фрагменты молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептиды ΙΕ-ΠΕί.’ или ЕЕ-ПКА. В качестве иллюстрации, молекулы ДНК, имеющие нуклетидную последовательность 8ЕО ΙΌ N0:1 и 8ЕО ΙΌ N0:4, могут быть расщеплены нуклеазой Ва131, чтобы получить ряд гнездовых делеций. Фрагменты затем вставляют в векторы экспрессии в присущей рамке считывания, и экспрессированные полипептиды изолируют и испытывают на способность связывать антитела анти-ЕЕ-ПВС. Альтернативой расщеплению экзонуклеазой является применение олигонуклеотидспецифического мутагенеза, чтобы ввести делеции или стоп-кодоны, чтобы определить продукцию желательного фрагмента. Альтернативно, определенные фрагменты гена ЕЕ-17К.С или ЕЕ-17КА могут синтезироваться, используя полимеразную цепную реакцию.

Этот общий подход иллюстрируется исследованиями по укорочению одного или обоих концов интерферонов и суммирован НобкЬегдег и Όί Магсо, Рйагтас. Тйег., 66:501 (1995). Кроме того, стандартные методы функционального анализа белков описаны, например, Тгеи!ег е! а1., Мо1ес. Сеп. Сепе!, 240:113 (1993), Соп!еп! е! а1., Ехргекбоп апй ргеНпипагу 4е1е!юп апа1ук15 оГ !Бе 42 кЭа 2-5А 5уп!йе!аке тйисей Ьу Битап т!егГегоп ш Вю1одюа1 БйегГегоп 8ук!етк, Ргосее4тдк оГ I8IΒ-ТN0 Меейпд оп БйегГегоп 8ук!етк, Сап!е11 (е4.), р. 65-72 (№(|НоГГ, 1987), НегксБтап, ТБе ЕСЕ ЕесерЮг т Соп!го1 оГ Ашта1 Се11 РгойГеайоп, Уо1. 1, Воуп!оп е! а1. (е4к.), р. 169-199 (Аса4етк Ргекк, 1985), СоитаШеаи е! а1., 1. Вю1. СБет. 270:29270 (1995); Еикипада е! а1., 1. Вю1. СБет. 270:25291 (1995); УатадисЫ е! а1., ВюсБет. РБагтасо1., 50:1295 (1995), апй Ме15е1 е! а1., Р1ап! Мо1ес. Вю1. 30:1 (1996).

Настоящее изобретение также рассматривает функциональные фрагменты гена ΙΕ-17Κ£ или гена ΙΕ-ΠΕΑ у которых есть изменения аминокислот, по сравнению с аминокислотной последовательностью, раскрытой здесь. Вариантный ген ΙΗ-17НС или ΙΗ-17РА может быть идентифицирован на основе структуры, определяя уровень идентичности с раскрытыми нуклеотидными и аминокислотными последовательностями, как обсуждено выше. Альтернативным подходом к идентификации вариантного гена на основе структуры является определение, может ли молекула нуклеиновой кислоты, кодирущая потенциальный вариантный ген ЕЕ-17ВС или ЕЕ-17КА, гибридизироваться с молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, такую как 8ЕО ΙΌ N0:1 и 8Е0 ΙΌ N0:4.

Настоящее изобретение также включает использование функциональных фрагментов полипептидов ЕЕ-17К.С или ΙΕ-ΠΕΑ антигенных эпитопов, эпитопнесущих участков или лигандсвязывающих участков полипептидов ЕЕ-17К.С и (или) ЕЕ-17КА и молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют такие функциональные фрагменты, антигенные эпитопы и эпитопнесущие участки или лигандсвязывающие участки полипептидов ΙΗ-17НС и (или) ЕЕ-17КА. Такие фрагменты применяют, чтобы произвести полипептиды

- 25 015351 для использования в производстве растворимых рецепторов или связывающих молекул, которые связывают, блокируют, ингибируют, уменьшают, противодействуют или нейтрализуют активность [Б-17А или 1Б-17Е или обоих 1Б-17А и 1Б-17Е. Функциональный полипептид 1Б-17ЕС или [И-17КС/1П-17КА или его фрагмент, как определено здесь, характеризуется способностью блокировать, ингибировать, уменьшать, противодействовать или нейтрализовать воспалительную, пролиферативную или дифференцирующуюся активность 1Б-17А и (или) 1Б-17Е, его способностью вызвать или ингибировать специализированные функции клетки, или его способностью связываться специфично с 1Б-17А и (или) 1Б-17Е. Как ранее описано здесь, 1Б-17КА и 1Б-17ЕС характеризуются уникальной структурой рецептора цитокина и доменами, как описано здесь. Таким образом, настоящее изобретение далее рассматривает использование слитых белков, включающих: (а) полипептидные молекулы, включающие один или больше доменов, описанных выше; и (Ь) функциональные фрагменты, включающие один или больше из этих доменов. Другая полипептидная часть слитого белка может быть внесена другим рецептором цитокина, таким как рецептор, подобный ГБ-17, такой как ГБ-ПЕА, 1Б-17ЕЕ, 1Б-ЕЭ, или неприродный и (или) неродственный секреторный сигнальный пептид, который облегчает секрецию слитого белка.

Настоящее изобретение также обеспечивает полипептидные фрагменты или пептиды, включающие лигандсвязывающий участок полипептида 1Б-17ЕС или ГБ-ПЕА, описанный здесь. Такие фрагменты или пептиды могут включать участок либо 1Б-17ЕС, либо ГБ-ПЕА, который связывается с соответствующим лигандом (1Б-17А и (или) 1Б-17Е).

Для любого полипептида 1Б-17ЕС или ГБ-ПЕА, включая варианты и слитые белки, специалист в технологии может легко произвести полностью вырожденную полинуклеотидную последовательность, кодирующую этот вариант, используя информацию, изложенную в табл. 1 и 2 выше. Кроме того, специалисты в технологии могут использовать стандартное программное обеспечение, чтобы разработать варианты 1Б-17ЕС или ГБ-ПЕА, основанные на нуклеотидных и аминокислотных последовательностях, описанных здесь.

Е) Продукция полипептидов 1Б-17ЕС. 1Б-17КА. и 1Б-17КС/1Б-17КА..

Полипептиды по настоящему изобретению, включая полипептиды полной длины; растворимые мономерный, гомодимерные, гетеродимерные и мультимерные рецепторы; рецепторы полной длины; фрагменты рецептора (например, лигандсвязывающие фрагменты и антигенные эпитопы); функциональные фрагменты и слитые белки, могут быть произведены в рекомбинантных клетках-хозяевах, следуя обычным методам. Чтобы экспрессировать ген 1Б-17ЕС, 1Б-17КА. и 1Б-17КС/1Б-17КА., молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, должна быть реально связана с регуляторными последовательностями, которые управляют транскрипционной экспрессией в векторе экспрессии, и затем введена в клетку-хозяина. В дополнение к транскрипционным регуляторным последовательностям, таким как промоторы и усилители, векторы экспрессии могут включать трансляционные регуляторные последовательности и маркерный ген, который подходит для выбора клеток, которые несут вектор экспрессии.

Векторы экспрессии, которые являются подходящими для продукции инородного белка в клеткахэукариотах, обычно содержат: (1) элементы прокариотической ДНК, кодирующей природу бактериальной реплики и маркера устойчивости к антибиотику, чтобы предусмотреть рост и выбор вектора экспрессии в бактериальном хозяине; (2) элементы эукаритической ДНК, которые управляют инициированием транскрипции, такие как промотор; и (3) элементы ДНК, которые управляют обработкой транскриптов, таких как последовательность завершения/полиаденилирования транскрипции. Как обсуждено выше, векторы экспрессии могут также включать нуклеотидые последовательности, кодирующие секреторную последовательность, которая направляет гетерологические полипептиды в секреторный путь клетки-хозяина. Например, вектор экспрессии 1Б-17ЕС может включать ген 1Б-17ЕС, [Б-17ЕА и 1Б17КС/1Б-17КА. и секреторную последовательность, полученную из любого секретируемого гена.

Белки 1Б-17ЕС, 1Б-17ЕА и 1Б-17КС/1Б-17КА. по настоящему изобретению могут быть экспрессированы в клетках млекопитающих. Примеры подходящих клеток-хозяев млекопитающих включают клетки почки африканской зеленой обезьяны (Уего; АТСС СЕБ 1583), клетки почки человеческого эмбриона (НЕК 293; АТСС СЕБ 1573), клетки почки детеныша хомячка (ВНК-21, ВНК-570; АТСС СЕБ 8544, АТСС СЕБ 10314), клетки почки собаки (МОСК; АТСС ССБ 34), клетки яичника китайского хомячка (СНО-К1; АТСС ССБ61; СНО ΌΟ44 (Сйаяп е! а1., 8от. Се11. Мо1ес. Сепе1, 12:555, 1986)), клетки крысиного гипофиза (СН1; АТСС ССБ82), клетки НеБа 83 (АТСС ССБ2.2), клетки крысиной гепатомы (Н-4-ΙΙЕ; АТСС СЕБ 1548), 8У40-преобразованные клетки почки обезьяны (СО8-1; АТСС СЕБ 1650) и мышиные эмбриональные клетки (Ы1Н-3Т3; АТСС СЕБ 1658).

Для млекопитающего организма транскрипционные и трансляционные регулирующие сигналы могут быть получены из вирусных источников млекопитающих, например аденовируса, бычьего вируса папилломы, обезьяньего вируса или им подобных, в которых регулирующие сигналы связаны с определенным геном, у которого есть высокий уровень экспрессии. Подходящие транскрипционные и трансляционные регулирующие последовательности также могут быть получены из генов млекопитающих, например актина, коллагена, миозина и металлотионеина.

Транскрипционные регулирующие последовательности включают промоторную область, достаточную, чтобы направить инициирование синтеза РНК. Подходящие эукариотические промоторы включают

- 26 015351 в качестве промотора мышиный ген металлотионеин 1 (Натег е! а1., 1. Мо1ес. Арр1. Сепе!, 7:273 (1982)), ТК промотор вируса герпеса (МсКшдЫ, Се11, 31:355 (1982)), ранний промотор 8У40 (Венок! е! а1., №(иге, 290:304 (1981)), вирусный промотор саркомы Роуса (Согтап е! а1., Ргос. №11'1 Асаб. 8сг И8А, 79:6111 (1982)), промотор вируса цитомегалии (Роескшд е! а1., Сепе, 45:101 (1980)) и мышиный вирусный промотор опухоли груди (см. в общем Е(сйеуепу, Ехргекыоп оГ Епдтеегеб Рго(еш8 ίπ МаттаЬаи Се11 СиНиге ш Рго(ет Епдтеегтд: Рппс1р1е5 апб Ргасбсе, С1е1апб е! а1. (ебк.), р. 163-181 (1оЬп ХУПеу & 8оп§, 1пс. 1996)).

Альтернативно, прокариотический промотор, такой как промотор бактериофаг Т3 РНК-полимераза, может применяться, чтобы управлять генной экспрессией в клетках млекопитающих, если прокариотический промотор регулируется эукариотическим промотором (2Ьои е! а1., Мо1. Се11. Вю1., 10:4529 (1990), и КаиГтап е а1., №с1. Ас1бк Век., 19:4485 (1991)).

В определенных вариантах последовательность ДНК, кодирующая растворимый рецепторный полипептид 1Ь-17ВС, 1Ь-17ВА и 1Ь-17ВС/1Ь-17ВА или фрагмент полипептида 1Ь-17ВС, 1Ь-17КА или 1Ь17ВС/1Ь-17ВА, является реально связанной с другими генетическими элементами, требуемыми для ее экспрессии, в общем, включая промотор и терминатор транскрипции в пределах вектора экспрессии. Вектор будет также обычно содержать один или более селектируемых маркеров и один или более репликаторов, хотя специалисты в технологии признают, что в пределах определенных систем селектируемые маркеры могут быть предоставлены на отдельных векторах, а реплика экзогенной ДНК может быть предоставлена интеграцией в геноме клетки-хозяина. Выбор промоторов, терминаторов, селектируемых маркеров, векторов и других элементов представляет собой вопрос обычной разработки в пределах уровня обычного навыка в искусстве. Много таких элементов описано в литературе и доступно через коммерческих поставщиков. Многие компоненты растворимого комплекса рецептора могут быть сотрансфицированы на индивидуальных векторах экспрессии или содержаться в единственном векторе экспрессии. Такие методы экспрессии многих компонентов белковых комплексов известны в технике.

Вектор экспрессии может быть введен в клетки-хозяева, используя много стандартных методов, включая кальцийфосфатную трансфекцию, липосом-опосредованную трансфекцию, микроснарядопосредованную доставку, электропорацию, и т.п. Трансфицированные клетки могут быть отобраны и размножены, чтобы обеспечить рекомбинантные клетки-хозяева, которые включают вектор экспрессии, устойчиво интегрированный в геном клетки-хозяина. Методы введения вектора в эукариотические клетки и методы выбора таких устойчивых трансформантов, используя доминантный селектируемый маркер, описаны, например, Аиы.1Ье1 (1995) и Миггау (еб.), Сепе ТгапкГег апб Ехргекыоп Рго!осок (Нитапа Ргекк, 1991).

Например, один подходящий селектируемый маркер представляет собой ген, который обеспечивает устойчивость к антибиотическому неомицину. В этом случае, выбор выполняют в присутствии лекарственного средства типа неомицина, такого как С-418 или ему подобного. Системы выбора могут также использоваться, чтобы увеличить уровень экспрессии гена интереса, процесс называется усиление. Усиление выполняют, культивируя трансфектанты в присутствии низкого уровня селективного средства и затем увеличивая количество селективного средства, чтобы выбрать клетки, которые производят высокие уровни продуктов введенных генов. Подходящий усиливаемый селектируемый маркер представляет собой дигидрофолатредуктазу (ДГФР), которая придает устойчивость к метотрексату. Другие гены устойчивости лекарственного средства (например, устойчивость гигромицина, множественная лекарственная устойчивость, пуромицинацетилтрансфераза) могут также использоваться. Альтернативно, маркеры, которые вводят измененный фенотип, такой как зеленый флуоресцентный белок или белки поверхности клетки, такие как СЭ4, СЭ8, ГКГС класс I, плацентарная щелочная фосфатаза, могут использоваться, чтобы сортировать трансфицированные клетки от нетрансфицированных клеток такими средствами, как сортер РАС8 (клеточный сортер с возбуждением флуоресценции) или технология магнитного разделения гранул.

Полипептиды по изобретению могут также быть произведены культивируемыми клетками млекопитающих, используя вирусную систему доставки. Образцовые вирусы для этой цели включают аденовирус, ретровирусы, вирус герпеса, вирус коровьей оспы и аденоассоциированный вирус (ААВ). Аденовирус, двухниточный вирус ДНК, в настоящее время является лучшим изученным генным вектором передачи гена для доставки гетерологической нуклеиновой кислоты (для обзора, см. Вескег е! а1., Ме!11. Се11 В1о1., 43:161 (1994), и ЭонДа^ и Сипе1, 8с1епсе & Мебкше, 4:44 (1997)). Преимущества аденовирусной системы включают приспособляемость относительно больших вставок ДНК, способность расти до высокого титра, способность инфицировать широкий диапазон типов клеток млекопитающих и гибкость, которая позволяет использование с большим количеством доступных векторов, содержащих различные промоторы.

Удалением участков генома аденовируса могут быть обеспечены большие вставки (до 7 Кб) гетерологической ДНК. Эти вставки могут быть включены в вирусную ДНК прямым сшиванием или гомологической рекомбинацией с со-трансфицированной плазмидой. Выбором является удаление существенного Е1 гена из вирусного вектора, которое приводит к неспособности копировать, если Е1 ген не предоставлен клеткой-хозяином. Человеческие клетки 293, инфицированные вектором аденовируса (АТСС №8.

- 27 015351

СВЬ-1573, 45504, 45505), например, могут быть выращены как прикрепленные клетки или в суспензионной культуре при относительно высокой плотности клеток, чтобы произвести значительное количество белка (см. Сат1ет е! а1., Су!о!есйпо1. 75:145 (1994)).

Полипептиды по изобретению могут также быть экспрессированы в других высших эукариотических клетках, таких как клетки птиц, грибов, насекомых, дрожжей или растений. Бакуловирусная система обеспечивает эффективное средство введения клонированных генов в клетки насекомого. Подходящие векторы экспрессии основаны на вирусе многократного ядерного полиэдроза Аи!одгарйа саНГогшса (АсМПРУ) и содержат известные промоторы, такие как промотор белок теплового шока Дрозофилы (йкр) 70, непосредственно-ранний генный промотор (1е1) и отсроченный ранний промотор 39 КБ вируса ядерного полиэдроза Аи!одгарйа саИГотшса, промотор бакуловируса р10 и промотор Эгокорйба те!а11о!йюпет. Второй метод создания рекомбинантного бакуловируса использует основанную на транспозоне систему, описанную Ьискоте (Ьискоте, е! а1., 1. У1го1. 67:4566 (1993)). Эта система, которая использует векторы передачи, продается в комплекте Вас-!о-Вас (ЫГе Тесйпокщек, ВоскуШе, ΜΌ). Эта система использует вектор передачи РЕА8ТВАС (ЫГе Тесйпок^ек), содержащий транспозон Тп7, чтобы переместить ДНК, кодирующую полипептид, в бакуловирусный геном, поддерживаемый в Е.сой как большая плазмида, названная бакмид; см. НШ-Реткшк апб Роккее, 1. Сеп. У1го1. 717:971 (1990), Вопшпд, е! а1., 1. Сеп. У1го1. 75:1551 (1994), апб Сйахепйа1к апб Варорой, 1. Вю1. Сйет. 270:1543 (1995). Кроме того, векторы передачи могут включать в рамке слияния ДНК, кодирующую эпитопную метку в С- или №конце экспрессированного полипептида, например эпитопую метку С1и-С1и (Сгиккептеуег е! а1., Ргос. №1'1 Асаб. 8ск, 82:7952 (1985)). Используя известную технику, вектор передачи, содержащий ген, кодирующий полипептид по настоящему изобретению, трансфомируется в Е.сой и подвергается скринингу на бакмиды, которые содержат прерванный ген 1ас2, указывающий на рекомбинантный бакуловирус. ДНК бакмида, содержащую геном рекомбинантного бакуловируса, затем изолируют, используя общие методы.

Иллюстративный вектор РЕА8ТВАС может быть изменен до значительной степени. Например, промотор полиэдрин может быть удален и заменен на промотор основного белка бакуловируса (также известный как промотор Рсог, р6.9 или МР), который экспрессировался ранее в бакуловирусной инфекции, и, как показано, был выгоден для экспрессии секретируемых белков (см., например, НШ-Реткшк апб Роккее, 1. Сеп. У1го1. 717:971 (1990), Воппзпд, е! а1., 1. Сеп. У1го1. 75:1551 (1994), апб Сйахепйа1к апб Варорой, 1. Вю1. Сйет. 270:1543 (1995). В таких конструктах вектора передачи может использоваться короткая или длинная версия основного белкового промотора. Кроме того, векторы передачи могут быть построены, которые заменяют нативные секреторные сигнальные последовательности на секреторные сигнальные последовательности, полученные из белков насекомого. Например, секреторная сигнальная последовательность из Есбук!его1б С1исоку1!гапкГегаке (ЕСТ), пчелиного Меййш (1пуйгодеп Сотротайоп; Саг1кЬаб, СА), или бакуловируса др67 (РйатМшдеп: 8ап П1едо, СА), может использоваться в конструкциях, чтобы заменить нативную секреторную сигнальную последовательность 1Б-17ВС.

Рекомбинантный вирус или бакмид применяют, чтобы трансфициовать клетки-хозяева. Подходящие клетки-хозяева насекомого включают клеточные линии, полученные из 1РЬВ-8Г-21, кукольной яичниковой линии клеток 8робор!ета Ггищрегба, такой как 8Г9 (АТСС СВЬ 1711), 8Г21АЕ и 8Г21 (1пуйтодеп Сотротайоп; 8ап П1едо, СА), так же как клетки Эгокорйба 8сйпе1бег-2 и клеточная линия Н1СН Е1УЕ0 (1пуйтодеп), происходящая из Тпсйор1ик1а πί (патент США № 5300435). Коммерчески доступные бессывороточные питательные среды могут использоваться, чтобы вырастить и поддержать клетки. Подходящими питательными средами являются 8Г900 II™ (ЫГе Тесйпо1ощек) или Е8Е 921™ (Ехртеккюп 8ук!етк) для клеток 8Г9; и Ех-се110405™ (1ВН Вюкаепсек, Ьепеха, К8) или Ехргекк Е1уе0™ (ЫГе Тесйпо1ощек) для Т. ш клеток. Когда применяют рекомбинантный вирус, клетки обычно вырастают от инокуляционной плотности приблизительно 2-5х10⁵ клеток до плотности 1-2х10⁶ клеток, за которое время рекомбинантная вирусная линия добавляется при множественности заражения (ти1йрйсйу оГ ^иГес!^оη, М01) от 0,1 до 10, более типично около 3.

Установленные методы для производства рекомбинантных белков в бакуловирусных системах предоставлены Вабеу е! а1., Машри1айоп оГ Васи1оу1гик Уес!огк, Миггау (еб.), р. 147-168 (Тйе Нитапа Ргекк, 1пс. 1991), Ра!е1 е! а1., Тйе Ьаси1оу1гик ехртеккюп кук!ет т ЭХА С1опйщ 2: Ехртеккюп 8ук!етк, 2-пб Еб1!юп, С1оуег е! а1. (ебк.), р. 205-244 (0хГогб ищуеткйу Ргекк, 1995), АикиЬе1 (1995) а! р. 16-37 !о 16-57, Вюйатбкоп (еб.), Васи1оу1гик Ехртеккюп Рго!осо1к (Тйе Нитапа Ргекк, 1пс. 1995), апб Ьу Ьискпоте, 1пкес! Се11 Ехртеккюп Тесйпо1оду ш Рто!ет Епдтеетшд: Ргтс1р1ек апб Ргасйсе, С1е1апб е! а1. (ебк.), р. 183-218 (бойп \Убеу & 8опк, 1пс. 1996).

Грибковые клетки, включая дрожжевые клетки, могут также использоваться, чтобы экспрессировать гены, описанные здесь. Виды дрожжей, особенно интересные в этом отношении, включают 8ассйатотусек сегеуЫае, РюЫа рак!опк и РюЫа те!йапойса. Подходящие промоторы для экспрессии в дрожжах включают промоторы из САБ1 (галактоза), РСК (фосфоглицераткиназа), АЭН (алкогольдегидрогеназа), АОХ1 (алкогольоксидаза), Н184 (гистидинолдегидрогеназа) и т.п. Много клонирующих векторов дрожжей разработаны и легко доступны. Эти векторы включают векторы, основанные на У1р, такие

- 28 015351 как ΥΙρ5, векторы ΥΚρ, такие как ΥΚρ17, векторы ΥΕρ, такие как ΥΕρ13 и векторы УСр, такие как УСр19. Методы для трансформации клеток 8. сегеу181ае с экзогенной ДНК и производства рекомбинантных полипептидов из них раскрыты, например, Кауакак1, патент США № 4599311, Кауакак1 е! а1., патент США № 4931373, Вгаке, патент США № 4870008, ^е1сб е! а1., патент США № 5037743 и Миггае е! а1., патент США № 4845075. Трансформированные клетки выбирают по фенотипу, определяемому селектируемым маркером, обычно устойчивостью лекарственного средства или способностью расти в отсутствие специфического питательного вещества (например, лейцина). Подходящей векторной системой для использования в 8ассйаготусек сегеу181ае является векторная система Ρ0Τ1, раскрытая Кауакак1 е! а1. (патент США № 4931373), который позволяет трансформированным клеткам быть отобранными выращиванием в содержащих глюкозу питательных средах. Дополнительные подходящие промоторы и терминаторы для использования в дрожжах включают промоторы из генов гликолитических ферментов (см., например, Кауакак1, патент США № 4599311, Ктдктап е! а1., патент США № 4615974, и В1йег, патент США № 4977092), и генов алкогольдегидрогеназы; см. также патенты США № 4990446, 5063154, 5139936 и 4661454.

Трансформационные системы для других дрожжей, включая Напкепи1а ρο1утο^ρйа, 8с1ихокасс11аготусек ροтЬе, К1иууеготусек 1асбк, К1иууеготусек ГгадШк, ИкШадо таубй, РюЫа ρηκΙοΓίκ, РюЫа теШапойса, РюЫа диШегтопби и Сапб1ба тайока, известны в технологии; см., например, С1еекоп е! а1., ί. Сеп. М1сгоЫо1., 732:3459 (1986), и Сгедд, патент США № 4882279. Клетки А^е^Ник могут быть использованы согласно методам МсКшдЫ е! а1., патент США № 4935349. Методы трансформации Асгетошит сйгукодепит раскрыты 8итто е! а1., патент США 5162228. Методы трансформации Nеи^οкρο^а раскрыты ЬатЬоуйх, патент США № 4486533.

Например, применение РюЫа теШапойса как организма-хозяина для продукции рекомбинантных белков раскрыто Иаутопб, патент США № 5716808, Иаутопб, патент США № 5736383, Иаутопб е! а1., Υеакΐ, 14:11-23 (1998), и в международных патентах XV0 97/17450, XV0 97/17451, XV0 98/02536 и ХУ0 98/02565. Молекулы ДНК для применения в трансформации Р. теШапойса будут обычно получаться как двухниточные, кольцевые плазмиды, которые предпочтительно линеаризуются перед трансформацией. Для продукции полипептида в Р. теШапойса, промотор и терминатор в плазмиде может быть из гена Р. теШапойса, такого как ген использования спирта Р. теШапойса (АИС1 или АИС2). Другие полезные промоторы включают промоторы генов дигидроксиацетонсинтазы (ДГАС), форматдегидрогеназы (ФМД) и каталазы (КАТ). Чтобы облегчить интеграцию ДНК в хромосому хозяина, предпочитают иметь весь сегмент экспрессии плазмиды, к которой примыкают с обоих концов последовательности ДНК хозяина. Подходящим селектируемым маркером для использования в РюЫа теЛапойса является ген Р. теШапойса АОЕ2, который кодирует фосфорибозил-5-аминоимидазолкарбоксилазу (АЖС; ЕС 4.1.1.21) и который позволяет клеткам-хозяевам абе2 расти в отсутствие аденина. Для крупномасштабных производственных процессов, когда желательно минимизировать использование метанола, могут применяться клетки-хозяева, в которых удалены оба гена использования метанола (АИС1 и АИС2). Для продукции секретируемых белков клетки-хозяева могут быть дефицитными в генах вакуолярной протеазы (РЕР4 и РРВ1). Электропорация используется, чтобы облегчить введение плазмиды, содержащей ДНК, кодирующей полипептид интереса в клетках Р. теЛапойса. Клетки Р. те!бапобса могут быть трансформированы электропорацией, используя экспоненциально затухающее, пульсирующее электрическое поле, имеющее напряженность поля от 2,5 до 4,5 кВ/см, предпочтительно приблизительно 3,75 кВ/см, и временную константу (!) от 1 до 40 мс (миллисекунд), наиболее предпочтительно приблизительно 20 мс.

Векторы экспрессии могут также быть введены в протопласты растений, интактные ткани растений или изолированные растительные клетки. Методы введения векторов экспрессии в ткань растения включают прямую инфекцию или со-культивирование ткани растения с АдгоЬас1егшт ШтеГаЫепк, микроснаряд-опосредуемую доставку, инъекцию ДНК, электропорацию и т.п.; см., например, Ногксй е! а1., 8с1епсе, 227:1229 (1985), К1ет е! а1., Вю1есйпо1оду, 10:268 (1992), и М1к1 е! а1., Ргосебигек £ог тйобистд Роге1дп ЭИА Й1!о Рго!ей1к т Мебюбк т Р1ап! Мо1еси1аг Вю1оду апб Вю!ес1то1оду С1юк е! а1. (ебк.), ρ. 67-88 (СРС Ргекк, 1993).

Альтернативно, гены, кодирующие полипептиды по настоящему изобретению, могут быть экспрессированы в прокариотических клетках-хозяевах. Подходящие промоторы, которые могут использоваться, чтобы экспрессировать полипептиды ГЬ-17КС в прокариотическом организме, известны специалистам в технологии и включают промоторы, способные узнавать полимеразы Т4, Т3, 8ρ6 и Т7, промоторы Р_Р и Р|. лямбда бактериофага, промоторы йр, гесА, шока высокой температуры, 1асИУ5, !ас, Ιρρ-^8ρτ, ρΙκΑ и 1ас2 Е.со11, промоторы В. киЬбйк, промоторы бактериофагов ВасШик, промоторы 8ΐ^еρΐοтусек, ΐπΐ промотор лямбда бактериофага, Ь1а промотор ρВΚ322 и промотор САТ гена хлорамфениколацетилтрансферазы. Прокариотические промоторы были рассмотрены С1юк, ί. Нзб. МюгоЬюк, 7:277 (1987), ^а!коп е! а1., Мо1еси1аг Вю1оду о£ Ле Сепе, 4'¹' Еб. (Вещатеп Ситттк, 1987), и АикиЬе1 е! а1. (1995).

Подходящие прокариотические организмы включают Е.соН и ВасШик киЬШик. Подходящие штаммы Е.сой включают ВЬ21(ПЕ3), В^21(^Ε3)ρ^ук8, В^21(^Ε3)ρ^укΕ, ΌΗ1, ΌΗ4Ι, ΌΗ5, ΌΗ5Ι, ϋΗ5ΙΤ, ПН5ГМСК, БН10В, ΌΗ^^, ΌΗ118, С600, №101, 1М101, 1М105, 1М109, 1М110, К38, ИИ1, Υ1088, Υ1089, С8Н18, ЕР1451 и ЕР1647 (см., например, Вгоуп (еб.), Мо1еси1аг Вю1оду ЬаЫах (Асабетю Ргекк,

- 29 015351

1991)). Подходящие штаммы ВасШик киЬб1ик включают ВК151, ΥΒ886, М1119, ΜΙ120 и В170 (см., например, Нагйу, ВасШик С1ошпд Ме!бойк ш ΌΝΑ С1ошпд: А Ргасбса1 Арргоасб, С1о\^гег (ей.) (ШЬ Ргекк, 1985)).

При экспрессии полипептида по настоящему изобретению в бактериях, таких как Е.соб, полипептид может сохраняться в цитоплазме, обычно как нерастворимые гранулы, или может направляться в периплазматическое пространство бактериальной последовательностью секреции. В первом случае клетки разлагают и гранулы выделяют и денатурируют, применяя, например, гуанидинизоцианат или мочевину.

Денатурированный полипептид может затем быть повторно свернут и димеризован разбавлением денатурирующего средства, таким как диализ относительно раствора мочевины и комбинации восстановленного и окисленного глютатиона, за которым следует диализ относительно буферного физиологического раствора. В последнем случае полипептид может быть выделен из периплазматического пространства в растворимой и функциональной форме разрушением клеток (например, ультразвуком или осмотическим ударом), чтобы выпустить содержимое периплазматического пространства и выделить белок, таким образом, устраняя потребность в денатурации и повторном сворачивании.

Методы экспрессии белков в прокариотических организмах известны специалистам в технологии (см., например, Аббатк е! а1., Ехргеккюп оГ Гоге1дп рго!етк ш Е.соб икшд р1акт1й νесΐο^к апб ршШсабоп оГ кресШс ро1ус1опа1 апбЬой1ек ш ΌΝΑ С1ошпд 2: Ехргеккюп 8ук1етк, 2'¹ ЕйШоп, С1о\^гег е! а1. (ейк.), р. 15 (ОхГогй Ипшегкйу Ргекк, 1995), Аагй е! а1., Сепебс Матри1абоп апй Ехргеккюп оГ АпбЬоШек ш Мопос1опа1 АпбЬой1ек: Рппс1р1ек апй Аррбсабопк, р. 137 (Абеу-Ыкк, 1пс. 1995), апй Сеогдюи, Ехргеккюп оГ Рго!етк ш ВасЮпа ш Рго!ет Епдшееппд: Рппар1ек апй Ргасбсе, С1е1апй е! а1. (ейк.), р. 101 (йобп Абеу & 8опк, 1пс. 1996)).

Стандартные методы для введения векторов экспрессии в клетки бактерий, дрожжей, насекомых и растений предоставлены, например, АикиЬе1 (1995).

Общие методы экспрессии и выделения чужеродного белка, произведенного клеточной системой млекопитающего, предоставлены, например, в Εΐсбеνе^^у, Ехргеккюп оГ Епдтеегей Рго!еб1 ш Маттабап Се11 Сибиге ш Рго!ет Епдшееппд: Рппс1р1ек апй Ргасбсе, С1е1апй е! а1. (ейк.), р. 163 (Абеу-Ыкк, 1пс. 1996). Стандартные методы для выделения белка, произведенного бактериальной системой, предоставлены, например, в Спккбаттег е! а1., РшШсабоп оГ ονе^-р^οйисей рго!етк Ггот Е.соб се11к ш ΌΝΑ С1оптд 2: Ехргеккюп 8ук1етк, 2¹¹'¹ ЕйШоп, С1о\^гег е! а1. (ейк.), р. 59-92 (ОхГогй Ипшегкйу Ргекк, 1995). Установленные методы для выделения рекомбинантных белков из бакуловирусной системы описаны Кгсбагйкоп (ей.), Васи1о\згик Ехргеккюп Рго!осо1к (Тбе Нитапа Ргекк, 1пс. 1995).

Как альтернатива, полипептиды по настоящему изобретению могут синтезироваться исключительным твердофазным синтезом, частичными твердофазными методами, конденсацией фрагментов или классическим синтезом в растворе. Эти методы синтеза известны специалистам в технологии (см., например, МепШе1й, I Сбет. 8ос. 85:2149 (1963), 8!е\уаг! е! а1., 8обй Рбаке Рербйе 8уп!бек1к (2^пй ЕйШоп) (Р1егсе Сбетюа1 Со. 1984), Вауег и Карр, Сбет. Рер!. Рго!, 3:3 (1986), А!бег!оп е! а1., 8обй Рбаке Рер!1йе 8уп!бебк: А Ргас!1са1 Арргоасб (ΙΒ6 Ргекк, 1989), Е1е1йк и Со1оЩск, 8обй Рбаке Рербйе 8уп!бек1к Ме!бойк ш Епхуто1оду Уо1ите 289 (Асайетю Ргекк, 1997), и Ь1оуй-Аббатк е! а1., Сбетюа1 Арргоасбек !о !бе 8уп!бек1к оГ Рер!1йек апй Рго!етк (СКС Ргекк, 1пс. 1997)). Изменения в полных химических стратегиях синтеза, таких как нативная химическая сшивка и сшивка экспрессированных белков, являются также стандартными (см., например, Эа^коп е! а1., 8аепсе, 266:776 (1994), Наскепд е! а1., Ргос. №61 Асай. 8ск И8А, 94:7845 (1997), Оатекоп, Ме!бойк Еп/уток 287: 34 (1997), Мшг е! а1., Ргос. №61 Асай. 8ск И8А, 95:6705 (1998), и 8е\еппо\ и Мшг, б Вю1. Сбет. 273:16205 (1998)).

Пептиды и полипептиды по настоящему изобретению включают по меньшей мере 6, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 15 смежных аминокислотных остатков последовательностей 8Еф ΙΌ ΝΟ:2, 5 или 21. Как иллюстрация, полипептиды могут включать по меньшей мере 6, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 15 смежных аминокислотных остатков последовательностей 8Еф ΙΌ ΝΟ:2, 5 и (или) 21. В пределах определенных вариантов изобретения полипептиды включают 20, 30, 40, 50, 100 или больше смежных остатков этих аминокислотных последовательностей. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такие пептиды и полипептиды, полезны в качестве праймеров и зондов полимеразной цепной реакции.

Кроме того, полипептиды и их фрагменты по настоящему изобретению могут быть экспрессированы как мономеры, гомодимеры, гетеродимеры или мультимеры в пределах высших эукариотических клеток. Такие клетки могут использоваться, чтобы производить мономерные, гомодимерные, гетеродимерные и мультимерные рецепторные полипептиды Г6-17К.С, которые включают, по меньшей мере, участок полипептида ГЬ-17КС (рецепторы, включающие Ι6-17Βί.' или рецепторные полипептиды, включающие ГЬ-17КС), участок Ι6-17Βί.' и Ι6-17ΒΑ вместе (в качестве мономера, гомодимера или гетеродимера) или могут использоваться как клетки пробы в системах скрининга. В пределах одного аспекта настоящего изобретения полипептид по настоящему изобретению, включающий, по меньшей мере, лигандсвязывающий участок внеклеточного домена либо ΙΠ-17ΗΟ, либо Ι6-17ΒΑ, производят культивируемой клеткой, и клетку используют, чтобы произвести скрининг лигандов для рецептора, включая естествен

- 30 015351 ный лиганд, 1Ь-17Р, так же как 1Ь-17А, или даже агонисты и антагонисты естественного лиганда. Чтобы суммировать этот подход, кДНК или ген, кодирующий рецептор, соединяют с другими генетическими элементами, требуемыми для его экспрессии (например, промотором транскрипции), и результатный вектор экспрессии вставляют в клетку-хозяина. Клетки, которые экспрессируют ДНК и производят функциональный рецептор, отбирают и используют в пределах многих систем скрининга. Каждый компонент мономерного, гомодимерного, гетеродимерного и мультимерного рецепторного комплекса может экспрессироваться в той же самой клетке. Кроме того, компоненты мономерного, гомодимерного, гетеродимерного и мультимерного рецепторного комплекса могут также быть слиты с трансмембранным доменом или другим мембранным фрагментом слияния, чтобы получить сложный ансамбль комплекса и скрининг трансфектанта, как описано выше.

Чтобы анализировать полипептиды по настоящему изобретению, клетки млекопитающих, подходящие для использования в экспрессии рецепторов 16-17КС и 1Ь-17КС/1Ь-17КА. или других известных рецепторов, чтобы связать 1Ь-17А или 1Ь-17Р (например, клетки, экспрессирующие Ι6-17Κ), и преобразовывающие опосредуемый рецептором сигнал, включают клетки, которые экспрессируют другие субъединицы рецептора, которые могут образовать функциональный комплекс с 16-17КС. Также предпочтительно использовать клетку из того же самого вида, что и рецептор, подлежащий экспрессии. В рамках предпочтительнного варианта клетка зависит от внешне поставляемого гематопоэтического фактора роста для ее пролиферации. Предпочтительными клеточными линиями этого типа являются линия клеток человека ТР-1 (АТСС номер СКЬ-2003) и линия клеток АМЬ-193 (АТСС номер СКб-9589), которая является зависимой от ГМ-КСФ человеческой линии клеток лейкемии, и ВаРЗ (Ра1асюк и 81сштс1х. Се11, 41:121-12,4 (1985)), которая является зависимой от 1Ь-3 мышиной клеточной линией рге-В. Другие линии клеток включают клетки ПДХ, СО8-1 и СНО. Подходящие клетки-хозяева могут быть спроектированы, чтобы производить необходимые рецепторные субъединицы или другой клеточный компонент, необходимый для желательной клеточной реакции. Этот подход выгоден, потому что линии клеток могут быть спроектированы, чтобы экспрессировать рецепторные субъединицы из любых видов, таким образом, преодолевая потенциальные ограничения, являющиеся результатом специфичности видов. Виды ортологов человеческого рецептора кДНК могут быть клонированы и использованы в пределах линий клеток из тех же самых видов, таких как кДНК мыши в линии клеток ВаРЗ. Линии клеток, которые зависят от одного гематопоэтического фактора роста, такого как ГМ-КСФ или 1Ь-3, могут таким образом быть спроектированы, чтобы стать зависящими от другого цитокина, который действует через рецепторы 16-17КС или 1Ь-17КА, такие как 1Ь-17Р или 1Ь-17А.

Клетки, экспрессирующие функциональный рецептор, применяют в скрининг-анализах. Много подходящих анализов известно в технологии. Эти анализы основаны на обнаружении биологической реакции в клетке-мишени. Один такой анализ представляет собой анализ пролиферации клеток. Клетки культивируют в присутствии или в отсутствие испытываемого соединения, и пролиферацию клеток обнаруживают, например, измерением включения тритированного тимидина или колориметрическим анализом, основанным на метаболическом распаде 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ) (Моктап, 1. 1ттипо1. Ме!й., 65: 55-63 (1983)). Альтернативный формат анализа применяет клетки, которые далее спроектированы, чтобы экспрессировать ген-репортер. Ген-репортер связывают с промоторным элементом, который чувствителен к пути, связанному с рецептором, и анализ обнаруживает активацию транскрипции гена-репортера. Предпочтительным промоторным элементом в этом отношении является элемент реакции сыворотки, или ЭРС; см., например, 8йает е! а1., Се11, 56:563-572 (1989). Предпочтительным таким геном-репортером является ген люциферазы (бе \¥е1 е! а1., Мо1. Се11. В1о1. 7:725 (1987)). Экспрессию гена люциферазы обнаруживают люминесценцией, используя методы, известные в технологии (например, Ваитдабпет е! а1., 1. Вю1. СНет., 269:29094-29101 (1994); 8с11епЬогп и СобТЕт Рготеда Ыо!е8, 41.11, 1993). Комплекты анализа активности люциферазы коммерчески доступны от, например, Рготеда Согр., Мабщоп, ^1. Линии клеток-мишеней этого типа могут использоваться, чтобы произвести скрининг библиотек химических веществ, кондиционированных клетками культуральных сред, грибковых бульонов, образцов почвы, водных образцов и т. п. Например, банк образцов кондиционированных клетками сред может анализироваться на клетки-мишени, чтобы идентифицировать клетки, которые производят лиганд. Положительные клетки затем применяют, чтобы произвести библиотеку кДНК в векторе экспрессии млекопитающих, который разделяется на пулы, трансфицированные в клетки-хозяева, и экспрессируется. Образцы питательных сред из трансфицированных клеток затем анализируются, с последующим разделением пулов, повторной трансфекцией, субкультивированием и повторным анализом положительных клеток, чтобы выделить клонированную кДНК, кодирующую лиганд.

Дополнительный скрининговый подход, предоставленный в соответствии с настоящим изобретением, включает использование гибридных рецепторных полипептидов. Эти гибридные полипептиды попадают в два общих класса. В пределах первого класса внутриклеточный домен 16-17КС соединяется с лигандсвязывющим доменом второго рецептора. Второй класс гибридных рецепторных полипептидов включает внеклеточный (лигандсвязывающий) домен 16-17КС (последовательность 8Еф ΙΌ N0:3) и 1Ь17КА (последовательностей 8Еф ΙΌ ΝΟ:Χ) с внутриклеточным доменом второго рецептора, предпочтительно гематопоэтического рецептора цитокина, и трансмембранный домен. Такие гибридные мономеры,

- 31 015351 гомодимеры, гетеродимеры и мультимеры рецепторов по настоящему изобретению этого второго класса экспрессируются в известных клетках, чтобы быть способными отвечать на сигналы, трансдуцированные вторым рецептором. Вместе, эти два класса гибридных рецепторов дают возможность идентифицировать чувствительный тип клетки для развития анализа для обнаружения 1Ь-17Р или 1Ь-17А. Кроме того, такие клетки могут использоваться в присутствии 1Ь-17Р или 1Ь-17А, чтобы анализировать растворимые антагонисты рецепторов по настоящему изобретению в анализе конкурентного типа. В таком анализе уменьшение пролиферации или активности трансдукции сигнала 1Ь-17Р или 1Ь-17А в присутствии растворимого рецептора по настоящему изобретению демонстрирует антагонистическую активность. Кроме того, анализы связывания растворимого рецептора 1Ь-17КС, анализы на основе клетки, могут также использоваться, чтобы оценить, связывает, блокирует, ингибирует, уменьшает, противодействует или нейтрализует ли растворимый рецептор активность 1Ь-17Р или 1Ь-17А.

Р) Продукция слитых белков и конъюгатов 1Ь-17КС. 1Ь-17КА и 1Ь-17КС/1Ь-17КА.

Один общий класс аналогов 1Ь-17КС, 1Ь-17КА и 1Ь-17КС/1Ь-17КА представляют собой варианты, имеющие аминокислотную последовательность, которая является мутацией аминокислотной последовательностью, раскрытой здесь. Другой общий класс аналогов 1Ь-17КС, 1Ь-17КА и 1Ь-17КС/1Ь-17КА предоставлен антиидиотипическими антителами и их фрагментами, как описано ниже. Кроме того, рекомбинантные антитела, включающие домены переменного антиидиотипа, могут применяться как аналоги (см., например, МопГагбш1 е! а1., Ргос. Аккос. Ат. РНук1с1апк, 108:420 (1996)). Так как переменные домены антиидиотипических антител 1Ь-17КС подражают 1Ь-17КС, эти области могут обеспечивать связывающую активность 1Ь-17КС. Методы производства антиидиотипических каталитических антител известны специалистам в технологии (см., например, 1огоп е! а1., Апп. N. Υ. Асаб. 8сЕ, 672:216 (1992), РпЬои1е! е! а1., Арр1. ВюсНет. Вю!есЬпо1. 47:229 (1994), и Ауа11е е! а1. Апп. N. Υ. Асаб. 8сЕ, 864:118 (1998)).

Другой подход к идентификации аналогов 1Ь-17КС, 1Ь-17КА и 1Ь-17КС/1Ь-17КА обеспечивается применением комбинаторных библиотек. Методы строительства и скрининга фага показаны и другие комбинаторные библиотеки предоставлены, например, Кау е! а1., РНаде О1кр1ау оГ Рерйбек апб Рго!етк (Асабетю Ргекк, 1996), Уегбте, υδ Ра!еп! №. 5783384, Кау е! а1., υδ Ра!еп! №. 5747334, апб КаиГГтап е! а1., И8 Ра!еп!№. 5723323.

Полипептиды 1Ь-17КС, 1Ь-17КА и 1Ь-17КС/1Ь-17КА имеют применение как ш у1уо, так и ш уйго. В качестве иллюстрации растворимая форма 1Ь-17КС может быть добавлена к культуральной клеточной среде, чтобы ингибировать эффекты лиганда 1Ь-17КС (т.е. 1Ь-17Р, 1Ь-17А или обоих), произведенных культивируемыми клетками.

Слитые белки 1Ь-17КС, 1Ь-17КА и 1Ь-17КС/1Ь-17КА могут использоваться, чтобы экспрессировать и выделить соответствующий полипептид. Как описано ниже, определенные белки слияния 1Ь-17КС, 1Ь17КА и 1Ь-17КС/1Ь-17КА также имеют применение в диагнозе и терапии. Один тип белка слияния включает пептид, который направляет полипептид 1Ь-17КС из рекомбинантной клетки-хозяина. Чтобы направить полипептид 1Ь-17КС в секреторный путь эукариотической клетки-хозяина, секреторная сигнальная последовательность (также известная как сигнальный пептид, лидерная последовательность, препропоследовательность или рге последовательность) предоставляется в векторе экспрессии 1Ь-17КС. В то время как секреторная сигнальная последовательность может быть получена из 1Ь-17КС, подходящая сигнальная последовательность может также быть получена из другого выделяемого белка или синтезироваться бе поуо. Секреторная сигнальная последовательность реально связывается с последовательностью, кодирующей 1Ь-17КС, так что две последовательности соединяются в правильной рамке считывания и позиционируются, чтобы направить вновь синтезированный полипептид в секреторный путь клетки-хозяина. Секреторные сигнальные последовательности обычно помещаются в положение 5' нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид интереса, хотя определенные секреторные сигнальные последовательности могут быть помещены в другом месте в нуклеотидной последовательности интереса (см., например, \Уе1с11 е! а1., патент США № 5037743; Но11апб е! а1., патент США № 5143830).

Хотя секреторная сигнальная последовательность 1Ь-17КС, 1Ь-17КА и 1Ь-17КС/1Ь-17КА, произведенная клетками млекопитающих (например, сигнальная последовательность активатора плазмогена тканевого типа, как описано, например, в патент США № 5641655), полезна для экспрессии соответствующего полипептида в рекомбинантных организмах млекопитающих, сигнальная последовательность дрожжей предпочтительна для экспрессии в дрожжевых клетках. Примерами подходящих сигнальных последовательностей дрожжей являются последовательности, полученные из дрожжей, сочетающих αфактор феромона (кодированный геном МРа1), инвертазу (кодированную геном 8ИС2) или кислотную фосфатазу (кодированную геном РН05); см., например, Котапок е! а1., Ехргеккюп оГ С1опеб Сепек ш Υеак! ш ЭХА С1ошпд 2: А Ргасйса1 Арргоасй, 2^пб Ебйюп, С1оуег апб Натек (ебк.), р. 123-167 (0хГогб Ишуегкйу Ргекк, 1995).

Растворимые рецепторные полипептиды по настоящему изобретению могут быть получены экспрессией урезанной ДНК, кодирующей внеклеточный домен, например полипептид, который содержит всю или участок последовательности δΕΟ 1Ό N0:3 или соответствующую область нечеловеческого рецептора. Предпочтительно, чтобы полипептиды внеклеточного домена получать в форме, существенно свободной от трансмембранных и внутриклеточных полипептидных сегментов. Чтобы направить экспорт

- 32 015351 рецепторного домена из клетки-хозяина, рецепторную ДНК связывают со вторым сегментом ДНК, кодирующим секреторный пептид, такой как пептид 1-РА. Чтобы облегчить очистку секреторного рецепторного домена, С-концевой удлинитель, такой как метка полигистидина, вещество Р, пептид Р1ад™ (Норр е! а1., Β^ο!есйηοίοду, 6:1204-1210 (1988); доступный от Еак!тап Кцбак Сб. №\ν Науеп, СТ), или другой полипептид или белок, для которого доступно антитело или другое специфическое связывающее средство, может быть слит с полипептидным рецептором.

В альтернативном подходе рецепторный внеклеточный домен или его участок 1Ь-17КС, 1Ь-17КА или 1Ь-17КС/1Ь-17КА вместе может быть экспрессирован как слияние с константными областями тяжелой цепи иммуноглобулина, обычно фрагментом Рс, который содержит два домена константной области и область стержня, но испытывает недостаток в переменной области (см., 81еб/1е\\ък| е! а1., патенты США № 6018026 и 5750375). Растворимые полипептиды по настоящему изобретению включают такие слияния. Одно такое слияние показано в последовательности 8ЕО ΙΌ N0:64. Такие слияния обычно секретируются как мультимерные молекулы, в которых участки Рс связаны дисульфидным связями друг с другом и два рецепторных полипептида выстраиваются в тесной близости друг к другу. Слияния этого типа могут использоваться, чтобы очищать близкий лиганд от раствора, в качестве ш νίίτο аналитического инструмента, чтобы блокировать, ингибировать или уменьшить сигналы ш νίίτο, специфически титруя лиганд, и в качестве антагонистов ш νίνο, применяя их парентерально, чтобы связать циркулирующий лиганд и очистить его от кровообращения. Чтобы очистить лиганд, 1Ь-17КС, Ш-17КА и химеру 1Ь17КС/1Ь-17КА-1д добавляют к образцу, содержащему лиганд (например, кондиционированные клеткой культуральные среды или экстракты ткани), в условиях, которые облегчают связывание лиганд-рецептор (обычно почти физиологическая температура, рН и ионная сила). Комплекс лиганд-химера затем отделяют смесью, используя белок А, который иммобилизируют на твердой подложке (например, нерастворимые гранулы смолы). Лиганд затем элюируют, используя обычные химические методы, такие как солевой или рН градиенты. Как альтернатива, сама химера может быть связана с твердой подложкой, причем связывание и элюирование выполняют, как выше. Химеры могут использоваться ш νίνο, чтобы регулировать воспалительные реакции, включая острые фазовые реакции, такие как амилоидный белок А сыворотки (8АА), С-реактивный белок (СКР) и т.п. Химеры с высоким сродством связывания применяются парентерально (например, внутримышечной, подкожной или внутривенной инъекцией). Циркулирующие молекулы связывают лигандом и очищают от кровообращения нормальными физиологическими процессами. Для использования в анализах химеры связывают с подложкой через область Рс и используют в формате ЕЫ8А.

Чтобы помочь в изоляции полипептидов по настоящему изобретению, может преимущественно использоваться система анализа, которая использует лигандсвязывающий рецептор (или антитело, один член пары комплемент/антикомплемент) или его фрагмент, и коммерчески доступный биосенсорный инструмент (Β^^ιό, РНагтааа Β^ο8еη8ο^. Рщса!атау, N1). Такой рецептор, антитело, член пары комплемент/антикомплемент или фрагмент иммобилизируют на поверхности рецепторного чипа. Использование этого инструмента раскрыто КаШю!·!, ί. ^тишк Ме^бк, 145:229-40, 1991 и Сипшпдйат и Vеίк, 1. Μοί. Βίο1., 234:554-63, 1993. Рецептор, антитело, член или фрагмент ковалентно соединяют, используя амино или сульфгидрильные группы, с волокнами декстрана, которые прикрепляют к золотой пленке в пределах проточной ячейки. Испытываемый образец пропускают через ячейку. Если лиганд, эпитоп или противоположный член пары комплемент/антикомплемент присутствуют в образце, то он будет связываться с иммобилизированным рецептором, антителом или членом, соответственно вызывая изменение в показателе преломления среды, которое обнаруживается как изменение в поверхностном плазмонном резонансе золотой пленки. Эта система позволяет определение при или вне нормы, из которых может быть вычислено сродство связывания и оценена стехиометрия связывания. Альтернативно, связывание лиганд/рецептор может быть проанализировано, используя 8ЕЬО1 (ТМ) технологию (Шрйетдеп, 1пс., РаЦ Λ1ίο, СА).

Лигандсвязывающие рецепторные полипептиды могут также использоваться в пределах других систем анализа, известных в технике. Такие системы включают анализ Скэтчарда (8са!сйатб) для определения сродства связывания (см. 8са!сйатб, Апп. NΥ Асаб. 8ск, 51: 660-72, 1949) и калориметрический анализ (Сипшпдйат е! а1., 8с1епсе, 253:545-48, 1991; Сипшпдйат е! а1., 8с1епсе, 245:821-25, 1991).

Настоящее изобретение далее обеспечивает много других слитых полипептидов и близких мультимерных белков, включающих один или больше слитых полипептидов. Например, растворимый рецепторный полипептид Ш-17КС, Ш-17КА или 1Ь-17КС/1Ь-17КА может быть получен как слитый конструкт с димеризирующимся белком, как раскрыто в патентах США № 5155027 и 5567584. Предпочтительные димеризирующиеся белки в этом отношении включают домены константной области иммуноглобулина, например 1дСу1 и человеческая легкая цепь к. Растворимые в иммуноглобулине слитые конструкты по настоящему изобретению могут быть экспрессированы в генно-инженерных клетках, чтобы произвести много мультимерных рецепторных аналогов Ш-17КС, Ш-17КА или 1Ь-17КС/1Ь-17КА. Вспомогательные домены могут быть слиты с растворимыми полипептидами по настоящему изобретению, чтобы нацелить их на определенные клетки, ткани или макромолекулы (например, коллаген или клетки, экспрессируюицие Ш-17Р или Ш-17А). Полипептиды по настоящему изобретению могут быть слиты с двумя или боль

- 33 015351 ше фрагментами, такими как метка сродства для очистки и домен нацеливания. Слитые полипептиды могут также включить один или больше сайтов расщепления, особенно между доменов. См., Тиап е! а1., Соппесйуе Т1ккие Векеагск, 34:1-9, 1996.

В бактериальных клетках часто желательно экспрессировать гетерологический белок как слитый белок, чтобы уменьшить токсичность, увеличить стабильность и увеличить регенерацию экспрессированного белка. Например, ГЬ-17ВС (или любой полипептид по настоящему изобретению) может быть экспрессирован как слитый белок, включающий полипептид глютатион 8-трансферазу. Глютатион 8трансферазные слитые белки обычно растворимы и легко очищаемы от продуктов лизиса Е.сой на колонках иммобилизированного глютатиона. В подобных подходах слитый белок ГЕ-17ВС, включающий мальтозасвязывающий полипептидный белок, может быть изолирован на колонке амилозной смолы, в то время как слитый белок, включающий С-конец гена урезанного белка А, может быть очищен, используя ^О-Сефарозу ([дС-8ер11аго5е). Установленные методы экспрессии гетерологического полипептида как слитого белка в бактериальной клетке описаны, например, АПйатк е! а1., Ехргеккюп оГ Гогещп рго!ешк т Е.сой иктд р1акт1б уес!огк апб рипДсайоп оГ кресШс ро1ус1опа1 апйЬоб1ек т ΌΝΑ С1ошпд 2: А Ргасйса1 Арргоаск, 2^пб Ебйюп, О1оуег апб Натек (ебк.), р. 15-58 (ОхГогб Итуегкйу Ргекк, 1995). Кроме того, доступны коммерческие системы экспрессии. Например, система очистки белков РЮТОЮТ Ха (Рготеда Согрогайоп; Маб1коп, ΑΙ) обеспечивает метод выделения слитого белка, включающего полипептид, который становится биотинилированным во время экспрессии со смолой, которая включает авидин.

Пептидные метки, которые полезны для выделения гетерологических полипептидов, экспрессированных прокариотическими или эукариотическими клетками, включают метки полигистидина (которые обнаруживают сродство к никель-хелатирующей смоле), метки с-тус, кальмомодулинсвязывающий белок (выделенный кальмомодулин-афинной хроматографией), вещество Р, метка ВУГВ8 (которая связывается с антителами анти-ВУЖБ), метка С1и-С1и и метка ЕЬАО (которая связывается с антителами антиЕЬАО); см., например, Ьио е! а1., Агск. Вюскет. Вюркук. 329:215 (1996), Могдапй е! а1., Вю!ескпо1.Арр1. Вюскет., 23.67 (1996), и 2кепд е! а1., Сепе, 186:55 (1997). Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие такие пептидные метки, доступны, например, от 81дта-А1бпск Согрога!юп (8!. Ьошк, МО).

Другая форма слитого белка включает полипептид по настоящему изобретению и константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, обычно фрагмент Ес, который содержит два или три домена константной области и область стержня, но испытывают недостаток в переменной области. В качестве иллюстрации, Скапд е! а1., патент США № 5723125 описывает слитый белок, включающий человеческий интерферон и фрагмент Ес человеческого иммуноглобулина. С-конец интерферона связывается с Νконцом фрагмента Ес пептидным линкером. Пример пептидного линкера представляет собой пептид, включающий прежде всего инертную последовательность Т-клетки, которая иммунологически инертна. Типичный пептидный линкер имеет аминокислотную последовательность СС8СС 8СССС 8СССС 8 (последовательность 8Е0 ΙΌ NО:9). В этом слитом белке иллюстративный фрагмент Ес представляет собой человеческую цепь у4, которая устойчива в растворе и имеет небольшую или не имеет никакой комплементактивирующей активности. Соответственно настоящее изобретение рассматривает ГЕ-17ВС или слитой белок Ж-ПВСЛЬ-ПВА, который включает ΙΕ-ПВС или фрагмент ΙΕ-ПВС и Ш-ИВА и человеческий фрагмент Ес, в котором С-конец остатка ГЕ-17ВС присоединен к Ν-концу фрагмента Ес через пептидный линкер, такой как пептид, включающий, по меньшей мере, участок аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ NО:2, 5 или 21. Как фрагмент ΙΗ-17ВС, так и ΙΗ-17ВЛ могут быть внеклеточным доменом или любым их фрагментом. Например, слитый белок может включать аминокислотную последовательность 8Е0 Ш NО:3 и фрагмент Ес (например, человеческий фрагмент Ес) (последовательность 8Е0 ΙΌ NО:64). Другим примером такого слитого белка является вариант 1454 (последовательности 8Е0 ΙΌ NО:157 и 158), который включает экзоны 1-6 человеческого I^-17ΒА и 8-16 человеческого Ж-ИВСх^ слитые с Ес5 (последовательности 8Е0 Ш NО:179 и 180). Вариант 1454 также имеет нативный сигнальный пептид из человеческого ГЬ-17ВЛ. Ес10, или любой эквивалент, известный в технологии, может также применяться вместо Ес5.

В другом варианте слитый белок по настоящему изобретению включает последовательность Ι§0, компонент ГЬ-17ВС, ГЬ-ИВА или ГЕ-ИВС/ГЕ-иВА, ковалентно соединенный с аминным концом последовательности Ι§0, и сигнальный пептид, который ковалентно соединен с аминным концом компонента Ш-иВС или ^-^ВЛ, в котором последовательность Ι§0 состоит из следующих элементов в следующем порядке: область стержня, домен СН₂ и домен СН₃. Соответственно последовательность Ι§0 не имеет домен СН1. Эти компоненты должны показать биологическую активность, как описано здесь, такую как способность связываться с ΙΕ-17Α и (или) ΙΗ-17Е. Этот общий подход к производству слитых белков, которые включают участки антитело и неантитело, был описан ЬаВоскейе е! а1., ЕР 742830 (АО 95/21258).

Слитые белки, включающие компоненты Ш-ИВС или I^-17ΒС/I^-17ΒΑ и фрагмент Ес, могут использоваться, например, как инструмент анализа ш уйго. Например, наличие ΙΕ-Е в биологическом образце может быть обнаружено, используя слитый белок I^-17ΒС-иммуноглобулин, в котором компонент £Е-17ВС используется, чтобы связать лиганд, а макромолекула, такая как белок А или анти-Ес антитело, используется, чтобы связать слитый белок с твердой подложкой. Такие системы могут использоваться,

- 34 015351 чтобы идентифицировать агонисты и антагонисты, которые влияют на связывание лигандов семейства ^-17, например ГО-ПЕ или как ГО-ПА, так и ГО-17Е, с рецептором.

Настоящее изобретение далее обеспечивает много других слитых полипептидов. Например, часть или весь домен, придающий желательную биологическую функцию (например, связывание ГО-17А), может быть добавлен к участку ГО-17КС с функционально эквивалентным доменом от другого члена семейства цитокиновых рецепторов (т.е. ГО-17КА), чтобы создать отличающуюся молекулу (т.е. ГО17КС/ГО-17КА). Слитые полипептиды могут экспрессироваться в рекомбинантных клетках-хозяевах, чтобы произвести многие из этих слитых аналогов. Полипептиды ЕЕ-17КС, ГО-17КА или I^-17КС/Е^17КА могут быть слиты с двумя или больше компонентами или доменами, такими как метки сродства для очистки и нацеливания домена. Слитые полипептиды могут также включать один или больше сайтов расщепления, особенно между доменами; см., например, Тиап еГ а1., Соппесбуе Иккие Кекеагсб, 34:1-9, 1996.

Слитые белки могут быть получены способами, известными специалистам в технологии, получая каждый компонент слитого белка и химически соединяя их. Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий оба компонента слитого белка в подходящей рамке считывания, может быть произведен, используя известные методики, и экспрессирован методами, описанными здесь. Общие методы ферментативного и химического расщепления слитых белков описаны, например, АикиЬе1 (1995) на страницах от 16-19 до 16-25.

Домены, связывающие ГО-17КС и (или) ГО-17КА, могут быть далее характеризованы физическим анализом структуры, определенной такими методами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, электронная дифракция или маркировка фотосродства, в соединении с мутацией предполагаемых аминокислот контактного сайта агонистов лиганда; см., например, бе Уок еГ а1., 8с1епсе, 255:306 (1992), 8ιιιίΐ1ι еГ а1., Е Мо1. Вю1., 224:899 (1992), и У1обауег еГ а1., ЕЕВ8 Ьеб., 309:59 (1992).

Настоящее изобретение также рассматривает химически измененные композиции ГО-17КС или ЕЬ17КС/ГО-17КА, в которых полипептид связан с полимером. Иллюстративные полипептиды ГО-17КС или I^-17КС/I^-17КА представляют собой растворимые полипептиды, у которых нет функционального трансмембранного домена, такого как полипептид, состоящий из аминокислотных остатков последовательности 8ЕО ГО N0:3 или X. Как правило, полимер растворим в воде так, что конъюгат не осаждается в водной среде, такой как физиологическая среда. Примером подходящего полимера является тот, который был изменен так, чтобы иметь единственную реакционноспособную группу, такую как активная сложноэфирная группа для ацилирования, или альдегидная группа для алкилирования. Таким образом, степенью полимеризации можно управлять. Примером реакционноспособного альдегида является полиэтиленгликоль пропиональдегид или его моно(С1-С10)алкокси или арилокси производные (см., например, Натк, еГ а1., патент США № 5252714). Полимер может быть разветвленным или неразветвленным. Кроме того, смесь полимеров может использоваться, чтобы производить конъюгаты ГО-17КС или I^-17КС/I^17КА.

Конъюгаты по настоящему изобретению, применяемые в терапии, могут включать фармацевтически приемлемые водорастворимые полимерные компоненты. Подходящие водорастворимые полимеры включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), монометокси-ПЭГ, моно(С1-С1₀)алкокси-ПЭГ, арилокси-ПЭГ, поли^-винилпирролидоирПЭГ, трезилмонометокси-ПЭГ, ПЭГ-пропиональдегид, биссукцинимидилкарбонат-ПЭГ, гомополимеры пропиленгликоля, сополимер пропиленоксид/этиленоксид, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт, декстран, целлюлоза, или другие основанные на углеводах полимеры. Подходящий ПЭГ может иметь молекулярный вес от приблизительно 600 до приблизительно 60000, включая, например, 5000, 12000, 20000 и 25000. Конъюгат ГО-17КС может также включать смесь таких водорастворимых полимеров.

Один пример конъюгата ГО-17КС включает компонент ГО-17КС (или компонент I^-17КС/I^-17КА) и полиалкилоксидный компонент, присоединенный к №концу компонента ГО-17КС. ПЭГ представляет собой один подходящий полиалкилоксид. В качестве иллюстрации, ГО-17КС (или I^-17КС/I^-17КА) может модифицироваться ПЭГ процессом, известным как ПЭГилирование. ПЭГилирование ГО-17КС может быть выполнено любой из реакций ПЭГилирования, известных в технологии (см., например, ЕР 0154316, Ие1дабо еГ а1., Сгбса1 Кеуе^к ш Тбегареибс Игид Саглег 8укГетк, 9:249 (1992), Иипсап апб 8ргеабсо, С1т. РбагтасоктеГ, 27:290 (1994) и Егапс1к еГ а1., ГОГ. I. НетаГо1., 68:1 (1998)). Например, ПЭГилирование может быть выполнено реакцией ацилирования или реакцией алкилирования реакционноспособной молекулой полиэтиленгликоля. В альтернативном подходе конъюгаты ГО-17КС образуют конденсацией активированного ПЭГ, в котором концевую гидрокси или аминогруппу ПЭГ заменяли активированным линкером (см., например, 1<агак1е\\'1сх еГ а1., патент США № 5382657).

ПЭГилирование ацилированием обычно требует реакции активного сложноэфирного производного ПЭГ с полипептидом ГО-17КС или I^-17КС/I^-17КА. Примером активированного сложного эфира ПЭГ является ПЭГ, эстерифицированный №гидроксисукцинимидом. Как используется здесь, термин ацилирование включает следующие типы связей между ГО-17КС или I^-17КС/I^-17КА и водорастворимым полимером: амид, карбамат, уретан, и т.п. Методы получения ПЭГилированных ЕЕ-17КС или ГО17КС/ГО-17КА ацилированием будут обычно включать стадии (а) реакции полипептида ГО-17КС или ГО

- 35 015351

17ВС/ТЬ-17КА с ПЭГ (таким как реакционноспособный сложный эфир альдегидного производного ПЭГ) в условиях, при которых одна или больше групп ПЭГ присоединяются к 1Ь-17ВС или 1Ь-17ВС/1Ь17КА, и (Ь) получения продукта(ов) реакции. Обычно, оптимальные условия реакции для реакций ацилирования будут определяться на основе известных параметров и желательных результатов. Например, чем больше отношение ПЭГ:1Ь-17ВС (или ПЭГ:1Ь-17К.С/1Ь-17ВА), тем больше процент полиПЭГилированного продукта 1Ь-17ВС (или 1Ь-17ВС/1Ь-17ВА).

Продукт ПЭГилирования ацилированием обычно представляет собой продукт полиПЭГилирования, в котором ε-аминогруппы лизина ПЭГилированы через ацильную линкерную группу. Примером соединяющей связи является амидная связь. Как правило, результатный 1Ь-17ВС или 1Ь-17ВС/1Ь-17КА будет по меньшей мере на 95% моно-, ди- или трипэгилирован, хотя некоторые частицы с более высокой степенью ПЭГилирования могут быть получены в зависимости от условий реакции. ПЭГилированнные частицы могут быть отделены от неконьюгированных полипептидов 1Ь-17ВС или 1Ь-17ВС/1Ь-17ВА, используя стандартные методы очистки, такие как диализ, ультрафильтрация, хроматография ионного обмена, афинная хроматография и т.п.

ПЭГилирование алкилированием обычно включает реакцию концевого альдегидного производного ПЭГ с 1Ь-17ВС или 1Ь-17ВС/1Ь-17ВА в присутствии восстановителя. Группы ПЭГ могут крепиться к полипептиду через группу -СН₂-МН.

Дериватизация через восстановительное алкилирование, чтобы произвести продукт моноПЭГилирования, использует различающуюся реакционноспособность различных типов первичных аминогрупп, доступных для дериватизации. Как правило, реакцию выполняют при рН, который позволяет использовать разницу в рКа между ε-аминогруппой остатков лизина и α-аминогруппой №концевого остатка белка. Такой селективной дериватизацией управляют присоединением водорастворимого полимера, который содержит реакционноспособную группу, такую как альдегид, к белку. Коньюгация с полимером встречается, главным образом, у №конца белка без значительной модификации других реакционноспособных групп, таких как аминогруппы боковой цепи лизина. Настоящее изобретение обеспечивает существенно гомогенные препараты монополимерных конъюгатов 1Ь-17ВС или 1Ь-17ВС/1Ь-17ВА.

Восстановительное алкилирование, чтобы произвести существенно гомогенную популяцию монополимерных молекул конъюгатов 1Ь-17ВС или 1Ь-17ВС/ТЬ-17ВА, может включать стадии (а) реакции полипептида 1Ь-17ВС или 1Ь-17ВС/1Ь-17ВА с реакционноспособным ПЭГ в условиях восстановительного алкилирования при рН, подходящем, чтобы разрешить селективную модификацию α-аминогрупп амино концов 1Ь-17ВС или 1Ь-17К.С/1Ь-17ВА, и (Ь) получения продукта(ов) реакции. Восстановитель, применяемый в восстановительном алкилировании, должен быть устойчивым в водном растворе и быть в состоянии восстанавливать только основания Шиффа, образующиеся в начальном процессе восстановительного алкилирования. Иллюстративные восстановители включают боргидрид натрия, цианоборгидрид натрия, диметиламинборан, триметиламинборан и пиридинборан.

Для существенно гомогенной популяции монополимерных конъюгатов 1Ь-17ВС или 1Ь-17ВС/1Ь17КА условия реакции восстановительного алкилирования являются условиями, которые допускают селективное прикрепление водорастворимого полимерного компонента к №концу 1Ь-17ВС или Ш17ВС/1Ь-17КА. Такие условия реакции обычно предусматривают разницу рКа между аминогруппами лизина и α-аминогруппами №конца. Также рН влияет на отношение полимера к белку, который применяется. В общем, чем ниже рН, тем больший избыток полимера к белку будет желателен, потому что N концевая α-группа менее реакционноспособна, и тем больше полимера требуется, чтобы достигнуть оптимальных условий. Если рН более высок, отношение полимер :1Ь-17ВС (или полимер:1Е-17ВС/1Е-17КА) не должно быть столь большим, потому что доступно больше реакционноспособных групп. Как правило, рН будет находиться в пределах диапазона 3-9 или 3-6. Этот метод может применяться для получения гомодимерных, гетеродимерных или мультимерных растворимых рецепторных конъюгатов, включающих Ш-17ВС или 1Ь-17КС/1Ь-17КА.

Другим фактором для рассмотрения является молекулярная масса водорастворимого полимера. Обычно, чем выше молекулярная масса полимера, тем меньше число молекул полимера, которые могут быть присоединены к белку. Для реакций ПЭГилирования типичная молекулярная масса составляет от приблизительно 2 до приблизительно 100 кДа, от приблизительно 5 до приблизительно 50 кДа или от приблизительно 12 до приблизительно 25 кДа. Молярное отношение водорастворимого полимера к 1Ь17ВС или Ш-ПВС/Ш-ПКА обычно будет в интервале от 1:1 до 100:1. Как правило, молярное отношение водорастворимого полимера к 1Ь-17ВС или 1Е-17ВС/ТЕ-17ВА будет от 1:1 до 20:1 для полиПЭГилирования и от 1:1 до 5:1 для моноПЭГилирования.

Известны общие методы получения конъюгатов, включающих полипептид и водорастворимые полимерные компоненты; см., например, Кагабетуюх е! а1., патент США № 5382657, Сгеепета1б е! а1., патент США № 5738846, №еГог!11 е! а1., С1т. РЬагтасо1 ТЬег., 59:636 (1996), МопкагкЬ е! а1., Апа1. ВюсЬет., 247:434 (1997). Этот метод может применяться для получения гомодимерных, гетеродимерных или мультимерных растворимых рецепторных конъюгатов, включающих 1Ь-17ВС.

- 36 015351

Настоящее изобретение рассматривает препараты, включающие пептид или полипептид, такой как растворимый рецептор или антитело, описанные здесь. Такие препараты могут далее включать носитель. Носитель может быть обычным органическим или неорганическим носителем. Примеры носителей включают воду, буферный раствор, спирт, пропиленгликоль, макрогол, сезамовое масло, кукурузное масло и т. п.

С) Выделение полипептидов [Б-17ЕС или [^-17ЕС/[^-17ЕЛ.

Полипептиды по настоящему изобретению могут быть очищены по меньшей мере до приблизительно 80%-ной чистоты, по меньшей мере до приблизительно 90%-ной чистоты, по меньшей мере до приблизительно 95%-ной чистоты или больше чем 95%, такой как 96, 97, 98%, или больше чем 99%-ная чистота относительно загрязняющих макромолекул, особенно других белков и нуклеиновых кислот, и освобождены от инфекционных и пирогенных средств. Полипептиды по настоящему изобретению могут также быть очищены до фармацевтически чистого состояния, которое больше чем чистота 99,9%. В определенных препаратах очищенный полипептид существенно освобожден от других полипептидов, особенно других полипептидов животного происхождения.

Фракционирование и (или) обычные методы очистки могут применяться, чтобы получить препараты [Б-17ЕС или [И- 17ЕС/[И-17ЕА, очищенные из природных источников (например, человеческих тканевых источников), синтетические полипептиды [Б-17ЕС или [^-17ЕС/[^-17ЕЛ. рекомбинантные полипептиды [Б-17ЕС или [П-17ЕС/[П-17ЕА и слитые полипептиды [Б-17ЕС или [^-17ЕС/[^-17ЕЛ. очищенные от рекомбинантных клеток-хозяев. В общем, осаждение сульфатом аммония и кислотой или хаотропная экстракция могут использоваться для фракционирования образцов. Типичные стадии очистки могут включать гидроксиапатит, эксклюзионную хроматографию, жидкостную хроматографию с программированием потока (РРБС) и высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенными фазами. Подходящие хроматографические среды включают дериватизованные декстраны, агарозу, целлюлозу, полиакриламид, специальные кварцы и т.п. Производные целлюлозы (РЕ[, ЭЕАЕ, ЦАЕ и О производные) являются подходящими. Типичные хроматографические среды включают среды, дериватизированные фенильными, бутильными или октильными группами, такие как Р11епу1-8ер11агоке ЕЕ (Рйагтас1а), Тоуореаг1 Ьи!у1 650 (Токо Наак, МоШдоте^Ше, РА), Ос1у1-8ер11агоке (Рйагтааа) и т.п.; или полиакриловые смолы, такие как АтЬегсЬгот СС 71 (Токо Наак) и т.п. Подходящие твердые подложки включают стеклянные гранулы, смолы, на основе оксида кремния, гранулы агарозы, сшитые гранулы агарозы, гранулы полистирола, смолы сшитого полиакриламида и т.п., которые нерастворимы в условиях, в которых они должны использоваться. Эти подложки могут быть модифицированы реакционноспособными группами, которые позволяют закрепление белков аминогруппами, карбоксильными группами, сульфгидрильными группами, гидроксигруппами и (или) углеводными фрагментами.

Примеры химического сочетания включают активацию бромциана, активацию Νгидроксисукцинимида, активацию эпоксида, сульфгидрильную активацию, активацию гидразида и карбокси и амино производные для карбодиимидного сочетания. Эти и другие твердые среды известны и широко используются в технологии и доступны от коммерческих поставщиков. Выбор определенного метода для выделения и очистки полипептида - вопрос обычного дизайна и определяется частично свойствами выбранной подложки; см., например, ЛΓΓ^η^(у СНготаЮдгарНу: Ргтщр1ек & Мебюбк (Рйагташа БКВ В1о1есЬпо1оду, 1988), и Эоопап, РгоЮт Риггйсабоп Рго!осо1к (Нитапа Ргекк, 1996).

Дополнительные изменения в выделении и очистке [Б-17ЕС или [П-17ЕС/[П-17ЕА могут быть разработаны специалистами в технологии.

Полипептиды по настоящему изобретению могут также быть изолированы эксплуатацией определенных свойств. Например, адсорбционная хроматография с иммобилизированными ионами металлов ([МАС) может применяться, чтобы очистить богатые гистидином белки, включая белки, которые содержат полигистидиновые метки. Кратко, гель сначала загружают ионами двухвалентных металлов, чтобы образовать хелаты (8и1ко^кк1, Тгепбк ίη Вюсйет., 3:1 (1985)). Богатые гистидином белки будут адсорбироваться на этой матрице с разным сродством, в зависимости от используемого металлического иона, и будут элюироваться конкурентной элюцией, понижающей рН, или используя сильные хелатирующие агенты. Другие методы очистки включают очистку гликозилированных белков лектин-афинной хроматографией и ионообменной хроматографией (М. ОеШксйег (еб.), Ме111. Еп/утоЕ 182:529 (1990)). В пределах дополнительных вариантов изобретения слияние полипептида интереса и метки сродства (например, мальтозасвязывающий белок, домен иммуноглобулина) может быть использовано, чтобы облегчить очистку. Кроме того, лигандсвязывающие свойства растворимых полипептидов [Б-17ЕС или [Б-17ЕС/[Б17ЕА по настоящему изобретению могут эксплуатироваться для очистки, например, растворимых ΣΕ17ЕС-содержащих рецепторов; например, при использовании афинной хроматографии, в которой лиганд [Б-17Р связывают с колонкой, а [Б-17ЕС-содержащий рецептор связывается и затем элюируется, используя стандартные методы хроматографии.

Полипептиды [Б-17ЕС, [Б-17ЕА или [П-17ЕС/[П-17ЕА либо их фрагменты могут также быть получены через химический синтез, как описано выше. Эти полипептиды могут быть мономерами или мультимерами; гликозилированными или негликозилированными; ПЭГилированными или неПЭГилированными; и могут включать или не включать начальный остаток аминокислоты метионина.

- 37 015351

Н) Продукция антител к белкам (-17(С или I^-17(С/I^-17(А.

Антитела к (-17(С или I^-17(С/I^-17(А могут быть получены, например, используя продукт вектора экспрессии (-17(С или I^-17(С/Т^-17(А или (-17(С или I^-17(С/I^-17(А, изолированный из естественного источника, как антиген. Особенно полезны антитела анти-(-17(С(' или I^-17(С/I^-17(А, способные связываться специфично с (-17(С или (-17(С/(-17(А. Антитела, как полагают, являются специфически связывающими, если антитела показывают по меньшей мере одно из следующих двух свойств: (1) антитела связываются с (-17(С или I^-17(С/I^-17(А при пороговом уровне связывающей активности и (2) антитела значительно не реагируют перекрестно с полипептидами, близкими к (-17(С или ( (-17(С/ТЬ-17(А.

Что касается первой особенности, антитела специфично связываются, если они связываются с полипептидом (-17(С или I^-17(С/I^-17(А, пептидом или эпитопом со сродством связывания (К_а) 10⁶ М^-1 или больше, предпочтительно 10⁷ М^-1 или больше, более предпочтительно 10⁸ М^-1 или больше и наиболее предпочтительно 10⁹ М^-1 или больше. Сродство связывания антитела может быть легко определено специалистом в технологии, например Скэтчард-анализом (8са!сБагД Апп. ИУ АсаД 8οΐ., 57:660 (1949)). Относительно второй особенности антитела значительно не реагируют перекрестно с близкими полипептидными молекулами, например, если они обнаруживают (-17(С или (-17(С/(-17(А, но не теперь известные полипептиды, используя стандартный Вестерн-блоттинг анализ. Примеры известных близких полипептидов включают известные цитокиновые рецепторы.

Антитела анти-(-17(С(' или I^-17(С/Т^-17(А могут быть произведены, используя антигенные эпитопнесущие пептиды и полипептиды (-17(С или (-17(С/(-17(А. Антигенные эпитопнесущие пептиды и полипептиды по настоящему изобретению содержат последовательность по меньшей мере 10, или от 15 до приблизительно 30 аминокислот, содержащихся в последовательностях 8ЕО ΙΌ N0:2, 8Е0 ΙΌ N0:3, 8Е0 ΙΌ N0:5 или другой аминокислотной последовательности, раскрытой здесь. Однако пептиды или полипептиды, включающие больший участок аминокислотной последовательности по изобретению, содержащий от 30 до 50 аминокислот, или любой длины, включая всю аминокислотную последовательность полипептида по изобретению, также полезны для индуцирования антител, которые связываются с (-17(С или (-17(С/ТЬ-17(А. Желательно, чтобы аминокислотная последовательность эпитопнесущего пептида выбиралась так, чтобы обеспечить существенную растворимость в водных растворителях (т. е. последовательность включает относительно гидрофильные остатки, в то время как гидрофобных остатков обычно избегают). Кроме того, аминокислотные последовательности, содержащие остатки пролина, могут также быть желательными для продукции антитела.

Как иллюстрация, потенциальные антигенные сайты в (-17(С идентифицировались, используя метод Джеймсона-Вулфа Сатекоп ап4 Vо1Г. САВЮ8, 4:181 (1988)), как осуществлено в соответствии с программой Р(0ТЕАN (версия 3.14), ЬА8Е(СЕХЕ (ЭХА8ТА( Майкоп, νΙ). Параметры по умолчанию использовались в этом анализе.

Метод Джеймсона-Вулфа предсказывает потенциальные антигенные детерминанты, комбинируя шесть главных подпрограмм для белкового структурного прогноза. Кратко, сначала использовался метод Хоппа-Вудса (Норр е! а1., Ргос. №И'1 АсаД 8сг И8А, 75:3824 (1981)), чтобы идентифицировать аминокислотные последовательности, представляющие области самой большой местной гидрофильности (параметр: семь усредненных остатков). Во второй стадии применяли метод Эмини, Ет1ш е! а1., 1. У1го1оду, 55:836 (1985), чтобы вычислить поверхностные вероятности (параметр: поверхностный порог решения (0,6)=1). В-третьих, применяли метод Карплюс-Шульца, Кагр1ик ап4 8сБи1!/, Nа!иго^ккепксБаГ!еп, 72:212 (1985), чтобы предсказать гибкость цепи скелета (параметр: порог гибкости (0,2)=1). В четвертой и пятой стадиях анализа вторичные прогнозы структуры применяли к данным, используя методы Чоу-Фасмана, СБои, Рге41с!юп оГ Рго!еш 81гис!ига1 С1аккек Ггот Атшо Ас14 Сотрокйюп, ш РгеДсбоп оГ Рго!ет 8(гис!иге ап4 !Бе Ргтщр1ек оГ Рго!ет СопГогтайоп, Еактап (еД), р. 549-586 (Р1епит Ргекк, 1990), и ГарньеРобсона, Сат1ег е! а1., Г Мо1. Вю1., 120:97 (1978) (параметры Чоу-Фасмана: таблица конформаций=64 белка; пороговая а-область=103; пороговая в-область=105; параметры Гарнье-Робсона: α и β константы решения=0). В шестой подпрограмме параметры гибкости и факторы доступности гидрофобность/растворитель были объединены, чтобы определить величину поверхности контура, обозначаемую как антигенный индекс. Наконец, функцию уширения пика применяли к антигенному индексу, который уширяет главные поверхностные пики добавлением 20, 40, 60 или 80% соответствующей величины пика, чтобы объяснить дополнительную свободную энергию, полученную из подвижности поверхностных областей относительно внутренних областей. Это вычисление не было применено, однако, ни к какому главному пику, который находится в спиральной области, так как спиральные области имеют тенденцию быть менее гибкими. Профили гидофильности Хоппа-Вудса могут применяться, чтобы определить области, у которых есть самый антигенный потенциал в пределах последовательности 8Е0 ΙΌ N0:3 (Норр е! а1., Ргос. КаГ'1 АсаД 8сг, 78:3824-3828, 1981; Норр, Д Iттип. Ме!Б., 88:1-18, 1986 и Тпс.|шег е! а1., Рго!еш Епдшеегшд, 11:153-169, 1998). Профиль основан на скользящем окне с шестью остатками. Скрытые остатки С, 8 и Т и доступные остатки Н, Υ и V были проигнорированы. Кроме того, антигенные эпитопы (-17(С в пределах последовательности 8ЕС ΙΌ N0:3, как предсказано схемой ДжеймсонаВулфа, например, используя программу 0ХА8ТА( Рго!еап (^NА8ТА(, Тпс., Майкоп, ν1), служат пред

- 38 015351 почтительнными антигенными эпитопами и могут быть определены специалистом в технологии. Такие антигенные эпитопы включают (1) аминокислотные остатки 73-82 последовательности 8Е0 ГО N0:3; (2) аминокислотные остатоки 95-104 последовательности 8Е0 ГО N0:3; (3) аминокислотные остатки 111119 последовательности 8Е0 ГО N0:3; (4) аминокислотные остатки 179-186 последовательности 8Е0 ГО N0:3; (5) аминокислотные остатки 200-205 последовательности 8Е0 ГО N0:3; (6) аминокислотные остатки 229-236 последовательности 8Е0 ГО N0:3; (7) аминокислотные остатки 264-268 последовательности 8Е0 ГО N0:3 и (8) аминокислотные остатки 275-281 последовательности 8Е0 ГО N0:3. Настоящее изобретение рассматривает использование любого из антигенных пептидов от X до Υ, чтобы произвести антитела к 1Ь-17КС, или как инструмент скрининга или идентифицикации нейтрализирующих моноклональных антител по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также рассматривает полипептиды, включающие по меньшей мере один из антигенных пептидов от X до Υ. Настоящее изобретение рассматривает использование любых антигенных пептидов или эпитопов, описанных здесь, чтобы произвести антитела к 1Ь-17КС, также как идентифицировать и произвести скрининг моноклональных антител анти-1Ь-17КС, которые являются нейтрализирующими и которые могут связывать, блокировать, ингибировать, уменьшать, противодействовать или нейтрализовать активность 1Ь-17Р и 1Ь-17А (индивидуально или вместе).

Кроме того, подходящие антигены также включают полипептиды ГО-17КС или 1Ь-17КС/1Ь-17КА, включающие цитокинсвязывающие ГО-17КС или 1Ь-17КС/1Ь-17КА, или внеклеточный домен, раскрытый выше, в комбинации с другим цитокиновым внеклеточным доменом, таким как домен цитокинового рецептора класса I или II, такой как домены, которые могут образовать растворимые гетеродимерные или мультимерные полипептиды ГО-17КС или 1Ь-17КС/1Ь-17КА и т.п.

Поликлональные антитела к рекомбинантному белку ГО-17КС или 1Ь-17КС/1Ь-17КА или к ГО-17КС или ГО-17КС/1Ь-17КА, выделенному из природных источников, могут быть получены, используя методы, известные специалистам в технологии; см., например, Огееп е! а1., РгойисИоп оГ Ро1ус1опа1 АпЕкега ш 1ттипос11ет1са1 Рго!осо1к (Мапкоп, ей.), р. 1-5 (Нитапа Ргекк, 1992), и У1Шатк е! а1., Ехргеккюп оГ Гоге1дп рго!етк т Е.соН иктд р1акиий уесЮгк апй рип1юа!юп оГ кресШс ро1ус1опа1 апИЬой1ек т ^NА С1ошпд 2: Ехргеккюп 8ук!етк, 2^пй Еййюп, 61оуег е! а1. (ейк.), р. 15 (0хГогй Ишуегкйу Ргекк, 1995). Иммуногенность полипептида ГО-17КС или 1Ь-17КС/1Ь-17КА может быть увеличена с помощью стимулятора, такого как квасцы (гидроксид алюминия) или полного или неполного стимулятора Ргеипй'к. Полипептиды, полезные для иммунизации, также, включают слитые полипептиды, такие как слияния ГО-17КС или 1Ь-17КС/1Ь17КА или их участка с полипептидом иммуноглобулина или с мальтозасвязывающим белком. Полипептидный иммуноген может быть молекулой полной длины или ее участком. Если полипептидный участок является гаптеноподобным, то такой участок может преимущественно присоединяться или связываться с макромолекулярным носителем (таким как хромопротеид КЬН, бычий сывороточный альбумин (В8А) или токсоид столбняка) для иммунизации.

Хотя поликлональные антитела обычно разводят в животных, таких как лошади, коровы, собаки, цыплята, крысы, мыши, кролики, морские свинки, козы или овцы, антитело анти-1Ь-17КС или 1Ь17КС/ТЬ-17КА по настоящему изобретению может также быть получено из нечеловеческого антитела примата. Общие методы разведения диагностически и терапевтически полезных антител в бабуинах могут быть найдены, например, у 6о1йепЬегд е! а1., международный патент № У0 91/11465, и у Ьоктап е! а1., 1п!. I. Сапсег, 46:310 (1990).

Альтернативно, моноклональные антитела анти-1Ь-17КС или 1Ь-17КС/1Ь-17КА могут быть произведены. Моноклональные антитела грызунов к специфическим антигенам могут быть получены методами, известными специалистам в технологии (см., например, КоЫег е! а1., №!иге, 256:495 (1975), СоНдап е! а1. (ейк.), Сштеп! Рго!осо1к ш 1ттипо1оду, Уо1. 1, р. 2.5.1-2.6.7 (Ло1т У11еу & 8опк, 1991) [СоНдап], Р1скк1еу е! а1., РгойисИоп оГ топос1опа1 апНЬоНек адатк! рго!етк ехргеккей ш Е.соН ш ^NА С1ошпд 2: Ехргеккюп 8ук!етк, 2^пй ЕйШоп, 61оуег е! а1. (ейк.), р. 93 (0хГогй ИтуегкИу Ргекк, 1995)).

Кратко, моноклональные антитела могут быть получены инъецированием мышей составом, включающим генный продукт ГО-17КС или 1Ь-17КС/ТЬ-17КА, проверяя наличие продукции антител удалением образца сыворотки, удалением селезенки, чтобы получить В-лимфоциты, сливая В-лимфоциты с миеломными клетками, чтобы произвести гибридомы, клонируя гибридомы, выбирая позитивные клоны, которые производят антитела к антигену, культивируя клоны, которые производят антитела к антигену, и выделяя антитела из гибридомных культур.

Кроме того, антитело анти-1Ь-17КС или 1Ь-17КС/1Ь-17КА по настоящему изобретению может быть получено из человеческого моноклонального антитела. Человеческие моноклональные антитела получают из трансгенных мышей, которые были созданы, чтобы произвести определенные человеческие антитела в ответ на антигенный стимул. В этом методе элементы человеческого локуса тяжелой и легкой цепи вводят в штаммы мышей, полученных из линий стволовых клеток эмбрионов, которые содержат целевые разрушения эндогенных локусов тяжелой и легкой цепей. Трансгенные мыши могут синтезировать человеческие антитела, специфические для человеческих антигенов, а мыши могут использоваться, чтобы производить гибридомы, секретирующие человеческие антитела. Методы получения человеческих антител из трансгенных мышей описаны, например, Огееп е! а1., №!иге Оепе!, 7:13 (1994), ЬопЬегд е! а1.,

- 39 015351 №!иге, 365:856 (1994) аиб Тау1ог е! а1., Ιώ. Iттии. 6:579 (1994).

Моноклональные антитела могут быть выделены и очищены от гибридомных культур многими известными методами. Такие методы выделения включают афинную хроматографию с Рто!еш-А 8ерйагоке, эксклюзионную хроматографию и ионообменную хроматографию (см., например, Сойдаи на страницах 2.7.1-2.7.12 и страницах 2.9.1-2.9.3; Ватек е! а1., Рштйса!юи оГ Iтшииод1оЬийи 6 ОдС) т Ме!йобк ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 10, р. 79-104 (Тйе Нитаиа Ргекк, Шс. 1992)).

Для специфического применения может быть желательно получать фрагменты антител анти-ГЙ17ИС или Ш-ПИС/ТЙ-ПЯЛ. Такие фрагменты антител могут быть получены, например, протеолитическим гидролизом антител. Фрагменты антител могут быть получены расщеплением целых антител пепсином или папаином обычными методами. В качестве иллюстрации, фрагменты антител могут быть произведены ферментативным расщеплением антител пепсином, чтобы обеспечить 58 фрагмент, обозначаемый Е(аЬ')2. Этот фрагмент может быть далее расщеплен, используя тиоловый восстановитель, чтобы произвести 3.58 ЕаЬ' моновалентные фрагменты. Необязательно, реакция расщепления может быть выполнена, используя защитную группу для сульфгидрильных групп, которые образуются при расщеплении дисульфидных связей. Как альтернатива, ферментативное расщепление, используя пепсин, производит два моновалентных ЕаЬ фрагмента и фрагмент Ес непосредственно. Эти методы описаны, например, 6о1беиЬегд, патент США № 4331647, № ко ной е! а1., Агсй Вюсйет. Вюрйук. 89:230 (1960), Ройет, Вюсйет. 1., 73:119 (1959), Ебе1таи е! а1., ш Ме!йобк т Еи7уто1оду, Уо1. 1, р. 422 (Асабетю Ргекк, 1967) и Сойдаи на страницах 2.8.1-2.8.10 и 2.10.-2.10.4.

Другие методы расщепления антител, таких как отделение тяжелых цепей с получением моновалентных фрагментов легко-тяжелой цепи, дальнейшее расщепление фрагментов, или другие ферментативные, химические или генетические методы, могут также использоваться, пока фрагменты связываются с антигеном, который узнается интактным антителом.

Например, фрагменты Εν включают ассоциацию У_й и У[ цепей. Эта ассоциация может быть нековалентной, как описано ШЬат е! а1., Ргос. №11'1 Асаб. 8сй И8А, 69:2659 (1972). Альтернативно, переменные цепи могут быть связаны межмолекулярным дисульфидным мостиком или поперечно сшиты химическими веществами, такими как глутаральдегид (см., например, 8аибйи, Стй. Иет. Вю!есй., 12:437 (1992)).

Фрагменты Εν могут включить У_Н и У_ъ цепи, которые связаны пептидным линкером. Эти одноцепные антигенсвязывающие белки (ксЕу) получают, конструируя структурный ген, включающий последовательности ДНК, кодирующие домены Уй и У1, которые связаны олигонуклеотидом. Структурный ген вставляют в вектор экспрессии, который впоследствии вводят в клетку-хозяин, такую как Е.сой. Рекомбинантные клетки-хозяева синтезируют единственную полипептидную цепь с линкерным пептидом, соединяющим два ν домена. Методы получения ксΕνк описаны, например, ^йй1оте е! а1., Ме!йобк: А Сотрашои !о Ме!йобк т Еи7уто1оду, 2:97 (1991) (также см. Вйб е! а1., 8с1еисе, 242:423 (1988), йабиет е! а1., патент США № 4946778, Раск е! а1., Вю /Тесйио1оду, 17:1271 (1993), и 8аибйи, выше).

В качестве иллюстрации, ксЕУ может быть получен, подвергая лимфоциты воздействию полипептида Ш-17ИС или Ш-П^/Ш-ПКА ш νίΙΐΌ и выбирая библиотеки показа антитела в фаге или подобных векторах (например, через использование иммобилизованного или маркированного белка или пептида Ш-17ИС или I^-17ИС/I^-17ИЛ). Гены, кодирующие полипептиды, имеющие потенциальные домены, связывающие полипептиды Ш-17ИС или I^-17ИС/I^-17ИЛ. могут быть получены, производя скрининг случайных библиотек пептида, показанных на фаге (показ фага) или на бактериях, таких как Е.сой. Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды, могут быть получены многими способами, такими как неспецифический мутагенез и случайный синтез полинуклеотида. Эти случайные библиотеки показа пептида могут использоваться, чтобы произвести скрининг пептидов, которые взаимодействуют с известной мишенью, которая может быть белком или полипептидом, таким как лиганд или рецептор, биологическая или синтетическая макромолекула, или органические или неорганические вещества. Методы создания и скрининга таких случайных библиотек показа пептида известны в технологии (йабиет е! а1., патент США № 5223409, йабиет е! а1., патент США № 4946778, йабиет е! а1., патент США № 5403484, йабиет е! а1., патент США № 5571698, и Кау е! а1., Рйаде И1кр1ау оГ Рерйбек аиб Рто!етк (Асабетю Ргекк, Шс. 1996)) и случайные библиотеки показа пептида и комплект для проведения скрининга таких библиотек доступны коммерчески, например от С^0NТЕСН йаЬота!опек, Шс. (Альт Ра1о А1!о, СА), Шуйгодеи Шс. (8аи П1едо, СА), №\у Еид1аиб Вю1аЬк, Шс. (Веуег1у, МА) и Рйаттааа ЙКВ Вю!есйио1оду Шс. (Р1кса!а^ау, N1). Скрининг случайных библиотек показа пептида может быть произведен, используя последовательности Ш-17ИС или I^-17ΚС/I^-17ΚЛ. раскрытые здесь, чтобы идентифицировать белки, которые связываются с Ш-17ИС или Ш-П^/Ш-ПКА.

Другая форма фрагмента антитела представляет собой пептид, кодирующий область, определяющую комплементарность (ООК). Пептиды ООК (минимальные единицы узнавания) могут быть получены, конструируя гены, кодирующие ООК антител интереса. Такие гены получают, например, при использовании полимеразной цепной реакции, чтобы синтезировать переменную область из РНК клеток, производящих антитела (см., например, йатлск е! а1., Ме!йобк: А Сотрашои !о Ме!йобк ш Еи/ушо^ду, 2:106 (1991), Соийеиау-йиск, Сеиейс Машри1а!юи оГ Моиос1оиа1 АийЬоб1ек т Моиос1оиа1 АийЬоб1ек: Ргобисйои, Еидшееттд аиб Сйшса1 Аррйсайои, КШег е! а1. (ебк.), р. 166 (СатЬпбде йшуегкйу Ргекк, 1995),

- 40 015351 и \агб е! а1., Оепейс Машри1айоп апб Ехргеззюп о£ АпйЬобхез, ш Мопос1опа1 АпйЬоб1ез: Рг1пс1р1ез апб Аррйсайоп, В1гсй е! а1. (ебз.), р. 137 (ХУПеу-Ызз, 1пс. 1995)).

Альтернативно, антитела анти-1Ь-17КС или 1Е-17КС/1Ь-17КА могут быть получены из гуманизированного моноклонального антитела. Гуманизированные моноклональные антитела произведены, передавая мышиные комплементарные определяющие области из тяжелых и легких переменных цепей мышиного иммуноглобулина в человеческий переменный домен. Типичные остатки человеческих антител затем заменяются в структурных областях мышиных копий. Использование компонентов антител, полученных из гуманизированных моноклональных антител, устраняет потенциальные проблемы, связанные с иммуногенностью мышиных константных областей. Общие методы клонирования переменных доменов мышиного иммуноглобулина описаны, например, Ог1аиб1 е! а1., Ргос. №11'1 Асаб. За. ИЗА, 86:3833 (1989). Методы получения гуманизированных моноклональных антител описаны, например, 1опез е! а1., №а!иге, 321:522 (1986), Сайег е! а1., Ргос. №11'1 Асаб. За. ИЗА, 89:4285 (1992), ЗапбЕи, Сй!. Кеу. В1о!есй., 12:437 (1992), Зтдег е! а1., 1. 1ттип., 150:2844 (1993), ЗибЫг (еб.), АпйЬобу Епдтеейпд Рго!осо1з (Нитапа Ргезз, 1пс. 1995), Ке11еу, Епдтеейпд Тйегареийс АпйЬоб1ез ш Рго!ет Епдтеейпд: Рйпар1ез апб Ргасйсе, С1е1апб е! а1. (ебз.), р. 399-434 (1о1т \беу & Зопз, 1пс. 1996), и Онееп е! а1., патент США № 5693762 (1997).

Кроме того, антитела анти-1Ь-17КС или 1Е-17КС/1Ь-17КА или фрагменты антител по настоящему изобретению могут быть ПЭГилированы, используя методы, известные в технологии и описанные здесь.

Поликлональные антиидиотипные антитела могут быть получены иммунизацией животных с антителами анти-1Ь-17КС или 1Й-17ЕС/1Й-17ЙА или фрагментами антител, используя стандартные методы; см., например, Огееп е! а1., Ргобисйоп о£ Ро1ус1опа1 Апйзега ш Ме1йобз ш Мо1еси1аг Вю1оду: 1ттипос11еппса1 Рго!осо1з (Мапзоп, еб.), р. 1-12 (Нитапа Ргезз, 1992). Кроме того, см. Сойдап на страницах 2.4.12.4.7. Альтернативно, моноклональные антиидиотипные антитела могут быть получены, используя антитела анти-1Ь-17КС или 1Е-17КС/ТЬ-17КА или фрагменты антител как иммуногены, методами, описанными выше. В качестве другой альтернативы, гуманизированные антиидиотипные антитела или нечеловеческие антиидиотипные антитела примата могут быть получены, используя вышеописанные методы. Методы производства антиидиотипных антител описаны, например, 1гбе, патент США № 5208146, Огеепе е! а1., патент США № 5637677 и Уаййакау1 и Мшосйа, 1. Сеп. Упо1., 77:1875 (1996).

Антитела анти-1Ь-17КС или 1Е-17КС/1Ь-17КА могут быть сопряжены с поддающейся обнаружению меткой с получением иммуноконъюгата анти-1Ь-17КС или 1Е-17КС/1Ь-17КА. Подходящие поддающиеся обнаружению метки включают, например, радиоизотоп, флуоресцентную метку, хемилюминесцентную метку, ферментную метку, биолюминесцентную метку или коллоидное золото. Методы создания и обнаружения такого определяемо меченого иммуноконъюгата известны специалистам в технологии и описаны более подробно ниже.

Поддающаяся обнаружению метка может быть радиоизотопом, который обнаруживается ауторадиографией. Изотопы, которые особенно полезны для целей настоящего изобретения ³Н, ¹²⁵1, ¹³¹1, ³⁵З и ¹⁴С.

Иммуноконъюгаты анти-1Ь-17КС или 1Е-17КС/1Ь-17КА могут также быть помечены флуоресцентным составом. Наличие флуоресцентно меченого антитела определяют экспонированием иммуноконъюгата светом подходящей длины волны и обнаружением результатной флюоресценции. Флуоресцентные метящие составы включают флуоресцеинизотиоциант, родамин, фикоэритерин, фикоцианин, аллофикоцианин, о-фталдегид и флуоресцамин.

Альтернативно, иммуноконъюгаты анти-1Ь-17КС или 1Е-17КС/1Ь-17КА могут быть определяемо мечены сочетанием компонента антитела с хемилюминесцентным соединением. Присутствие хемилюминесцентно меченого иммуноконъюгата определяют, обнаруживая наличие люминесценции, которая возникает в течение химической реакции. Примеры метящих хемилюминесцентных соединений включают люминол, изолюминол, ароматический сложный эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и сложный эфир оксалата.

Точно так же биолюминесцентное соединение может применяться, чтобы метить иммуноконъюгаты анти-1Ь-17КС или 1Е-17КС/1Ь-17КА по настоящему изобретению. Биолюминесценция представляет собой тип хемилюминесценции, найденной в биологических системах, в которых каталитический белок увеличивает эффективность хемилюминесцентной реакции. Присутствие биолюминесцентного белка определяют, обнаруживая наличие люминесценции. Биолюминесцентные соединения, которые полезны для маркировки, включают люциферин, люциферазу и экворин.

Альтернативно, иммуноконъюгаты анти-1Ь-17КС или 1Е-17КС/1Ь-17КА могут быть определяемо маркированы, связывая компонент антитела анти-1Ь-17КС или 1Е-17КС/1Ь-17КА с ферментом. Когда конъюгаты анти-1Ь-17КС или 1Ь-17КС/1Е-17КА-фермент культивируют в присутствии адекватного субстрата, ферментный компонент реагирует с субстратом с получением химического компонента, который может быть обнаружен, например, спектрофотометрическими, флуориметическими или визуальными средствами. Примеры ферментов, которые могут применяться, чтобы определяемо пометить полиспецифические иммуноконъюгаты, включают β-галактозидазу, глюкозоксидазу, пероксидазу и щелочную фосфатазу.

- 41 015351

Специалистам в технологии известны другие подходящие метки, которые могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением. Связывание маркеров с антителами анти-1Ь-17КС или 1Ь17КС/1Ь-17КА может быть достигнуто, используя стандартные методы, известные в технологии. Типичная методология в этом отношении описана Кеппебу е! а1., Сбп. СЫт. Ас!а, 70:1 (1976), 8сНитк е! а1., С1ш. СЫт. Ас!а, 81:1 (1977), 81ιί1ι е! а1., 1п!'1 Сапсег, 46:1101 (1990), 8!еш е! а1., Сапсег Кек., 50:1330 (1990) и Собдап, выше.

Кроме того, удобство и универсальность иммунохимического детектирования могут быть увеличены при использовании антител анти-1Ь-17КС или 1Ь-17КС/1Ь-17КА, которые сопрягались с авидином, стрептавидином и биотином (см., например, ХУПсНек е! а1. (ебк.), Ау1бш-Вюбп ТесНпо1оду Ме!обк ш Епхуто1оду, Уо1. 184 (Асабетю Ргекк, 1990) и Вауег е! а1., 1ттипос11е1шса1 Аррбсабопк о£ Ау1бш-Вюбп ТесНпо1оду ш Ме!Нобк ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1 10, Мапкоп (еб.), р. 149-162 (ТНе Нитапа Ргекк, 1пс. 1992).

Методы выполнения иммунологических анализов известны; см., например, Соок апб 8е1£, Мопос1опа1 АпбЬоб1ек ш О1адпокбс 1ттипоаккаук ш Мопос1опа1 АпбЬоб1ек: Ргобисбоп, Епдшееппд апб Сбшса1 Аррбсабоп, К1бег е! а1. (ебк.), р. 180-208 (СатЬпбде Ишуегкйу Ргекк, 1995), Репу, ТНе Ко1е о£ Мопос1опа1 АпбЬоб1ек ш Ле Абгапсетеп! о£ 1ттипоаккау ТесНпо1оду ш Мопос1опа1 АпбЬоб1ек: Рппар1ек апб Аррбсабоп, В|гсН е! а1. (ебк.), р. 107-120 (^беу-Ыкк, 1пс. 1995) и П1атапб1к, 1ттипоаккау (Асабетк Ргекк, 1пс. 1996).

Настоящее изобретение также рассматривает комплекты для выполнения иммунологического диагностического анализа на экспрессию гена 16-17КС или 1Ь-17КС/1Ь-17КА. Такие комплекты включают по меньшей мере один контейнер, включающий антитело анти-1Ь-17КС или 1Ь-17КС/1Ь-17КА, или фрагмент антитела. Комплект может также включать второй контейнер, включающий один или больше реактивов, способных указывать на присутствие антитела 16-17КС или 1Ь-17КС/1Ь-17КА или фрагментов антитела. Примеры таких индикаторных реактивов включают поддающиеся обнаружению метки, такие как радиоактивная метка, флуоресцентная метка, хемилюминесцентная метка, ферментная метка, биолюминесцентная метка, коллоидное золото и т.п. Комплект может также включать средство передачи пользователю такое, что антитела 16-17КС или 1Ь-17КС/1Ь-17КА или фрагменты антител используются, чтобы обнаружить белок 16-17КС или 1Ь-17КС/1Ь-17КА. Например, письменные инструкции могут заявлять, что приложенное антитело или фрагмент антитела могут использоваться, чтобы обнаружить 1Ь17КС или 1Ь-17КС/1Ь-17КА. Письменный материал может быть нанесен непосредственно на контейнер или письменный материал может быть предоставлен в форме упаковочной вставки.

Терапевтическое применение полипептидов 16-17КС или 1Ь-17КС/1Ь-17КА по изобретению.

Аминокислотые последовательности, имеющие растворимую активность 16-17КС или 1Ь-17КС/1Ь17КА, могут использоваться, чтобы модулировать иммунную систему, связывая лиганды 1Ь-17А и 1Ь17Р (или по отдельности или вместе) и, таким образом, предотвращая связывание этих лигандов с эндогенным рецептором 16-17КС и (или) 16-17КА. Такие антагонисты, как растворимый 16-17КС или 1Ь17КСДЬ-17КА, могут также использоваться, чтобы модулировать иммунную систему, ингибируя связывание 1Ь-17А и (или) 1Ь-17Р с эндогенным рецептором 16-17КС и (или) 16-17КА. Соответственно настоящее изобретение включает использование белков, полипептидов и пептидов, имеющих активность 16-17КС или 1Ь-17КСДЬ-17КА (таких как растворимые полипептиды 16-17КС или 1Ь-17КСДЬ-17КА, полипептидные фрагменты 16-17КС или 16-17КА, аналоги 16-17КС или 1Ь-17КС/1Ь-17КА, и слитые белки 16-17КС или 1Ь-17КС/1Ь-17КА) к субъекту, который испытывает недостаток в адекватном количестве этого полипептида, или который производит избыток 1Ь-17А и (или) 1Ь-17Р. Полипептиды по настоящему изобретению (например, растворимый 16-17КС и (или) 1Ь-17КС/1Ь-17КА) могут также использоваться, чтобы лечить субъекты, которые производят избыток либо 1Ь-17А, 1Ь-17Р, 16-17КА, либо 16-17КС. Подходящими субъектами являются млекопитающие, такие как люди. Например, такие растворимые полипептиды полезны в связывании, блокировании, ингибировании, ослаблении, противодействии или нейтрализации 1Ь-17А и 1Ь-17Р (или поотдельности или вместе), в лечении воспаления и воспалительных заболеваний, таких как псориаз, псориатический артрит, ревматоидный артрит, эндотоксинемия, ВБК, СРК, колит, астма, отторжение аллотрансплантата, иммунноопосредованные почечные болезни, гепатобилиарные болезни, рассеянный склероз, атеросклероз, поощрение роста опухоли, или дегенеративная болезнь суставов и другие воспалительные состояния, раскрытые здесь.

В пределах предпочтительных вариантов растворимый рецептор включает К-17КС (последовательность 8Еф ΙΌ N0:3) и мономер, гомодимер, гетеродимер или мультимер, который связывается с, блокирует, ингибирует, уменьшает, противодействует или нейтрализует Ι6-17Ε и 1Ь-17А (индивидуально или вместе) ш у1уо. Антитела и полипептиды, связывающиеся с таким мономером, гомодимером, гетеродимером или мультимерами 1Ь-17КС, также служат как антагонисты активности 16-17КС и как антагонисты 1Ь-17А и 1Ь-17Р (отдельно или вместе), как описано здесь.

В пределах других предпочтительных вариантов растворимый рецептор включает участки как Ι617КС, так и 16-17КА. Одним таким предпочтительным вариантом является вариант 1454 (последовательности 8Еф ΙΌ N0:157 и 158), который включает экзоны 1-6 человеческого 1Ь-17КА и 8-16 человеческого 1Ь-17КСх1, слитых с Рс5 (последовательности 8Еф ΙΌ N0:179 и 180). Вариант 1454 также имеет

- 42 015351 нативный сигнальный пептид из человеческого 1Ь-17КА. Рс10 или любой эквивалент, известный в технологии, может также использоваться вместо Рс5.

Кроме того, мы описали здесь, что оба, поликлональное и моноклональное, нейтрализующие антитела анти-1Ь-17Р связываются с, блокируют, ингибируют, уменьшают, противодействуют или нейтрализуют активность 1Ь-17Р и 1Ь-17А в клетке, основываясь на нейтрализационном анализе. Анализ тканевого распределения мРНК, соответствующей кДНК 1Ь-17КС, показал, что мРНК гена 1Ь-17КС сильно экспрессируется в щитовидной железе, надпочечнике, простате и тканях печени и экспрессируется в меньшей степени в сердце, тонкой кишке, желудке и тканях трахеи. В частности, 1Ь-17КС последовательно экспрессируется в не-Т клетках клеточных линий периферической крови, включая моноциты, В-клетки и клетки миелоидного происхождения. Кроме того, мРНК 1Ь-17КС надежно экспрессируется в клеточных линиях, полученных из кожи. Другие клеточные линии, которые экспрессируют 1Ь-17КС, являются всеми 5 из клеточных линий толстой кишки, которые присутствовали во множестве. Напротив, есть небольшая или нет никакой экспрессии в мозге, плаценте, легком, скелетной мышце, почке, поджелудочной железе, селезенке, тимусе, яичке, яичнике, ободочной кишке, лейкоцитах периферической крови, спинном мозге, лимфатическом узле и костном мозге. Лиганд, с которым связывается 1Ь-17КС (1Ь-17Р и (или) 1Ь-17А), вовлечен в стимулирование воспалительной реакции и вносит вклад в воспалительные заболевания, прежде всего через способность увеличивать продукцию воспалительных медиаторов, включая 1Ь-16, 1Ь-6 и ФНО-альфа, так же как тех медиаторов, которые вовлечены в пролиферацию, созревание и хемотаксис нейтрофилов (рассмотрено у νίΙονκΚί е! а1., Се11. Μοί. Ьйе 8с1, 61:567-579 [2004]).

Таким образом, определенные варианты по настоящему изобретению направлены на использование растворимых полипептидов 1Ь-17КС и 1Ь-17КС/1Ь-17КА в качестве антагонистов в воспалительных и иммунопатологических заболеваниях или состояниях, таких как псориаз, псориатический артрит, смещенный дерматит, воспалительные состояния кожи, ревматоидный артрит, ВБК, СРК, болезнь Крона, дивертикулез, астма, панкреатит, диабет 1 типа (ГООМ), панкреатический рак, панкреатит, болезнь Граве, рак ободочной кишки и кишечный рак, аутоиммунная болезнь, сепсис, трансплантат органа или костного мозга; воспаление из-за эндотоксемии, травмы, хирургия или инфекции; амилоидоз; спленомегалия; болезнь трансплантат против хозяина; и где желательно торможение воспаления, иммунное подавление, сокращение пролиферации кроветворных, иммунных, воспалительных или лимфоидных клеток, макрофагов, Т-лимфоцитов (включая клетки Т111 и Тй2), подавление иммунной реакции на патоген или антиген, или другие случаи, где торможение 1Ь-17Р и (или) 1Ь-17А желательно.

Кроме того, растворимые полипептиды 1Ь-17КС и 1Ь-17КС/1Ь-17КА полезны, чтобы:

(1) блокировать, ингибировать, уменьшать, противодействовать или нейтрализовать передачу сигналов через 1Ь-17КА или 1Ь-17КС в лечении острого воспаления, воспаления в результате травмы, раны ткани, хирургии, сепсиса или инфекции и хронических воспалительных болезней, таких как астма, воспалительная болезнь кишечника (ВБД), СРК, хронический колит, спленомегалия, ревматоидный артрит, рецидивные острые воспалительные эпизоды (например, туберкулез), и лечении амилоидоза, и атеросклерозе, болезни Кастльмана, астмы и других болезней, связанных с индукцией острофазных реакций;

(2) блокировать, ингибировать, уменьшать, противодействовать или нейтрализовать передачу сигналов 1Ь-17КА или 1Ь-17КС в лечении аутоиммунных болезней, таких как инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗД), рассеянный склероз (РС), системная красная волчанка (СКВ), миастения, ревматоидный артрит, ВБД и СРК, чтобы предотвратить или ингибировать передачу сигналов в иммунных клетках (например, лимфоцитах, моноцитах, лейкоцитах). Блокирование, ингибирование, уменьшение или противодействие передаче сигнала через 1Ь-17КС и (или) 1Ь-17КА, используя полипептиды по настоящему изобретению, может также промотировать болезни поджелудочной железы, почки, гипофиза и нейронных клеток. ИЗД, ИНСД, панкреатит и панкреатический рак могут получать преимущества. 1Ь-17КС и (или) 1Ь-17КА могут служить целью для лечения рака, где антагонист по настоящему изобретению ингибирует рост рака и предназначается для иммунноопосредованного лизиса (Ηο11ί^Γ Р. апб Ηοο^ι-ι^οΗ!, Н.: №1!иге Βίο^ΐι., 16: 1015-1016, 1998). Растворимые полипептиды по настоящему изобретению могут также быть полезными, чтобы лечить нефропатии, такие как гломерулосклероз, пленчатая невропатия, амилоидоз (который также влияет на почку среди других тканей), почечный артериосклероз, гломерулонефрит различного происхождения, фиброзно-пролиферативные болезни почки, так же как почечную дисфункцию, связанную с СКВ, ИЗД, диабетом ΙΙ типа (ИНСД), почечными опухолями и другими болезнями;

(3) агонизировать, усиливать, увеличивать или инициировать передачу сигналов через 1Ь-17КА или 1Ь-17КС в лечении аутоиммунных болезней, таких как ИЗД, РС, СКВ, миастения, ревматоидный артрит, СРК и ВБК. Растворимые полипептиды по настоящему изобретению могут сигнализировать лимфоцитам или другим иммунным клеткам, чтобы дифференцировать, изменять пролиферацию или изменять продукцию цитокинов или белков поверхности клетки, которые повышают качество аутоиммунитета. Конкретно, модуляция реакции клетки Т-хелпера к дополнительной структуры секреции цитокина может отклонять аутоиммунную реакцию, чтобы улучшить течение болезни (8ιηί11ι 1А е! а1., 1. Iттиηοί., 160:4841-4849, 1998). Точно так же агонистические растворимые полипептиды могут использоваться, чтобы передавать сигнал, уничтожать и отклонять иммунные клетки, вовлеченные в астму, аллергию и

- 43 015351 атопические болезни. Передача сигналов через Ш-ПЕС и (или) ΙΕ-17ΚΑ может также принести пользу при болезни поджелудочной железы, почки, гипофиза и нейронных клеток. ИЗД, ИНСД, панкреатит и панкреатический рак могут извлечь выгоду.

Растворимые полипептиды Щ-ПЕС или ΙΓ-17ΕΕ/ΙΓ-17ΕΑ. описанные здесь, могут использоваться, чтобы связать, блокировать, ингибировать, уменьшать, противодействовать или нейтрализовать активность ΙΕ-17Ε или ΙΚ-17А, по отдельности или вместе, в лечении аутоиммунной болезни, атопической болезни, ИНСД, панкреатита и почечной дисфункции, как описано выше. Растворимая форма 1Е-17КС или Ш-ПЕС/Ш-ПЕЛ может использоваться, чтобы промотировать реакцию антител, опосредованную Т-клетками, и (или) промотировать продукцию ΙΕ-4 или других цитокинов лимфоцитами или другими иммунными клетками.

Растворимые полипептиды по настоящему изобретению полезны как антагонисты ΙΕ-17Α и (или) ΙΕ-17Ε. Такие антагонистические эффекты могут быть достигнуты прямой нейтрализацией или связыванием ΙΕ-17Α или ΙΕ-17Ε. В дополнение к антагонистическому использованию растворимые рецепторы по настоящему изобретению могут связывать ΙΕ-17Ε или ΙΕ-17Α и действовать как белки-носители для лиганда, чтобы транспортировать его к различным тканям, органам и клеткам в пределах тела. Также растворимые рецепторы по настоящему изобретению могут быть слиты или соединены с молекулами, полипептидами или химическим компонентами, которые направляют растворимый комплекс лигандрецептор к определенному месту, такому как ткань, определенная иммунная клетка или опухоль. Например, при острой инфекции или некоторых раках польза может следовать из индукции воспаления и белков местных острых фазовых реакций под действием ΙΕ-17Ε. Таким образом, растворимые рецепторы по настоящему изобретению могут применяться, чтобы специфично направлять действие ГО-17А или ΙΕ-17Ε; см. Соктап, Ό. Су!окше, 5: 95-106, 1993; и Еетапбех-Войап, К., Ехр. 0ρίη. Iηνе8ΐ. Игидк. 9:497513, 2000.

Воспаление представляет собой защитную реакцию организма, чтобы отразить вторгшееся средство. Воспаление - каскадное событие, которое включает много клеточных и гуморальных медиаторов. С одной стороны, подавление воспалительных реакций может нанести вред иммунитету организмахозяина; однако, если оставлено без контроля, воспаление может привести к серьезным осложнениям, включая хронические воспалительные болезни (например, псориаз, артрит, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, воспалительная болезнь кишечника и т.п.), септический шок и полиорганная недостаточность. Важно, что эти разнообразные болезненные состояния имеют общие воспалительные медиаторы. Коллективные болезни, которые характеризуются воспалением, оказывают большое влияние на человеческую заболеваемость и летальность. Поэтому ясно, что противовоспалительные белки, такие как растворимые полипептиды по настоящему изобретению, могли бы иметь критический терапевтический потенциал для обширного количества заболеваний человека и животных, от астмы и аллергии до аутоиммунитета и септического шока.

1. Артрит.

Артрит, включая остеоартрит, ревматоидный артрит, артритические суставы в результате раны и т.п., является общим воспалительным состоянием, которому было бы полезно терапевтическое применение противовоспалительных белков, таких как растворимые полипептиды по настоящему изобретению. Например, ревматоидный артрит (РА) является системным заболеванием, которое повреждает все тело и является одной из самых общих форм артрита. Оно характеризуется воспалением мембраны, выстилающей сустав, что вызывает боль, неподвижность, жар, красноту и набухание. Воспалительные клетки выделяют ферменты, которые могут расщеплять кости и хрящи. В результате ревматоидного артрита воспаленная выстилка сустава, синовиальная оболочка, может вторгаться и повреждать кости и хрящи, приводя к разрушению сустава и сильной боли среди других физиологических эффектов. Пораженный сустав может терять свою форму и выравнивание, что приводит к боли и потере подвижности.

Ревматоидный артрит (РА) является иммунно-опосредованной болезнью, в частности, охарактеризованной воспалением и последующим повреждением ткани, приводящими к тяжелой инвалидности и повышенной летальности. Много цитокинов производятся локально в ревматоидных суставах. Многочисленные исследования продемонстрировали, что ЕС-1 и ТИЕ-альфа, два прототипических провоспалительных цитокина, играют важную роль в механизмах, вовлеченных в синовиальное воспаление и в прогрессирующее разрушение суставов. Действительно, назначение ингибиторов Т№-альфа и ЕС-1 больным РА приводило к резкому улучшению клинических и биологических симптомов воспаления и снижению радиологических симптомов эрозии кости и деструкции хряща. Однако несмотря на эти ободряющие результаты, значительный процент больных не реагирует на эти средства, что позволяет предполагать, что другие медиаторы также вовлечены в патофизиологию артрита (СаЬау, Ехрей. 0ρίη. Вю1. Тйег., 2 (2): 135-149, 2002). Одним из этих медиаторов могут быть ΙΕ-17Α или ΙΕ-17Ρ, а также молекула, которая связывает или ингибирует активность ΙΕ-17Ρ или ΙΕ-17Α, такая как растворимый Ш-ПЕС или ΙΡ-17Εί.7ΙΡ17ΚΑ, может служить ценным терапевтическим средством, чтобы уменьшать воспаление в ревматоидном артрите и других артритических заболеваниях.

Есть несколько животных-моделей ревматоидного артрита, известных в технологии. Например, в модели коллагениндуцированного артрита (КИА) у мышей развивается хронический воспалительный

- 44 015351 артрит, который близко напоминает человеческий ревматоидный артрит. Так как КИА имеет подобные иммунологические и патологические особенности с РА, это делает его идеальной моделью для скрининга потенциальных человеческих противовоспалительных соединений. Модель КИА является известной моделью в мышах, которая зависит как от иммунной реакции, так и от воспалительной реакции, чтобы иметь место. Иммунная реакция включает взаимодействие В-клеток и 0Ό4+ Т-клеток в ответ на коллаген, который задан как антиген, и приводит к продукции антиколлагеновых антител. Воспалительная фаза представляет собой результат тканевых реакций от медиаторов воспаления, как следствие некоторых из этих антител, перекрестно-реагирующих с нативным мышиным коллагеном и активирующих каскад комплемента. Преимущество в использовании модели КИА состоит в том, что основные механизмы патогенеза известны. Соответствующие эпитопы Т-клеток и В-клеток на коллагене типа 11 идентифицированы и различные иммунологические (например, повышенная чувствительность отложенного типа и антитело антиколлагена) и воспалительные (например, цитокины, хемокины и матрикс-разрушающиеся ферменты) параметры, касающиеся иммунно-опоседованного артрита, были определены и могут, таким образом, использоваться, чтобы оценить эффективность испытанных соединений в модели КИА (\Уоо1еу, Сигг. 0рт. Кйеит. 3:407-20, 1999; ^1Шатк е! а1., 1ттипо1., 89:9784-788, 1992; Муегк е! а1., ЫГе δα., 61:1861-78, 1997; и \\ апу е! а1., 1ттипо1., 92:8955-959, 1995).

Одна группа показала, что антимышиное антитело 1Ь-17 уменьшает симптомы в мышиной модели КИА относительно мышей контроля, таким образом, показывая концептуально, что растворимые полипептиды по настоящему изобретению были бы полезны в лечении человеческой болезни. Назначение единственной мышино-1Ь-17-специфической крысиной антисыворотки уменьшало симптомы артрита в животных, когда вводилась профилактически, или после того, как симптомы артрита уже присутствовали в модели (ЪиЬЬейк е! а1., АпНгШк Кйеит., 50:650-9, 2004). Поэтому 1Ь-17КС-Рс или 1Ь-17КС/1Ь-17КАРс может использоваться, чтобы нейтрализовать 1Ь-17А и (или) 1Ь-17Р в лечении определенных человеческих болезней, таких как артрит, псориаз, псориатический артрит, эндотоксинэмия, воспалительная болезнь кишечника (ВБД), СРК, колит, и других воспалительных состояний, раскрытых здесь.

Назначение растворимых полипептидов по настоящему изобретению, таких как 1Ь-17КС-РС или другой 1Ь-17КС/1Ь-17КА растворимый и слитый белки, КИА-модельным мышам применяют, чтобы оценить их использование как антагонистов к 1Ь-17Р и 1Ь-17А, чтобы улучшить симптомы и изменить течение болезни. Кроме того, результаты, показывающие ингибирование или нейтрализацию 1Ь-17Р и (или) 1Ь-17А растворимыми полипептидами по настоящему изобретению, обеспечили бы доказательство концепта, что другие антагонисты 1Ь-17А или 1Ь-17Р могут также использоваться, чтобы улучшить симптомы и изменить течение болезни. Кроме того, так как 1Ь-17А и (или) 1Ь-17Р вызывает продукцию 1Ь-1Ь и ФНО-альфа, оба которые вовлечены в патогенез и прогресс ревматоидного артрита, системное или местное введение этих растворимых полипептидов могут потенциально подавить воспалительную реакцию в РА. Посредством примера и без ограничения, инъекция 10-200 мкг 1Ь-17КС-РС на мышь (один - семь раз в неделю в течение до 4 недель, но не ограничиваясь этим, подкожным, внутриперитонеальным или внутримышечным путем введения) может значительно уменьшить показатели болезни (параметр лапы, случай воспаления или болезнь). В зависимости от инициирования введения 1Ь-17КС-РС (например, до или во время коллагеновой иммунизации, или в любых временных точках после второй коллагеновой иммунизации, включая те временные точки, в которых болезнь уже прогрессировала), 1Ь-17КС может быть эффективным в предотвращении ревматоидного артрита, так же как в предотвращении его развития. Другие потенциальные терапевтические средства включают полипептиды 1Ь-17КС/1Ь-17КА и т.п.

2. Эндотоксемия.

Наличие в крови эндотоксинов (эндотоксемия) - тяжелое состояние, обычно возникающее от возбудителей инфекции, таких как бактерии, и других средств инфекционных заболеваний, сепсиса, синдрома токсического шока, или в больных с поврежденным иммунитетом, подвергнутых условно-патогенным инфекциям, и т.п. Терапевтически полезные из противовоспалительных белков, таких как растворимые полипептиды по настоящему изобретению, могли бы помочь в предотвращении и лечении эндотоксемии у людей и животных. Эти растворимые полипептиды могли бы служить ценными терапевтическими средствами, чтобы уменьшать воспаление и патологические эффекты в эндотоксемии.

Липополисахарид(ЛПС)-индуцированная эндотоксемия затрагивает многие из провоспалительных медиаторов, которые оказывают патологические эффекты в инфекционных заболеваниях, и ЛПСиндуцированная эндотоксемия в грызунах является широко используемой и приемлемой моделью для изучения фармакологических эффектов потенциальных провоспалительных или иммуномодулирующих средств. ЛПС, произведенный в грамотрицательных бактериях, является главным возбудителем в патогенезе септического шока (С1аикпег е! а1., Ьапсе!, 338:732, 1991). Шокоподобное состояние может действительно быть вызвано экспериментально единственной инъекцией ЛПС животным. Молекулы, произведенные клетками, отвечающими на ЛПС, могут предназначаться для болезнетворных организмов прямо или косвенно. Хотя эти биологические реакции защищают организм-хозяин от вторгшихся болезнетворных организмов, они могут также вызвать вред. Таким образом, массивное возбуждение врожденного иммунитета, имеющее место в результате тяжелой грамотрицательной бактериальной инфекции, приводит к избыточной продукции цитокинов и других молекул и развитию фатального синдрома, синдрома

- 45 015351 септического шока, который характеризуется лихорадкой, гипотензией, диссеминированной внутрисосудистой коагуляцией и полиорганной недостаточностью (ΌιιιηίΙπι е! а1., Се11, 103:1071-1083, 2000).

Эти токсичные эффекты ЛПС, главным образом, относятся к макрофагальной активации, приводящей к выделению многочисленных воспалительных медиаторов. Среди этих медиаторов ФНО, кажется, играет критическую роль, как указывается профилактикой токсичности ЛПС введением нейтрализирующих антител анти-ФНО (ВеиЙег е! а1., 8аепсе, 229:869, 1985). Хорошо установлено, что инъекция ЛПС Е.сой мышам С57В1/6 будет приводить к значительной циркуляции 1Ь-6, ЮТ-альфа, 1Ь-1 и белков острой фазы (например, 8АА), приблизительно 2 ч после инъекции. Токсичность ЛПС, кажется, опосредуется этими цитокинами, поскольку пассивная иммунизация против этих медиаторов может приводить к пониженной летальности (ВеиЙег е! а1., 8аепсе, 229:869, 1985). Потенциал стратегии иммуноинтервенции для профилактики и (или) лечения септического шока включает анти-ФНО тАЬ, антагонист рецептора 1Ь-1, ЫЕ, 1Ь-10 и ГКСФ.

Введение растворимых полипептидов по настоящему изобретению (пациентам) ЛПСиндуцированной модели может быть использовано, чтобы оценить применение 1Ь-17ВС или 1Ь-17ВС/1Ь17ВА, чтобы улучшить симптомы и течение ЛПС-индуцированной болезни. Кроме того, результаты, показывающие ингибирование 1Ь-17Е или 1Ь-17А этими растворимыми полипептидами, обеспечили бы доказательство концепта, что другие такие антагонисты могут также использоваться, чтобы улучшить симптомы ЛПС-индуцированной модели и изменять течение болезни. Модель покажет индукцию 1Ь-17Е инъекцией ЛПС и потенциальное лечение болезни растворимыми полипептидами. Так как ЛПС вызывает продукцию провоспалительных факторов, возможно вносящих вклад в патологию эндотоксемии, нейтрализацию активности 1Ь-17Е или других провоспалительных факторов антагонистом, растворимый полипептид может применяться, чтобы уменьшать симптомы эндотоксемии, такой как отмечена в эндотоксическом шоке.

3. Воспалительная болезнь кишечника (ВБК).

В Соединенных Штатах приблизительно 500000 человек страдают от воспалительной болезни кишечника (ВБК), которая может влиять на либо ободочную кишку и прямую кишку (неспецифический язвенный колит ЯК), либо на обе, тонкую и толстую кишки (болезнь Крона). Патогенез этих болезней неясен, но они включают хроническое воспаление поврежденных тканей. Растворимые полипептиды по настоящему изобретению могли бы служить ценным терапевтическим средством, чтобы уменьшить воспаление и патологические эффекты при ВБК, ЯК и близких заболеваниях.

Неспецифический язвенный колит (ЯК) является воспалительной болезнью толстой кишки, обычно называемой ободочной кишкой (колон), характеризующейся воспалением и образованием язв слизистой оболочки или самой внутренней выстилки ободочной кишки. Это воспаление заставляет ободочную кишку часто пустеть, приводя к диарее. Симптомы включают послабление кишечника и ассоциированные абдоминальные схватки, лихорадку и потерю веса. Хотя точная причина ЯК неизвестна, недавнее исследование предполагает, что естественная защита организма действует против белков в теле, которые организм считает чужеродными (аутоиммунная реакция). Возможно, потому что они напоминают бактериальные белки в кишке, эти белки могут или спровоцировать, или стимулировать воспалительный процесс, который начинает разрушать выстилку ободочной кишки. Поскольку выстилка ободочной кишки разрушается, язвы выделяют слизь, гной и кровь. Болезнь обычно начинается в ректальной области и может, в конечном счете, распространяться на всю толстую кишку. Повторные эпизоды воспаления приводят к утолщению стен (толстой) кишки и прямой кишки рубцовой тканью. Омертвление ткани ободочной кишки или сепсис может встречаться при тяжелой болезни. Симптомы неспецифического язвенного колита изменяются по серьезности, их начало может быть постепенным или внезапным. Приступы могут быть вызваны многими факторами, включая инфекцию дыхательных путей или стресс.

Хотя в настоящее время нет доступного лечения ЯК, лечение сосредоточено на подавлении патологического воспалительного процесса в выстилке ободочной кишки. Лечение, включающее кортикостероиды, иммунодепрессанты (например, азатиопурин (имуран), меркаптопурин и метотрексат) и аминосалицилаты, доступно для лечения болезни. Однако отдаленное использование иммунодепрессантов, таких как кортикостероиды и азатиопурин (имуран), может закончиться серьезными побочными эффектами, включая утоньшение костей, катаракту, инфекции и эффекты костного мозга и печени. Для больных, у которых текущие методы лечения не успешны, выбор - хирургия. Хирургия включает удаление всей ободочной кишки и прямой кишки.

Есть несколько животных-моделей, которые могут частично воспроизводить хронический неспецифический язвенный колит. Наиболее широко используемой моделью является модель колита, вызванная средством 2,4,6-тринитробензолсульфоновая кислота/этанол (ТНБС), которое вызывает хроническое воспаление и образование язв в ободочной кишке. Когда ТНБС вводят в ободочную кишку восприимчивых мышей через внутриректальную инстилляцию, это вызывает иммунную реакцию, опосредованную Т-клетками, в слизистой оболочке ободочной и толстой кишок, в этом случае приводя к массивному воспалению слизистой оболочки, характеризущемуся плотной инфильтрацией Т-клеток и макрофагов по всей стенке толстой кишки. Кроме того, эта гистопатологическая картина сопровождается клинической картиной: прогрессирующая потеря веса (истощение), кровавая диарея, ректальный пролапс и утолщение

- 46 015351 стенок толстой кишки (№игаШ е! а1., бПегп. Реу. Iшшиπο1., 19:51-62, 2000).

Другая модель колита использует натрийдекстрансульфат (НДС), который вызывает острый колит, проявляющийся кровавой диареей, потерей веса, укорачиванием ободочной кишки и изъязвлением слизистой с инфильтрацией нейтрофила. НДС-вызванный колит характеризуется гистологически инфильтрацией воспалительных клеток в тонкий слой пластинки с лимфоидной гиперплазией, очаговым повреждением крипты и изъязвлением эпителия. Эти изменения, как думают, развиваются из-за токсического влияния НДС на эпителий и фагоцитоз клеток тонкого слоя пластинки и продукцию ФНО-альфа и интерферон-гамма (ШЫ-гамма). Несмотря на его обычное использование, несколько проблем, касающихся механизмов значимости НДС для человеческой болезни, остаются нерешенными. НДС рассматривается как модель, независимая от Т-клеток, потому что она наблюдается у животных с дефицитом Т-клеток, таких как мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (8СШ).

Введение растворимых полипептидов по настоящему изобретению этим моделям ТНБС и НДС может использоваться, чтобы оценить их применение для улучшения симптомов и изменения течения желудочно-кишечного заболевания. Кроме того, результаты, показывающие ингибирование или нейтрализацию 66-17Р и (или) 66-17А этими растворимыми полипептидами, обеспечивают доказательство концепта, что они (или подобные молекулы) могут также использоваться, чтобы улучшать симптомы в моделях колит/ВБК и изменять течение болезни.

4. Псориаз.

Псориаз - хроническое состояние кожи, которое поражает больше 7 млн американцев. Псориаз встречается, когда новые клетки кожи растут неправильно, приводя к воспаленным, раздутым и чешуйчатым пятнам кожи, где старая кожа не исчезает достаточно быстро. Пятнистый псориаз, самая общая форма, характеризуется воспаленными пятнами кожи (поражения), завершающимися серебристыми белыми чешуйками. Псориаз может ограничиваться несколькими пятнами или включать зоны кожи от умеренных до обширных, появляясь обычно на скальпе, коленях, локтях и туловище. Хотя псориаз очень заметен, он не инфекционная болезнь. Патогенез болезней включает хроническое воспаление поврежденных тканей. Растворимые полипептиды по настоящему изобретению могли бы служить ценными терапевтическими средствами, чтобы уменьшить воспаление и патологические эффекты в псориазе, других воспалительных кожных заболеваниях, аллергиях кожи и слизистой оболочки, и близких болезнях.

Псориаз является воспалительным нарушением кожи, опосредованным Т-клетками, которое может вызвать значительный дискомфорт. Псориаз - болезнь, для которой нет лечения, поражает людей всех возрастов. Псориаз поражает приблизительно 2% населения Европы и Северной Америки. Хотя люди с умеренным псориазом могут часто управлять своей болезнью местными средствами, больше чем 1 млн пациентов во всем мире нуждается в ультрафиолетовой или системной иммуносупрессивной терапии. К сожалению, неудобство и риски ультрафиолетового излучения и токсичность многих методов лечения ограничивают их долговременное использование. Кроме того, пациенты обычно имеют рецидив псориаза, и в некоторых случаях возвращение болезни, вскоре после остановки иммуносупрессивной терапии.

Растворимые полипептиды настоящего изобретения могут также использоваться в пределах диагностических систем для обнаружения уровней циркуляции 66-17Р или Г6-17А и в обнаружении Г6-17Р или ГЬ-17А, связанных с острой фазовой воспалительной реакцией. В пределах близкого варианта растворимые полипептиды по настоящему изобретению могут использоваться, чтобы обнаружить циркуляцию или локально-действующие полипептиды 66-17Р или 66-17А. Увеличенные или подавленные уровни лиганда или рецепторных полипептидов могут указывать на патологические состояния, включая воспаление или рак. 66-17Р, как известно, вызывает ассоциированную острую фазовую воспалительную реакцию. Кроме того, обнаружение острофазовых белков или молекул, таких как 66-17А или 66-17Р, может указывать на хроническое воспалительное состояние в определенных болезненных состояниях (например, астма, псориаз, ревматоидный артрит, колит, ВБК, СРК). Обнаружение таких состояний служит, чтобы помочь в диагнозе болезни, а также помочь врачу в выборе подходящей терапии.

В дополнение к другим моделям болезни, описанным здесь, активность растворимых полипептидов по настоящему изобретению на воспалительной ткани, полученной из человеческих псориатических поражений, может быть измерена, 1п у1уо используя мышиную модель с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (8СШ). Несколько мышиных моделей были развиты, в который человеческие клетки имплантируют иммунодефицитным мышам (все вместе называется модель ксенотрансплантата); см., например, Сайап АР. апб Эоид1ак Е., беик. Рек., 18:513-22, 1994 и Р1ауе11, Ό1., Нета!о1одюа1 0псо1оду, 14:67-82, 1996. Так же как в т у1уо модели ксенотрансплантата для псориаза человеческую псориатическую кожную ткань имплантируют в мышиную модель 8СШ и стимулируют адекватным антагонистом. Кроме того, другие животные модели псориаза в технологии могут использоваться, чтобы оценить антагонисты 66-17А и ΙΛ-17Р, такие как человеческие псориатические кожные трансплантаты, имплантированные в мышиную модель АСР129 и стимулированные адекватным антагонистом (например, см., Воутап, О. е! а1., ί. Εxρ. Меб. Онлайн публикация #20031482, 2004, включенная здесь ссылкой). Растворимые полипептиды по настоящему изобретению, которые связывают, блокируют, ингибируют, уменьшают, противодействуют или нейтрализуют активность 66-17Р, или как Г6-17А, так и Г6-17Р, являются предпочтительными антагонистами, так же как другие антагонисты 66-17А и 66-17Р могут применяться в

- 47 015351 этой модели. Точно так же ткани или клетки, полученные из человеческого колита, ВБК, СРК, артрита или других воспалительных поражений, могут использоваться в модели 8СГО, чтобы оценить противовоспалительные свойства антагонистов ЕЕ-17А и ЕЕ-17Е, описанных здесь.

Методы лечения, разработанные, чтобы отменить, задержать или уменьшать воспаление, используя растворимые полипептиды по настоящему изобретению, могут быть проверены введением (полипептидов) мышам 8СГО, несущим человеческую воспалительную ткань (например, псориатические поражения и т. п.), или другим моделям, описанным здесь. Эффективность лечения измеряют и статистически оценивают как увеличенный противовоспалительный эффект в пределах леченой популяции в течение долгого времени, используя методы, известные в технологии. Некоторые типичные методы включают, но не ограничиваются ими, измерение, например, в модели псориаза, эпидермальной толщины, количества воспалительных клеток в верхней дерме и степени паракератоза. Такие методы известны в технологии и описаны здесь. Например, см. 2е1д1ег, М. еГ а1., ЬаЬ. IηνекГ., 81:1253, 2001; 2о11пег, Т. М. еГ а1., I. С1т. IηνекГ., 109:671, 2002; Υатаηака, N. еГ а1., МютоЬю1. Iттиηо1. 45:507, 2001; КаусНаибНшг, 8. Р. еГ а1., Вг. I. ОегтаЮк 144:931, 2001; ВоеНпске, У. Н. еГ а1., АгсН. ОегтаЮ1. Кек. 291:104, 1999; ВоеНпске, У. Н. еГ а1., I. Птуек!. ОегтаГо1., 116:596, 2001; №ско1оГГ, В. I. еГ а1., Ат. I. РаГОо1., 146:580, 1995; ВоеНпске, У. Н. еГ а1., I. СиГап. РаГОо1., 24:1, 1997; 8ида1, I. М. еГ а1., I. ОегтаЮ1. 8сЕ, 17:85, 1998; и УШабкеп Ь.8. еГ а1., I. С1ш. Шуей. 112:1571, 2003. Воспаление может также быть проверено в течение долгого времени, используя известные методы, такие как поточная цитометрия (или ПЦР), чтобы количественно определить число воспалительных или пораженных клеток, присутствующих в образце, показатели болезни (потеря веса, диарея, кровотечение из прямой кишки, длина ободочной кишки) для ВБК, показатель болезни лапы и показатель воспаления для модели КИА РА. Например, терапевтические стратегии, адекватные тестированию в такой модели, включают прямое лечение, используя растворимые ГО-17КС или I^-17КС/I^17КА, или другие антагонисты ГО-17А и ГО-17Е (поотдельности или вместе), или близкие конъюгаты или антагонисты, основанные на разрушающем взаимодействии ГО-17КС и (или) ГО-17КА с соответствующими лигандами.

Псориаз является хроническим воспалительным кожным заболеванием, которое связано с гиперпластическими эпидермальными кератиноцитами и инфильтрацией в мононуклеарные клетки, включающем СЭ4+ Т-клетки памяти, нейтрофилы и макрофаги (СНлкГорНетк, ГОГ. АгсН. А11егду Iттиηо1., 110:199, 1996). В настоящее время полагают, что природные антигены играют значительную роль в инициировании и внесении вклада в патологию болезни. Однако это - потеря толерантности к аутоантигенам, которая, как думают, опосредует патологию псориаза. Дендритные клетки и ΟΩ4' Т-клетки, как думают, играют важную роль в представлении и узнавании антигена, который опосредует иммунную реакцию, приводящую к патологии. Мы недавно развили модель псориаза, основанного на модели передачи С’О4+С’О45ВВ (ЭауепроП еГ а1., ГОГетаГ. IттиηорНа^тасо1., 2:653-672). Растворимые полипептиды по настоящему изобретению вводят мышам. Ингибирование показателей болезни (поражения кожи, воспалительные цитокины) указывает на эффективность растворимых полипептидов в (лечении) псориаза.

5. Атопический дерматит.

Атопический дерматит (АД) является общим хроническим воспалительным заболеванием, которое характеризуется гиперактивированными цитокинами субпопуляции 2 клеток Т-хелпера (ТН2). Хотя точная этиология АД неизвестна, множественные факторы были вовлечены, включая гиперактивные иммунные реакции ТН2, аутоиммунитет, инфекцию, аллергены и генетическое предрасположение. Главные особенности болезни включают ксероз (сухость кожи), зуд (зуд кожи), конъюнктивит, воспалительные поражения кожи, инфекцию 81арНу1ососсик аигеик, увеличенную эозинофилию крови, увеличение сывороточного ^Е и и хронический дерматит Т-клеткой, тучной клеткой, макрофагом и инфильтрацией эозинофила. Колонизация или инфекция 8. аигеик, как было признано, усиливает АД и сохраняет хроническое состояние этого кожного заболевания.

АД часто находят у больных астмой и аллергическим ринитом, АД часто является начальным проявлением аллергической болезни. Приблизительно 20% населения в Западных странах страдают от этих аллергических болезней, и сфера действия АД в развитых странах повышается по неизвестным причинам. АД обычно начинается в детстве и может часто сохраняться через пубертатный период во взрослом состоянии. Текущее лечение АД включает местные кортикостероиды, пероральный циклоспорин А, некортикостероидные иммунодепрессанты, такие как такролимус (ЕК506 в форме мази) и гаммаинтерферон. Несмотря на разнообразие лечения АД, симптомы многих пациентов не улучшаются, или у них есть побочные реакции на лекарства, что требует поиска других, более эффективных терапевтических средств. Растворимые полипептиды по настоящему изобретению могут использоваться, чтобы нейтрализовать ГО-17Е и ГО-17А в лечении определенных человеческих болезней, таких как атопический дерматит, воспалительные состояния кожи, и другие воспалительные состояния, раскрытые здесь.

6. Астма.

ГО-17 играет важную роль в вызванной аллергеном активации Т-клеток и нейтрофильном притоке в дыхательных путях. Рецептор ГО-17 экспрессируется в дыхательных путях ^ао, еГ а1., Iттишίу, 3:811 (1995)), а рекрутмент нейтрофила, опосредованного ГО-17, в аллергической астме в значительной степени индуцируется хемоаттрактантом ГО-8, СК0 и макрофагальный воспалительный белок-2 (МВБ-2, МГР-2),

- 48 015351 произведенный 1Ь-17, стимулировал человеческие бронхиальные эпителиальные клетки (ЧБЭК, НВЕС) и человеческие бронхиальные фибробласты (Уао, е! а1., 1. 1ттипо1., 155:5483 (1995)); Мо1е!, е! а1., 1. А11егду С1ш. 1ттипо1., 108:430 (2001)). 1Ь-17 также стимулирует ЧБЭК к выделению 1Ь-6, нейтрофилактивирующего фактора (Рокыех, е! а1., 1. Ехр. Меб., 183:2593 (1996), и Ьшбеп е! а1., 1п!. АгсЬ. А11егду 1ттипо1., 126:179 (2001)) и, как показано, является синергистом с ФНО-альфа, чтобы продлить выживание человеческих нейтрофилов ш νί!ΐΌ (Ьаап, е! а1., Еиг. Ве^ри. 1., 21:387 (2003)). Кроме того, 1Ь-17 способен усиливать воспалительные реакции в астме своей способностью увеличивать секрецию цитокинов, вовлеченных в реконструкцию дыхательных путей, таких как профибротические цитокины, 1Ь-6 и 1Ь-11 и воспалительные медиаторы: колониестимулирующий фактор гранулоцитов (ГКСФ) и колониестимулирующий фактор макрофагов-гранулоцитов (ГМ-КСФ) (Мо1е!, е! а1. 1. А11егду С1ш. 1ттипо1., 108:430 (2001)).

Клинические симптомы показывают, что острые, тяжелые обострения астмы связаны с рекрутментом и активацией нейтрофилов в дыхательных путях, таким образом, 1Ь-17, вероятно, играет значительную роль в астме. Пациенты с умеренной астмой показывают поддающееся обнаружению увеличение местной концентрации свободного, растворимого белка 1Ь-17А (Мо1е! е! а1., 1. А11егду С1ш. 1ттипо1., 108:430 (2001)), в то время как здоровые человеческие добровольцы с вызванным, тяжелым воспалением дыхательных путей из-за воздействия стойлового содержания свиней показывают явное увеличение концентрации свободного, растворимого белка 1Ь-17А в бронхоальвеолярном пространстве (Рокиех, е! а1., 1. Ехр. Меб., 183:2593 (1996), и Ьшбеп е! а1., 1п!. АгсЬ. А11егду 1ттипо1., 126:179 (2001)). Кроме того, уровни 1Ь-17 в мокроте коррелировали с уровнем 1Ь-17 у людей, которые имели повышенную гиперреактивность дыхательных путей: Вагсхук е! а1., Векрш Меб., 97:726 (2003).

В животных моделях гиперреактивности дыхательных путей хроническая ингаляция яичного белка чувствительными мышами приводила к бронхиальному эозинофильному воспалению и ранней индукции экспрессии мРНК 1Ь-17 в воспаленной ткани легкого, вместе с бронхиальной нейтрофилией: НеШпдк, е! а1. Ат. 1. Векрш Се11 Мо1. Вю1., 28:42 (2003). Моноклональные антитела анти-1Ь-17 сильно уменьшали бронхиальный нейтрофильный приток, но значительно увеличили уровни 1Ь-5 как в бронхоальвеолярной промывной жидкости, так и в сыворотке и ухудшали вызванный аллергеном бронхиальный эозинофильный приток, предполагая, что 1Ь-17А может быть вовлечен в определение баланса между накоплением нейтрофилов и эозинофилов после повреждения антигена 1б.

Среди членов семейства 1Ь-17 1Ь-17Р наиболее близок к 1Ь-17А. Биологические активности, опосредованные 1Ь-17Р, подобны таковым от 1Ь-17А, так как 1Ь-17Р стимулирует продукцию 1Ь-6, 1Ь-8 и ГКСФ, Ншь! е! а1., 1. 1ттипо1., 169:443 (2002). 1Ь-17Р также вызывает продукцию 1Ь-2, трансформирующего фактора роста (ТФР-бета) и моноцитарного хемоаттрактантного белка (МХБ) в эндотелиальных клетках: 81агпе5, е! а1., 1. 1ттипо1., 167:4137 (2001). Точно также аллергизация может увеличить локальный 1Ь-17Р у больных аллергической астмой: Ка^адисЫ, е! а1., 1. 1ттипо1., 167:4430 (2001). Генная поставка 1Ь-17Р в мышином легком увеличивает нейтрофилы в бронхоальвеолярном пространстве, в то время как передача гена 1Ь-17Р в слизистой оболочке увеличивает уровни Ад-индуцированной легочной нейтрофилии и реактивности дыхательных путей к метахолину: 0ба, е! а1., Ат. 1. Векрш Сп!. Саге Меб., 171:12 (2005).

Кроме астмы, несколько хронических воспалительных болезней дыхательных путей характеризуются рекрутментом нейтрофилов в дыхательных путях, и 1Ь-17, как сообщали, играет важную роль в патогенезе дыхательных состояний, таких как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), бактериальная пневмония и кистозный фиброз (Ьшбеп, е! а1., Еиг. Векрш 1., 15:973 (2000), Уе, е! а1., Ат. 1. Ве8р1г. Се11 Мо1. Вю1., 25:335 (2001), ВаЬтап, е! а1., С1ш. 1ттипо1., 115:268 (2005)). Терапевтическая молекула анти-1Ь-17А и (или) анти-1Ь-17Р, как может быть продемонстрировано, является эффективной для хронической воспалительной болезни дыхательных путей в ш νί!ΐΌ модели воспаления. Способность антагонистов активности 1Ь-17Р и (или) 1Ь-17А, таких как растворимые рецепторы 1Б-17ВС и антитела к ним, включая моноклональные и нейтрализующие антитела античеловеческий 1Ь-17ВС по настоящему изобретению, ингибировать продукцию цитокина и хемокина, индуцированную 1Ь-17А или и (или) 1Ь17Р, из культивируемых ЧБЭК или бронхиальных фибробластов может использоваться как мера эффективности таких антагонистов в предотвращении продукции воспалительных медиаторов, непосредственно возникающих из стимулирования 1Ь-17А и (или) Р. Если добавление антагонистов активности 1Ь-17Р и (или) 1Ь-17А, таких как растворимые полипептиды по настоящему изобретению, заметно уменьшает продукцию и экспрессию воспалительных медиаторов, то это, как ожидалось, будет эффективно в воспалительных аспектах, связанных с хроническим воспалением дыхательных путей.

7. Синдром раздражительного кишечника (СРК, 1В8).

Раздражительный синдром кишечника представляет болезнь, характеризующуюся болью в животе или дискомфортом и непостоянным поведением кишечника. Больные СРК могут характеризоваться тремя главными группами, основанными на поведении кишечника: группа с преобладанием жидкого или частого стула, группа с преобладанием твердого или нечастого стула и группа с переменным или нормальным стулом (Та11еу е! а1., 2002). Переменная кишечная моторика, расстройства эпителиальной функции, патологический переход стула и газа и напряжения могут способствовать симптомам, в то вре

- 49 015351 мя как висцеральная гиперчувствительность является главной особенностью большинства больных. Генетические факторы, влияющие на передачу болевых сигналов и нарушение в центральной обработке афферентных сигналов, как постулируется, предрасполагают людей к СРК после определенных экологических воздействий. Исследования также продемонстрировали, что воспалительные реакции в ободочной кишке могут способствовать увеличенной чувствительности гладкомышечных и тонкокишечных нервов и, следовательно, нарушать сенсорно-моторные функции в кишечнике (СоШпк е! а1., 2001). Есть клиническое совпадение между СРК и ВБК, с СРК-подобными симптомами, часто сообщаемыми больными перед диагнозом ВБК, и более высокими, чем ожидаемые симптомы СРК у больных в ремиссии установленного ВБК. Таким образом, эти условия могут сосуществовать с более высокой, чем ожидаемая, частотой или могут существовать на одном отрезке с СРК и ВБК на разных концах того же самого спектра. Однако нужно отметить, что у большинства больных СРК образцы биопсии ободочной кишки оказываются нормальными. Тем не менее СРК значительно поражает очень большое количество людей (американская распространенность в 2000 г. приблизительно 16 млн людей), приводя к общей стоимости расходов в 1,7 млрд долларов (2000 г.). Таким образом, среди самых распространенных и дорогостоящих желудочно-кишечных болезней и нарушений СРК является вторым только относительно болезни гастроэзофагеального рефлюкса (ГЭРБ). Все же в отличие от ГЭРБ лечение СРК остается неудовлетворительным (Та11еу е! а1., 2002; Еагкаб1 е! а1., 2001; СоШпк е! а1., 2001), демонстрируя, что СРК ясно представляет неудовлетворенную медицинскую потребность.

Предложены сближающиеся модели болезни, которые постулируют расширенную реактивность невральных, иммунных или нейроиммунных цепей в центральной нервной системе (ЦНС) или в кишке к центральным (психосоциальным) или периферическим (раздражение ткани, воспаление, инфекция) возмущениям нормального гомеостаза (Та11еу е! а1., 2002). Эта расширенная реактивность приводит к дисрегуляции моторики кишки, эпителиальной функции (иммунной, проницаемость) и висцеральной гиперчувствительности, которые, в свою очередь, приводят к симптомам СРК.

Ролью многих различных молекул в патогенезе СРК может быть роль стимулировать нейроны и участвовать в инициировании воспалительного процесса. Многие наши внутренние молекулы, как известно, связываются с возможной активностью на нейронах из-за их прямой экспрессии нейронами или экспрессии их рецепторов на нейронах, включая ΙΕ-17Ό, Ш-17В и Ш-31. Кроме того, ряд членов семейства Ш-17 и близких молекул были связаны с воспалением в кишке, включая ΙΕ-17Α, Ш-17Е, Ш-23 и Ш-31.

Эффективность ингибиторов этих молекул могла быть испытана ш у1уо в животных моделях болезни. Несколько животных моделей были предложены, которые воспроизводят главные особенности СРК и включают центрально нацеленные стимулы (стресс) или периферически нацеленные стимулы (инфекция, воспаление). Двумя примерами ш у1уо животных моделей, которые могут использоваться, чтобы определить эффективность ингибиторов в лечении СРК, являются (1) модели, сфокусированные на первичном ЦНС-направленном патогенезе СРК (модели стреса), и (ίί) модели, сфокусированные на направленных на кишку индукторах стресса (т.е. воспаление кишки, инфекция или физическое напряжение). Следует отметить, однако, что события в пределах ЦНС или в желудочно-кишечном (ЖК) тракте не встречаются изолированно и что симптомы СРК наиболее вероятно возникают из сложного взаимодействия между сигналами от ЦНС на ЖК тракт и наоборот.

1) Фармацевтические составы.

Для фармацевтического использования растворимые полипептиды по настоящему изобретению составляют для парентеральной, особенно внутривенной или подкожной, доставки согласно обычным методам. Внутривенное введение будет болюсным вливанием, выпуском, которым управляют, например, используя мини-насосы или другую целесообразную технологию, или вливанием за типичный период от одного до нескольких часов. В общем фармацевтические составы будут включать гематопоэтический белок в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, таким как солевой раствор, буферный солевой раствор, 5%-ная декстроза в воде или подобном растворе. Составы могут далее включать один или более наполнителей, консервантов, солюбилизаторы, буферные средства, альбумин, чтобы снизить белковые потери на поверхностях пробирки и т. д. Используя такую комбинациионную терапию, цитокины могут быть объединены в едином составе или могут применяться в отдельных составах. Методы составления известны в технологии и раскрыты, например, в Веш1пд!оп'к Ркагтасеи!1са1 8с1епсек, Сеппаго, еб., Маск РиЬккктд Со., Еак!оп РА, 1990, который включен здесь ссылкой. Терапевтические дозы обычно будут в интервале от 0,1 до 100 мг/кг веса больного в день, предпочтительно 0,5-20 мг/кг в день, с точной дозой, определяемой клиническим врачом согласно принятым стандартам, принимая во внимание природу и серьезность состояния, подлежащее лечению, особенности больного и т. д. Определение дозы в пределах уровня обычного навыка специалиста в технологии. Белки будут обычно применяться в течение 28 дней после химиотерапии или трансплантации костного мозга или пока не будет достигнут счет тромбоцитов > 20000/мм³, предпочтительно > 50000/мм³. Более обычно, белки будут применяться одну неделю или меньше, часто в течение одного-трех дней. В общем терапевтически эффективное количество растворимых полипептидов по настоящему изобретению в количестве, достаточном, чтобы произвести клинически значительное увеличение пролиферации и (или) дифференцирования лимфоидных или

- 50 015351 миелоидных клеток-предшественников, проявится как увеличение циркулирующих уровней зрелых клеток (например, тромбоцитов или нейтрофилов). Лечение нарушений тромбоцитов будет, таким образом, продолжено, пока не будет достигнут счет тромбоцитов по меньшей мере 20000/мм³, предпочтительно 50000/мм³. Растворимые полипептиды по настоящему изобретению могут также применяться в комбинации с другими цитокинами, такими как Ι6-3, -6 и -11; фактор стволовой клетки; эритропоэтин; ГКСФ и ГМ-КСФ. В режиме комбинационной терапии суточные дозы других цитокинов в общем будут: ЭПО 150 Е/кг; ГМ-КСФ 5-15 мг/кг; Ι6-3 1-5 мг/кг и ГКСФ 1-25 мг/кг. Комбинационная терапия с ЭПО, например, указана для анемичных больных с низкими уровнями ЕРО.

Обычно дозировка вводимых растворимых полипептидов будет изменяться в зависимости от таких факторов, как возраст пациента, вес, высота, пол, общее медицинское состояние и предыдущая медицинская история. Как правило, желательно предоставить реципиенту дозировку такого растворимого полипептида, которая находится в интервале приблизительно от 1 пг/кг до 10 мг/кг (количество средства/веса тела пациента), хотя более низкая или более высокая дозировка также может применяться, если обстоятельства диктуют.

Введение растворимых полипептидов по настоящему изобретению субъекту может быть внутривенным, внутриартериальным, интраперитонеальным, внутримышечным, подкожным, внутриплевральным, внутриоболочковым, перфузией через региональный катетр или прямой инъекцией внутрь повреждения. При введении терапевтических белков инъекцией введение может быть непрерывным вливанием или единым или многократными болюсами.

Дополнительные пути введения включают пероральный, слизисто-мембранный, легочный и чрескожный. Пероральный путь является подходящим для полиэфирных микросфер, зеиновых микросфер, протеиноидных микросфер, полицианоакриловых микросфер и липидных систем (см., например, Э|Ваке и Могге1, Ога1 ЭеШ'егу оГ М1сгоепсарки1а1ей Рго!етк ш Рго!ет ЭеШ'егу: Рбукюа1 8ук1етк, Запйегк и Непйгеп (ейк.), р. 255-288 (Р1епит Ргекк, 1997)). Выполнимость внутриносовой доставки иллюстрируется способом введения инсулина (см., например, Нтсбс1Ше апй Шит, АШ.Огид ЭеШ'. Κν., 35:199 (1999)). Сухие или жидкие частицы, включающие растворимые антитела Ι6-17Κί.' или апи-Ш-ПКС могут быть получены и ингалированы при помощи сухого порошкового диспергатора, жидких генераторов аэрозолей или распылителей (например, РеШ! и СотЬо!/, ТШТЕСН 16:343 (1998); Райоп е! а1., АШ.Огид ЭеШ'. Κ^ν., 35:235 (1999)). Этот подход иллюстрируется системой управления диабетом АЕКХ, которая является переносным электронным ингалятором, который поставляет аэрозольный инсулин в легкие. Исследования показали, что белки такого размера, как 48000 кВа, поставлялись через кожу в терапевтических концентрациях при помощи низкочастотного ультразвука, иллюстрируя выполнимость чрескожного введения (МйгадоШ е! а1., 8с1епсе, 269:850 (1995)). Чрескожное введение, используя электропорацию, обеспечивает другое средство введения растворимых полипептидов по настоящему изобретению (Р1о!!к е! а1., Рбагт. Вю1есбпо1.,10:213 (1997)).

Фармацевтический состав, включающий растворимые полипептиды по настоящему изобретению, может быть составлен согласно известным методам, чтобы получить фармацевтически полезный состав, посредством чего терапевтические белки объединяют в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Носитель, как говорят, является фармацевтически приемлемым носителем, если его введение может быть толерантным для принимающего больного. Стерильный фосфатный буферный солевой раствор является одним примером фармацевтически приемлемого носителя. Другие подходящие носители известны специалистам в технологии; см., например, Кеттд!оп'к Рбагтасеийса1 8с1епсек, Сеппаго, ей., 19^!бЕйШоп (Маск РиЬбкЫпд Со., 1990).

В целях терапии растворимые полипептиды по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель вводят больному в терапевтически эффективном количестве. Комбинация терапевтической молекулы по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемого носителя, как говорят, применяется в терапевтически эффективном количестве, если вводимое количество физиологически значимо. Средство физиологически значимо, если его наличие приводит к поддающемуся обнаружению изменению в физиологии принимающего больного. Например, средство, используемое, чтобы лечить воспаление, физиологически значимо, если его наличие облегчает воспалительную реакцию.

Фармацевтический состав, включающий растворимый полипептид по настоящему изобретению, может быть предоставлен в жидкой форме, в аэрозоле, или в твердой форме. Жидкие формы иллюстрируются растворами для инъекций и пероральными суспензиями. Типичные твердые формы включают капсулы, таблетки и формы с регулированным выделением. Последняя форма иллюстрируется миниосмотическими насосами и имплантами (Вгетег е! а1., Рбагт. ВюЮсбпоС 10:239 (1997); Капайе, Лтр^Ш т Эгид ЭеШ'егу ш Эгид ЭеШ'егу 8ук!етк, Капайе и НоШпдег (ейк.), р. 95-123 (СКС Ргекк, 1995); Вгетег е! а1., Рго!ет ЭеШ'егу тейб ИчГикюп Ритрк ш Рго!ет ЭеШ'егу: Рбукюа1 8ук!етк, Запйегк и Непйгеп (ейк.), р. 239-254 (Р1епит Ргекк, 1997); Υе\νеу е! а1., ЭеШ'егу оГ Рго!етк Ггот а Соп!го11ей Ке1еаке ЩесЮЫе ^р^Ш ш Рго!ет ЭеШ'егу: Рбукюа1 8ук!етк, Запйегк и Непйгеп (ейк.), р. 93-117 (Р1епит Ргекк, 1997).

Липосомы обеспечивают средство поставки терапевтических полипептидов субъекту внутривенно, интраперитонеально, интратекально, внутримышечно, подкожно, или через пероральный прием, ингаляцию или внутриносовое введение. Липосомы представляют собой микроскопические пузырьки, которые

- 51 015351 состоят из одного или больше двойных слоев липида, окружающих водные компартементы (см., обычно, Ваккег-ХУонбепЬегд е! а1., Еиг. 1. С1ш. М1сгоЫо1. [пГес!. П1к., 12 (8ирр1. 1):861 (1993), К1т, Эгидк, 46:618 (1993) и Еапабе, 8йе-8ресгГю Эгид ЭеЫ'егу Иктд Ырокотек ак Сатегк ш Эгид ЭеЫ'егу 8ук!етк, Еапабе и НоШпдег (ебк.), р. 3-24 (СЕС Ргекк, 1995)). Липосомы подобны по составу клеточным мембранам, в результате липосомы могут применяться безопасно и разлагаться микроорганизмами. В зависимости от метода получения липосомы могут быть однослойными или многослойными, и липосомы могут изменяться в размере с диаметрами в пределах от 0,02 до больше 10 мкм. Многие средства могут быть инкапсулированы в липосомах: гидрофобные средства разделения в двойных слоях и гидрофильньные средства разделения в пределах внутреннего водного пространства (см., например, Масйу е! а1., Ырокотек ш Се11 В1о1оду апб Рйагтасо1оду (Джон ЫЬЬеу, 1987) и Ок!го е! а1., Атепсап 1. Нокр. Рйагт., 46:1576 (1989)). Кроме того, возможно управлять терапевтической доступностью инкапсулированного средства, изменяя размер липосом, количество двойных слоев, липидный состав, так же как заряд и поверхностные характеристики липосом.

Липосомы могут адсорбироваться на фактически любом типе клеток и затем медленно освобождать инкапсулированное средство. Альтернативно, адсорбированная липосома может эндоцитозироваться клетками, которые являются фагоцитарными. Эндоцитоз сопровождается внутрилизосомным расщеплением липосомных липидов и освобождением инкапсулированных средств (8сНегрНоГ е! а1., Апп.НУ. Асаб. 8с1., 446:368 (1985)). После внутривенного введения маленькие липосомы (0,1-1,0 мкм) обычно принимаются клетками ретикулоэндотелиальной системы, расположенными преимущественно в печени и селезенке, в то время как липосомы больше 3,0 мкм осаждаются в легком. Это предпочтительное поглощение меньших липосом клетками ретикулоэндотелиальной системы использовалось, чтобы доставить химиотерапевтические средства макрофагам и опухолям печени.

Ретикулоэндотелиальная система может быть обманута несколькими методами, включая насыщение большими дозами липосомных частиц или селективную макрофагальную инактивацию фармакологическими средствами (С1ааккеп е! а1., ВюсЫт. Вюрйук., 802:428 (1984)). Кроме того, включение гликолипид- или полиэтиленгликоль-дериватизированных фосфолипидов в липосомные мембраны, как показано, приводит к значительно сниженному поглощению ретикулоэндотелиальной системой (А11еп е! а1., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а, 1068:133 (1991); А11еп е! а1., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а, 1150:9 (1993)).

Липосомы могут также быть получены так, чтобы попасть в специфические клетки или органы путем изменения фосфолипидного состава или вставления рецепторов или лигандов в липосомы. Например, липосомы, полученные с высоким содержанием неионогенного сурфактанта, использовались, чтобы попасть в печень (Науака^а е! а1., японский патент 04-244018; Ка!о е! а1., Вю1. РНагт. Ви11., 16:960 (1993)). Эти составы получали смешиванием фосфатидилхолина сои, альфа-токоферола и этоксилированного гидрированного касторового масла (ГКМ-60) в метаноле, концентрированием смеси под вакуумом и затем воссозданием смеси с водой. Липосомный состав дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) со стерилглюкозидной (СГ) смесью, полученной из сои, и холестерином (Сй), как также показано, попадает в печень (81ιίιηίζι.ι е! а1., Вю1. Рйагт. Ви11., 20:881 (1997)).

Альтернативно, различные нацеливающие лиганды могут быть связаны с поверхностью липосомы, такие как антитела, фрагменты антител, углеводы, витамины и транспортные белки. Например, липосомы могут быть модифицированы галактозиллипидными производными разветвленного типа, чтобы попасть на асиалогликопротеиновые (галактоза) рецепторы, которые исключительно экспрессируются на поверхности клеток печени (Ка!о и 8ид1уата, 14:287 (1997); МигайакЫ е! а1., Вю1. РНагт. Ви11., 20:259 (1997)). Точно так же \¥и е! а1., Нера!о1оду, 27:772 (1998), показали, что мечение липосом асиалофетуином привела к сокращенному периоду полураспада липосомной плазмы и очень увеличила поглощение асиалофетуин-меченой липосомы гепатоцитами. С другой стороны, накопление печенью липосом, включающих галактозиллипидные производные разветвленного типа, может быть ингибировано прединъекцией асиалофетуина (МигаНакЫ е! а1., Вю1. РНагт. Ви11., 20:259 (1997)). Липосомы полиаконитилированого сывороточного альбумина человека обеспечивают другой подход для нацеливания липосом на клетки печени (Катрк е! а1., Ргос. ΝηΓ1 Асаб. 8сг и8А, 94:11681 (1997)). Кроме того, Сейо, е! а1., патент США № 4603044, описывают направленную на гепатоциты систему доставки липосомных пузырьков, у которой есть специфичность к гепатобиллиарным рецепторам, связанным с специализированными метаболическими клетками печени.

В более общем подходе к нацеливанию на ткани клетки-мишени являются предварительно мечеными биотинилированными антителами, специфическими для лиганда, экспрессируемого клеткоймишенью (Нагакут е! а1., Λбν. Эгид ЭеИт. Кеν., 32:99 (1998)). После устранения свободного антитела из плазмы вводят липосомы, сопряженные со стрептавидином. В другом подходе нацеливающие антитела против клетки-мишени непосредственно присоединяются к липосомам (Нагакут е! а1., Лбν. Эгид ЭеЫ'. Еет., 32:99 (1998)).

Полипептиды и антитела могут быть инкапсулированы в липосомы, используя стандартные методы микроинкапсуляции белков (см., например, Андерсона и др., [пГес!. [ттип., 31:1099 (1981), Андерсон и др., Сапсег Кек., 50:1853 (1990) и Сойеп е! а1., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а, 1063:95 (1991), АМпд е! а1., Ргерага!юп апб Ике оГ Ырокотек ш [ттипо1од1са1 8!иб1ек ш Ырокоте ТесНпо1оду, 2^пб Ебйюп, Уо1. Ш, Сгедоп

- 52 015351 аб1к (еб.), р. 317 (СКС Ргекк, 1993), νηκ^ί е! а1., Ме!Н. Εηζутοί., 149:124 (1987)). Как отмечено выше, терапевтически полезные липосомы могут содержать много компонентов. Например, липосомы могут включать липидные производные полиэтиленгликоля (Аллен и др., ΒϊοοΗμ. Βίορίκκ. Ас!а, 1150:9 (1993)).

Микросферы разлагаемого полимера были разработаны, чтобы поддержать высокие системные уровни терапевтических белков. Микросферы получают из разлагаемых полимеров, таких как поли(лактид-со-гликолид) (ПЛГ), полиангидриды, поли(ортоэфиры), неразлагаемые микроорганизмами этилвинилацетатные полимеры, где белки захвачены полимером (СοтЬο!ζ апб Ре!й!, Β^οсοη^υда!е СНет., 6:332 (1995); Капабе, Κοίе οί Рο1уте^κ т Эгид ОеКуагу т Эгид ЭеКуегу 8ук!етк, Капабе апб ΗοΠω^Γ (ебк.), р. 51-93 (СКС Ргекк, 1995); ^к^к и Мак^еую/, ОедгабаЫе Сοη!^ο11еб Ке1еаке 8ук!етк ИкеГи1 1ог Рго!еш Ое1уегу т Рго!еш Ое1уегу: РНук1са1 8ук!етк, 8апбегк и Непбгеп (ебк.), р. 45-92 (Р1епит Ргекк, 1997); ΒογΚ^ е! а1., 8с1епсе, 281:1161 (1998); Ри!пеу апб ΒγιιΙ^, №!иге Β^ο!есНηο1οду, 76:153 (1998); Ри!пеу, Сигг. 0рш. СНет. Βίο1., 2:548 (1998)). Наносферы, покрытые полиэтиленгликолем (ПЭГ), также могут обеспечить носители для внутривенного введения терапевтических белков (см., например, СгеГ е! а1., РНагт. Βίο^ΐκιοί, 10:167 (1997)).

Настоящее изобретение также рассматривает химически модифициованные полипептиды, имеющие активность связывания 1Й-17А и (или) 1Й-17Р, такие как мономерный, гомодимерный, гетеродимерный или мультимерный растворимые рецепторы 1Й-17КС или 1Ь-17КС/1Ь-17КА, полипептид которых связан с полимером, как обсуждено выше.

Другие формы дозировки могут быть разработаны специалистом в технологии, как показано, например, Апке1 апб Рοрον^сН. РНагтасеийса1 Ωο^·^ Рο^тκ апб Эгид Ое1уегу 8ук!етк, 5^|Н Ебйюп (Ьеа & РеЫдег, 1990), Сеппаго (еб.), КеттдЮп'к РНагтасеийса1 8аепсек, 19^!Н Ебйюп (Маск РиЫйтд ^трапу, 1995), и Капабе апб ^1111^1: Эгид Ое1уегу 8ук!етк (СКС Ргекк, 1996).

В качестве иллюстрации, фармацевтические составы могут поставляться как комплект, включающий контейнер, который содежит один из растворимых полипептидов по настоящему изобретению. Терапевтические полипептиды могут быть предоставлены в форме раствора для инъекций для единственной или многих доз, или как стерильный порошок, который будет ресуспендирован перед инъекцией. Альтернативно, такой комплект может включать диспергатор сухого порошка, генератор жидких аэрозолей или распылитель для введения терапевтического полипептида. Такой комплект может далее включать письменную информацию по показаниям и применению фармацевтического состава. Кроме того, такая информация может включать утверждение, что состав противопоказан больным с известной гиперчувствительностью к 1Й-17КС или 1Й-17КА.

Фармацевтический состав, включающий растворимые полипептиды по настоящему изобретению, может быть поставлен в жидкой форме, в аэрозоле или в твердой форме. Жидкие формы иллюстрируются растворами для инъекций, аэрозолями, каплями, топологическими растворами и пероральными суспензиями. Типичные твердые формы включают капсулы, таблетки и формы с регулированным выделением. Последняя форма иллюстрируется миниосмотическими насосами и имплантами (Βιόιικγ е! а1., РНагт. Βιο^ΙμΕ, 10:239 (1997); Капабе, 1тр1ап!к т Эгид Ое1уегу Капабе апб ^1111^1: т Эгид Ое1й'егу 8ук!етк, Капабе и ^1111^1· (ебк.), р. 95-123 (СКС Ргекк, 1995); Βι-етег е! а1., Рго!ет Ое1уегу уйН 1пГикюп Ритрк ш Рго!еш Ое1уегу: РНукюа1 8ук!етк, 8апбегк и Непбгеп (ебк.), р. 239-254 (Р1епит Ргекк, 1997); Уеуеу е! а1., Ое1й'егу οί Рго!етк Ггат а Сοηί^ο11еб Ке1еаке 1п)ес!аЫе 1тр1ап!к ш Рго!еш ОеКк'егу: РНукюа1 8ук!етк, 8апбегк и Непбгеп (ебк.), р. 93-117 (Р1епит Ргекк, 1997)). Другие твердые формы включают кремы, пасты и другие топологические применения, и т. п.

Липосомы обеспечивают средство поставки терапевтических полипептидов субъекту внутривенно, интраперитонеально, интратекально, внутримышечно, подкожно, или через пероральный прием, ингаляцию или внутриносовое введение. Липосомы представляют собой микроскопические пузырьки, которые состоят из одного или больше двойных слоев липида, окружающих водные компартементы (см., обычно, Βакке^-VουбеηЬе^д е! а1., Еиг. 1. С1ш. МюгоЬюк 1пГес!. П1к., 12 (8ирр1. 1):861 (1993), К1т, Эгидк, 46:618 (1993), и Капабе, 8йе-8рес1йс Эгид Ое1|\'егу Иктд ^^рοκοтеκ ак Сатегк ш Эгид Ое1|\'егу 8ук!етк, Капабе и ^1111^1· (ебк.), р. 3-24 (СКС Ргекк, 1995)). Липосомы подобны по составу клеточным мембранам, в результате липосомы могут применяться безопасно и разлагаться микроорганизмами. В зависимости от метода получения липосомы могут быть однослойными или многослойными, и липосомы могут изменяться в размере с диаметрами в пределах от 0,02 мкм до больше 10 мкм. Многие средства могут быть инкапсулированы в липосомах: гидрофобные средства разделения в двойных слоях и гидрофильные средства разделения в пределах внутреннего водного пространства (см., например, МасНу е! а1., Ь1рοκοтеκ ш Се11 Β^ο1οду апб РНа^тасο1οду (Джон ЫЬЬеу, 1987), 0к1го е! а1., Атепсап 1. ^кр. РНагт., 46:1576 (1989)). Кроме того, возможно управлять терапевтической доступностью инкапсулированного средства, изменяя размер липосом, количество двойных слоев, липидный состав, так же как заряд и поверхностные характеристики липосом.

Липосомы могут адсорбироваться на фактически любом типе клеток и затем медленно освобождать инкапсулированное средство. Альтернативно, адсорбированная липосома может эндоцитозироваться клетками, которые являются фагоцитарными. Эндоцитоз сопровождается внутрилизосомным расщепле

- 53 015351 нием липосомных липидов и освобождением инкапсулированных средств (8сйегрйоГ е! а1., Апп. И.У. Асаб. 8с1., 446:368 (1985)). После внутривенного введения маленькие липосомы (0,1-1,0 мкм) обычно принимаются клетками ретикулоэндотелиальной системы, расположенными преимущественно в печени и селезенке, в то время как липосомы больше 3,0 мкм осаждаются в легком. Это предпочтительное поглощение меньших липосом клетками ретикулоэндотелиальной системы использовалось, чтобы доставить химиотерапевтические средства макрофагам и опухолям печени.

Ретикулоэндотелиальная система может быть обманута несколькими методами, включая насыщение большими дозами липосомных частиц, или селективную макрофагальную инактивацию фармакологическими средствами (С1ааккеп е! а1., ВюсЫт. Вюрйук., 802:428 (1984)). Кроме того, включение гликолипид- или полиэтиленгликоль-дериватизированных фосфолипидов в липосомные мембраны, как показано, приводит к значительно сниженному поглощению ретикулоэндотелиальной системой (А11еп е! а1., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а, 1068:133 (1991); А11еп е! а1., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а, 1150:9 (1993)).

Липосомы могут также быть получены так, чтобы попасть в специфические клетки или органы путем изменения фосфолипидного состава или вставления рецепторов или лигандов в липосомы. Например, липосомы, полученные с высоким содержанием неионогенного сурфактанта, использовались, чтобы попасть в печень (Науака^а е! а1., японский патент 04-244018; Ка!о е! а1., Вю1. Рйагт. Ви11., 16:960 (1993)). Эти составы получали смешиванием фосфатидилхолина сои, альфа-токоферола и этоксилированного гидрированного касторового масла (ГКМ-60) в метаноле, концентрированием смеси под вакуумом и затем воссозданием смеси с водой. Липосомный состав дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) со стерилглюкозидной (СГ) смесью, полученной из сои, и холестерином (Сй), как также показано, попадает в печень (δΐιίιηίζιι е! а1., Вю1. Рйагт. Ви11., 20:881 (1997)).

Альтернативно, различные нацеливающие лиганды могут быть связаны с поверхностью липосомы, такие как антитела, фрагменты антител, углеводы, витамины и транспортные белки. Например, липосомы могут быть модифицированы галактозиллипидными производными разветвленного типа, чтобы попасть на асиалогликопротеиновые (галактоза) рецепторы, которые исключительно экспрессируются на поверхности клеток печени (Ка!о и 8ид1уата, 14:287 (1997); МигайакЫ е! а1., Вю1. Рйагт. Ви11., 20:259 (1997)). Точно также XVи е! а1., Нера!о1оду, 27:772 (1998), показали, что мечение липосом асиалофетуином привела к сокращенному периоду полураспада липосомной плазмы и очень увеличила поглощение асиалофетуин-меченой липосомы гепатоцитами. С другой стороны, накопление печенью липосом, включающих галактозиллипидные производные разветвленного типа, может быть ингибировано прединъекцией асиалофетуина (МигайакЫ е! а1., Вю1. Рйагт. Ви11., 20:259 (1997)). Липосомы полиаконитилированого сывороточного альбумина человека обеспечивают другой подход для нацеливания липосом на клетки печени (Катрк е! а1., Ргос. №11'1 Асаб. δα. И8А, 94:11681 (1997)). Кроме того, Сейо, е! а1., патент США № 4603044, описывают направленную на гепатоциты систему доставки липосомных пузырьков, у которой есть специфичность к гепатобиллиарным рецепторам, связанным с специализированными метаболическими клетками печени.

В более общем подходе к нацеливанию на ткани клетки-мишени являются предварительно мечеными биотинилированными антителами, специфическими для лиганда, экспрессируемого клеткоймишенью (Нагакут е! а1., Абу. Эгид ЭеНу. Веу., 32:99 (1998)). После устранения свободного антитела из плазмы вводят липосомы, сопряженные со стрептавидином. В другом подходе нацеливающие антитела против клетки-мишени непосредственно присоединяются клипосомам (Нагакут е! а1., Абу. Эгид ЭеНу. Веу., 32:99 (1998)).

Растворимые полипептиды по настоящему изобретению могут быть инкапсулированы в липосомы, используя стандартные методы микроинкапсуляции белков (см., например, Апбегкоп е! а1., 1пГес!. 1ттип., 31:1099 (1981), Апбегкоп е! а1., Сапсег Век., 50:1853 (1990), и Сойеп е! а1., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а, 1063:95 (1991), АМпд е! а1., Ргерага!юп апб Ике оГ Ырокотек т Iшшипо1од^са1 8!иб1ек ш Ырокоте Тесйпо1оду, 2^пб Ебйюп, Уо1. 111, Сгедопаб1к (еб.), р. 317 (СВС Ргекк, 1993), ^№аккеГ е! а1., Ме!й. ЕпхутоЕ 149:124 (1987)). Как отмечено выше, терапевтически полезные липосомы могут содержать много компонентов. Например, липосомы могут включать липидные производные полиэтиленгликоля (Аллен е! а1., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а, 1150:9 (1993)).

Микросферы разлагаемого полимера были разработаны, чтобы поддержать высокие системные уровни терапевтических белков. Микросферы получают из разлагаемых полимеров, таких как поли(лактид-со-гликолид) (ПЛГ), полиангидриды, поли(ортоэфиры), неразлагаемые микроорганизмами этилвинилацетатные полимеры, где белки захвачены полимером (СотЬоЫ и РеШЕ В1осои)ида!е Сйет., 6:332 (1995); Ваиабе, Во1е оГ Ро1утегк ίη Эгид ОеНуагу ίη Эгид ЭеНуегу 8ук!етк, Ваиабе апб НоШпдег (ебк.), р. 51-93 (СВС Ргекк, 1995); Воккок и МакЫетас/, ЭедгабаЫе Соп!го11еб Ве1еаке 8ук!етк ИкеГи1 Гог Рго!ет ОеНуегу ίη Рго!ет ЭеНуегу: Рйукюа1 8ук!етк, 8апбегк и Непбгеп (ебк.), р. 45-92 (Р1епит Ргекк, 1997); ВагШк е! а1., 8аепсе, 281:1161 (1998); Ри!пеу апб Вгике, №!иге Вю!есйпо1оду, 16:153 (1998); Ри!пеу, Сигг. 0рт. Сйет. Вю1., 2:548 (1998)). Наносферы, покрытые полиэтиленгликолем (ПЭГ), также могут обеспечить носители для внутривенного введения терапевтических белков (см., например, СгеГ е! а1., Рйагт. Вю!есйиоЕ, 10:167 (1997)).

- 54 015351

Другие формы дозировки могут быть разработаны специалистом в технологии, как показано, например, Αηке1 апб Ророукй, Рйагтасеийса1 Эокаде Рогтк апб Эгид Эейуегу 8ук!етк, 5'¹' Ебйюп (Ьеа & РеЫдег, 1990), Сеппаго (еб.), Кеттд!оп'к Рйагтасеийса1 8аепсек, 19^!й Ебйюп (Маск РиЬйктд Сотрапу, 1995) и Капабе апб НоШпдег, Эгид Эейуегу 8ук1етк (СКС Ргекк, 1996).

Настоящее изобретение рассматривает составы растворимых полипептидов по настоящему изобретению, методы и терапевтическое использование, включающее те же самые полипептиды, описанные здесь. Такие составы могут далее включить носитель. Носитель может быть обычным органическим или неорганическим носителем. Примеры носителей включают воду, буферное раствор, спирт, пропиленгликоль, макрогол, сезамовое масло, кукурузное масло и т. п.

К) Продукция трансгенных мышей.

Трансгенные мыши могут быть спроектированы, чтобы повышенно экспрессировать ген ΙΕ-17Ρ, ΙΕ-17Α, ΙΕ-17ΚΑ или ΙΡ-17ΡΡ во всех тканях или под контролем тканеспецифичного или тканепредпочтительного регулирующего элемента. Эти сверхпроизводители могут использоваться, чтобы характеризовать фенотип, который возникает из чрезмерной экспрессии, а трансгенные животные могут служить моделями человеческого заболевания, вызванного избытком ΙΕ-17Ρ, ΙΕ-17Α, ΙΕ-17ΚΑ или Ш-ПЕС. Трансгенные мыши, которые повышенно продуцируют любой из них, также обеспечивают модельные биореакторы для продукции ΙΕ-17ΚΑ или ΙΠ-17ΗΟ, такие как любой из растворимых полипептидов по настоящему изобретению, в молоке или крови больших животных. Методы продуцирования трансгенных мышей известны специалистам в технологии (см., например, 1асоЬ, Ехргеккюп апб Кпоскои! оБ йиегБегопк 1п Тгапкдешс Мюе ш 0уегехргеккюп апб Кпоскои! оБ СуЮкшек ш Тгапкдешс Мюе, 1асоЬ (еб.), р. 111-124 ^сабетю Ргекк, Иб. 1994), Мопак!егкку и КоЬ1 (ебк.), 8!га!ед1ек ш Тгапкдешс Αη^та1 8аепсе (Α8Μ Ргекк, 1995), и ΑЬЬиб и №1коп, КесотЬтап! Рго!ет Ехргеккюп ш Тгапкдешс Мюе ш Сепе Ехргеккюп 8ук1етк: Иктд №1иге Бог !йе Αή оБ Ехргеккюп, Регпапбех и НоеБДег (ебк.), р. 367-397 (^сабетю Ргекк, Шс. 1999)).

Например, метод продуцирования трансгенной мыши, которая экспрессирует ген ΙΡ-17ΕΟ может начаться со взрослых, фертильных самцов (производители) (В6С3Б1, возраст 2-8 месяцев (Тасошс Рагтк, Сегтап!о^п, НУ)), вазэктомированных самцов (суррогат) (В6Э2Б1, 2-8 месяцев (Тасошс Рагтк)), незрелых фертильных самок (доноры) (В6С3Б1, 4-5 недель (Тасошс Рагтк)) и зрелых фертильных самок (реципиенты) (В6Э2Б1, 2-4 месяца (Тасошс Рагтк)). Донорам дают акклиматизироваться в течение одной недели и затем вводят инъекцию приблизительно 8 МЕ/мышь гонадотропина сыворотки жеребой кобылы (СЖК) (81дта Сйетюа1 Сотрапу, 8ΐ. Ьошк, МО) внутрибрюшинно, и 46-47 ч спустя, 8 МЕ/мышь человеческого хорионического гонадотропина (чХГ (81дта)) внутрибрюшинно, чтобы вызвать суперовуляцию. Доноры спариваются с производителями после гормональных инъекций. Овуляция обычно имеет место в течение 13 ч после чХГ инъекции. Коитус подтверждается наличием влагалищной пробки утром после спаривания.

Оплодотворенные яйца собирают под хирургическим микроскопом. Яйцеводы собирают, а яйцеклетки выпускают в лунки предметного стекла для анализа мочи, содержащие гиалуронидазу (81дта). Яйцеклетки промывают 1 раз в гиалуронидазе и дважды в питательной среде Уиттена (ЛУйШеп'к \7640) (описанной, например, Мешпо апб 0'С1агау, Вю1. Кергоб., 77:159 (1986), и Э1епйаг1 апб Эотепк, 2удо!е, 4:129 (1996)), которая культивировалась с 5% С0₂, 5% 0₂ и 90% N при 37°С. Яйцеклетки затем сохраняют в инкубаторе при 37°С/5% С02 до микроинъекции.

10-20 мкг ДНК плазмиды, содержащей последовательность, кодирующую ^-17^0, линеаризуют, очищают от геля и ресуспендируют в 10 мМ Трис-НС1 (рН 7,4), 0,25 мМ ЭДТУК (рН 8,0), при конечной концентрации 5-10 нг на 1 мкл для микроинъекции. Например, последовательности, кодирующие ΙΕ17КС, могут кодировать полипептид, включающий аминокислотные остатки 21-452 последовательности 81Т) ΙΌ N0:2.

ДНК плазмиды микроинъецируют в собранные яйцеклетки, содержащиеся в капле питательной среды ^640, покрытой теплым, уравновешенным С0₂ минеральным маслом. ДНК втягивается инъекционную иглу (вытянутую из капилляра боросиликатного стекла с внутренним диаметром 0,75 мм и внешним диаметром 1 мм) и вводится в индивидуальную яйцеклетку. В каждую яйцеклетку вносятся инъекционной иглой один или оба гаплоидных пронуклеуса.

Пиколитры ДНК инъецируют в пронуклеусы и инъекционная игла выводится, не входя в контакт с ядрышками. Процедуру повторяют, пока все яйцеклетки не будут иньецированы. Успешно микроинъецированные яйцеклетки переводят в чашку для культивирования тканей органа с предварительно газированной питательной средой \7640 для хранения в течение ночи в инкубаторе при 37°С/5% С0₂.

На следующий день двухклеточные эмбрионы переносят псевдобеременным реципиентам. Реципиенты опознаются по наличию копуляционной пробки после копуляции с вазэктомированными суррогатными самцами. Реципиентов анестезируют и бреют на дорсальной левой стороне и переносят под хирургический микроскоп. Маленький разрез делается на коже и через стенку мышцы в середине абдоминальной области, очерченной грудной клеткой, седлом и задней конечностью, на полпути между коленом и селезенкой. Органы размножения выводят на поверхность тела на маленькую хирургическую пленку. Жировое тело растягивают по хирургической пленке и детский зажим (Койо/, КоскуШе, МО) прикреп

- 55 015351 ляют к жировому телу и оставляют подвешенным над спиной мыши, препятствуя органам соскользнуть назад.

Тонкой переносящей пипеткой, содержащей минеральное масло, за которым следует, чередуясь, \У640 и воздушные пузыри, 12-17 здоровых двухклеточных эмбрионов из инъекции предыдущего дня переносят в реципиента. Раздутая ампула располагается, удерживая яйцевод между ампулой и бурсой, засечка в яйцеводе делается 28-г иглой вблизи бурсы, удостоверяясь, чтобы не порвать ампулу или бурсу.

Пипетка переводится в засечку в яйцеводе и эмбрионы вдуваются, позволяя первому воздушному пузырю покинуть пипетку. Жировое тело мягко заталкивается в брюшину, и органам размножения позволяли соскользнуть назад. Перитонеальную стенку закрывают одним швом, а кожу закрывают зажимом раны. Мыши выздоравливают на подогревательном столике при 37°С в течение минимум 4 ч.

Реципиентов возвращают в клетки парами и оставляют на период беременности в 19-21 день. После рождения разрешают 19-21 послеродовой день перед отниманием от груди. Пол недавно отнятых от груди устанавливают и помещают в отдельные клетки в соответствии с полом, биопсию в 0,5 см (используемую для генотипирования) отрезают от хвоста чистыми ножницами.

Геномную ДНК получают из отрезков хвоста, применяя, например, комплект Р1адеп-Кпеаку, следуя инструкциям изготовителя. Геномную ДНК анализируют полимеразно-цепной реакцией (ПЦР), используя праймеры, разработанные, чтобы усилить ген 1Ь-17КС или селектируемый маркерный ген, который был введен в ту же самую плазмиду. После того как трансгенность животных подтверждена, они обратно скрещивались в инбредную линию, размещая трансгенную самку с самцом дикого типа или трансгенного самца с одной или двумя самками дикого типа. По мере того как детеныши рождаются и отнимаются от груди, полы разделяют, а их хвосты отрезают для генотипирования.

Чтобы проверить экспрессию трансгена в живом животном, выполняют частичное удаление печени. Хирургическое приготовление делают из верхнего абдомена непосредственно ниже зифоидного (ζγр1ю1б) процесса. Используя стерильную технику, маленький разрез делают на 1,5-2 см ниже грудины и левую боковую долю печени выводят на поверхность тела. Используя шелк 4-0, вокруг нижней доли делают узел, сохраняющий ее вне полости. Атравматический зажим применяют, чтобы удерживать узел, в то время как вторую петлю из поглощаемого дексона (Эехоп) (Атепсап Суапат1б, ^аупе, N.1) помещают вблизи первого узла. Периферийный кусочек отрезают от дексонового узла и приблизительно 100 мг иссеченной ткани печени помещают в стерильную чашку Петри. Иссеченную часть печени переносят в полипропиленовую круглодонную 14-мл пробирку и кусочек замораживают в жидком азоте, затем сохраняют на сухом льду. Хирургический участок закрывают швом и зажимами раны и клетку животного помещают на электрогрелку при 37°С в течение 24 ч после операции. Животное проверяют ежедневно после операции и зажимы раны удаляют спустя 7-10 дней после хирургии. Уровень экспрессии мРНК 1Ь-17КС определяют для каждой трансгенной мыши, используя гибридизационный анализ раствора РНК или полимеразную цепную реакцию.

В дополнение к продукции трансгенных мышей, которые повышенно экспрессируют 1Ь-17Р, 1Ь-17А, 1Ь-17КА или 1Ь-17КС, полезно спроектировать трансгенных мышей либо с ненормально низкой, либо без экспрессии любого из этих генов. Такие трансгенные мыши обеспечивают полезные модели для болезней, связанных с нехваткой 1Ь-17Р, 1Ь-17А, 1Ь-17КА или 1Ь-17КС. Как обсуждено выше, генная экспрессия 1Ь-17КС может ингибироваться, используя антисенсорные гены, рибозимные гены или гены внешней гидовой последовательности. Например, чтобы произвести трансгенных мышей, которые недостаточно экспрессируют ген 1Ь-17КС, такие ингибиторные последовательности нацеливают на мРНК 1Ь-17КС. Методы продукции трансгенных мышей, которые имеют ненормально низкую экспрессию определенного гена, известны специалистам в технологии (см., например, \¥и е! а1., Сепе ипбегехргеккюп 1п Си1!игеб Се11к апб Ашта1к Ьу Апбкепке ЭНА апб КНА 8!га!ед1ек т Мейюбк т Сепе Вю!есЬпо1оду, р. 205-224 (СКС Ргекк, 1997)).

Альтернативным подходом к продукции трансгенных мышей, у которых есть небольшая или нет никакой экспрессии гена 1Ь-17КС, является продукция мышей, имеющих по меньшей мере один нормальный аллель 1Ь-17КС, замененный нефункциональным геном 1Ь-17КС. Одним методом проектирования нефункционального гена 1Ь-17КС является вставка другого гена, такого как селектируемый маркерный ген, в молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует 1Ь-17КС. Стандартные методы для продукции этих так называемых мышей нокаута известны специалистам в технологии (см., например, 1асоЬ, Нхргеккюп апб Кпоскои! оГ 1п!егГегопк ш Тгапкдешс Мюе ш 0уегехргеккюп апб Кпоскои! оГ Су!октек т Тгапкдешс Мюе, 1асоЬ (еб.), р. 111-124 (Асабетю Ргекк, Ь!б. 1994) и \Уи е! а1., №\ν 8!га!е§1ек Гог Сепе Кпоскои! т Ме!1обк т Сепе Вю!есЬпо1оду, р. 339-365 (СКС Ргекк, 1997)).

Изобретение далее иллюстрировано следующими неограничивающими примерами.

- 56 015351

Примеры

Пример 1.

Экспрессия гена (-17(С.

Нозерн-анализы выполняли, используя блот-анализатор пятен человеческой ткани (Нитап Ми1йр1е Т1ккие В1о!к) (С1оп!есБ ЬаЬога!опек, (с., Ра1о А1!о, СА). Два зонда были произведены из продуктов ПЦР, очищенных гелем. Первый зонд был сделан, используя 2С21798 (5' ССС ССТ ССТ ССТ СТТ ССТ СТТ 3'; последовательность 8ЕО ГО N0:8) и 2С21808 (5' ТСС ССТ ССС ССС ССС САС СТС 3'; последовательность 8Е0 ГО N0:31) в качестве праймеров. Зонд был радиоактивно помечен с помощью маркировочного комплекта МиШрпте от АтегкБат (Аг1тд!оп Не1дБ!к, () согласно протоколу изготовителя. Зонд был очищен на колонке ШсТгар рикБ (8!га!адепе, Ьа 1о11а, СА). Раствор ЕхргеккНуЬ (С1оп!есБ) применяли для предгибридизации и гибридизации в Нозерн-блот анализе. Гибридизация имела место в течение ночи при 65ΌΟ После гибридизации пятна были смыты в течение 30 мин каждое в растворы, которые содержали 0,1% 8Ό8 (натрийдодецилсульфонат) и 88С (натрия хлорид и натрия цитрат), следующим образом: дважды в 2х88С при комнатной температуре, три раза в 0,1х88С при 50°С, один раз в 0,1х88С при 55°С и один раз в 0,1х88С при 65°С. Результаты продемонстрировали, что ген (-17(С сильно экспрессируется в щитовидной железе, надпочечнике, простате и тканях печени и экспрессируется в меньшей степени в сердце, тонкой кишке, желудке и тканях трахеи. Напротив, есть небольшая или нет никакой экспрессии в мозге, плаценте, легком, скелетной мышце, почке, поджелудочной железе, селезенке, тимусе, яичке, яичнике, ободочной кишке, лейкоцитах периферической крови, спинном мозге, лимфатическом узле и костном мозге.

Пример 2.

Распределение мРНК в панелях клеточных линий, используя ПЦР.

Полная РНК была очищена от покоящихся и стимулированных клеточных линий, выросших самостоятельно, с применением комплекта О|адеп-(№аку (Уа1епаа, СА) согласно инструкциям изготовителя или протокола кислотно-фенольной очистки (С1ютсхупкк| и 8ассБ1, Апа1уйса1 ВюсБетИйу, 162:156-9, 1987). Качество РНК было оценено анализом аликвоты на биоанализаторе Адйеп!. Если РНК имела значительно ухудшенные характеристики, она не использовалась для последующего создания первой нити кДНК. Наличие загрязняющей геномной ДНК было оценено анализом ПЦР на аликвоте РНК с помощью ΖΟ41011 (5'СТСТССАТССТТАТСТТТСАТСААС 3'; последовательность 8ЕО ГО N0:32) и ΖС41012 (5'СТСТСТССТСССТАААС ААААС АС 3'; последовательность 8Е0 ΙΌ N0:33), праймеров, которые усиливают единственный сайт межгенной геномной ДНК. Условия ПЦР для анализа загрязняющей геномной ДНК были следующие: 2,5 мкл буфера 10Х и 0,5 мкл микса А4тап1аде 2 кДНК-полимеразы (ВО Вюкбепсек С1оп!есБ, Ра1о А1!о, СА), 2 мкл 2,5 мМ микса 4ЭТР (Аррйе4 Вюкук!етк, Еок!ег Сйу, СА),

2,5 мкл (е4йоа4 10Х (^йгодеп, Саг1кЬа4, СА) и 0,5 мкл 20 мМ ΖС41011 и ΖС41012, в заключительном объеме 25 мкл. Циклические параметры были 94°С в течение 20, 40 циклов при 94°С в течение 20 и 60°С в течение 1'20 и один цикл при 72°С в течение 7'. 10 мкл каждой реакции подвергали электрофорезу на геле агароза, и гели были исследованы на наличие продукта ПЦР из загрязняющей геномной ДНК. Если загрязняющая геномная ДНК наблюдалась, полная РНК была ДНКирована (ОХАкей), используя реактивы без ДНК (АтЬюп, (с., Аикбп, ТХ) согласно инструкциям изготовителя, затем повторно проверена, как описано выше. Только РНК, которые оказались свободными от загрязняющей геномной ДНК, использовались для последующего создания первой нити кДНК.

мкг полной РНК 82 человеческих клеточных линий приводили (каждую) водой к 98 мкл, затем расщепляли на две 49-мкл аликвоты, каждая содержащая 10 мкг полной РНК, и помещали в два 96-луночных планшета ПЦР. К каждой аликвоте добавляли реагенты для синтеза первой нити кДНК ((ν^!^одеп Е1гк! 8!гап4 сЭНА купИек1к, Саг1кЬа4, СА): 20 мкл 25 мМ МдС1₂, 10 мкл буфера 10Х (Т, 10 мкл 0,1М ОТТ, 2 мкл олиго 4Т, 2 мкл РНКаза-0и!. Затем к одной аликвоте из каждой клеточной линии добавляли 2 мкл 8ирегкспр! ΙΙ обратной транскриптазы и к соответствующей клеточной линии добавляли аликвоту 2 мкл Н20, чтобы сделать отрицательный контроль минус обратной транскриптазы. Все образцы культивировали следующим образом: 25°С в течение 10', 42°С в течение 50', 70°С в течение 15'. Образцы были устроены в глубоколуночный планшет и разбавлены водой до 1,7 мл. Многоканальную пипетку-робот (8а1дап) применяли, чтобы вносить аликвоту 16,5 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета ПЦР многократно, производя многочисленные ПЦР панели клеточных линий однократного использования, которые затем запечатывали и сохраняли при -20°С. Каждая лунка в этих панелях представляет первую нить кДНК из приблизительно 100 нг полной РНК. 82 клеточные линии распространяли по двум панелям группы, наборы 118А и 118В. Качество первой нити кДНК на панелях оценивали мультиплексным анализом ПЦР на одном наборе панелей, используя праймеры для двух широко экспрессируемых, но только умеренно распространенных генов, СЬТС (клатрин) и ТЕ(С (рецептор С трансферрина). 0,5 мкл каждого из праймеров клатрина ΖС42901 (5'СТСАТАТТССТСААСТСТСТСААААС 3'; последовательность 8Е0 ΙΌ N0:34), ΖС42902 (5'ТАСААСССАССТСААСАСАААТСТС3'; последовательности 8ЕО ГО N0:65) и праймеров ТЕ(С ΖС42599 (5'АТСТТСССТТСТАТСТТСААААТСААТТ3'; последовательность 8НО ГО N0:36) и ΖС42600 (5ТГСТССАССАССТАААСААСТСТАС3'; последовательность

- 57 015351

8Е0 ΙΌ NО:37), смешивали с 2,5 мкл буфера 10Х и 0,5 мкл смеси АбтаШаде 2 кДНК-полимеразы (ВБ В1окс1епсек С1оп!еск, Ра1о А1!о, СА), 2 мкл смеси 2,5 мМ бХТР (Аррйеб Вюкук!етк, Еок!ег Сйу, СА),

2,5 мкл 10Х ВебПоаб (Iηνй^οдеη, Саг1кЬаб, СА) и добавляли в каждую лунку панели набора 118А и набора 118В. Повторяющиеся циклически параметры были следующие: 94°С в течение 20, 35 циклов при 94°С в течение 20, 67°С в течение 80 и один цикл при 72°С в течение 7'. 10 мкл каждой реакции был подвергнут электрофорезу на агарозном геле, и гели подсчитывали на наличие робастного продукта ПЦР для каждого гена, специфического для +ВТ лунок для каждой клеточной линии.

Экспрессия мРНК в панелях человеческой первой нити кДНК для Ш-ИВС анализировали ПЦР с сенсорным олиго 2С42756 (5'с!с!ссаддсссаад1сд1дс!с!3'; последовательность 8ЕО ΙΌ NО:38) и антисенсорным олиго 2С42757 (5'йд!сс!дддддсс!сд!д!с!сс3'; последовательность 8ЕО ΙΌ NО:39) при следующих ПЦР условиях на образец: 2,5 мкл буфера 10Х и 0,5 мкл микса Абуап!аде 2 кДНК-полимеразы (ВБ В1окс1епсек С1оп!еск, Ра1о А1!о, СА), 2 мкл микса 2,5 мМ бХТР (АррНеб Вюкук!етк, Еок!ег Сйу, СА),

2,5 мкл Вебйоаб 10Х (Iηνй^οдеη, Саг1кЬаб, СА) и 0,5 мкл 20 мкМ каждого сенсорного и антисенсорного праймера. Повторяющиеся циклически условия были 94°С в течение 2', 35 циклов при 94°С в течение 1', 66°С в течение 30, 72°С в течение 1,5' и один цикл при 72°С в течение 7'. 10 мкл каждой реакции подвергали электрофорезу на агарозном геле и гели были выбраны для положительной или отрицательной экспрессии Ш-ПВС.

мРНК I^-17ΒС широко экспрессируется на многих клеточных линиях, представляющих широкий спектр тканей и клеточных типов. В частности, I^-17ΒС последовательно экспрессируется в линиях не-Т клеток периферической крови, включая моноциты, В-клетки и клетки миелоидного происхождения. Кроме того, мРНК Ш-ИВС надежно экспрессируется в линиях клеток, полученных из кожи. Другие клеточные линии, которые экспрессируют I^-17ΒС, являются всеми 5 из клеточных линий толстой кишки, которые присутствовали в наборе.

Пример 3.

Распределение мРНК в панелях мышиной клеточной линии, используя обратную транскриптазную полимеразную цепную реакцию (ОТ ПЦР).

Полная РНК была очищена от 60 покоящихся и стимулированных клеточных линий, выросших самостоятельно и очищенных, используя комплект О|адеп-В№аку (Уа1епс1а, СА) согласно инструкциям изготовителя или протокол кислотно-фенольной очистки (С1ю1псхупкк| и 8асск1, Апа1уйса1 ВюскетШгу, 162:156-9, 1987) или протокол реагента Тризол (Тпхо1) (Iην^!^οдеη, Саг1кЬаб, СА).

мкг полной РНК от каждой клеточной линии были устроены в глубоколуночном 96-луночном планшете, в каждую лунку добавляли 125 мкл 3М №1ОЛс и 100 мкл Ре11е! Рат! Щоуадеп, Маб1коп, А1)), затем заключительный объем был приведен водой к 1,25 мл. Многоканальную пипетку-робот (8а1дап) применяли для внесения аликвоты 25 мкл смеси РНК и затем 75 мкл Е!ОН в каждую лунку 96-луночного планшета ПЦР многократно, производя многочисленные панели клеточных линий ОТ ПЦР однократного использования, которые были затем закрыты и сохранены при -20°С. Скрининг ОТ ПЦР выполняли первым центрифугированием панели в 96-луночной центрифуге 01адеп (Уа1епс1а, СА) в течение 10 мин при 6000 об/мин. Супернатант был удален опрокидыванием планшета на гигроскопичную бумагу. Шарики РНК промывали 100 мкл 70%-го Е!ОН, затем центрифугировали 5 мин при 6000 об/мин. Супернатант снова удаляли и планшет высушивали на воздухе до испарения Е!ОН. Шарики РНК были повторно суспендированы в 15 мкл воды.

Экспрессия мРНК Ш-ИВС в панелях мышиной клеточной линии анализировалась ОТ ПЦР с 2С38910 (5'асдаадсссаддассадааадад3'; последовательность 8ЕО ΙΌ NО:4Ο) и 2С38679 (5'адсдссдсадссаадад!адд3'; последовательность 8ЕО ΙΌ NО:41) при таких следующих условиях ОТ ПЦР на образец: комплект 8ирегкспр! Опе-8!ер РСВ тейй Р1а!тит Тад (Iην^!^οдеη, Саг1кЬаб, СА). Повторяющиеся циклически условия были: 1 цикл при 48°С в течение 30 мин, 94°С в течение 2 мин, затем 35 циклов при 94°С в течение 15 с, 55°С в течение 30 с, 72°С в течение 1,5 мин, затем 1 цикл при 72°С в течение 7 мин. 10 мкл каждой реакции были подвергнуты электрофорезу на агарозном геле, и гели были выбраны для положительной или отрицательной экспрессии Ш-ИВС.

Мышиная мРНК Ш-17ВС экспрессируется в нескольких мышиных клеточных линиях, особенно в клеточных линиях, полученных из костного мозга, включая клеточные линии остеобласта, адипоцита и предадипоцита. Кроме того, мышиная мРНК ΙΌ-17ВС представляется в нескольких образцах эндокринной системы, таких как линии клетки стромы поджелудочной железы, линии клетки островка поджелудочной железы, гипоталамуса, слюнной железы и линии клеток яичка.

Пример 4.

Свертывание и очистка рЖ-ПЕ, произведенных в Е.сой.

А) Выделение тела включения и экстрация рШ-ПЕ.

После индукции белка экспрессии либо в партии фермента, либо в культуре колбы шейкера, бульон Е.сой центрифугируют в 1-л бутылках при 3000 об/мин в микроцентрифуге 8огуа11. Промывку клеточной пасты, чтобы удалить любые загрязнители бульона, выполняют 50 мМ Трис с рН 8,0, содержащим 200 мМ №1С1 и 5 мМ ЭДТУК, пока супернатант (надклеточная жидкость) не будет прозрачным.

- 58 015351

Клеточные шарики затем суспендируют в ледяном буфере лизиса (50 мМ Трис рН 8,0; 5 мМ ЭДТУК; 200 мМ №аС1, 10% сахароза (вес/объем); 5 мМ ΌΤΤ; 5 мМ бензамидина) до 10-20 единиц оптической плотности при 600 нм. Эту суспензию затем подвергают 3 проходам при 8500-9000 фунтов на кв. дюйм через охлажденный гомогенизатор (АРУ 2000 ЬаЬ Нотодеш/ег), производящий разрушенный клеточный лизат. Нерастворимую фракцию (тела включения) регенерируют центрифугированием клеточного лизата при 20000 С в течение 1 ч при 4°С.

Шарик тела включения, возникающий из вращения при 20000 О, взвешивают и затем повторно суспендируют в промывном буфере (50 мМ Трис рН 8,0; 5 мМ ЭДТУК; 200 мМ №аС1, 5 мМ ΌΤΤ; 5 мМ бензамидина) при 10 мл промывного буфера на грамм тел включения. Полной дисперсии достигают гомогенизацией в генераторе 0ΜΝΙ 1п!етайопа1 го!ог з!а!ог депега!ог. Эта суспензия центрифугируется при 20000 С в течение 30 мин при 4°С. Промывочный цикл повторяют 3-5 раз, пока супернатант не станет прозрачным.

Конечный промытый шарик солюбилизируют в 7М гуанидин НС1 в 40 мМ буфере Трис рН 8, содержащем 0,1М сульфит натрия и 0,02М тетратионат натрия. Экстракции и реакции сульфитолиза позволяют протекать при мягком перемешивании при 4°С в течение ночи. Результатный розоватый раствор центрифугируют при 35 000 С в течение 1 ч при 4°С и очищенный супернатант, содержащий растворимый р1Ь-17Е, фильтруют через мембрану 0,45 мкм.

B) Методика складывания р1Ь-17Е.

Солюбилизированный сульфитолизованный р1Ь-17Е сворачивают капельным разбавлением в ледяном холодном буфере сворачивания, содержащем 55 мМ МЕЗ, 10,56 мМ №аС1, 0,44 мМ КС1, 0,055% ПЭГ (3400 К), 1,1 мМ ЭДТУК, 20% глицерина, 0,5М гуанидина НС1, 0,75 М аргинина и глютатионовую редокс-пару в отношение 1:1 (1 мМ СЗН:1 мМ СЗЗС). Буфер сворачивания приводят к рН 6,5 с помощью НС1 и р1Ь-17Е добавляют до конечной концентрации 100 мкг/мл. Разбавленную смесь медленно перемешивают в холодной комнате в течение 72 ч.

C) Регенерация продукта и очистка.

Свернутый р1Ь-17Е концентрируют 10-кратно с отсечной мембраной 10 кДа на системе ТЕЕ лабораторного масштаба. Затем продукт фильтруют, используя мембрану 0,45 мкм, и приводят к рН 5,1 добавлением уксусной кислоты. Материал с установленным рН захватывается катионо-обменной хроматографией на колонке РЕагтааа ЗР Еаз! Е1оте, уравновешенной в 50 мМ ацетатном буфере, рН 5,1.

р1Ь-17Е загружают с уравновешивающим буфером в пропорции 1:5 при скорости потока 190 см/ч. Это разбавление понижает ионную силу, давая возможность эффективного связывания мишени с матрицей. После того как загрузка образца завершается, колонку промывают уравновешивающим буфером до начальной спектральной поглощательной способности. Колонку промывают 0,4 М №аС1 в 50 мМ ацетатном буфере при рН 5,1 и затем связанный белок элюируют с 5-СУ градиентом от 0,4 до

1,5 М №аС1 в 50 мМ ацетатном буфере при рН 5,1. Белок элюируется при ~1 М №аС1 и является приблизительно на 85% димерным по данным ЗЭЗ РАСЕ анализа фракций элюата. Фракции, содержащие р1Ь17Е, объединяют и концентрируют с ультрафильтрационной мембраной 10 кДа, используя ячейку Ат1соп с перемешиванием в подготовке заключительной очистки и буферного обмена эксклюзионной хроматографией.

Ό) Эксклюзионный буферный обмен и состав.

Сконцентрированный катионный пул (в объеме 3-4% от объема колонки) вводят при скорости потока 30 см/ч в эксклюзионную колонку РЕаттааа Зирегбех 75, уравновешенную в 50 мМ буфере фосфата натрия, содержащем 109 мМ №аС1, рН 7,2. Симметричный пик элюата, содержащий продукт, разбавляют до концентрации 1 мг/мл в 50 мМ буфере фосфата натрия, содержащем 109 мМ №аС1, рН 7,2. Наконец, р1Ь-17Е стерильно фильтруют через мембраны 0,2 мкм, делают аликвоты и сохраняют при -80°С. Конечный выход процесса составляет 20%.

Пример 5.

Построение растворимого конструкта экспрессии 1Ь-17КС млекопитающего.

Конструкт экспрессии, содержащий человеческий 1Ь-17КС [Ь21-К451]-тЕс1 (мышь ВАЬВ/с ц2а Ес), получают наложением ПЦР и гомологичной рекомбинации, использующей фрагмент ДНК (последовательность ЗЕО ΙΌ N0:42), кодирующий полипептид 1Ь-17КС (последовательность ЗЕО ΙΌ N0:43), фрагмент ДНК, кодирующий тЕс1 (последовательность ЗЕО ΙΌ N0:44), и вектор экспрессии р2МР20. Фрагменты произведены амплификацией ПЦР.

Фрагмент ПЦР, кодирующий 1Ь-17КС [Ь21-К451], содержит перекрывание 5'-концевого участка с векторной последовательностью р2МР20 в области, кодирующей предпро секреторную лидерную последовательность оптимизированного активатора тканевого плазминогена, [Ь21-К451] кодирует внеклеточный домен 1Ь-17КС и перекрывание 3'-концевого участка с областью, кодирующей тЕб. Реакция ЦПР амплификации использует 5'-концевой олигонуклеотид [СТТТСССТСАСССАССАААТССАТССССАСТТСАСАСССТТСССТАСАСТССАСАСССТТСТССС СССТ; последовательность ЗЕО ΙΌ N0:46], 3'-концевой олигонуклеотид [ТСТССССССТСТССССТССТТСТССАТСТАТТТСТС; последовательность ЗЕО ΙΌ N0:47] и ранее произведенный клон ДНК ГЕ-17КС в качестве матрицы.

- 59 015351

Фрагмент ПЦР, кодирующий тРс1, содержит перекрывание 5'-концевого участка с последовательностью Ш-17РС, причем область кодирует тРс1, и перекрывание 3'-концевого участка с вектором ρΖМΡ20 в области внутреннего рибосомного начального сайта полиовируса. Реакция амплификации ПЦР использует 5'-концевой олигонуклеотид [САСАААТАСАТССАСААССАССССАСАССССССАСА; последовательность 8 ЕС) ΙΌ N0:48], 3'концевой олигонуклеотид [СААССССАСАССТСТТТТААССССССССТСТАСАТТАТТТАСССССАСТСССССА; последовательность 8Е0 ΙΌ N0:49] и ранее произведенный клон ДНК шРс1 в качестве матрицы.

Условия реакции амплификации ПЦР следующие: 1 цикл, 94°С, 5 мин; 35 циклов, 94°С, 1 мин, затем 55°С, 2 мин, затем 72°С, 3 мин; 1 цикл, 72°С, 10 мин. Смеси реакции ПЦР пропускают через 1% агарозный гель и фрагменты ДНК, соответствующие ожидаемым размерам, извлекают из геля, используя комплект для экстракции геля рТАцшск™ (О)адеп, Са!. №. 28704).

Два фрагмента ПЦР соединяют перекрыванием ПЦР. Приблизительно 1 мкл каждого из двух фрагментов, извлеченных из геля, объединяют в реакции амплификации ПЦР, используя 5'-концевой олигонуклеотид [СТТТСССТСАСССАССАААТССАТССССАСТТСАСАСССТТСССТАСАСТССАСАСССТТСТССС СССТ; последовательность 8Е0 ΙΌ N0:46] и 3'-концевой олигонуклеотид [СААССССАСАССТСТТТТААССССССССТСТАСАТТАТТТАСССССАСТСССССА; последовательность 8Е0 ΙΌ N0:49]. Условия реакции амплификации ПЦР следующие: 1 цикл, 94°С, 5 мин; 35 циклов, 94°С, 1 мин, затем 55°С, 2 мин, затем 72°С, 3 мин; 1 цикл, 72°С, 10 мин. Смеси реакции ПЦР пропускают через 1% агарозный гель и фрагменты ДНК, соответствующие ожидаемым размерам, извлекают из геля, используя комплект для экстракции геля р^дшсй™ (О)адеп, Са!. №. 28704).

Плазмида ρΖМΡ20 является вектором экспрессии млекопитающих, содержащим кассету экспрессии, имеющую промотор МР8У, сайт ВдШ для линеаризации перед дрожжевой рекомбинацией, сигнальную пептидную последовательность о!РА, внутренний рибосомный начальный элемент полиовируса, внеклеточный домен СЭ8, урезанный у С-конца трансмембранного домена; Е.со11 репликатор; единицу экспрессии селектируемого маркера млекопитающих, включающую промотор, усилитель и репликатор 8У40, ген ОНРР, и терминатор 8У40; и последовательности ИРА3 и СЕ^АРБ, требуемые для выбора и репликации в 8. сегеу1к1ае.

Плазмида ρΖМΡ20 расщепляется ВдШ перед рекомбинацией в дрожжах гель-экстрагированного Ι617РС[Ь21-К451]-шРс1 фрагмента ПЦР. 100 мкл подходящих дрожжевых (8. сегеу1к1ае) клеток объединяют с 10 мкл Ш-17РС [Ь21-К451]-шРс1 инсерта ДНК и 100 нг вектора ρΖМΡ20, расщепленного ВдШ, и смесь переносят в кювету электропорации на 0,2 см. Смесь дрожжи/ДНК подвергают электроимпульсной обработке, используя электропитание (ВюРаб ЬаЬога1опек, Негси1ек, СА) с параметрами настройки 0,75 кВ (5 кВ/см), ж Ом и 25 мкФ. 600 мкл 1,2 М сорбита добавляли в кювету и дрожжи высевали в аликвотах 100 мкл и 300 мкл на два планшета ИРА-Э и культивировали при 30°С. Приблизительно после 72 ч Ига+ трансформанты дрожжей из одного планшета ресуспендируют в 1 мл воды и спрядывают кратко в шарик дрожжевых клеток. Шарик клеток ресуспендируют в 0,5 мл буфера лизиса (2% Тритон Х-100, 1% СДС, 100 мМ №С1, 10 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТУК). 500 мкл смеси лизиса добавляют в пробирку Эппендорфа, содержащую 250 мкл стеклянных шариков, промытых кислотой, и 300 мкл фенол-хлороформа, перемешивают в течение 3 мин и крутят в течение 5 мин в центрифуге Эппендорфа при максимальной скорости. 300 мкл водной фазы переносят в новую пробирку и ДНК осаждают 600 мкл этанола с последующим центрифугированием в течение 30 мин при максимальной скорости. Пробирку декантируют и шарик промывают 1 мл 70%-го этанола. Пробирку декантируют и шарик ДНК ресуспендируют в 30 мкл 10 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТУК.

Трансформация электрически подходящих клеток-хозяев Е.со11. (ΌΗ128) выполняется, используя 5 мкл препарата ДНК дрожжей и 50 мкл клеток Е.соН. Клетки подвергают электроимпульсной обработке при 2,0 кВ, 25 мкФ и 400 Ом. После электропорации добавляют 1 мл 80С (2% Вас!о™ Тгу]э!опе (Ойсо, Ое1гой, М1)), 0,5% экстракта дрожжей (Эйсо), 10 мМ №С1, 2,5 мМ КС1, 10 мМ МдС1₂, 10 мМ Мд80₄, 20 мМ глюкоза) и затем клетки высевали в аликвотах 50 мкл и 200 мкл на двух планшетах ЬВ АМР (бульон ЬВ (Ъеппох), 1,8% Вас!о™ Адаг (Ойсо), 100 мг/л ампициллина).

Инсерты трех клонов ДНК для конструкта подвергают секвенированию и выбирают один клон, содержащий правильную последовательность. Крупномасштабную плазмиду ДНК выделяли, используя коммерчески доступный комплект (ОМСЕИ Р1акт1б Меда Кй, Р1адеп, Уа1епс1а, СА) согласно инструкциям изготовителя.

Пример 6.

Построение растворимых конструктов экспрессии Ш-17РС млекопитающего, которые экспрессируют Ш-17РС-СЕЕ, П.-17РС-С1 ΙΙ8 и Ш-ПРС-СРЬАС.

Конструкт экспрессии, содержащий человеческий Ш-17РС [Б21-К451] с С-концевой меткой С1иС1и (СЕЕ), шесть Н1к (СНК) или РЬАС (СРЬАС), строят через ПЦР и гомологическую рекомбинацию, применяя фрагмент ДНК, кодирующий Ш-17РС [Б21-К451] (последовательность 8Е0 ΙΌ N0:42), и век

- 60 015351 тор экспрессии р2МР20.

Фрагмент, кодирующий РСК Ш-ПИССЕЕ, содержит перекрывание 5-конца с векторной последовательностью р2МР20 в области, кодирующей предпросекреторную лидерную последовательность оптимизированного активатора тканевого плазминогена, [Й21-К451] кодирует внеклеточный домен ЕЕ-17КС, последовательность метки С1и-С1и (С1и С1и Туг Ме! Рго Ме! С1и; последовательность 8Е0 ΙΌ N0:53), и перекрывание 3'-конца с вектором р2МР20 в области внутреннего рибосомного начального сайта полиовируса. Реакция амплификации ПЦР использует 5'-концевой олигонуклеотид [6ТТТС6СТСА6ССА6АААТССАТ6СС6А6ТТ6А6АС6СТТСС6ТА6АСТ66А6А66СТТ6Т6666 ССТ; последовательность 8 ЕС ΙΌ N0:46], 3'-концевой олигонуклеотид [СААСССС6А6СТ6ТТТТАА66С6С6ССТСТА6АТТАТТССАТ666САТ6ТАТТСТТССТТ6Т66АТ6 ТАТТТСТС; последовательность 8Е0 ΙΌ N0:50] и ранее произведенный клон ДНК Ш-ПКС в качестве матрицы.

Условия реакции амплификации ПЦР следующие: 1 цикл, 94°С, 5 мин; 35 циклов, 94°С, 1 мин, затем 55°С, 2 мин, затем 72°С, 3 мин; 1 цикл, 72°С, 10 мин. Реакционную смесь ПЦР пропускают через 1% агарозный гель и фрагменты ДНК, соответствующие ожидаемым размерам, извлекают из геля, используя комплект для экстракции геля рТАдшск™ (Р1адеи, Са!. №. 28704).

Плазмида р2МР20 расщепляется ВдШ перед рекомбинацией в дрожжах гель-экстрагированного Ш17КССЕЕ фрагмента ПЦР. 100 мкл подходящих дрожжевых (8. сегеуыае) клеток объединяют с 10 мкл Ш-ИКССЕЕ инсерта ДНК, и 100 нг вектора р2МР20, расщепленного ВдШ, и смесь переносят в кювету электропорации на 0,2 см. Смесь дрожжи/ДНК подвергают электроимпульсной обработке, используя электропитание (ВюКаб ЬаЬога!ог1ек, Негси1ек, СА) с параметрами настройки 0,75 кВ (5 кВ/см), х> Ом и 25 мкФ. 600 мкл 1,2 М сорбита добавляли в кювету и дрожжи высевали в аликвотах 100 мкл и 300 мкл на два планшета ИКА-О и культивировали при 30°С. Приблизительно после 72 ч Ига+ трансформанты дрожжей из одного планшета ресуспендируют в 1 мл воды и спрядывают кратко в шарик дрожжевых клеток. Шарик клеток ресуспендруют в 0,5 мл буфера лизиса (2% Тритон Х-100, 1% 8Ό8, 100 мМ №С1, 10 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТУК). 500 мкл смеси лизиса добавляют в пробирку Эппендорфа, содержащую 250 мкл стеклянных шариков, промытых кислотой, и 300 мкл фенол-хлороформа, перемешивают в течение 3 мин и крутят в течение 5 мин в центрифуге Эппендорфа при максимальной скорости. 300 мкл водной фазы переносят в новую пробирку и ДНК осаждают 600 мкл этанола с последующим центрифугированием в течение 30 мин при максимальной скорости. Пробирку декантируют и шарик промывают 1 мл 70%-го этанола. Пробирку декантируют и шарик ДНК ресуспендируют в 30 мкл 10 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТУК.

Трансформация электрически подходящих клеток-хозяев Е.со11. (ЭН128) выполняется, используя 5 мкл препарата ДНК дрожжей и 50 мкл клеток Е.соН. Клетки подвергают электроимпульсной обработке при 2,0 кВ, 25 мкФ и 400 Ом. После электропорации добавляют 1 мл 80С (2% Вас!о™ Тгур!оие (ОгГсо, Пе!гой, М1)), 0,5% экстракта дрожжей (ЭДсо), 10 мМ №С1, 2,5 мМ КС1, 10 мМ МдС1₂, 10 мМ Мд80₄, 20 мМ глюкоза), и затем клетки высевали в аликвотах 50 мкл и 200 мкл на двух планшетах ЬВ АМР (бульон ЬВ (Ъеииох), 1,8% Вас!о™ Адаг (ОгГсо), 100 мг/л ампициллина).

Инсерты трех клонов ДНК для конструкта подвергают секвенированию и выбирают один клон, содержащий правильную последовательность. Крупномасштабную плазмиду ДНК выделяли, используя коммерчески доступный комплект (^IАСЕN Р1акт1б Меда КД, Р1адеи, Уа1еис1а, СА) согласно инструкциям изготовителя.

Тот же самый процесс применяют, чтобы получить Ш-ПКС с С-концевой меткой Н1к, составленной из С1у 8ег С1у С1у Н1к Н1к Н1к Н1к Н1к Н1к (Ш-ПКССНШ; последовательность 8Е0 ΙΌ N0:51) или с С-концевой меткой ЕЬАС, составленной из С1у 8ег Акр Туг Ьук Акр Акр Акр Акр Ьук (I^-17КССΕ^ЛС; последовательность 8Е0 ΙΌ N0:52). Чтобы получить эти конструкты, вместо 3'-концевого олигонуклеотида последовательности 8Е0 ΙΌ N0:50 применяют 3'-концевой олигонуклеотид [СААССССА6А6СТ6ТТТТАА66С6С6ССТСТА6АТТА6Т6АТ66Т6АТ66Т6АТ6ТССАСС АСАТСССТТСТССАТСТАТТТСТС; последовательность 8 ЕС ΙΌ N0:54], чтобы произвести Ш17КССШ8, или 3'-концевой олигонуклеотид [СААССССА6А6СТ6ТТТТАА66С6С6ССТСТА6А ТТАСТТАТСАТСАТСАТССТТАТААТ С66АТСССТТ6Т66АТ6ТАТТТ6ТС; последовательность 8ЕС ΙΌ N0:55], чтобы произвести Ш-ПКССЕЬАб.^^.

Пример 7.

Трансфекция и экспрессия растворимых конструктов экспрессии рецептора Ш-ПКС, которые экспрессируют слитый белок Ш-ПКС-тЕс]. и С-концевые теговые белки Ш-ПКС-СЕЕ, Ш-ПКС-СНШ Ш17КС-СЕЬА6.

Три набора по 200 мкг каждого растворимых слитого или теговых конструкций экспрессии Ш-ПКС отдельно расщепляют 200 единицами Руи1 при 37°С в течение 3 ч, осаждают изопропиловым спиртом и центрифугируют в 1,5-мл микроцентрифужной пробирке. Супернатант декантируют с шарика и шарик промывают с 1 мл 70%-го этанола и культивируют в течение 5 мин при комнатной температуре. Пробирку крутят в микроцентрифуге в течение 10 мин при 14000 об/мин и супернатант декантируют с шарика.

- 61 015351

Шарик затем повторно суспендируют в 750 мкл культуральной среды тканевых клеток СНО в стерильной среде, культивируют при 60°С в течение 30 мин и позволяют охладиться до комнатной температуре. Приблизительно 5 х 10⁶ клеток СНО гранулируют в каждой из трех пробирок и повторно суспендируют, используя раствор питательной среды ДНК. Смеси ДНК/клетки помещают в кювету со щелью 0,4 см и подвергают электропорации, используя следующие параметры; 950 мкФ, высокая емкость, при 300 В. Содержание кювет затем удаляют, объединяют и разбавляют до 25 мл культуральной средой тканевых клеток СНО и помещают во встряхиваемую колбу на 125 мл. Колбу помещают в инкубатор на аппарате для встряхивания при 37°С, 6% СО2 с колебанием 120 об/мин.

Клетки СНО подвергнуты питательному выбору с последующей амплификацией до 200 нМ метотрексата (МТХ) и затем до 1 мкМ МТХ. Экспрессия слитого или тегового белка подтверждается Вестернблоттингом, и пул клеток СНО увеличивают для урожаев для очистки белков.

Пример 8.

Экспрессия растворимого Ш-17КС.

Плазмида экспрессии, содержащая 1Ь-17КС_ТЬх-С(Рс9) (последовательность 8ЕО ΙΌ N0:64), была построена через гомологическую рекомбинацию, используя фрагмент ДНК 1Ь-17КС_ТЬх и вектор экспрессии р2МР40. Фрагмент был произведен амплификацией ПЦР, используя праймеры 2С44531 и 2С44545.

1Ь-17КС_ТЬх фрагмент ПЦР содержит область, кодирующую парциальный внеклеточный домен 1Ь17КС, который был сделан, используя ранее произведенный клон Ш-17КС в качестве матрицы. Фрагмент включает перекрывание 5'-конца с последовательностью вектора р2МР40 в области, кодирующей о!РА, сегмент Ш-17КС (аминокислотные остатки с 21 до 451 последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2), линкерная последовательность, сайт расщепления тромбина, и перекрывание 3'-конца с вектором р2МР40 в области, кодирующей Рс9. Используемые условия ПЦР были следующие: 1 цикл, 94°С, 5 мин; 35 циклов, 94°С, 1 мин, затем 55°С, 2 мин, затем 72°С, 3 мин; 1 цикл, 72°С, 10 мин.

Реакционные смеси ПЦР пропускают через 1% агарозный гель и полосы, соответствующие размерам инсертов, извлекают из геля, используя комплект для экстракции геля О^сциск™ (Р1адеп, Са!. №. 28704).

Плазмида р2МР40 является вектором экспрессии млекопитающих, содержащим кассету экспрессии, имеющую промотор МР8У, многие рестрикционные сайты для вставки кодирующих последовательностей, сигнальную пептидную последовательность о!РА и последовательность для Рс9; внутренний рибосомный начальный сайтовый (ВРНС) элемент из полиовируса и внеклеточный домен, СЭ8усеченного у С-конца трансмембранного домена; Е.соН репликатор; единицу экспрессии селектируемого маркера млекопитающего, включающую промотор 8У40, усилитель и репликатор, ген ЭНЕЕ и терминатор 8У40; и последовательности ИКА.3 и СЕ№АК8, требуемые для селекции и репликации в 8. сегеУ1к1ае. Она была построена из р2МР21 (Ра!еп! РиЬ. №. И8 2003/0232414 А1; выложенный при культурной коллекции американского типа и определяемый как АТСС # РТА-5266).

Плазмида р2МР40 расщепляется Вд111 перед рекомбинацией в дрожжах с фрагментом ПЦР. 100 мкл подходящих дрожжевых (8. сегеук1ае) клеток независимо объединяют с 10 мкл инсерта ДНК (последовательность 8ЕО ΙΌ N0:66) и 100 нг отрезка вектора р2МР40 и смесь переносят в кювету электропорации на 0,2 см. Смесь дрожжи/ДНК подвергают электроимпульсной обработке, используя электропитание (ВюКай ЬаЬога!опек, Негси1ек, СА) с параметрами настройки 0,75 кВ (5 кВ/см), х> Ом и 25 мкФ. 600 мкл 1,2 М сорбита добавляли в кювету и дрожжи высевали в аликвотах 100 мкл и 300 мкл на два планшета иКА-Ό и культивировали при 30°С. Приблизительно после 72 ч Ига+ трансформанты дрожжей из одного планшета ресуспендируют в 1 мл воды и спрядывают кратко в шарик дрожжевых клеток. Шарик клеток ресуспендруют в 0,5 мл буфера лизиса (2% Тритон Х-100, 1% 8Ό8, 100 мМ №С1, 10 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТУК). 500 мкл смеси лизиса добавляют в пробирку Эппендорфа, содержащую 250 мкл стеклянных шариков, промытых кислотой, и 300 мкл фенол-хлороформа, перемешивают в течение 3 мин и крутят в течение 5 мин в центрифуге Эппендорфа при максимальной скорости. 300 мкл водной фазы переносят в новую пробирку и ДНК осаждают 600 мкл этанола с последующим центрифугированием в течение 30 мин при максимальной скорости. Пробирку декантируют и шарик промывают 1 мл 70%-го этанола. Пробирку декантируют и шарик ДНК ресуспендируют в 30 мкл ТЕ.

Трансформация электрически подходящих клеток-хозяев Е.соН. (ЭН128) выполняется, используя 5 мкл препарата ДНК дрожжей и 50 мкл клеток. Клетки подвергают электроимпульсной обработке при 2,0 кВ, 25 мкФ и 400 Ом. После электропорации добавляют 1 мл 80С (2% Вас!о™ Тгур!опе (ОНсо, Ое(го11, М1)), 0,5% экстракта дрожжей (Оксо), 10 мМ №С1, 2,5 мМ КС1, 10 мМ МдС1₂, 10 мМ Мд80₄, 20 мМ глюкоза), и затем клетки высевали в аликвотах 50 мкл и 200 мкл на двух планшетах ЬВ АМР (бульон ЬВ (^еииоx), 1,8% Вас!о™ Адаг (Ойсо), 100 мг/л ампициллина).

Инсерты трех клонов ДНК для конструкта подвергают секвенированию и выбирают один клон, содержащий правильную последовательность. Крупномасштабную плазмиду ДНК выделяли, используя коммерчески доступный комплект (^IΛСЕN Р1акт1й Меда КН, Р1адеп, Уа1епс1а, СА) согласно инструкциям изготовителя.

- 62 015351

Три набора по 200 мкг конструкта ГО-17КС [Ь21-К451] _ТЬх_С (Ес9) были затем каждый расщеплены 200 единицами Руи1 при 37°С в течение 3 ч и затем осаждались изопропиловым спиртом (ИПС) и спрядывались в 1,5-мл микроцентрифужной пробирке. Супернатант декантировали с шарика и шарик промывали 1 мл 70%-го этанола и культивировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Пробирку крутили в микроцентрифуге в течение 10 мин при 14 000 об/мин и супернатант декантировали с шарика. Шарик был затем повторно суспендирован в 750 мкл среды РЕ-СН0 в стерильной среде, культивировали при 60°С в течение 30 мин и позволяли охлаждаться до комнатной температуры. Клетки 5Е6 АРЕЭХВ11 спрядывались в каждой из трех пробирок и были повторно суспендированы, используя раствор питательных сред ДНК. Смеси ДНК/клетки помещали в кювету со щелью 0,4 см и подвергали электропорации, используя следующие параметры: 950 мкФ, высокую емкость и 300 В. Содержимое кювет затем удаляли, объединяли и разбавляли до 25 мл средами РЕ-СН0 и помещали в 125-мл колбу для встряхивания. Колбу помещали в инкубатор на аппарате для встряхивания при 37°С, 6% С0₂ и взбалтывали при 120 об/мин.

Клеточную линию подвергали питательному выбору с последующей амплификацией до 200 нМ метотрексата (МТХ) и затем до 1 мкМ МТХ. Экспрессия подтверждается Вестерн-блоттингом, и клеточная линия увеличивается с последующей очисткой белка.

Пример 9.

Очистка растворимого ГО-17КС от клеток СНО.

Кондиционированные среды от клетек СНО, экспрессирующих ГО-17КС-ТЬХ-Ес9 (последовательность 8ЕО ГО N0:64), концентрировали приблизительно 10-кратно с помощью тангенциальной системы потока РеШсоп по отношению к двум мембраным кассетам Вютах 0,1 м2, предельная молекулярная масса 30 кДа (М1Шроге, ВебГогб, МА). Водородный показатель (рН) концентрированной среды приводили к 5,5 ледяной уксусной кислотой, стерильно отфильтрованной через мембрану 0,2 мкм, затем загружали на смолу сефароза Протеин Ж (РгоГет С керНагоке) (РНагтааа, Р1ксаГа^ау, N1) для периодической хроматографии в течение ночи при 4°С. До загрузки кондиционированной среды с приведенным рН смола сефароза Протеин Ж была предуравновешена раствором 25 мМ ацетата натрия и 150 мМ №С1, рН 5,5 в количестве 5 объемов колонки (приблизительно 150 мл). Отношение фильтрованной, кондиционированной среды с приведенным рН к смоле был 33:1 (по объему).

Периодический процесс хроматографии выполняли при окружающей комнатной температуре (приблизительно 21°С). Одноразовую кондиционированную среду, фильтрованную через мембрану 0,22 мкм, с приведенным рН выливали в пустую стеклянную колонку 5,5 х 20,5 см (ВюКаб, Негси1ек, СА) и насадка наносилась под действием силы тяжести. Колонку промывали (10 объемов колонки (приблизительно 300 мл)) раствором 25 мМ ацетата натрия и 150 мМ №С1, рН 5,5. Связанный белок затем элюировали 100 мМ глицина, рН 2,7. Фракции по 9,0 мл были собраны и немедленно нейтрализованы 1,0 мл 2,0 М Трис, рН 8,0. Собранные фракции были проанализированы через окрашивание по Кумасси (8П8-РАСЕ Соотакые кГа1шпд). Фракции, содержащие ГО-17КС-ТЬх-Ес9, объединяли и концентрировали приблизительно 6-кратно, используя вращающийся концентратор с мембраной Вютах (предельный молекулярный вес 5кЭ) (М1Шроге, ВебГогб, МА) согласно инструкциям изготовителя.

Объединенные, концентрированные фракции были затем подвергнуты диализу при 4°С, в значительной степени относительно фосфатно-буферного солевого раствора IX, рН 7,3 (81дта, 8Г.-Ьошк, МО), используя мембрану 8Нбе-А-Еухег с предельным молекулярным весом 7 кДа (Р1егсе, КосГкГогб, ГО).

Состав ГО-17КС-ТЬХ-Ес9 в 1 х фосфатно-буферном растворе, рН 7,3, был стерильно отфильтрован через мембрану 0,22 мкм перед созданием аликвот и хранением при -80°С.

Пример 10.

Связывание ГО-17А и ГО-17Е с человеческим ГО-17КС.

А) Связывание биотинилированных цитокинов с трансфицированными клетками.

Клетки почки детеныша хомяка (ПДХ), которые были трансфицированы векторами экспрессии, кодирующими человеческий рецептор ГО-17 (последовательность 8ЕО ГО N0:21), человеческий ГО-17КС (последовательность 8Е0 ГО N0:2) или оба этих рецептора, оценивают по их способности связывать биотинилированные человеческий ГО-17А и человеческий ГО-17Е. Клетки собирают версеном (динатриевая соль ЭДТУК), считают и разбавляют до 107 клеток на мл в окрашивающих средах (ОС), которые представляют собой буферный солевой раствор Хэнка (БСРХ (НВ88)) плюс 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА (В8А)), 10 мМ Нерек и 0,1% азида натрия (вес/объем). Биотинилированные человеческий ГО-17А (последовательность 8Е0 ГО N0:14) и человеческий ГО-17Е (последовательность 8Е0 ГО N0:16) культивировали с клетками на льду в течение 30 мин при различных концентрациях. После 30 мин избыточный цитокин смывают ОС и клетки культивируют с конъюгатом стрептавидинфикоэритрин (СА-ФЭ (8А-РЕ)) при разбавлении 1:100 в течение 30 мин на льду. Избыточный СА-ФЭ смывают и клетки анализируют поточной цитометрией. Количество связывания цитокина было количественно определено из средней интенсивности флюоресценции окрашивания цитокина. Из этого анализа мы находим, что человеческий ГО-17А связывает как человеческий ГО-17К, так и ГО-17КС в равной степени. Кроме того, человеческий ГО-17Е связывает ГО-17КС в подобной степени, но связывает ГО-17К оп

- 63 015351 ределяемо, но в намного более низкой степени, чем степень, замеченная с ГО-17А.

B) Связывание биотинилированных цитокинов с мононуклеарными клетками человеческой периферической крови.

Мононуклеарные клетки человеческой периферической крови (МКПК) получали из цельной крови центрифугированием в градиенте плотности (среда фиколл). МКПК при 107 клетках на мл одновременно культивировали с биотинилированными ΙΕ-17Λ или К-ПР при 1 мкг/мл и флюорохром-сопряженными антителами к определенным белкам поверхности клетки, которые были разработаны, чтобы различать лейкоциты различного происхождения. Эти маркеры включают СЭ4, СЭ8, СЭ19, СЭ11Ь, СЭ56 и СЭ16. Избыточные антитела и цитокины смывают и определенное связывание цитокина обнаруживают культивированием с СА-ФЭ, как описано выше. Образцы анализировали поточной цитометрией и из этого анализа мы нашли, что человеческий ГЕ-17А связывается фактически со всеми исследованными популяциями МКПК, но что человеческий Ι6-17Ε не связывается определяемо с какой-либо популяцией.

C) Ингибирование специфического связывания биотинилированных человеческих ГЕ-17А и ΙΕ-17Ε с немаркированным цитокином.

Исследование связывания выполняют, как обсуждено выше, но избыточные, немаркированные человеческие ГО-17А и ΙΕ-17Ε включаются в реакцию связывания. В исследованиях с клетками ПДХ количество немаркированного цитокина было различно по интервалу концентраций, и мы нашли, что добавление немаркированного ГО-17А конкурировало за связывание ГО-17А и ΙΕ-17Ε с ΙΠ-17ΚΠ и ГО-17К. Однако немаркированный ГО-17Р конкурировал за связывание ГО-НА и ΙΕ-17Ε с ГО-НКС, но он не конкурировал эффективно за связывание с ГО-17К. Это указывает, что ГО-17А и Ι6-17Ε специфично связываются с ГС-17КС, и что они связываются на сайте, который или идентичен, или перекрывается значительно, так как они перекрестно конкурируют за связывание. Кроме того, ГО-17А конкурирует с относительно слабым связыванием ГО-17Р с ГО-ПК, указывая, что эти два цитокина также связываются с подобной областью в ГО-17К, но ΙΕ-17Ε связывает ГО-17К с гораздо более низким сродством по сравнению с ГО-17КС.

Ό) Ингибирование специфического связывания биотинилированных человеческих ГО-17А и Ι6-17Ε с растворимыми ГО-17КС и К-17К

Исследования связывания выполняют, как обсуждено выше, за исключением того, что растворимые формы ГО-17КС или ΙΕ-17Ε включают в реакции связывания. Эти растворимые рецепторы представляют собой слитые белки, полученные из внеклеточного домена каждого рецептора, слитого с константной областью (Рс) человеческого ^01. Мы нашли, что растворимый ΙΠ-17КС ингибирует связывание человеческих ГО-17А и Ш-ПР с клетками ПДХ, трансфицироваными ΙΕ-17Ε и ГО-17КС. Однако растворимый ГО-17К ингибирует связывание ГО-НА с любым рецептором, но эффективно не блокирует связывание ГО17Р с ГО-17КС, что совместимо со слабым связыванием К-ПР с Ш-17К

Пример 11.

ГО-17А и К-ПР связывается с ГО-17КС.

A) Ингибирование связывания с холодным лигандом.

Клетки ПДХ, трансфицированные ЫЬ-17КС (последовательность 8Еф ГО N0:2) и ΙΕ-17Ε (последовательность 8Е0 ГО N0:21), высевали в 24-луночный планшет (Сок!аг 3527) при 40000 клеток/лунку за два дня до анализа. ГО-17А (последовательность 8Еф ГО N0:14) и Ι6-17Ε (последовательность 8Еф ГО N0:16), которые были помечены радиоактивным изотопом иодогранульным методом, добавляли независимо в лунки трижды при 10 нг/мл в общей сложности 250 мкл/лунку в связывающем буфере (среда КРМI 1640 (ДКН 51502-500М) с 10 мг/мл альбумина бычьей сыворотки (01Ьсо 15260-037)). Холодные конкуренты добавляли в 100-кратном молярном избытке. Испытанные конкуренты включали ГО-ПА, ГОНВ, ГО-НС, ΙΕ-17Ό, ГО-17Е, Ш-17Р и ГО-21. Лунки культивировали на льду в течение 1 ч, затем промывали два раза фосфатным буферным раствором (ФБР) Цпуйтодеп 20012-027) и один раз высокосолевым раствором (1,5 М №С1, 50 мМ НЕРЕ8, рН 7,4). Лунки экстрагировали 500 мкл 0,8 М №-10Н в течение 30 мин при комнатной температуре, и счет импульсов в минуту измеряли, применяя гамма-счетчик (Раскагб СоЬга ΙΙ А5005).

Результаты указали, что 100-кратный молярный холодный ГО-НА и ГО-17Р были в состоянии уменьшать связывание 1251 ГО-17А с ЫЬ-17КС ПДХ приблизительно 7-кратно, в то время как ГО-17В, С, Ό, Е и ΙΕ-21 не имели никакого влияния на связывание. 100-кратный молярный холодный ГО-17А снижал связывание 1251 ГО-17А с ΙΕ-17Ε ПДХ приблизительно 4-кратно, в то время как ГО-ПВ, С, Ό, Е, Р и ГО-21 не имели никакого влияния на связывание. 100-кратные молярные холодные ГО-17А и ГО-17Р уменьшали связывание 1251 ГО-17Р с ЫЕ-17КС ПДХ приблизительно 4- и 5-кратно соответственно, в то время как Ш-17В, С, Ό, Е и ГО-21 не имели никакого эффекта на связывание.

B) Ингибирование связывания растворимым рецептором.

Связывание с Нху!ог14 (последовательность 8Еф ГО N0:2) клеток ПДХ, трансфицированных ΙΕ-17Ε (последовательность 8Еф ГО N0:21), выполняли как в части один, но 100-кратный молярный избыток растворимого ЫЬ-17КСх1/Ес9 (пример 8) и растворимого ГО-НК/РС (полученный из Е&Э; ссылка 177ΙΕ) использовали вместо холодного лиганда в конкуренции. Клетки промывали, экстрагировали и считали как в части один.

- 64 015351

Растворимый ЫП-17ВС/Рс ингибировал связывание 1251Ь-17Р с ЫР-17КС ПДХ с ИК50 при 10-кратном молярном избытке в среднем в трех экспериментов. Ингибирование 125ПЬ-17А растворимым ЫП-17ВС/Рс на той же самой клеточной линии дало в среднем ИК50 при 20-кратном молярном избытке, а ингибирование 1251 1Ь-17А растворимым 1Ь-17ВС/Рс дало в среднем ИК50 при 20-кратном молярном избытке.

С) Насыщение связывания.

Трансфицированные клетки ПДХ высевали на 24-луночный планшет как в части один. Радиоактивно-меченые 1Ь-17А и ΙΡ-17Η добавляли, начиная с концентрации 4 нМ в восьми 1:3 разбавлениях (до концентрации 1,83 пМ) в трех экспериментах, в общем 250 мкл/лунку в буфере связывания. Отдельно, 100-кратный молярный избыток холодного лиганда добавляли в каждом пункте разбавления. Клетки промывали, экстрагировали и считали как в части один. Определенный счет в минуту был нанесен на график против концентрации радиоактивно-меченого лиганда, добавленного, вычитая 100-кратный избыток счета из неконкурентного счета в каждом пункте разбавления. Эти нормализованные данные были подготовлены, чтобы получить кривые насыщения связывания для каждой комбинации радиоактивномеченого лиганда и трансфицированных клеток ПДХ. Табл. 7 показывает величины сродства, вычисленные из всех трех экспериментов.

Таблица 7

1251 И-17А +ПДХ ЫЫ7КС

1. 180 пМ

2. 200 пМ

3. 370 пМ

1251 И-17А + ПДХИ-17К

1.2.5+/-0.2 нМ

2. 4.5 +/-0.3 нМ

3. 5.9 +/-0.1 нМ

1251 И-17Р + ПДХ ЫП17КС

1. 50 пМ

2. 60 пМ

3. 80 пМ

1251И-17Р + ПДХ И-17К

1. очень низкое сродство

2. очень низкое сродство

3. очень низкое сродство

Кривая односайтового связывания подходит наиболее близко для связывания ΙΡ-17Λ и 1Ь-17Р с ΙΡ17В. Кривая двухсайтового связывания подходит наиболее близко для связывания 1Р-17А и ΙΡ-17Η с ЫР17ВС. Сайт высокого сродства связывания является величиной, показанной выше. Сайт низкого сродства связывания имел очень низкое сродство и изменялся широко в трех экспериментах.

Пример 12.

Реакция мышиных клеток N111313 на человеческие 1Ь-17А и ΙΡ-17Η.

A) Культивирование клеток и инфекция репортерного аденовируса к/142.

Клетки N113(3 получали из фибробластов мыши (описано в АТСС). N113(3 высевали в количестве 5000 клеток/лунку в твердом, белом, покрытом клеточной культурой 96-луночном планшете (Са1. #3917. СоКаг), применяя среду СИМД/10% ФБС (среда Игла, модифицированная Дулбекко/10% фетальной бычьей сыворотки), содержащую глутамин и исправленную пируватом, и культивировали в течение ночи при 37°С и 5% С0₂. На второй день культуральную среду удаляли и частицы аденовируса К/142 при кратности инфекции 5000 частиц/клетку получали в среде СИМД/1% ФБС, содержащей глутамин и исправленной пируватом и культивированной в течение ночи при 37°С и 5% С02.

B) Люциферазный анализ, измеряющий активацию 1Ь-17А и Р клеток т'Ь3!3, инфицированных репортерным аденовирусом к/142.

После ночной инкубации с репортерной частицей аденовируса человеческие лиганды 1Ь-17А и 1Ь17Р получали в бессывороточных средах, исправленных к 0,28% АБС (альбумин бычьей сыворотки). Частицы аденовируса и питательные среды удаляли, и адекватные дозы лиганда давались в 3 экспериментах. Инкубацию при 37°С и 5% С02 продолжали в течение 4 ч, после которых питательные среды удаляли, клетки подвергали лизису в течение 15 мин и среднюю интенсивность флюоресценции (СИФ) измеряли, применяя систему и реагенты люциферазного анализа (Са! # е1531 Рготеда, МабНоп, Ш1) и микропланшетный люминометр. Активность была обнаружена при концентрациях в интервале 0,1-1000 нг/мл человеческого 1Ь-17А и 1Ь-17Р, что дает величину ЕС50 приблизительно 50 нг/мл для обоих лигандов. Эти данные предполагают, что клетки пШ313 несут рецепторы к этим лигандам и что ΙΡ17А и ΙΡ-17! активируют фактор транскрипции N^^^^-1.

Пример 13.

Экспрессия !Ъ-17КА и П.-17КС мышиными клетками т'Ь3!3.

Анализ ОТ ПЦР РНК 11113(3 продемонстрировал, что эти клетки позитивны как для 1Т-17КА, так и для РЬ-ПКС, что совместимо с их пГкЬ/ар1 реакцией, причем посредничество человеческих РР-17А и ΙΤ17Р опосредуется через один или оба из этих рецепторов.

Детали от ПЦР.

А) Мышиная ПЦР Ш-17КС.

Первую нить кДНК получали из полной РНК, выделенной из клеток п1Ь3!3, используя стандартные методы. ПЦР применяли, используя Но181аг полимеразу и рекомендации изготовителя (СРапеп, Уа1епс1а, СА), используя сенсорный праймер, 2С38910, 5' АССААССССАССТАССАСАААСАС 3' (последовательность 8ЕО ΙΌ N0:56) и антисенсорный праймер, /С 38679, 5' ААААСССССССАСССААСАСТАСС

- 65 015351

3' (последовательность 8Еф ΙΌ NΟ:57) и 35 циклов амплификации. Электрофорез на агарозном геле показал единственный, сильный ампликон ожидаемого размера, 850 пар оснований.

В) Мышиная ПЦР Ι6-17ΚΛ.

Первую нить кДНК получали из полной РНК, выделенной из клеток шб313, используя стандартные методы. ПЦР применяли, используя Но!8!аг полимеразу и рекомендации изготовителя (фхадеп, Уа1епс1а, СА), используя сенсорный праймер, 2С38520, 5' ССТААССССТСССССТТТТС 3' (последовательность 8Еф ΙΌ NΟ:58) и антисенсорный праймер, 2С38521, 5' ТССССАССССАСАСТСАСАС 3' (последовательность 8Еф ΙΌ NΟ:59) и 35 циклов амплификации. Электрофорез на агарозном геле показал единственный, сильный ампликон ожидаемого размера, 498 пар оснований.

Пример 14.

Создание устойчивого клона анализа шб313, экспрессирующего фактор транскрипции ар1/пГкЬ.

Мышиную клеточную линию шб313, описанную выше, устойчиво трансфицировали репортерным конструктом к/142 ар1/пГкЬ, содержащим неомицин-селектируемый маркер. Нео-устойчивый пул трансфекции высевали при клональной плотности. Клоны выделяли, используя клонзапирающие кольца, и подвергали скринингу люциферазным анализом, используя человеческий лиганд Ι6-17Λ в качестве индуктора. Выбирали клоны с самой высокой средней интенсивностью флюоресценции (СИФ) (через ар1/пГкЬ люциферазу) и самый низкий фон. Выбрана устойчивая клеточная линия трансфектанта и названа п1б313/кг142.8.

Пример 15.

Ингибирование активации человеческим Ι6-17Λ и Ι6-17Ρ в мышиных клетках Νί!3ΐ3, используя растворимые химеры Ι6-17Κ0’ и Ι6-17ΚΛ/ΡΟ’.

Растворимые формы ]Ъ-17КС или Ι6-17ΚΛ использовались как антагонисты активации человеческих Ι6-17Λ и Ι6-17Ρ элементов ар1/пГкЬ в люциферазном анализе. Эти растворимые рецепторы представляют собой слитые белки, полученные из внеклеточного домена каждого рецептора, слитого с константной областью (Ес) человеческого ^С1. Растворимый человеческий слитый белок Ι6-17Κ ЕС был куплен (рекомбинантная человеческая химера ΙΌ-17К/ЕС, каталожный номер 177-ΙΚ-100, Κ&Ό 8ук1ешк, Шс., М1ппеаро11к, Мп). Растворимая человеческая химера Ι6-17Κ0’ ЕС иб-ПКСкК/ЕСУ) была построена, как описано выше. Мы нашли, что избыток Ш-ПКСкК/ЕСУ и человеческая химера ШПЕкК/РС ингибируют уровни ЕС50 как человеческого Ι6-17Λ, так и Гб-ПЕ-опосредованной активации ар1/пГкЬ мышиной аналитической клеточной линии пП13!3/кх142.8.

Белок ΙΕ-ΠΡΟΥΚ/ΡΟΑ показал самую большую потенцию в противодействии активации Ι6-17Β а химера ШПЕкК/ЕС показала самую большую потенцию в противодействии активации Ι6-17Α.

Пример 16.

мРНК Ι6-17Е активируется в мышиной модели астмы.

Уровни мРНК Ι6-17Γ измеряли в сенсибилизации и модели стимула дыхательных путей в мышах. Группы мышей 8-10-недельного возраста сенсибилизировали интраперитонеальной инъекцией 10 мкг рекомбинантного аллергена 1 Оегта1орбадо1йек р!егопуккйшк (ЭегР1) Цпйоог Ыо1есбпо1од1ек, Сагйй£, ИК) в 50% А1ит (Р1егсе) в дни 0 и 7. Семь дней спустя, мыши стимулировались каждый 3-й последовательный день (дни 14, 15 и 16) 20 мкг ЭегР1 в 50 мкл ФБР. Было 4 мыши, представляющие эту группу. Отрицательные контрольные группы включали 5 мышей, подвергнутых сенсибилизации фосфатным буферным раствором (ФБР), затем стимулированию ФБР. В дополнение, 3 мыши подвергали сенсибилизации ЭегРб затем стимулировали ФБР. Через 48 ч после аллергена или контрольного стимулирования всю легочную ткань собирали и полную РНК выделяли.

Первую нить кДНК получали, используя идентичное количество полной РНК от каждого субъекта. ПЦР Ι6-17Ρ применяли, используя ф1адеп Но!8!аг полимеразу (ф1адеп, Уа1епаа, СА) и рекомендации изготовителя. ПЦР Ι6-17Ρ использовала 35 циклов амплификации с сенсорным праймером 2С46098, 5' АСТТСССАТТСТСАСССАССТАСС 3' (последовательность 8Еф ΙΌ NΟ:60) и антисенсорным праймером, 46099, 5' САСАССТССАСССААСТТТТАССА 3' (последовательность 8Еф ΙΌ NΟ:61). Для того чтобы установить, что матричное качество матрицы было однородным среди всех субъектов, ПЦР Бета Актина применяли к тому же самому количеству каждой матрицы, используемой в амплификации Ι617Е. ПЦР Бета Актина включала 25 циклов ПЦР с сенсорным праймером, 2С44779,

5' СТСССССССТСТАСССАССА 3' (последовательность 8Еф ΙΌ NΟ:62) и антисенсорным праймером, Ζ0’44776, 5' СССТТССССТТАСССТТСАСССССС 3' (последовательность 8Еф ΙΌ ^:63).

Все 4 мыши из группы, сенсибилизированной ЭегР1 и стимулированной ЭегР1 (симуляция астмы), показали сильную амплификацию Ι6-17Γ. Напротив, слабая амплификация Ι6-17Ρ было замечена в отрицательных контрольных группах, включая 3 из 3 субъектов, представляющих ЭегР1сенсибилизированную/ФБР-стимулированную группу и 5 из 5 субъектов из ФБРсенсибилизированной/ФБР-стимулированной группы. Амплификация бета-актина была, по меньшей мере, такой же сильной для отрицательных контрольных групп, как для астма-моделируемых субъектов, демонстрируя, что слабая отрицательная контрольная амплификации Ι6-17Ρ не происходила из-за матричных проблем.

- 66 015351

Пример 17.

Трансфекция клеток С08 и секреционная ловушка.

A) Трансфекция клеток С08 и анализы секреционная ловушка показывают, что 1Ь-17КСкК/Рс9 и 1Ь-17Р представляет собой пару рецептор/лиганд.

Анализ секреционная ловушка применяли, чтобы спарить человеческий 1Ь-17КС (последовательность δΕΟ 1Ό N0:2) с человеческим 1Ь-17Р (последовательность δΕΟ 1Ό N0:16). Растворимый слитый белок 1Ь-17КСкК/Рс9 (пример 8) использовался как связывающий реагент в секреционном анализе. 8У40 оп, содержащий векторы экспрессии, содержащие кДНК человеческих 1Ь-17В, С, Ό, Е и Р, был быстро трансфицирован в клетки С08. Связывание 1Ь-17КСкК/Рс9 с трансфицированными клетками С08 проводили, используя анализ секреционная ловушка, описанный ниже. Положительное связывание 1Ь17КСкК/Рс9 было замечено только с человеческим 1Ь-17Р. Эти результаты демонстрируют новую находку, что человеческие 1Ь-17КС и 1Ь-17Р являются парой рецептор/лиганд.

B) Трансфекции клеток С08.

Трансфекцию клетки С08 выполняли следующим образом: смесь 3 мкл объединенной ДНК и 5 мкл Липофектамина (Ь1роГес1ашше™) в 92 мкл бессывороточной питательной среды аллергена 1 СИМД (55 мг пирувата натрия, 146 мг Ь-глутамина, 5 мг трансферрина, 2,5 мг инсулина, 1 мг селена и 5 мг фетуина в 500 мл СИМД) культивируют при комнатной температуре в течение 30 мин и затем добавляют 400 мкл бессывороточной питательной среды СИМД. Добавляют эти 500 мкл смеси к 1,5 х 10⁵ клеток С08 на лунку, высеянных на 12-луночный планшет культуры тканей, и культивируют в течение 5 ч при 37°С. Добавляют 500 мкл 20% ФБР среды СИМД (100 мл ФБР, 55 мг пирувата натрия, 146 мг Ь-глутамина в 500 мл СИМД) и культивируют в течение ночи.

C) Анализ секреционная ловушка.

Секреционную ловушку выполняли следующим образом: среды смывали с клеток с помощью ФБР и затем фиксировали в течение 15 мин 1,8% формальдегидом в ФБР. Клетки затем промывали ТНТ (0,1М Трис-НСЬ, 0,15М №С1 и 0,05% Твин-20 в воде) и пропитывали 0,1% Тритоном-Х в ФБР в течение 15 мин, и снова промывали ТНТ. Клетки блокировали в течение 1 ч ТНБ (0,1М Трис-НСЬ, 0,15М №1С1 и 0,5% Блокирующего Реагента (комплект NΕN Кепаккапсе Т8А-Э1гес!) в Н20) и снова промывали ТНТ. Клетки культивировали в течение 1 ч с 1 мкг/мл человеческого растворимого рецепторного слитого белка 1Ь-17КСх1кК/РС9. Клетки затем промывали ТНТ. Клетки культивировали в течение другого часа с разбавленным 1:200 козлиным античеловеческим 1д-НКР (Рс-специфическим). Снова клетки промывали ТНТ.

Положительное связывание обнаруживали флуоресцеин-тирамидным реагентом, разбавленным 1:50 буфером разбавления (комплект NΕN), и культивировали в течение 4-6 мин и промывали ТНТ. Клетки сохраняли в среде Уес1ак1ие1б Моипбпд Меб1а (Уес!ог ЬаЬк ВигНпдаше, СА), разбавленной 1:5 ТНТ. Клетки визуализировали, используя фильтр ФИТЦ на флуоресцентном микроскопе.

Пример 18.

Генерация мышиных моноклональных антител античеловеческий 1Ь-17КС.

А. Иммунизация генерации антител анти-1Ь-17КС.

1. Растворимый 1Ь-17КС-тиРс.

6-12-недельных интактных мышей или мышей нокаута 1Ь-17КС иммунизируют интраперитонеальной инъекцией 25-50 мкг растворимого человеческого белка 1Ь-17КС-тиРс (пример 23), смешанного 1:1 (по объему) со стимулятором К1Ь1 (81дта) по двухнедельному графику. Семь - десять дней после третьей иммунизации, пробы крови были взяты через ретроорбитальное кровотечение, сыворотку собирают и оценивают на способность ингибировать связывание 1Ь-17 или 1Ь-17Р с 1Ь-17КС в нейтрализационном анализе (например, описанном здесь) и окрашивать 1Ь-17КС-трансфицированные против нетрансфицированных клеток 293 в анализе окрашивания РАС8.

Мышей продолжали иммунизировать, отбирали пробы крови и оценивали, как описано выше, до тех пор, пока титры нейтрализации не достигали плато. Затем мышей с самыми высокими титрами нейтрализации инъецировали интраваскулярно 25-50 мкг растворимого белка 1Ь-17КС-РС в ФБР. Три дня спустя, селезенку и лимфатические узлы из этих мышей собирали и использовали для генерации гибридом, например, используя клетки миеломы мышей (Р3-Х63-Ад8.653.3.12.11) или другие адекватные клеточные линии, используя стандартные методы, известные в технологии (например, смотри Кеагпеу, ЬЕ. е! а1., 1. 1ттипо1., 123:1548-50, 1979; Ьапе, Β.Ό. 1. 1ттипо1. Ме!1обк, 81:223-8, 1985).

2. Растворимые 1Б-17КС. 1Ε-17ΒΓ^ΕΕ, 1Ь-17КС-СН18 и 1Ь-17КС-СРЬАС.

6-12-недельных интактных мышей или мышей нокаута 1Ь-17КС иммунизируют интраперитонеальной инъекцией 25-50 мкг растворимого человеческого ^-17ΒΟ-ίΕΕ, 1Ь-17КС-СН18 или 1Ь-17КССРЬАС, смешанного 1:1 (по объему) со стимулятором К1Ь1 (81дта) по двухнедельному графику. 7-10 дней после третьей иммунизации пробы крови были взяты через ретроорбитальное кровотечение, сыворотку собирают и оценивают на способность ингибировать связывание 1Ь-17 или 1Ь-17Р с 1Ь-17КС в нейтрализационном анализе (например, описанном здесь) и окрашивать 1Ь-17КС-трансфицированные против нетрансфицированных клеток 293 в анализе окрашивания РАС8. Мышей продолжали иммунизи

- 67 015351 ровать, отбирали пробы крови и оценивали, как описано выше, до тех пор, пока титры нейтрализации не достигали плато. Затем, мышей с самыми высокими титрами нейтрализации инъецировали интраваскулярно 25-50 мкг растворимого антигенного белка 1Б-17КС, Ш-ПКС-СЕЕ, хсуЧог-СШЗ или [Щ-17КССЕБАС в ФБР. Три дня спустя, селезенку и лимфатические узлы из этих мышей собирали и использовали для генерации гибридом, например, используя клетки миеломы мышей (РЗ-Х63-Ад8.653.3.12.11) или другие адекватные клеточные линии, используя стандартные методы, известные в технологии (например, смотри Кеатеу, ТЕ. е! а1., 1. Iттиηο1., 123:1548-50, 1979; и Бапе, Κ.Ό. 1. Iттипο1. Ме!Ьобз, 81:223-8, 1985).

3. Р815 трансфектанты, которые экспрессируют ΙΚ-17ΗΟ.

6-10-недельных самок мышей БВА/2 иммунизируют интраперитонеальной инъекцией 1х10⁵ живых, трансфицированных клеток Р815, например, клеток Р815/Ш-17КС (например, 0,5 мл при плотности клеток 2х10⁵ клеток/мл). До инъекции клетки поддерживают в фазе экспоненциального роста. Для инъекции клетки собирают, промывают три раза ФБР и затем повторно суспендируют в ФБР до плотности 2х10⁵ клеток/мл. В этой модели мыши заболевают опухолью асцита в течение 2-3 недель и прогрессируют к смерти на 4-6 неделю, если иммунная реакция к трансфицированному антигену-мишени не была установлена. Спустя три недели мышей без очевидного брюшного набухания (показатель асцита) повторно иммунизируют, как выше с 2-3-недельными интервалами. 7-10 дней после третьей иммунизации пробы крови были взяты через ретроорбитальное кровотечение, сыворотку собирают и оценивают на способность ингибировать связывание ΙΕ-17 или ΙΕ-17Ε с ГЕ-17КС в нейтрализационном анализе (например, описанном здесь) и окрашивать ГЕ-17КС-трансфицированные против нетрансфицированных клеток 293 в анализе окрашивания ЕАСЗ. Мышей продолжали иммунизировать, отбирали пробы крови и оценивали, как описано выше, до тех пор, пока титры нейтрализации не достигали плато.

Затем мышей с самыми высокими титрами нейтрализации инъецировали интраперитонеально 1х 10⁵живых, трансфицированных клеток Р815. Четыре дня спустя селезенку и лимфатические узлы этих мышей собирают и используют для генерации гибридом, например, используя клетки миеломы мышей (Р3-Х63-Ад8.653.3.12.11) или другие адекватные линии клетки, используя стандартные методы, известные в технологии (например, см. Кеатеу, ЕЕ. е! а1., выше; Бапе, Κ.Ό. выше).

Альтернатива вышеупомянутой схеме иммунизации живыми, трансфицированными клетками Р815 включает интраперитонеальную инъекцию 1-5х10⁶ облученных, трансфицированных клеток каждые 2-3 недели. В этом подходе никакие животные не заболевают и не умирают от асцита. Вместо этого животных проверяют на нейтрализацию иммунной реакции к ГЕ-17КС в сыворотке, как обрисовано выше, начиная с кровотечения после второй иммунизации. Как только титры нейтрализации достигали максимального уровня, мышам с самыми высокими титрами дают предфузию, интраперитонеальную инъекцию 5 х 10⁶ облученных клеток и четыре дня спустя, селезенку и лимфатические узлы этих мышей собирают и используют для генерации гибридом, например, используя клетки миеломы мыши (Р3-Х63Ад8.653.3.12.11) или другие адекватные линии клеток, используя стандартные методы, известные в технологии (например, смотри Кеатеу, ЕЕ. е! а1., выше.; и Бапе, Κ.Ό. выше).

В. Скрининг слитых гибридом на антитела, которые связывают ГЕ-17КС и ингибируют связывание Ш-17 или Ш-17Е с Ш-17КС.

Три различных первичных скрининга выполнены на гибридомных супернатантах на 8-10 день после слияния. Для первого анализа антитела в супернатантах были испытаны на их способность связываться с растворимыми человеческими белками Ш-17КС, Ш-ПКС-тиЕс, Ш-ПКС-СЕЕ, Ш-ПКС-СЮЗ или ГЕ-17КС-СЕЕАС, применяя иммуносорбентный анализ ЕЕГЗА, используя НКР-сопряженные козьи антимышиные каппа и анти-лямбда легкой цепи реагенты второй стадии, чтобы идентифицировать связанные мышиные антитела. Чтобы продемонстрировать специфичность к участку ГЕ-17КС слитых белков ГЕ-17КС, положительные супернатанты в начальном анализе оценивали на постороннем белке, слитом с той же самой мышиной областью Ес (тС2а), последовательностью ЕЕ, последовательностью ШЗ или последовательностью ЕБАС. Антитела в тех супернатантах, которые связываются с слитым белком ГЕ-17КС, а не с посторонним тиЕс или другими белками, содержащими последовательность слитого белка, как считали, являются специфическими для ГБ-17КС. Для второго анализа антитела во всех гибридомных супернатантах оценивали анализом ЕЫЗА на их способность ингибировать связывание биотинилированного человеческого ГБ-17 или биотинилированного человеческого ГБ-17Е со слитыми белками ГБ-ПКС-тиЕс или ЕБ-ПКС, связанными с чашкой.

Все супернатанты, содержащие антитела, которые связаны специфично с ΙΕ-17ΚΕ, ингибировали ли они связывание ΙΕ-17 или ΙΕ-17Ε с ΙΚ-17ΗΟ или нет в анализе ЕБША, были впоследствии проверены на их способность ингибировать связывание ΙΕ-17 или ΙΕ-17Ε с клетками ВаГ3 или ВНК, трансфицированными !Б-17КС, или нормальными человеческими бронхиальными эпителиальными клетками. Все супернатанты, которые были нейтрализационно положительны либо в ингибиторных анализах ΙΕ-17 или Ш17Е, либо в ингибиторных анализах ΙΕ-17 и ЕБ-17Е, были впоследствии оценены по их способности окрашивать клетки ВаГ3 или ПДХ, трансфицированные Ш-ПКС или нетрансфицированные ΙΕ-17ΚΤ, анализом ЕАСЗ. Этот анализ был разработан, чтобы подтвердить, что ингибирование связывания ΙΕ-17 или

- 68 015351 [Б-17Б с [Ы-17ЕС, происходило действительно из-за антитела, которое специфично связывает рецептор [Б-17ЕС. Дополнительно, так как анализ РАС8 выполняли с анти-[дС реагентом второй стадии, определенные положительные результаты РАС8 указывают, что нейтрализирующее антитело, вероятно, будет иметь класс [дС. Этими средствами мастер-лунку идентифицировали, которая связывала [Б-17ЕС в анализе ЕЫ8А, ингибировала связывание [Б-17 или [Б-17Б с [Б-17ЕС в ингибиторном анализе на основе ЕБКА, блокировала взаимодействие [Б-17 и [Б-17Б с клетками ВаГ3 или ПДХ, трансфицированными [Б17ЕС, соответственно, и была сильно положительна в окрашивании [Б-17ЕС-трансфицированных клеток ВаГ3 или ПДХ антимышиным [дС реагентом второй стадии.

Третий анализ состоит из первичных человеческих бронхиальных эпителиальных клеток, которые экспрессируют [Б-17ЕС и могут быть индуцированы секретировать [Б-8 или [Б-6 в ответ на обработку [Б-17Б. Специфическое моноклональное антитело анализируется по его способности ингибировать продукцию [Б-8 или [Б-6, стимулированную [Б-17 или [Б-17Р, этими клетками. Продукцию [Б-8 и [Б-6 анализируют в ответ на [Б-17 или [Б-17Б, как описано здесь.

Альтернативно, моноклональное антитело, анти-[^-17ЕС. опосредовавшее ингибирование [Б-17 или [Б-17Р, индуцировавшее продукцию люциферазы в МН 3Т3 или других [Б-17ЕС-содержащих клетках, может использоваться с или вместо одного из анализов нейтрализации биоактивности, отмеченных выше. МкВ-опосредованный люциферазный анализ в клетках МН 3Т3 описан здесь.

С) Клонирование гибридом, производящих анти-[Б-17ЕС-специфические антитела.

Гибридомные клеточные линии, производящие определенное анти-[Б-17ЕС тАЬ, которые перекрестно нейтрализовали связывание [Б-17 и [Б-17Р с соответственно трансфицированными клетками ВаР3 или ПДХ, клонировали стандартным подходом при разбавлении до низкой плотности (меньше 1 клетки на лунку). Спустя приблизительно 5-7 дней после посева, клоны подвергали скринингу, используя иммуносорбентный анализ ЕБ18А на, например, человеческий [^-17ЕС-тиЕс. за которым следует повторное испытание положительных лунок анализом ЕЫ8А на посторонний тиРс, содержащий слитый белок, как описано выше. Выбранные клоны, супернатанты которых связываются с [^-17ЕС-тиРс. а не с посторонним тиРс, содержащим слитый белок, далее подтверждаются на определенную активность антитела повторением обоих анализов нейтрализации, так же как анализа РАС8. Все выбранные клоны, положительные на антитело [Б-17ЕС, клонируют минимум два раза, чтобы помочь гарантировать клональность и оценить стабильность продукции антитела. Дальнейшие раунды клонирования выполняли и подвергали скринингу, как описано, до тех пор, пока предпочтительно по меньшей мере 95% результатных клонов не были позитивны на нейтрализацию продукции антитела анти-[Б-17ЕС.

Ό) Биохимическая характеристика молекулы, узнаваемой анти-[Б-17ЕС тАЬк.

Биохимическое подтверждение, что целевая молекула, [Б-17ЕС, узнаваемая предполагаемыми анти-[Б-17ЕС тАЬк, является действительно [Б-17ЕС, выполняют стандартной иммунопреципитацией, за которой следует анализ 8Ό8 РАСЕ, или процедурами вестерн-блоттинга, которые применяют растворимые мембранные препараты из клеток ВаГ3 или ПДХ, трансфицированных [Б-17ЕС против нетрансфицированных. Кроме того, растворимые мембранные препараты нетрансфицированных клеточных линий, которые экспрессируют [Б-17ЕС, используют демонстрацию, что тАЬк узнают нативную рецепторную цепь, так же как трансфицированную цепь. Альтернативно, тАЬк испытывают на их способность к специфической иммунопреципитации или вестерн-блоттингу растворимого белка [Б-17ЕС-тиБс.

Пример 19.

Нейтрализация человеческого [Б-17ЕС сыворотками мышей, инъецированных клетками Р815, трансфицированными человеческим [Б-17ЕС.

Применяя нейтрализационный анализ на основе клеток, сыворотку мышей, инъецированных живыми человеческими клетками Р815, трансфицированными [Б-17ЕС (пример 17), добавляют при серийном разбавлении 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06, 0,03, 0,02 и 0%. Аналитические планшеты культивировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 4 дней, за которое время Синий Аламар (А1атаг В1ие) (Асситеб, СЫсадо, [Б) добавляют при 20 мкл/лунку. Планшеты снова культивируют при 37°С, 5% СО₂ в течение 16 ч. Результаты показали, что сыворотка из четырех животных могла нейтрализовать передачу сигналов как Ни[Б-17, так и йи[Б-17Р через человеческий [Б-17ЕС.

Результаты, такие как эти, обеспечивают дополнительное свидетельство, что эффективно блокирование [Б-17ЕС связыванием, блокированием, ингибированием, уменьшением, противодействием или нейтрализацией активности [Б-17 или [Б-17Р (индивидуально или вместе), например нейтрализацией моноклонального антитела к [Б-17ЕС по настоящему изобретению, могло быть выгодным в ослаблении эффектов [Б-17 и [Б-17Р (индивидуально или вместе) ш νί\Ό и может уменьшить воспаление, вызванное [Б-17 и/или [Б-17Р, такое как воспаление, замеченное, например, в псориазе, ВБК, колите, хронической обструктивной болезни легких, муковисцидозе или других воспалительных болезнях, вызванных [Б-17, и или [Б-17Р, включая ВБК, артрит, астму, псориатический артрит, колит, воспалительные состояния кожи и атопический дерматит.

- 69 015351

Пример 20.

Фармакокинетика античеловеческого(апИ-Битап) !Ь-17(С моноклонального антитела.

Испытываемое моноклональное антитело, античеловеческий !Ь-17(С тАЬ, обеспечивается, например, в 3х3 мл аликвотах при концентрации приблизительно 1 мг/мл (определенной УФ спектральной поглощательной способностью при 280 нм) и сохранялось при -80°С до использования. Носитель представляет собой ΙΧ ФБР (50 мМ NаРΟ₄, 109 мМ №С1), рН 7,3. тАЬ растапливают при комнатной температуре перед использованием, и аликвоты 1 и 2 используются, как предусмотрено для 100-мкг доз, внутривенно и подкожно, соответственно. Половину аликвоты 3 разбавляют 1:2 в ΙΧ ФБР для 50 мкг подкожной дозы, а вторую половину аликвоты 3 разбавляют 1:10 в ΙΧ ФБР для 10 мкг подкожной дозы. Самки мышей 8СГО (п=96) получают из СБаг1ек (Аег ЬаЬк. Животных проверяют на здоровье по прибытию и размещают группой (3 животных на клетку). Мыши являются 12-недельными со средним весом тела приблизительно 22 г в начале исследования.

A) Протокол дозирования.

Самок мышей 8СГО (п=24/дозную группу) рандомизированно распределяют на четыре группы дозирования (табл. 8). Группе 1 вводили античеловеческий Ш-17(С тАЬ инъекцией внутривенно приблизительно 93 мкл в хвостовую вену, а Группам 2, 3 и 4 вводят тАЬ инъекцией подкожно приблизительно 93 мкл в загривок шеи.

B) Сбор образцов.

До взятия крови мыши были полностью анестезированы галотаном или изофлуораном. Пробы крови были собраны через кардиальный щуп для всех точек времени, исключая точку времени 168 ч (собрана через глазной отсос, и у тех же самых животных кровь забирали снова во временной точке 504 часа через кардиальный щуп). Кровь собирали в пробирки сепарации сыворотки и позволяли сгущаться в течение 15 мин. Образцы затем центрифугировали в течение 3 мин при 14000 об/мин. После центрифугирования аликвоты 125-150 мкл распределяли в маркированные пробирки Эппендорфа и немедленно сохраняли при -80°С до анализа.

Таблица 8

Г руппа ^#	Доза (снятие анальгезии)	Животные	Временные точки
1	100мкг (внутривенно)	3 мыши/точку	0.25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 и 504 часа
2	ΊΟΟμκγ (подкожно)	3 мыши/точку*	0.25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 и 504 часа
3	50мкг (подкожно)	3 мыши/точку*	0.25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 и 504 часа
4	Юмкг (подкожно)	3 мыши/точку*	0.25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 и 504 часа

* Те же животные использовались в точках времени 168 и 504 часа.

С) Количественный анализ концентрации сывороточного античеловеческого Ш-17(С тАЬ методом ЕЫ8А.

Иммуносорбентный анализ (ЕЬ!8А) развивают и квалифицируют, чтобы анализировать образцы сыворотки мыши от животных, дозированных анти-!Ь-17(С тАЬ во время фармакокинетических исследований. Эта проба разработана, чтобы использовать коммерчески доступное вторичное антитело и колориметрическое обнаружение, используя тетраметилбензидин (ТМВ). Разбавления, используемые для калибровочной кривой, были изменены, чтобы улучшить определение линейного участка калибровочной кривой. Калибровочная кривая в интервале от 100 нг/мл до 0,231 нг/мл с 2-кратными разбавлениями позволяет количественную оценку образцов сыворотки мыши. Контрольные образцы разбавляют до 1:100, 1:1000 и 1:10000 в 10% сыворотке мыши 8СГО и обратно вычисляют из калибровочной кривой.

Ό) Фармакокинетический анализ.

Данные концентрация сыворотки от времени загружены в программное обеспечение V^пNоп1^п Рго£еккюпа1 4.0 (РБагщдЫ, Шс; Сагу, ЫС) для фармакокинетического анализа. Некомпартиментальный анализ используется, чтобы определить фармакокинетические параметры, основанные на средних данных в каждой временной точке.

Пример 21.

Нейтрализация активности Ш-17А и ΙΕ-17Τ античеловеческий Ш-17(С моноклональным антителом.

Используя нейтрализационный анализ, основанный на клетке, очищенное мышиное античеловеческий Ш-17(С моноклональное антитело (тАЬ) добавляют при серийном разбавлении, например, при 10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 1,25 мкг/мл, 625 нг/мл, 313 нг/мл, 156 нг/мл и 78 нг/мл. Аналитические планшеты культивируют при 37°С, 5% С0₂ в течение 4 дней, за которое время А1атаг В1ие (Асситей, СЫсадо, Ш) добавляют в количестве 20 мкл/лунку. Планшеты снова культивируют при 37°С, 5% С0₂ в течение 16 ч. Этот анализ в состоянии продемонстрировать, что очищенное античеловеческий !Ь-17(С

- 70 015351 моноклональное антитело в состоянии нейтрализовать передачу сигналов обоих йи1Ь-17 и йи1Ь-17Е через человеческий 1Ь-17ВС. Для очень эффективных антител, когда применяются приблизительно в концентрации 10 мкг/мл, антитело полностью нейтрализует пролиферацию, вызванную йи1Ь-17 или йи1Ь-17Е, причем ингибирование пролиферации уменьшается зависимым от дозы образом при снижении концентраций. Подходящее по изотипу отрицательное контрольное мышиное тАЬ, испытанное при концентрациях, описанных выше, как ожидалось, не ингибирует пролиферацию любого цитокина. Эти результаты в состоянии далее продемонстрировать, что моноклональные антитела к 1Ь-17ВС могли действительно противодействовать активности провоспалительных лигандов, 1Ь-17 и 1Ь-17Е, при низких концентрациях.

Пример 22.

1Ь-17А вызывает повышенные уровни ИФ-гамма и ФНО-альфа в мононуклеарных клетках человеческой периферической крови.

Мононуклеарные клетки человеческой периферической крови (МКЧПК) очищали центрифугированием в градиенте плотности (фикол) и затем культивировали в течение ночи при 37°С только в питательной среде, 50 нг/мл антитела античеловеческий СЭ3, или комбинации 50 нг/мл антитела античеловеческий СЭ3 плюс 1 мкг/мл антитела античеловеческий СЭ28. Реплицируемые культуры для каждого из этих состояний установлены как не дающие цитокина, дающие 25 нг/мл человеческого 1Ь-17А, или дающие 25 нг/мл человеческого 1Ь-17Е. После 24-часовой инкубации супернатанты из каждой культуры собирают и анализируют на содержание цитокина, применяя комплект В-Ό Вюкаепсе'к йитаи Тй1/Тй2 Су!оте!г1с Веаб Аггау (СВА). Мы нашли, что культуры, которые стимулированы либо анти-СП3, либо анти-СО3 плюс анти-СЭ28 и дополнены 1Ь-17А, содержали значительно повышенные уровни интерферона-гамма (ИФ-гамма) и ФНО-альфа (3-5-кратный рост каждого) по культурам без добавленного цитокина, или культурам, которые получали 1Ь-17Е. Культуры, в которые не была добавлена стимуляция анти-СО3, не показывали значительные изменения в уровнях цитокина. Кроме того, добавление 1Ь-17А не вызвало значительных изменений в других цитокинах, анализированных СВА, включая 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-5 и 1Ь-10. Эти данные указывают, что 1Ь-17А, но не 1Ь-17Е, может увеличить продукцию ИФ-гамма и ФНОальфа в культурах МКЧПК, стимулированных анти-СВ3 или анти-СВ3 плюс анти-СВ28.

Пример 23.

1Ь-17ВС-Ес уменьшает сферу действия и развитие болезни в мышиной модели коллагениндуцированного артрита (КИА).

A) Мышиная модель коллагениндуцированного артрита (КИА).

Десятинедельных самцов мышей ЭВА/1 1 (Засккоп ЬаЬк) разделяют на 3 группы по 13 мышей на группу. В день 21 животным делают подкожную хвостовую инъекцию 50-100 мкл 1 мг/мл цыплячьего коллагена типа II, составленного как стимулятор Сотр1е!е Егеипб'к Аб)иуап1 (изготовитель Сйопбгех, Вебтопб, VА), и три недели спустя на день 0 им делают ту же самую инъекцию, за исключением инъекции, приготовленной как неполный стимулятор ШсотрШе Егеипб'к Аб_)иуап!. ГЬ-ИВС-Ес вводят как интраперитонеальную инъекцию 3 раза в неделю в течение 4 недель, в различных точках времени в пределах от дня 0 до дня, в котором большинство мышей показывают умеренные симптомы болезни. Группы получают либо 10, либо 100 мкг [Е-17ВС-Ес на животное за дозу, а контрольные группы получают контрольный носитель, фосфатный буферный раствор (ФБР) (Ьйе Тесйио1од1ек, ВоскуШе, МО). Животные начинают показывать симптомы артрита после второй инъекции коллагена, у большинства животных воспаление развивается в течение 1,5-3 недель. Степень болезни оценивается в каждой лапе при использовании толщиномера, чтобы измерить толщину лапы, и назначая клинический показатель (0-3) каждой лапе: 0=нормальна, 0,5=воспалены пальцы ног, 1=слабое воспаление лапы, 2=умеренное воспаление лапы и 3=тяжелое воспаление лапы, как детализировано ниже.

B) Контроль болезни.

Животные могут начать показывать симптомы воспаления лап вскоре после второй инъекции коллагена, и некоторые животные могут даже начать иметь симптомы воспаления пальцев лап до второй инъекции коллагена. У большинства животных развивается артрит в течение 1,5-3 недель после инъекции поддержки, но для некоторых может потребоваться более длинный промежуток времени. Уровень болезни в этой модели обычно составляет 95-100%, и 0-2 нереагирующих организма (определяется после 6 недель наблюдения) обычно замечаются в исследовании, использующем 40 животных. Заметим, что как только воспаление начинается, общее переходное наличие переменного воспаления пальцев лап или лапы низкой степени может иметь место. Поэтому животное, как полагают, не имеет установленной болезни, пока не развилось постоянное опухание лапы.

Все животные наблюдаются ежедневно, чтобы оценивать статус болезни в их лапах, который делается установлением качественных клинических показателей для каждой из лап. Каждый день, каждое животное имело свои 4 лапы, оцененные по состоянию клинической болезни. Чтобы определить клинический показатель, можно считать, что лапа имеет 3 зоны, пальцы, непосредственно лапа (тапик или рек) и кистевой или голеностопный сустав. Степень или тяжесть воспаления относительно этих зон отмечают, включая: наблюдение за каждым пальцем лапы на набухание; рваные ногти или краснота пальцев лапы; отмечают любой признак отека или красноты в любой из лап; отмечают любую потерю прекрасной анатомической демаркации сухожилий или костей; оценивают запястья или лодыжки на любой отек

- 71 015351 или красноту; и отмечается, если воспаление распространяется проксимально на ногу. Показатель лапы 1, 2 или 3 базируется, в первую очередь, на полном впечатлении о серьезности и, во вторую очередь, на том, сколько зон вовлечено. Масштаб, используемый для клинической оценки, показан ниже.

С) Клинические показатели.

0=нормальный,

0,5=один или больше пальцев лапы вовлечены, но только пальцы лапы воспалены,

1=мягкое воспаление, охватывающее лапу (1 зона), и может включать палец или пальцы лапы,

2=умеренное воспаление в лапе и может включать некоторые из пальцев ноги и/или запястье/лодыжку (2 зоны),

3=тяжелое воспаление в лапе, запястье/лодыжке и некоторых или всех пальцах лапы (3 зоны).

Установленная болезнь определяется как качественный показатель воспаления лапы от 2 или больше, который сохраняется в течение двух дней подряд. После того как болезнь установлена, дата регистрируется и определяется как первый день животного с установленной болезнью.

Кровь собирают в течение эксперимента, чтобы контролировать сывороточные уровни антител антиколлагена, так же как уровни сывороточного иммуноглобулина и цитокина. Антитела антиколлагена сыворотки коррелируют хорошо с тяжестью болезни. Животных подвергали эвтаназии в День 21 и кровь собирали для сыворотки и клинического анализа крови. От каждого животного одна пораженная лапа забирается в 10% NВΕ для гистологии, и одна замораживается в жидком азоте и сохраняется при -80°С для анализа мРНК. Кроме того, 1/2 селезенки, 1/2 тимуса, 1/2 мезэнтериального лимфатического узла, одну долю печени и левую почку собирали в РНКатор для анализа РНК, а 1/2 селезенки, 1/2 тимуса, 1/2 мезэнтериального лимфатического узла, оставшуюся печень и правую почку собирали в 10% NВΕ для гистологии. Сыворотка собрана и заморожена при -80°С для анализа цитокина и иммуноглобулина.

Группы мышей, получающих I^-17ΒС-Εс во всех пунктах времени, характеризуются задержкой начала и/или развития воспаления лапы. Эти результаты указывают, что I^-17ΒС может уменьшить воспаление, так же как сферу действия и прогрессию, связанную с этой моделью. Эти результаты далее поддерживаются наблюдением, что I^-17ΒС-Εс приводил к сниженным уровням сывороточного ФНОальфа, ШЛЬ и антител антиколлагена.

Пример 24.

Стабильная сверхэкспрессия I^-17ΒС в мышиной аналитической клеточной линии №к3!3/кх142.8, экспрессирующей фактор транскрипции ар1/пГкЬ.

Мышиная аналитическая клеточная линия пП1313/кх142.8 была трансфицирована человеческим Ш17ВСх1 (последовательность 8ЕО ΙΌ NО:2) в вектор экспрессии с геном устойчивости метотрексата (дигидрофолатредуктаза, ДГФР). Эта трансфекция была выполнена, используя коммерчески доступный комплект и рекомендации изготовителя (М1гик, Маб1коп, А1. Са!. Мадисон, #МЖ218). Клетки помещали в 1 мкМ т!х исправленной ростовой среды, чтобы выбрать вектор экспрессии, содержащий человеческий трансген Ш-ПВСхК После выбора человеческий пул трансфекции I^-17ΒСx1 был произведен и назывался шк3!3/кх142.8/ксу!ог14Х1.

А) Люциферазный анализ, использующий аналитическую линию клеток пП1313/кх142.8

Так как пП1313/кх142.8 имеет стабильный репортер кх142, нет никакой потребности в инфекции аденовируса, чтобы добавить этот репортер. Таким образом, протокол люциферазного анализа был укорочен и выбран следующий путь:

1. Выращивание клеток.

Клетки пП1313/кх 142.8 высевали при 5000 клеток/лунку в твердые белые, покрытые клеточными культурами 96-луночные планшеты (Са!. #3917. Сок!аг), использующими СИМД/10% ФБС, содержащий глютамин и исправленный пируватом, и культивировали в течение ночи при 37°С и 5% СО2. На второй день культуральную среду удаляли и обменивали на среду СИМД/1% ФБС, содержащую глютамин и исправленную пируватом, и культивировали в течение ночи при 37°С и 5% СО₂.

2. Измерение люциферазным анализом активации ΙΕ-17Α и Е устойчивого репортера кх142.

После ночной инкубации в 1% ФБС/среда СИМД, разбавления человеческих лигандов ΙΕ-17Α и Ш17Е были сделаны в безсывороточных питательных средах, исправленных АБС до уровня 0,28%. После добавления разбавлений лиганда клетки культивировали при 37°С и 5% СО₂ в течение 4 ч, после которых питательные среды удаляли, клетки расщепляли лизисом в течение 15 мин и среднюю интенсивность флюоресценции (СИФ) измеряли, используя систему и реагенты люциферазного анализа (Са!. # е1531 Рготеда, Маб1коп, ΑΙ) и микропланшетный люминометр. Активность была обнаружена для обоих лигандов при концентрациях в пределах от 0,1-1000 нг/мл. Пул трансфекции шк3!3/кх142.8/ксу!ог14Х 1 показал подобную активность для мышиного лиганда ΙΕ-17Α, такую же, как и родительская клеточная линия (пример 14). Однако пул трансфектанта су!огНх1 показал повышенную реактивность к обработкам человеческими 1Ь-17А и Е, даже когда эти концентрации лиганда были столь низки как 20 фемтограмм. Факт, что передача сигналов шТЬ-ПА сопоставима с передачей сигналов в родительской клеточной линии (пример 14), предполагает, что не имеется общей, неопределенной проблемы с человеческими клетками, экспрессирующими Ш-17ВС, и что мышиный ΙΕ-17Α, вероятно, передает сигналы через эндогенный мышиный шк3!3 клеточный рецептор Ш-ПВ или Ш-ИВС. Таким образом, факт, что человеческий

- 72 015351

ГО-17А и ГО-17Е вызывает повышение СИФ при таких низких концентрациях лиганда, может указать на определенную гиперреактивность клеток к этим лигандам, которая опосредуется через повышенно продуцируемый человеческий рецептор ГО-17КС.

У этого результата есть значительные клинические и биологические ответвления и полезность. Например, физиологические ситуации могли вызвать местную повышенную активацию рецепторов ГО17КС, которые могли затем сделать эти области гиперчувствительными к ГО-17А и ГО-17Е, приводя к биологической активации при намного более низких концентрациях лиганда, чем концентрации, предложенные без сверхэкспрессии ГО-17КС. Таким образом, намного более низкие уровни растворимого рецептора могут быть достаточными, чтобы противодействовать этим гипотетически более низким концентрациям лиганда, чем ранее думали или признавали в этой области.

Пример 25.

Антагонисты активности ГО-17Е и ГО-17А снижают склонность к заболеванию и его развитие в модели воспалительной болезни кишечника (ВБК).

Эта модель разработана, чтобы показать, что культивируемая кишечная ткань больных ВБК производит более высокие уровни воспалительных медиаторов по сравнению с тканью от здоровых контрольных групп. Эта повышенная продукция воспалительных медиаторов (включая, но не ограничиваясь ими, ГО-1Ь, ГО-4, ГО-5, ГО-6, ГО-8, ГО-12, ГО-13, ГО-15, ГО-17 А и Е, ГО-18, ГО-23, ФНО-альфа, IЕN-гамма, члены семейства М1Р, МСР-1, Г- и ГМ-КСФ и т.д.) способствует симптомам и патологии, связанной с ВБК, такими как болезнь Крона (БК) и неспецифический язвенный колит (ЯК), посредством их влияния на активирующие воспалительные пути и нисходящие эффекторные клетки. Эти пути и компоненты затем приводят к повреждению/деструкции тканей и клеток, наблюдаемому ш у1уо. Поэтому эта модель может моделировать этот повышенный воспалительный медиаторный аспект ВБК. Кроме того, когда кишечная ткань от здоровых контрольных групп или из человеческих кишечных эпителиальных клеточных (КЭК) линий культивируются в присутствии этих воспалительных компонентов, воспалительный путь передачи сигналов может наблюдаться, так же как признаки повреждения клеток и тканей.

Терапия, которая была бы эффективна в человеческой ВБК ш у1уо, будет работать в вышеупомянутых ех у1уо или КЭК моделях, ингибируя и/или нейтрализуя продукцию и/или наличие воспалительных медиаторов.

В этой модели человеческую кишечную ткань собирают от больных ВБК или от здоровых контрольных групп, перенесших кишечную биопсию, резекцию, или из патологоанатомических коллекций тканей, и обрабатывают, используя модификацию А1ехак1к еГ а1. (СиГ, 53:85-90; 2004). В асептических условиях образцы мягко чистят обильным количеством ФБР, затем культивируют измельченные участки ткани в присутствии полных тканевых культур (плюс антибиотики, чтобы предотвратить размножение бактерий). Образцы от того же самого пула измельченной ткани обрабатывают одним из следующих веществ: носитель (ФБР); рекомбинантный человеческий (гН) ГО-17А; гНГО-17Е; или гНГО-17А+гНГО-17Е. Кроме того, их обрабатывают антагонистом, или без антагониста, либо ГО-17А, либо ГО-17Е, одним или в комбинации (такой как комбинация с растворимым ГО-17КС). Этот экспериментальный протокол следует исследованиям с человеческими линиями КЭК, за исключением того, что клетки берут из существующих запасов. После переменных времен культивирования (от 1 ч до нескольких дней) супернатанты собирают и анализируют на уровень воспалительных медиаторов, включая упомянутые выше. В образцах от больных ВБК или в образцах, обработанных гНГО-17А и/или Е, уровни воспалительных цитокинов и хемокинов увеличиваются по сравнению с необработанными образцами здоровых контрольных тканей. Добавление антагонистов активности ГО-17Е и/или ГО-17А, таких как растворимые рецепторы ГО-17КС и антитела к ним, включая античеловеческий ГО-17КС моноклональное и нейтрализирующее антитела по настоящему изобретения, заметно уменьшает продукцию воспалительных медиаторов, и таким образом, как ожидают, являются эффективными в человеческой ВБК.

Пример 26.

Антагонисты активности ГО-17Е и ГО-17А снижают склонность к заболеванию и его развитие в модели рассеянного склероза (РС).

Рассеянный склероз (РС) является сложной болезнью, которая, как думают, опосредуется многими факторами, включая наличие воспалительных инфильтратов лимфоцитарных и мононуклеарных клеток и демиелинизацию по всей ЦНС. Микроглия представляет собой макрофагоподобные клетки, которые населяют центральную нервную систему (ЦНС) и становятся активированными при ранении или инфицировании. Микроглия была вовлечена, как играющая критическую роль, в различные болезни ЦНС, включая РС, и может использоваться, чтобы изучать механизм(ы) инициирования, развития и терапии болезни (№1да1 еГ а1., №игоЬю1. РГО, 8:1057-1068, 2001; 01коп еГ а1., 1. №игоксг МеГОобк, 128:33-43, 2003). Бессмертные человеческие микроглиальные клеточные линии и/или установленные человеческие астроглиальные клеточные линии могут, следовательно, использоваться, чтобы изучить некоторые из эффектов воспалительных медиаторов на эти клеточные типы и их потенциал для нейтрализации. Воспалительные медиаторы (включая, но не ограничиваясь ими, ГО-1Ь, ГО-6, ГО-8, ГО-12, ГО-13, ГО-15, ГО-17 А и Е, ГО-18, ГО-23, ФНО-альфа, ГО^-гамма, члены семейства МГО, КА№ТЕ8, ЕР-10, МСР-1, Г- и ГМ-КСФ, и т.д.) способствуют симптомам и патологии, связанной с РС посредством их влияния на активирующие воспа

- 73 015351 лительные пути и нисходящие эффекторные клетки.

Для того чтобы оценить провоспалительное действие Ш-17А и Ш-17Р и способность антагонистов активности Ш-17Р и/или Ш-17А, таких как растворимые рецепторы Ш-ПРС и антитела к ним, включая античеловеческий Ш-ПРС моноклональное и нейтрализирующее антитело по настоящему изобретению, нейтрализовать или уменьшить эти эффекты, культивируемые глиальные клетки обрабатывают одним из следующих веществ: носитель; гЫЬ-17А; гЫЬ-17Р; или гЫЬ-17А+гЫЬ-17Р. Кроме того, их обрабатывают антагонистом, или без антагониста, либо I^-17А, либо Ш-ПР, одним или в комбинации (такой как комбинация с растворимым Ш-17РС). После переменных времен культивирования (от 1 ч до нескольких дней) супернатанты собирают и анализируют на уровень воспалительных медиаторов, включая упомянутые выше. Уровни воспалительных цитокинов и хемокинов увеличиваются в присутствии гЫЬ-17А и/или гЫЬ-17Р, по сравнению с культурами, обработанными одним носителем. Добавление антагонистов активности Ш-17Р и/или Ш-17А, таких как растворимые рецепторы Ш-ПРС и антитела к ним, включая античеловеческий Ш-17РС моноклональное и нейтрализирующее антитело по настоящему изобретения, заметно уменьшает продукцию и экспрессию воспалительных медиаторов, и таким образом, как ожидают, будут эффективными в воспалительных аспектах, связанных с человеческим РС.

Пример 27.

Антагонисты активности Ш-17Р и Ш-17А снижают склонность к заболеванию и его развитие в модели ревматоидного артрита (РА) и остеоартрита (ОА).

Эта модель разработана, чтобы показать, что человеческие синовиальные культуры (включая синовиальные макрофаги, синовиальные фибробласты и суставные хондроциты) и эксплантаты от больных РА и ОА продуцируют более высокие уровни воспалительных медиаторов (включая, но не ограничиваясь ими, онкостатин М, Ш-1Ь, Ι6-6, Ι6-8, Ι6-12, Ι6-15, Ш-17 А и Р, Ι6-18, Ш-23, ФНО-альфа, ШМ-гамма, ТР-10, Κ.ΛNΤΕ8. РАНКЕ, члены семейства МШ, МСР-1, Г- и ГМ-КСФ, оксид азота и т.д.), способствуют симптомам и патологии, связанной с РА и ОА посредством их влияния на активирующие воспалительные пути и нисходящие эффекторные клетки. Эти пути и компоненты затем приводят к воспалительным инфильтратам, потере/деструкции хрящей и матрикса, потере костной массы и активации простагландинов и циклооксигеназ. Поэтому эта модель может моделировать деструктивные воспалительные аспекты РА и ОА в 1п νί!ΐΌ и ех у1уо экспериментах. Кроме того, когда эксплантаты и синовиальные культуры от здоровых контрольных групп культивируются в присутствии нескольких из этих воспалительных компонентов (например, онкостатина М., ФНО-альфа, ΙΗ-1ό, Ш-6, Ш-17А и Р, Ш-15, и т.д.), воспалительный путь передачи сигналов может наблюдаться. Терапия, которая была бы эффективна в человеческом РА ш У1уо, будет работать в вышеупомянутых ш νί!ΐΌ и ех у1уо моделях, ингибируя и/или нейтрализуя продукцию и/или присутствие воспалительных медиаторов.

В этой модели человеческие синовиальные эксплантаты собирают от больных РА, ОА или от здоровых контрольных групп, перенесших замену сустава, или из патолого-анатомических коллекций ткани, и обрабатывают, используя модификацию ^оо1еу и ТеИоу (АгШпйк Рек., 2: 65-70, 2000) и уап'! Но£ е! а1. (РЬеита1о1оду, 39:1004-1008, 2000). Культуры синовиальных фибробластов, синовиальных макрофагов и суставных хондроцитов также изучены. Повторные выборки обрабатывают одним из следующих веществ: носитель (ФБР); рекомбинантный человеческий (гк) ΙΛ-17А; гЫЬ-17Р; или гЫЬ-17А+гЫЬ-17Р, а некоторые образцы содержат различные комбинации онкостатина М, ФНО-альфа, Ш-Ш Ш-6, Ш-17 А, Ш-17Р, и Ш-15. Кроме того, их обрабатывают антагонистом, или без антагониста, активности либо Ι617А, либо Ш-17Р, таким как растворимые рецепторы Ш-ПЕС) и антитела к ним, включая античеловеческий Ш-17РС моноклональное и нейтрализирующее антитело по настоящему изобретению. После переменных времен культивирования (от 1 ч до нескольких дней) супернатанты собирают и анализируют на уровень воспалительных медиаторов, включая упомянутые выше. В образцах от больных РА или ОА или в образцах, обработанных гЫЬ-17А и/или гЫЬ-17Р (одними или в комбинации с другими воспалительными цитокинами), уровни воспалительных цитокинов и хемокинов повышены по сравнению с необработанными контрольными эксплантами или в необработанных клеточных культурах. Добавление антагонистов активности Ш-17Р и/или Ш-ПА, таких как растворимые рецепторы Ш-ПЕС и антитела к ним, включая античеловеческий Ш-17РС моноклональное и нейтрализирующее антитело по настоящему изобретению, заметно уменьшает продукцию воспалительных медиаторов, и таким образом, как ожидают, будут эффективными в человеческих РА или ОА.

Пример 28.

Функциональные реакции Ш-17А и Ш-ПР.

Клетки NIΗ-3Τ3/КΖ142 были устойчиво трансфицированы человеческим Ш-17РСх1 (последовательность 8ЕО ΙΌ N0:1) и мышиным Ш-17РСх1 (последовательность 8ЕО ΙΌ N0:25). Как описано выше, каждую линию обрабатывали в течение 7 и 15 мин с реакцией на дозу Ш-17А, Ш-ПР, мышиного Ι617Р, и адекватных контрольных групп. Как Ш-17А, так и ΙΡ-17Р давал зависимую от дозы реакцию в факторах транскрипции, фосфорилированном РВ-альфа и р38 МАРК, когда Ш-17РСх1 (последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1) трансфицировали, которая реакция была приблизительно на 30% больше, чем врожденная передача сигналов из контрольной линии. Ш-17А и ΙΛ-17Р не дали увеличения передачи сигналов, когда мышиный Ш-17РСх1 (последовательность 8Е0 ΙΌ N0:25) трансфицировали. Мышиный Ш

- 74 015351

17Р не дал увеличения передачи сигналов ни для человеческого, ни для мышиного !Е-17КСх1.

Пример 29.

Экспрессия ΙΕ-17Α, ГО-ПР, ΙΕ-17ΗΑ и ΙΠ-17ΗΟ в мышиных моделях болезни.

Четыре мышиных модели болезни (астма, колит, вызванный ДСН (декстрансульфонат натрия), атопический дерматит и экспериментальный аллергический энцефаломиелит) были проанализированы, используя известные методы экспрессии ΙΕ-17Α, ГО-ПР, ΙΕ-17Η и ГО-ПКС.

В модели астмы ΙΕ-17Α и ΙΠ-17Р экспрессируются при уровнях от очень низкого до необнаруживаемого в легком, селезенке, дренирующих легкое лимфатических узлах и клетках, инфильтрующихся в легкое, в патологически измененных и неизмененных мышах. Сигналы ΙΕ-17ΒΓ, как было найдено, более высоко экспрессируются в легком по сравнению с селезенкой и лимфатическим узлом, но не регулируются болезнью. ΙΕ-17Η более высоко экспрессировался в селезенке и лимфатическом узле, дренирующем легкое, по сравнению с легким, но также не регулировался болезнью.

Вопреки модели астмы ΙΕ-17Α и Ш-ПР высоко активировались в патологически измененных, но не нормальных мышах, в модели ДСН-колита и в проксимальной и периферической ободочной кишках. Никакой цитокин значительно не активировался в мезентериальном лимфатическом узле. Далее, была найдена повышенная активация обоих цитокинов в контексте острого ДСН-индуцированного колита, но не хронического ДСН-индуцированного колита. ΙΕ-17Η, как было найдено, заметно экспрессировался в мезентериальных лимфатических узлах по сравнению с проксимальной и дистальной ободочной кишками, но не регулировался болезнью. Напротив, Ш-ПКС более высоко экспрессировался в проксимальной дистальной ткани ободочной кишки по сравнению с мезентериальными лимфатическими узлами. Экспрессия ΙΠ-17ΗΟ также не регулировалась болезнью.

В атопическом дерматите мРНК ΙΕ-17Α не поддавалась обнаружению. ΙΠ-17Р, как было найдено, экспрессировался как в коже, так и в дренирующих кожу лимфатических узлах, но, кажется, значительно не регулировался болезнью. мРНК ΙΕ-17Η более высоко экспрессировалась в дренирующих кожу лимфатических узлах по сравнению с кожей, но не была отрегулирована болезнью. Ш-ПКС более высоко экспрессировался в коже по сравнению с дренирующими кожу лимфатическими узлами, но также не регулировался болезнью.

В экспериментальном аллергическом энцефаломиелите как ΙΕ-17Α, так и Ш-ПР, как оказалось, активировались в спинном мозге в патологически измененных, но не здоровых мышах. Ш-ПР, возможно, более высоко экспрессировался в лимфатических узлах по сравнению со спинным мозгом, но экспрессия в лимфатических узлах не регулировалась болезнью. Однако полные уровни экспрессии в этих тканях были весьма низкими. ΙΕ-17Η более высоко экспрессировался в ткани лимфатического узла по сравнению с мозгом и спинным мозгом. Ш-ПКС не был испытан.

Короче говоря, экспрессия ΙΕ-17Α и Ш-ПР, как оказалось, регулируется болезнью в контексте моделей ДСН-вызванного колита и экспериментального аллергического энцефаломиелита, но очевидно не в моделях астмы или атопического дерматита. Экспрессия ΙΕ-17Η и ΙΠ-17ΗΟ, кажется, не регулируется болезнью, но экспрессия ΙΕ-17Η, кажется, увеличивается в лимфоидных тканях, в то время как экспрессия ΙΕ-17ΒΓ, кажется, увеличивается в нелимфоидных тканях.

Пример 30.

ГО-ПКС - медиатор активации ΙΕ-17Α и Ш-ПР.

Мышиная аналитическая клеточная линия πί1ι3ΐ3/1<ζ142.8 была трансфицирована человеческим ΙΕ17КСх1 (последовательность 8Е0 ΙΌ N0:2) в вектор экспрессии с геном устойчивости метотрексата (дигидрофолатредуктаза, ДГФР). Человеческий ΙΕ-17ΗΑ (последовательность 8Е0 ΙΌ N0:21) был также трансфицирован в эту клеточную линию. Трансфекция была выполнена, используя коммерчески доступный комплект и рекомендации изготовителя (М1гик, Маб1коп, ^1. Са!. Мадисон, #МIК218). Клетки помещали в 1 мкМ т!х исправленной ростовой среды, чтобы выбрать вектор экспрессии, содержащий конструкты экспрессии. После выбора человеческие пулы были произведены и названы шй3!3^142.8/йсу!ог14Х1 и η^й3!3/кζ142.8/I^-17К.

А) Люциферазный анализ, использующий клеточные линии на основе шй3!3/кз142.8.

Так как клеточные линии на основе ш11313/1«142.8 имеют стабильные репортеры ар1/пГкЬ (1ζ 142), нет никакой потребности в инфекции аденовируса, чтобы добавить этот репортер. Таким образом, протокол люциферазного анализа был укорочен и выбран следующий путь.

1. Выращивание клеток.

Клетки высевали при 5000 клеток/лунку в твердые, белые, покрытые клеточными культурами 96луночные планшеты (Са!. #3917. Сок!аг), использующими среду СИМД/10% ФБС, содержащую глютамин и исправленную пируватом, и культивировали в течение ночи при 37°С и 5% С02. На второй день культуральную среду удаляли и обменивали на среду СИМД/1% ФБС, содержащую глютамин и исправленную пируватом, и культивировали в течение ночи при 37°С и 5% С02.

2. Измерение люциферазным анализом активации ΙΕ-17Α и Р устойчивого репортера 1ζ142.

После ночной инкубации в 1% ФБС/среда СИМД, разбавления человеческих лигандов ΙΕ-17Α и ГО17Р были сделаны в бессывороточных питательных средах, исправленных АБС до уровня 0,28%. После добавления разбавлений лиганда клетки культивировали при 37°С и 5% С0₂ в течение 4 ч, после кото

- 75 015351 рых питательные среды удаляли, клетки расщепляли лизисом в течение 15 мин и среднюю интенсивность флюоресценции (СИФ) измеряли, используя систему и реагенты люциферазного анализа (Са!. # е1531 Рготеда, Майкоп, У1) и микропланшетный люминометр. Активность была обнаружена для обоих лигандов при концентрациях в пределах от 0,1-1000 нг/мл.

Величины эффективной концентрации, ЭК50, обсуждаемые ниже, являются средними числами из по меньшей мере 4 экспериментов. Пул трансфекции шЬ3!3/кζ142.8/Ьсу!о^14X1 показал активность для мышиного лиганда 1Б-17А, такую как показала родительская клеточная линия, с ЭК50 приблизительно нг/мл (пример 14). Факт, что передача сигналов т1Ь-17А в рекомбинантной линии Ьсу!о^14X1 сопоставима с передачей сигналов в родительской клеточной линии (пример 14), предполагает, что мышиный 1Б-17А, вероятно, передает сигналы через эндогенную мышиную Ι'ΐί1ι3ΐ3 клетку рецепторам 1Б-17КА или 1Б-17КС и не активирует клетки через Ьсу!о^14X1. Однако пул трансфектанта ЫЬ-17КСх1 показал повышенную реактивность к обработке человеческим 1Б-17А с ЭК50 0,41 нг/мл против 2,8 нг/мл (средние числа из 4 экспериментов) в родительской клеточной линии (в 6,8 раз более мощная ЭК50 в рекомбинантной линии). Кроме того, рекомбинантная линия ЫЬ-17КСх1 имела повышенную реактивность к ЫЬ17Р, с ЭК50 0.61 нг/мл в рекомбинантной линии против 10 нг/мл в родительской клеточной линии (17-кратно более мощная ЭК50 в рекомбинантной линии). Повышенная потенция к ЫБ-17А и Р в линии ЫЬ-17КСх1 совместима с тем, что человеческий 1Ь-17КСх1 является рецептором высокого сродства для человеческих 1Б-17А и 1Б-17Р. Напротив, рекомбинантная линия ЫБ-17КА имела повышенную чувствительность только к ЫБ-17А, с ЭК50 0,6 нг/мл против 2,8 нг/мл для родительской клеточной линии. Не было повышения ЭК50 ЫБ-17Р в рекомбинантной линии ЫБ-17КА, с ЭК50 1Б-17Р 12,4 нг/мл против 8,9 нг/мл в родительской клеточной линии.

Этот результат является значительным, потому что он специфично включает ЫЬ-17КСх1 как медиатор активации как к ЫБ-17А, так и к ЫБ-17Р и предполагает, что ЫБ-17КА опосредует передачу сигналов только к активации ЫБ-17А, а не к ЫБ-17Р.

Пример 31.

Внутривенное введение 1Б-17А и 1Б-17Р.

Чтобы определить эффект внутривенной доставки мышиного или человеческого 1Б-17А или 1Б-17Р на полный анализ крови (ПАК) и серологические цитокины/хемокины в мышах ВАЬВ/с в различные пункты времени.

Внутривенное введение 1 мкг т1Ь-17А приводило к приблизительно 2-кратному увеличению циркулирующих нейтрофилов (ПАК) и приблизительно к 10-кратному увеличению сывороточного КС и МСР-1 (Ьиттех) через 1-2 часа после введения; подобные результаты в этих хемокинах наблюдались с мкг ЫБ-17А. Уровни моноцитов крови были также значительно увеличены в мышах, обработанных мкг т1Ь-17А (показали самое большое увеличение), 5 мкг ЫБ-17А или 5 мкг ЫБ-17Р в точке времени часа. Внутривенное введение т и ЫБ-17Р приводило к заметным увеличениям сывороточного 1Ь-15 (Ьиттех) в точках времени 1 и 2 часа и к маленьким увеличениям сывороточного КС и МСР-1 в этих же самых точках времени.

Нейтрализация внутривенного введения 1Ь-17А и 1Ь-17Р.

Чтобы нейтрализовать внутривенное 1Ь-17А и ЕЬ-17Р-опосредованное повышение цитокинов и хемокинов внутрибрюшинно растворимыми рецепторами (т1Ь-17КА:Рс для мышиных лигандов; растворимый человеческий 1Ь-17КС для человеческих лигандов). Самкам мышей ВАЬВ/с вводили внутрибрюшинной инъекцией либо ФБР, 100 мкг т1Ь-17КА:Рс, либо 100 мкг растворимого человеческого 1Б-17КС за три часа до получения внутривенной инъекции в хвост: ФБР; 2 мкг либо т1Ь-17А, т1Ь-17Р, либо 2 мкг т1Ь-17А и Р (для мышей, которые получали т1Ь-17КА:Рс); или 2 мкг либо ЫЬ-17А, ЫЬ-17Р, либо 2 мкг ЫЬ-17А и Р (для мышей, которые получали растворимый человеческий 1Б-17КС). Сыворотку собирали через 1 ч после введения лиганда и анализировали на небольшое количество сывороточных цитокинов и хемокинов.

Мыши, предварительно обработанные внутрибрюшинно растворимым рецептором, имели заметное понижение в 1Ь-17А-опосредованном увеличении сывороточных концентраций 1Ь-17А и КС по сравнению с мышами, обработанными ФБР + 1Ь-17А.

Пример 32.

Планшетный анализ со связыванием белка для анализа растворимых полипептидов 1Б-17КС и 1Ь17КСЛЬ-17КА.

Формат ферментного иммуноанализа с захватом (Сар!иге Е1А) следующий: покрывают планшет ЕЫ8А козьим античеловеческим 1дС при 1 мкг/мл и культивируют в течение ночи при 4°С. Промывают и блокируют планшет 200 мкл на лунку 1% АБС в течение 1 ч при комнатной температуре. Промывают, добавляют растворимые варианты рецептора (А1586Р, А1587Р) или серии разбавления 1Ь-17КСх1 (А1034Р) (от 100 мкг/мл до 0,10 мкг/мл) в планшет и культивируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Промывают, добавляют лиганд, меченый биотином, 10:1 (1Ь-17А) или 6:1 (1Ь-17Р), и культивируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Промывают, добавляют стрептавидин-пероксидаза хрена (81гер1ау1йш-Ногке КайкН Регох1йаке) 0,5 мкг/мл и культивируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Промывают, добавляют субстрат ТМВ в течение 4 мин. Реакцию останавливают добавлением

- 76 015351

Стоп-раствора (8!ор ко1и!юи) (примечание: все объемы реактивов были 50 мкл на лунку, если не заявлено иначе). Положительный результат имел бы высокие значения передозировки (0Ό), обычно выше 0,5. Результаты указывают, что конструкт 1342 (последовательности 8ЕО ΙΌ N0:74) не связывает Ш-ПА и слабо связывает ΙΕ-17Ε в этом анализе. Конструкт 1341 (последовательности 8Е0 ΙΌ N0:72) сильно связывает оба Ш-ПА и Ш-17Е. ΙΕ-17ΚΕχ1 связывает Ш-ПА и Ш-17Е.

Формат ферментного иммуноанализа с нейтрализацией (№и1га117а!юи ЕМ) следующий: покрывают планшет ЕЬША растворимым рецептором (А1034Е) при 1 мкг/мл и культивируют в течение ночи при 4°С. Промывают и блокируют планшет 200 мкл на лунку 1% АБС в течение 1 ч при комнатной температуре. В то время как блокируют, в отдельном планшете культивируют растворимые варианты рецептора (А1586Е, А1587Е) в сериях разбавления (от 50 мкг/мл до 0,05 мкг/мл) лигандом, меченым биотином, 10:1 (Ш-ПА) или 6:1 (ЕЙ-17Е) при равных объемах в течение 1 ч при комнатной температуре. Промывают блокированный планшет, добавляют комплекс лиганд-рецептор к блокированному планшету и культивируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Промывают, добавляют стрептавидин-пероксидазу хрена (8!гер!ау1б1и-Ногке Каб1кй Регох1баке) 0,5 мкг/мл и культивируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Промывают, добавляют субстрат ТМВ в течение 7 мин. Реакцию останавливают добавлением Стоп-раствора (8!ор ко1и!юи) (примечание: все объемы реактивов были 50 мкл на лунку, если не заявлено иначе). Положительный результат имел бы низкие значения передозировки (0Ό), обычно ниже 0,5. Результаты указывают, что конструкт 1342 (последовательности 8Е0 ΙΌ N0:74) слабо нейтрализует связывание Ш-ПА с ^-17^^1 и сильно нейтрализует связывание Ш-МЕ с Ш-ПИСхЕ Конструкт 1341 (последовательности 8Е0 ΙΌ N0:72) слабо нейтрализует связывание I^-17Л с ^-17^.^1 и слабо нейтрализует связывание Ш-17Е с Ш-ПИСхЕ

Пример 33.

Протокол анализа связывания с применением ЕАС8.

Чтобы оценить способность растворимых полипептидов Ш-ПКС и I^-17ИС/Т^-17ИЛ по настоящему изобретению связывать лиганды Ш-ПА и Ш-ПЕ, применяли конкурентно-связывающий анализ, основанный на поточной цитометрии. Инкубация клеточной линии ПДХ, устойчиво трансфицированной ЕЕ17КСх4 полной длины в присутствии лигандов Ш-ПА или Ш-ПЕ и растворимого рецептора, предназначенного связывать лиганды, позволяет детектирование и относительный количественный анализ лиганда, связанного с поверхностью клетки (и поэтому не связанного с растворимым рецептором). Биотинилирование лиганда позволяет обнаружение методом ЕАС8 с использованием вторичного флюорофора, сопряженного со Стрептавидином. Снижение лиганда, связанного с клеткой, в течение титрования растворимого рецептора зарегистрировано как уменьшение средней флюоресценции клеток. Биотинилированные лиганды индивидуально заранее смешаны в количестве 1 мкг/мл с титрующими количествами растворимого рецептора в среде окрашивания (НВ88 + 1% АБС + 0,1% №-азид + 10 мМ НЕРЕ8) в 100 мкл объемах и культивированы при комнатной температуре в течение 15 мин. Клеточную линию ПДХ, устойчиво трансфицированную ЕЕ-17КСх4 полной длины, получают для окрашивания лиганда ресуспендированием с верзеном (Тиуйгодеи са!. 15040-066), уравновешиванием до 2х10⁵ клеток/100 мкл, гранулированием и повторным суспендированием в премиксе лиганд/растворимый рецептор премиксе рецептора. Окрашенные клетки культивировали при 4° в течение 30 мин, промывали 1х в среде окрашивания и окрашивали стрептавидином-РЕ (ВИ Рйагтшдеи са!. 554061) в отношении 1:100. Клетки культивировали при 4° в темноте в течение 30 мин, промывали 2х в среде окрашивания и повторно суспендировали при отношении 1:1 среда окрашивания и Су!ойх (ВИ Вюкшеисе 554655). Поточный цитометр И8КП или подобный инструмент применяли для сбора данных и анализа. Фигура 5 изображает стандартный график. График был получен, используя программу Рпхт. Величины Υ представляют СИФ (среднюю интенсивность флуоресценции), нормализованную к максимуму и минимуму. (100% и 0%), основанную на контрольных лунках только лиганд и никакого лиганда/никакого растворимого рецептора, и таким образом, определяют процент связывания лиганда с клетками. Программное обеспечение вычисляет !С, для каждой кривой.

Пример 34.

Ингибирование специфического связывания биотинилированного человеческого ЕЕ-17А и ΙΕ17Ρ с растворимым полипептидом I^-17ИС7I^-17ИЛ

Анализ связывания применяли, чтобы определять способность растворимых полипептидов ГО-ПКС и ΙΒ-1 ТИСИй- 17ИА связывать ЕЕ-17А и ЕЕ17Е, описанную здесь. Исследования связывания выполняют, как обсуждено выше, за исключением того, что дополнительные растворимые полипептиды, такие как последовательности 8Е0 ΙΌ N0:157 и 158, включали в реакцию связывания. Этот растворимый полипептид ингибировал связывание человеческих ЕЕ-17А и ΙΕ-17Ρ с клетками ПДХ, трансфицированными ΙΕ17ИС, до той же самой степени, как растворимый человеческий слитый белок ^-17^.^1 Ес (последовательность 8Е0 ΙΌ N0:64). Остаток растворимых полипептидов, включая растворимый полипептид последовательностей 8Е0 ΙΌ N0:157 и 158, включены в табл. 9.

- 77 015351

Таблица 9*

Растворимый полипептид	Вариант	ИК50- И17А	Растворимый полипептид	Вариант	ИК50- И17А
И17РА/РС	1407	7	1_17РС	1390	9
И17РА/РС	1407	9	М7РА/РС	1454	18
И17РА/РС	1454	4	И17РА/РС	1454	31
И17РА/РС	1454	17	Ц7РА/РС	1454	95
И17РА/РС	1454	20	И17РА/РС	1407	33
1Ы7РС	1390	12		И17РА/РС	1407	42
И17РА/РС	1341	30		И17РС	1210	31
1И7РС	1210	35		1Ь17РС	1210	61
И17РС	1210	47		И17РС	1210	67
И17РС	1210	74		И17РА/РС	1341	47
И17КС	1459	126		И17РС	1459	103
И17КС	1342	217		И17РС	1342	313

* ИК50 при конкурентном связывании на клеточной основе (нг/мкл); порядок конструктов от вещества с самым сильным связыванием до самого слабого связывания по ИК50 для каждого лиганда.

Пример 35.

Сродство связывания растворимых полипептидов 1Ь-17КС и 1Ь-17КС/1Ь-17КА с 1Ь-17 анти-17Р.

1Ь-17КСх1, 1Ь-17КА и растворимый 1Ь-17КС и растворимый полипептид 1Е-17КС/1Ь-17КА (последовательности 8ЕР ΙΌ N0:157 и 158) испытывали на сродство связывания как к 1Ь-17А, так и к 1Ь-17Р следующим образом: СРапН-Ни 1дС-Рс специфическое антитело (Заск^п #109-005-008) разбавляли до 50 мкг/мл при рН 5,0 ацетатом натрия и иммобилизировали на чипе СМ5 Βιι^ιό. Протокол оптимизиро вали до захвата рецептора при теоретическом связывании, максимальном перед инъецированием ряда концентраций каждого лиганда, чтобы наблюдать ассоциацию и диссоциацию. Растворимые рецепторы и полипептид 1Р-17КС/1Ь-17КА проверяли на связывание ряда концентраций каждого лиганда. Поверхность восстанавливали инъекциями 2x30 с глицина при рН 1,75 между циклами. Данные были оценены, используя программное обеспечение Βιι^ιό Ενа1υаΐ^οη, чтобы определить кинетические величины, которые приведены в табл. 10.

Таблица 10*

Сродство человеческого И-17РСх1 к человеческому И-17А	05-2005
Ка (1/Мэ)	Κά (1/5)	Κϋ (М)	Ртах (Ки)	СИ!² щи²)
1.05Е+06	4.90Е-04	4.69Е-10	9,02	0,424
1.24Е+06	4,38Е-04	3.52Е-10	8,86	0,324

Сродство человеческого 11-17РСх1 к человеческому И-17Е 05-2005

Ка (1/М8) ί 9,91 Е+05	Кб (1/5) 4,31 Е-04	ίΚϋ (М) \|4,35Е-10	Ртах (Ри) 7,22	сы² (ри²) 0,378
1.11Е+06	3.84Е-04	Ι3.46Ε-10	7.57	0,549
Растворимый полипептид И-17РС/И-17РА для человеческого И-17А 04-2006
Ка (1/Ме)	Κά (1/8)	\|ко (М) \|	Ртах (Ри) \|	сн!² (ри²)
1.42Е+06	р,22Е-05	4.39Е-11	20,5	0,460
2,61 Е+06	9,95Е-05	3.82Е-11	18,3	0,888
Растворимый полипептид 11-17РС/11-17РА для человеческого И-17Р 04-2006
Ка (1/Мз)	Κά (1/5)	Κϋ (М)	Ртах (Ри)	СЬ\|²(Ри²)
1,82Е+06	2,61 Е-04	;1,43Е-10	10,2	0,495
2,49Е+06	3.15Е-04	1.26Е-10	11,2	0,544
Сродство человеческого И-17РА к человеческому ΙΙ-17А	06-2006
Ка (1/Мз)	Κά (1/5)	Κϋ (Μ)	Ртах (Ри)	сь>² щи²)
3,70Е+05	8.65Е-05	2.34Е-10	29,5	10,249
2.89Е+05 \|	8.57Е-05	р,96Е-10	35,1 \|0,197
Сродство человеческого	ΙΙ--17ΡΑ к человеческому И.-17Г	07-2006
Ка (1/Мз)	Κά (1/5)	Κϋ (М)	Ртах (ΡΙΙ)	СЬ)² (Ри²)
2.09Е+04	5.56Е-04	\|2,66Е-08	20,3	0,071
2.55Е+04	4,40Е-04	\|1,72Е-08	9,9	0,076

* показаны константы равновесия и скорости.

СН12 относится к сумме квадратов остатков между кривыми связывания и оценочными сглаживающими кривыми. Чем ближе к 0, тем больше достоверности мы имеем в данных. Эти данные показаны с хорошей достоверностью.

- 78 015351

Эти данные демонстрируют связывание человеческого ГЬ-17А и человеческого ΙΕ-17Ε с человеческим ГО-ПКА и человеческим ΙΕ-17ΕΕ. Конкретно, человеческий ΙΕ-17ΕΕ демонстрирует близкое сродство связывания к обоим человеческому ГЬ-17А и человеческому ΙΕ-17Ε с константами равновесной диссоциации (КО) в пикомолярной области 400 пМ. Растворимый полипептид I^-17ВС/I^-17ВА связывал человеческий ГБ-17А с немного более высоким сродством, КО ~40 пМ, чем человеческий ΙΕ-17Ε, КО ~140 пМ. Человеческий ГО-ПКА показал наибольшее несоответствие сродства лиганда со 100-кратным различием между человеческим ГО-17А, КО ~300 пМ, и человеческим ΙΕ-17Ε, КО ~30 нМ (наномолярное связывание).

Пример 36.

Создание рекомбинантных человеческих клеточных линий I^-17ВΛ/NIН3Т3/КΖ142.8 и ГЪ17ВСх4/МН3Т3/К2142.8 репортерного анализа.

Мышиная репортерная клеточная линия №Н3Т3/К2142.8, описанная здесь, использовалась, чтобы создать новые аналитические клеточные линии, рекомбинантные для человеческого ГО-ПКА (последовательность 8ЕО ГО N0:21) или Ш-17К.Сх4 (последовательность 8Е0 ГО N0:166). Это было достигнуто трансфекцией этих клеток конструктами экспрессии, содержащими каждую из этих кДНК. Применяли вектор экспрессии, рхтр1Е который содержит ген дигидрофолатредуктазы. Таким образом, трансфектанты выбирались, используя ростовую среду, исправленную 1 мкМ метотрексата, чтобы создать устойчивые пулы. Эти аналитические клеточные линии назвали Ы^-17КΛ/NIН3Т3/КΖ 142.8 и ЫЕ17ВСх4/МШ3Т3/К2142.8.

Пример 37.

Растворимый полипептид I^-17ВС/I^-17ВА противодействует активации человеческим ΙΚ-17А рекомбинантных человеческих клеток ^-17^/^4^^3/1^142.8.

Эффективность конкуренции растворимого полипептида I^-17ВС/I^-17ВА (последовательности 8Е0 ГО N0:157 и 158) за активацию человеческим ΙΕ-17Λ рекомбинантных клеток ЫЕ17ВΛ/NIН3Т3/КΖ142.8 измеряли следующим образом: культивирование клеток и препараты люциферазного анализа были тем же самыми, как описано здесь. В день анализа этим клеткам сначала давали трижды 2-кратными сериями одного объема растворимые рецепторы при 2-кратной конечной концентрации, включая вышеуказанный растворимый полипептид, ΙΚ-17КА и ΙΚ-17КС, начиная с 2 мкг/мл (которая приводит к конечной концентрации 1 мкг/мл, будучи объединенной с лигандом). Затем один объем ГО17А применяли при концентрации 1 нг/мл, которая является 2-кратной конечной концентрацией к 0,5 нг/мл, которая возникает из рецепторов-лигандов, смешивающихся вместе. Максимальная активация была определена, используя тройной набор, который получил 0,5 нг/мл Ш-17А без рецептора. Основная активация определялась, используя тройной набор, который получал только аналитическую среду, которая не содержала ни лиганда, ни растворимого рецептора. Анализ данных показал, что ингибирующая концентрация ИС50 для активации Ш-17А вышеупомянутой клеточной линии растворимым полипептидом была 7 нг/мл. Не было достаточной потенции растворимых ГО-ПКА или ΙΚ-17Η0, чтобы убедительно противодействовать 0,5 нг/мл активации ЫЕ-17А этой клеточной линии даже самой высокой дозой 1 нг/мл растворимого рецептора.

Пример 38.

Растворимый полипептид I^-17ВС/I^-17ВА противодействует активации человеческим ГО-17Е рекомбинантных человеческих клеток ^-17^/^4^^3/1^142.8.

Эффективность конкуренции растворимого полипептида I^-17ВС/I^-17ВА (последовательности 8Е0 ГО N0:157 и 158) за активацию человеческим ГО-17Е рекомбинантных клеток ЫЕ17ВΛ/NIН3Т3/КΖ142.8 измеряли следующим образом: культивирование клеток и препараты люциферазного анализа были тем же самыми, как описано здесь. В день анализа, этим клеткам сначала давали трижды 2-кратными сериями одного объема растворимые рецепторы при 2-кратной конечной концентрации, включая вышеуказанный растворимый полипептид, ΙΒ-17КА и ΙΒ-17КС, начиная с 4 мкг/мл (которая приводит к конечной концентрации 2 мкг/мл, будучи объединенной с лигандом). Затем один объем ГО17Р применяли при 40 нг/мл, которая является 2-кратной конечной концентрацией от 20 нг/мл, которая возникает из рецепторов-лигандов, смешивающихся вместе. Максимальная активация была определена, используя тройной набор, который получил 20 нг/мл ГО-17Е без рецептора. Основная активация определялась, используя тройной набор, который получал только аналитическую среду, которая не содержала ни лиганда, ни растворимого рецептора. Анализ данных показал, что ИС50 для активации ГО-17Е вышеупомянутой клеточной линии растворимым полипептидом была 0,48 мкг/мл. Не было достаточной потенции растворимых ГО-ПКА или ΙΗ-17Κ0, чтобы показать какое-либо противодействие 20 нг/мл активации ЫЕ-17А этой клеточной линии даже самой высокой дозой 2 мкг/мл растворимого рецептора.

Пример 39.

Растворимый полипептид I^-17ВС/I^-17ВА противодействует активации человеческим ГО-17Е рекомбинантных человеческих клеток I^-17ВСx4/NIН3Т3/КΖ142.8.

Эффективность конкуренции растворимого полипептида I^-17ВС/I^-17ВА (последовательности 8Е0 ГО N0:157 и 158) за активацию человеческим ГО-17Е рекомбинантных клеток ЫЕ17ВСx4/NIН3Т3/КΖ142.8 измеряли следующим образом: культивирование клеток и препараты люцифе

- 79 015351 разного анализа были тем же самыми, как описано здесь. В день анализа этим клеткам сначала давали трижды 5-кратными сериями одного объема растворимые рецепторы при 2-кратной конечной концентрации, включая вышеуказанный растворимый полипептид, ^-17^^ и I^-17ВС. начиная с 4 мкг/мл (которая приводит к конечной концентрации 1 мкг/мл, будучи объединенной с лигандом). Затем один объем II .-171^; партия А1275Е применяли при 2 нг/мл, которая является 2-кратной конечной концентрацией от 1 нг/мл, которая возникает из рецепторов-лигандов, смешивающихся вместе. Максимальная активация была определена, используя тройной набор, который получил 1 нг/мл II.-17Е без рецептора. Основная активация определялась, используя тройной набор, который получал только аналитическую среду, которая не содержала ни лиганда, ни растворимого рецептора. Анализ данных выявил, что ИС50 для активации II.-17Е растворимого I^-17ВС/I^-17ВА полипептида была 0,8 мкг/мл, для I^-17ВС была 6 мк/мл и для II .-171СА не было антагонизма при любой дозе.

Пример 40.

Растворимый I^-17ВС/I^-17ВА полипептид нейтрализует активность индукции Г-КСФ, ПА и ПА человеческим I^-17А и ПА7Е.

Человеческие маленькие эпителиальные клетки дыхательных путей (МЭКДП) обрабатывали человеческим Ш-17А или человеческим II .-17Е7 и после 48 ч собирали супернатанты. Эти супернатанты анализировались и показали зависимую от дозы индукцию Г-КСФ, ПА) и ^-8, как показано в табл. 11.

Таблица 11

	кратность индукции в 48-часовых супернатантах
Маленькие эпителиальные клетки дыхательных путей (МЭКДП) обработаны:	Г-КСФ	интерлейкин- 6 (ИЛ-6)	интерлейкин- 8 (ИЛ-8)
	ЬиИ-17А 50 нг/мл Ми11_-17А 10 нг/мл Ьи11_-17А 2 нг/мл Г\|иИ-17А 0,4 нг/мл	26 24 14 13	13 14 8 8	8 6 3 3
	Ни1Ы7Е 250 нг/мл ЬиИ-17Р 50 нг/мл ήυΙΙ_-17Е 10 нг/мл Ьи11_-17Е 2 нг/мл	15 10 8 4	11 8 8 5	4 3 2 2

МЭКДП также обрабатывали дозами 0,01-10 мкг/мл растворимого полипептида I^-17ВС/I^-17ВА (последовательности 8Е^ ГО N0:157 и 158) в комбинации с 10 нг/мл человеческого ГО-17А или 50 нг/мл человеческого II .-17Е (оба лиганд и растворимый полипептид культивировали вместе в течение 30 мин при 37°С прежде, чем добавить к клеткам), и после 48 ч собирали супернатанты. Как показано в табл. 12 ниже, эти супернатанты показали уменьшенный уровень Г-КСФ, ПА) и ПА, демонстрируя, что растворимый полипептид II .-171СС/П .-171СА был в состоянии эффективно нейтрализовать активность индукции этих цитокинов человеческим I^-17А и человеческим ГО-17Е. Отмечено, что величины ИС50 не определены для нейтрализации ПА), потому что при самой низкой дозе (0,01 мкг/мл) испытанного растворимого полипептида I^-17ВС/I^-17ВА. нейтрализация возвратилась только к приблизительно к 50% от максимальной величины).

Таблица 12

Растворимый 1Ы7КА/КС рецептор 1С50 οΐ 1Ы7КА/КС (ид/т!)

нейтрализует активность ΗιιΙί. 17А/Р
ΙίιιΙΙ- 17А (10нг/мл) индукция КСМ ЬиИ 17Р (50нг/мл) индукция КСМ	0,14 1,20
ЬиИ_ 17А (10нг/мл) индукция ΙΙ.-8 ИиИ 17Р (50нг/мл) индукция И-8	0,03 0,57
КиИ 17А (10нг/мл) индукция И-6 Ьи11_ 17Р (50нг/мл) индукция И-6	94%, нейтрализованные в 10 ид/гп! 49%, нейтрализованные в 0,01 ид/т1 72%, нейтрализованные в 10 ид/т! 57%, нейтрализованные в 0,01 ид/т!

Пример 41.

Эффективность растворимых полипептидов I^-17ВС и I^-17ВС/I^-17ВА в образцах человеческого рассеянного склероза.

Рассеянный склероз (РС) является сложной болезнью, которая, как думают, опосредуется многими факторами, включая присутствие воспалительных инфильтратов лимфоцитарных и мононуклеарных клеток и демиелинизацию по ЦНС. Микроглия представляет собой подобные макрофагу клетки, которые населяют центральную нервную систему (ЦНС) и становятся активированными при ранении или инфекции. Микроглия и нейронные клетки вовлечены, как играющие критические роли, в различные болезни ЦНС, включая РС, и могут использоваться для того, чтобы изучить механизм(ы) инициирования, развития и терапии болезни (№да1 е! а1., №игоЬю1. Эхк., 8:1057-1068, 2001; 01коп е! а1., 1. №игоксЕ Ме!йобк,

- 80 015351

128:33-43, 2003; СшНаш е! а1., 1. Nеи^о^штипо1., 165: 83-91, 2005). Первичные нейронные клеточные культуры, иммортализованные человеческие микроглиальные клеточные линии и/или установленные человеческие астроглиальные клеточные линии могут, следовательно, использоваться, чтобы изучить некоторые эффекты воспалительных медиаторов на этих типах клеток и их потенциал для нейтрализации. Воспалительные медиаторы (включая, но не ограничиваясь ими, Ι(-ΓΒ, (-6, (-8, (-12, К-13, (15, (-17 А и Е, К-18, (-23, ФНО-альфа, ИФ-гамма, члены семейства М(, (АNТЕ8, К-10, МСР-1, Г- и ГМ-КСФ, и т.д.) могут способствовать симптомам и патологии, связанной с РС посредством их влияния на формирование воспалительных проводящих путей и нисходящих эффекторных клеток.

Для того чтобы оценить провоспалительные действия К-17А и (-17Е на эти типы клеток и способность растворимых полипептидов по настоящему изобретению, таких как растворимый полипептид (-17(С/(-17(А (последовательность 8ЕО ΙΌ N0:158), нейтрализовать или уменьшить эти эффекты, культивируемые нейронные или глиальные клетки обрабатывают одним из следующих веществ: носитель; гЫЬ-17А; гЫЬ-17Е; гЫЬ-17А+(-17Е. Кроме того, их обрабатывают (или не обрабатывают) растворимым полипептидом по настоящему изобретению, таким как растворимый полипептид (-17(С/(17(А (последовательность 8Е0 ΙΌ N0:158). В отдельном наборе культур, циркулирующие Т-клетки, выделенные из человеческих субъектов и активированные анти-СП3, добавляют к культивируемым нейронным и глиальным клеткам в отсутствие экзогенного (-17А или (17-Е, таким образом, обеспечивая сокультуральный метод исследования деструктивных эффектов активированных Т-клеток на эти клеточные типы. Т-Клетки обрабатывают (или не обрабатывают) растворимым полипептидом по настоящему изобретению, таким как растворимый полипептид (-17(С/(-17(А (последовательность 8Е0 ΙΌ N0:158). После переменного времени культивирования (от 1 ч до нескольких дней) супернатанты и клетки собирают и анализируют на уровни и/или экспрессию воспалительных медиаторов, включая упомянутые выше, и также анализируют на выживание клеток. Уровни воспалительных цитокинов и хемокинов, и смерть нейронных клеток, увеличиваются в присутствии гЫЬ-17А и/или (-17Е по сравнению с культурами, обработанными только носителем. Добавление растворимого полипептида по настоящему изобретению, такого как растворимый полипептид (-17(С/(-17(А (последовательность 8Е0 ΙΌ N0:158), заметно уменьшает продукцию и экспрессию воспалительных медиаторов в этих культурах и увеличивает выживание клетки в нейронных клетках.

Следовательно, поскольку эти ех νί\Ό эксперименты демонстрируют, что растворимый полипептид по настоящему изобретению, такой как растворимый полипептид (-17(С/(-17(А (последовательность 8Е0 ΙΌ N0:158), может уменьшать деструктивные и воспалительные действия, которые связаны с патологией человеческого РС, лечение такими растворимыми полипептидами, как ожидалось, будет эффективно в ослаблении воспалительных аспектов, смерти нейронов и/или демиелинизации, связанной с человеческим РС.

Пример 42.

Эффективность растворимых полипептидов (-17(С и (-17(С/(-17(А в образцах человеческого ревматоидного артрита (РА) и остеоартрита (ОА).

Эти модели разработаны, чтобы показать, что человеческие синовиальные культуры (включая синовиальные макрофаги, синовиальные фибробласты и суставные хондроциты) и эксплантаты от больных РА и ОА, производят более высокие уровни воспалительных медиаторов по сравнению с культурами/эксплантатами от здоровых контрольных групп, которые, в свою очередь, могут вносить вклад в деградацию внеклеточных матриксных компонентов (например костей, хрящей и т.д), что является признаком этих болезней. Кроме того, совместно культивирующиеся модели, описанные ниже, разработаны, чтобы показать, что воспалительные медиаторы присутствуют в синовиальном флюиде РА/ОА и/или активированные Т-клетки могут также приводить к большему воспалению и деградации матрикса.

Расширенная продукция воспалительных медиаторов (включая, но не ограничиваясь ими, онкостатин М, (-1Ь, (-6, (-8, (-12, (-15, (-17 А и Е, (-18, (-23, ФНО-альфа, ИФ-гаммма, ТР-10, (АКГЕ8, члены семейства М(, МСР-1, ММР-9, Г- и ГМ-КСФ, оксид азота и т.д.) вносит вклад в симптомы и патологии, связанные с РА и ОА, посредством их влияния на активацию воспалительных проводящих путей и нисходящие эффекторные клетки. Эти проводящие пути и компоненты затем приводят к воспалительным инфильтратам, хрящам и потере/деструкции матрикса, потере костной массы и активации матриксных металлопротеаз, простагландинов и циклооксигеназ. Следовательно, эти модели могут моделировать деструктивные воспалительные аспекты РА и ОА в ш ν 11го и ех νί\Ό экспериментах. Кроме того, когда эксплантаты и синовиальные культуры от здоровых контрольных групп культивируются в присутствии экзогенно добавленных воспалительных компонентов (например, онкостатин М, ФНО-альфа, К-1Ь, (-6, (-17А и Е, К-15, и т.д.) или альтернативно, в присутствии синовиального флюида от больных РА (который содержал бы воспалительные компоненты эндогенно), воспалительный и деградационный пути передачи сигналов могут наблюдаться. Терапевтические средства, которые были эффективны в человеческом РА ш νίνΌ, будут работать в вышеупомянутых 1п νίΙΐΌ и ех νί\Ό моделях, ингибируя и/или нейтрализуя продукцию и/или присутствие воспалительных медиаторов.

В этих моделях человеческие синовиальные эксплантаты собирают от пациентов с РА, ОА или от здоровых контрольных групп, перенесших замену сустава, или из патологоанатомической коллекции

- 81 015351 тканей, и обрабатывают, используя модификацию Аоо1еу и Те11о\у (АйЬпйк Век., 2: 65-70, 2000) и уап'! НоГ е! а1. (ВЬеита!о1оду, 39:1004-1008; 2000). Культуры синовиальных фибробластов, синовиальных макрофагов и суставных хондроцитов также изучены. Идентичные образцы обрабатывают одним из следующих веществ: носитель (ФБР), рекомбинантный человеческий (гк) ΙΕ-17Α; гЫЬ-17Е; или гЫЬ17А+гЫЬ-17Е, и некоторые образцы содержат различные комбинации онкостатина М, ФНО-альфа, Ш-1Ь, ΙΕ-6, ΙΕ-17Α, ΙΕ-17Η и ΙΕ-15. Отдельный набор образцов обрабатывают активированными человеческими Т-клетками или синовиальным флюидом от здоровых контрольных групп или больных РА или ОА. Кроме того, все эти образцы обрабатывают (или не обрабатывают) растворимым полипептидом по настоящему изобретению, таким как растворимый полипептид Ш-17ВС или растворимый полипептид Ш17ВС/Ш-17ВА (последовательность 8ЕО ΙΌ NО:158). После переменного времени культивирования (от 1 ч до нескольких дней) супернатанты и клетки собирают и анализируют на уровни воспалительных медиаторов и биомаркеров хряща/кости/матрикса, включая упомянутые выше. В образцах от больных РА или ОА или в образцах, обработанных синовиальной жидкостью РА/ОА, активированными Т-клетками, гЫЬ-17А и/или гЫЬ-17Е (либо по отдельности, либо в комбинации с другими воспалительными цитокинами), уровни воспалительных цитокинов и хемокинов и маркеров деградации хряща/кости/матрикса увеличиваются по сравнению с необработанными здоровыми контрольными эксплантатами или в необработанных клеточных культурах. Добавление растворимого полипептида по настоящему изобретению заметно уменьшает продукцию воспалительных медиаторов и медиаторов деградации хряща/кости/матрикса, и таким образом, как ожидалось, является эффективным в человеческом РА и ОА.

Пример 43.

Эффективность растворимых полипептидов Ш-17ВС и I^-17ΒС/I^-17ΒΑ в образцах человеческой воспалительной болезни кишечника (ВБК) посредством культуры биопсии слизистой.

Эта модель разработана, чтобы показать, что культивируемая кишечная ткань от пациентов с ВБК производит более высокие уровни воспалительных медиаторов по сравнению с тканью от здоровых контрольных групп. Эта расширенная продукция воспалительных медиаторов (включая, но не ограничиваясь ими, ТЬ-1Ь, Ш-4, ΙΕ-5, ΙΕ-6, Ш-8, Ш-12, Ш-13, Ш-15, Ш-17 А и Е, Ш-18, Ш-23, ФНО-альфа, ИФгаммма, члены семейства МЖ, МСР-1, Г- и ГМ-КСФ, и т.д.) вносит вклад в симптомы и патологии, связанные с ВБК, такими как болезнь Крона (БК) и неспецифический язвенный колит (ЯК) посредством их влияния на активирование воспалительных путей и нисходящих эффекторных клеток. Эти пути и компоненты затем приводят к повреждению/деструкции тканей и клеток, наблюдаемых ш у1уо. Следовательно, эта модель может моделировать этот усиленный воспалительный медиаторный аспект ВБК. Кроме того, когда кишечная ткань от здоровых контрольных групп или от человеческих кишечных эпителиальных клеточных линий (КЭК) культивируется в присутствии этих воспалительных компонентов, воспалительный путь передачи сигналов может наблюдаться, так же как признаки повреждения клеток и тканей.

Терапевтические средства, которые были эффективны в человеческой ВБК ш у1уо, будут работать в вышеупомянутых моделях ех у1уо или моделях ВБК, ингибируя и/или нейтрализуя продукцию и/или присутствие воспалительных медиаторов.

В этой модели человеческую кишечную ткань собирают от больных ВБК или от здоровых контрольных групп, перенесших кишечную биопсию, резекцию, или из патологоанатомической коллекции тканей и обрабатывают, используя модификацию А1ехак1к е! а1. (Си!, 53:85-90, 2004). В асептических условиях образцы мягко очищают обильным количеством ФБР, за которым следует культивирование измельченных секций ткани, в присутствии полных тканевых культуральных сред (плюс антибиотики, чтобы предотвратить размножение бактерий). Образцы из того же самого пула измельченной ткани обрабатывают одним из следующего: носитель (ФБР), рекомбинантный человеческий (гк) Ш-17А; гЫЬ-17Е; или гЫЕ-17А+гЫЬ-17Е. Кроме того, все эти образцы обрабатывают (или не обрабатывают) растворимым полипептидом по настоящему изобретению, такими как растворимый полипептид Ш-17ВС или растворимый полипептид Ш-17ВС/Ш-17ВЛ (последовательность 8ЕО ΙΌ NО:158). Этот экспериментальный протокол следует исследованию человеческих КЭК линий, за исключением того, что клетки поступают из существующих запасов. После переменных времен культивирования (от 1 ч до нескольких дней) супернатанты собирают и анализируют на уровни воспалительных медиаторов, включая упомянутые выше. В образцах от больных ВБК или в образцах, обработанных гЫЬ-17А и/или Е, уровни воспалительных цитокинов и хемокинов увеличены по сравнению с необработанными, здоровыми, контрольными образцами тканей. Добавление растворимого полипептида по настоящему изобретению заметно уменьшает продукцию воспалительных медиаторов, и таким образом, как ожидалось, является эффективным при человеческой ВБК.

Дополнительный раздел этого исследования может включать сравнения продукции воспалительных медиаторов из биопсий ткани больных ВБК, подвергшихся эффективному лечению, и тех, которые в настоящее время не принимают лекарства или рассматриваются как не отвечающие лечению.

- 82 015351

Пример 44.

Эффективность растворимых полипептидов ГО-17КС и I^-17КС/I^-17КА в образцах человеческой ВБК с помощью функции эпителиального барьера.

Поддержание целостности эпителиального барьера является критическим фактором в сохранении здорового желудочно-кишечного тракта. Экспериментальные данные предполагают, что негерметичность эпителиального барьера в кишке может способствовать развитию ВБК. Иммунные клетки, расположенные в кишечной ламине, обычно взаимодействуют с кишечными эпителиальными клетками через контакт клетка-клетка или продукцию растворимых факторов, чтобы поддержать иммунный надзор и способствовать целостности эпителиального барьера. Однако пролонгированное или дисрегулируемое иммуноопосредованное воспаление может способствовать дефектам целостности эпителиального барьера и функции. Следующее исследование разработано, чтобы измерить прямое влияние ^-^А и/или Л17Р, полученных из Т-клетки, на целостность эпителиального барьера.

В этом примере кишечные линии эпителиальных клеток, таких как клетки Сасо-2, дифференцируют на полупроницаемых мембранах и совместно культивируют на базолатеральной стороне либо с Тклетками, либо с моноцитами, полученными из биопсий от больных ВБК или нормальных людей. Целостность эпителиального монослоя проверяют в течение долгого времени, используя исследование трансэпителиального электрического сопротивления или устойчивости монослоя к диффузии красителя. Уменьшение трансэпителиального сопротивления монослоев в сокультурах предполагало разрушение в монослое, вызванное активностью Т-клеток или моноцитов в сокультурах (со-си1!иге). Ингибиторы Л17А и ГО-ИР, такие как растворимые полипептиды по настоящему изобретению, такие как растворимый полипептид ГО-ПКС или растворимый полипептид I^-17КС/I^-17КА (последовательность 8Еф ГО N0:158), могли бы использоваться, чтобы определить относительный вклад ГО-ПА и ГО-17Р в разрушение эпителиального монослоя и проверить будут ли ингибиторы ГО-17А и ГО-ПЕ эффективны в поддержании целостности эпителиального барьера. Профилактика эпителиального разрушения монослоя, вызванного активированными Т-клетками, такими молекулами предполагала бы, что растворимые полипептиды ГО-17КС и ГО-17КС/ГО-17КА по настоящему изобретению могут быть эффективны для терапевтического лечения ВБК у людей.

Совместно культивируемые системы могут также производится, используя монослои, сформированные первичным эпителием от больных ВБК, чтобы определить, более ли чувствительны эти клетки к ^-^А и ГО-ПР по сравнению с эпителиальными клетками, полученными от здоровых людей. Если так, эти данные предполагали бы, что ингибирование ГО-17А и ГО-ПР будет подходящей стратегией для терапевтического лечения ВБК.

Пример 45.

Влияние ГО-17А и ГО-ПР на Т-клетки ламины и моноциты/макрофаги из нормальных образцов и человеческой ВБК.

Дисрегулированное или длительное иммуноопосредованное воспаление могут вносить вклад в симптомы и патологии, связанные с ВБК посредством повреждения ткани или постоянного перекоса к несоответствующим или длительным иммунным реакциям. Эта модель может определить потенциальные нисходящие последствия воздействия Т-клеток и моноцитов, связанных с болезнью, на ГО-17А и ГО17Р, которые могут присутствовать в непосредственной окружающей цитокин среде кишечной ткани.

Терапевтические средства, которые были эффективны в человеческой ВБК ш у1уо, будут работать в вышеупомянутых моделях ех у1уо, ингибируя и/или нейтрализуя продукцию и/или присутствие воспалительных медиаторов (включая, но не ограничиваясь ими, ΙΠ-ГЬ, ΙΕ-4, ГО-5, ГО-6, ГО-8, ГО-12, ΙΠ-13, ΙΠ-15, ΙΣ-17 А и Р, ΙΠ-18, ГО-23, ФНО-альфа, ИФ-гамма, члены семейства МП, МСР-1, Г- и ГМ-КСФ, и т.д.)

В этой модели Т-клетки и моноциты/макрофаги выделяют из образцов биопсии, тщательно измельчая биоптат ножницами в НВ88 (сбалансированный солевой раствор Хэнкса, ССРХ), обрабатывая коллагеном и Э|краке ΙΙ и культивируя в течение 1 ч при 37°С в аппарате для встряхивания. Суспензию клетки фильтруют через нейлоновую сетку, чтобы удалить осколки и скопления клеток и промывая многократно в ССРХ. Т-Клетки и моноциты/макрофаги могут быть изолированы, используя прямую сортировку клеток или протоколы истощения/обогащения гранул. Выделенные клетки культивируют в присутствии Ш-17А и ГО-ПР. Это вызывает продукцию воспалительных медиаторов Т-клетками и моноцитами/макрофагами или приводит к искажению последующих реакций Т-клеток до высоко провоспалительных реакций. Сравнения между типами воспалительных медиаторов, произведенных клетками от больных ВБК и воспалительных медиаторов из клеток нормальных людей, могут быть сделаны и можно предположить, что Т-клетки и моноцит/макрофаги от больных ВБК производят более провоспалительный профиль в присутствии ГО-17А и ГО-ПР. Добавление растворимого полипептида по настоящему изобретению, такого как растворимый полипептид ГО-17КС или растворимый полипептид 1Ь-17КС/ГО17КА (последовательность 8ЕС ГО N0:158), чтобы нейтрализовать продукцию нисходящих воспалительных медиаторов, вызванных Ш-17А и ГО-17Р, предполагает, что такие растворимые полипептиды ГОИКС и I^-17КС/I^-17КА могут быть эффективны в терапевтическом лечении больных ВБК.

- 83 015351

Пример 46.

Эффективность растворимых полипептидов ГО-17КС и ГО-17КС/ТЬ-17КА в синдроме раздражительного кишечника (СРК): ЦНС-направленный патогенез.

Модель, сосредотачивающаяся на первичном ЦНС-направленном патогенезе СРК, который использует стимулирование стресса, чтобы вызвать симптомы характеристической СРК. Модель психосоциального стресса новорожденных подражает некоторым клиническим особенностям, связанным с больными СРК, включая висцеральную гипералгезию, диарею и чувствительность к напряжению. Ежедневное разделение выводка и их матерей в течение 180 мин каждый день в течение 4-18 послеродовых дней приводит к альтерации материнского поведения и значительно уменьшает времена поведения облизывания/чистки. Стресс у новорожденных приводит к постоянным изменениям в ЦНС, заканчивающимся измененной висцеральной и соматической болевой чувствительностью, вызванной стрессом. Моторная функция ободочной и толстой кишки в ответ на стресс усиливается у этих животных, и предварительные данные приводят доказательства повышенной кишечной проницаемости (Мауег еГ а1., 2002). Лечение растворимым полипептидом по настоящему изобретению, таким как растворимый полипептид ГО-ИКС или растворимый полипептид ГО-17КСГО-17КА (последовательность 8ЕО ГО N0:158), и последующий анализ моторной функции ободочной и толстой кишки, эпителиальной проницаемости и реакции на стимулы стресса могли бы определять эффективность в этой животной модели СРК. Снижение доли симптомов после лечения этими ингибиторами предполагало бы потенциальную эффективность в лечении СРК.

Пример 47.

Эффективность растворимых полипептидов ГО-17КС и ГО-17КС/ТЬ-17КА в синдроме раздражительного кишечника (СРК): первичные индукторы стресса, направленные на кишку.

Это модель, сосредотачивающаяся на первичных индукторах стресса, направленных на кишку (т.е. воспаление кишки, инфекция или физическое напряжение). Исследование на животных показало, что низкой степени воспаление или иммунная активация могут быть основанием для измененной моторики, и/или афферентной и эпителиальной функции кишки (Мауег еГ а1. 2002). В этой модели ежедневное раздражение ободочной кишки производится в новорожденных животных (дни 8-21) в форме ежедневной внутритолстокишечной инъекции горчичного масла. Горчичное масло представляет собой невральный стимул и, как показано, вызывает висцеральную гипералгезию после внутритолстокишечного введения. Эта модель подражает главным особенностям СРК, включая висцеральную гиперчувствительность и альтерацию привычек кишечника. Животные также получают диарею или запор, главную особенность больных СРК (Мауег еГ а1., 2002; К1тЬа11 еГ а1., 2005). Растворимый полипептид по настоящему изобретению, такой как растворимый полипептид ГО-17КС или растворимый полипептид ГО-17КС/ГО-17КА (последовательности 8ЕО ГО N0:158), мог бы быть обеспечен, чтобы определять изменения в развитии симптомов, связанных с этой моделью. Снижение уровня величины висцеральной гиперчувствительности и измененной моторики кишки после терапевтического лечения нашими ингибиторами предполагает, что потенциал этих молекул будет эффективен в лечении СРК.

Пример 48.

Проектирование масштабируемого способа продукции белков для растворимого антагониста ГОПА и ГО-17Е.

В проектировании стратегий, сосредоточенных на развитии масштабируемого способа продукции белков для растворимой формы ГО-17КС, много трудностей встретилось в идентификации системы экспрессии, которая позволяет белковые концентрации высокого уровня в кондиционированных средах. Вестерн-блот анализ продемонстрировал низкие уровни секреции белков с белком, накапливающимся в клетке. В открытии растворимых полипептидов по настоящему изобретению больше чем семьдесят различных конструктов экспрессии были разработаны, произведены и испытаны на экспрессию либо в клетках ПДХ, клетках СНО, либо в клетках НЕК 293. Несколько были проверены в более чем одной линии клеток-хозяев. Изменения испытанной кассеты экспрессии растворимой ГО-17КС включали следующее.

1) Альтернативные сигнальные последовательности, такие как: а) нативная; Ь) оГРА; с) переменная область тяжелой цепи иммуноглобулина мыши; б) гормон роста человека; е) мышиный ГО17КА.

2) Два различных естественно встречающихся сплайс-варианта (ГО-17КСх1, последовательность 8Е0 ГО N0:2 и ГО-17КСх4, последовательность 8Е0 ГО N0:166).

3) Добавление линкерных последовательностей между внеклеточным доменом (ВКД) ГО-17КС и участком Ес, таких как: а) отсутствие линкера; Ь) 9-аминокислотный линкер, на основе С1уС1уС1у8ег; и с) 20-аминокислотный линкер, на основе С1уС1уС1у8ег.

4) Н1к-теговые мономерные формы.

5) Амино- и карбоксиконцевые слитые белки Ес.

6) Удаление ^связанных участков прикрепления углевода.

7) 3амещение аминокислоты Акп на Ст.

8) Гибридные слитые белки между ГО-17КА и ГО-17КС.

Все растворимые конструкты варианта экспрессии ГО-17КС испытывались на экспрессию белков

- 84 015351 скоротечной трансфекцией в клетки ПИК 293. Вестерн-блот-анализ использовался, чтобы обнаружить белок, секретируемый в кондиционированную среду, по сравнению с белком, сохраненным в клетке, отбирая пробы лизатов клеток. Большинство конструкций экспрессировали белок, выделяемый в кондиционированную среду, который едва поддавался обнаружению Вестерн-блоттингом. Дополнительно, сигнал был больше от образца лизата клеток по сравнению с образцом кондиционированных сред, указывая на неспособность белка эффективно секретироваться. Те конструкты экспрессии, которые приводили к самым высоким сигналам в кондиционированных средах, применяли, чтобы трансфицировать пулы устойчивых клеток СНО. Белковые титры измеряли из пулов устойчивых СНО и где только возможно, очищенный белок анализировали на связывание 1Ь-17А и 1Ь-17Р, в анализе конкурентного связывания на клеточной основе. Следующая таблица показывает результаты экспрессии белка из конструктов самой высокой экспрессии в устойчивых пулах клеток СНО. Когда измерения абсолютной концентрации белка были ниже уровня обнаружения, белковый титр указывался как < 0,5 мг/мл.

Номер обозначения конструктов экспрессии белков 1Ь-17КС и 1Ь-17КС/КА, краткое описание включенных экзонов, белковый титр из пулов устойчиво трансфицированных клеток СНО, и сродство связывания 1Ь17А и 1Ь17Р. Не все последовательности вариантов, включенных в табл. 13, были включены при этом.

Таблица 13

Описание Титр белка (мг/л) Связывание

сплайс-вариант х1 И-17КС экзоны 1-6, экзоны 8-16 (Вариант 1210) сплайс-вариант х4 И-17КС экзоны 1-16	3,0 <0,5	Способность блокировать 1Ь17Аи И-17Р
нельзя достаточное образца	получить количество
И-17КС экзоны 1-6	<0,5	неактивный
И-17КС экзоны 8-13	1,6	неактивный
1Е-17КС экзоны 7-16	<0,5	Способность блокировать
		И.-17А и И-17Г
11_-17КА экзоны 1-10	32,5	. Способность блокировать
11.-17ЕС экзоны 8-16		И.-17А и И.-17Г
(Вариант 1407)
И-17КА экзоны 1-6	<0,5	неактивный
И-17КС экзоны 8-16
И.-17КА экзоны 7-10
И-17КА экзоны 1-3	<0,5	нельзя	получить
И.-17КС экзоны 4-16		достаточное	количество
		образца
И-17ПА экзоны 1	<0,5	нельзя	получить
И-17КС экзоны 2-16		достаточное	количество
		образца
11_-17(ТА экзоны 1-6	19	Способность блокировать
И-17КС экзоны 8-16		И-17А и И-17Е
(Вариант 1454)

Из вышесказанного ясно, что, хотя определенные варианты по изобретению были описаны здесь в целях иллюстрации, различные модификации могут быть сделаны, не отклоняясь от духа и области изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Выделенный растворимый полипептид, кодируемый полинуклеотидом, включающим по меньшей мере один экзон гена, кодирующего Ι6-17ΒΑ (8Еф ΙΌ NΟ:21), и по меньшей мере один экзон гена, кодирующего ΙΕ-ΠΡΟ', где указанный растворимый полипептид связывает Ι6-17Λ и Ι6-17Ε.
2. Выделенный растворимый полипептид по п.1, в котором полипептидная последовательность Ι617КС выбрана из группы, состоящей из 8Еф ΙΌ NΟ:2, 166, 4 и 24.
3. Выделенный растворимый полипептид по п.1, отличающийся тем, что его растворимая форма связывается с Ι6-17Ρ.
4. Выделенный растворимый полипептид по п.3, отличающийся тем, что дополнительно связывается с Ι6-17Α.
5. Выделенный растворимый полипептид по п.1, отличающийся тем, что специфически связывается с ]Ь-17Е и Ι6-17Α.
6. Выделенный растворимый полипептид по п.1, отличающийся тем, что дополнительно включает полипептид, выбранный из группы, состоящей из 8Еф ΙΌ NΟ:175 и 180.
7. Выделенный растворимый полипептид по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно ПЭГилирован.
8. Выделенный растворимый полипептид, включающий аминокислотные остатки 193-447 из 8Еф ΙΌ NΟ:2 и аминокислотную последовательность, кодируемую, по меньшей мере, экзоном 1 гена, кодирующего ΙΕ-17ΚΛ, представленный на фиг. 3, в котором указанный растворимый полипептид специфически связывается с Ш-ПА и Ι6-17Ε.
9. Выделенный растворимый полипептид по п.8, отличающийся тем, что включает аминокислотную последовательность, кодированную экзонами 1-6 гена, кодирующего ΙΕ-17ΕΑ, представленную на фиг. 3.
10. Выделенный растворимый полипептид по п.8, в котором указанный полипептид включает полипептид, представленный на фиг. 4.
11. Выделенный растворимый полипептид по любому из пп.8 и 9, отличающийся тем, что дополнительно включает полипептид, выбранный из группы, состоящей из 8Еф ΙΌ NΟ:175 и 180.
12. Выделенный растворимый полипептид по любому из пп.8 и 9, отличающийся тем, что он дополнительно ПЭГилирован.
13. Выделенный растворимый полипептид, включающий аминокислотные остатки 1-458 из 8Еф ΙΌ NΟ:158, где указанный растворимый полипептид специфически связывает Ι6-17Λ и Ι6-17Ρ.
14. Выделенный растворимый полипептид по п.13, отличающийся тем, что он включает 8Еф ΙΌ ^:158.
15. Выделенный растворимый полипептид по п.13, отличающийся тем, что состоит из аминокислотных остатков 1-458 из 8Еф ΙΌ NΟ:158.
16. Выделенный растворимый полипептид по п.14, отличающийся тем, что состоит из 8Еф ΙΌ ^:158.
17. Выделенный растворимый полипептид по п.13, отличающийся тем, что он дополнительно ПЭГилирован.
18. Выделенный растворимый полипептид по п.14, отличающийся тем, что он дополнительно ПЭГилирован.
19. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных остатков 193-276 из 8Еф ΙΌ NΟ:2, аминокислотных остатков 208291 из 8ЕО ΙΌ NΟ:166, аминокислотных остатков 277-370 из 8Еф ΙΌ NΟ:2, аминокислотных остатков 292-385 из 8ЕО ΙΌ NΟ:166, аминокислотных остатков 371-447 из 8Еф ΙΌ NΟ:2 и аминокислотных остатков 386-462 из 8ЕО ΙΌ NΟ:166, где указанный полипептид специфически связывает Ι6-17Λ и Ι6-17Ε.
20. Выделенный полипептид по п.19, отличающийся тем, что включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Еф ΙΌ NΟ:160, 162 и 164.
21. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЕ) ΙΌ ^:68, 70, 72, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 122, 140 и 152, где указанный полипептид специфически связывает Ι6-17Λ и Ι6-17Ε.
22. Выделенный полипептид по п.21, отличающийся тем, что он дополнительно ПЭГилирован.
23. Способ продуцирования антитела к полипептиду, включающий инокуляцию животного полипептидом, выбранным из группы, состоящей из 8Еф ΙΌ NΟ:160, 162 и 164, в котором полипептид вызывает иммунную реакцию в животном, чтобы продуцировать антитело, и выделение антитела из животного, и в котором антитело специфически связывается с полипептидом Ι6-17Κ0' и снижает активность Ι617А и/или Ι6-17Ε.
24. Способ по п.23, отличающийся тем, что антитело снижает провоспалительную активность Ι617А и/или Ι6-17Ε.
25. Способ по п.23, отличающийся тем, что антитело нейтрализует взаимодействие Ι6-17Λ и/или

- 86 015351 [Б-17Р с [Б-17ЕС или ^-17^.
26. Способ по п.25, отличающийся тем, что нейтрализация антителом измеряется обнаружением нейтрализации [Б-17А и/или [Б-17Б штйго.
27. Способ по п.23, отличающийся тем, что антитело снижает провоспалительную активность обоих [Б-17А и [Б-17Р.
28. Способ по п.23, отличающийся тем, что антитело нейтрализует взаимодействие обоих ББ-17А и с [Б-17ЕС.
29. Способ по п.25, отличающийся тем, что нейтрализацию антителом измеряют обнаружением нейтрализации обоих [Б-17А и [Б-17Р ш νίΙΐΌ.
30. Способ снижения или ингибирования либо [Б-17А-вызванного, либо [Б-ПР-вызванного воспаления, включающий введение млекопитающему с воспалением количества растворимого полипептида по любому из пп.1, 8, 9, 13 или 14, достаточного для снижения воспаления.
31. Способ снижения [Б-17А-вызванного и [Б-ПР-вызванного воспаления, включающий введение млекопитающему с воспалением количества растворимого полипептида по любому из пп.1, 8, 9, 13 или 14, достаточного для снижения воспаления.
32. Способ лечения млекопитающего, пораженного воспалительным заболеванием, вызванным [Б17А или [Б-ПР, включающий введение млекопитающему антагониста [Б-17А или [^-17Б. позволяющего снизить воспаление, в котором антагонист содержит растворимый полипептид по п.1 и в котором воспалительная активность либо [^-17Л, либо [Б-17Р снижается.
33. Способ по п.32, отличающийся тем, что болезнью является астма.
34. Способ по п.32, отличающийся тем, что болезнью является хроническое воспалительное заболевание.
35. Способ по п.34, отличающийся тем, что болезнью является хроническое воспалительное заболевание, включая воспалительную болезнь кишечника, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, артрит, атопический дерматит или псориаз.
36. Способ по п.32, отличающийся тем, что болезнью является синдром раздраженного кишечника ([В8).
37. Способ по п.32, отличающийся тем, что болезнью является острое воспалительное заболевание.
38. Способ по п.37, отличающийся тем, что болезнью является острое воспалительное заболевание, включая эндотоксемию, сепсис, синдром токсического шока или инфекционное заболевание.
39. Способ лечения млекопитающего, пораженного воспалительным заболеванием, в котором принимают участие [Б-17А и Ш-ПР, включающий введение млекопитающему антагониста [Б-17А и [^-17Б. позволяющего снизить воспаление, в котором антагонист содержит растворимый полипептид по п.1 и в котором воспалительная активность [Б-17А и [Б-17Р снижается.
40. Способ по п.39, отличающийся тем, что болезнью является астма.
41. Способ по п.39, отличающийся тем, что болезнью является хроническое воспалительное заболевание.
42. Способ по п.41, отличающийся тем, что болезнью является хроническое воспалительное заболевание, включая воспалительную болезнь кишечника, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, артрит, атопический дерматит или псориаз.
43. Способ по п.39, отличающийся тем, что болезнью является синдром раздраженного кишечника ([В8).
44. Способ по п.39, отличающийся тем, что болезнью является острая воспалительная болезнь.
45. Способ по п.44, отличающийся тем, что болезнью является острая воспалительная болезнь, включая эндотоксемию, сепсис, синдром токсического шока или инфекционную болезнь.
46. Способ по п.32, отличающийся тем, что болезнью является рассеянный склероз.
47. Способ по п.39, отличающийся тем, что болезнью является рассеянный склероз.
48. Способ по п.32, отличающийся тем, что болезнью является ревматоидный артрит.
49. Способ по п.39, отличающийся тем, что болезнью является ревматоидный артрит.
50. Способ по п.32, отличающийся тем, что болезнью является остеоартрит.
51. Способ по п.39, отличающийся тем, что болезнью является остеоартрит.
52. Способ по п.32 или 39, отличающийся тем, что болезнью является аутоиммунная болезнь.
53. Способ по п.52, отличающийся тем, что аутоиммунная болезнь представляет собой рассеянный склероз, ревматоидный артрит или воспалительную болезнь кишечника ([ВО).
54. Способ по п.32 или 39, отличающийся тем, что болезнью является хроническая воспалительная болезнь дыхательных путей.
55. Способ по п.54, отличающийся тем, что хроническая воспалительная болезнь дыхательных путей представляет собой астму, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ) и кистозный фиброз.
56. Способ по п.32 или 33, отличающийся тем, что болезнь представляет собой псориаз, ревматоидный артрит, остеоартрит, язвенный колит, болезнь Крона, синдром раздраженной толстой кишки (СРТК), контактный дерматит, рассеянный склероз, отторжение трансплантата, астма, хроническое обструктив

- 87 015351 ное заболевание легких (ХОЗЛ), кистозный фиброз или аллергическую астму.
57. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид в соответствии с любым из пп.1-11, 13-16 и 19-21.
58. Молекула нуклеиновой кислоты по п.57, включающая нуклеотидную последовательность, показанную в ЗЕС) ΙΌ N0:157.
59. Экспрессирующий вектор, включающий следующие функционально связанные элементы:

a) промотор транскрипции,

b) сегмент ДНК, кодирующий полипептид по любому из пп.1-11, 13-16 и 19-21;

c) терминатор транскрипции.
60. Клетка, включающая экспрессирующий вектор по п.59, причем клетка экспрессирует полипептид, кодируемый указанным ДНК-сегментом.
61. Способ получения полипептида, включающий:

a) культивирование клетки по п.60 в условиях, пригодных для экспрессии белка;

b) выделение экспрессированного полипептида.
62. Способ по п.61, где клетка является эукариотической клеткой и где экспрессированный полипептид секретируется из клетки.
63. Способ по п.61 или 62, где полипептид включает аминокислотную последовательность, показанную в ЗЕС) ΙΌ N0:158 или остатки 1-458 от ЗЕС) ΙΌ N0:158.
64. Способ по любому из пп.32-56, отличающийся тем, что растворимый полипептид получают способом по п.63.