NO301718B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid med cytokinsynteseinhiberingsfaktoraktivitet - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid med cytokinsynteseinhiberingsfaktoraktivitet med aminosyresekvensen: eller aminosyresekvensen:

Oppfinnelsen angår også en nukleinsyre, en ekspresjonsvektor og en transformert celle anvendt ved fremgangsmåten, samt et monoklonalt antistoff mot faktoren.

Bakgrunn

Immunsvar på antigener klassifiseres som enten hovedsakelig cellemedierte, illustrert ved fenomenet forsinket type hypersensitivitet ("delayed-type hypersensitivity", DTH) , eller hovedsakelig humorale, illustrert ved produksjon av antistoffer. Cellemediert immunitet er av største viktighet for rejeksjon av svulster og for restitusjon fra en rekke virus-, bakterie-, protozo- og soppinfeksjoner. Det humorale immunsvar er i motsetning til dette den mest effektive type immunitet for eliminering av toksiner og invaderende organismer fra sirkulasjonen. For forskjellige antigener er det observert at det ene eller det andre av disse to svar ofte vil være det fremherskende på en gjensidig utelukkende måte, og at styrken av en del sykdommer, f.eks. lepra, leishmaniasis og andre typer av autoimmunitet, kan skyldes en uheldig dominans av én type svar over det andre Mosmann et al., Immunol. Today, vol. 8, s. 223-227 (1987); Mosmann et al., Ann. Rev. Immunol., vol. 7, s. 145-173 (1989); Parish, Trans- plant. Rev., vol. 13, s. 35-66 (1972) og Liew, Immunol. Today, vol. 10, s. 40-45 (1989). Det er videre bemerket at sett av cytokiner er individuelt forbundet med DTH-reaksjoner og humorale immunsvar, Cher et al., J. Immunol, vol. 138,

s. 3688-3694 (1987) og Mosmann et al. (1987 og 1989, referert til ovenfor), og det antas at sykdommer forbundet med disse typer svar, forårsakes av uhensiktsmessig produksjon av de assosierte cytokinsett.

En stor mengde bevis peker f.eks. på at overproduk-sjon av gamma-interferon (IFN-if) er ansvarlig for autoimmun-.sykdommer forbundet med det store vevskompatibilitetskompleks (MHC): Hooks et al., New England J. Med., vol. 301, s. 5-8

(1979) (forhøyede serumnivåer av IFN-7" forbundet med autoimmunitet); Basham et al., J. Immunol., vol. 130, s. 1492-1494 (1983) (IFN-71 kan gi økt ekspresjon av MHC-genprodukt); Battazzo et al., Lancet, s. 1115-1119 (11/12/83) (unormal ekspresjon av MHC-genprodukt forbundet med visse former av autoimmunitet); Hooks et al., Ann. N.Y. Acad. Sei., vol. 301, s. 21-32 (1980) (høyere IFN-7-nivåer korrelert med styrken av sykdommen hos SLE-pasienter, og inhibering av interferons stimulerende virkning på histaminfrigivelse med anti-interferonsera); og Iwatani et al., J. Clin. Endocrin. and Metabol., vol. 63, s. 695-708 (1986) (monoklonalt anti-IFN-r-antistoff fjernet leukoagglutininstimulerte T-cellers evne til induksjon av HLA-DR-ekspresjon). Det antas at overskudd av IFN-71 forårsaker en uhensiktsmessig ekspresjon av MHC-genprodukter som i sin tur forårsaker autoimmunreaksjoner mot de vev hvis celler viser denne uhensiktsmessige ekspresjon av MHC-produktene og som fremviser autoantigener sammen med disse produkter.

Innen området klinisk parasitologi er det nylig blitt bemerket at nivåene av IFN-7og IL-2 er viktige faktorer i forløp og/eller helbredelse av protozoinfeksjonen leishmaniasis. Tilstedeværelse av passende nivåer av IFN-7'synes i særdeleshet å være nødvendig for aktivering av infiserte makrofager for å eliminere intracellulære amastigoter, Mauel og Behin, i Cohen et al., red., Immunology of Parasitic Infections (Blackwell, London, 1982). I musemodeller for sykdommen er det videre blitt vist at høye nivåer av IFN-7og lave nivåer av IL-4 er forbundet med helbredelse mens lave nivåer av IFN-7" og høye nivåer av IL-4 er forbundet med fort-gang av leishmaniasis, Heinzel et al., J. Exp. Med., vol.

169, s. 59-72 (1989).

I lys av det ovenstående ville det være fordelaktig

å ha tilgjengelig stoffer som kunne forskyve dominansen av én type immunsvar relativt til den andre, og som i særdeleshet kunne undertrykke eller øke syntesen av IFN-7" og/eller andre cytokiner i henhold til terapeutiske krav. Slike stoffer ville være svært nyttige ved behandling av sykdommer forbundet med upassende eller utilstrekkelig immunsvar som vevsforkast-else, leishmaniasis og andre parasittsykdommer, og MHC-assosierte immunsykdommer som reumatoid artritt, systemisk lupus erythematosus (SLE), myastenia gravis, insulinavhengig diabetes mellitus, thyroiditt og andre.

Sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse gjelder en fremgangsmåte for fremstilling av en cytokinsynteseinhiberende faktor (CSIF) fra pattedyr. Den omfatter nukleinsyrer som koder for polypeptider med CSIF-aktivitet, ekspresjonsvektor og transformert celle anvendt ved fremgangsmåten, samt et monoklonalt antistoff mot faktorer.

CSIF-antagonister avledes fortrinnsvis fra monoklonale antistoffer som er i stand til å blokkere den biologiske virkning av CSIF. Nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen defineres (1) ved sin homologi til eller sin evne til å danne påvisbare hybrider med de klonede, komplementære DNA (cDNA)-sekvenser som beskrives heri, og (2) ved funksjonelle analyser av CSIF-aktivitet utført på de polypeptider som kodes for av nukleinsyrene. I det følgende betyr begrepet "CSIF-aktivitet" i forbindelse med et protein eller et polypeptid at proteinet eller polypeptidet er i stand til å inhibere eller i det vesentlige redusere produksjonsnivået av minst ett av de følg-ende cytokiner i analysene beskrevet nedenfor: IFN-y, interleukin-2 (IL-2), lymfotoksin, interleukin-3 (IL-3) eller granulocytt-makrofagstimulerende faktor (GM-CSF).

En foretrukket utførelse av oppfinnelsen fremstilles en moden, human CSIF fra den åpne leseramme definert ved følg- ende aminosyresekvens: hvor de sedvanlige énbokstavssymboler for L-aminosyrer er oppstilt fra venstre mot høyre fra det N-terminale methionin. Mer foretrukket er den modne, humane CSIF definert ved følg-ende aminosyresekvens:

I disse sekvenser er mellomrommene til stede bare for leserens bekvemmelighet. Den sedvanlige énbokstavskode benyttes her for aminosyrene:

Oppfinnelsen er delvis basert på oppdagelsen av og kloningen av cDNA-er som kan uttrykke proteiner med CSIF-aktivitet. Følgelig har en rekke slike kloner betegnet pcD (SRot) -F115 (med et CSIF-gen fra mus), og pH5C og pH15C (hver med et humant CSIF-gen) blitt deponert ved American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, under akse sjonsnumrene 68027, 68191 og 68192.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser doseresponsforholdet for graden av inhibering av IFN-r-syntese i flere T-cellekloner fra mus behandlet med forskjellige mengder CSIF. Figur 2 er et diagram som viser de viktigste egen-skaper ved pattedyrekspresjonsvektorene pH5C og pHl5C. Figur 3 viser RBS-ATG-polylinkerområdet i plasmid

TAC-RBS-hCSIF.

Figur 4 viser nukleotidsekvensen for cDNA-innskuddet i pH15C.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Oppfinnelsen omfatter fremstilling av modne polypeptider eller proteiner fra de største åpne leserammer i cDNA-innskuddene i pH5C, pH15C, pcD(SRa)-F115 og cDNA-er som effektivt er homologe med disse, så vel som antagonister av disse. For utskilte proteiner koder en åpen leseramme vanligvis for et polypeptid som består av et modent eller utskilt produkt kovalent bundet i sin N-terminale ende til et signal-peptid. Signalpeptidet avkuttes forut for utskillelse av det modne, eller aktive, polypeptid. Kløvingssetet kan forutsies med stor grad av nøyaktighet fra empiriske regler, se f.eks. von Heijne, Nucleic Acids Research, vol. 14, s. 4683-4690

(1986), og den nøyaktige aminosyresammensetning av signalpeptidet synes ikke å være avgjørende for dets funksjon, se f.eks. Randall et al., Science, vol. 243, s. 1156-1159 (1989); Kaiser et al., Science, vol. 235, s. 312-317 (1987). Modne proteiner kan således lett uttrykkes fra vektorer som koder for signalpeptider som er temmelig forskjellige fra de som kodes for av den åpne leseramme definert ved cDNA-innskuddene i pH5C, pH15C og pcD(SRa)-F115.

I. Tilveiebringelse og ekspresjon av CSIF- cDNA

Begrepet "effektivt homolog" som benyttes her, betyr at nukleotidsekvensen kan påvises med en hybridiseringsprobe avledet fra en cDNA-klon ifølge oppfinnelsen. Den nøyaktige grad av homologi som er nødvendig for å påvise nukleinsyrer som koder for CSIF-aktivitet, avhenger av en rekke faktorer som omfatter (1) homologien av proben til ikke-CSIF-kodende sekvenser forbundet med målnukleinsyrene, (2) stringensen av hybridiseringsbetingelsene, (3) hvorvidt enkelttrådede eller dobbelttrådede prober benyttes, (4) hvorvidt RNA- eller DNA-prober benyttes, (5) hvilke forholdsregler som tas for å redusere ikke-spesifikk binding av proben, (6) hvilken fremgangsmåte som benyttes til merking av proben, (7) andelen av guanidin- og cytosinbaser i proben, (8) fordelingen av baser som ikke hybridiserer med hverandre i proben og mål-sekvensen, (9) størrelsen av proben, og lignende. Fortrinnsvis er en effektivt homolog nukleinsyresekvens minst nitti prosent (90%) homolog med cDNA ifølge oppfinnelsen. Mer detaljert er en effektivt homolog nukleinsyresekvens en hvis cDNA kan isoleres med en probe fremstilt fra et cDNA-innskudd fra pcD(SRa)-F115, pH5C, pHl5C eller en ekvivalent av disse, ved bruk av hybridiseringsfremgangsmåten beskrevet i eksemplene og med ikke mer enn noen få falske, positive signaler, f.eks. færre enn ett hundre. Det finnes en omfatt-ende litteratur som skaffer til veie råd for valg av betingelser for slik hybridisering, f.eks. Hames et al., Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1985); Gray et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 80, s. 5842-5846 (1983); Kafatos et al., Nucleic Acids Research, vol. 7, s. 1541-1552 (1979); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg. (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989) og Beltz et al., Meth. in Enzymol., vol. 100, s. 266-285 (1983), for å navngi noen få.

Begrepet homologi som benyttet her, er et mål på likhet mellom to nukleotid- (eller aminosyre-) sekvenser. Homologi uttrykkes som fraksjonen eller prosenten av like baser (eller aminosyrer) etter at to sekvenser (muligens av ulik lengde) er blitt oppstilt. Begrepet oppstilling ("alignment") benyttes som definert av Sankoff og Kru skal i kapittel 1 i Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison (Addison-Wesley, Reading, MA, 1983). Enkelt sagt oppstilles to sekvenser ved å maksimalisere antallet like baser (eller aminosyrer) mellom de to sekvensene ved å sette inn et så lite antall som mulig av "tomme" baser i de to sekvensene for å oppnå maksimal overlapping. For to gitte sekvenser er algoritmer tilgjengelige for beregning av deres homologi, f.eks. Needleham og Wunsch, J. Mol. Biol., vol. 48, s. 443-453 (1970); og Sankoff og Kruskal (henvist til ovenfor),

s. 23-29. Videre er kommersielle tjenester og software-pakker tilgjengelige for utførelse av slike sammenligninger, f.eks. Intelligenetics, Inc. (Palo Alto, CA); og University of Wisconsin Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin).

Restriksjonsendonukleasefragmenter av vektorene som inneholder cDNA-er ifølge oppfinnelsen, benyttes til fremstilling av prober (ved bruk av gjengse teknikker som nick-translasjon, se f.eks. Sambrook et al., referert til oven-

for) for screening ved lav hybridiseringsstringens av genomiske eller cDNA-biblioteker (også fremstilt ved gjengse teknikker) fra en celletype som formodes å fremstille CSIF. Gjengse fremgangsmåter for screening benyttes, se f.eks. Grunstein et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 72, s. 3961-3965 (1975); eller Benton et al., Science, vol. 196,

s. 180-183 (1977) eller Woo, Methods in Enzymology, vol. 68,

s. 389-396 (1979) . Alternativt kan biblioteker screenes med merkede oligonukleotidprober hvis sekvenser er bestemt ut fra nukleotidsekvensene til cDNA-innskuddene i pcD(SRa)-F115, pH5C og pH15C. Slike prober kan syntetiseres på kommersielt tilgjengelige DNA-syntesemaskiner, f.eks.

Applied Biosystems modell 38IA, ved bruk av gjengse teknikker, se f.eks. Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, (IRL Press, Washington D.C., 1984). I alle fall

bør proben være minst 18-30 baser lang. Mer fordelaktig er prober på minst 50-200 baser. Hybridiseringsprober kan også benyttes til screening av mulige kilder for CSIF-mRNA forut for fremstilling av biblioteket.

Et bredt utvalg av enkeltcelle- og multicellulære ekspresjonssystemer (dvs. kombinasjoner av verter og ekspresjonsvektorer) kan benyttes for fremstilling av proteinene ifølge oppfinnelsen. Mulige typer av vertceller omfatter, men er ikke begrenset til, bakterieceller, gjærceller, insektceller, pattedyrceller og lignende. Mange oversikter er tilgjengelige som skaffer til veie råd for valg og/eller modifiseringer av spesifikke ekspresjonssystemer, f.eks. for å angi noen få, de Boer og Shepard, "Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli", s. 205-247, i Kroon, red. Genes: Structure and Expression (John Wiley&Sons, New York, 1983), som gir en oversikt over en rekke E. coli ekspresjonssystemer; Kucherlapati et al., Critical Reviews in Biochemistry, vol. 16, hefte 4, s. 349-379 (1984), og Banerji et al., Genetic Engineering, vol. 5, s. 19-31 (1983) som gir en oversikt over fremgangsmåter for transfeksjon og transformasjon av pattedyrceller; Reznikoff of Gold, red., Maximizing Gene Expression (Butterworths, Boston, 1986), som gir en oversikt over utvalgte emner innen genekspresjon i E. coli, gjær og pattedyrceller; og Thilly, Mammalian Cell Technology (Butterworths, Boston, 1986) som gir en oversikt over ekspresjonssystemer i pattedyrceller. Videre er mange oversikter tilgjengelige som beskriver teknikker og betingelser for sammenkobling og/eller manipuler-ing av spesifikke cDNA-er og ekspresjonskontrollsekvenser for tillaging og/eller modifisering av ekspresjonsvektorer som er egnet til bruk i foreliggende oppfinnelse, f.eks. Sambrook et al. (henvist til ovenfor).

Et E. coli ekspresjonssystem er beskrevet av Riggs

i US patentskrift nr. 4 431 739 som inkorporeres heri ved referanse. En spesielt velegnet prokaryotisk promoter for høy ekspresjon i E. coli er tac-promoteren beskrevet av de Boer i US patentskrift nr. 4 551 433 som inkorporeres heri ved referanse. Ekspresjonsvektorer for sekresjon er også tilgjengelige for E. coli vertceller. Spesielt anvendelige er pIN-III-ompA-vektorene beskrevet av Ghrayeb et al., i EMBO J., vol. 3, s. 2437-2442 (1984), hvor det cDNA som skal transkriberes, sammenkobles med den del av OmpA-genet fra

E. coli som koder for signalpeptidet til ompA-proteinet, og som vil få det modne protein til å utskilles i det peri-plasmatiske rom i bakterien. US patentskrifter nr. 4 336 336 og 4 338 397 beskriver også ekspresjonsvektorer for sekresjon i prokaryoter. Disse referanser inkorporeres følgelig også heri ved referanse.

En rekke bakteriestammer er egnede verter for pro-karyotiske ekspresjonsvektorer innbefattende stammer av E. coli som W3110 (ATCC nr. 27325), JA221, C600, ED767, DH1, LE392, HB101, X1776 (ATCC nr. 31244), X2282, RR1 (ATCC nr. 31343) MRCI; stammer av Bacillus subtilis og andre enterobakterier som Salmonella typhimurium eller Serratia marcescens og forskjellige arter av Pseudomonas. Generelle fremgangsmåter for utledning av bakteriestammer, f.eks. E. coli K12 X1776,

som er anvendbare for ekspresjon av eukaryote proteiner, er beskrevet av Curtis III i US patentskrift nr. 4 190 495.

Dette patent inkorporeres følgelig heri ved referanse.

I tillegg til prokaryote og eukaryote mikroorganismer kan ekspresjonssystemer som omfatter celler avledet fra multicellulære organismer, også nyttes for produksjon av proteinene ifølge oppfinnelsen. Av spesiell interesse er mammalske ekspresjonssystemer da disses posttranslasjonelle prosesseringsmaskineri mer sannsynlig vil produsere biologisk aktive pattedyrproteiner. En rekke DNA-tumorvirus er blitt benyttet som vektorer i pattedyrverter. Spesielt viktige er de mange vektorer som omfatter SV40-replikasjons-, trans-kripsjons- og/eller translasjonskontrollsekvenser koplet til bakterielle replikasjonskontrollsekvenser, f.eks. pcD-vektorene utviklet av Okayama og Berg, og beskrevet i Mol. Cell. Biol., vol. 2, s. 161-170 (1982) og Mol. Cell. Biol., vol. 3, s. 280-289 (1983) og forbedret av Takebe et al.,

Mol. Cell. Biol., vol. 8, s. 466-472 (1988). Disse referanser inkorporeres følgelig heri ved referanse. Andre SV40-baserte, mammalske ekspresjonsvektorer omfatter de beskrevet av Kaufmann og Sharp i Mol. Cell. Biol., vol. 2, s. 1304-1319

(1982), og Clark et al., i US patentskrift nr. 4 675 285 som begge inkorporeres heri ved referanse. Apeceller er vanligvis de foretrukne verter for de ovenfor nevnte vektorer. Slike vektorer som inneholder SV40-ori-sekvensene og et intakt A-gen, kan replikeres autonomt i apeceller (slik at høyere og/eller mer stabile kopitall oppnås enn med ikke-autonomt replikerende plasmider). Videre kan vektorer som inneholder SV40-ori-sekvensene uten et intakt A-gen, replikeres autonomt til høye kopitall (men ikke stabilt) i C0S7-apeceller, beskrevet av Gluzman, Cell., vol. 23, s. 175-182 (1981) og tilgjengelige fra ATCC (aksesjonsnr. CRL 1651). De ovenfor beskrevne SV40-baserte vektorer er også i stand til å trans-formere andre pattedyrceller som L-celler fra mus, ved inte-grasjon i vertcellens DNA.

Multicellulære organismer kan også fungere som verter for produksjon av CSIF, f.eks. insektlarver, Maeda et al., Nature, vol. 315, s. 592-594 (1985) og Ann. Rev. Entomol.,

s. 351-372 (1989); og transgene dyr, Jaenisch, Science,

vol. 240, s. 1468-1474 (1988).

II. Analyser av CSIF in vitro

CSIF-aktivitet er evnen til å inhibere syntesen av minst ett cytokin blant IFN-71, lymfotoksin, IL-2, IL-3 og GM-CSF i en populasjon av T-hjelperceller som er indusert til syntese av ett eller flere av disse cytokiner ved å utsettes for syngene antigenpresenterende celler (APC) og antigen. Fortrinnsvis er APC behandlet slik at de ikke er i stand til replikasjon, men fortsatt innehar et fungerende antigen-prosesserende maskineri. Dette kan enkelt oppnås ved bestråling av APC, f.eks. med tilnærmet 1500-3000 R (gamma- eller røntgenstråling) før de blandes med T-cellene.

Alternativt kan cytokininhibering analyseres i primære eller helst sekundære, blandede lymfocyttreaksjoner ("mixed lymphocyte reactions", MLR), hvor syngene APC ikke er nødvendig. MLR er velkjente for fagfolk, se f.eks. Bradley, s. 162-166, i Mishell et al., red., Selected Methods in Cellular Immunology (Freeman, San Francisco, 1980); og Battisto et al., Meth. in Enzymol., vol. 150, s. 83-91

(1987) . Kort beskrevet blandes to populasjoner av allogene lymfeceller etter at én av dem er blitt behandlet for å forhindre proliferering, f.eks. ved bestråling. Fortrinnsvis fremstilles cellepopulasjonene ved en konsentrasjon på tilnærmet 2 x 10 celler/ml i supplementert medium, f.eks. RPMI 1640 med 10% føtalt kalveserum. For både kontroll- og analysekulturer blandes 0,5 ml av hver populasjon i analysen.

For en sekundær MLR restimuleres de gjenværende celler etter

7 dager i den primære MLR med nyfremstilte, bestrålte sti-mulatorceller. Prøven som antas å inneholde CSIF, kan tilsettes analysekulturene ved sammenblandingen, og både kontroll-og analysekulturer kan analyseres med hensyn til cytokinproduksjon 1 til 3 dager etter sammenblanding.

For tilveiebringelse av T-cellepopulasjoner og/eller APC-populasjoner for analyse av CSIF benyttes fremgangsmåter som er velkjente for fagfolk og som beskrives detaljert i DiSabato et al., red., Meth. in Enzymol., vol. 108 (1984).

APC i den foretrukne CSIF-analyse er monocytter fra perifert blod. Disse tilveiebringes ved bruk av gjengse fremgangsmåter, f.eks. som beskrevet av Boyum, Meth. in Enzymol., vol. 108,

s. 88-102 (1984); Mage, Meth. in Enzymol., vol. 108,

s. 118-132 (1984); Litvin et al., Meth. in Enzymol., vol. 108, s. 298-302 (1984); Stevenson, Meth. in Enzymol., vol. 108,

s. 242-249 (1989) og Romain et al., Meth. in Enzymol.,

vol. 108, s. 148-153 (1984), som alle inkorporeres heri ved referanse. I CSIF-analysene benyttes fortrinnsvis T-hjelperceller som er erholdt ved først å skille lymfocyttene fra det perifere blod og deretter å selektere, f.eks. ved "panning" eller "flow"-cytometri, hjelperceller med et kommersielt tilgjengelig anti-CD4-antistoff, f.eks. 0KT4 beskrevet i US patentskrift nr. 4 381 295 og tilgjengelig fra Ortho Pharmaceutical Corp. De nødvendige teknikker er detaljert beskrevet i Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest., vol. 21 (Suppl. 97), s. 77 (1968); Meth. in Enzymol., vol. 108 (henvist til ovenfor) og i Bram et al., Meth. in Enzymol., vol. 121, s. 737-748 (1986). Generelt beskrevet erholdes PBL fra friskt blod ved "Ficoll-Hypaque"-tetthetsgradientsentrifuger-ing.

En rekke antigener kan benyttes i analysen, f.eks.

albuskjell-hemocyanin ("Keyhole limpet hemocyanin", KLH) , Tf-globulin fra høns eller lignende. Mer foretrukket er å erstatte antigen i analysen med T-hjelperceller som er sti-mulert med monoklonalt anti-CD3-antistoff, f.eks. 0KT3 som er beskrevet i US patentskrift nr. 4 361 549.

Cytokinkonsentrasjonene i kontroll- og analyse-prøver måles ved gjengse, biologiske og/eller immunokjemiske analyser. Oppbygging av immunokjemiske analyser for spesifikke cytokiner er velkjent for fagfolk når det rensede cytokin er tilgjengelig, se f.eks. Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Tijssen, Practice

and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); og US patentskrift nr. 4 486 530 som eksempler på den om-fattende litteratur som behandler området. ELISA-utstyr for analyse av humant IL-2, humant IL-3 og human GM-CSF, er kommersielt tilgjengelig fra Genzyme Corp. (Boston, MA); og ELISA-utstyr for analyse av humant IFN-7er kommersielt tilgjengelig fra Endogen, Inc. (Boston, MA). Polyklonale antistoffer som er spesifikke for humant lymfotoksin, er tilgjengelige fra Genzyme Corp. og kan benyttes til radioimmuno-analyse av humant lymfotoksin, se f.eks. Chard, An Intro-duction to Radioimmunoassay and Related Techniques (Elsevier, Amsterdam, 1982).

Biologiske analyser av de ovenfor beskrevne cytokiner kan også benyttes for å fastsette CSIF-aktivitet. En biologisk analyse av humant lymfotoksin er beskrevet av Aggarwal, Meth. in Enzymol., vol. 116, s. 441-447 (1985), og Matthews et al., s. 221-225, i Clemens et al., red., Lymphokines and Interferons: A Practical Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1987). Humant IL-2 hhv. GM-CSF kan analyseres med de faktoravhengige cellelinjer CTLL-2 og KG-1 som er tilgjengelige fra ATCC under aksesjonsnumrene TIB 214 hhv. CCL 246. Humant IL-3 kan analyseres via dets evne til å stimulere dannelsen av et bredt spekter av hematopoetiske cellekolonier i mykagarkulturer, f.eks. som beskrevet av Metcalf, The Hemopoietic Colony Stimulating Factors (Elsevier, Amsterdam, 1984) . IFN-T kan kvantifiseres via antivirale analyser, se f.eks. Meager, s. 129-147, i Clemens et al.,

red. (henvist til ovenfor).

Cytokinproduksjon kan også bestemmes ved mRNA-analyse. Cytokin-mRNA kan måles ved cytoplasmatisk "dot"-hybridisering som beskrevet av White et al., J. Biol. Chem., vol. 257,

s. 8569-8572 (1982) og Gillespie et al., US patentskrift nr.

4 483 920. Disse referanser inkorporeres følgelig heri ved referanse. Andre tilnærminger omfatter "dot"-blotting ved renset RNA, se f.eks. kapittel 6 i Hames et al., red., Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1985). Generelt omfatter cytoplasmatisk "dot"-hybridisering forankring av mRNA fra en celle eller en vevsprøve til et fast støttemedium, f.eks. nitrocellulose, hybridisering av en DNA-probe til det forankrede mRNA og fjerning av probesekvenser som er uspesifikt bundet til det faste støttemedium eller som danner umake hybrider med mRNA slik at bare probesekvenser som danner i det vesentlige perfekte hybrider med mål-mRNA, forblir bundet. Mengden av gjenværende DNA-probe er et mål på antallet mål-mRNA for-ankret til det faste støttemedium. Mengden gjenværende DNA-probe bestemmes fra signalet avgitt fra dets merking. En rekke gjengse teknikker for merking av enkelt- og dobbelttrådede nukleinsyrefragmenter er tilgjengelige. Disse omfatter inkorporering av radioaktiv merking, se f.eks. Harper et al., Chromosoma, vol. 83, s. 431-439 (1984); direkte tilkobling av fluorescensmerking, se f.eks. Smith et al., Nucleic Acids Research, vol. 13, s. 2399-2412 (1985), og Connolly et al., Nucleic Acids Research, vol. 13, s. 4485-4502 (1985); og en rekke kjemiske modifikasjoner av nukleinsyre fragmentene som gjør at de kan påvises immunokjemisk eller ved andre affinitetsreaksjoner, se f.eks. Tchen et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 81, s. 3466-3470 (1984); Richardson et al.., Nucleic Acids Research, vol. 11, s. 6167-6184 (1983); Langer et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 78, s. 6633-6637 (1981); Brigati et al., Virology, vol. 126, s. 32-50 (1983); Broker et al., Nucleic Acids Research, vol. 5, s. 363-384 (1978) og Bayer et al., Methods of Biochemical Analysis, vol. 26, s. 1-45 (1980). mRNA fra T-celler forankres fortrinnsvis for hybridisering til proben ved følgende fremgangsmåte. Isolerte T-celler lyseres ved å suspenderes i en lysisbuffer (0,14 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl pH 8,6, 0,5% "Nonidet P-40" (en ikke-ionisk detergent, f.eks. fra Sigma) ved 4°C og en sluttkonsentrasjon på 1 x 10 celler/ml. Suspensjonen vortexes i 10 sekunder, og kjernene sentrifugeres ned (13.000 g, 2,5 min.). De resulterende cytoplasmatiske lys-ater overføres så til et sterilt 1,5 ml rør med 0,3 volumer 20 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M trinatriumcitrat ("standard saline citrate")) og 0,2 volumer 37% (vekt/vekt) formaldehyd. Blandingen inkuberes så ved 60°C i 15 minutter og lagres i aliquoter ved -70°C. For analyse titreres 15 ml av hver prøve ved tre gangers seriefortynninger med 15 x SSC i en 96-brønners flatbunnet mikrotiterplate (Falcon, Becton Dickinson, Oxnard, CA) i 0,1 ml. Hver fortynning settes under sug på et ark med "Nytran" (et støttemateriale av modifisert nylon tilgjengelig fra Schleicher og Schuell, Keene, NH; 0,45 mm porestørrelse) støttet av et filterpapir (Whatman 3mmChr, Whatman Inc., Clifton, NJ) ved hjelp av et 96-greps "Minifold"-apparat (Schleicher og Schuell). "Nytran"-papiret varmes så ved 80°C i 2 timer og behandles med en prehybridiseringsløsning som består av 50% formamid (BRL, Gaithersburg, MD 6 x SSC, 50 mg/ml E. coli-tRNA (Sigma), 0,2% (vekt/volum) av hhv. ficoll (molekylvekt = 400.000), poly-vinylpyrrolidon og bovint serumalbumin (BSA). Proben til-føres "Nytran"-støttemediet ved en konsentrasjon på tilnærmet 50 ng probe/ml prehybridiseringsløsning. Etter hybridiser-ingen vaskes støttemediet to ganger ved romtemperatur i 2 x SSC 15 minutter hver gang, deretter to ganger ved 60°C i 2 x SSC/0,5% SDS 30 minutter hver gang. Støttemediet på-legges så en film med en intensiveringsfolie og kvantiteres ved scanning med et laserdensitometer (f.eks. "Ultroscan XL", LKB Instruments Inc., Gaithersburg, MD). Hvis cytoplasmatisk "dot"-hybridisering ikke gir tilstrekkelig sensitivitet, kan RNA med fordel først ekstraheres fra PBL forut for blotting. RNA kan f.eks. ekstraheres ifølge guanidiniumthio-cyanatmetoden beskrevet av Chirgwin et al., i Biochemistry, vol. 18, s. 5294-5299 (1979).

I noen tilfeller må prøver som skal analyseres for CSIF-aktivitet, forbehandles for å fjerne tilstedeværende cytokiner som kan tenkes å interferere med analysen. IL-2

vil f.eks. øke produksjonen av IFN-T i noen celler. Følgelig må i noen tilfeller IL-2 fjernes fra prøven som skal analyseres avhengig av hva slags T-hjelperceller som benyttes i analysen. Dette kan lett oppnås ved å føre prøven over en standard anticytokin-affinitetskolonne.

III. Monoklonale antistoffer og antagonister spesifikke for CSIF

Antagonister ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis avledet fra antistoffer som er spesifikke for human CSIF. Mer foretrukket omfatter antagonistene ifølge oppfinnelsen fragmenter eller bindende sammensetninger som er spesifikke for human CSIF. Antistoffer er sammensatt av polypeptidkjeder sammenbundet med disulfidbroer. To hovedtyper av polypeptidkjeder kalt lette kjeder og tunge kjeder, utgjør alle de viktige strukturelle klasser (isotyper) av antistoffer. Både tunge kjeder og lette kjeder kan videre inndeles i under-regioner kalt variable regioner og konstante regioner. Tunge kjeder består av en enkelt variabel region og tre forskjellige konstante regioner, og lette kjeder består av en enkelt variabel region (forskjellig fra den i den tunge kjede) og en enkelt konstant region (forskjellig fra dem i den tunge kjede). De variable regioner i den tunge kjede og lette kjede er ansvarlige for antistoffets bindingsspesifisitet.

Som benyttet her, betyr uttrykket "tung kjede variabel region" et polypeptid (1) som er mellom 110 og 125 aminosyrer langt, og (2) hvis aminosyresekvens tilsvarer den til en tung kjede i et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen, begynnende fra den tunge kjedes N-terminale aminosyre. Tilsvarende betyr uttrykket "lett kjede variabel region" et polypeptid (1) som er mellom 95 og 115 aminosyrer langt, og

(2) hvis aminosyresekvens tilsvarer den til en lett kjede i

et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen, begynnende

fra den lette kjedes N-terminale aminosyre.

Som benyttet her, henviser uttrykket "monoklonalt antistoff" til homogene populasjoner av immunoglobuliner som er i stand til spesifikt å bindes til human CSIF.

Som benyttet her, betyr uttrykket "bindende sammensetning" en sammensetning som består av to polypeptidkjeder (1) som når operasjonelt forbundet, inntar en konformasjon med høy bindingsaffinitet for human CSIF, og (2) som er avledet fra et hybridom som produserer monoklonale antistoffer spesifikke for human CSIF. Uttrykket "operasjonelt forbundet" er ment å antyde at de to polypeptidkjeder kan plasseres relativt til hverandre for binding på flere måter, heriblant sammenbinding i et nativt antistoffragment som Fab eller Fv, eller ved genetisk innføring av cysteinholdige peptidlinkere ved carboxyendene. Normalt tilsvarer de to polypeptidkjeder den lette kjede variable region og tunge kjede variable region i et monoklonalt antistoff spesifikt for human CSIF. Antagonister ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis avledet fra monoklonale antistoffer spesifikke for human CSIF. Monoklonale antistoffer som er i stand til å blokkere eller nøytralisere CSIF, utvelges ved hjelp av deres evne til å inhibere CSIF-induserte effekter i gjengse CSIF-bioanalyser, f.eks. inhibering av IFN-7-syntese.

Hybridomer ifølge oppfinnelsen fremstilles ved velkjente teknikker. Vanligvis omfatter prosessen fusjon av en immortalisert cellelinje med en B-lymfocytt som produserer det ønskede antistoff. Alternativt er ikke-fusjonsteknikker for dannelse av en immortell, antistoffproduserende cellelinje mulige og vil ligge innenfor foreliggende oppfinnelses område, f.eks. viralt indusert transformasjon: Casali et al., "Human Monoclonals from Antigen-Specific Selection of B Lymphocytes and Transformation by EBV", Science, vol. 234, s. 476-479 (1986). Immortaliserende cellelinjer er vanligvis transformerte pattedyrceller, spesielt myelomceller med opphav i gnagere, storfe og menneske. Vanligvis benyttes rotte- eller musemyelomcellelinjer da disse er lett anvendelige og tilgjengelige. Teknikker for å oppnå passende lymfo- cytter fra pattedyr injisert med målantigenet, er velkjente. Generelt benyttes enten perifere blodlymfocytter (PBL) hvis celler av human opprinnelse er ønsket, eller miltceller eller lymfeknuteceller hvis pattedyrkilder foruten menneske er ønsket. Et vertpattedyr injiseres med gjentatte doser av det rensede antigen, og pattedyret tillates å danne de ønskede antistoffproduserende celler før disse høstes for fusjon med den immortaliserende cellelinje. Fusjonsteknikker er også velkjente for fagfolk og omfatter generelt blanding av cellene med et fuserende stoff, som f.eks. polyethylen-glycol. Hybridomer utvelges ved gjengse fremgangsmåter som HAT-seleksjon. Blant disse hybridomer utvelges de som ut-skiller det ønskede antistoff, dvs. spesifikt for human CSIF, ved analyse av dyrkningsmediet ved gjengse immunoanalyser som Western-blotting, ELISA, RIA, CSIF-nøytraliserende evne, og lignende. Antistoffer gjenvinnes fra mediet ved bruk av gjengse proteinrensingsteknikker, se f.eks. Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam,

1985). Mange referanser er tilgjengelige for veiledning ved bruk av de ovenfor nevnte teknikker, se f.eks. Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory,

New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); og tilsvarende. Hybridomer som produserer monoklonale antistoffer spesifikke for human CSIF, utsettes så for en ny screening med CSIF-analysene beskrevet ovenfor, for å velge slike som er i stand til å blokkere eller nøytralisere den biologiske aktivitet av CSIF.

Benyttelse og fremstilling av antistoffragmenter er også velkjent, f.eks. Fab-fragmenter: Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985) og Fv-fragmenter: Hochman et al., Biochemistry, vol. 12,

s. 1130-1135 (1973), Sharon et al., Biochemistry, vol. 15,

s. 1591-1594 (1976) og Ehrlich et al., US patentskrift nr.

4 355 023; og halve antistoffmolekyler: Audiotore-Hargreaves, US patentskrift nr. 4 470 925.

Antistoffer og antistoffragmenter karakteristiske for hybridomer ifølge oppfinnelsen, kan også fremstilles ved rekombinante metoder ved ekstraksjon av messenger-RNA, fremstilling av et cDNA-bibliotek og seleksjon av kloner som koder for segmenter av antistoffmolekylet, se f.eks. Wall et al., Nucleic Acids Research, vol. 5, s. 3113-3128 (1978); Zakut et al., Nucleic Acids Research, vol. 8, s. 3591-3601 (1980); Cabilly et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 81, s. 3273-3277

(1984); Boss et al., Nucleic Acids Research, vol. 12,

s. 3791-3806 (1984); Amster et al., Nucleic Acids Research, vol. 8, s. 2055-2065 (1980); Moore et al., US patentskrift nr. 4 642 334; Skerra et al., Science, vol. 240, s. 1038-1041

(1988) og Huse et al., Science, vol. 246, s. 1275-1281 (1989). Slike teknikker kan spesielt brukes til fremstilling av monoklonale antistoffer med opphav i flere arter i hvilke den bindende region fra én art kombineres med den ikke-bindende region av antistoffet fra en annen art for å redusere immuno-geniteten, se f.eks. Liu et al., Proe. Nati. Acad. Sei.,

vol. 84, s. 3439-3443 (1987).

IV. Rensing og farmasøytiske sammensetninger

Når polypeptider fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse uttrykkes i løselig form, f.eks. som et utskilt produkt fra transformerte gjærceller eller pattedyrceller, kan de renses i henhold til standardfremgangsmåter innen faget, heriblant trinn som ammoniumsulfatutfelling, ionebytter-kromatografi, gelfiltrering, elektroforese, affinitetskromato-grafi og/eller lignende, se f.eks. "Enzyme Purification and Related Techniques", Methods in Enzymology, 22:233-577 (1977) og Scopes, R., Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag, New York, 1982) som gir veiledning i slik resning. Likeledes kan polypeptider fremstilt ifølge oppfinnelsen som uttrykkes i uløselig form, f.eks. som aggregater, inklusjonslegemer eller lignende, renses ved standard fremgangsmåter innen faget, heriblant separasjon av inklusjonslegemene fra åpnede vertceller ved sentrifugering, oppløsning av inklusjonslegemene med kaotrope og reduserende stoffer, fortynning av den oppløste blanding og reduksjon av konsentrasjonen av kaotrope og reduserende stoffer slik at polypeptidet inntar en biologisk aktiv konformasjon. Disse senere fremgangsmåter er beskrevet i følgende referanser som inkorporeres heri ved referanse: Winkler et al., Biochemistry, 25: 4041-4045 (1986); Winkler et al., Biotechnology, 3: 992-998 (1985); Koths et al., US patentskrift 4 569 790 og europeiske patentsøknader nr. 86306917.5 og 86306353.3.

Som benyttet her, betyr uttrykket "effektiv mengde" en mengde som er tilstrekkelig til å lette et symptom på en autoimmun tilstand. For en gitt pasient vil den effektive mengde variere med faktorer som stadiet av den autoimmune tilstand som skal behandles, pasientens generelle helsetil-stand, tilførselsmetode, bieffektenes styrke og lignende. Generelt tilføres CSIF som en farmasøytisk sammensetning som består av en effektiv mengde CSIF og et farmasøytisk bærerstoff. Det farmasøytiske bærerstoff kan være ethvert forenlig, ikke-giftig stoff som kan anvendes for å tilføre en pasient sammensetningene ifølge oppfinnelsen. Generelt er sammensetninger som er anvendelige for parenteral tilførsel av slike medikamenter, velkjente, se f.eks. Remington's Pharmaceutical Science, 15. utgave (Mack Publishing Company, Easton, PA 1980). Alternativt kan sammensetninger tilføres pasientens kropp ved implanterbare eller injiserbare medikamentleverings-systemer, se f.eks. Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., vol. 24, s. 199-236 (1984); Lewis, red., Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals (Plenum Press, New York, 1981); US patentskrift nr. 3 773 919; US patentskrift nr. 3 270 960 og lignende.

CSIF kan renses fra kultursupernatanter fra pattedyrceller som er forbigående transfektert eller stabilt transformert med en ekspresjonsvektor som bærer et CSIF-gen. CSIF renses fortrinnsvis fra kultursupernatanter fra COS 7-celler forbigående transfektert med ekspresjonsvektoren pcD. Transfeksjon av COS 7-celler med pcD forløper som følger: Én dag forut for transfeksjonen sås tilnærmet 10^ COS 7-apeceller ut på individuelle 100 mm skåler i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DME) med 10% føtalt kalveserum og 2 mM glutamin. For utførelse av transfeksjonen avsuges mediet fra hver skål og erstattes med 4 ml DME med 50 mM Tris.HCl pH 7,4, 400 mg/ml DEAE-Dextran og 50 ug plasmid-DNA. Skålene inkuberes i

4 timer ved 37°C, hvoretter det DNA-holdige medium fjernes, og skålene vaskes to ganger med 5 ml serumfritt DME. DME tilsettes skålene som så inkuberés ytterligere 3 timer ved 37°C. Skålene vaskes én gang med DME, hvoretter DME med 4% føtalt kalveserum, 2 mM glutamin, penicillin (100 U/liter)

og streptomycin (100 ug/liter) ved standardkonsentrasjoner tilsettes. Cellene inkuberés så i 72 timer ved 37°C, hvoretter vekstmediet oppsamles for rensing av CSIF. Alternativt kan transfeksjon utføres ved elektroporering som beskrevet i eksemplene. Plasmid-DNA til transfeksjonene erholdes ved å dyrke pcD(SRa) med CSIF-cDNA-innskuddet i E. coli MC1061 beskrevet av Casadaban og Cohen, J. Mol. Biol., vol. 138,

s. 179-207 (1980), eller en tilsvarende organisme. Plasmid-DNA renses fra kulturene ved gjengse teknikker, se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual

(Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).

Når antagonistene ifølge oppfinnelsen er avledet

fra antistoffer, tilføres de vanligvis parenteralt, fortrinnsvis intravenøst. Da slike protein- eller peptid-antagonister kan være immunogene, tilføres de fortrinnsvis langsomt, enten ved konvensjonell, intravenøs tilførsel, eller fra et subkutant depot, f.eks. som beskrevet av Tomasi et al., US patentskrift nr. 4 732 863. For parenteral tilførsel er antistoffene og/eller fragmentene utformet som enhets-doser i injiserbar form sammen med et farmasøytisk bærerstoff som beskrevet ovenfor. Antistoffet er fortrinnvis utformet i renset tilstand i det vesentlig fritt for aggregater, andre proteiner, endotoksiner og tilsvarende, ved en konsentrasjon på tilnærmet 5 til 30 mg/ml, fortrinnsvis 10 til 20 mg/ml. Endotoksinnivået er helst mindre enn 2,5 EU/ml.

V. Genetisk bearbeidede, muterte CSIF

Så snart nukleinsyresekvens- og/eller aminosyre-sekvensinformasjon er tilgjengelig for et nativt protein, blir en rekke teknikker tilgjengelige for fremstilling av nær sagt enhver mutasjon i den native sekvens, se f.eks. Shortle, i Science, vol. 229, s. 1193-1201 (1985); Zoller og Smith, Methods in Enzymology, vol. 100, s. 468-500 (1983); Mark et al., US patentskrift 4 518 584; Wells et al., i Gene, vol. 34,

s. 315-323 (1985); Estell et al., Science, vol. 233,

s. 659-663 (1986); Mullenbach et al., J. Biol. Chem.,

vol. 261, s. 719-722 (1986), og Feretti et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 83, s. 597-603 (1986). Disse referanser inkorporeres følgelig heri ved referanse.

Mutanter av det naturlig forekommende polypeptid

kan være ønskelige i en rekke tilfeller. Uønskede bivirk-ninger kan f.eks. reduseres ved bruk av visse muterte proteiner, spesielt hvis bivirkningsaktiviteten er forbundet med en annen del av polypeptidet enn den som står for den ønskede aktivitet. I noen ekspresjonssystemer kan det native polypeptid være utsatt for degradering av proteaser. I slike tilfeller kan utvalgte substitusjoner og/eller delesjoner av aminosyrer som forandrer de utsatte sekvenser, i vesentlig grad forbedre utbyttene, se f.eks. britisk patentsøknad nr. 2173-804-A hvor Arg i posisjon 275 i vevsplasminogenaktiva-tor fra menneske er erstattet med Gly eller Glu. Muterte proteiner kan også gi økt utbytte i rensingsfremgangsmåter og/eller øke holdbarheten av proteiner ved at aminosyrer som er utsatt for oxydasjon, acylering, alkylering eller andre kjemiske modifikasjoner, er fjernet. Methionin vil f.eks. lett oxyderes slik at sulfoxyder dannes, i mange proteiner er dette forbundet med tap av biologisk aktivitet, se f.eks. Brot og Weissbach, Arch. Biochem. Biophys., vol. 223, s. 271

(1983). Methioniner kan ofte erstattes med mer stabile aminosyrer med lite eller intet tap av biologisk aktivitet,

se f.eks. australsk patentsøknad AU-A-52451/86. I bakterielle ekspresjonssystemer kan utbyttet noen ganger økes ved å fjerne eller utbytte cysteinrester som ikke er av betydning for konformasjonen, se f.eks. Mark et al., US patentskrift nr. 4 518 584.

Fortrinnsvis anvendes kassettmutagenese for dannelse av mutante proteiner. Et syntetisk gen med en rekke restriksjonsendonukleaseseter tilnærmet jevnt fordelt langs genet, konstrueres; disse restriksjonsendonukleaseseter er valgt slik at de forblir unike også når genet er satt inn i en passende vektor. De unike restriksjonsseter gjør det enkelt å kutte ut segmenter av genet og erstatte dem med syntetiske oligonukleotider (dvs. "kassetter") som koder for ønskede mutasjoner. For fastsettelse av antallet og fordelingen av unike restriksjonsseter må flere faktorer tas med i betraktning, heriblant (1) allerede eksisterende restriksjonsseter i vektoren som skal benyttes for ekspresjon, (2) hvorvidt artsspesifikk eller slektsspesifikk kodonbruk er ønsket, (3) antall forskjellige tilgjengelige restriksjonsendonukleaser som ikke kutter i vektoren (og deres multiplisiteter innen det syntetiske gen), og (4) hvor enkelt og pålitelig seg-mentene mellom de unike restriksjonsseter kan syntetiseres og/eller sekvenseres.

Teknikken beskrevet ovenfor, er hensiktsmessig for å oppnå konservative aminosyresubstitusjoner og lignende i den native proteinsekvens. "Konservative" som benyttet her,

betyr (i) at endringene er så konformasjonelt nøytrale som mulig, dvs. planlagt slik at de gir minimale forandringer i tertiærstrukturen til de mutante polypeptider sammenlignet med det native protein, og (ii) at endringene er så antigent nøytrale som mulig, dvs. planlagt slik at de gir minimale forandringer i de antigene determinanter i de muterte polypeptider sammenlignet med det native protein. Konformasjonell nøytralitet er ønskelig for å bibeholde biologisk aktivitet, og antigen nøytralitet er ønskelig for å unngå utløsning av immunogene responser hos pasienter eller dyr som behandles med forbindelsene ifølge oppfinnelsen. Selv om det er vanske-lig å velge alternativer som er konformasjonelt og antigent nøytrale med absolutt sikkerhet, eksisterer regler som kan veilede fagfolk til å lage forandringer som med stor sann-synlighet vil være konformasjonelt og antigent nøytrale, se f.eks. Anfinsen (referert til ovenfor); Berzofsky, Science, vol. 229, s. 932-940 (1985); og Bowie et al., Science, vol. 247, s. 1306-1310 (1990). Noen av de viktigste reglene er

(1) erstatning av hydrofobe rester vil mindre sannsynlig gi forandringer i antigenisitet da de sannsynligvis er plassert

i proteinets indre, se f.eks. Berzofsky (referert til ovenfor) og Bowie et al., (referert til ovenfor); (2) erstatning av fysiokjemisk like, dvs. synonyme, rester vil mindre sannsynlig gi konformasjonelle endringer fordi den erstattende aminosyre kan spille den samme strukturelle rolle som den erstattede aminosyre; og (3) endring av evolusjonsmessig

konserverte sekvenser vil sannsynligvis gi skadelige, kon-formas jonelle virkninger fordi evolusjonær konservering peker på at sekvensene kan være viktige for funksjonen. I tillegg til slike grunnregler for valg av mutasjoner er analyser tilgjengelige som kan bekrefte den biologiske aktivitet og konformasjon av de modifiserte molekyler. Biologiske analyser for polypeptidene ifølge oppfinnelsen er beskrevet mer detaljert ovenfor. Endringer i konformasjon kan analyseres ved minst to velkjente analysemetoder: mikrokomplement-fikseringsmetoden, se f.eks. Wasserman et al., J. Immunol., vol. 87, s. 290-295 (1961), eller Levine et al., Methods in Enzymology, vol. 11, s. 928-936 (1967) som anvendes meget

i evolusjonære studier av proteiners tertiærstruktur; og affinitet til sett av konformasjonsspesifikke, monoklonale antistoffer, se f.eks. Lewis et al., Biochemistry, vol. 22,

s. 948-954 (1983).

VI. Antistoffer mot humane CSIF- peptider

Oppfinnelsen omfatter fremstilling av peptider avledet fra human CSIF og immunogener som består av konjugater mellom bærerstoffer og peptidene. Begrepet immunogen som benyttes her, viser til et stoff som er i stand til å forårsake et immunsvar. Begrepet bærerstoff som benyttet her, viser til ethvert stoff som når det er kjemisk konjugert til et peptid fremstilt ifølge oppfinnelsen, tillater en vertsorganisme immunisert med det resulterende konjugat, å danne antistoffer som er spesifikke for det konjugerte peptid. Bærerstoffer omfatter røde blodceller, bakteriofager, proteiner og syntetiske partikler som agarosekuler. Bærerstoffer er fortrinnsvis proteiner som serumalbumin, gammaglobulin, hemocyanin fra albuskjell, thyroglobulin, ovalbumin, fibrinogen eller lignende.

Peptider fremstilt ifølge oppfinnelsen kan også syntetiseres ved gjengse teknikker, se f.eks. Stewart og Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. utgave (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 1984). Fortrinnsvis benyttes en kommersielt tilgjengelig peptidsyntesemaskin, f.eks. modell 430A fra Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA). Peptidene bygges opp ved fast-fasesyntese på et støttemedium av kryssbundet polystyren med start fra den carboxyterminale rest og trinnvis addering av aminosyrer til det fullstendige peptid er blitt dannet. Følgende referanser beskriver kjemien som benyttes ved syntese: Merrifield, J. Amer. Chem. Soc, vol. 85, s. 2149 (1963); Kent et al., s. 185, i Peptides 1984, Ragnarsson, red. (Almquist og Weksell, Stockholm, 1984);

Kent et al., s. 217 i Peptide Chemistry 84, Izumiya, red.

(Protein Research Foundation, B.H. Osaka, 1985); Merrifield, Science, vol. 232, s. 341-347 (1986); Kent, Ann. Rev. Biochem., vol. 57, s. 957-989 (1988) og referanser angitt i de siste to referanser.

I fast-fasesyntese er det uhyre viktig å unngå syntese av biprodukter som i første rekke er for tidlig ter-minerte, deleterte eller modifiserte peptider. De fleste sideraksjoner kan unngås eller minimaliseres ved å benytte rene, godt ikarakteriserte harpikser, rene aminosyrederivater, rene løsningsmidler og ved å velge passende koblings- og kløvingsmetoder og reaksjonsbetingelser, se f.eks. Barany og Merrifield, The Peptids, Cross og Meienhofer, red.,

vol. 2, s. 1-284 (Academic Press, New York, 1979). Det er viktig å overvåke koblingsreaksjonene for å fastslå at de

har gått til fullførelse slik at delesjonspeptider som mangler én eller flere rester, kan unngås. Den kvantitative ninhydrinreaksjon er anvendbar for dette formål: Sarin et al., Anal. Biochem., vol. 117, s. 147 (1981). Na~t-butyloxy-carbonyl (t-Boc)-aminosyrer benyttes med passende beskyttelsesgrupper på sidekjedene som er stabile under betingelsene for kjedeoppbygning, men labile overfor sterke syrer. Etter oppbygning av den beskyttede peptidkjede fjernes beskyttelses-gruppene, og peptidets ankringsbinding kløves ved benyttelse av først lave, så høye konsentrasjoner av vannfritt hydrogen-fluorid i nærvær av en thioesterfjerner: Tam et al., J. Amer. Chem. Soc, vol. 105, s. 6442 (1983). Egnede beskyttelsesgrupper for sidekjedene som kan benyttes, angis ved trebokstav-forkortelsen for aminosyre det gjelder etterfulgt av beskytt-elsesgruppen i parenteser: Asp(OBzl), Glu(OBzl), Ser(Bzl), Thr(Bzl), Lys(Cl-Z), Tyr(Br-Z), Arg(NGTos), Cys(4-MeBzl) og His(ImDNP). (Bzl - benzyl; Tos = toluensulfoxyl; DNP =

dinitrofenyl; Im = imidazol; Z = benzyloxycarbonyl). De gjenværende aminosyrer har ingen beskyttelsesgrupper for sidekjedene. I hver syklus utsettes den (t-Boc-N^)-beskyttede peptid-harpiks for 65% trifluoreddiksyre (fra Eastman Kodak)

(destillert før bruk) i diklormethan (DCM), (Mallenckrodt): først i 1 minutt, så i 13 minutter for å fjerne den N - beskyttende gruppe. Peptid-harpiksen vaskes i DCM og nøy-traliseres to ganger med 10% diisopropylethylamin (DIEA)

(Aldrich) i dimethylformamid (DMF) (Applied Biosystems) i 1 minutt hver gang. Nøytraliseringen følges av vask med DMF. Koblingen utføres med det symmetriske anhydrid av aminosyren

i DMF i 16 minutter. Det symmetriske anhydrid fremstilles på syntesemaskinen ved å løse 2 mmol aminosyre i 6 ml DCM

og tilsette 1 mmol dicyclohexylcarbodiimid (Aldrich) i 2 ml DCM. Etter 5 minutter overføres den aktiverte aminosyre til et separat kar, og DCM bortdampes ved gjennombobling av nitrogengass. DCM erstattes med DMF (totalt 6 ml) ved forskjellige stadier av gjennomboblingen. Etter den første kobling vaskes peptid-harpiksen med DCM, 10% DIEA i DCM, og så med DCM. For rekobling overføres først den samme aminosyre og så det aktiverende stoff, dicyclohexylcarbodiimid,

til reaksjonskaret. Etter aktivering in situ og kobling i 10 minutter tilsettes tilstrekkelig DMF til å gi en 50% DMF-DCM-blanding, og koblingen fortsettes i 15 minutter. Arginin tilkobles som en hydroxybenzotriazol (Aldrich)-ester

i DMF i 60 minutter og rekobles så på samme måte som de andre aminosyrer. Asparagin og glutamin tilkobles to> ganger som hydroxybenzotriazolestere i DMF, hver kobling i 40 minutter. For alle rester vaskes harpiksen etter den annen kobling, og en prøve tas automatisk ut for måling av gjenværende, ukoblet oc-amin ved en kvantitativ ninhydrinreaksjon, Sarin et al.

(referert til ovenfor).

Den generelle teknikk for å koble syntetiske peptider til et bærerstoff er beskrevet i flere referanser, se f.eks. Walter og Doolittle, "Antibodies Against Synthetic Peptides", i Setlow et al., red., Genetic Engineering, vol. 5, s. 61-91 (Plenum Press, N.Y., 1983); Green et al., Cell, vol. 28,

s. 477-487 (1982); Lerner et al., Proe. Nati. Acad. Sei.,

vol. 78, s. 3403-3407 (1981); Shimizu et al., US patent-

skrift nr. 4 474 754; og Ganfield et al., US patentskrift nr. 4 311 639. Disse referanser inkorporeres følgelig heri ved referanse. Teknikker som benyttes for å koble haptener til bærerstoffer, er også i det vesentlige de samme som tek-nikkene referert til ovenfor, se f.eks. kapittel 20 i Tijsseu's Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, New York, 1985). De fire mest vanlig anvendte fremgangsmåter for å koble et peptid til et bærerstoff, er (1) glutar-aldehyd for aminokobling, f.eks. som beskrevet av Kagan og Glick, i Jaffe og Behrman, red., Methods of Hormone Radioimmunoassay, s. 328-329 (Academid Press, N.Y., 1979), og Walter et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 77, s. 5197-5200

(1980); (2) vannløselige carbodiimider for kobling av carboxyl til amino, f.eks. som beskrevet av Hoare et al.,

J. Biol. Chem., vol. 242, s. 2447-2453 (1967); (3) bis-diazobenzidin (DBD) for kobling av tyrosin til tyrosin-sidekjede, f.eks. som beskrevet av Bassiri et al., s. 46-47, i Jaffe og Behrman, red. (referert til ovenfor), og Walter et al. (referert til ovenfor); og (4) maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) for kobling av cystein (eller andre sulfhydryler) til aminogrupper, f.eks. som beskrevet av Kitagawa et al., J. Biochem. (Tokyo), vol. 79, s. 233-239

(1976), og Lerner et al. (referert til ovenfor). En generell regel for valg av en passende metode for kobling av et gitt peptid til en proteinbærer kan formuleres som følger: gruppen som er involvert i koblingen, bør bare forekomme én gang i sekvensen, fortrinnsvis i en passende ende av seg-mentet. BDB bør f.eks. ikke benyttes hvis en tyrosinrest forekommer i hoveddelen av en sekvens som er valgt på grunn av sin potensielt antigene karakter. Tilsvarende utelukker sentralt plasserte lysiner glutaraldehydmetoden, og forekomst av asparaginsyre og glutaminsyre vil ofte utelukke carbo-diimidmetoden. På den annen side kan egnede rester plasseres i den ene eller annen ende av et gitt sekvenssegment som til-koblingsseter, uansett om de forekommer i den "native" proteinsekvens. I motsetning til amino- og carboxyendene vil interne segmenter skille seg vesentlig i den "utilkoblede ende" fra den samme sekvens som finnes i det native protein hvor polypeptidryggraden er kontinuerlig. Dette problem kan til en viss grad avhjelpes ved å acetylere a-aminogruppen og så tilkoble peptidet via carboxyenden. Koblingseffektiviteten til bærerproteinet kan lett måles ved å benytte et radioaktivt merket peptid fremstilt enten ved å benytte en radioaktiv aminosyre i ett trinn av syntesen eller ved å merke det ferdige peptid ved jodinering av en tyrosinrest. Nærværet av tyrosin i peptidet tillater også konstruksjon av en sensi-tiv radioimmunologisk analysemetode, om ønsket. For dette formål kan tyrosin innføres som en terminal rest hvis det ikke er en del av peptidsekvensen definert av det native polypeptid.

Foretrukne bærerstoffer er proteiner, og foretrukne proteinbærere omfatter bovint serumalbumin, myoglobulin, ovalbumin (OVA), hemocyanin fra albuskjell (KLH) og lignende. Peptider kan kobles til KLH via cysteiner ved hjelp av MBS som beskrevet av Liu et al., Biochemistry, vol. 18, s. 690-697 (1979). Peptidene løses i fosfatbufret saltvann (pH 7,5), 0,1 M natriumboratbuffer (pH 9,0) eller 1,0 M natriumacetat-buffer (pH 4,0). pH for oppløsning av peptidet er valgt for å gi optimal peptidløselighet. Innholdet av fritt cystein for løselige peptider bestemmes ved Ellmans metode, Ellman, Arch. Biochem. Biophys., vol. 82, s. 7077 (1959). For hvert peptid behandles 4 mg KLH i 0,25 ml 10 mM natriumfosfatbuffer (pH 7,2) med 0,7 mg MBS (oppløst i dimethylformamid) under røring i 30 minutter ved romtemperatur. MBS tilsettes dråpevis for å unngå for høye lokale konsentrasjoner av formamid da KLH er uløselig i >30% formamid. Reaksjonsprod-uktet, KLH-MBS, føres så gjennom "Sephadex G-25" ekvilibrert med 50 mM natriumfosfatbuffer (pH 6,0) for å fjerne fritt MBS. Utbyttet av KLH fra toppfraksjoner av kolonneeluatet (målt ved OD280) anslås til tilnærmet 80%. KLH-MBS får så reagere med 5 mg peptid oppløst i 1 ml av den valgte buffer. pH justeres til 7-7,5, og reaksjonen røres i 3 timer ved romtemperatur. Koblingseffektiviteten bestemmes med radioaktivt peptid ved dialyse av en prøve av konjugatet mot fosfatbufret saltvann, og varierte fra 8% til 60%. Så snart peptid-bærerstoffkonjugatet er tilgjengelig, fremstilles polyklonale eller monoklonale antistoffer ved gjengse teknikker, f.eks. som beskrevet av Campbell, Monoclonal Antibody Technology

(Elsevier, New York, 1984); Hurrell, red., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); Schreier et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); US patentskrift nr. 4 562 003 eller lignende. US patentskrift nr.

4 562 003 inkorporeres spesielt heri ved referanse.

Både polyklonale og monoklonale antistoffer kan screenes ved ELISA. Som for andre fast-faseimmunoanalyser bygger analysen på makromolekylers tendens til uspesifikk adsorpsjon til plast. Denne reaksjons irreversibilitet uten uten tap av immunologisk aktivitet tillater dannelse av antigen-antistoffkomplekser med enkel separasjon av slike komplekser fra ubundet materiale. For titrering av antipeptidserum adsorberes peptid konjugert til et bærerstoff som er forskjellig fra det som ble benyttet under immuniser-ingen, til brønnene i en 96-brønners mikrotiterplate. Det adsorberte antigen får så reagere i brønnene med fortynninger av antipeptidserum. Ubundet antistoff vaskes bort, og de gjenværende antigen-antistoffkomplekser får reagere med antistoff som er spesifikt for IgG fra det immuniserte dyr.

Dette andre antistoff er konjugert til et enzym, f.eks. alkalisk fosfatase. Et synlig farget reaksjonsprodukt dannet når enzymsubstratet tilsettes, viser hvilke brønner som har bundet antipeptid-antistoffer. Bruk av spektrofotometer-målinger tillater bedre kvantifisering av mengden bundet peptidspesifikt antistoff. Antisera med høy titer gir lineære

-3 -5 titreringskurver mellom fortynninger på 10 og 10

Eksempler

De følgende eksempler skal illustrere foreliggende oppfinnelse. Valg av vektorer og verter, så vel som konsentrasjonen av reagenser, temperaturer og verdier for andre variabler, tjener som eksempler på anvendelse av foreliggende oppfinnelse.

Eksempel I

Biologisk aktiviteter av muse- CSIF

Muse-CSIF-holdige supernatanter fra de mange T-cellekloner ble erholdt ved å inkubere T-celleklonene (5 x IO<6>celler/ml) i serumfritt medium (RPMI 1640 uten fenolrødt med 0,05 mM 2-mercaptoethanol og 20 mM HEPES) og concanavalin A (5 ug/ml) i 24 timer- Klonene omfattet cellelinjer, D9 beskrevet i US patentskrift 4 613 459, D10 (beskrevet nedenfor), MB2-1 beskrevet i Mosmann et al., I. Immunol., vol. 13 6,

s. 2348-2357 (1986), CDC25 og CDC35 beskrevet i Tony et al., J. Exp. Med., vol. 161, s. 223 (1985), og M411-2 og M411-6. T-cellesupernatantene ble analysert med hensyn til deres

evne til å undertrykke IFN-7-syntese i cellelinjen HDK-1 beskrevet i Cherwinski et al., J. Exp. Med., vol. 166,

s. 1229-1244 (1987). To gangers seriefortynninger av prøver fra hver T-celleklon ble fremstilt i 96-brønners flatbunnede mikrotiterplater i et volum på 0,05 ml. HDK-l-celler (5 x 10 celler pr. brønn) sammen med bestrålte (2500 R), syngene APC (miltceller, 5 x 10 5 celler pr. brønn) og antigent hemocyanin fra albuskjell, 150 ug/ml) ble tilsatt i et volum på 0,15 ml. 11B11 anti-IL-4-antistoff (10 ug/ml) beskrevet i Ohara et al.. Nature, vol. 315, s. 333-336 (1985), ble tilsatt prøver som kunne antas å inneholde IL-4. Etter inkubasjon ved 37°C i 24 timer ble supernatanter oppsamlet og lagret ved 4°C i et tidsrom på mindre enn en uke eller ved -80°C i lengre tidsrom. Nivåer av IFN-T ble analysert ved to-seters " sandwich"-ELISA med et monoklonalt anti-muse-IFN-if-antistoff fra rotte, XMG1.2, og affinitetsrenset anti-muse-IFN-Tf-antistoff fra kanin. Figur 1 viser graden av inhibering av IFN-7-syntese som prosent av kontrollnivåer.

CSIF fremstilt fra D10-celler, ble delvis renset og tilsatt to forskjellige T-cellekloner for å undersøke graden av cytokinsynteseinhibering som en funksjon av CSIF-konsentrasjon. Den delvis rensede CSIF ble fremstilt som følger. 1-2,5 liters porsjoner av concanavalin A-indusert D10-super-natant ble konsentrert tilnærmet 10 ganger ved bruk av "Amicon YM-5"-membraner (Amicon Corp., Danvers, MA), sendt gjennom en 5 ml mannosekonjugert agarosekolonne (E-Y Laboratories, San Mateo, CA) og så konsentrert ytterligere 3 til 5 ganger slik at en total oppkonsentrering på 30-50 ganger ble oppnådd. Dette materiale ble så videre renset ved to trinn med høyytelsesvæskekromatografi: først over en hydroxyl-apatitt-basert kolonne ("Bio-Gel HPHT", Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) og så over en gelfiltreringskolonne (TSK-G 3000 SW, 60 cm lengde, LKB Instruments, Gaithersburg, MD).

Én slik porsjon med delvis renset CSIF ble oppbevart i aliquoter ved -80°C og benyttet som en standard for CSIF-aktivitet. Ved den opprinnelige analyse ga dette preparat tilnærmet 50% inhibering av IFN-Tf-produksjon ved en fortynning på 1/200 i et analysevolum på 0,2 ml, en standardenhet ble så definert ved å tilskrive dette standard CSIF-preparat en verdi på 1000 U/ml. I hver analyse beskrevet nedenfor,

ble CSIF-aktiviteten i ukjente prøver kvantitert ved å sammenligne nivåene til IFN-7-synteseinhibering av den ukjente med det til standarden. T-celleklonene som ble analysert med hensyn til cytokinsynteseinhibering, var HDK-1 (beskrevet ovenfor) og MD13-10 beskrevet i Cell. Immunol., vol. 97,

s. 357 (1986). For analyse av IL-3- og GM-CSF-nivåer ble den delvis rensede CSIF videre behandlet ved å la den passere over anti-IL-3- og anti-GM-CSF-affinitetskolonner. Antistoffer i 0,1 M NaCl, 0,1 M HEPES og 0,08 M CaCl2ble koblet til "Affi-Gel 10" (Bio-Rad) ved 4°C med forsiktig røring i 4 timer. Hver søyle på 1-2 ml inneholdt tilnærmet 10 til

20 mg koblet antistoff.

Som vist i tabellen nedenfor, ble IFN-7-produksjon inhibert i begge kloner. Syntesen av de andre cytokiner, IL-2, lymfotoksin, IL-3 og GM-CSF ble inhibert i mindre grad eller ikke i det hele tatt i MD13-10-celler.

Eksempel II

Fremstilling av cDNA- bibliotek fra DIO- celler og isolering

av klon pcD( SRa)- F115

Et cDNA-bibliotek ble konstruert i vektoren pcD(SRoc) fra mRNA ekstrahert fra D10-celler beskrevet i Kaye et al., J. Exp. Med., vol. 158, s. 836 (1983), i samsvar med fremgangsmåten til Okayama og Berg, Mol. Cell. Biol. 2: 161-170

(1982) og 3: 280-289 (1983), også beskrevet i US patentskrift nr. 4 695 542, som inkorporeres heri ved referanse. pcD(SRa)-vektorene som bar cDNA-innskudd, ble amplifisert i E. coli. Plasmid-DNA ble ekstrahert fra sammenslåtte, til-feldig plukkede kloner og benyttet for transfeksjon av COS 7-apeceller som beskrevet nedenfor. Supernatantene fra COS 7-kulturene ble så analysert for CSIF-aktivitet. COS-celler ble transfektert som følger: En dag forut for transfeksjonen ble tilnærmet 1,5 x 10 COS 7-apeceller utsådd i individuelle 100 mm skåler i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DME) med 5% føtalt kalveserum (FCS) og 2 mM glutamin. For utførelse av transfeksjonen ble COS 7-celler fjernet fra skålene ved inkubasjon med trypsin, vasket to ganger med serumfritt DME og suspendert i serumfritt DME med 10 7 celler/ml. En aliquot på 0,75 ml ble blandet med 20 ug DNA og overført til en steril 0,4 cm elektroporeringskyvette. Etter 10 minutter ble cellene pulset ved 200 volt, 960 uF i en "BioRad Gene Pulser"-enhet. Etter ytterligere 10 minutter ble cellene fjernet fra kyvetten og tilsatt 20 ml DME med 5% FCS, 2 mM glutamin, penicillin, streptomycin og gentamycin. Blandingen ble fordelt på fire 100 mm vevskulturskåler. Etter 12-24 timer ved 37°C i 5% C02ble mediet erstattet med et tilsvarende medium med kun 1% FCS og inkubasjonen fortsatt i ytterligere 72 timer ved 37°C, 5% C02, hvoretter mediet ble oppsamlet og analysert med hensyn på CSIF-aktivitet. Deretter ble sekvensen av den største åpne leseramme fra cDNA-innskuddet i pcD(SRa)-F115 bestemt som følger: og aminosyresekvensen til det modne CSIF-protein fra mus bestemt ved hjelp av Heijne-algoritmen, er som følger:

Eksempel III

Screening av cDNA- biblioteker for human CSIF med prober avledet fra pcD( SRa)- F115; isolering av pH5C og pH! 5C

Et cDNA-bibliotek fremstilt i pcD(SRa) fra mRNA ekstrahert fra en human T-celleklon, ble screenet med en samling av 70-mere oligonukleotider hvis sekvenser var komplementære til de kodende og ikke-kodende tråder i frag-mentet av muse-CSIF-genet som koder for moden CSIF. Gjengse hybridiseringsprotokoller ble benyttet, dvs. bakterie-kolonier dyrket i 150 mm petriskåler ble overført til "GeneScreen"-membraner behandlet med de radioaktivt merkede oligonukleotidprober, ble vasket og deretter pålagt røntgen-film. Probene ble hybridisert under betingelser med lav stringens, probenes lengde tatt i betraktning: prehybridis-eringen besto av inkubasjon av målnukleinsyrene i 5X SET (20X SET er 3 M NaCl +0,4 Tris-Cl (pH 7,8) + 20 mM EDTA) ved 60°C etterfulgt av hybridisering under de samme betingelser og vasking med 5X SET ved 50°C. To kloner som inneholdt plasmidene pH5C og pHl5C, ble identifisert. Begge plasmider uttrykte proteiner i COS 7-celler som var i stand til å inhibere IFN-7-syntese i PHA-stimulerte, humane PBL. cDNA-innskuddet i pH15C er vist i figur 4, og nukleotidsekvensen av dens største åpne leseramme er gitt nedenfor:

Eksempel IV

Monoklonale antistoffer spesifikke for CSIF

En Lewis-hannrotte immuniseres med delvis rensede preparater av human CSIF uttrykt i C0S7-celler. Rotten immuniseres først med tilnærmet 50 ug human CSIF i Freunds komplette adjuvans og "boostes" to ganger med den samme mengde stoff i Freunds ukomplette adjuvans. Analyseblod-prøver tas. Dyret gis en endelig "boost" på 25 ug i fosfatbufret saltvann, og fire dager senere erholdes milten for fusjon.

Tilnærmet 3 x 10 Q rottesplenocytter fuseres med

et like antall P3X63-AG8.653 musemyelomceller (tilgjengelige fra ATCC under aksesjonsnr. CRL 1580). 3840 mikrotiter-platebrønner utsås med 5,7 x 10 4 parentale myelomceller pr. brønn. Gjengse protokoller for fusjon og påfølgende dyrking av hybrider følges, f.eks. som beskrevet av Chretien et al., J. Immunol. Meth., vol. 117, s. 67-81 (1989). 12 dager etter fusjonen høstes supernatanter og screenes ved indirekte ELISA på PVC-plater dekket med human CSIF fremstilt i C0S7-celler. Hybridom JES3-19F1 ble identifisert på denne måte og deponert hos American Type Culture Collection.

Hybridomer som produserer blokkerende antistoffer, utvelges blant de opprinnelig screenede hybridomer ved deres evne til å produsere antistoffer som motvirker den CSIF-induserte IFN-7-synteseinhibering i PHA-stimulerte, humane

PBL.

Eksempel V

Ekspresjon av human CSIF i en bakterievert

Et syntetisk, humant CSIF-gen settes sammen av et stort antall kjemisk syntetiserte, dobbelttrådede DNA-fragmenter for å danne en ekspresjonsvektor betegnet TAC-RBS-hCSIF. Kloning og ekspresjon utføres i et standard bakteri-elt system, f.eks. E. coli K-12 stamme JM101, JM103 eller lignende, beskrevet av Viera og Messing, i Gene, vol. 19,

s. 259-268 (1982). Kuttinger med restriksjonsendonuklease og ligasereaksjoner utføres ved bruk av gjengse fremgangsmåter, se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).

Alkalimetoden (Maniatis et al., referert til ovenfor) anvendes for plasmidfremstilling i liten skala. For fremstillinger i stor skala anvendes en endret alkalimetode hvor et likt volum isopropanol anvendes for å utfelle nukleinsyrer fra det klarede lysat. Felling med kaldt 2,5 M ammoniumacetat anvendes for å fjerne RNA forut for likevekts-tetthetssentrifugering i cesiumklorid og påvisning med ethidiumbromid.

Til filterhybridiseringer anvendes "Whatman 540" sirkulære filtre til løfting av kolonier som deretter lyseres og fikseres ved påfølgende behandlinger med 0,5 MNaOH,

1,5 M NaCl; 1 M Tris-HCl pH 8,0, 1,5 M NaCl (2 minutter hver); og oppvarming ved 80°C (30 minutter). Hybridiser-inger foregår i 6xSSPE, 20% formamid, 0,1% natriumdodecyl-sulfat (SDS), 100 mg/ml E. coli tRNA, 100 mg/ml Coomassie brilliantblått G-250 (Bio-Rad) ved 42°C i 6 timer med<32>P-merkede (kinaserte), syntetiske DNA-er. (20xSSPE fremstilles ved å løse 174 g NaCl, 7,4 g EDTA og 27,6 g NaH2P04.9H20 i 800 ml vann; pH justeres til 7,4 medNaOH, volumet justeres til 1 liter, og løsningen steriliseres ved autoklavering). Filtrene vaskes to ganger (15 minutter, romtemperatur) med lxSSPE, 0,1% SDS. Etter autoradiografi (Fuji RX-film) lokaliseres positive kolonier ved å oppstille de gjenoppdyrkede kolonier med de blåfargede kolonier på filtrene. DNA sekvenseres ved dideoxymetoden, Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei., vol. 74, s. 5463 (1977). Templater for dideoxyreaksjonene er enten enkelttrådede DNA-er fra relevante områder reklonet i Ml3mp-vektorer, se f.eks. Messing et al., Nucleic Acids Res., vol. 9, s. 309 (1981), eller dobbelttrådet DNA fremstilt ved minialkalimetoden og denaturert med 0,2 M NaOH (5 minutter, romtemperatur) og ut-felt fra 0,2 M NaOH, 1,43 M ammoniumacetat ved tilsetning av 2 volumer ethanol. DNA syntetiseres ved fosforamiditt-kjemi under anvendelse av Applied Biosystems 380A syntesemaskiner. Syntese, avbeskyttelse, kløving og rensing

(7 M urea PAGE, eluering, DEAE-cellulosekromatografi) ut-føres som beskrevet i manualen til 380A syntesemaskinen.

Komplementære tråder av syntetiske DNA-er som skal klones (400 ng hver), blandes og fosforyleres med poly-nukleotidkinase i et reaksjonsvolum på 50 ul. Dette DNA ligeres med 1 mg vektor-DNA kuttet med passende restrik-sjonsenzymer, og ligeringene foregår i et volum på 50 ul

ved romtemperatur i 4 til 12 timer. Betingelser for fosfor-ylering, restriksjonsenzymkuttinger, polymerasereaksjoner og ligering er blitt beskrevet (Maniatis et al., referert til ovenfor). Kolonier analyseres for lacZ+ (når ønskelig) ved utsåing på L-agar med ampicillin, isopropyl-l-thio-

beta-D-galactosid (IPTG) (0,4 mM) og 5-brom-4-klor-3-indolyl-beta-D-galactopyranosid (x-gal) (40 mg/ml).

TAC-RBS-vektoren fremstilles ved igjenfylling med DNA-polymerase av det eneste BamHI-sete i det tacP-bærende plasmid pDR540 (Pharmacia). Dette ligeres, så til ufosfor-ylerte, syntetiske oligonukleotider (Pharmacia) som danner et dobbelttrådet fragment som koder for et konsensus ribosombindende sete (RBS, GTAAGGAGGTTTAAC). Etter ligering fosforyleres blandingen og religeres med Sstl-linkeren ATGAGCTCAT. Dette kompleks ble så kuttet med Sstl og EcoRI, og det 173 bp store fragment isolert ved polyacrylamid-gelelektroforese (PAGE) og klonet inn i pUC19 (Pharmacia) kuttet med EcoRI og Sstl (som beskrevet nedenfor). Sekvensen av RBS-ATG-polylinkerområdene i det endelige konstrikt (kalt TAC-RBS) er vist i figur 3.

Det syntetiske CSIF-gen settes inn i et pUC19-plasmid i åtte trinn. I hvert trinn kan innskudd fri for delesjoner og/eller insersjoner påvises etter kloning ved å bibeholde lacZ(a)-genet i pUC19 i ramme med ATG-startkodonet innsatt i trinn 1. Kloner med delesjoner og/eller insersjoner kan filtreres ut ved å søke etter blå kolonier på L-ampicillinskåler med x-gal og IPTG. Alternativt kan sekvenser i innskuddene i hvert trinn lett bekreftes ved å benytte en universell sekvenseringsprimer på plasmid-DNA-preparater i liten skala, f.eks. tilgjengelig fra Boehringer Mannheim.

I trinn 1 kuttes TAC-RBS-vektoren med Sstl, behandles med T4 DNA-polymerase (hvis 3'-exbnukleaseaktivitet fjerner de 3<1->overhengende tråder i Sstl-kuttene slik at buttendede fragmenter dannes), og behandles med EcoRI etter inaktivering av T4 DNA-polymerase slik at et fragment på

173 bp dannes som inneholder TAC-RBS-området og har en butt ende ved ATG-startkodonet og EcoRI-kuttet i den motsatte ende. Endelig isoleres det 173 bp store TAC-RBS-fragment.

I trinn 2 blandes det isolerte TAC-RBS-fragment

fra trinn 1 med plasmid pUC19 kuttet med EcoRI og Kpnl og det syntetiske fragment IA/B som, som vist nedenfor, har en butt ende i sin oppstrømsende og en klebrig ende som tilsvarer et Kpnl-kutt i sin nedstrømsende. Denne Kpnl-ende

ligger nær ved og nedstrøms for et BstEII-sete. Fragmentene ligeres slik at pUC19 fra trinn 2 dannes.

I trinn 3 blandes de syntetiske fragmenter 2A/B og 3A/B (vist nedenfor) med pUCl9 fra trinn 2 kuttet med BstEII og Smal (etter amplifisering og rensing) og ligeres slik at pUC19 fra trinn 3 dannes. Bemerk at nedstrømsenden til fragment 3A/B inneholder ekstra baser som danner den butte Smal-ende. Disse ekstra baser kløves i trinn 4. Videre har fragmentene 2A/B og 3A/B komplementære, enkelttrådede ender på 9 rester som herder ved blanding slik at bare det oppstrøms BstEII-kutt i 2A/B og den nedstrøms butte ende i 3A/B kan ligere til pUC19.

I trinn 4 renses pUC19 fra trinn 3 kuttet med

AfIII og Xbal (etter amplifisering og rensing), blandes med det syntetiske fragment 4A/B (vist nedenfor) og ligeres slik at pUC19 fra trinn 4 dannes.

I trinn 5 blandes pUC19 fra trinn 4 kuttet med

Xbal og Sali (etter amplifisering og rensing) med det syntetiske fragment 5A/B (vist nedenfor) og ligeres slik at pUC19 fra trinn 5 dannes. Bemerk at den klebrige Sall-ende i fragment 5A/B fjernes ved kutting med Hpal i trinn 6.

I trinn 6 blandes pUC19 fra trinn 5 kuttet med

Hpal og Pstl (etter amplifisering og rensing) med det syntetiske fragment 6A/B (vist nedenfor) og ligeres slik at pUC19 fra trinn 6 dannes.

I trinn 7 blandes pUC19 fra trinn 6 kuttet med Clal og SphI (etter amplifisering og rensing) med det syntetiske fragment 7A/B (vist nedenfor) og ligeres slik at pUC19 fra trinn 7 dannes.

I trinn 8 blandes pUC19 fra trinn 7 kuttet med Mlul og Hindlll (etter amplifisering og rensing) med de syntetiske fragmenter 8A/B og 9A/B og ligeres slik at det endelige konstrikt dannes. Det endelige konstrikt settes inn i E. coli K-12 stamme JM101, f.eks. tilgjengelig fra ATCC

under aksesjonsnr. 33876, ved gjengse teknikker. Etter dyrking ekstraheres protein fra JMlOl-cellene, og fortynninger av ekstraktene analyseres for biologisk aktivitet.

(Små typer indikerer at en base er forskjellig fra den i den native sekvens i denne posisjon).

Eksempel VI

Antistoffer spesifikke for CENKSKAVE- peptidet

50 mg ovalbumin (OVA) og 50 mg myoglobulin (MYO)

(f.eks. tilgjengelig fra Sigma) løses hver i 10 ml 0,1 M natriumbicarbonat og får reagere med 1 ml 0,12 jodacetamid-løsning (88 mg jodacetamid oppløst i 4 ml 0,1 M natriumbicarbonat) i 1 time ved romtemperatur i et 15 ml "Falcon"-rør (Falcon Plastics, Oxnard, CA) eller lignende. Hver reaksjonsblanding dialyseres over natten mot 4 liter 0,1 M natriumbicarbonat ved 4RC. 10 mg CENKSKAVE oppløses i 2 ml 0,1 M DTT (dithiothreitol)-løsning (med 50 mM Tris og 2,5 mM EDTA ved pH 8) i et 4 ml rør, inkuberés ved 37°C over natten, settes så på en GF05 gelfiltreringskolonne (1,5 x 26,5 cm)

(LKB, Bromma, Sverige) og elueres med en peptideluerings-buffer bestående av 0,015 M eddiksyre og 0,005 M beta-mercaptoethanol. Tre fraksjoner på tilnærmet 3,5 ml hver som inneholdt det reduserte peptid, identifieres ved optisk tetthet ved 206 nm, oppsamles, slås sammen, fryses i tørris og frysetørkes over natten. I mellomtiden gjenvinnes OVA og MYO fra dialysen og klargjøres ved filtrering gjennom 0,45 um filtere. OVA og MYO aktiveres ved å blande hver med 3 80 ul

N-hydroxysuccinimidester av jodeddiksyre (NHIA) (beskrevet

av Rector et al., i J. Immunol. Meth., vol. 24, s. 321

(1978)) oppløst i tetrahydrofuran (THF) (5 mg/ml), røre i 30 minutter ved romtemperatur og dialysere over natten mot 4 liter PBS (1,8 g NaH2P04-H20, 7,2 g Na2HP04•H20; og 34 g NaCl i 4 liter H20). Separat resuspenderes det frysetørkede peptid i 5 ml boratreduksjonsbuffer (2 g Na2B407•10H20, 17,4 g NaCl og 336 mg EDTA-Na2i 1 liter H20 med pH justert til 8,5 med konsentrert HC1, deoxygenert under nitrogen i 15 minutter, hvoretter 178 mg ascorbat tilsettes). Det dialyserte jod-acetylerte OVA og MYO gjenvinnes, blandes hver for seg med like volumer (fortrinnsvis 2 ml) boratreduksjonsbuffer med peptidet og inkuberés over natten ved romtemperatur. Konju-gatene som dannes ved dette, analyseres ved SDS-PAGE (12,5% gel). Den konjugatholdige løsning fortynnes med PBS til 1 mg/ml, sterilfiltreres, aliquoteres i volumer som er hendige for immunisering (f.eks. 500 mikroliter) og/eller lagres ved 4°C. Polyklonale antisera mot MYO-konjugatet fremstilles både i rotter og kaniner (New Zealand White). Immuniserings-timeplanen for kaniner er som følger: Først (uke 0) ekstraheres en 10 ml serumprøve som kontroll. Én uke senere (uke 1) blandes 0,5 ml peptid-bærerstoffkonjugat med 0,5 ml Freunds komplette adjuvans og injiseres i.p. Tre uker senere (uke 4) gis en "booster" som består av 0,5 ml peptid-bærerstof f konjugat blandet med 0,5 ml Freunds ukomplette adjuvans. Den følgende uke (uke 5) gis ytterligere en "booster" som igjen består av 0,5 ml peptid-bærerstoffkonjugat blandet med 0,5 ml Freunds ukomplette adjuvans, etterfulgt av nok en identisk "booster" den neste uke (uke 6). I uke 7 tappes 20 ml serum fra dyret. Etter at cellefraksjonen er fjernet, analyseres serumet med hensyn på positivt anti-CENKSKAVE-titer ved ELISA. Rotteimmuniseringen forløp på tilsvarende måte, bortsett fra at den første injeksjon består av 0,15 ml PBS og 0,1 ml peptid-bærerstoffkonjugat blandet med 0,75 ml Freunds komplette adjuvans, "boostere" består av 0,15 ml PBS og 0,1 ml peptid-bærerstoffkonjugat blandet med 0,75 ml Freunds ukomplette adjuvans, og bare 2-3 ml serum tappes fra rotten. Igjen påvises en positiv anti-CENKSKAVE-reaksjon ved ELISA.

Beskrivelsene av disse utførelsesformer av oppfinnelsen er blitt gitt i den hensikt å illustrere og beskrive, og følgelig er mange modifikasjoner og variasjoner i lys av den ovenfor beskrevne lære. Utførelsesformene ble valgt og beskrevet for best å forklare prinsippene for oppfinnelsen og således sette andre fagfolk i stand til best mulig å utnytte oppfinnelsen i forskjellige utførelsesformer og med forskjellige modifikasjoner som er best mulig egnet for den på-tenkte bruk.

Søkerne har separat deponert E. coli MC1061 med pcD(SRa)-F115, pH5C og pH15C hos American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC), under hhv. aksesjonsnr. 68027, 68191 og 68192. Disse deponeringer ble gjort under de betingelser som er gitt under ATCCs avtale for deponering av kulturer i patentøyemed, som sikrer at deponeringene vil bli gjort tilgjengelige for US Commissioner of Patents and Trademarks ifølge 35 USC 122 og 37 CFR 1.14, og vil bli gjort tilgjengelige for publikum ved innvilgelse av et amerikansk patent, som krever at deponeringene blir fore-tatt. Tilgjengeligheten av de deponerte stammer skal ikke oppfattes som tillatelse til å utøve oppfinnelsen i strid med de rettigheter som gis under enhver regjerings autoritet i samsvar med dens patentlover.

Deponeringene er blitt modifisert for å samsvare

med kravene i Budapestavtalen om deponering av mikroorganismer .

Claims (13)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid med cytokinsynteseinhiberingsfaktoraktivitet med aminosyresekvensen :

eller aminosyresekvensen:

karakterisert vedat en vertscelle, som er transformert med en vektor som inneholder og som kan uttrykke DNA-sekvensen som koder for polypeptidet, dyrkes og polypeptidet isoleres fra dyrkningsmediet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat vertscellen er en pattedyrcelle.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat vertscellen er en bakteriecelle.

4. Nukleinsyre, karakterisert vedat den er i stand til å kode for en moden cytokinsynteseinhiberingsfaktor med den åpne avlesningsramme definert ved aminosyresekvensen:

5. Nukleinsyre ifølge krav 4,karakterisert vedat den modne cytokin-synteseinhiberingsf aktor er definert ved aminosyresekvensen:

6. Nukleinsyre, karakterisert vedat den er i stand til å kode for et modent polypeptid definert ved aminoysresekvensen:

7. Ekspresj onsvektor, karakterisert vedat den er i stand til å uttrykke i en vertscelle en moden, human cytokinsynteseinhiberingsfaktor med den åpne avledningsramme definert ved aminosyresekvensen:

8. Ekspresjonsvektor ifølge krav 7,karakterisert vedat vertscellen er en pattedyrcelle.

9. Ekspresvektor ifølge krav 7,karakterisert vedat vertscellen er en bakteriecelle.

10. Ekspresjonvektor ifølge krav 8,karakterisert vedat den modne, humane cytokinsynteseinhibiberingsfaktor er definert ved aminosyresekvensen :

11. Ekspresj onsvektor, karakterisert vedat den er i stand til å uttrykke i en vertscelle en musecytokinsynteseinhiberingsfaktor definert ved aminosyresekvensen:

12. Monoklonalt antistoff,karakterisert vedat det bindes spesifikt til en human cytokinsyteseinhiberingsfaktor med aminosyresekvens :

og som er i stand til å inhibere den biologisk aktivitet av den humane cytokinsynteseinhiberingsfaktor.

13. Transformert celle, karakterisert vedat den er i stand til å produsere en human cytokinsynteseinhiberingsfaktor med aminosyresekvens :

eller en musecytokinsynteseinhiberingsfaktor med aminosyresekvens :