SK283096B6 - Imunomodulátory - Google Patents

Abstract

Je opísaný polypeptid, iný ako ľudský interleukín-10, ktorý má jednu alebo viac z nasledujúcich vlastností: a) indukuje inhibíciu spontánnej produkcie IL-8 ľudskými monocytmi, b) indukuje inhibíciu IL-1beta indukovanej produkcie IL-8 ľudskými jednojadrovými bunkami periférnej krvi (PBMC, peripheral blood mononuclear cells), c) indukuje produkciu antagonistického proteínu receptora pre interleukín-1 (IRAP) ľudskými monocytmi, d) indukuje chemotaktickú migráciu CD8+ ľudských T-lymfocytov "in vitro", e) znecitlivuje ľudské CD8+ T-bunky majúc za následok bezodozvovosť voči rhIL-10, f) potláča chemotaktickú odpoveď CD4+ ľudských T-lymfocytov voči IL-8, g) potláča chemotaktickú odpoveď ľudských monocytov voči MCAF/MCP-1, h) indukuje produkciu IL-4 kultivovanými normálnymi ľudskými CD4+ T-bunkami, i) redukuje produkciu TNFalfa v ľudskej zmiešanej leukocytovej reakcii. Zvlášť je opísaný nonapeptid Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn, ako aj jeho analógy a varianty.ŕ

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka látky, ktorá je agonistom interleukínu 10 (IL-10), a jej farmaceutického použitia, najmä využitia predmetu tohto vynálezu na výrobu farmaceutického prípravku na prevenciu a/alebo na liečbu chorôb, ktorých patogenéza sa týka zníženej produkcie a/alebo funkcie imunoinhibítorových mediátorov, obzvlášť cytokinov, a/alebo sa týka zvýšenej produkcie a/alebo funkcie imuno-zápalových mediátorov, obzvlášť cytokínov. Vynález sa predovšetkým týka použitia predmetu tohto vynálezu na výrobu farmaceutického prípravku na prevenciu a/alebo liečbu autoimunitných chorôb, ako sú diabetes mellitus I. typu, zápalové ochorenia gastrointestinálneho traktu, rcumatoidnej artritídy, ale aj dny a alergie kože, ako sú alergické reakcie v koži, v pľúcach a v dýchacom systéme, vrátane prieduškovej astmy, ďalej na poškodenia tkaniva v dôsledku hypoxie/ischémie pri infarkte a reperfúzii, na aterosklerózu, psoriázu, granulomatózne choroby, chronickú myeloidnú leukémiu, akútnu myeloidnú leukémiu, rakovinu, reakcie medzi transplantátom a príjemcom pri odmietnutí transplantátu, fibrózu pľúc, fibrózu pečene, chronický neinfekčný zápal pľúc, glomerulonefritidu, predčasné pôrodné bolesti, periodontitídu, zápalové reakcie v dôsledku vírusových infekcii, osteoporózu, septický šok a/alebo na výrobu antikoncepčného agens.

Doterajší stav techniky

Výskum posledných dvoch desaťročí ukázal, že iniciácia, regulácia a ukončenie zápalových reakcií, ako aj regulácia rastu a diferenciácie v cicavčích organizmoch je pod tesnou kontrolou prostredníctvom špeciálnej skupiny signálnych polypeptidov všeobecne nazývaných cytokíny. Cytokíny sú polypeptidy, ktoré môžu byť produkované väčšinou jadrotvomých buniek a ktoré prenášajú regulačné signály medzi bunkami, čim vytvárajú komunikačnú sieť medzi identickými alebo rôznymi typmi buniek organizmu. Cytokíny sú extrémne účinné mediátory a sú aktívne pri koncentráciách až do 10‘¹⁵ M. Cytokíny sú tiež kľúčovými faktormi priebehu bunkových imunitných reakcií, ktoré naopak tvoria základ klinických prejavov infekcie, alergie, traumy, reakcií medzi transplantátom a príjemcom a autoimunitných reakcií. Alergické a autoimunitné choroby sa vysvetľujú abnormalitami v imunitnom systéme. „In vitro“ štúdie, experimenty na zvieratách a klinické experimentálne štúdie ukázali, že cytokíny hrajú dôležité patofyziologické úlohy v zápalových reakciách vzťahujúcich sa na autoimunitné choroby, alergiu, ischémiu, reperfúzne poškodenie, úrazy, infekcie a sú dôležité pri vývoji rakoviny, aterosklerózy, v tehotenstve pri vývoji plodu a na homeostázu kostí. Cytokíny môžu spolupôsobiť aj v iných zápalových a proliferatívnych chorobách, ako to bude opísané v ďalších detailoch nasledujúcej časti.

Uvedené choroby sú zvyčajne chronické a liečba je paliatívna, t. j. väčšina liekov predpísaných v spojitosti s uvedenými chorobami je určených na zmiernenie symptómov a zvyčajne nemajú žiadny liečebný účinok. Iná liečba je takzvaná substitučná terapia, ktorá zahŕňa doživotné podávanie látok pacientovi, napr. hormónov potrebných v dôsledku ich redukovanej/nedostatočnej vnútornej produkcie. Uvedená liečba je často neuspokojivá, navodí nechcené a často vážne vedľajšie účinky a skôr odďaľuje, než zabraňuje vývoju choroby. Sú teda veľmi potrebné zlepšené metódy liečenia a zlepšené farmaceutické prípravky.

Interleukín-10 (IL-10) je nedávno opísaný naturálny endogénny imunosupresívny cytokín, identifikovaný v myšom a v ľudskom organizme. Myší interleukín-10 (mIL-10) bol pôvodne opísaný ako inhibičný faktor syntézy cytokínu uvoľňovaný z TH₂ helperových T-bunkových klonov, ale má aj proliferatívne účinky na rôzne podsúbory lymfocytov, vrátane zosilňujúceho efektu na klonovaciu účinnosť CD4-,8 ⁺ T-buniek z myšej sleziny (4). Ľudský interleukín 10 (hIL-10) bol nedávno sekvenovaný a ukázalo sa, že má vysokú homológiu s mIL-10 na úrovni sekvencie DNA a tiež na úrovni aminokyselín. Okrem toho nedávno bol sekvenovaný prasací interleukín 10 a ukázalo sa, že má vysokú homológiu s ľudským IL-10 na úrovni sekvencie DNA a tiež na úrovni aminokyselín (88), pozri tiež obrázok 2. Tiež hIL-10 má vysokú homológiu s otvoreným čítacím rámcom genómu Epstein-Barrovho vírusu, BCRF1, a vírusový IL-10 má určitú aktivitu podobnú hIL-10, porovnaj na obrázku 1 (5).

Ľudský IL-10 sa produkuje aktivovanými T-bunkovými klonmi a umŕtvenými B-bunkami a okrem jeho aktivity inhibičného faktora cytokínovej syntézy (CSIF), inhibujúc produkciu niekoľkých zápalových cytokínov a kolónie stimulujúcich faktorov tiež indukuje produkciu prirodzeného proteínového/peptidového antagonistu interleukín-1 receptorov (1RAP) jednojadrových buniek a takto nepriamo inhibuje IL-1 aktivitu. IL-10 tiež regulačné znižuje svoju vlastnú produkciu monocytmi a inhibuje expresiu II. triedy MIIC expresie (12). Ďalej hIL-10 redukuje antigénovo špecifickú proliferáciu ľudských T buniek a CD4⁺ bunkových klonov, keď sa použijú monocyty ako antigén predstavujúce bunky. „In vivo“ experimenty na myšiach indikujú, že výsledok infekcie Leishmaniou je závislý od cytokínového profilu zo zodpovedajúcich CD4⁺ lymfocytov (13). V C57BL/6 myšiach rezistentných na infekciu Leishmaniou majú CD4⁺ T-bunky z drenujúcich lymfatických uzlín regulačné zvýšenie hladiny IFN-gama a IL-2 cytokínov, kým senzitívne BALB/c myši v ich drenujúcich lymfatických uzlinách majú CD4⁺ zodpovedajúcich T buniek uvoľňujúcich IL-4 a IL-10, čo môže demonštrovať, že korelujú s postupom choroby (13). Preto IL-10 môže mať silné regulačné účinky na imunologické odpovede aj v „in vitro“ aj v „in vivo“ podmienkach. Okrem toho IL-10 silne ovplyvňuje chemokínovú biológiu, pretože ľudský interleukín 10 je špecifický chemotaktický faktor proti CD8+ T-bunkám, kým IL-10 potláča schopnosť CD4+, ale nie CD8+ T-buniek migrovať v reakcii na T-bunkový chemotaktický cytokín IL-8 (14). IL-10 tiež inhibuje chemotaktický účinok iných chemokínov MCP-l/MCAF a RANTES (75). Nakoľko IL-10 je deaktivátor monocytových/makrofágových funkcií a je inhibítorom Thl aktivity, lieky s plnou alebo čiastočnou aktivitou podobnou IL-10 môžu mať terapeutický účinok v chorobách charakterizovaných nevyváženosťou cytokínovej produkcie a/alebo aktivity.

Už skôr bolo navrhnuté pripraviť farmaceutické prípravky zahrnujúce hIL-10 alebo vIL-10 a použitie hIL-10 alebo vIL-10 na výrobu farmaceutického prípravku na liečenie rozličných stavov, ako septický alebo toxický šok, reumatoidná artritída, choroba z odmietnutia transplantátu príjemcom, odmietnutie tkaniva, diabetes mellitus, autoimunitné ochorenia, leukémia a rakovina, ako bolo zverejnené, napr. vo WO93/02693 a W094/04180. Navyše ÍL-10 antagonisty, napr. protilátky špecificky sa viažuce k IL-10, boli zverejnené, napr. v EP 405 980 a WO94/06473 a očakávalo sa, že takéto protilátky môžu byť užitočné v liečbe HIV infikovaných pacientov.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je polypeptid pozostávajúci najviac z 10 aminokyselinových zvyškov, ktorý zahrnuje nasledujúcu sekvenciu

Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEKV ID Č: 19), kde

X₄ a X₅ sú nezávisle vybraté zo skupiny skladajúcej sa z Met, íle, Leu a Val; a

X<, je vybratý zo skupiny skladajúcej sa z Asn, Asp, Gin a Glu, a ktorý má aspoň jednu z nasledujúcich vlastností:

a) indukuje inhibíciu spontánnej produkcie IL-8 ľudskými monocytmi,

b) indukuje inhibíciu IL-Ιβ indukovanej produkcie IL-8 ľudskými jednojadrovými bunkami periférnej krvi (PBMC),

c) indukuje produkciu antagonistického proteínu receptora pre interleukín-1 (IRAP) ľudskými monocytmi,

d) indukuje chemotaktickú migráciu CD8+ ľudských T-lymfocytov „in vitro“,

e) znecitlivuje ľudské CD8+ T-bunky majúc za následok bezodozvovosť proti rhIL-10,

f) potláča chemotaktickú odpoveď CD4+ ľudských T-lymfocytov proti IL-8,

g) potláča chemotaktickú odpoveď ľudských monocytov proti MCAF/MCP-1,

h) indukuje produkciu IL-4 kultivovanými normálnymi ľudskými CD4+ T-bunkami,

i) redukuje produkciu TNFa v ľudskej zmiešanej Ieukocytovej reakcii.

Tento polypeptid, ktorý výhodne zahrnuje aminokyselinovú sekvenciu Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn, alebo analóg, alebo variant uvedenej sekvencie (nonapeptid so sekvenčnou homológiou k hIL-10, nazývaný IT9302), a jeho deriváty môžu byť použité na prevenciu a/alebo liečbu niektorých foriem zápalových procesov, hlavne foriem vzťahujúcich sa k imunitnému a/alebo hormonálnemu systému. Predpokladá sa (ako je to podrobne opísané v nasledovnom opise imunologických reakcií), že mechanizmus účinku prebieha cez interferenciu s účinkom mediátorov imunitného systému, zvlášť cytokínov takých ako monokíny, lymfokíny, chemokíny a monokínové receptorové antagonisty, to znamená, že látka podľa vynálezu ruší/potláča produkciu a/alebo účinok niektorých cytokínov, a tým inhibuje patologické procesy vedúce k tkanivovému poškodeniu, a že látka podľa vynálezu indukuje produkciu prirodzených monokínových receptorových antagonistov, a tak ruší/potláča účinok niektorých cytokínov, a tým inhibuje patologické procesy, ktoré vedú k tkanivovému poškodeniu.

Dôležité uskutočnenie predkladaného vynálezu sa týka aj farmaceutického prípravku zahrnujúceho ako aktívnu zložku látku podľa vynálezu. Ďalším uskutočnením predmetu vynálezu je aj látka, ktorá je schopná neutralizovať jednu alebo viac uvedených aktivít a) až g), napr. protilátka, a farmaceutický prípravok zahrnujúci takúto látku.

V ďalšom aspekte sa predkladaný vynález týka použitia látky podľa vynálezu na výrobu farmaceutického prípravku na podstatnú inhibíciu biologického účinku vzťahujúceho sa na cytokín, napr. použitie látky podľa vynálezu ako IL-1 receptorový antagonistický proteín/peptid, lymfokín, monokin, interleukín, interferón, chemokín alebo kolónie stimulujúci faktor. Iný aspekt sa týka použitia látky podľa vynálezu na výrobu farmaceutického prípravku na profylaxiu alebo liečenie stavov spôsobených porušením cytokínového systému, t. j. systému IL-1 receptorových proteinových/pcptidových antagonistov, lymfokínov, monokínov, interleukínov, interferónov, chemokínov alebo kolónie stimulujúcich faktorov. V inom aspekte sa vynález tiež týka metódy liečenia stavu porušenia cytokínového systému u ľudí a táto metóda zahrnuje podávanie efektívneho množstva látky podľa vynálezu pacientovi.

Bunkový imunitný systém sa zúčastňuje pri vývoji takých ochorení, ako sú infekčné, zápalové a neoplastické choroby. Imunokompetentné bunky a ich produkty môžu hrať dôležité úlohy v iniciácii, vo vývoji choroby a v možnosti chronickej povahy tohto vývoja zápalových stavov. Tieto ochorenia sú často bez známej etiológie a zahrnujú bežné choroby, ako diabetes mellitus, reumatoidná artritída, zápalové choroby gastrointestinálneho traktu a kože. Okrem týchto príkladov však bunkou sprostredkovaná imunita, resp. zápalové mediátory prispievajú k mnohým ďalším zápalovým a proliferativnym chorobám (pozri tabuľku 2).

TABUĽKA2

Niektoré choroby, v ktorých sa makrofágmi/T-lymfocytmi sprostredkované imunitné reakcie považujú za patogenicky dôležité

Kožné choroby:

psoriáza atopická dermatitída kontaktná dermatitída lymfóm kožných T-buniek (CTCL)

Sezarov syndróm jednoduchý pemfigus (pľuzgier) bulózny pemfigoid nodózny erytém (uzlovité začervenanie kože) sklerodermia

Autoimunitné choroby (vrátane reumatických):

uveitída

Bechetova choroba

Boeckova sarkoidóza

Sjogrenov syndróm reumatoidná artritída juvenilná artritída Reiterov syndróm dna osteoartróza systémová tuberkulóza kože polymyozitida (zápal svalov) myokarditída (zápal srdcového svalu) prvotná biliáma cirhóza (žlčová cirhóza pečene) Crohnova choroba ulceratívna kolitída (vredovitá kolitída) roztrúsená skleróza a iné demyelinizačné choroby aplastická anémia trombopenická idiopatická purpura (Werlhofova choroba) mnohonásobný myelóm a lymfóm B-buniek Simmonov panhypopituitarizmus

Gravesova choroba a Gravesova oftalmopatia subakútna tyreoiditída a Hašimotova choroba Addisonova choroba od inzulínu závislý diabetes mellitus (typ 1)

Iné choroby:

rôzne klinické syndrómy s vaskulitídou (napr. uzlovitá polyarteritída, Wegenerova granulomatóza, arteritída obrovitých buniek), horúčka, nevoľnosť, nechutenstvo (napr. pri akútnych a chronických zápalových a infekčných chorobách) roztrúsená intravaskulárna koagulácia (DIC) artérioskleróza (ateroskleróza) šok (napr. pri gramnegatívnej sepse) kachexia (napr. pri rakovine, chronických infekčných a chronických zápalových chorobách) odmietnutie transplantátu a choroba príjemcu transplantátu

Cytokíny:

T-lymfocyty riadia indukciu a reguláciu bunkou sprostredkovaných imunitných reakcií a cytokínové produkty (lymfokíny) T-buniek iniciujú a riadia imunitnú odpoveď (1,2). Lymfocyty aktivujúce mediátory (lymfokíny), produkované antigén rozpoznávajúcimi bunkami, patria do skupiny polypeptidov nazývaných cytokíny. Cytokíny sú prenášače medzibunkovej komunikácie vo fyziologických ako aj v patofyziologických stavoch a môžu tiež pôsobiť ako hormóny poskytujúce signály medzi imunitným systémom a inými tkanivami a orgánmi. Cytokíny môžu byť tiež produkované bunkami mimo imunitného systému a všeobecne sa predpokladá, že všetky jadrotvorné bunky sú schopné produkovať jeden alebo niekoľko cytokínov. Tak napríklad keratinocyty a fibroblasty sú potenciálni producenti cytokínov a v tomto systéme cytokíny môžu fungovať ako autokrinné alebo parakrinné hormóny nezávislé od imunitného systému (3).

lnterleukín-10:

Myší interleukin 10 (mlL-10) bol pôvodne opísaný ako inhibičný faktor cytokínovej syntézy (CSIF) uvoľňovaný z TH₂ helperových T-bunkových klonov, ale má tiež proliferatívne účinky na rôzne podskupiny lymfocytov, vrátane zosilňujúceho účinku na klonovaciu účinnosť CD4-,8* myších slezinových T-buniek (4). Ľudský interleukin 10 (hlL-10) bol opísaný nedávno (5) a má vysokú homológiu s otvoreným čítacím rámcom v genóme Epstein-Barrovho vírusu, BCRF1, a vírusový IL-10 má určitú aktivitu podobnú hIL-10. Ďalej budú sumarizované biochemické, biologické, fyziologické a možné patofyziologické úlohy IL-10.

IL-10 štruktúra:

Primárne štruktúry myšieho (mIL-10) a ľudského IL-10 (hIL-10) mali vysoký stupeň homológie nukleotidovej sekvencie (>80 %) v ich celej dĺžke (4, 5). Jediným významným rozdielom je inzercia ľudského Alu repetitívneho sekvenčného elementu v 3'-neprekladanej oblasti hIL-10 cDNA klonu. Obe cDNA mIL-10 aj hIL-10 kódujú veľmi podobné otvorené čítacie rámec (ORF) pre 178 aminokyselín, zahrnujúc aj hydrofóbne signálne sekvencie a majú 73 %-nú aminokyselinovú homológiu. mIL-10, ktorý' je aktívny v myších bunkách, nevytvára významnú krížovú reakciu v ľudských bunkách. hIL-10 je 18 kDa veľký polypeptid, ktorému chýba detegovateľný cukomý zvyšok, ale mIL-10 je N-glykozylovaný v mieste blízkom k jeho N-koncu, ktorý chýba v hIL-10. Oba interleukíny mIL-10 a rekombinantný hIL-10 (rhIL-10) sú exprimované ako nekovalentné homodiméry. Rozsah, v ktorom mIL-10 alebo hIL-10 monoméry sú biologicky aktívne nie je ešte zistený. mIL-10 a hIL-10 s aspoň 8 aminokyselín dlhými polypeptidovými „príveskami“ naN-konci a 21 aminokyselinami na C-konci nepreukázali detegovateľnú aktivitu podľa publikácie od autorov Moore a kol., ktorí ako prví sekvenovali IL-10 (6). „Privesené“ C a N terminálové konce celého IL-10 nie vždy zapríčiňujú funkčné zmeny, pokým toto „privesenie“ je príležitostné, resp. náhodné. Vysoký počet možných aminokyselinových substitúcií, ako je to ďalej podrobnejšie opísané, môže tiež vysvetliť, prečo „privesenie“ nepreukázalo chýbajúce funkcie. Rekombinantné mlL-10 a hIL-10 boli exprimované v: CDS7 bunkách, myších myelomových bunkách, vaječníkových bunkách čínskych škrečkov, bakulovírusovom expresnom systéme a E. coli.

Biologické aktivity týchto rIL-10 bielkovín sú zatiaľ nerozlíšiteľné (6).

mlL-10 gén zahrnuje päť exónov zoradených približne cez 5,1 kb DNA. Genómový kloň samotný kóduje exprimovateľnú mIL-10 bielkovinu. mIL-10 a hIL-10 gény sú na myšom a ľudskom chromozóme 1 (6, 7).

mIL-10 a hIL-10 majú silnú DNA a aminokyselinovú sekvenčnú homológiu k otvorenému čítaciemu rámcu v genóme Epstein-Barr vírusu, BCRF1, a homológia je obmedzená iba ku proteín kódujúcej sekvencií a nedeteguje sa v signálnej sekvencií a v 5'- a 3'- neprekladaných sekvenciách (5). Z troch sekvencií mIL-10 a hIL-10 sú bližšie príbuzné páry na úrovni DNA sekvencie (81 %), kým DNA sekvencie kódujúce hotové hIL-10 a BCRF1 bielkoviny majú homológiu 71 %. Homológia medzi hIL-10 a BCRF1 je 84 % na úrovni aminokyselín. Bola vytvorená hypotéza, že mIL-10 a hIL-10 gény sa vyvíjali zo spoločného predka, kým BCRF1 reprezentuje ancestrálne opracovaný zachytený bunkový cytokínový gén, a že BCRF1 bielkovina bola donútená napodobniť hIL-10. BCRF1 je exprimovaný počas lytického cyklu EBV. BCRF1 ORF kóduje 17 kDa sekretovaný polypeptid, ktorý podobne ako hIL-10, obsahuje slabú alebo žiadnu glykozyláciu. BCRF1 má nejaké aktivity IL-10 a bol nazvaný ako vírusový IL-10 (vIL-10), hoci sa zistilo, že jeho aktivita je len 10 % z hIL-10.

IL-10 aktivita na cytokínovú produkciu:

hlL-10 inhibuje produkciu viacerých cytokínov zahrnujúc interferón-γ (IFN-γ), tumory nekrotizujúci faktor-a (TNF-a), granulocytové makrofágové kolónie stimulujúci faktor (GM-CSF), granulocytový-CSF (G-CSF), IL-Ια, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8 a monocytový chemotaktický polypeptid-1 (MCP-l/MCAF) pri monocytoch/makrofágoch a/alebo T-lymfocytoch (4, 5). IL-10 tiež inhibuje schopnosť migrácie monocytov ako odozvu na chemokín MOP-1/MCAF (75). Ďalej, hIL-10 indukuje produkciu endogénneho, prirodzeného interleukin-1 receptorového antagonistu (IRAP) (6), ktorý inhibuje IL-Ια a IL-Ιβ kompetitívne s viazaním receptora. Nakoľko IL-8 je silne indukovateľný prostredníctvom IL-Ια a IL-Ιβ, prejavuje IL-10 časť svojho inhibičného účinku na produkciu IL-8 stimulovaním produkcie IL-1-receptorového antagonistu (IRAP). Tento posledný mechanizmus je veľmi dôležitý z hľadiska predkladaného vynálezu, ako sa to opisuje a dokumentuje v príkladoch ďalšej časti. IRAP má protizápalové aktivity (9) a uvažuje sa o jeho terapeutickom účinku pri reumatoidnej artritíde (10). Dokázalo sa tiež, že IRAP je účinný pri liečbe septického syndrómu a dávkovo závislý 28-dňový preživací účinok bol spojený s IRAP liečbou (p = 0,015) v štúdii Fishera a spol. (11). IRAP môže prejavovať časť svojich protizápalových účinkov inhibovanim chemokínovej produkcie, ako napr. produkcie IL-8.

IL-10 a antigénová expresia:

IL-10 inhibuje expresiu II. triedy MHC expresie ľudských monocytov (8). Konštitutívna a IL-4 alebo IFN-γ indukovaná expresia HLA-DR/DP a DQ bola inhibovaná hIL-10 (12). Okrem toho monocyty predinkubované s IL-10 sú odolné proti následnej indukcii expresie II. triedy MHC prostredníctvom IL-4 alebo IFN-γ. IL-10 inhibuje expresiu II. triedy ľudských monocytov nasledujúcu po aktivácii LPS (12, 76). BALB/c myši, ktorým bolo podávané 1 až 10 mg IL-10 súčasne s letálnou dávkou LSP, boli ochránené pred smrťou (6).

IL-10 inhibuje dusíkové intermediáty a superoxidové anióny. IL-10 tiež inhibuje reaktívny dusíkový intermediát (NO), ako aj reaktívne kyslíkové intermediáty (H₂O₂) pri makrofágoch po následnej aktivácii IFN-γ (13).

IL-10 a aktivita T-buniek:

IL-10 má tiež modulačný účinok na T-bunkové fiinkcie/aktivitu. Takto sa hIL-10 stáva silným chemotaktickým faktorom k CD8+ T-lymfocytov, zatiaľ čo proti CD4+ T-buniek nemá hIL-10 chemotaxiu (14). Navyše IL-10 potláča schopnosť CD4+ T-buniek odpovedať na chemotaktické signály p-chemokínových „RANTES“ a tiež a-chemokínového IL-8. hIL-10 tiež priamo inhibuje proliferáciu ľudských T-buniek periférnej krvi a CD4+ T-bunkových klonov (14).

IL-10 a B-lymfocyty:

hIL-10 doplňujúco stimuluje B-lymfocytovú proliferáciu indukovanú pri skríženej reakcii povrchového Ig s imobilizovanou anti-IgM protilátkou a tento účinok je zosilnený, keď B-bunky sú stimulované skríženou reakciou ich CD40 antigénu s anti-CD40 protilátkou a ľudským FcgRII/CD32 exprimovaným myšími L-bunkami (15). Účinok IL-10 na proliferáciu a diferenciáciu aktivovaných ľudských B-buniek naznačuje, že tento cytokin môže zodpovedať za vynikajúcu schopnosť hIL-10 exprimujúcich T-buniek poskytovať pomoc pre B-bunkové odpovede.

IL-10 ako homeostatický faktor pre imunitný systém:

Predpokladá sa, že fyziologické konzekvencie spomenutých funkcií IL-10 sú istým stupňom homeostázy imunitného systému. Takto IL-10 jasne inhibuje helperové funkcie T-buniek a pravdepodobne stimuluje T-bunky so supresorovými funkciami. Preto sa predpokladá, že IL-10, podobne ako IL-4, reguluje rovnováhu medzi Thl a Th2 cytokínovými profilmi T-buniek. Špeciálne sa predpokladá, že IL-10 inhibuje diferenciáciu Thl-buniek. Pretože Thl-bunky sú charakterizované produkciou cytokínov (IFN-γ a 1L-2), ktoré uprednostňujú bunkovo sprostredkované imunitné odpovede, zatiaľ čo Th2-bunky produkujú cytokíny (IL-4, IL-5 a IL-10), ktoré uprednostňujú humorálne odpovede a potláčajú bunkovo sprostredkované imunitné odpovede, IL-10 pravdepodobne potláča T-bunkami sprostredkovanú imnitnú reakciu, ako napr. hypersenzitívne reakcie spomaleného typu, zatiaľ čo humorálne odpovede uprednostňuje.

Ako dôsledok spomenutých vlastností bol IL-10 opísaný ako inhibitor makrofágovej a Thl cytokinovej syntézy. Preto sa skúmalo, či chýbajúca IL-10 produkcia a/alebo aktivita môže hrať úlohu pri chorobách, kde sa predpokladá, že zosilnená bunkou sprostredkovaná imunoreaktivita hrá úlohu pri ochorení, tak ako pri autoimunitných chorobách alebo zápaloch. Anti-IL-10 protilátkami ošetrené myši majú silnejšiu zápalovú odpoveď k zápalu indukovanému monokínmi a sú významne náchylnejšie k uhynutiu LPS-indukovaným septickým šokom, t. j. monokínmi sprostredkovanou zápalovou reakciou (16). Taktiež pri myšiach s vyradeným IL-10 sa spontánne vyvíjajú zápalové reakcie čriev podobné ulceróznej kolitíde (17). Ďalej sa skúmalo, či IL-10 hrá úlohu v rôznych parazitámych, mykobakteriálnych alebo vírusových infekciách a ukázalo sa, že IL-10 hrá patofyziologickú úlohu v imunitnej paréze pri infekcii Schistosoma mansoni (18). Tiež sa predpokladá jeho úloha v infekciách Mycobacterium leprae. Nedávno sa zistilo, že AIDS pacienti so zlou prognózou majú vyššiu hladinu IL-10 v plazme a bolo naznačené, že to prispieva k imunitnej paréze, ktorá je známa pri AIDS (19).

Terapeutické úvahy:

Tieto „in vivo“ výsledky/údaje silno naznačujú homcostatickú úlohu IL-10 v riadení bunkou sprostredkovaného a monokínmi amplifikovaného imunitného zápalu a indikujú široko rozsahové terapeutické aplikácie IL-10 alebo lieku s IL-10 podobnou aktivitou, pri liečení chorôb, ktoré sú charakterizované zníženou/nedostatočnou produkciou a/alebo aktivitou IL-10. Nakoľko látka podľa predkladaného vynálezu, overená prostredníctvom IT9302, prejavuje aktivitu podobnú IL-10

1. indukovaním produkcie IRAP ľudskými monocytmi,

2. inhibovaním spontánnej produkcie IL-8 ľudskými monocytmi,

3. inhibovaním IL-lp-stimulovanej produkcie IL-8 jednojadrovými bunkami periférnej krvi, (PBMC, periferal blood mononuclear cells),

4. stimulovaním chemotaktickej migrácie CD8+, ale nie CD4+, ľudských T-lymfocytov,

5. znecitlivením ľudských CD8+ T buniek proti rhIL-10 indukovanej chemotaktickej migrácii,

6. inhibovaním IL-8 sprostredkovanej chemotaxie ľudských CD4+ T-buniek,

7. inhibovaním MCP-l/MCAF sprostredkovanej chemotaxie ľudských monocytov,

8. indukovaním produkcie IL-4 pri kultivácii normálnych ľudských CD4+ T-buniek,

9. redukovaním TNFa produkcie v ľudskej zmiešanej leukocytovej reakcii, tento polypeptid a jeho analógy môžu mať teda rovnaké terapeutické možnosti ako IL-10. V tabuľke 3 sa uvádzajú niektoré choroby, v ktorých imunomodulátor IL-10 alebo imunomodulátor s IL-10 podobnou aktivitou môže mať terapeutický význam.

TABUĽKA 3

Niektoré choroby, pri ktorých imunomodulátor s IL-10 podobnou aktivitou, v dôsledku indukcie IRAP produkcie a/alebo inhibície cytokinovej produkcie a/alebo aktivity, môže mať terapeutický význam (Lit. 20 - 74)

Predčasné pôrodné bolesti zapríčinené infekciou alebo inými okolnosťami

Reumatoidná artritída

Lymská artritída

Dna

Septický syndróm

Hypertermia

Ulceratívna kolitída alebo enterokolitída

Osteoporóza

Cytomegalovírusové ochorenie

Periodontálne choroby

Glomerulonefritída

Chronický, neinfekčný zápal pľúc (napr. sarkoidóza a fajčiarske pľúca)

Uzlíkovitý zápal

Fibróza pečene

Fibróza pľúc

Odmietnutie transplantátu

Choroba príjemcu transplantátu

Chronická myeloidná leukémia

Akútna myeloidná leukémia

Iné neoplastické choroby

Bronchiálna astma

Diabetes mellitus, I. typu (od inzulínu závislý) Artérioskleróza/ateroskleróza

Psoriáza

Chronická B-lymfocytová leukémia

Bežná variabilná imunodeficiencia

Vedľajšie účinky použitia iných modifikátorov biologickej odozvy

Roztrúsená intravaskulárna koagulácia

Systémová skleróza

Encefalomyelitída

Zápal pľúc

Hyper IgE syndróm

Enterokolitída

Metastázujúca rakovina

Prijatá imunitná terapia

Získaný respiračný bolestivý syndróm

Sepsa

Reperfuzny syndróm

Pooperačný zápal

Transplantácia orgánu

Alopécia

V najširšom aspekte sa tento vynález týka látky, ktorá má aktivitu hIL-10 agonistu, t. j. látky inej ako ľudský interleukín 10, ktorá má jednu alebo viac z nasledujúcich vlastností:

a) indukuje inhibíciu spontánnej produkcie IL-8 ľudskými monocytmi,

b) indukuje inhibíciu IL-1 β indukovanej produkcie IL-8 ľudskými jednojadrovými bunkami periférnej krvi (PBMC, peripheral blood mononuclear cells),

c) indukuje produkciu antagonistického proteínu receptora pre interleukín-1 (IRAP) ľudskými monocytmi.

d) indukuje chemotaktickú migráciu CD8+ ľudských T-lymfocytov „in vitro“,

e) znecitlivuje ľudské CD8+ T-bunky majúc za následok bezodozvovosť proti rhIL-10,

f) potláča chemotaktickú odpoveď CD4+ ľudských T-lymfocytov proti IL-8,

g) potláča chemotaktickú odpoveď ľudských monocytov proti MCAF/MCP-1,

h) neinhibuje molekulovú expresiu II triedy MHC v ľudských monocytoch, na rozdiel od ľudského IL-10,

i) indukuje produkciu IL-4 kultivovanými normálnymi ľudskými CD4+ T-bunkami,

j) redukuje produkciu TNFa v ľudskej zmiešanej leukocytovej reakcii.

Medzi týmito aktivitami sa d) až g) považujú za najunikátnejšie. Jedno dôležité uskutočnenie vynálezu je látka, ktorá má aktivitu hIL-10 agonistu, ako sa to definovalo, a ktorá zahrnuje aminokyselinovú sekvenciu Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn alebo analóg, alebo variant uvedenej sekvencie. Táto sekvencia a všetky ďalšie polypeptidové sekvencie v tomto opise vynálezu a v patentových nárokoch sú, aj vtedy, keď sa to explicitne neuvádza, písané od N-terminálového ku C-terminálovému koncu v konvenčnom formáte.

Nonapeptid IT9302 veľmi účinne indukuje rôzne funkcie, je veľmi stabilný a predpokladá sa, že nemôže byť nesprávne viazaný k receptorom. Nonapeptid sa zvolil preto, lebo všeobecne 9 aminokyselinová polypeptidová sekvencia je pre bielkovinu jedinečná. Ale treba poznamenať, že 6 koncových aminokyselín na okraji hIL-10 sa javí ako najdôležitejších. V rámci tohto vynálezu je to teda látka alebo polypeptid zahrnujúci podsekvenciu aminokyselinovej sekvencie Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (SEKV ID Č: 1).

Považuje sa za pravdepodobné, že niektoré substitúcie aminokyselín nebudú mať nepriaznivé účinky na aktivitu hIL-10 agonistu, ako sa to definovalo, pokiaľ treonin, lyzín a arginín sú prítomné aj s jednou aminokyselinou umiestnenou uprostred.

V jednom aspekte sa tento vynález tak týka polypeptidu majúceho vzorec

Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEKV ID Č: 19), kde

X₄ a X₅ sú nezávisle vybraté zo skupiny skladajúcej sa z Met, íle, Leu a Val; a

X₆ je vybratý zo skupiny skladajúcej sa z Asn, Asp, Gin a Glu s podmienkou, že polypeptid nie je Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn.

V inom aspekte sa vynález týka polypeptidu majúceho vzorec

X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEKV ID Č: 20), kde

X₃ ,X₄ a X₅ sú nezávisle vybraté zo skupiny skladajúcej sa z Met, íle, Leu a Val; a

X₆ je vybratý zo skupiny skladajúcej sa z Asn, Asp, Gin a Glu.

V ešte ďalšom aspekte sa vynález týka polypeptidov majúcich vzore

X₂-X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEKV ID Č: 21), kde

X₂ je Tyr alebo Phe,

X₃, X₄ a X₅ sú nezávisle vybraté zo skupiny skladajúcej sa z Met, íle, Leu a Val a

X₆ je vybratý zo skupiny skladajúcej sa z Asn, Asp, Gin a Glu.

Preferované uskutočnenia vynálezu sú polypeptidy majúce vzorec

XrXrXrThr^-Lys-Xj-Arg-JQ (SEKV ID Č: 22), kde

X, je Ala alebo Gly,

X₂je Tyr alebo Phe,

X₃, X₄ a X₅ sú nezávisle vybraté zo skupiny skladajúcej sa z Met, íle, Leu a Val; a

X₆ je vybratý zo skupiny skladajúcej sa z Asn, Asp, Gin a Glu.

Tento vynález sa teda týka látky alebo polypeptidu, ktorý zahrnuje definovanú aminokyselinovú sekvenciu, s podmienkou, že látka alebo polypeptid nie je ľudský IL-10.

Príklady špecifických polypeptidov, o ktorých sa predpokladá, že majú aktivitu hIL-10 agonistu definovanú, sú nasledovné:

1. NHi-Ala-Tvr-Met-Thr-Ile-Lvs-Met-Arg-Asn-COOH (SEKV ID Č: 2)

2. NH-»-Ala-Phe-Met-Thr-Leu-Lvs-Leu-Arg-Asn-COOH (SEKV ID Č: 3)

3. NH->-Ala-Tyr-Met-Thr-Mct-Lvs-Val-Arg-Glu-COOH (SEKV ID Č: 4)

4. NH₂-Gly-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp-COOH (SEKV ID Č: 5)

5. NH₂-Ala-Phe-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEKV ID Č: 6)

6. NH₂-Ala-Tyr-Ile-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEKV ID Č: 7)

7. NH₂-Ala-Tyr-Leu-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEKV ID Č: 8)

8. NH₂-Ala-Tyr-Val-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEKV ID Č: 9)

9. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEKV ID Č: 10)

10. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Leu-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEKVIDČ: 11)

11. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Val-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEKV ID Č: 12)

12. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEKV IDČ: 13)

13. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Met-Arg-Asp-COOH (SEKV ID Č: 14)

14. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Asp-COOH (SEKV ID Č: 15)

15. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Gln-COOH (SEKVIDČ: 16)

16. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Glu-COOH (SEKV ID Č: 17)

Na porovnanie, ďalší nonapeptid nazvaný IT9301 so 100 % homológiou k sekvcncii hIL-10 bol syntetizovaný. Tento polypeptid IT9301, ktorý’ zodpovedá nonapeptidovej sekvencii začínajúcej pri N-terminálovom konci hIL-10, (aminokyseliny č. 19 až 27, t. j. prvých 9 aminokyselín hotovej bielkoviny) má nasledujúcu aminokyselinovú sekvenciu:

NH₂-Ser-Pro-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Ser-Glu-COOH (SEKV ID Č: 18)

Tento polypeptid neukázal použitím opísaných techník žiadnu aktivitu podobnú IL-10 a bol ako jediný vybratý preto, že je z iného konca hIL-10 a väčšinou slúžil ako kontrola pre záporné výsledky. Nemá charakteristiky C-terminálovej sekvencie vzhľadom na sekvenčnú homológiu k vIL-10 a nemá výhodné aminokyseliny pre viazanie receptora. IT9301 bol testovaný v IL-1 β indukovanom systéme periférnych jednojadrových buniek na produkciu IL-18, ale neindukoval žiadnu inhibíciu produkcie IL-18 z buniek.

V súlade s týmto vynálezom výraz „hIL-10 agonistová substancia podľa vynálezu“ zahrnuje hocijakú farmaceutický aktívnu a akceptovateľnú zlúčeninu identickú alebo štrukturálne podobnú IT9302 a prejavujúcu relevantné biologické pôsobenia podobné IT9302, vrátane derivátov IT9302, zvlášť farmaceutický akceptovateľných solí, esterov a solvátov a tiež konjugátov IT9302 alebo derivátov IT9302 vrátane peptidových napodobenín. Kovalentná väzba 1T9302 na NH₂-terminálovom konci k vhodným nosičom, napr. k polyetylénglykolu alebo k cukru môže predĺžiť polčas života polypeptidu „in vivo“.

V tomto texte sa používajú nasledovné definície:

„Cytokín“ je všeobecný názov pre proteínový mediátor uvoľňovaný primáme, ale nie výlučne, bunkovou populáciou imunitného systému ako odozva na špecifický stimulujúci agens, napr. špecifický antigén alebo aloantigén, alebo nešpecifický polyklonálny aktivátor, napr. endotoxín, alebo na iné zložky bunkovej steny gramnegatívnej baktérie.

„Lymfokín“ je všeobecný názov pre proteínový mediátor, ktorý je uvoľňovaný senzitívnymi lymfocytmi ako odpoveď na stimulujúci agens, napr. špecifický antigén alebo aloantigén, alebo je pri lymfocyte vyvolaný polyklonálnym aktivátorom, napr. endotoxínom, alebo inými zložkami bunkovej steny gramnegatívnej baktérie.

„Interleukín“ je všeobecný názov pre proteínový mediátor uvoľňovaný primárne, ale nie výlučne makrofágom, T-, B- alebo NK-bunkou, ako odozva na stimulujúci agens, napr. špecifický antigén alebo aloantigén, alebo je pri lymfocyte vyvolaný polyklonálnym aktivátorom, napr. endotoxínom, alebo inými zložkami bunkovej steny gramnegatívnej baktérie.

„Monokín“ je všeobecný názov pre proteínový mediátor uvoľňovaný primáme, ale nie výlučne jednojadrovým fagocytom (napr. monocytom), alebo makrofágovou či Kupfferovou bunkou (pečeň), alebo Langerhansovou bunkou (koža), ako odpoveď na stimulujúci agens.

„Chemokín“ je všeobecný názov pre proteínový chemotaktický a/alebo leukocyty aktivujúci mediátor, uvoľňovaný primáme, ale nie výlučne bunkovou populáciou imunitného systému ako odpoveď na špecifický stimulujúci agens, napr. špecifický antigén alebo aloantigén, alebo nešpecifický polyklonálny aktivátor, napr. endotoxín, alebo na iné zložky bunkovej steny gramnegatívnej baktérie, a zároveň patriaci do osobitnej génovej rodiny, buď do a-chemokínovej génovej rodiny, alebo do β-chemokínovej génovej rodiny.

„Interferón“ je všeobecný názov pre proteínový antivírusový a/alebo monocyty aktivujúci mediátor uvoľňovaný primáme, ale nie výlučne, bunkovou populáciou imunitného systému ako odozva na vírus, alebo interferónový induktor, ako napr. polynukleotid. Uvoľňovaný je hlavne bunkami imunitného systému ako odpoveď na špecifický stimulujúci agens, napr. špecifický antigén alebo aloantigén, alebo nešpecifický polyklonálny aktivátor, napr. endotoxín, alebo na iné zložky bunkovej steny gramnegatívnej baktérie.

„Kolónie stimulujúci faktor“ je všeobecný názov pre proteínový, hematopoietické kolónie stimulujúci mediátor, uvoľňovaný primáme, ale nie výlučne bunkovou populáciou imunitného systému ako odozva na špecifický stimulujúci agens, napr. špecifický antigén alebo aloantigén, alebo na nešpecifický polyklonálny aktivátor, napr. endotoxín, alebo na iné zložky bunkovej steny gramnegatívnej baktérie.

„Polypeptid“ sa tu používa na označenie krátkych peptidov s dĺžkou najmenej dvoch aminokyselinových zvyškov a najviac 10 aminokyselinových zvyškov, oligopeptidov (11 -100 aminokyselinových zvyškov), ako aj dlhších peptidov (čo je obvyklá interpretácia pojmu „poíypeptid“, t. j. v dĺžke viac ako 100 aminokyselinových zvyškov), ale aj proteínov (funkčná entita zahrnujúca najmenej jeden peptid, oligopeptid alebo polypeptid, ktorý môže byť chemicky modifikovateľný glykozylovanim alebo lipidovaním, alebo obsahujúci prostetické skupiny). Definícia polypeptidov tiež zahŕňa natívne formy peptidov/bielkovín u ľudí a taktiež rekombinantné bielkoviny alebo peptidy v hocijakom type expresných vektorov transformujúcich hocijaké druhy hostiteľov a tiež chemicky syntetizované peptidy.

Jedno uskutočnenie predkladaného vynálezu sa týka polypeptidu obsahujúceho podsekvenciu sekvencie ľudského IL-10, ktorý’ má 66 %-nú homológiu s vIL-10 a 44 %-nú homológiu s mIL-10, najmä SEK V ID Č: 1. Pod pojmom „homológia“ sa rozumie identita v sekvenciách aminokyselín v segmentoch dvoch alebo viac aminokyselín, ak sa zhodujú v identite a v polohe aminokyselín v polypeptidoch.

Homológia ako pojem sa tu požíva na označenie miery podobnosti medzi dvoma aminokyselinovými (alebo nukleotidovými) sekvenciami. Homológia je vyjadrená ako podiel alebo percento zhodujúcich sa aminokyselín (alebo báz) potom, ako sa usporiadali vedľa seba dve sekvencie (hoci aj nerovnakej dĺžky). Pojem usporiadanie sa používa v takom zmysle, ako je to definované v (76). Zhruba povedané, dve sekvencie sú zoradené maximalizovaním počtu zhodujúcich sa báz (alebo aminokyselín) medzi dvoma sckvenciami s inzerciou minimálneho počtu „slepých“ alebo „nulových“ báz do jednej alebo druhej sekvencie s cieľom dosiahnuť maximálne prekrytie.

Pojem „homologický“ sa tu používa medzi iným na ilustráciu stupňa identity medzi aminokyselinami daného polypeptidu a aminokyselinovej sekvencie IT9302. Aminokyselinová sekvencia, ktorá sa má porovnať s aminokyselinovou sekvenciou IT9302 môže byť odvodená z nukleotidovej sekvencie, ako napr. DNA alebo RNA sekvencie, získanej, napr. hybridizáciou, ako sa to definuje ďalej, alebo môže byť získaná konvenčnými metódami aminokyselinového sekvenovania. Stupeň homológie sa prednostne určuje na aminokyselinovej sekvencii hotového polypeptidu, t j. neberú sa do úvahy žiadne signálne sekvencie. Vo všeobecnosti sa používajú len kódujúce oblasti na porovnanie nukleotidových sekvencii na určenie ich vnútornej homológie.

Hoci sa predpokladá, že podstatný stupeň homológie s hlL-10 a vIL-10 je výhodný, nie je nepravdepodobné, že podsekvencie sekvencie hIL-10, ktoré preukazujú nižší stupeň homológie s vIL-10, napr. 50 %, 55 % alebo 60 %, môžu tiež preukázať ešte ďalšie prospešné aktivity agonistu hlL-10. Navyše, ako sa to hovorilo, nepokladá sa za absolútne nevyhnutné, aby homológia k hIL-10 bola 100 %. V rozsahu predkladaného vynálezu sú tiež polypeptidy, ktoré majú nižší stupeň homológie s hIL-10, a to 75 %, 80 %, 90 % alebo 95 %, hoci sa 100 % uprednostňuje.

Takéto polypeptidy sa môžu považovať za analógy nonapeptidu. Pod pojmom „analóg alebo variant“ sa teda rozumie polypeptid, ktorý nemá presne aminokyselinovú sekvenciu Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (SEKV ID Č: 1), ale stále ešte má „aktivitu hIL-10“ podľa definície. Všeobecne, takými polypeptidmi budú polypeptidy, ktoré sa odlišujú, napr. v istom rozsahu aminokyselinového zloženia, alebo v posttranslačných modifikáciách, napr. v glykozylácii alebo fosforylácii, v porovnaní s IT9302, ako je to opísané v príkladoch.

Pojem „analóg“ alebo „variant“ sa používa v predkladanom kontexte na označenie bielkoviny alebo polypeptidu, ktorý má trochu odlišnú, ale stále ešte podobnú sekvenciu s aminokyselinovou sekvenciou IT9302, berúc do úvahy malé variácie, ktoré menia aminokyselinovú sekvenciu, napr. delécie, bodové mutácie, inzercie nadbytočných aminokyselín, alebo ich kombinácie, s cieľom generovať polypeptidové analógy IT9302.

Bodovo orientovaná mutagenéza poskytuje vhodný spôsob na ovplyvnenie konzervatívnych aminokyselinových substitúcii v sekvencii natívnej bielkoviny. Alternatívne sa môžu analógy pripraviť známymi metódami polypeptidovej syntézy v kvapalnej fáze, alebo na tuhom nosiči, využívajúc postupné pripájanie individuálnych aminokyselín polypeptidovej sekvencie, alebo polypeptid možno syntetizovať spájaním individuálnych aminokyselín tvoriac fragmenty polypeptidovej sekvencie, ktoré sa potom spoja do požadovaného polypeptidu.

„Konzervatívny“ tu znamená (I), že zmeny sú čo najviac konformačne neutrálne, t. j. sú navrhnuté tak, aby vyvolali minimálne zmeny terciámej štruktúry mutantných polypeptidov v porovnaní s natívnou bielkovinou, a (II) že zmeny sú čo najviac antigénovo neutrálne, t. j. sú navrhnuté tak, aby spôsobili minimálne zmeny v antigénových determinantoch mutantných polypeptidov v porovnaní s natívnou bielkovinou. Konformačná neutralita je potrebná na zachovanie biologickej aktivity a antigénová neutralita je potrebná na to, aby sa vyhlo spusteniu imunogénnych odpovedí u pacientov alebo zvierat ošetrených látkou podľa vynálezu. Hoci je ťažké selektovať s absolútnou istotou tie alternatívy, ktoré budú konformačne a antigénovo neutrálne, existujú pravidlá, ktoré môžu usmerniť skúsených odborníkov robiť také zmeny, ktoré s vysokou pravdepodobnosťou budú konformačne a antigénovo neutrálne, pozri napr. (77) a (78). Podľa niektorých dôležitejších pravidiel (1) zámena hydrofóbnych zvyškov menej pravdepodobne spôsobuje zmeny v antigenicite, pretože sú zvyčajne lokalizované vnútri bielkoviny, ako uvádza napr. Berzofsky (citovaný vyššie) a Bowie a spol. (citovaný vyššie), (2) zámena fyzikálnochemicky podobných, t. j. synonymných zvyškov menej pravdepodobne spôsobuje konformačné zmeny, pretože vymieňajúca aminokyselina môže hrať rovnakú štruktúrnu úlohu ako vymenená aminokyselina a (3) zmena evolučné konzervatívnych sekvencii pravdepodobne spôsobuje škodlivé konformačné účinky, pretože evolučná konzervatívnosť naznačuje, žc sekvencie môžu byť funkčne dôležité. Navyše k týmto základným pravidlám selekcie mutovaných sekvencii existujú skúšky na potvrdenie aktivity a konformácie skonštruovaných molekúl. Biologické skúšky látok podľa vynálezu sú opísané obšírnejšie v príkladoch. Konformačne zmeny sa môžu testovať najmenej dvoma známymi metódami: mikrokomplementovou fixačnou metódou, napr. (79) a (80), široko použitou v evolučných štúdiách terciárnych štruktúr bielkovín a metódou zisťovania afinít k súborom konformačne špecifických monoklonálnych protilátok, napr.(81).

Dôležité uskutočnenie predkladaného vynálezu sa týka polypeptidu, v ktorom najmenej jeden aminokyselinový zvyšok bol substituovaný odlišným aminokyselinovým zvyškom a/alebo, v ktorom aspoň jeden aminokyselinový zvyšok bol deletovaný alebo pridaný, aby sa získal polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu odlišnú od aminokyselinovej sekvencie alebo podsekvencie uvedenej sekvencie definovanej v ďalšom, ale v podstate majúcu aktivitu hIL-10 agonistu, ako sa to definovalo.

Zaujímavé uskutočnenie vynálezu sa týka polypeptidu, ktorý je analógom a/alebo obsahuje aspoň časť polypeptidu podľa vynálezu pozostávajúceho celkove z 10 až 100 aminokyselín, napr. aspoň z 12 aminokyselín, minimálne z 15 aminokyselín, najmenej z 20 aminokyselín, alebo aspoň z 30 aminokyselín.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sa látka alebo polypeptid používa v skutočne čistej forme. Na dosiahnutie toho je potrebná purifikácia polypeptidu. Príkladmi postupov na purifikáciu polypeptidov sú: (I) imunoprecipitácia alebo afinitná chromatografia s protilátkami, (II) afinitná chromatografia s vhodným ligandom, (III) iný chromatografický postup, ako napr. gélová filtrácia, iónovýmenná alebo vysokoúčinná kvapalinová chromografia, alebo postupy odvodené od hociktorého z nich, (IV) elektroforetické postupy, ako napr. polyakrylamidová gélová elektroforéza, agarózová gélová elektroforéza a izoelektrická fokusácia, (V) ďalšie špecifické solubilizačné a/alebo purifikačné techniky.

V rozsahu predkladaného vynálezu je tiež nukleotidová sekvencia kódujúca polypeptid definovaný, najmä nukleotidová sekvencia, ktorá kóduje polypeptid, obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu SEKV ID Č: 1, napr. nukleotidová sekvencia obsahujúca sekvenciu GCC TAC ATG ACA ATG AAG ATA CGA AAC (SEKV ID Č: 23), alebo nukleotidová sekvencia kódujúca polypeptid majúci subsekvenciu zmienenej aminokyselinovej sekvencie. Navyše aj modifikovaná nukleotidová sekvencia, ktorá sa líši od nukleotidovej sekvencie uvedenej aspoň v tom, že minimálne jeden nukleotid bol deletovaný, substituovaný alebo modifikovaný, alebo aspoň v tom, že minimálne jeden ďalší nukleotid bol vložený, a tak vznikla nukleotidová sekvencia, ktorá kóduje polypeptid majúci aktivitu hIL-10 agonistu, spadá do rozsahu tohto vynálezu.

V predkladanom opise a v patentových nárokoch pojem „subsekvencia“ označuje sekvenciu, ktorá má výhodne veľkosť najmenej 18 nukleotidov, výhodnejšie najmenej 21 nukleotidov a najvýhodnejšie 24 nukleotidov. V množstve uskutočnení vynálezu, subsekvencia alebo analóg nukleotidovej sekvencie podľa vynálezu bude obsahovať najmenej 27 nukleotidov, najmenej 30 nukleotidov alebo najmenej 45 nukleotidov. Polypeptid kódovaný „subsekvenciou“ by mal spĺňať najmenej jedno z uvedených kritérií a) - g) a/alebo nukleotidová „subsekvencia“ by mala hybridizovať s nukleotidovou sekvenciou obsahujúcou sekvenciu SEKV ID C: 23 za veľmi stringentných podmienok.

Ak pojem „veľmi stringentný“ sa používa v spojitosti s hybridizačnými podmienkami, potom sa to chápe tak, že je to 5 - 10 °C pod bodom topenia T_m, porovnaj Sambrook a spol., 1989, strany 11.45-11.49.

Pojem „analóg“ v súvislosti s DNA fragmentmi podľa vynálezu zahrnuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje polypeptid identický alebo v podstate identický s polypeptidom kódovaný spomenutou DNA. Je známe, že tá istá aminokyselina môže byť kódovaná rôznymi kodónmi a výber kodónov sa riadi okrem iného aj podľa preferencií predmetného organizmu exprimujúceho danú nukleotidovú sekvenciu. Takto jeden alebo viac nukleotidov alebo kodónov DNA-fragmentu predmetu vynálezu môže byť vymenených inými, ktoré po expresii rezultujú do polypeptidu identického alebo v podstate identického s polypeptidom kódovaným uvedeným DNA-fragmentom.

Okrem toho pojmy „analóg“ a „subsekvencia“ majú zmysel takých variácií v sekvencií ako substitúcia, inzercia (vrátane intrónov), adícia a preskupenie jedného alebo viac nukleotidov, ktoré nemajú žiadny podstatný nepriaznivý účinok na hIL-10 agonistovú aktivitu polypeptidu, kódovaného DNA-fragmentom alebo jeho subsekvenciou. Vynález takto tiež zahrnuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu polypeptid, ktorý má subsekvenciu aminokyselinovej sekvencie SEKV ID Č: 1.

Polypcptidy podľa vynálezu môžu byť vyrobené použitím technológie rekombinantnej DNA. Dôležité uskutočnenie predkladaného vynálezu sa týka expresného systému zahrnujúceho nukleotidovú sekvenciu podľa vynálezu. Súčasťou vynálezu je teda tiež expresný systém zahrnujúci nukleotidovú sekvenciu podľa vynálezu, ako replikovateľný expresný vektor, ktorý nesie uvedenú nukleotidovú sekvenciu a je schopný sprostredkovať jej expresiu.

Organizmus, ktorý sa používa na výrobu polypeptidu podľa vynálezu, môže byť vyšší organizmus, napr. živočích, alebo nižší organizmus, napr. mikroorganizmus, ako Escherichia coli, kvasinka, prvok alebo bunka odvodená z viacbunkového organizmu, ako huba, bunka hmyzu, rastlinná bunka, cicavčia bunka alebo bunková línia, ktorá obsahuje uvedený expresný systém.

Nezávisle od typu použitého organizmu, DNA-fragment podľa vynálezu sa zavádza do organizmu buď priamo, alebo pomocou vhodného vektora. Alternatívne polypeptidy sa môžu produkovať v cicavčích líniách zavedením DNA-fragmentu alebo jeho analógu, alebo jeho podsekvencie podľa vynálezu buď priamo, alebo pomocou expresného vektora. Polypeptidy podľa vynálezu sa môžu tiež produkovať prostredníctvom uvedenej chemickej syntézy.

Vynález sa ďalej týka aj plazmidového vektora obsahujúceho DNA-sekvenciu, kódujúcu polypeptid podľa vynálezu, alebo fuzovaný polypeptid definovaný v tomto texte. V jednom osobitne dôležitom uskutočnení DNA-fragment alebo jeho analóg, alebo jeho subsekvencia podľa vynálezu, alebo fiizovaný DNA-fragment podľa vynálezu, definovaný v tomto texte, môže byť nesený replikovateľným expresným vektorom, ktorý je schopný replikácie v hostiteľskom organizme alebo v bunkovej línii.

Vektorom môže byť predovšetkým plazmid, fág, kozmid, minichromozóm alebo vírus. V jednom zaujímavom uskutočnení vynálezu vektorom môže byť taký vektor, ktorý sa po zavedení do hostiteľskej bunky integruje do genómu hostiteľskej bunky.

Polypeptid produkovaný tak, ako je opísané, môže byť podrobený posttranslačným alebo postsyntetickým modifikáciám v dôsledku tepelného pôsobenia, chemického pôsobenia (formaldehyd, glutaraldehyd atď.) alebo enzýmového pôsobenia (peptidázy, proteinázy a proteín modifikujúce enzýmy). Polypeptid môže byť rôznymi spôsobmi opracovaný počas produkcie v organizme v porovnaní s jeho prirodzeným produkčným prostredím. Napríklad glykozylácia sa dosahuje často, keď sa polypeptid exprimuje bunkou vyššieho organizmu, ako napr. kvasinkou alebo výhodne cicavčou bunkou. Glykozylácia sa normálne vyskytuje v spojitosti s aminokyselinovými zvyškami Asn, Ser, Thr alebo hydroxylyzín.

Jedno uskutočnenie vynálezu sa tak týka metódy produkcie definovaného polypeptidu a zahrnuje nasledovné kroky:

(a) vloženie definovanej nukleotidovej sekvencie do expresného vektora, (b) transformácia vhodného hostiteľského organizmu vektorom produkovaným v kroku (a), (c) kultivovanie hostiteľského organizmu pripraveného v kroku (b) za podmienok vhodných na expresiu polypeptidu, (d) získanie polypeptidu a (e) prípadné podrobenie polypeptidu posttranslačnej modifikácii.

Predpokladá sa, že účinok antagonistov na hIL-10 alebo vlL-10 sa dosiahne medzi iným aj použitím protilátok viažucich sa špecificky k nonapeptidu IT9302 a že tieto protilátky sa môžu použiť v terapii na neutralizáciu vysokej koncentrácie IL-10.

V inom aspekte sa predkladaný vynález teda týka aj protilátky, ktorá sa špecificky viaže k polypeptidu podľa vynálezu.

Pojem „protilátka“ sa vzťahuje na látku, ktorá sa produkuje cicavčími alebo presnejšie bunkami cicavčieho pôvodu, patriacimi k imunitnému systému, ako odpoveď na expozíciu polypeptidovému antigénu podľa vynálezu. V predkladanej špecifikácii a v patentových nárokoch sa „protilátka“ definuje ako látka, ktorá sa skladá zo špecificky sa viažucej základnej jednotky pozostávajúcej z dvoch ťažkých a z dvoch ľahkých reťazcov. Ale v najširšom aspekte pojem protilátky by mal obsiahnuť aj napr. dimér alebo pentamér základnej jednotky.

Variantná doména protilátky sa skladá z variabilných a konštantných sekvencií. Premenná časť domény sa nazýva idiotyp protilátky. Táto časť protilátky je zodpovedná za interakciu s antigénom, antigénovc viazanie. V predkladanom kontexte pod pojmom protilátka sa rozumie celá protilátková molekula alebo hocijaký jej fragment. Protilátku možno fragmentovať počas a/alebo po produkcii. Možno tiež začať s fragmentovanou formou a použiť ju samu osebe, alebo použiť ju po pospájaní rôznych fragmentov.

Zvlášť zaujímavými fragmentmi sú väzbové fragmenty protilátok podľa vynálezu, napr. Fab alebo Fab' fragmenty.

Idiotypová (antigén viažuca) štruktúra protilátky je antigenická, a tak podnecuje vznik špecifických protilátok namierených proti idiotypovej štruktúre. Protilátky vyvolané proti idiotypu sa nazývajú antiidiotypové protilátky. Takéto protilátky môžu napodobňovať štruktúru pôvodného antigénu, a preto môžu pôsobiť ako pôvodný antigén. Takéto protilátky sú schopné nahradiť pôvodný antigén s časťou funkcií alebo so všetkými funkciami, použiteľnosťou a vlastnosťami pôvodného polypeptidu podľa vynálezu.

Protilátky podľa vynálezu zahrnujú tak polyklonálne, ako aj monoklonálne protilátky.

Protilátka alebo jej fragmenty môžu byť monošpecifické (polyklonálne). Monošpccifickú protilátku možno pripraviť injektovaním veľmi čistého preparátu polypeptidu podľa vynálezu do vhodného zvieraťa. Potom môže nasledovať jedna alebo viac injekcií zosilňujúcich účinok vo vhodných intervaloch pred prvým odberom krvi. Zvieratám sa odoberá krv okolo 5 - 7 dní po každej imunizácii. Protilátky možno optimálne izolovať zo séra použitím štandardných protilátkových purifikačných techník.

Zviera použité na preparáciu protilátok viažucich sa k polypeptidu podľa vynálezu sa preferenčne vyberie zo skupiny pozostávajúcej z králika, opice, ovce, kozy, myši, potkana, ošípanej, koňa a morčaťa. Bunky, ktoré produkujú protilátky, môžu byť slezinové bunky alebo lymfocyty periférnej krvi.

Monoklonálna protilátka alebo jej fragmenty môžu byť vytvorené proti základnej zložke polypeptidu, t. j. epitopu. Monoklonálna protilátka môže byť produkovaná konvenčnými technikami (Kôhler a Milstein, 1975) použitím hybridómovej bunkovej línie, alebo ich klonmi a subkionmi, alebo bunkami nesúcimi genetickú informáciu z hybridómovej bunkovej línie, produkujúcej uvedenú monoklonálnu protilátku. Monoklonálna protilátka môže byť produkovaná fúzovaním buniek produkujúcich uvedenú monoklonálnu protilátku s bunkami vhodnej bunkovej línie a klonovaním výsledných hybridómových buniek produkujúcich uvedenú monoklonálnu protilátku. Alternatívne môže byť monoklonálna protilátka produkovaná nesmrteľnou nefúzovaňou bunkovou líniou produkujúcou uvedenú monoklonálnu protilátku. Monoklonálne protilátky sú nakoniec získané z bunkového kultivačného média. Hybridómové bunky použité na tvorbu monoklonálnej protilátky môžu byť pestované „in vitro“ alebo v telesnej dutine zvieraťa. Monoklonálna protilátka alebo jej fragmenty sa môžu tiež pripravovať použitím techník rekombinantnej DNA (Huse a spol., 1989).

Monoklonálne protilátky môžu byť tiež produkované imunizovaním vhodných zvierat nepurifikovaným preparátom polypeptidu podľa vynálezu. Výsledné hybridómové klony sekretujúce monoklonálne protilátky by sa mali triediť podľa ich schopnosti viazať polypeptid(y) alebo jeho analóg.

Na účely nevyžadujúce vysokú špecificitu môže byť protilátka polyklonálna. Polyklonálne protilátky sa môžu získať napr. tak, ako to opísali Harboe a Ingild, pozri skôr. Špecifickejšie, ak sa majú získať polyklonálne protilátky, do zvieraťa sa injektuje polypeptíd podľa vynálezu alebo jeho analóg, prednostne po pridaní vhodného adjuvans, ako napr. Freundovho nekompletného alebo kompletného adjuvans. Zvieratám je pravidelne odoberaná krv, napr. v týždňových intervaloch a zo získanej krvi sa separuje frakcia séra obsahujúca protilátku a táto frakcia sa podrobuje ďalším konvenčným procedúram purifíkácie protilátky a/alebo procedúram zahrnujúcim použitie purifíkovaného polypeptidu alebo jeho analógu.

Protilátka môže byť tiež anti-antiidiotypová, nasmerovaná proti antiidiotypovej protilátke, ktorá je reaktívna s epitopom na antigén. Antiidiotypová protilátka môže byť pripravená podobnou metódou, aká je opísaná pre monoklonálnu alebo polyklonálnu protilátku.

Súčasťou predkladaného vynálezu je aj protilátka, ktorá sa viaže k látke alebo opísanému polypeptidu, osobitne protilátka, ktorá sa viaže špecificky k polypeptidu majúcemu nasledovnú Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn sekvenciu aminokyselín.

V širokom aspekte vynález sa týka aj látky, ktorá je schopná neutralizovať jednu alebo viac aktivít a) až j) hlL-10, t. j. majúcej aktivitu antagonistu hIL-10, akou je aj protilátka majúca tieto vlastnosti. Je známa monoklonálna protilátka 19F1 (82), ktorá je schopná špecificky sa viazať k IL-10 a môže blokovať endogénny IL-10 produkovaný LPS stimulovanými monocytmi, pozri tabuľka 1 (82). Táto protilátka rozpoznáva natívne zvinutý IL-10, ale nie nevyhnutne celú jeho funkčnú doménu, nakoľko táto protilátka špecificky neviaže IT9302.

Do rozsahu predkladaného vynálezu tiež spadá farmaceutická kompozícia obsahujúca takúto látku a tiež farmaceutická kompozícia obsahujúca látku alebo polypeptíd podľa vynálezu.

Veľmi dôležitý aspekt vynálezu sa týka farmaceutickej kompozície, ktorá obsahuje látku majúcu aktivitu agonistu hIL-10 alebo aktivitu antagonistu hlL-10 podľa definície, a farmaceutický akceptovateľný excipient. Prípravok môže obsahovať syntetizovanú bielkovinu alebo purifikovaný rekombinantný polypeptíd, monoklonálnu alebo polyklonálnu protilátku alebo hocijakú inú látku, ktorá spĺňa kritériá a) až j) alebo, ak má aktivitu agonistu hIL-10 je schopná neutralizovať jednu alebo viac aktivít a) až j) hIL-10.

Agonista alebo antagonista IL-10 použitý v tomto vynáleze sa môže pripraviť ako formulácia vo farmaceutický akceptovateľnom médiu, napríklad ako soľná formulácia, vo fosfátovej tlmivej soli (PBS, phosphate buffered saline), v Ringerovom roztoku, v dextrózovej/soľnej formulácii, v Hankovom roztoku a v glukóze. Prípravky môžu obsahovať farmaceutický akceptovateľné pomocné látky potrebné na priblíženie fyziologických podmienok, ako aj pufrujúce zložky, tonicitu nastavujúce zložky, zvlhčovadlá, detergenty a podobne. Aditíva môžu tiež obsahovať ďalšie aktívne ingrediencie, napr. baktericídne zložky alebo stabilizátory. Množstvo podávané pacientovi sa bude meniť v závislosti od toho, čo bolo podávané, od účelu podávania, či ide o profylaxiu alebo liečbu, od stavu hostiteľa, od spôsobu podávania a podobne.

Farmaceutické prípravky sú typicky určené na transdermálne alebo parenterálne podávanie, napr. intravenózne, podkožnéy alebo vnútrosvalovo. Orálne formy podávania sú tiež možné a možno ich poskytovať modifikovaním prípravku tak, aby sa obchádzalo prostredie žalúdka. Prípravok sa môže použiť na profylaktickú a/alebo terapeutickú liečbu. Farmaceutické prípravky sa podávajú preferenčne intravenózne. Vynález poskytuje prípravky, ktoré obsahujú látku IL-10 agonistu alebo antagonistu, rozpustenú alebo suspendovanú v akceptovateľnom nosiči, prednostne vo vodnom nosiči. Tieto prípravky možno sterilizovať konvenčnými sterilizačnými technikami alebo sa dajú sterilné filtrovať.

Výsledné vodné roztoky môžu byť adjustované samy osebe, alebo lyofilizované. Lyofilizované preparáty sa pred podávaním kombinujú so sterilným vodným nosičom. Agonistu alebo antagonistu IL-10 možno podávať s druhým biologicky aktívnym činidlom, ako aj so štandardným chemoterapeutickým činidlom. Takéto činidlá zahrnujú, ale nie sú limitované na vinkristín, daunorubicín, L-asparaginázu, mitoxantrón a amsakrín.

V terapeutických aplikáciách farmaceutické prípravky sa podávajú pacientovi v množstvách vhodných na vyvolanie požadovaného účinku, definovaných ako „terapeuticky účinné dávky“. Terapeuticky účinná dávka IL-10 agonistu alebo antagonistu sa bude meniť, napr. podľa osobitného použitia v danej liečbe, spôsobu podávania, zdravotného stavu pacienta a podľa uváženia predpisujúceho lekára. Napr. dávka na kontinuálnu infúziu bude typicky v rozsahu od približne 500 ng do približne 800 pg denne u pacienta s hmotnosťou 70 kg, výhodne medzi približne 10 pg a približne 300 pg. Dávka bude typicky medzi 700 ng/kg/deň a 16 pg/kg/deň.

Koncentrácia IL-10 agonistu alebo antagonistu vo farmaceutických formuláciách sa môže meniť v širokom rozsahu, t. j. od približne 10 pg do približne 5 mg/ml, prednostne medzi približne 100 pg a približne 2 mg/ml. Koncentrácia sa obvykle zvolí primáme podľa objemu tekutiny, viskozity atď. v súlade s osobitným spôsobom podávania. Tak napr. typická farmaceutická kompozícia na intravenóznu infúziu obsahuje 2,5 mg IL-10 agonistu alebo antagonistu v 250 ml dextrózového/soľného roztoku.

Na tuhé prípravky sa môžu používať konvenčné netoxické tuhé nosiče, ako napr. farmakologicky čistý manitol, laktóza, škrob, stearát horečnatý, sodná soľ sacharínu, mastenec, celulóza, glukóza, sacharóza, uhličitan horečnatý a podobne. Na orálne podávanie sa farmaceutický akceptovateľný netoxický prípravok vytvorí inkorporovaním bežne používaných prímesí, ako aj uvedených nosičov a všeobecne 10 - 90 % aktívnej zložky, výhodnejšie 25 - 70 % IL-10 agonistu alebo antagonistu.

Na aerosólové podávanie sa IL-10 agonista alebo antagonista výhodnejšie dodávajú v jemne dispergovanej forme spolu s povrchovo aktívnou látkou a kondenzovaným hnacím plynom. Typické percento IL-10 agonistu alebo antagonistu je 0,01 - 20 % hmotn., výhodnejšie 1 - 10 % hmotn. Povrchovo aktívna látka musí byť samozrejme netoxická a výhodnejšie rozpustná v kondenzovanom hnacom plyne. Reprezentantmi takýchto činidiel sú estery alebo čiastočné estery mastných kyselín obsahujúcich od 6 do 22 uhlíkových atómov, ako kyselina kaprónová, oktánová, laurová, palmitová, stearová, linolová, linolénová, oleostearová a olejová, s alifatickým polyhydroxyalkoholom alebo jeho cyklickým anhydridom, ako je napr. etylénglykol, glycerol, erytritol, arabitol, manitol, sorbitol, hexitolové anhydridy odvodené zo sorbitolu a polyoxyetylénové a polyoxypropylénové deriváty týchto esterov. Môžu sa používať zmiešané estery, ako aj zmiešané alebo prirodzené glyceridy.

Povrchovo aktívna látka môže tvoriť 0,1 - 20 % hmotn. kompozície, výhodnejšie 0,25 - 5 % hmotn. Zvyšok prípravku je obvykle kondenzovaný hnací plyn. Skvapalnené hnacie plyny sú typické plyny za bežných podmienok a sú kondenzované pod tlakom. Medzi vhodné skvapalnené hnacie plyny patria nižšie alkány obsahujúce až 5 uhlíkov, ako napr. bután a propán a prednostne fluórované a fluorochlórované alkány. Používajú sa aj ich zmesi. Pri príprave aerosólu sa kontajner vybavený vhodným ventilom naplní primeraným kondenzovaným hnacím plynom, ktorý obsahuje jemne dispergovaný polypeptid(y) a povrchovo aktívnu látku. Zložky sú takto uchovávané pri zvýšenom tlaku až do uvoľnenia pôsobením ventilu.

Na zvýšenie polčasu života séra môže byť IL-10 agonista alebo antagonista enkapsulovaný, zavedený do lúme nu lipozómov, pripravených ako koloid, alebo sa môžu použiť iné konvenčné techniky, ktoré zabezpečujú predĺženie životnosti polypeptidov. V niektorých uskutočneniach teda môže byť IL-10 agonista alebo antagonista enkapsulovaný v lipozóme. Na prípravu lipozómov je k dispozícii veľa metód, ako je napríklad uvedené v (83), (84), (85) a (86).

Jedno dôležité uskutočnenie vynálezu sa teda týka použitia látky na zníženie alebo neutralizáciu vysokej koncentrácie hIL-10 a/alebo vIL-10, ako aj použitia látky majúcej vlastnosti antagonistu IL-10 na výrobu farmaceutického prípravku na liečenie alebo profylaxiu rakoviny vaječníka a/alebo AIDS (87, 19).

Súčasťou vynálezu je tiež spôsob liečby alebo prevencie rakoviny vaječníka a/alebo AIDS, metóda, zahrnujúca podávanie terapeuticky a profylaktický účinného množstva látky IL-10 antagonistu pacientovi a tiež použitie zlúčeniny, ktorá má aktivitu hIL-10 agonistu, na výrobu farmaceutického prípravku na liečenie alebo profylaxiu rakoviny vaječníka a/alebo AIDS.

Použitie látky podľa predkladaného vynálezu

V súlade s predkladaným vynálezom sa zistilo, ako je to opísané, že IT9302 a jeho analógy a varianty sú užitočné na zabránenie účinkov cytokínov, o ktorých je známe, že sú patogeneticky obsiahnuté v skôr opísaných patalogických stavoch.

Preto sa skúmali možnosti terapie použitím polypeptidu podľa vynálezu alebo jeho analógov a derivátov a mali by sa preskúmať pri všetkých chorobách, v ktorých sa očakáva terapeutický účinok hIL-10 a/alebo IRAP (pozri tabuľka 3).

Veľmi dôležité uskutočnenia vynálezu sa týkajú látky alebo polypeptidu podľa vynálezu na liečenie alebo profylaxiu jednej alebo viac chorôb uvedených v tabuľke 3, použitia látky alebo polypeptidu podľa vynálezu na výrobu farmaceutického prípravku na liečenie a profylaxiu jednej alebo viac chorôb uvedených v tabuľke 3, a tiež spôsobu liečby a/alebo prevencie jednej alebo viac chorôb uvedených v tabuľke 3, metódy zahrnujúcej podávanie terapeuticky alebo profylaktický účinného množstva látky alebo polynukleotidu podľa vynálezu pacientovi.

Jedným dôležitým aspektom vynálezu je teda použitie IT9302 alebo jeho funkčného derivátu na výrobu farmaceutickej kompozície na podstatné inhibovanie biologického účinku u ľudí súvisiaceho s cytokínom, ako je lymfokín, interleukin, monokín, chemokínu, interferón, kolónie stimulujúci faktor, prostaglandín a/alebo leukotrién, na profylaxiu alebo liečbu stavu súvisiaceho s poruchou cytokínového systému, ako je lymfokínový, interleukínový, monokinový, chemokínový, interferónový systém, systém kolónie stimulujúceho faktora a/alebo s poruchou v prostaglandínovom a/alebo leukotriénovom systéme. Použitý výraz „farmaceutická kompozícia“ zahrnuje hocijakú kompozíciu vhodnú na humánne použitie, ako je podrobne uvedené.

Vynález sa hlavne týka použitia IT9302 alebo jeho funkčných derivátov na podstatné inhibovanie biologického účinku u ľudí súvisiaceho s cytokínom na profylaxiu alebo liečbu stavu súvisiaceho s poruchou cytokinového systému a/alebo na podstatné inhibovanie biologického účinku u ľudí súvisiaceho s lymfokínom na profylaxiu alebo liečbu stavu súvisiaceho s poruchou lymfokínového systému a/alebo na podstatnú inhibíciu biologického účinku u ľudí súvisiaceho s interleukínom na profylaxiu alebo liečbu stavu súvisiaceho s poruchou interleukínového systému a/alebo na podstatné inhibovanie biologického účinku u ľudí súvisiaceho s monokínom na profylaxiu alebo liečbu stavu súvisiaceho s poruchou monokínového systému a/alebo na podstatné inhibovanie biologického účinku u ľudí súvisiaceho s chemokínom na profylaxiu alebo liečbu stavu súvisiaceho s poruchou chemokínového systému a/alebo na podstatné inhibovanie biologického účinku u ľudí súvisiaceho s lymfokinom na profylaxiu alebo liečbu stavu súvisiaceho s poruchou lymfokínového systému a/alebo na podstatné inhibovanie biologického účinku u ľudí súvisiaceho s interferónom na profylaxiu alebo liečbu stavu súvisiaceho s poruchou interferónového systému a/alebo na podstatné inhibovanie biologického účinku kolónie stimulujúceho faktora u ľudí na profylaxiu alebo liečbu stavu súvisiaceho s poruchou systému kolónie stimulujúceho faktora a/alebo na podstatné inhibovanie biologického účinku prostaglandínu u ľudí na profylaxiu alebo liečbu stavu súvisiaceho s poruchou prostaglandínového systému a/alebo na podstatné inhibovanie biologického účinku leukotriénu u ľudí na profylaxiu alebo liečbu stavu súvisiaceho s poruchou leukotriénového systému.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 ukazuje porovnanie predpovedaných aminokyselinových sekvencií mIL-10, hIL-10 a BCRF1. Identity aminokyselinových sekvencií sú indikované zvislými čiarami.

Obr. 2 ukazuje COOH terminálové polypeptidové sekvencie IL-10 zahrnujúce 9 aminokyselín a porovnanie prasacích, ľudských, BCRF1 a myších proteínov.

Obr. 3 je diagram ukazujúci, že IT9302 inhibuje spontánnu produkciu IL-8 čistenými kultivovanými ľudskými monocytmi.

Obr. 4 je diagram ukazujúci, že IT9302 inhibuje IL-1 indukovanú (1 ng/ml) IL-8 produkciu ľudskými jednojadrovými bunkami periférnej krvi.

Obr. 5 ilustruje produkciu IRAP ľudskými monocytmi stimulovanými IT9302.

Obr. 6 ilustruje produkciu IRAP ľudskými monocytmi stimulovanými IL-10.

Obr. 7 ilustruje chemotaktickú aktivitu IT9302 na CD8+ T-bunkách.

Obr. 8 ilustruje znecitlivenie CD8+ T-buniek pomocou IT9302 vedúce ku strate citlivosti CD8+ T-buniek proti IL-10(10 ng/ml) indukovanej chemotaxii.

Obr. 9 ilustruje potlačenie aktivity IL-8 pomocou IT9302.

Obr. 10 je diagram ukazujúci, že IT9302 inhibuje MCAF/MCP-1 indukovanú chemotaxiu monocytov.

Obr. 11 ukazuje IL-4 produkciu v CD4+ T-bunkových cytosólických frakciách pri ECL - Westem blotingu.

Obr. 12 ukazuje produkciu TNF-α v cytosólových frakciách ľudských zmiešaných lymfocytov pri ECL - Westem blotingu. TNF-α Westem bloting bol uskutočnený ako IL-4 bloting, opísaný v Materiáloch a metódach, ale použitím králičích protilátok proti ľudskému TNF-α (Pepro Tech. Inc., Londýn, Anglicko) a chrenovou peroxidázou značenými sekundárnymi protilátkami (Cat. no. P 217, Dáko, Dánsko).

Obr. 13 ukazuje, že LPS indukovaný šok a leukopénia sú modulované pomocou IT9302, ako sa ukázalo pri úplnom spočítaní leukocytov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vývoj IL-10 homológneho nonapeptidu s aktivitou ako IL-10;.

Čiastočné sekvencie hIL-10, majúce dĺžku 9 aminokyselín, sa vybrali podľa princípu, že sekvencie by mali mať vysokú homológiu medzi vIL-10 a hIL-10, ale čo najnižšiu homológiu k mIL-10. Táto stratégia sa zakladala na skutočnosti, že vIL-10 skrížené reaguje čiastočne s hIL-10, kým mIL-10 nereaguje skrížené s hIL-10 (pozri vyššie). Takto sekvencie hIL-10 zodpovedné za niektoré aktivity v ľudskom organizme môžu byť lokalizované v doménach, kde je vysoká homológia medzi hIL-10 a vIL-10 a nie vo vzťahu ku mIL-10.

Predpokladá sa, že signálny polypeptid hIL-10 pozostáva z prvých 18 aminokyselín. Hotový proteín začína od 19. aminokyseliny (č. 1 vo funkčnej bielkovine, je to serín) a celý proteín obsahuje 160 aminokyselín. Prezeraním ľudských a vírusových IL-10 COOH-koncových sekvencií a hlavne pozícií 157 a 159, obsahujúcich lyzínový a arginínový zvyšok, sa zistilo, že táto doména je vhodná na to, aby bola čiastočne zodpovedná za väzbu k receptoru (obr. 1 a 2)·

Po skríningu IL-10 aktivity viacerých kandidátov získaných chemickou syntézou bolo zistené, že syntetický nonapeptid IT9302 mal určité imunosupresívne aktivity, ktoré napodobňujú hIL-10, ako sa to opisuje podrobne v ďalších príkladoch. IT9302 zodpovedá nonapeptidovej sekvencií z C-terminálového konca hIL-10 s nasledovnou aminokyselinovou sekvenciou:

NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asn-COOH (SEKV ID Č: 1)

IT9302 má 100 % homológiu so segmentom hIL-10 zodpovedajúcim aminokyselinám č. 152 až 160 pri C-terminálovom konci. Okrem toho táto polypeptidová sekvencia má 6 aminokyselín spoločných s vírusovým vIL-10 v zodpovedajúcej oblasti, pozri obr. 1. a 2., čo znamená, že 6 z 9 alebo 66 % aminokyselín je homologických, ako sa to tu definovalo a 4 aminokyseliny sú spoločné s mIL-10, t. j. 4 z 9 alebo 44 %. Tento nonapeptid je jedinou sekvenciou získanou alebo odvodenou z hIL-10 a doteraz preskúmanou, ktorá má špeciálne vlastnosti demonštrované v príkladoch. Až doposiaľ nikto nepoukázal na túto sekvenciu ako na funkčnú doménu.

Materiály a metódy Cytokíny a chemoatraktanty

Rekombinantný hIL-10 sa získal od Pepro Tech Inc., NJ. (Cat. No. 200 10). Rekombinantný hIL-1 β a rekombinantný hIL-8 boli láskavým darom Dainippon Pharmaceutical Company, Osaka, Japonsko. Kultivačným médiom bolo RPMI 1640 GIBCO, bez LPS, podľa stanovenia lyzátu Limulusových amébocytov (Sigma E-TOXATE Kit Cat. No. 210-A1). rhMCAF/MCP-1 bol milým darom od profesora Kouji Matsushimu, Kanazawa, Japonsko.

Stanovenie chemotaxie leukocytov Chemotaxia T-buniek

CD4+ a CD8+ T-lymfocytové podskupiny, charakterizované expresiou buď CD4, alebo CD8 antigénov, boli purifikované z heparínovanej krvi pravidelných darcov. Jednojadrové bunky periférnej krvi (PBMC) boli purifikované zo 100 ml heparínovanej krvi po zriedení Hanksovým rovnovážnym soľným roztokom (HBSS) v pomere 1 : 1 a potom separované navrstvením buniek na Lymphopac™ (Nycomed Pharma, Oslo, Nórsko) a následnou 20 minútovou gradientovou centrifugáciou pri 2000 ot/min. Jednojadrové bunky boli premývané 3-krát v HBSS a bunkové pelety boli rozriedené v 4 ml HBSS obsahujúceho 1 % fetálneho teľacieho séra a boli triedené pri 4 °C použitím sklenených guľôčok (Dynabeads M-450 CD4 Cat. No. 111.16, Dynabeads M-450 CD8 Cat. No. 111.08, DERACHa-BEAD Cat. No. 125.04) s povrchovo naviazanou monoklonálnou protilátkou proti CD4 alebo CD8 antigénu. Pomer guľôčka : : bunka bol 10 : 1 a inkubačný čas bol 1 hodina. Guľôčky boli oddelené pridaním polyklonálnej antimyšej protilátky podľa návodu výrobcu.

Stanovenie chemotaxie bolo uskutočnené 48-jamkovou mikrokomôrkovou technikou (Neuroprobe, Rockville, MD), ako to bolo opísané skôr (74; pozri ref. 3 a ref. 14). Chemoatraktanty boli riedené v RPMI 1640 (GIBCO Cat. No. 61870-010) 1 %-ným sterilným filtrovaným fatálnym teľacím sérom a boli umiestnené v dolnej 25 μΐ komôrke. V prípade určovania T-bunkovej chemotaxie, T-bunky (5 x 10^s/ml) boli suspendované v médiu a 50 μΐ sa umiestnilo v hornej komôrke oddelenej od dolnej komôrky polykarbonátovým filtrom bez polyvinylpyrolidónu s veľkosťou pórov 5 pm (Nucleopore Corp., Pleasanton, CA) pokrytého kolagénom typu IV (Sigma Cat. No. C 0543). Bunky sa nechali migrovať 2 hodiny pri 39 °C a v prítomnosti 5 % CO₂. Filtre boli potom opatrne odstránené, fixované v 70 %-nom metanole a vyfarbené 5 minút v Coomassie Brilliant Blue. Bunky prichytené k dolnému povrchu filtra boli spočítané meraním ich plochy použitím videokamery na mikroskope pripojenej k počítačovému systému na digitálnu analýzu a podporovaného softvérom na objektívne určenie chemotaktickej migrácie. Približne 5 % T-buniek bude migrovať spontánne, čo zodpovedá 12 000 až 13 000 bunkám; to sa môže meniť zo dňa na deň, ale len veľmi málo v experimentoch vykonaných v ten istý deň. Ako už bolo opísané skôr (ref. 3 a ref. 14), bolo rozhodnuté zverejňovať výsledky pomerom medzi počtom buniek migrujúcich vo vzorke a v negatívnej kontrole, ktorý odzrkadľuje spontánnu migráciu. Tento pomer sa nazýva chemotaktický index (Cl). Všetky vzorky boli analyzované trojmo a bunková migrácia v každej jamke bola meraná v troch poliach pred tým ako bola určená priemerná hodnota plochy. V niektorých experimentoch chemotaktická membrána nebola pokrytá kolagénom a v takomto testovacom systéme budú preto migrujúce bunky padať na dno dolnej jamky chemotaktickej komôrky.

V jednom experimente bola chemotaktická aktivita IT9302 na CD8+ T-bunky vykonaná testovaním série riedení IT9302 pridaných do spodnej komôrky a vyhodnotením chemotaxie, ako je to opísané.

V druhom experimente sa študovala schopnosť IT9302 znecitlivovať migráciu CD8+ T-buniek ako odpoveď na rhIL-10 (10 ng/ml) pridaním IT9302 ku cieľovým bunkám 30 minút pred chemotaxiou. IT9302 sa pridával v sérii rôznych koncentrácií a chemotaktická odpoveď rhIL-10 sa vyhodnotila, ako je to opísané.

V treťom experimente sa študovala schopnosť IT9302 potláčať chemotaktickú odpoveď CD4+ T-buniek na rhIL-8 (10 ng/ml), pridaním IT9302 k cieľovým bunkám 30 minút pred vykonaním chemotaxie. IT9302 sa pridával v sérii rôznych koncentrácií a chemotaktická odpoveď na rhIL-10 sa vyhodnotila, ako je to opísané.

Chemotaxia monocytov

Monocytová chemotaxia sa merala použitím rovnakého Boydenovho komôrkového prístroja, aký bol opísaný pre T-bunky. Chemoatraktant MCAF/MCP-1 bol riedený v médiu RPMI 1640 s 0,5 % BSA a pridaný bol do dolnej komôrky pri koncentrácii 10 ng/ml. Monocyty čistené štandardnou adherenčnou metódou z normálnych ľudských PBMC, získaných tak, ako je opísané, boli suspendované v RPMI 1640 médiu s 0,5 % BSA a potom inkubované 30 minút v prítomnosti IT9302 pri rôznych koncentráciách. Následne potom boli bunky pridané do horných chemotaktických komôrok pri koncentrácii 10⁶ buniek/ml. Horné a dolné komôrky boli oddelené polybarbonátovým filtrom bez polyvinylpyrolidónu s veľkosťou pórov 8 pm (Nucleopore, Pleasaton, CA). Komôrka bola inkubovaná 90 minút pri 37 °C. Membrámy, ktoré obsahovali migrujúce bunky boli spracované tak, ako je to opísané a chemotaktický index sa vypočítal metódou, ktorá je opísaná.

Produkcia IL-8 normálnymi ľudskými jednojadrovými bunkami periférnej krvi (PBMC)

PBMC boli purifikované z heparínovanej krvi pravidelných ľudských darcov. Po gradientovej centrifugácii s Lymphoprep™ (Nycomed Pharma, Oslo, Nórsko), jednojadrové bunky riedené na 2 x 10⁶ buniek/ml v médiu RPMI 1640 bez LPS(Gibco Cat. No. 6187-010) obsahujúcom 1 % sterilného filtrovaného tepelne inaktivovaného fetálneho teľacieho séra, penicilín (10 000 ΙΕ/ml), streptomycín (10 mg/ml) a gentamycín (2,5 mg/ml). Bunky boli kultivované v 24-jamkových mikroplatničkách (Nunc Micro Plates, Nunc, Dánsko) a v prítomnosti rôznych koncentrácií IT9302 (0,1 ng/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml) počas 24 hodín. Po 24 hodinovej inkubácii sa ešte raz pridala ďalšia dávka a o hodinu neskôr bol pridaný rhIL-1 β (1 ng/ml) do bunkových kultúr. Supematanty sa zbierali po celkovej 48 hodinovej inkubácii a koncentrácia sekretovaného IL-8 bola meraná pomocou IL-8 ELISA testu použitím súpravy IL-8 ELISA (Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd, Osaka, Japonsko). V krátkosti, štandardy a bunkové supematanty sa dvojmo inkubovali 1 hodinu pri 20 °C na mikroplatničkovej trepačke. Potom po premytí sa pridala druhá protilátka na jednu hodinu a nasledovala jednohodinová inkubácia s peroxidázou označeným kozím anti-králičím IgG. Po premytí bola reakcia vyvolaná O-fenyléndiamínom. O tridsať minút neskôr bola reakcia zastavená 1,6 N kyselinou sírovou. Optická hustota (OD) sa merala v ELISA čítači pri 490 nm. Koncentrácia IL-8 sa vypočítala pomocou kalibračnej krivky absorbancie neznámej koncentrácie proti koncentráciám IL-8 štandardov.

Určenie koncentrácie IRAP

PBMC boli purifikované, ako bolo opísané. PBMC boli kultivované v RMPI 1640, 10 %-nom sterilnom, tepelne-inkubovanom fetálnom teľacom sére (obsahujúcom penicilín 10 000 ΙΕ/ml, streptomycín 10 mg/ml a gentamycín 2,5 mg/ml) a koncentrácia buniek bola 5 x 10⁶ buniek/ml. Monocyty sa potom purifikovali štandardnou technikou plastickej adherencie. Potom sa monocyty kultivovali v RPMI 1640 s 2 %-ným FCS (2,5 x 10⁶ buniek/ml) a s rôznymi riedeniami rhIL-10 alebo IT9302. Bunky boli stimulované počas 24 hodín a supematanty sa zbierali na IRAP stanovenie. IRAP ELISA sa vykonala použitím „Human

IL-lra Quantikin Immunoassay Kit“ od R&D Systems Európe Ltd. (Cat. No. DRA 00, Abingdon, Oxon, Anglicko).

Stanovenie II triedy MHC antigénavej expresie pri monocytoch

PBMC boli purifikované ako je to opísané a monocyty boli izolované technikou plastickej adherencie. Monocyty sa potom kultivovali v RPMI 1640 s 2 %-ným FCS obsahujúcim penicilín 10 000 IE/ml, streptomycín 10 mg/ml, gentamycín 2,5 mg/ml) pri koncentrácii buniek 3xl0⁶ /ml. Bunky boli stimulované počas 40 hodín v mikropriehradkách (Nunc, Dánsko) so 100 ng/ml rhIL-10, alebo IT9302 1 pg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml. Na konci stimulácie sa supernatanty odstránili a bunky boli oddelené od plastického povrchu zmrazením pri -20 °C počas 20 minút. Bunky sa zbierali v 1 ml vychladeného HBSS s 1 %-ným FCS a boli triedené pri 20 °C použitím 50 μΐ/ml Dynabeads M 450, pokrytých naviazanou monoklonálnou protilátkou proti β-reťazcu II triedy HLA (Cat. No. 210.03). Po 20 minútach inkubácie sa bunky 3-krát premyli ochladeným HBSS s 1 %-ným FCS a zbierali sa na magnetickom separačnom zariadení. Bunky boli zriedené v uvedenom tlmivom roztoku, vyfarbené metylénovou modrou a spočítali sa ružicovité bunky (bunky nesúce Dynabeads s mAb II triedy HLA).

Určenie IL-4 produkcie CD4+ T-lymfocytmi Bunkové kultúry

CD4+ T-lymfocyty sa purifikovali z heparínovanej normálnej ľudskej krvi. Po gradientovej centrifugácii pri použití Lymphoprep™ (Nycomed Pharma, Oslo, Nórsko) sa jednojadrové bunky ďalej triedili pri 4 °C použitím guľôčok Dynabeads (Dynal AS, Nórsko) pokrytých monoklonálnymi protilátkami proti CD4. Guľôčky boli oddelené pridaním polyklonálnej anti-myšej protilátky (Dynal AS, Nórsko). Podľa FACS analýzy čistota pozitívne selektovaných buniek bola vyššia ako 99 %. Pri skúmaní produkcie IL-4 „de novo“ v T-bunkách stimulovaných IL-8, tvorili T-bunky kultúry 5 x 10^ϋ buniek/ml v RPMI 1640 bez LPS (Gibco Cat. No. 61870-010) obsahujúcom 1 % sterilné filtrovaného tepelne inaktivovancho fetálneho teľacieho séra (FCS), penicilín (10 000 IU/ml), streptomycín (10 mg/ml) a gentamycín (2,5 mg/ml). T-bunky boli stimulované 3 dni použitím rIL-8 (100 ng/ml), rIL-10 (100 ng/ml), IT9302 (10 ng/ml) a IFN-γ (10 ng/ml). Re-kombinantný ľudský IL-8 (rhIL-8) bol láskavým darom Dainippon Pharmaceuticals Co. Ltd., Osaka, Japonsko a IFN-γ bol zakúpený od Boehringer Ingelheim Am Rhein, Nemecko. Na dosiahnutie špecifickej inhibície IL-8 stimulácie sa používa neutralizujúca anti-IL-8 protilátka (WS,4), (priateľský dar od Dr.

K. Matsushimu, Japonsko). Rekombinantný IL-10 bol zakúpený od Pepro Tech. Inc.(London, Anglicko).

Príprava bunkového materiálu a kultivačného supernatantu pre gélovú elektroforéza.

Kultivované T-bunky a kultivačné médiá boli oddelené centrifugáciou pri 2000 ot/min počas 5 minút. Supematanty boli lyofllizované a potom rozpustené v 100 μΐ tlmivého roztoku pre lýzu. Bunky boli resuspendované priamo v 100 μΐ tlmivého roztoku pre gélovú lýzu (9). Do ďalšieho skúmania bol materiál uchovávaný pri -80 °C.

ECL-Western bloting bielkovín pochádzajúcich z CD4+ T-buniek

Bunky alebo lyofllizované supernantanty bunkových kultúr sa použili na určenie obsahu IL-4 bielkoviny. Bielkoviny z jednorozmerných 15 %-ných SDS-PAGE gélov sa blotingom preniesli na Hybond-ECL nitrocelulózové mem brány (Amersham RPN 2020D, UK) a boli blokované 5 %-ným hovädzím sérovým albumínom (Sigma) v Tris tlmivom roztoku pH 7,8 obsahujúcom 0,1 % Tween-20. Takto preparované nitrocelulózové membrány sa potom inkubovali s polyklonálnou kozou protilátkou proti ľudskému IL-4 (R&D Systems, Anglicko) a následne chrenovou peroxidázou značenou sekundárnou protilátkou (Cat. no. RPN 2106 ECL, Amersham, UK) a imunostanovenie sa detegovalo exponovaním filmu (Kodak X-OMAT-S, USA) počas 90 sekúnd.

Specificita aminokyselinovej sekvencie IT9302

Hľadanie možnej homológie sekvencie IT9302 s inými známymi bielkovinami sa uskutočnilo hľadaním v bielkovinovej databáze EMBO za priateľskej pomoci Dr. Henrika Leffersa, Inštitúte for Medical Biochemistry, University of Aarhus, Dánsko.

Aminokyselinová sekvenčná specificita IT9302

Podľa informácie z bielkovinovej databázy EMBO (Heidelberg) získanej 10. júna 1994, IT9302 má 100 %-nú homológiu so sekvenciou ľudského IL-10 a 75 %-nú so sekvenciou bielkoviny odvodenej z Epstein-Barrovho vírusu, ktorá je identická s vIL-10. Iné vírusové bielkoviny, ako napr. z fágu T7 alebo z vírusu žltej listovej kučeravosti paradajok mali 75 %-nú, resp. 85 %-nú identitu.

lysledky

Koncepcia vynálezu vznikla v októbri a novembri 1992, keď sa navrhol nonapeptid označený ako IT9302 podľa načrtnutej stratégie a o chemickej syntéze sa rozhodlo 27. 11. 1992. Očakávalo sa, že tento nonapeptid by mohol mať imunomodulátorové aktivity, z ktorých niektoré by mohli napodobňovať aktivitu podobnú IL-10 a počas tohto obdobia sa plánovali aj kontrolné experimenty. Chemická syntéza IT9302 sa uskutočnila použitím automatického polypeptidového syntetizátora v spoločnosti Carlbiotech Ltd. A/S, Dánsko, ako vynálezcami platená zákazka. Potom sa bielkovina purifikovala na HPLC a potvrdilo sa, že jej čistota presiahla 95 %. Toto potvrdilo, že syntetický produkt bol identický s IT9302 navrhnutou vynálezcami v októbri a novembri 1992.

PRÍKLAD 1

IT9302 indukovaná inhibícia spontánnej produkcie IL-8 ľudskými monocytmi

Test bol vykonaný tak, ako sa to opisuje v časti „Produkcia IL-8 normálnymi ľudskými jednojadrovými bunkami periférnej krvi (PBMC)“. Monocyty sa purifikovali plastickou adherenčnou technikou a 3,0 x 10⁶ buniek/ml sa stimulovalo počas 40 hodín. Ako znázorňuje obr. 3, IT9302 inhiboval produkciu IL-8 monocytmi a pri koncentrácii 0,1 ng/ml IT9302 produkcia IL-8 bola potlačená na 35 % spontánnej produkcie v podmienkach „in vitro“. Životaschopnosť buniek presahovala vždy 80 % po 1 dni kultivovania a pridanie IT9302 neovplyvnilo v tomto a ani v ďalších experimentoch životaschopnosť pri žiadnej koncentrácii IT9302 v rozmedzí 0,1 až 1 000 ng/ml (IT9302 M. Hm.: 1127 daltonov, rhIL-10 vypočítaná M. Hm.: 18 400 daltonov).

PRÍKLAD 2

1T9302 indukovaná inhibícia IL-Ιβ indukovanej produkcie IL-8 ľudskými jednojadrovými bunkami periférnej krvi

Test bol vykonaný tak, ako sa to opisuje v časti „Produkcia IL-8 normálnymi ľudskými jednojadrovými bunkami periférnej krvi (PBMC)“. Ako ukazuje obr. 4, v pod mienkach „in vitro“ v dávkovo závislom spôsobe IT9302 inhiboval IL-1P indukovanú produkciu IL-8 ľudskými jednojadrovými bunkami periférnej krvi. Závislosť potláčania IL-8 produkcie mala plató pri koncentráciách IT9302 v rozmedzí 0,01 až lOOng/ml.

PRÍKLAD 3

IT9302 indukovaná produkcia proteínového antagonistu interleukín-1 receptorov (1RAP) ľudskými monocytmi

Test bol vykonaný tak, ako sa to opisuje v časti „Určenie koncentrácie I-RAP“. Ako ukazuje obr. 5, IT9302 dávkovo závislé indukoval produkciu IRAP ľudskými monocytmi. Produkcia sa zvýšila drasticky pri použití koncentrácií IT9302 nad 10 ng/ml. Obr. 6 znázorňuje indukciu IRAP prostredníctvom rhIL-10 a nakoľko hIL-10 je približne 20-krát väčší ako IT9302, v molarite 10 ng/ml 1T9302 sa rovná 200 ng/ml IL-10. Preto schopnosti IT9302 a rhIL-10 sú porovnateľné a približne rovnaké vzhľadom na indukciu IRAP pri nižších koncentráciách. Pri koncentráciách IT9302 prevyšujúcich 10 ng/ml sa indukcia IRAP drasticky znižovala a dosahovala úroveň približne 700 ng/ml.

PRÍKLAD 4

Chemotaktický účinok IT9302 na ľudské CD8+ T-lymfocyty

Experiment bol vykonaný tak, ako sa to opisuje v časti „Stanovenie chemotaxie leukocytov“. Ako znázorňuje obr. 7, IT9302 indukoval chemotaktickú migráciu CD8+ ľudských T-lymfocytov v podmienkach „in vitro“, zatiaľ čo nemal žiadny účinok na CD4+ T-bunky (údaje nie sú uvedené). Schopnosť IT9302 preukázaná v tomto experimente je zrovnateľná so schopnosťou rhIL-10 preukázanou už skôr(ref. 14).

PRÍKLAD 5

IT9302 znecitlivuje ľudské CD8+ T-bunky, čo má za následok bezodozvovosť proti rhlL-10

Experiment bol vykonaný tak, ako sa to opisuje v časti „Stanovenie chemotaxie leukocytov“. IT9302 sa pridal do suspenzie CD8+ T-buniek 30 minút pred testovaním týchto buniek na ich chemotaktickú odpoveď proti rhIL-10. Ako ukazuje obr. 8, predinkubácia buniek s IT9302 má za následok potlačenie citlivosti CD8+ T-buniek proti hrIL-10. To naznačuje, že IT9302 môže ovplyvniť viazanie rhIL-10 k receptoru IL-10.

PRÍKLAD 6

IT9302 potláča chemotaktickú odpoveď CD4+ T-lymfocytov na IL-8

Experiment bol vykonaný tak, ako sa to opisuje v časti „Stanovenie chemotaxie leukocytov“. Ako znázorňuje obr. 9, IT9302 inhibuje odpoveď CD4+ T-buniek na IL-8, ak je v dávkovo závislom spôsobe pridávaný do suspenzie ľudských CD4+ T-lymfocytov.

PRÍKLAD 7

IT9302 potláča chemotaktickú odpoveď ľudských monocytov na MCAF/MCP-1

Experiment bol vykonaný tak, ako sa to opisuje v časti „Chemotaxia monocytov“. Ako ukazuje obr. 10, IT9302 inhibuje chemotaktickú odpoveď monocytov na MCAF/MCP-1, ak je dávkovo závislým spôsobom pridávaný do suspenzie ľudských monocytov.

PRÍKLAD 8

1T9302 neinhibuje expresiu molekuly I! triedy MHC v ľudských monocytoch

Experiment sa vykonal, ako je opísané v časti „Materiály a metódy“, a ukazuje, že rhIL-10 inhibuje expresiu II triedy MHC, kým IT9302 ju neinhibuje, ako vyplýva z tabuľky 4.

TABUĽKA 4

Stimulácia Počet ružicovitých monocytov

100 ng/ml rhIL-10 1 p g/ml IT9302

100 ng/ml IT9302 mg/ml IT9302 (12,0 ± 1,0) x 10⁴ (4,6 ± 1,4) x 10⁴ (ll,0±3,0)x 10⁴ (14,4 ±2,4) x 10⁴ (11,2 ±3,2) x 10⁴

Diskusia k experimentom

Predkladané údaje demonštrujú dávkovo závislý inhibičný účinok syntetického nonapeptidu IT9302 na procesy, ktoré odrážajú protizápalovú aktivitu, vrátane IL-8 produkcie a monocytovej a/alebo T-bunkovej migrácie. Teda IT9302 bol schopný potláčať spontánnu produkciu IL-8 ľudskými monocytmi kultivovanými cez noc. Možno to vysvetliť priamym inhibičným účinkom na IL-8 mRNA produkciu a/alebo na následnú bielkovinovú produkciu alebo uvoľňovanie. Iný mechanizmus by sa dal vysvetliť na základe faktu, že monocyty kultivované v podmienkach „in vitro“ budú exprimovať a produkovať IL-1, ktorý potom indukuje produkciu IL-8. Toto je podopreté preukázaným faktom, že IT9302 silno indukuje produkciu IRAP z monocytov. Preto IT9302 môže tiež inhibovať spontánnu produkciu IL-8 interferenciou s aktivitou IL-1. Zdá sa, že pozorovaná indukcia IRAP pomocou IT9302 indukuje biologicky aktívny IRAP, pretože IT9302 pridávaný do kultúr pôsobí proti IL-8 produkcii indukovanej IL-1, ale len vtedy, keď sa pridáva najmenej 16 hodín pred pridaním IL-1 do kultúr. To môže znamenať, že IT9302 inhibuje IL-1 indukovanú IL-8 produkciu indukovaním produkcie IRAP, ktorý potom blokuje aktivitu IL-1 cez jeho receptor. Ak by IT9302 priamo inhiboval IL-8 produkciu, potom by sa dalo očakávať, že pridanie IT9302 do kultúr 1 hodinu pred pridaním IL-10 by malo inhibovať IL-8 produkciu, ale sa to nestalo (údaje nie sú uvedené). Preto pozorovaná inhibícia produkcie IL-8 pomocou IT9302 jc pravdepodobne zapríčinená skôr indukciou produkcie IRAP, než priamou inhibíciou produkcie IL-8. Tieto funkcie IT9302 sa zistili aj pri hIL-10, čo naznačuje, že IT9302 má podobné aktivity ako IL-10. IT9302 napodobňuje IL-10 aktivitu tiež potláčaním schopnosti CD4+ T-buniek migrovať, ako odpoveď na IL-8. Pretože IL-8 sa týka veľkého množstva rôznych stavov zápalu a nakoľko CD4+ T-bunky sa už skoro objavujú v infiltráte T-bunkou mediovaného imunitného zápalu, ako je napr. alergia kože, táto vlastnosť môže mať významný terapeutický význam na ovládanie T-bunkou sprostredkovaného zápalu.

Uvedená CD8+ T-bunková chemotaktická aktivita IT9302 je tiež paralelná s aktivitou IL-10, a tak IT9302 môže aktivovať T-bunkové populácie so supresorovou aktivitou, ktorá prispieva k ukončeniu imunitného zápalu sprostredkovaného T-bunkou. Preto podľa uvedených príkladov IT9302 má terapeutický význam pri chorobách, kde IL- 10 a/alebo tiež IRAP môže mať terapeutický význam. Navyše IT9302 môže mať terapeutický význam pri chorobách, kde IL-8 a/alebo MCAF, a/alebo IL- 1 majú pravdepodobne patogenické úlohy.

PRÍKLAD 9

IT9302 a IL-10 indukujú produkciu IL-4 v CD4+ T15

-lymfocytoch

Pozadie

Podobne ako IL-10, aj IL-4 je produktom CD4+ T-buniek T_H2 typu. Pozorovalo sa, že rekombinantný ľudský IL-10 indukuje produkciu IL-4 kultivovanými ľudskými CD4+ T-bunkami. To znamená, že IL-10, navyše k svojim vlastným imunorepresívnym funkciám tiež indukuje produkciu iného imunorepresívneho cytokinu, a to IL-4. Bolo zisťované, či IT9302 tiež indukuje produkciu IL-4 CD4+ T-bunkami.

Teda CD4+ T-bunky, puriflkované tak, ako to opisujú „Metódy pre T-bunkovú chemotaxiu“ a kultivované tak, ako je to opísané v časti „Určenie IL-4 produkcie CD4+ T-lymfocytmi“, boli stimulované 3 dni pomocou IT9302 (10 ng/ml) alebo IL-10 (100 ng/ml). Cytosólovc frakcie sa zbierali a použitím Western blotingu (obr. 11) a kozej polyklonálnej protilátky proti ľudskému IL-4 sa v nich analyzoval obsah IL-4.

Ako je znázornené na obr. 11, pozorovalo sa, že IL-10 a tiež IT9302 indukujú produkciu IL-4 kultivovanými normálnymi ľudskými CD4+ T-bunkami.

PRÍKLAD 10

IT9302 inhibuje produkciu TNF-a počas zmiešanej leukocytovej reakcie (MLR)

Bolo dokázané, že zmiešaná leukocytová reakcia je čiastočne závislá od produkcie TNF-α počas reakcie. Bolo preukázané, že IT9302 významne neredukuje MLR, ale zistilo sa, že významne sa redukuje produkcia TNF-α počas MLR.

Teda MLR sa vykonala na purifikovaných ľudských leukocytoch a následnou kultiváciou 1 milióna buniek/ml od alogenetických darcov počas 4 dní. Pred zakladaním kultúr bola jedna skupina buniek ožarovaná 2 minúty použitím beta žiarenia. Cytosólové bielkovinové frakcie boli purifikované tak, ako sa to opísalo v časti „Určenie IL-4 produkcie CD4+ T-lymfocytov“, a uskutočnil sa Western bloting použitím králičej protilátky proti ľudskému TNF-a.

Ako je to demonštrované na obr. 12, významné zníženie produkcie TNF-α sa pozorovalo počas zmiešanej reakcie ľudských leukocytov.

PRÍKLAD 11

Modulácia LPS indukovaného šoku a leukopénie pri prasati použitím IT9302

Pretože sa zistilo, že IT9302 moduluje cytokínovú reakciu, vrátane TNF-α a IL-8 a podporované publikovanou sekvenciou prasacieho IL-10 (Blancho ct al., 1995) (pozri obr. 2 pre homológiu k COOH-terminálovému peptidu), bolo zisťované, či je IT9302 schopný modulovať priebeh LPS indukovanej leukopénie pri prasati (obr. 13).

V predbežnom experimente sa testovalo ako intravenózna injekcia 0,1 mg/kg IT9302 modulovala účinok intravenóznej injekcie 2 pg/kg LPS pri prasati (N = 3). IT9302 bol injektovaný 30 minút pred injekciou LPS a krvné vzorky sa odoberali tak, ako je to opísané pri obr. 13. Určil sa celkový počet leukocytov a tiež diferenčný počet buniek a na základe týchto výsledkov sa počítal celkový počet neutrofi Iných leukocytov.

Ako bolo uvedené, pozorovalo sa, že injekcia LPS spôsobila prechodnú leukopéniu. Injekcia IT9302 ale pôsobila preventívne, ako to vyplýva z obrázka.

PRÍKLAD 12

Protilátka proti syntetickému polypeptidu IT9302

Syntetický polypeptid 1T9302 bol zakúpený od Kem-En-Tec A/S, Copenhagen, Dánsko s čistotou vyššou ako

%. Tento polypeptid bol tiež pripojený ku Keyhole Limpet Hemokyanínu (KLH) výrobcom. Rozpustný IT9302/KLH je viac imunogénny ako samotný polypeptid a môže byť tiež použitý ako kontrolná bielkovina pre ELISA alebo Western Blotting.

Imunizácia králikov

250 pg IT9302 viazaného ku KLH, a ako emulzia s kompletným Freundovým adjuvansom sa používa na intradermálne alebo subkutánne injekcie. Injekcie sa opakujú 4-krát v dvojtýždňových intevaloch a králikom je odobratá krv po 8 a 12 dňoch. Neskoršie zosilňujúce injekcie 250 pg IT9302/KLH v nekompletnom Freundovom adjuvanse sa podávajú v mesačných intervaloch použitím subkutánnych injekcií. Tvorba IT9302 protilátky sa testuje dot-blotovým imunotestom alebo Western blotingom.

LITERATÚRA

1. Bendtzen K. Lymphokines in inflammation. Inŕlammation Basic Mechanisms Tissue Injuring Principles and Clinical Models (P Venge & A Lindbom eds) 1985; Almqvist & Wiksell Intemational. Stockholm: 187 - 217.

2. Bendtzen K. Interleukin-1, Interleukin-6, and tumor necrosis factor in infection, inflammation and immunity. Immunol Lett 1988; 19:183 - 192.

3. Larsen C.G. Leukocyte activating and chemotactic cytokines in cell-mediated immune reactions of the human skin. ActaDermatovcncrol. 1991; Suppl. 160: 1 -48.

4. Fiorentino D. F„ M. W. Bond, and T. R. Mosmann. 1989. Two types od mouse helper T celí. IV. Th2 dones secrete a factor that inhibits cytokine production by Thl dones. J. Exp. Med., 170: 2081.

5. Viera P., R. de Wall-Malefyt, M. N. Dang, K. E. Johnson, R. Kastelein, D. F. Fiorentiono, J. E. de Vrieš, M. G. Roncarolo, T. R. Mosmann, and K. W. Moore. 1991. Isolation and expression of human cytokine synthesis inhibitory factor (CSIF/IL-10) cDNA dones: homology to EpsteinBarr vírus open reading frame BCRF1. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 88: 1172.

6. Moore, K.W., O'Garra A„ de Waal Malefyt R., Vieira, Mosmann T.R. 1993. Interleukin-10, Annu Rev. Immunol, 11: 165 -90.

7. Kim, J.M., Brannan, C. I. Copeland N.G., Jenkins, N. A., Khan, T.A., Moore, K. W. 1992. Structure of the mouse interleukin-10 géne and chromosomal localization of the mouse and human genes. J. Immunol 148: 3618 - 23.

8. Carter, D.B., Dcibel, M.R-Jr, Dunn, C. J. et al. 1990. Purifleation, cloning, expression and biological characterization of an interleukin-1 receptor antagonist proteín. NÁTURE 344: 633 - 638.

9. Hannum, C. H., Wilcox, C. J„ Arend, W. P. et al. 1990. Interleukin-1 receptor antagonist activity of a human interleukin-1 inhibitor. Náture 343: 336 - 40.

10. Firestein, G. S., Boyle, D. L., Yu, C., et al. 1994. Synovial interleukin-1 receptor antagonist and interleukin-1 balance in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 37: 644 -652.

11. Fisher, C. J.-Jr.,Slotman, G. L, Opál, S. M., Pribble, J. P. et al. 1994. Initial evaluation of recombinant interleukin1 receptor antagonist in the treatment of sepsis syndróme: a randomized, open-label, placebo-controlled multicenter trial. The IL-IRA Sepsis Syndróme Study Group. Crit-Care-Med. 22: 12-21.

12. de Wall-Malefyt, R„ Haanen J., Spits, H., et al. 1991. IL-10 and viral IL-10 strongly reduce antigen-specific human T celí proliferation by diminishing the antigen presenting capacity of monocytes via down-regulation of class IIMHC expression. J. Exp. Med. 174: 915 - 24.

13. Gazzonelli, R. T., Oswald, I. P., James, S. L., Sher, A.,

1992. IL-10 inhibits parasite killing and nitric oxide production by IFN-\-activated macrophages. J. Immunol. 148: 1792 - 96.

14. Jinquan, T., Larsen, C. G., Gesser, B., Matsushima, K., Thestrup-Pedersen, K. 1993. Human IL-10 is a chemoattractant for CD8+ T lymphocytes and an inhibitor of IL-8-induced CD4+ T lymphocyte Migration. Joumal of Immunology, 151:4545-4551.

15. Rousset F., E. Garcia, T. Defrance, C. Peronne, D. H. Hsu, R. Kastelein, K. W. Moore, and J. Banchereau. 1992. IL-10 is a potent growth and differentiation factor for activated human B lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 175:671.

16. Hovvard. M., O'Garra, A., Ishida, H., de Waal Malefyt, R., de Vrieš, J. 1992. Biological properties od Interleukin-10, J. Clin. Immunol 12: 239 - 47.

17. Kuhn, R., Lohler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Muller, W. 1993. Interleukin-10-deficient mice develop chronic cntcrocolotis. Celí 75: 263 - 74.

18. Sher, A., Fiorentino, D. F., Caspar, P., Pearce, E., Mosmann, T. 1991. Production of IL-10 by CD4+ lymphocytes correlates with down-regulation of Thl cytokine synthesis in helminth infection. J. Immunol. 147: 2713 - 16.

19. Clerici, M., Shearer, G. M. 1993 Immunology Today. 14:107-111.

20. Bry, K., Lappalainen, U. 1994. Interleukin-4 and transforming growth factor-beta 1 modulate the production of interleukin-1 receptor antagonist and prostaglandin E2 by decidual cells. Am-J-obstet-Gynecol 170 (4): 1194- 1198

21. Firestein, G., S., Boyle, D. L., Yu, C., Paine, M. M., Whisenand, T. D., Zvaifler, N. J., Arend, W. P. 1994. Synovial intrleukín-1 receptor antagonist and interleukin-1 balance in rheumatoid arthritis. Arthritis-Rheum, 37/5: 644 -652

22. Roberge, C. J., De-Medicis, R., Dayer, J. M., Rola-Pleszcyczynski, M., Naccahe, P. H., Poubelle, P. E. 1994. Crystal-induced neutrophil activation: V. Differential produkction of biologically active IL-1 receptor antagonist. J. Immunol 152/11:5485 -5494

23. McCall, R. D., Haskill, S., Zimmermann, E. M., Lund, P. K., Thompson, R.C., Sartor, R. B. 1994. Tissue intcrleukin 1 and interkeukin-1 receptor antagonist expression in entercolitis in resistant and susceptible rats. Gastroenterology(4): 960-72

25. Kimble, R. B., Vannice, J. L, Bloedow, D. C., Thompson, R. C., 1994. Interleukin-1 receptor antagonist decreases bone loss and bone resorption in ovariectomized rats. J. Clin Invest. 93/5: 1959- 1967

26. Kline, J. N., Geist, L. J., Monick, M. M., Stinski, M. F., Hunninghake, G. W., 1994. J. Immunol. 152 (5): 2351 - 7

27. Tompkins, R. G. 1994. Human recombinant interleukin-1 receptor antagonist in the treatment of sepsis syndróme (editorial; comment). Crit-Care-Med. 22 (1): 3, 22 (1):12-21

28. Everaerdt, B., Brouckaert, P., Fiers, W. 1994. Recombination IL-1 receptor antagonist protects against TNF-induced lethality in mice. J. Immunol. 152/10: 5041 - 5049

29. Fischer, C. J. Jr., Slotman, G. J., Opál, S. M., Pribble, J. P., Bone, R. C., Emmanuel, G., Ng, D., Bloedoxv, D. C., Catalano, M. A. 1994. Initial evalutaion of human recombination interleukin-1 receptor antagonist in the treatment of sepsis syndróme: a randomized, open-label, placebocontrolled multicenter trial. The IL-1RA Sepsis Syndróme

Study Group (see comments). Crit-Care-Med. 22(1): 12 -21,22(1):3

30. Gomez-Reino-Camoto, J. J. 1994. New terapies in rheumatoid arthritis. Med-Clin 543 - 545.

32. Nishihara, T., Ohsaki, Y., Ueda, N., Saito, N., Mundy, G. R. 1994. Mouse interleukin-1 receptor antagonist induced by actinobacillus actinomycetemcomitans lipopolysaccharide blocks the effects of interleukin-1 om bone resorption and osteoclast-like celí formation. Infect-lmmun. 62(2): 390 - 7

33. Šimon, C., Frances, A., Piquette, G. N., el-Danasouri,

L, Zurawski, G., Dang, W., Polan, M. L. 1994. Embryonic implantation in mice is blocked by interleukin-1 receptor antagonist (see comments). Endocrinology. 134(2): 521 - 8, 134(2):519-20

34. Baergen, R., Benirschke, K., Ulich, T. R., 1994. Cytokine expression in the placenta. The role of interleukin 1 and interleukin 1 receptor antagonist expression in chorioamnionitis and parturition. Arch-Pathol-Lab-Med. 118(1): 52-5

35. Táng, W. W., Feng, L., Vannice, J. L., Wilson, C. B. 1994. Interleukin-1 receptor antagonist ameliorates experimental antiglomerular basement membráne antibodyassociated flomeulonephritis. J. Clin-Invest. 93(1): 279 - 9.

36. Cassatella, M. A., Meda, L., Gasperini, S., Calzetti, F., Bonara, S. 1994.

37. Interleukin 10 (IL-10) upregulates IL-1 receptor antagonist production from lipopolysaccharide-stimulated human polymorphonuclear leukocytes by delaying mRNA degradation. J. Exp-Med. 179/5: 1695 -1699

38. Mancini, R., Bendetti, A., Jezequel, A. M. 1994. An interleukin-1 receptor antagonist decreases fibrosis induced by dimethylnitrorsamine in rat liver. Virchows-Arch. 424/1:25-31

39. Lukacs, N. W., Kunkel, S. L., Burdick, M. D., Lincoln, P. M., Strieter, R. M. 1993.

40. Interleukin-1 receptor antagonist blocks chemokine production in the mixed lymphocyte reaction. Blood. 82(12): 3668 - 74

41. Bandara, G., Mueller, G. M., Galea-Lauri, J., Tindal,

M. H., Georgescu, H. L, Suchanek, M. K., Hung, G. L., Gloriso, J. C., Robbins, P. D., Evans, C. H. 1993.

42. Intraarticular expression of biologically active interleukin 1-receptorantagonist protein by ex vivo transfer. Proc-Natl-Acad-Sci-U-S-A. 90(22): 10764 - 8

43. Dinarello, C. A. 1994. Anti-interleukin-1 strategies in the treatment of the septic shock syndróme. Can-J-infect-Dis. 5(suppl. A): 9A - 16A

44. Oelmann, E., Topp, M. S., Reufi, B., Papadimitriiou, C., Koeningsmann, M., Oberberg, D., Thiel, E., Berdel, W. E. 1994. Int-J-Oncol. 4/3: 555 - 558

45. Estrov, Z. 1993. Interruption of autocrine and paracrine growth-stimolatory mechaisms: a new therapeutic stratefy for chronic myelogenous leukémia. Semin-Hematol. 30(3 suppl 3): 35 - 6

46. Wooley, P. H., Whalen, J. D., Chapman, D. L., Berger, A. E., Richard, K. A., Aspar, D. G., Staite, N. D. 1993. The effect of an interleukin-1 receptor antagonist protein on type II collagen-induced arthritis and antigen-induced arthritis in mice. Arthritis Rheum. 36 (9): 1305 - 1314

47. Peterson, C. M., Halcs, H. A., Hatasaka, H. H., Mitchell, M. D., Rittenhouse, L., Jones, K. P. 1993. Interleukin-1 beta (IL-1 beta) modulates prostaglandin production and the natural IL-1 receptor antagonist inhibits ovulation in the optimally stimulated rat ovarian perfusion model. Endocrinology 133 (5): 2301 - 2306

48. Estrov, Z., Kurzrock, R., Talpaz, M. 1993. Role of interleukin-1 inhibítory molecules in therapy of acute and chronic myelogenous leukémia. Leuk. Lymphoma 10 (6): 407-418

49. Chensue, S. W., Bienkowski, M., Eessalu, T. E., Warmington, K. S., Hershey, S. D., Lukacs, N. W., Kunkel, S.

L. 1993. nous IL-1 receptor antagonist protein (IRAP) regulates schistosome egg granuloma formation and the regional lymphoid response. J. Immunol. 151 (7): 3654 -3662

50. Bowyer, J. F., Davies, D. L., Schmued, L., Broening, H. W., Newport, G. D., Slikker, W. Jr., Holson, R. R. 1994. Further studies of the role f hyperthermia in methamphetamine neurotoxicity. J. Pharmacol. Exp. Ther. 268/3: 1571 - 1580

51. Cóle, O. F. Sullivan, M. H. F., Elder, M. G. 1993. The 'interleukin-1 receptor antagonist' is a partial agonist of prostaglandin synthesis by human decidual cells. Prostaglandins 46/6:493 - 498

52. Jenkins, J. K., Arend, W. P. 1993. Interleukin 1 receptor antagonist production in human monocytes is induced by IL-1 alpha, IL-3, and IL-4 and GM-CSF. Cytokine 5/5: 407 -415

53. Coceani, F., Lees, J., Redford, J., Bishai, I. 1992. Interleukin-1 receptor antagonist: effectiveness against interleukin-1 fever. Can. J. Pharmacol. 70 (12): 1590 - 1596

54. Schiro, R., Longoni, D., Rossi, V., Maglia, O., Doni, A., Arsura, M. Carrara, G., Masera, G., Vannier, E., Dinarello, C. A., Rambaldi, A., Biondi, A. 1994. Suppression of juvenile chronic myelogenous leukémia colony growth by interleukin-1 receptor antagonist. Blood 83/2: 460 - 465

55. Watson, M. L., Smith, D., Boume, A. D., Thompson, R. C., Westwick, J. 1993. Cytokines contribute to airway dysfunction hyerreactivity, pulmonary eosinophil accumulation and tumor necrosis factor generation by pre-treatment with an interleukin-1 receptor antagonist. Am. J. Respir. Celí Mol. Biol. 8 (4): 365 - 369

56. Abhyankar, S., Gilliland, D. G., Ferrara, J. L. M. 1993. Interleukin-1 is a critical effector molecule during cytokine dysregulation in graft-versus-host disease to minor histocompatibility antigens. Transplantation 56/6: 1518 - 1523

57. Lan, H. Y., Nikolic Patrson, D. J., Zarama, M., Vannice, J. L., Atkins, R. C. 1993. Suppression of experimental crescentic glomerulonephitis by the interleukin-1 receptor antagonist. Kidney Int. 43 (2): 479 - 485

58. Herve, P. 1993. Prevention and treatment of acute GvHD - New modalities. Nouv. Rev. Fr. Hematol. 35/3: 295 - 297

59. Conti, P., Panara, M. R., Barbacane, R. C., Placido, F. C., Bongrazio, M., Reale, M., Dempsey, R. A., Fiore, S. 1992. Blocking the interleukin-1 receptor inhibits leukotriene B4 and prostaglandin E2 generation in human monocyte cultures. Celí Immunol. 145 (1): 199 - 209

60. Kristensen, M., Delcuran, B., Eedy, D. J., Feldmann,

M. , Breathnach, S. M., Brennan, F.M. 1992. Distribution of interleukin-1 receptor antagonist protein (IRAP), interleukin-1 receptor, and interleukin-1 alpha in normál and psoriatic skin, Decreased expression of IRAP in psoriatic lesional epidermis. Br. J. Dermatol. 127 (4): 305 - 311

61. Romero, R., Sepulveda, W., Mazor, M., Brandt, F., Cotton, D. B., Dinarello, C. A., Mitchell, M. D. 1992. The natural interleukin-1 receptor antagonist in term and preterm parturition. Am. J. Obstet. Gynecol. 167 (4Ptl): 863 872

62. Dinarello, C. A. 1992. Reduction of inflammation by decreasing production of interleukin-1 or by specific receptor antagonism. Int. J. Tissue. React. 14 (2): 65 - 75

63. Conti, P., Panara, M. R., Barbacane, R. C., Bongrazio, M., Dempsey, R. A., Reale, M. 1993. Human recombinant IL.l receptor antagonist (IL-IRa) inhibits leukotriene B4 generation Írom human monocyte suspensions stimulated by lipopolysaccharide (LPS). Clin. Exp. Immunol. 91/3: 526- 531

64. DeForge, L. E., Tracey, D. E., Kenney, J. S., Remick, D. G. 1992. Interleukin-1 receptor antagonist protein inhibits interleukin-8 expression in lipopolysac-charidestimuled human whole blood. Am. J. Pathol. 140 (5): 1045 -1054

65. Porat, R., Poutsiaka, D. D., Miller, L. C., Granowitz, E. V., Dinarello, C. A. 1992. Interleukin-1 (IL-1) receptor blockade reduces endotoxin and Borrealia burgdor-feristimulated IL-8 synthesis in human monoclear cells. Faseb. J. 6 (7): 2482 - 2486

66. Boermeester, M. A., van Leeuwen, P. A. M., Schneider, A. J., Houdijk, A. P. J., Ferwerda, C. C., Wesdorp, R. I. C.

1993. Interleukin-1 receptor antagonist: A new therapeutic agent in the treatment of septic syndróme. Ned. Tijd-schr. Geneesks. 137/7: 337 -342

67. Smith, R. J., Chin, J. E., Sam, L. M., Justen, J. M. 1991. Biológie effects of an interleukin-1 receptor antagonist protein on interleukin-1-stimulated cartilage erosion and chondrocyte responsiveness. Arthisitis Rheum. 34 (1); 78 -83

68. Conti, P. Barbacane, R. C., Panara, M. R., Reale, M., Placido, F. C., Fridas, S., Bongrazio, M., Dempsey, R. A. 1992. Human recombinant interleukin-1 receptor antagonist (hrlL-lra) enhances the stimulátory effect of interleukin-2 on natural killer celí activity against MOLT-4 target cells. Int. J. Immunopharm. 14/6: 987 - 993

69. Seling, W., Tocker, L 1992. Effect of interleukin-1 receptor antagonist on antigen-induced pulmonary responses in quinea pigs. Eur. J. Pharmacol. 213/3: 331 - 336

70. McCarthy, P. L. Jr., Abhyankar, A., Neben, S., Newman, G., Sieff, C., Thompson, R. C., Burakoff, S. J., Ferrara, J. L. M. 1991. Inhibition of interleukin 1 by an interleukin-1 receptor antagonist prevents graft-versus-host diseases. Blood 78/8: 1915-1918

71. Estrov, Z, Kurzrock, R., Wetzler, M., Kantarjian, H., Blake, M., Harris, D., Gutterman, J. U., Talpaz, M. 1991. Suppression of chronic myelongenous leukémia colony growth by interleukin-1 (IL-1) receptor antagonist and soluble IL-1 receptors: A novel application for inhibitors of IL-1 activity. Blood 78/6: 1476 - 1484

72. Thomas, T. K., Will, P. C., Srivastava, A., Wilson, C. L., Harbison, M., Little, J., Chesonis, R. S., Pignatello, M., Schmolze, D., Symington, J., Kilin, P. L,, Thompson, R. C. 1991. Evaluation of an interleukin-1 receptor antagonist in the rat acetci acid-induced colitis model. Agcnts Actions 34/1-2: 187- 190

73. Carter, D. B., Deibel, M. R. Jr., Dunn, C. J., Tomich, C.

S. C., Laborde, A. L., Slightom, J. L., Berger, A. E., Bienkowski, M. J., Sun, F. F., McEwan, R. N., Harris, P. K. W., Yem, A. W., Waszak, G. A., Chosay, J. G., Sieu, L. C., Hardee, M. M., Zurcher Neely, H. A., Reardon, I. M., Heinrikson, R. L. et al. 1990. Purification, cloning expression and biological characterization of an interleukin-1 receptor antagonist protein. Náture 344/6267: 633 - 638

74. Larsen C. G., Anderson A. O., Apella E., Oppenheim J. J., MatsushimaK., 1989. Science 243: 1464.

75. Larsen C. G., Jinquan T., Deleurant B., ThestrupPedersen K. 1993, IL-10 is a potent regulátor of the chemotactic response of mononuclear cells, but not of granulocytes. J. Invest. Dermatol. Vol 100, No 6

76. Sankoff and Kruskal in chapter 1 of „Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison“ (Addison-Wesley, Reading, Mass. 1983).

77. Berzofsky, Science 229, (1985) 932 - 940

78. Bowie etal., Science 247, (1990) 1306 - 1310

79. Wasserman et al., J. Immunol. 87,1961,290 - 295

80. Levine et al., Methods in Enzymology 11, 1967, 928 -936

81. Lewis et al., Biochemistry 22, 1983, 948 - 954

82. Rene de Waal Maletyt, John Abrahams, Bruce Bennet, Carl G. Figdor and Jan E. de Vrieš (1991), Interleukin 10 (IL-10) Inhibits Cytokine Synthesis by Human Monocytes: An Autoregulatory Role of IL-10 Produced by Monocytes. J. Exp. Med. 174, 1209 - 1220

83. Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9,1980,467

84. US Patent No. 4,235,871

85. US 4,501,728

86. US 4,837,028.

87. Walter H. Gotlieb, John S. Abrams, Joanna M. Watson, Thierry J. Velu, Jonathan S. Berek, Otoniel Martinez-Meza (1992), Presence of interleukin 10 (IL-10) in the ascites of patients with ovarian and other intra-abdominal cancers. Cytokine 4, No. 5,385 - 390

88. Blancho G., P. Gianello, Sh. Germana, M. Baetscher, D. H. Sachs and Chr. Le Guem (1995), Molecular identification of porcine interleukin 10: Regulation of expression in kidney allograf model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2800 - 2804

ZOZNAM SEKVENCIÍ (1) VŠEOBECNÁ INFORMÁCIA:

(i) PRIHLASOVATEĽ:

(A) MENO: Nycomed DAK A/S (B) ULICA: P.O. Box 1911, Lergraversvej 59 (C) MESTO: Copenhagen S (E) KRAJINA: Dánsko (F) POŠTOVÝ KÓD (ZIP): 2300 (ii) NÁZOV VYNÁLEZU: Imunomodulátory (iii) POČET SEKVENCIÍ: 23 (iv) POČÍTAČOM ČITATEĽNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAM: Patentln Release #1,0 Version #1,30 (EPO) (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 1:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 1:

Ala Tyr Met Thr Met Lys íle Arg Asn

5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 2:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 2:

Ala Tyr Met Thr íle Lys Met Arg Asn

5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 3:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE. SEKV ID Č: 3:

Ala Phe Met Thr Leu Lys Leu Arg Asn

5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 4.

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 4:

Ala Tyr Met Thr Met Lys Val Arg Glu

5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 5:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY.

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 5:

Gly Tyr Met Thr Met Lys íle Arg Asp

5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 6:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 6:

Ala Phe Met Thr Met Lys íle Arg Asp

5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 7:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY.

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 7:

Ala Tyr íle Thr Met Lys íle Arg Asp

5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 8:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č. 8: Ala Tyr Leu Thr Met Lys íle Arg Asp 1 5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 9:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 9: Ala Tyr Val Thr Met Lys íle Arg Asp 1 5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 10:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 10: Ala Tyr Met Thr íle Lys íle Arg Asp 1 5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 11:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ, nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 11: Ala Tyr Met Thr Leu Lys íle Arg Asp 1 5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 12:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 12: Ala Tyr Met Thr Val Lys íle Arg Asp 1 5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 13:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE. SEKV ID Č: 13:

Ala Tyr Met Thr Met Lys íle Arg Asp

5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 14:

(i) , SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE. SEKV ID Č: 14: Ala Tyr Met Thr Met Lys Met Arg Asp 1 5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 15:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 15: Ala Tyr Met Thr Met Lys Val Arg Asp 1 5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 16:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 16: Ala Tyr Met Thr Met Lys íle Arg Gin 1 5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 17:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 17: Ala Tyr Met Thr Met Lys íle Arg Glu 1 5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 18:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE. SEKV ID Č: 18: Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu 1 5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 19:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 6 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 19: Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 20:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 7 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 20: Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa

5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 21.

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 8 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 21: Xaa Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa 1 5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 22:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 9 aminokyselín (B) TYP: aminokyselinová (C) POČET VLÁKIEN:

(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 22: Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa 1 5 (2) INFORMÁCIA O SEKV ID Č: 23:

(i) SEKVENČNÉ CHARAKTERISTIKY:

(A) DĹŽKA: 27 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genómová) (iii) HYPOTETICKÁ: nie (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKV ID Č: 23: GCCTACATGA CAATGAAGAT ACGAAAC

Claims (59)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polypeptid pozostávajúci najviac z 10 aminokyselinových zvyškov, ktorý· zahrnuje nasledujúcu sekvenciu

   Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEKV ID Č: 19), kde

   X₄ a X₅ sú nezávisle vybraté zo skupiny skladajúcej sa z Met, íle, Leu a Val; a

   X₆ je vybratý zo skupiny skladajúcej sa z Asn. Asp, Gin a Glu, a ktorý má aspoň jednu z nasledujúcich vlastností:

   a) indukuje inhibíciu spontánnej produkcie IL-8 ľudskými monocytmi,

   b) indukuje inhibíciu IL-Ιβ indukovanej produkcie IL-8 ľudskými jednojadrovými bunkami periférnej krvi (PBMC),

   c) indukuje produkciu antagonistického proteínu receptora pre interleukín-1 (IRAP) ľudskými monocytmi,

   d) indukuje chemotaktickú migráciu CD8+ ľudských T-lymfocytov „in vitro“,

   e) znecitlivuje ľudské CD8+ T-bunky majúc za následok bezodozvovosť proti rhIL-10,

   f) potláča chemotaktickú odpoveď CD4+ ľudských T-lymfocytov proti IL-8,

   g) potláča chemotaktickú odpoveď ľudských monocytov proti MCAF/MCP-1,

   h) indukuje produkciu IL-4 kultivovanými normálnymi ľudskými CD4+ T-bunkami,

   i) redukuje produkciu TNFa v ľudskej zmiešanej leukocyte vej reakcii.
2. 2. Polypeptid podľa nároku 1, ktorý’ zahrnuje nasledujúcu sekvenciu

   X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEKV ID Č: 20), kde

   X₃, X₄ a X₆ sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z Met, íle, Leu a Val; a

   X₆ je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Asn, Asp, Gin a Glu.
3. 3. Polypeptid podľa nároku 1, ktorý zahrnuje nasledujúcu sekvenciu

   X₂-X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEKV ID Č: 21), kde

   X 2 je Tyr alebo Phe,

   X₃, X₄ a X₅ sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z Met, íle, Leu a Val; a

   X₆je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Asn, Asp, Gin a Glu.
4. 4. Polypeptid podľa nároku 1, ktorý zahrnuje nasledujúcu sekvenciu

   X_rX₂-X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEKV ID Č:

   22), kde

   Xi je Ala alebo Gly,

   X₂je Tyr alebo Phe,

   X₃, X₄ a X₅ sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z Met, íle, Leu a Val; a

   X₆ je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Asn, Asp, Gin a Glu.
5. 5. Polypeptid vzorca

   X_I-X₂-X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEKV ID Č:

   22), kde

   X) je Ala alebo Gly,

   X₂ je Tyr alebo Phe,

   X₃, X₄ a X₅ sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z Met, íle, Leu a Val; a

   X₆ je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Asn, Asp, Gin a Glu, kde tento polypeptid má aspoň jednu z vlastností definovaných v nároku 1.
6. 6. Polypeptid vzorca

   X₂-X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEKV ID Č: 21), kde

   X₂ je Tyr alebo Phe,

   X₃, X₄ a X₅ sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z Met, íle, Leu a Val; a

   X₆je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Asn, Asp, Gin a Glu, a kde tento polypeptid má aspoň jednu z vlastností definovaných v nároku 1.
7. 7. Polypeptid vzorca

   X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEKV ID Č: 20), kde

   X₃, X₄ a X₅ sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z Met, íle, Leu a Val; a

   X₆ je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Asn, Asp, Gin a Glu, a kde tento polypeptid má aspoň jednu z vlastností definovaných v nároku 1.
8. 8. Polypeptid vzorca

   Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEKV ID Č: 19), kde

   X₄ a X₅ sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z Met, íle, Leu a Val; a

   X₆je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Asn, Asp, Gin a Glu, kde tento polypeptid má aspoň jednu z vlastností definovaných v nároku 1.
9. 9. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 4 až 6, kde X[ je Ala.
10. 10. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 4 až 6, kde X] je Gly.
11. 11. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 6 alebo 9 až 10, kde X₂ je Tyr.
12. 12. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 6 alebo 9 až 10, kde X₂ je Phe.
13. 13. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 7 alebo 9 až 12, kde X₃ je Met.
14. 14. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 7 alebo 9 až 12, kde X₃ je íle.
15. 15. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 7 alebo 9 až 12, kde X₃ je Leu.
16. 16. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 7 alebo 9 až 12, kde X₃ je Val.
17. 17. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 16, kde X₄je Met.
18. 18. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 16, kde X₄je íle.
19. 19. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 16, kde X₄je Leu.
20. 20. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 16, kde X₄ je Val.
21. 21. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 20, kde X₅ je Met.
22. 22. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 20, kde X₅ je íle.
23. 23. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 20, kde X₅je Leu.
24. 24. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 20, kde XjjeVal.
25. 25. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 24, kde X₆je Asp.
26. 26. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 24, kde X₆je Gin.
27. 27. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 24, kde X₆ je Glu.
28. 28. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 24, kde X₆je Asn.
29. 29. Polypeptid majúci sekvenciu aminokyselín Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (SEKV ID Č: 1).
30. 30. Polypeptid podľa nároku 1, vybraný zo skupiny pozostávajúcej z Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Met-Arg-Asn (SEKV ID Č: 2), Ala-Phe-Met-Thr-Leu-Lys-Leu-Arg-Asn (SEKV ID Č: 3), Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Glu (SEKV ID Č: 4), Gly-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEKV ID Č: 5), Ala-Phe-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEKV ID Č: 6), Ala-Tyr-Ile-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEKV ID Č: 7), Ala-Tyr-Leu-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEKV ID Č: 8), Ala-Tyr-Val-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEKV ID Č: 9), Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Ile-Arg-Asp (SEKV ID Č: 10), Ala-Tyr-Met-Thr-Leu-Lys-Ile-Arg-Asp (SEKV ID Č: 11), Ala-Tyr-Met-Thr-Val-Lys-Ile-Arg-Asp (SEKV ID Č: 12), Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEKV ID Č: 13), Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Met-Arg-Asp (SEKV ID Č: 14), Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Asp (SEKV ID Č: 15), Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Gln (SEKV ID Č: 16) a Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Glu (SEKV ID Č: 17).
31. 31. Farmaceutický účinná látka, ktorou je farmaceutický prijateľná soľ, ester alebo konjugát polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 30.
32. 32. Látka podľa nároku 31, ktorou je soľ, ester alebo konjugát polypeptidu Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (SEKV ID Č: 1).
33. 33. Látka podľa nároku 32, kde konjugátom je sacharidový konjugát alebo polyetylénglykolový konjugát Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (SEKV ID Č: 1)
34. 34. Polypeptid alebo látka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 33, enkapsulované do lipozómu.
35. 35. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 30, enkapsulovaný do lipozómu.
36. 36. Polypeptid podľa nároku 35, enkapsulovaný do lipozómu, kde polypeptid má aminokyselinovú sekvenciu Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (SEKV ID Č: 1)
37. 37. Polypeptid alebo látka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 33 vo v podstate čistej forme.
38. 38. Nukleotidová sekvencia kódujúca polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 30.
39. 39. Nukleotidová sekvencia podľa nároku 38, kódujúca polypeptid podľa nároku 3 alebo 4.
40. 40. Nukleotidová sekvencia podľa nároku 38, kde polypeptid má aminokyselinovú sekvenciu Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (SEKV ID Č: 1).
41. 41. Vektor, ktorý zahrnuje nukleotidovú sekvenciu podľa nároku 38 alebo 39.
42. 42. Vektor, ktorý zahrnuje nukleotidovú sekvenciu podľa nároku 40.
43. 43. Protilátka, ktorá sa špecificky viaže na polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 30.
44. 44. Protilátka, ktorá sa špecificky viaže na polypeptid vzorca Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ue-Arg-Asn (SEKV ID Č:l).
45. 45. Protilátka podľa nároku 44, ktorou je polyklonálna protilátka.
46. 46. Protilátka podľa nároku 44, ktorou je monoklonálna protilátka.
47. 47. Protilátka podľa nároku 43, ktorá je schopná neutralizovať aspoň jednu z nasledujúcich činností:

    a) indukovanie inhibície spontánnej produkcie IL-8 ľudskými monocytmi,

    b) indukovanie inhibície IL-10 indukovanej produkcie IL-8 ľudskými jednojadrovými bunkami periférnej krvi (PBMC),

    c) indukovanie produkcie antagonistického proteínu receptora pre interleukín-1 (IRAP) ľudskými monocytmi,

    d) indukovanie chemotaktickej migrácie CD8+ ľudských T-lymfocytov „in vitro“,

    e) znecitlivenie ľudských CD8+ T-buniek majúce za následok bezodozvovosť proti rhIL-10,

    i) potláčanie chemotaktickej odpovede CD4+ ľudských T-lymfocytov proti IL-8,

    g) potláčanie chemotaktickej odpovede ľudských monocytov proti MCAF/MCP-1.
48. 48. Protilátka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 44 až 46, ktorá je schopná neutralizovať aspoň jednu z činností uvedených v nároku 47.
49. 49. Protilátka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 43 až 48 na použitie v medicíne.
50. 50. Spôsob znižovania alebo neutralizácie vysokej koncentrácie hIL-10 alebo vIL-10, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje použitie protilátky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 43 až 48.
51. 51. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa t ý m , že zahrnuje polypeptíd alebo látku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 36.
52. 52. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa t ý m , že zahrnuje protilátku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 43 až 49.
53. 53. Polypeptíd podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 30 na použitie v medicíne.
54. 54. Polypeptíd na použitie v medicíne podľa nároku 53, kde polypeptíd má vzorec Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (SEKV ID Č: 1).
55. 55. Polypeptíd alebo látka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 33 na použitie pri liečbe alebo profylaxii aspoň jedného z týchto ochorení: predčasný pôrod spôsobený infekciou alebo inými stavmi, reumatoidná artritída, Lymská artritída, dna, septický syndróm, hypertermia, ulceratívna kolitida alebo enterokolitída, osteoporóza, cytomegalovírusové ochorenie, periodontálne choroby, glomerulonefritída, chronický neinfekčný zápal pľúc (napr. sarkoidóza a fajčiarsky zápal pľúc), tvorba granulómov, fibróza pečene, fibróza pľúc, odhojovanie transplantátu, ochorenia pri odmietaní transplantátu, chronická myeloidná leukémia, akútna myeloidná leukémia, iné neoplastické ochorenia, bronchiálna astma, diabetes mellitus I. typu (od inzulínu závislý), artérioskleróza/ateroskleróza, psoriáza, chronická Blymľocytová leukémia, bežná variabilná imunodeficiencia, vedľajšie účinky s využitím iných modifikátorov biologickej odozvy, roztrúsená intravaskulárna koagulácia, systémová skleróza, encefalomyelitída, zápal pľúc, hyper IgE syndróm, enterokolitída, metastázy a rast nádorov, adoptívna imunitná terapia, syndróm získanej respiračnej tiesne, sepsa, reperfúzny syndróm, pooperačný zápal, transplantácie orgánov a alopécia.
56. 56. Polypeptíd podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 30 na použitie pri liečbe alebo profylaxii aspoň jedného z ochorení uvedených v nároku 55.
57. 57. Použitie polypeptidu alebo látky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 33 na výrobu farmaceutickej kompozície na liečbu alebo profylaxiu ochorenia vybraného zo sku piny, ktorú tvorí predčasný pôrod spôsobený infekciou alebo inými stavmi, reumatoidná artritída, Lymská artritída, dna, septický syndróm, hypertermia, ulceratívna kolitida alebo enterokolitída, osteoporóza, cytomegalovírusové ochorenie, periodontálne choroby, glomerulonefritída, chronický neinfekčný zápal pľúc (napr. sarkoidóza a fajčiarsky zápal pľúc), tvorba granulómov, fibróza pečene, fibróza pľúc, odhojovanie transplantátu, ochorenia pri odmietaní transplantátu, chronická myeloidná leukémia, akútna myeloidná leukémia, iné neoplastické ochorenia, bronchiálna astma, diabetes mellitus I. typu (od inzulínu závislý), artérioskleróza/ateroskleróza, psoriáza, chronická B-lymfocytová leukémia, bežná variabilná imunodeficiencia, vedľajšie účinky s využitím iných modifikátorov biologickej odozvy, roztrúsená intravaskulárna koagulácia, systémová skleróza, encefalomyelitída, zápal pľúc, hyper IgE syndróm, enterokolitída, metastázy a rast nádorov, adoptívna imunitná terapia, syndróm získanej respiračnej tiesne, sepsa, reperfúzny syndróm, pooperačný zápal, transplantácie orgánov a alopécia.
58. 58. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 30 na výrobu farmaceutickej kompozície na liečbu alebo profylaxiu aspoň jedného z ochorení uvedených v nároku 55.
59. 59. Použitie polypeptidu podľa nároku 58, kde polypeptid má vzorec Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (SEKVIDČ: 1).