HU220344B

HU220344B - Immunmodulátorok

Info

Publication number: HU220344B
Application number: HU9603615A
Authority: HU
Inventors: Borbala Gesser; Christian Gronhoj Larsen
Original assignee: Steeno Research Group A/S
Priority date: 1994-07-05
Filing date: 1995-06-07
Publication date: 2001-12-28
Also published as: HU9603615D0; CA2194444A1; AP690A; CZ1497A3; GR3034628T3; FI970009A0; EE03451B1; DE69518156T2; PL319429A1; US6168791B1; US6599501B1; MX9606537A; RO118758B1; NZ287406A; NO970020D0; PT769054E; EE9700029A; NO970020L; WO1996001318A1; EP0769054A1

Abstract

A találmány tárgya egy polipeptid, amely nem azonos a humáninterleukin–10-zel, és amely a következő tulajdonságok közül legalábbeggyel rendelkezik: a) indukálja a humán monociták spontán IL–8-termelésének gátlását; b) indukálja a humán egymagvú perifériásvér-sejtek IL–1? által indukált IL–8-termelésének gátlását; c) indukálja ahumán monociták interleukin–1 receptorantagonista-protein (IRAP)termelését; d) indukálja a humán CD8+ T-limfociták in vitrokemotaktikus migrációját; e) deszenzibilizálja a humán CD8+ T-sejteket, ami rhIL– 10-re való reagálóképtelenséget eredményez; f)szuppresszálja a humán CD4+ T-limfociták IL–8-ra adott kemotaktikusreakcióját; g) szuppresszálja a humán monociták MCAF/MCP–1-re adottkemotaktikus reakcióját; h) a humán IL–10-zel ellentétben, nem gátoljaa humán monocitákon az MHC II. osztályú molekulák exp- resszióját; i)indukálja a tenyésztett normális humán CD4+ T-sejtek IL–4-termelését;j) vegyes humánleukocita-- reakcióban csökkenti a TNF? termelődését.Közelebbről, a találmány tárgya az Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-- Arg-Asn aminosavszekvenciát tartalmazó nonapeptid, valamint annakanalógjai és változatai. ŕ

Description

A találmány tárgya interleukin-10 (IL-10) agonistaként funkcionáló anyag gyógyászati alkalmazása, közelebbről, interleukin-10-agonista-aktivitással rendelkező anyag alkalmazása gyógyászati készítmény előállítására, amely olyan betegségek megelőzésére és/vagy kezelésére alkalmas, melyek kialakulása az immunoinhibitor-mediátorok, elsősorban a citokinek fokozott termelődésével és/vagy működésével, és/vagy bizonyos „immunogyulladás-mediátorok”, elsősorban a citokinek fokozott termelődésével és/vagy működésével függ össze. Közelebbről, a találmány tárgya a találmány szerinti anyag alkalmazása gyógyászati készítmény előállítására, amely autoimmun betegségek (I. típusú diabetes mellitus, a gyomor-bél rendszer autoimmun betegségei, reumatoid artritis); artritis urica (köszvény); bőrallergia; bőrön, tüdőben, légutakban kialakuló allergiás reakciók (köztük az asthma bronchiale); hypoxia/isémia következtében kialakult szövetkárosodások (infarktus, reperfúziós károsodás); atherosclerosis; psoriasis; granulomás betegség; krónikus myeloid leukémia; akut myeloid leukémia; rák; „graft-versus-host” reakció és transzplantátumkilökődéssel kapcsolatos állapotok; tüdőfibrózis; májfibrózis; krónikus, nem fertőző tüdőgyulladás; glomerulonephritis; koraszülés; periodontitis; vírusfertőzés következtében kialakuló gyulladásos reakciók; osteoporosis és szeptikus sokk megelőzésére és/vagy kezelésére, és/vagy fogamzásgátló előállítására alkalmazható.

Az utóbbi két évtized kutatásai rámutattak arra, hogy emlősökben a gyulladásos reakciók beindítása, szabályozása és befejezése, valamint a növekedés és differenciálódás a szignálpolipeptidek egy speciális citokinek néven ismert - csoportjának szigorú szabályozása alatt áll. A citokinek olyan polipeptidek, amelyek termelésére a legtöbb, sejtmaggal rendelkező sejt képes, és amelyek a sejtek között szabályozójeleket közvetítenek, miáltal az organizmus azonos vagy különböző sejttípusai között kommunikációs hálózatot hoznak létre. A citokinek rendkívül hatásos mediátorok, és egészen 10-¹⁵ M koncentrációig hatásosak. A citokinek a celluláris immunreakciók (melyek a fertőzés, allergia, trauma, „graft-versus-host” reakció vagy autoimmun betegség okozta gyulladás klinikai megnyilvánulását eredményezik) kialakításában is kulcsfontosságú faktorok. Az allergiás és autoimmun betegségek okait az immunrendszer (különösen a Tlimfocita közvetítette immunitás) rendellenességei képezik, de általában e betegségek kóroka nem ismert. In vitro vizsgálatokkal, állatkísérletekkel és klinikai kísérletekkel kimutatták, hogy a citokinek fontos kórélettani szerepet játszanak az autoimmun betegségekkel, allergiával, isémiával, reperfúziós károsodással, sérüléssel, fertőzésekkel kapcsolatos gyulladásos reakciókban, és lényegesek a rák kifejlődése, az atherosclerosis, a terhesség és magzatfejlődés, valamint a csonthomeosztázis szempontjából is.

Az említett betegségek rendszerint krónikusak, és kezelésük palliatív, vagyis az e betegségekkel kapcsolatban leírt gyógyszerek legtöbbje a tünetek enyhítésére irányul, és általában nincs gyógyhatásúk. Más kezelések úgynevezett helyettesítő terápiát jelentenek, melyek során a páciensnek egész életén keresztül olyan anyagokat (például hormonokat) adnak be, amelyek belső termelődése csökkent mértékű vagy elégtelen. Az ilyen kezelések gyakran nem kielégítő hatásúak, nemkívánatos - és gyakran súlyos - mellékhatásokat idéznek elő, és csupán késleltetik - és nem gátolják - a betegség előrehaladását. Ennek megfelelően, nagy szükség van javított kezelési eljárások és gyógyászati készítmények kifejlesztésére.

Az interleukin-10 az utóbbi időben leírt, természetes, endogén immunszuppresszív hatású citokin, melyet egérben és patkányban, illetve emberben egyaránt azonosítottak. Az egérinterleukin-10-et (mIL-10) eredetileg - TH₂-helper-T-sejt-klónokból felszabadult citokinszintézis-gátló faktorként írták le, de emellett a limfociták különböző alcsoportjaira proliferatív hatásokat is gyakorol; ilyen például a CD4-, 8+ egérlép-Tsejtek klónozási hatékonyságára gyakorolt fokozó hatás [Fiorentino, D. F. és munkatársai: J. Exp. Med. 170, 2 081 (1989)]. A humán interleukin-10-et (hIL-10) az utóbbi időben szekvenálták, és kimutatták, hogy DNS-szekvencia- és aminosavszekvenciaszinten nagy homológiát mutat az mIL-10-zel. A sertés-IL-10-et szintén a közelmúltban szekvenálták, és erről is kimutatták, hogy - DNS-szekvencia- és aminosavszekvencia-szinten - nagy homológiát mutat a hIL-10-zel [Blancho, G. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2 800 (1995)], lásd még 2. ábra. A hIL-10 nagy homológiát mutat az Epstein-Barrvírus genomjának nyitott leolvasási keretével (BCRF1) is, és a virális IL-10 mutat némi - a hIL-10-éhez hasonló - aktivitást is (vesd össze 1. ábra) [Viera, P. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1 172 (1991)].

A humán IL- 10-et aktivált T-sejt-klónok és immortalizált B-sejtek termelik, és citokinszintézist gátló faktor (CSIF)-aktivitása mellett - több „gyulladás előtti” citokin- („pro-inflammatory cytokine”) és kolóniastimuláló faktor termelődését gátolva - egy természetes interleukin-1 receptorantagonista protein/peptid (IRAP) egymagvú sejtek által történő termelését is indukálja, miáltal közvetve gátolja az IL-1-aktivitást. Az IL-10 saját - monociták által történő - termelését is leszabályozza, és gátolja az MHC II. osztályú expressziét [de Waal-Malefyt, R. és munkatársai: J. Exp. Med. 174, 915 (1991)]. Ezenkívül, a hIL-10 - antigénprezentáló sejtekként monociták alkalmazásakor csökkenti a humán T-sejtek és CD4+-T-sejt-klónok antigénspecifikus proliferációját is. Egerekben végzett in vivő kísérletek eredményei azt mutatják, hogy a Leishmania-fertőzés kimenetele a reagáló CD4+-T-limfociták citokinprofiljától függ [Gazzinelli, R. T. és munkatársai: J. Immunoi. 148, 1 792 (1992)]. A Leishmania-fertőzéssel szemben rezisztens C57BL/6 egerekben a kiürülő nyirokcsomókból származó CD4+-T-sejtek az IFN-γ- és IL-2-citokinek felülszabályozását mutatják, míg a fertőzésre érzékeny Balb/c egerek kiürülő nyirokcsomóikban - IL-4-et és IL-10-et termelő reagáló CD4⁺-T-sejteket tartalmaznak, ami bizonyítha2

HU 220 344 Β tóan kapcsolatban áll a betegség előrehaladásával [Gazzinelli és munkatársai (1992), lásd fentebb]. Ilyenformán, az IL-10 - in vitro és in vivő egyaránt - hatásos szabályozóhatásokat gyakorolhat az immunreakciókra. Az IL-10 ezenkívül jelentős mértékben befolyásolja a kemokinbiológiát, mivel a humán interleukin-10 a CD8⁺-T-sejtek felé specifikus kemotaktikus faktor, miközben az IL-10 gátolja a CD4+ (de nem a CD8+) T-sejtek azon képességét, hogy a T-sejtkemotaktikus citokin, az IL-8 hatására vándoroljanak [Jinquan, T. és munkatársai: Journal of Immunology 151, 4 545 (1993)]. Az IL-10 más kemokinek (MCP-l/MCAF és RANTES) kemotaktikus hatását is gátolja [Larsen, C. G. és munkatársai: J. Invest. Dermatol. 700(6), (1993)]. Mivel az IL-10 a monocita/makrofág funkciók deaktivátora, és a Thlaktivitás inhibitora, a teljes vagy részleges IL- 10-szerű hatással rendelkező gyógyszerek - a citokin termelődése és/vagy aktivitása egyensúlyának megbomlásával jellemezhető betegségek esetében - gyógyhatást fejthetnek ki.

Korábban javasolták hIL-10-et vagy vIL-10-et tartalmazó gyógyászati készítmények előállítását, és - például az EP 405 980 számú szabadalmi leírásban vagy a WO94/06 473 számú nemzetközi közzétételi iratban leírták a hIL-10 vagy vIL-10 gyógyászati készítmények előállításában történő alkalmazását, mely készítmények különböző betegségek (mint például szeptikus vagy toxikus sokk, reumatoid artritis, „graft-versushost” betegség, szövetkilökődés, diabetes mellitus, autoimmun betegségek, leukémia és rák) kezelésére alkalmasak. Felvetették továbbá, hogy az ilyen antitestek előnyösen alkalmazhatók HÍV-vei fertőzött páciensek kezelésében is.

A találmány szerinti megoldás kidolgozása során felismertük, hogy egy - a humán interleukin-10-től eltérő - anyag, amely a következő tulajdonságok közül eggyel vagy többel rendelkezik:

a) indukálja a humán monociták spontán IL-8termelésének gátlását;

b) indukálja a humán egymagvú perifériás vérsejtek - IL-Ιβ által indukált - IL-8-termelésének gátlását;

c) indukálja a humán monociták interleukin-1 receptorantagonista protein (IRAP) termelését;

d) indukálja a humán CD8⁺-T-limfociták in vitro kemotaktikus migrációját;

e) deszenzibilizálja a humán CD8⁺-T-sejteket, ami rhIL-10-re való reagálóképtelenséget eredményez;

f) szuppresszálja a humán CD4⁺-T-limfociták IL-8-ra adott kemotaktikus reakcióját;

g) szuppresszálja a humán monociták MCAF/MCP-l-re adott kemotaktikus reakcióját;

h) a humán IL-10-zel ellentétben, nem gátolja a humán monocitákon az MHC II. osztályú molekulák expresszióját;

i) indukálja a tenyésztett normális humán CD4+-Tsejtek IL-4-termelését;

j) vegyes humánleukocita-reakcióban csökkenti a TNFa termelődését;

mint például az Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-IleArg-Asn aminosavszekvenciát (vagy ennek analógját vagy változatát) tartalmazó polipeptid (a hIL-10-zel szekvenciahomológiát mutató, IT9 302 elnevezésű nonapeptid), valamint ennek származékai felhasználhatók a gyulladásos folyamatok bizonyos (különösen az immunrendszerrel és/vagy a hormonháztartással kapcsolatos) fajtáinak megelőzésére és/vagy kezelésére. Amint azt az alábbiakban, az immunológiai mechanizmusok ismertetése során részletesen leírjuk, úgy véljük, hogy a gyulladás gátlásának mechanizmusa az immunrendszer mediátorai (név szerint a citokinek, mint például a monokinek, limfokinek, kemokinek és a monokinreceptor-antagonisták) működésének gátlásán alapul; vagyis, a találmány szerinti anyag megakadályozza, illetve szuppresszálja bizonyos citokinek termelődését és/vagy működését, s ezáltal gátolja a szövetkárosodáshoz vezető kóros folyamatokat. Feltételezzük továbbá, hogy a találmány szerinti anyag indukálja a természetes monokinreceptor-antagonisták termelődését, s ezáltal megakadályozza, illetve szuppresszálja bizonyos citokinek működését, és gátolja a szövetkárosodást eredményező kóros folyamatokat.

A találmány egy lényeges megvalósítási módja értelmében egy gyógyászati készítményt állítunk elő, amely aktív alkotórészként egy találmány szerinti anyagot tartalmaz. A találmány tárgyát képezi továbbá egy olyan anyag, például antitest, amely a fentebb (a)-(g) pontokban említett működések közül egy vagy több semlegesítésére képes; valamint egy ilyen anyagot tartalmazó gyógyászati készítmény.

A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti anyag alkalmazása gyógyászati készítmény előállításában, mely készítmény citokinnel kapcsolatos biológiai hatás gátlására alkalmas; azaz a találmány szerinti anyag alkalmazása IL-1 receptorantagonista proteinként, illetve pepiidként, limfokinként, monokinként, interleukinként, interferonként, kemokinként vagy kolóniastimuláló faktorként. A találmány tárgya továbbá a találmány szerinti anyag alkalmazása olyan gyógyászati készítmény előállításában, amely citokinrendszer, vagyis az IL—1 receptorantagonista protein/peptid-, limfokin-, monokin-, interleukin-, interferon-, kemokin- vagy kolóniastimuláló faktorrendszer zavarával összefüggő állapot megelőzésére vagy kezelésére alkalmas. A találmány tárgya továbbá egy eljárás citokinrendszer zavarával összefüggő emberi betegség kezelésére, melynek során a páciensnek a találmány szerinti anyag hatásos mennyiségét adjuk be.

A celluláris immunrendszer fertőző, gyulladásos és daganatos betegségek kifejlődésében vesz részt. Az immunkompetens sejtek és termékeik fontos szerepet játszhatnak a gyulladásos állapotok beindításában, előrehaladásában és kialakulásuk esetleges krónikus természetében. E betegségek kóroka gyakran nem ismert. Olyan betegségek tartoznak ide, mint a diabetes mellitus, reumatoid artritis, valamint a gyomor-bél rendszer és a bőr gyulladásos betegségei. A sejt közvetítette immunitás vagy az gyulladás előtti („pro-inflammatory”) mediátorok - az említett példákon kívül - sok

HU 220 344 B más gyulladásos és proliferatív betegség kialakulását segítik elő (lásd 2. táblázat).

2. táblázat

Néhány betegség, melyekben a makrofágok, illetve a

T-limfocita közvetítette immunreakciók kóroktani szempontból lényeges szerepet játszanak

Bőrbetegségek:

Psoriasis

Atópiás dermatitis Kontakt dermatitis

Bőrrel kapcsolatos („cutaneous”) T-sejt-limfoma (CTCL)

Sezary-szindróma Pemphigus vulgáris Bullous pemphigoid Erythema nodosum Scleroderma

Autoimmun betegségek (beleértve a reumaszerű betegségeket):

Uveitis

Bechet-betegség Sarcoidosis Boeck Sjögren-szindróma Reumatoid artritis Fiatalkori artritis Reiter-szindróma Köszvény Osteoarthrosis

Szisztémás lupus erythematosis

Polymyositis

Myocarditis

Primer cirrhosis biliaris

Crohn-betegség

Colitis ulcerosa

Multiplex sclerosis és más, demielinizációval járó betegségek

Aplasztikus anémia Idiopátiás trombocitopéniás purpura Myeloma multiplex és B-sejt-limfoma Simmons-féle általános hipofízis-hipofünkció Graves-betegség és Graves-féle szembántalom Szubakut thyreoditis és Hashimoto-betegség Addison-kór

Inzulinfüggő (I. típusú) diabetes mellitus Egyéb betegségek:

Vasculitis-szel járó különböző klinikai szindrómák (például polyarteritis nodosa, Wegener-féle granulomatosis, óriássejtes arteritis)

Láz, rossz közérzet

Étvágytalanság (például akut vagy krónikus gyulladásos és fertőző betegségek esetében)

Disszeminált intravaszkuláris véralvadás (DIC) Arteriosclerosis (atherosclerosis)

Sokk (például gram-negatív szepszis)

Cachexia (például rák, krónikus fertőző vagy krónikus gyulladásos betegség esetében)

Transzplantációkilökődés és „graft-versus-host” betegség

Citokinek

A T-limfociták végzik a sejt közvetítette immunreakciók indukcióját és regulációját, míg a T-sejtek citokintermékei (limfokinek) beindítják és irányítják az immunreakciót [Bendtzen, K.: „Lymphokines in infalmmation. Infalmmation Basic Mechanisms Tissue Injuring Principles and Clinical Models”, szerkesztők: P. Venge és A. Lindbom, Almqvist & Wiksell International, Stockholm, 187-217. oldal (1985); Bendtzen, K.: Immunoi. Lett. 19, 183 (1988)]. Az antigénprezentáló sejtek által termelt limfocitaaktiváló mediátorok (limfokinek) a citokin néven ismert polipeptidek közé tartoznak. A citokinek - mind fiziológiai, mint patofiziológiai állapotban - a sejtek egymás közötti kommunikációjának közvetítői, továbbá az immunrendszer, illetve a szövetek és szervek közötti jeleket biztosító hormonokként is funkcionálhatnak. A citokineket az immunrendszeren kívüli sejtek is termelhetik, és az az általánosan elfogadott vélemény, hogy valamennyi sejtmaggal rendelkező sejt képes egy vagy több citokin termelésére. Ennek megfelelően, például a keratinociták és a fibroblasztok hatásos citokintermelők, és ebben a rendszerben a citokinek az immunrendszertől független autokrin vagy parakrin hormonokként funkcionálnak [Larsen, C. G.: Acta Dermatovenerol. Suppl. 160, 1 (1991)].

lnterleukin-10

Az egérinterleukin-10-et (mIL-10) eredetileg TH₂ helper-T-sejt-klónokból felszabaduló - citokinszintézist gátló faktorként (CSIF) írták le, de a limfociták különböző alcsoportjaira proliferatív hatást is mutat, mint például a CD4-, 8+ egérlép-T-sejtek klónozási hatékonyságára gyakorolt fokozó hatás [Fiorentino, D. F. és munkatársai: J. Exp. Med. 170, 2081 (1989)]. A humán interleukin-10-et (hIL-10) a közelmúltban írták le [Viera, P. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1172 (1991)]. A hIL-10 nagymértékű homológiát mutat az Epstein-Barrvírusgenom nyitott leolvasási keretével (BCRF1), és a virális IL-10 mutat némi hIL-10-hez hasonló aktivitást. Az alábbiakban az IL-10 biokémiai, biológiai, fiziológiai és lehetséges patofiziológiai szerepét foglaljuk össze.

Az IL-10 szerkezete

Az egér-IL-10 (mIL-10) és a humán 1L-10 (hIL-10) elsődleges szerkezete a teljes hosszúságot tekintve nagyfokú (80%-nál nagyobb) nukleotidszekvencia-azonosságot mutat [Fiorentino és munkatársai, (1989); Viera és munkatársai, (1991); lásd fentebb]. A két szekvencia közötti egyetlen lényeges különbség, hogy a hIL-10 cDNS-klónjának 3’-transzlálatlan régiójában egy humán ismétlődő Alu szekvenciaelem inszertálódott. Az mIL-10- és a hIL- 10-cDNS nagy hasonló nyitott leolvasási keretet tartalmaz, melyek 178 aminosavat kódolnak, beleértve a hidrofób vezetőszekvenciákat. A két interleukin aminosavszinten 73%-os homológiát mutat. Az egérsejtekben aktív mIL-10 emberi sejtekkel nem mutat jelentős keresztreakciót. A hIL-10 egy 18 kD-os polipeptid, amelyben nincs kimutatható szénhidrát, ezzel szemben az mIL-10 - N4

HU 220 344 Β terminálisához közel - N-glikozilált, ami a hIL-10ből hiányzik. Mind az mIL-10, mind a rekombináns hIL-10 (rhIL-10) nem kovalens kötésű homodimerként expresszálódik. Jelenleg nem bizonyos, hogy az mIL-10 vagy hIL-10 monomerek milyen mérethatárig mutatnak biológiai aktivitást. Moore és munkatársai leírása szerint [Annu. Rév. Immunoi. 77, 165 (1993)] (akik elsőként szekvenálták a hIL-10-et) az mIL-10 és a hIL-10 aktivitása - N-terminálisukon legalább 8 aminosavas, C-terminálisukon pedig 21 aminosavas polipeptid-„toldalékkal” - nem mutatnak detektálható aktivitáscsökkentést. A teljes IL-10 C- és N-terminális toldalékai nem okoznak szükségszerűen funkcionális változásokat, mivel ezek ritkán, illetve véletlenszerűen találhatók meg. A lehetséges aminosavszubsztitúciók nagy száma, amint azt a következőkben részletezzük, szintén magyarázatot adhat arra, hogy a toldalékok jelenléte miért nem eredményezi a hiányzó funkciók megjelenését. A rekombináns mIL-10-et és hIL- 10-et CDS7-sejtekben, egér-mielomasejtekben, kinaihörcsögpetefészek- (CHO-) sejtekben baculovírus expressziós rendszerben és E. coliban expresszálták. Ezeknek az rIL-10 proteineknek a biológiai aktivitása mindezidáig megkülönböztethetetlen [Moore, K. W. és munkatársai: Annu. Rév. Immunoi. 11, 165 (1993)].

Az mIL-10 gén 5,1 kb hosszúságú DNS-en elhelyezkedő öt exont tartalmaz. Maga a genomiális klón expresszálható mIL-10 proteint kódol. Az mIL-10 és hIL-10 gén az 1. egér-, illetve 1. emberi kromoszómán helyezkednek el [Moore és munkatársai (1993), lásd fentebb; és Kim, J. M. és munkatársai: J. immunoi. 148, 3 618 (1992)].

Az mIL-10 és hIL-10 nagymértékű DNS- és aminosavszekvencia-homológiát mutat az Epstein-Barr-vírus egy leolvasási keretével (BCRF1). A homológia az érett protein kódolószekvenciájára korlátozódik, és a szignálszekvenciában, vagy az 5’- és 3’-transzlálatlan szekvenciákban nem mutatható ki [Viera, P. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1 172 (1991)]. A három szekvencia közül - DNS-szekvencia szintjén - az mIL-10 és a hIL-10 áll legközelebb egymáshoz (81%), míg az érett hIL-10-et és BCRFl-proteint kódoló DNSszekvenciák 71 %-os homológiát mutatnak. A hIL-10 és a BCRF1 közötti aminosavszekvencia-homológia 84%os. Feltételezhető, hogy az mIL-10 és hIL-10 közös ősből alakult ki, míg a BCRF1 egy ősi érési folyamaton átesett, tokozott celluláris citokingént reprezentál, a BCRF1 protein és a hIL-10 közötti hasonlóság erőltetett. A BCRF1 az EBV litikus ciklusa során expresszálódik. A BCRF1 nyitott leolvasási kerete egy 17 kD-os szekretált polipeptidet kódol, amely - a hIL-10-hez hasonlóan - kevéssé vagy egyáltalán nem glikozilált. A BCRF1 mutat némi IL-10-aktivitást, és virális IL- 10-nek nevezik (vIL-10), de aktivitása csak a hIL-10 10%-át éri el.

Az IL-10 citokintermelésre gyakorolt hatása

A hIL-10 számos citokin termelődését gátolja, köztük a monociták/makrofágok és/vagy T-limfociták által termelt interferon-γ (IFN-γ), tumomekrózis-faktor-a (TNF-a), granulocita-makrofág-kolóniastimuláló faktor (GM-CSF), granulocita-CSF (G-CSF), IL-la, IL-Ιβ, IL-2, IL-6, IL-8 és monocita kemotaktikus polipeptid-1 (MCP-l/MCAF) termelődését [Fiorentino, D. F. és munkatársai.: J. Exp. Med. 170, 2 081 (1989); Viera, P. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1172 (1991)]. Az IL-10 gátolja a monociták - MCP-l/MCAF kemokinra adott reakcióként bekövetkező - migrációját is [Larsen, C. G. és munkatársai: J. Invest. Dermatol. 700(6), (1993)]. Ezenkívül, a hIL-10 egy endogén, természetes interleukin-1 receptorantagonista (IRAP) termelődését indukálja [Moore, K. W. és munkatársai: Annu. Rév. Immunoi. 77, 165 (1993)], amely - a receptorkötődés kompetíciója révén - gátolja az IL-la-t és IL—Ιβ-t. Mivel az IL-8 az IL— 1 α-val és IL-Ιβ-val könnyen indukálható, az IL-10 - az IRAP termelődésének fokozásával - gátolja az IL-8-termelődést is. Ez utóbbi mechanizmus a találmány szempontjából nagyon lényeges, amint azt a későbbiekben leírjuk, és példákkal szemléltetjük. Az IRAP gyulladáscsökkentő aktivitást mutat [Hannum, C. H. és munkatársai: Natúré 343, 336 (1990)], s felvetették, hogy reumatoid artritis esetében gyógyhatású lehet [Firestein, G. S. és munkatársai: Arthritis Rheum. 37, 644 (1994)]. Fisher és munkatársai kísérletében az IRAP hatásosnak bizonyult a szepszisszindróma kezelésében, melynek során előnyös, dózisfüggő 28 napos túlélési hatást mutatott (p=0,015) [Fischer, C. J. Jr. és munkatársai: Crit-Care-Med. 22, 12 (1994)]. Az IRAP gyulladáscsökkentő hatását részben a kemokintermelődés (mint például az IL-8-termelődés) gátlásával fejti ki.

IL-10 és az antigénexpresszió

Az IL-10 gátolja az emberi monocitákon az MHC II. osztályú expressziót [Carter, D. B. és munkatársai: Natúré 344, 633 (1990)]. A hlL-10 gátolta a HLA-DR/DP és DQ konstitutív és IL-4 vagy IFN-γ indukálta expresszióját [de Waal-Malefyt, R. és munkatársai: J. Exp. Med. 174, 915 (1991)]. Emellett az IL-10-zel inkubált monociták ellenállnak az MHC II. osztályú expresszió IL-4-gyel vagy IFN-y-val történő indukálásának. Az IL-10 a humán monocitákon lejátszódó MHC II. osztályú expressziót - LPS-aktiválást követően - is gátolja [de Waal-Malefyt és munkatársai (1991), lásd fentebb; és Sankoff és Kruskal: „Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison” 1. fejezet, (Addison-Wesley, Reading, Mass., 1983)]. Balb/c egereknek a letális dózisú LPS beadásával egy időben adott 1-10 mg IL-10 megvédte őket a pusztulástól [Moore és munkatársai: Annu. Rév. Immunoi. 77, 165 (1993)].

Az IL-10 gátolja a nitrogén, a nitrogén köztestermékek és a szuperoxid-anionok termelődését, továbbá gátolja az reaktív nitrogén köztestermékek (NO), valamint a reaktív oxigén köztestermékek (H₂O₂) - IFN-γval aktivált makrofágok általi - termelését [Gazzinelli, R. T. és munkatársai: J. Immunoi. 148, 1792 (1992)]. IL-10 és a T-sejt-aktivitás

Az IL-10 modulátorhatást gyakorol a T-sejt-funkciókra, illetve -aktivitásra. Ilyenformán, a hIL-10 a

HU 220 344 Β

CD8+ T-limfociták hatásos kemotaktikus faktora, míg a CD4+ T-sejtek felé nem mutat kemotaxist [Jinquan, T. és munkatársai: Journal of Immunology 151, 4545 (1993)]. Az IL-10 ezenkívül gátolja a CD4+ Tsejtek azon képességét, hogy reagáljanak a RANTES β-kemokin, illetve az IL-8 α-kemokin kemotaktikus jeleire. A hIL-10 közvetlenül gátolja az emberi perifériás vér T-sejtek és a CD4+ T-sejt-klónok proliferációját [Jinquan és munkatársai, lásd fentebb].

IL-10 és a B-limfociták

A hIL-10 kostimulálja az immobilizált anti-IgM antitesttel keresztkötő felületi Ig-vel indukált B-limfocitaproliferációt, és ezt a hatást fokozza, ha a B-sejtek serkentése a saját CD40 antigénjük anti-CD40 antitesttel és - humán FcyRII/CD32-t expresszáló - egér-L-sejtek keresztkötésével történik [Rousset, F. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci USA 175, 671 (1992)]. Az IL-10 - aktivált B-sejtek proliferációjára és differenciálódására gyakorolt - hatása felveti annak lehetőségét, hogy ez a citokin lehet felelős a hIL-10-et expresszáló T-sejtek azon kiemelkedő képességének nagy részéért, miszerint segítik a B-sejt-reakciókat.

IL-10 mint az immunrendszer homeosztatikus faktora

Úgy tartjuk, hogy az IL-10 fentebb említett funkcióinak fiziológiai következménye, bizonyos mértékig, az immunrendszer homeosztázisa. így, az IL-10 egyértelműen gátolja a „helper” T-sejt-funkciókat, s feltehetően serkenti a szuppresszor funkciójú T-sejteket. Következésképpen úgy véljük, hogy - az IL-4-hez hasonlóan - az IL-10 szabályozza a T-sejtek Thl és Th2 citokinprofílja közötti egyensúlyát, vagyis gátolja a Thl-sejtek differenciálódását. Mivel a Thl-sejtekre olyan citokinek termelése jellemző (IFN-γ és IL-2), amelyek a sejt közvetítette immunreakcióknak kedveznek, a Th2-sejtek pedig Immorális reakciót elősegítő citokineket (IL-4, IL-5 és IL-10) termelnek, és szuppresszálják a sejt közvetítette immunreakciókat, valószínű, hogy az IL-10 szuppresszálja a T-sejt közvetítette immunreakciókat (mint például a késői típusú hiperszenzitivitási reakciókat), miközben elősegíti a Immorális reakciókat.

Az IL-10 fentebb említett sajátságai következtében az IL-10 aktivitása a makrofágok és a Thl citokinszintézis inhibitoraként írták le, következésképpen azt vizsgálták, hogy az IL-10 termelődésének és/vagy aktivitásának hiánya szerepet játszik-e olyan betegségekben, amelyek kialakulását feltételezhetően fokozott sejt közvetítette immunreaktivitás okozza (mint például az autoimmun betegségek és a gyulladásos betegségek esetében). Az anti-IL-10 antitesttel kezelt egerek a monokin indukálta gyulladásra erősebb gyulladásos reakciót mutatnak, és LPS-sel indukált szeptikus sokk (ami egy monokin közvetítette gyulladásos reakció) következtében lényegesen könnyebben elpusztulnak [Howard, M. és munkatársai: J. Clin. Immunoi. 12, 239 (1992)]. Az anti-IL-10 antitesttel kezelt egerekben - fekélyes vastagbélgyulladáshoz hasonló - spontán bélgyulladásos reakciók alakulnak ki [Kuhn, R. és munkatársai: Cell 75, 263 (1993)]. Vizsgálták továbbá, hogy az IL-10 szerepet játszik-e a különböző parazita-, mycobacterium- vagy vírusfertőzésekben, s kimutatták, hogy a Schistosoma mansoni-fe.tfő'z&ssQl kapcsolatos immunparézisben kórélettani szerepet játszik [Sher, A. és munkatársai: J. Immunoi. 147, 2713 (1991)]. Felvetették továbbá, hogy az IL-10 szerepet játszik a Mycobacterium /eprae-fertőzésekben is. Az utóbbi időben felismerték, hogy a gyenge prognózissal rendelkező AIDS-es páciensek vérplazmájában nagyobb mennyiségű IL-10 található, s felvetették annak lehetőségét, hogy ez hozzájárul - az AIDS-es páciensek esetében ismert - immunparézishez [Clerici, M. és Shearer, G. M.: Immunology Today 14, 107 (1993)].

Gyógyászati megfontolások A fenti in vivő eredmények és adatok arra utalnak, hogy az IL-10 a sejt közvetítette és a monokin erősítette „immungyulladás” kontrollálásában homeosztatikus szerepet játszik, és az IL-10 - vagy egy IL- 10-hez hasonló aktivitású gyógyszer - széleskörűen alkalmazható az IL-10 csökkent, illetve elégtelen termelődésével és/vagy aktivitásával jellemezhető betegségek kezelésében. Mivel a találmány szerinti anyag - melynek példájaként az IT9 302-nonapeptidet említjük - az alábbi hatásokkal fejti ki IL-10-hez hasonló aktivitását

1. a humán monociták IRAP-termelésének indukálása;

2. a humán monociták spontán IL-8-termelésének gátlása;

3. az egymagvú perifériásvér-sejtek (PMBC) ΙΕ-Ιβ-val serkentett - IL-8-termelésének gátlása;

4. a CD8+ (de nem a CD4+) T-sejtek kemotaktikus migrációjának serkentése;

5. a CD8+ T-sejtek rhIL-10 indukálta kemotaktikus migrációval szembeni deszenzibilizálása;

6. a humán CD4+ T-sejtek IL-8 közvetítette kemotaxisának gátlása;

7. a humán monociták MCP-l/MCAF közvetítette kemotaxisának gátlása;

8. a tenyésztett normális humán CD4+ T-sejtek IL-4-termelésének indukálása;

9. a TNFa - vegyes humánleukocita-reakcióban történő - termelődésének csökkentése;

így ez a polipeptid - és analógjai - a hIL-10-ével azonos gyógyászati lehetőségeket hordozhatnak. A 3. táblázatban néhány olyan betegséget sorolunk fel, amelyekben egy IL-10-hez hasonló (vagy egy IL-10-szerű aktivitást mutató) immunmodulátor gyógyászati jelentőséggel bírhat.

3. táblázat

Néhány olyan betegség, amelyben egy IL-10-szerű aktivitással rendelkező immunmodulátor (IRAP-indukciójának és/vagy citokintermelódésés/vagy -aktivitás-gátlásának köszönhetően) gyógyászati jelentőséggel bírhat

Fertőzés vagy más rendellenességek okozta koraszülés Reumatoid artritis Lyme-féle artritis

HU 220 344 Β

3. táblázat (folytatás)

Köszvény

Szepszis-szindróma

Hyperthermia

Fekélyes vastagbélgyulladás vagy vékony- és vastagbélgyulladás

Osteoporosis

Cytomegalovírus

Periodontális betegségek

Glomerulonephritis

Krónikus, nem fertőző tüdőgyulladás (például sarcoidosis és dohányzók tüdőgyulladása)

Granulomaképződés

Májfibrózis

Tüdófibrózis

Transzplantátumkilökődés „Graft-versus-host” betegség

Krónikus myeloid leukémia

Akut myeloid leukémia

Egyéb daganatos betegségek

Tüdőasztma

Inzulinfüggő (I. típusú) diabetes mellitus

Arteriosclerosis/atherosclerosis

Psoriasis

Krónikus B-limfocita leukémia

Általános, változatos immunhiány

Egyéb biológiai reakciómodulátorok alkalmazásával kapcsolatos mellékhatások

Disszeminált intravaszkuláris véralvadás

Szisztémás sclerosis

Encephalomyelitis

Tüdőgyulladás

Hiper-IgE-szindróma

Enterocolitis

Rák metasztázis

Adoptív immunterápia

Szerzett légzési elégtelenség szindróma

Szepszis

Reperíúziós szindróma

Műtét utáni gyulladás

Szervátültetés

Alopecia [Bry, K. és Lappalainen, U.: Am. J. Obstet. Gynecol. 770(4), 1 194 (1994); Firestein és munkatársai: Arthritis-Rheum. 37(5) 644 (1994); Roberge és munkatársai: J. Immunoi. 752(11), 5 485 (1994); McCall és munkatársai: Gastroenterology 4, 960 (1994); Kimble és munkatársai: J. Clin. Invest. 93(5), 1959 (1994); Kline és munkatársai: J. Immunoi. 752(5), 2 351 (1994); Tompkins, R. G.: Crit-Care-Med. 22(1) 3 (1994) és 22(1) 12 (1994); Everaerdt és munkatársai : J. Immunoi. 750(10) 5041 (1994); Fischer és munkatársai: Crit-Care-Med. 22(1) 12 (1994) és 22(1) 3 (1994); Bomez-Reino-Carnoto: Med. Clin. 543 (1994); Nishihara és munkatársai: Infect. Immun. 62(2) 390 (1994); Simon és munkatársai: Endocrinology 734(2) 521 (1994) és 734(2) 519 (1994); Baergen és munkatársai: Arch. Pathol. Láb. Med. 773(1) 52 (1994);

Tang és munkatársai: J. Clin. Invest. 93(1) 279 (1994); Cassatella és munkatársai: J. Exp. Med. 779(5) 1 695 (1994); Mancini és munkatársai: Virchows. Arch. 424(1), 25 (1994); Lukacs és munkatársai: Blood 32(12), 3 668 (1993); Bandara és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(22), 10 764 (1993); Dinarello, C. A.: Can. J. Infect. Dis. 5 (A melléklet), 9A (1994); Oelmann és munkatársai: Int. J. Oncol. 4, 555 (1994); Estrov, Z.: Sémin. Hematol. 30, 35 (1993); Wooley és munkatársai: Arthritis Rheum. 36, 1 305 (1993); Peterson és munkatársai : Endocrinol. 133, 2 301 (1993); Estrov és munkatársai: Leuk. Lymphoma 70, 407 (1993); Chensue és munkatársai: J. Immunoi. 757, 3 654 (1993); Bowyer és munkatársai: J. Pharmacol. Exp. Ther. 268, 1571 (1994); Colé és munkatársai: Prostaglandins 46, 493 (1993); Jenkins és Arend: Cytokine 5,407 (1993); Coceani és munkatársai: Can. J. Pharmacol. 70, 1 590 (1993); Schiro és munkatársai: Blood 33, 460 (1994); Watson és munkatársai: Am. J. Respir. Cell Mól. Bioi. 3, 365 (1993): Abhyankar és munkatársai: Transplantation 56, 1 518 (1993); Lan és munkatársai: Kidney Int. 43, 479 (1993); Herve, P: Nouv. Rév. Fr. Hematol 35, 295 (1993); Conti és munkatársai: Cell Immunoi. 745, 199 (1992); Kristensen és munkatársai: Br. J. Dermatol. 127, 305 (1992); Romero és munkatársai: Am. J. Obstet. Gynecol. 767, 863 (1992); Dinarello, C. A.: Int. J. Tissue React. 74, 65 (1992); Conti és munkatársai: Clin. Exp. Immunoi. 91, 526 (1993); DeForge és munkatársai: Am. J. Pathol. 740, 1 045 (1992); Porát és munkatársai: Faseb. K. 6, 2482 (1992); Boermeester és munkatársai: Ned. Tijdschr. Geneesks. 737, 337 (1993); Smith és munkatársai: Arthritis Rheum. 34, 78 (1991); Conti és munkatársai: Int. J. Immunopharm. 74, 987 (1992); Selig, W. és Tocker: Eur. J. Pharmacol. 273, 331 (1992); McCarthy és munkatársai: Blood 73, 1915 (1991); Estrov és munkatársai: Blood 73, 1 476 (1991); Thomas és munkatársai: Agents Actions 34, 187 (1991); Carter és munkatársai: Natúré 344, 633 (1990); Larsen és munkatársai: Science 243, 1 464 (1989)].

IL-10-szerű aktivitással rendelkező, IL-10-zel homológ nonapeptid kifejlesztése

A hIL-10 kilenc aminosavat tartalmazó részleges szekvenciáját azon elv alapján választottuk ki, miszerint a szekvenciának a vIL-10 és hIL-10 vonatkozásában nagymértékű homológiát kell mutatnia, de az mIL-10-zel a lehető legkisebb homológiával kell rendelkeznie. Ez a stratégia azon alapul, hogy a vIL-10 részlegesen keresztreaktív a hIL-10-zel, míg az mIL-10 nem mutat keresztreaktivitást a hIL- 10-zel (lásd fentebb). Ennek megfelelően, a hIL-10 - emberi szervezetben kifejtett bizonyos hatásokért felelős szekvenciájának olyan doménban kell elhelyezkednie, amely jelentős mértékben homológ a vIL-10-zel, az mIL-10-zel csekély homológiát mutat.

Feltételezzük, hogy a hIL-10 szignálpolipeptidje az első 18 aminosavat foglalja magában. Az érett protein a 19. aminosavnál kezdődik (a funkcionális proteinben ez az 1. aminosav, név szerint egy szerin), és a teljes protein 160 aminosavat tartalmaz. Az emberi és a

HU 220 344 Β virális IL-10 C-terminális szekvenciáit - és különösen a 157. (lizin) és 159. (arginin) aminosavat - tekintve, úgy találtuk, hogy a receptorkötődésért részben ez a dómén a felelős (1. és 2. ábra).

Több - kémiai szintézissel előállított - lehetséges szekvencia IL-10-szerű aktivitásra történő átvizsgálása után azt találtuk, hogy egy szintetikus nonapeptid (IT9 032) rendelkezett némi immunszuppresszív aktivitással, amely hasonlított a hIL-10 aktivitásához (részletesebben lásd a példákban). Az IT9 302 megfelel a hIL-10 C-terminálisától induló nonapeptid-szekvenciának, melynek aminosavszekvenciája a következő: (1. azonosítószámú szekvencia):

NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn-COOH.

Az IT9 302 100%-os homológiát mutat a hIL-10 C-terminálisának 152-160. aminosavai alkotta - szakaszával. Ez a polipeptid hat olyan aminosavat tartalmaz, amely - a megfelelő szakaszt tekintve - közös a vIL-10 szekvenciájával (lásd 1. és 2. ábra), ami azt jelenti, hogy 9 aminosav közül 6, vagyis az aminosavak 66%-a azonos, míg a polipeptid négy aminosava közös az mIL-10 szekvenciájával, ami 44%-os azonosságot jelent. Jelen pillanatig ez a nonapeptid az egyedüli hIL-10-ből kapott vagy származtatott - szekvencia, amely az alábbi példákban bemutatott speciális tulajdonságokkal rendelkezik. A találmány szerinti megoldás kidolgozásáig e szekvencia funkcionális dómén szerepére senki nem mutatott rá.

Ilyenformán szélesebb értelemben a találmány tárgya egy olyan anyag, amely hIL- 10-agonista-aktivitást mutat, azaz - a humán interleukin-10-től eltérő olyan anyag, amely az alábbi tulajdonságok közül eggyel vagy többel rendelkezik:

a) indukálja a humán monociták spontán IL-8termelésének gátlását;

b) indukálja a humán egymagvú perifériásvérsejtek - IL-ip-val indukált - IL-8-termelésének gátlását;

c) indukálja a humán monociták interleukin-1 receptorantagonista protein (IRAP)-termelését;

d) indukálja a humán CD8+-T-limfociták in vitro kemotaktikus migrációját;

e) deszenzibilizálja a humán CD8+-T-sejteket, ami rhIL-10-re való reagálóképtelenséget eredményez;

f) szuppresszálja a humán CD4+-T-limfociták IL-8-ra felé irányuló kemotaktikus reakcióját;

g) szuppresszálja a humán monociták MCAF/MCP-l-re irányuló kemotaktikus reakcióját;

h) a humán IL- 10-zel ellentétben, nem gátolja a humán monocitákon az MHC II. osztályú molekulák expresszióját;

i) indukálja a tenyésztett normális humán CD4+-Tsejtek IL-4-termelését;

j) vegyes humánleukocita-reakcióban csökkenti a TNFa termelődését.

E hatások közül a (d) és (g) pontban említetteket tartjuk a leginkább egyedülállóaknak. A találmány egyik előnyös megvalósítási módját olyan anyag képezi, amely - a fentebb leírtaknak megfelelően hIL-10-agonista-aktivitást mutat, és amely az AlaTyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn aminosavszekvenciát (vagy ennek analógját vagy változatát) tartalmazza. Ezt és - a leírásban, illetve az igénypontokban említett - minden más polipeptidszekvenciát hagyományos módon, az N-terminálistól a C-terminális irányába haladva írjuk le (még akkor is, ha ezt külön nem jelöljük).

Az IT9 302 nonapeptid nagyon hatásos a különböző funkciók indukálásában, továbbá nagyon stabil, és feltételezzük, hogy nem kapcsolódhat hibásan a receptorokhoz. Azért nonapeptidet választottunk a találmány megvalósításához, mert egy kilenc aminosavas polipeptidszekvencia egy proteinre általában egyedülállóan jellemző. Meg kell azonban jegyeznünk, hogy a hIL-10 legvégén lévő hat aminosav a legfontosabb.

Ilyenformán a találmány tárgyát képezi egy olyan anyag vagy polipeptid, amely a következő aminosavszekvenciát tartalmazza:

Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (1. azonosítószámú szekvencia).

Feltételezzük, hogy a találmány szerinti hIL-10agonista aktivitását nem befolyásolja károsan, ha tartalmaz néhány aminosavszubsztitúciót, mindaddig, amíg a treonin, lizin és arginin (közöttük egy-egy aminosavval) a helyén marad.

Ilyenformán szélesebb értelemben a találmány olyan polipeptidekre vonatkozik, amelyek a következő képletű szekvenciát tartalmazzák:

Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (19. azonosítószámú szekvencia) amelyben

X₄ és X₅ jelentése - egymástól függetlenül - Met, Ile, Leu vagy Val; és

X₆ jelentése Asn, Asp, Gin vagy Glu, azzal a feltétellel, hogy a peptid Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn képletű polipeptidtől eltérő.

A találmány tárgyát képezi továbbá a következő képletű polipeptid:

X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (20. azonosítószámú szekvencia) amelyben

X₃, X₄ és X₅ jelentése - egymástól függetlenül - Met,

Ile, Leu vagy Val; és

X₆ jelentése Asn, Asp, Gin vagy Glu.

A találmány tárgyát képezi továbbá a következő képletű polipeptid:

X₂-X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (21. azonosítószámú szekvencia) amelyben

X₂ jelentése Tyr vagy Phe;

X₃ X₄ és X₅ jelentése - egymástól függetlenül - Met,

Ile, Leu vagy Val; és

X₆ jelentése Asn, Asp, Gin vagy Glu.

A találmány előnyös megvalósítási módját képezik a következő képletű polipeptidek:

X,-X₂-X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (22. azonosítószámú szekvencia) amelyben

X, jelentése Alá vagy Gly;

HU 220 344 Β

X₂ jelentése Tyr vagy Phe;

X₃ X₄ és X₅ jelentése - egymástól függetlenül - Met,

He, Leu vagy Val; és

X₆ jelentése Asn, Asp, Gin vagy Glu.

A fentebb leírtak alapján a találmány olyan anyagra vagy polipeptidre vonatkozik, amely valamely fent említett aminosavszekvenciát tartalmaz, azzal a feltétellel, hogy az anyag vagy polipeptid nem humán IL-10.

A fentebb leírtak alapján feltételezhetően hIL-10agonista aktivitással rendelkező specifikus polipeptidek példái a következők:

1. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Met-Arg-AsnCOOH (2. azonosítószámú szekvencia);

2. NH₂-Ala-Phe-Met-Thr-Leu-Lys-Leu-Arg-AsnCOOH (3. azonosítószámú szekvencia);

3. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-GluCOOH (4. azonosítószámú szekvencia);

4. NH₂-Gly-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-AspCOOH (5. azonosítószámú szekvencia);

5. NH₂-Ala-Phe-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-AspCOOH (6. azonosítószámú szekvencia);

6. NH₂-Ala-Tyr-Ile-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-AspCOOH (7. azonosítószámú szekvencia);

7. NH₂-Ala-Tyr-Leu-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-AspCOOH (8. azonosítószámú szekvencia);

8. NH₂-Ala-Tyr-Val-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-AspCOOH (9. azonosítószámú szekvencia);

9. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Ile-Arg-AspCOOH (10. azonosítószámú szekvencia);

10. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Leu-Lys-Ile-Arg-AspCOOH (11. azonosítószámú szekvencia);

11. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Val-Lys-Ile-Arg-AspCOOH (12. azonosítószámú szekvencia);

12. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-AspCOOH (13. azonosítószámú szekvencia);

13. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Met-Arg-AspCOOH (14. azonosítószámú szekvencia);

14. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-AspCOOH (15. azonosítószámú szekvencia);

15. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-GlnCOOH (16. azonosítószámú szekvencia);

16. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-GluCOOH (17. azonosítószámú szekvencia).

Az összehasonlítás kedvéért szintetizáltunk egy másik (IT9 301 elnevezésű) nonapeptidet is, amely a hIL-10 szekvenciájával 100%-os homológiát mutatott. Ez a polipeptid a hIL-10 N-terminális végén kezdődő (a 19. aminosavtól a 27. aminosavig terjedő, vagyis az érett protein első 9 aminosavát tartalmazó) nonapeptidszekvenciának felel meg, melynek aminosavszekvenciája a következő:

NH₂-Ser-Pro-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Ser-Glu- COOH (13. azonosítószámú szekvencia).

Ez a polipeptid (az alábbiakban leírt technikákat alkalmazva) nem mutatott IL-10-szerű aktivitást, és csupán azért választottuk ki, mert ez a szekvencia helyezkedik el a hIL-10 másik végén (kísérleteink során többnyire negatív kontrollként alkalmaztuk). Az IT9 301 polipeptid - a vIL-10-zel mutatott homológia és a receptorkötődéshez előnyös aminosavak tekintetében

- nem rendelkezett a C-terminális szekvencia jellemzőivel. Ezt a polipeptidet IL-ip-val indukált egymagvú perifériásvér-sejtek alkalmazásával IL-8-termelésre teszteltük, de a sejtek IL-8-termelését egyáltalán nem gátolta.

A találmány értelmében a „találmány szerinti hIL- 10-agonista anyag” kifejezés magában foglalja valamennyi, az IT9 302 polipeptiddel azonos, vagy ahhoz szerkezetileg hasonló, gyógyászati szempontból aktív és elfogadható vegyületet, melyek az 1T9 302 polipeptidéhez hasonló biológiai működést mutatnak; ezek közé tartoznak az IT9 302 polipeptid származékai, különösen annak gyógyászati szempontból elfogadható sói, észterei és szolvátjai, valamint az IT9 303 polipeptid (vagy származékainak, beleértve a peptidutánzó vegyületeket) konjugátumai. Az IT9 302 polipeptidet N-terminálisánál kovalensen hordozókhoz (például polietilénglikolhoz vagy cukorhoz) kapcsolva növelhetjük in vivő felezési idejét.

A találmány leírásában a következő definíciókat használjuk.

A „citokin” kifejezés egy olyan proteinszerű mediátor általános elnevezése, amelyet elsősorban - de nem kizárólag - az immunrendszer egy sejtcsoportja szabadít fel, mégpedig egy specifikus stimulálóanyagra (például specifikus antigénre vagy alloantigénre), vagy egy nem specifikus, poliklonális aktivátorra (például egy Gram-negatív baktérium endotoxinjára vagy más sejtfalkomponensére) adott reakcióként.

A „limfokin” kifejezés olyan proteinszerű mediátor általános elnevezése, amelyet egy stimulálóanyagra (például specifikus antigénre vagy alloantigénre) adott reakcióként a szenzibilizált limfociták; vagy egy poliklonális aktivátor (például Gram-negatív baktériumok endotoxinjára vagy más sejtfalkomponensére) adott reakcióként limfociták szabadítanak fel.

Az „interleukin” kifejezés olyan proteinszerű mediátor általános elnevezése, amelyet egy stimulálóanyagra (például specifikus antigénre vagy alloantigénre) adott reakcióként elsősorban - de nem kizárólag - a makrofágok, T-, B- vagy NK-sejtek; vagy egy poliklonális aktivátor (például Gram-negatív baktériumok endotoxinja vagy más sejtfalkomponense) hatására a limfociták szabadítanak fel.

A „monokin” kifejezés olyan proteinszerű mediátor általános elnevezése, amelyet bármilyen stimulálóanyagra adott reakcióként elsősorban - de nem kizárólag - egymagvú fagocita, például monocita, makrofág vagy Kupffer-sejt (máj) vagy Langerhans-sejt (bőr) szabadít fel.

A „kemokin” kifejezés egy olyan proteinszerű mediátor kemotaktikus és/vagy leukocitaaktiváló mediátor általános elnevezése, amelyet egy specifikus stimulálóanyagra (például specifikus antigénre vagy alloantigénre), vagy nem specifikus, poliklonális aktivátorra (például Gram-negatív baktériumok endotoxinjára vagy más sejtfalkomponenseire) adott reakcióként elsősorban - de nem kizárólag - az immunrendszer egy sejtcsoportja szabadít fel, és amely a kemokin-α vagy a kemokin-β géncsaládba tartozik.

HU 220 344 B

Az „interferon” kifejezés olyan proteinszerű, antivirális és/vagy monocitaaktiváló mediátor általános elnevezése, amelyet egy vírusra vagy egy interferonindukáló anyagra (például polinukleotidra) adott reakcióként elsősorban - de nem kizárólag - az immunrendszer egy sejtcsoportja; közelebbről, egy specifikus stimulálóanyagra (például specifikus antigénre vagy alloantigénre), vagy nem specifikus, poliklonális aktivátorra (például Gram-negatív baktériumok endotoxinjára vagy más sejtfalkomponenseire) adott reakcióként az immunrendszer sejtjei szabadítanak fel.

A „kolóniastimuláló faktor” kifejezés egy olyan proteinszerű, vérképzési kolóniastimuláló mediátor általános elnevezése, amelyet egy specifikus stimulálóanyagra (például specifikus antigénre vagy alloantigénre), vagy nem specifikus, poliklonális aktivátorra (például Gram-negatív baktériumok endotoxinjára vagy más sejtfalkomponenseire) adott reakcióként elsősorban de nem kizárólag - az immunrendszer egy sejtcsoportja szabadít fel.

Ahogy a leírásban és az igénypontokban használjuk, a „polipeptid” kifejezés legalább két, legfeljebb tíz aminosavat tartalmazó, rövid peptidekre, 11-100 aminosavat tartalmazó oligopeptidekre és hosszabb peptidekre (ami a „polipeptidek” általános jelentése), vagyis több, mint 100 aminosavat tartalmazó peptidekre, valamint proteinekre vonatkozik (amelyben a funkcionális egység legalább egy peptidből, oligopeptidből vagy polipeptidből áll, amely kémiailag módosított lehet, vagyis tartalmazhat glikozilcsoportot, lipidet vagy prosztetikus csoportot). A polipeptidek definíciója magában foglalja a peptidek és proteinek emberi szervezetben megtalálható natív alakjait, továbbá a rekombináns proteineket vagy peptideket, melyek bármilyen gazda transzformálásához alkalmas bármilyen expressziós vektorban elhelyezkedhetnek, valamint a kémiai úton szintetizált peptideket is.

A találmány egyik megvalósítási módját olyan polipeptid képezi, amely a humán IL-10 szekvenciájának részszekvenciáját tartalmazza, és amely a vIL-10 szekvenciájával 66%-os, az mIL-10 szekvenciájával pedig 44%-os homológiát mutat. Ezt a szekvenciát az 1. azonosítószámú szekvenciaként mutatjuk be. A „homológia” kifejezésen aminosavszekvenciák azonosságát értjük, melyek - a polipeptidek egymásnak megfelelő pozícióiban - két vagy több aminosavból álló szakaszokon egyformák.

Ennek megfelelően, a homológia két aminosav(vagy nukleotid-) szekvencia közötti hasonlóság mérőszáma. A homológiát két szekvencia (melyek nem feltétlenül egyforma hosszúságúak) egymás alá rendezése („alignment”) után az egyező aminosavak (vagy bázisok) arányaként vagy százalékaként fejezzük ki. Az „egymás alá rendezés” kifejezést Sankoff és Kruskal által leírt értelemben alkalmazzuk [“Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison” 1. fejezet, (Addison-Wesley, Reading, Mass., 1983)]. Eszerint két szekvenciát úgy helyezünk egymás alá, hogy - a maximális átfedés elérése érdekében bármelyik szekvenciába minimális számú „üres” vagy „null”-házist (vagy aminosavat) beiktatva - az egymás alatt lévő, egyező bázisok (vagy aminosavak) lehető legnagyobb számát éljük el.

Ilyenformán, a leírásban a „homológ” kifejezést többek között - egy adott polipeptid aminosavszekvenciája és az IT9 302 nonapeptid aminosavszekvenciája közötti azonosság mértékének bemutatására alkalmazzuk. Az 1T9 302 nonapeptid aminosavszekvenciájával összehasonlítani kívánt aminosavszekvenciát leszármaztathatjuk egy - például a későbbiekben leírtak szerint végzett hibridizációval kapott - nukleotidszekvenciából (például DNS- vagy RNS-szekvenciából), de megállapíthatjuk a hagyományos aminosavszekvenálási eljárásokkal is. A homológia mértékét előnyösen egy érett polipeptid aminosavszekvenciája alapján határozzuk meg (vagyis a vezetőszekvenciák figyelmen kívül hagyásával). Nukleotidszekvenciák összehasonlítása esetében általában csak a kódolórégiókat alkalmazzuk, annak érdekében, hogy belső homológiájukat határozzuk meg.

Bár előnyös, ha a találmány szerinti polipeptid jelentős mértékű homológiát mutat a hIL-10-zel és vIL-10-zel, nem lehetetlen, hogy a hIL-10 rész szekvenciáinak részszekvenciái, melyek a vIL-10-zel kisebb mértékű (például 50%-os, 55%-os vagy 60%-os) homológiát mutatnak, szintén kifejtsenek egy vagy több előnyös hIL-10-agonista-aktivitást. Sőt, amint fentebb leírtuk, nem tartjuk feltétlenül fontosnak, hogy a hIL-10-zel mutatott homológia 100%-os legyen. A találmány tárgyát képezik azok a polipeptidek is, amelyek a hIL-10-zel kisebb mértékű (például 75%os, 80%-os, 85%-os, 90%-os vagy 95%-os) homológiát mutatnak, bár a 100%-os homológia az előnyös.

Az ilyen polipeptideket a nonapeptid analógjainak tekintjük. Az „analógja vagy változata” kifejezésen olyan polipeptidet értünk, amely nem pontosan az Ala-TyrMet-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn aminosavszekvenciát (1. azonosítószámú szekvencia) tartalmazza, de „hIL-10agonista-aktivitást” (amint azt fentebb meghatároztuk) mutat. Ezek a polipeptidek általában olyan polipeptidek, amelyek aminosav-összetétele - a példákban leírt IT9 302 nonapeptidhez képest - bizonyos mértékben eltérő, illetve transzláció utáni módosításokat tartalmaznak, például glikoziláltak vagy foszforiláltak.

Ilyenformán a találmány leírásában az „analóg” vagy „változat” kifejezéssel azt jelezzük, hogy egy adott protein vagy polipeptid az IT9 302 nonapeptid aminosavszekvenciájától némileg eltérő - de még mindig hasonló - aminosavszekvenciát tartalmaz. Az eltéréseket például deléciók, helyspecifikus mutációk, újabb aminosavak inszerciói (vagy ezek kombinációi) eredményezhetik, miáltal az IT9 302 polipeptidanalógjai jönnek létre.

A helyspecifikus mutagenezis az eredeti protein szekvenciájában konzervatív aminosavszubsztitúciók és hasonlók megvalósításának egy kényelmes módját képezi. Más lehetőség szerint, az analógok jól ismert folyadék vagy szilárd fázisú - polipeptidszintézissel is előállíthatok, melynek során a polipeptidszekvencia egyes aminosavait egymáshoz kapcsoljuk. A polipepti10

HU 220 344 Β det szintetizálhatjuk úgy is, hogy az egyes aminosavakat a polipeptid fragmenseivé kapcsoljuk össze, majd ezeket a fragmenseket egymáshoz kapcsolva a kívánt polipeptidet kapjuk.

Az itt használt „konzervatív” kifejezés azt jelenti, hogy (i) a módosítások konformációs szempontból - lehetőség szerinti legnagyobb mértékben - semlegesek, azaz úgy terveztük őket, hogy a mutáns polipeptid negyedleges szerkezetében - az eredeti proteinéhez képest - minimális változásokat okozzanak; és (ii) a módosítások antigénhatás szempontjából - lehetőség szerinti legnagyobb mértékben - semlegesek, azaz úgy terveztük őket, hogy a mutáns polipeptidantigéndeterminánsaiban - az eredeti proteinéhez képest - minimális változásokat okozzanak. A konformációs semlegesség a biológiai aktivitás megőrzése szempontjából, az antigenikus semlegesség pedig a találmány szerinti anyagokkal kezelt páciensekben vagy állatokban az immunreakciók kiváltásának elkerülése érdekében kívánatosak. Bár nehéz abszolút bizonyossággal kiválasztani, hogy mely változatok lesznek konformációs és antigenikus szempontból semlegesek, léteznek bizonyos szabályok, amelyek útmutatást adhatnak arra vonatkozóan, hogy miképpen hozhatók létre olyan módosítások, amelyek nagy valószínűséggel konformációs és antigenikus semlegességet biztosítanak [lásd például Berzofsky: Science 229, 932 (1985); és Bowie és munkatársai: Science 247, 1 306 (1990)]. A legfontosabb szabályok közül megemlítünk néhányat: (1) a hidrofób aminosavak helyettesítése kisebb valószínűséggel okoz változásokat az antigenitásban, mivel ezek valószínűleg a protein belsejében helyezkednek el [Berzofsky (1985), lásd fentebb; Bowie és munkatársai (1990) lásd fentebb]; (2) a fizikokémiailag hasonló (vagyis szinonim) aminosavak helyettesítése kisebb valószínűséggel okoz konformációs változásokat, mivel a helyettesítő aminosav ugyanazt a strukturális szerepet tölti be, mint a helyettesített aminosav; és (3) az evolúció során konzervált szekvenciák módosítása valószínűleg káros konformációs hatásokat okoz, mivel a konzerváltság arra utal, hogy az adott szekvencia funkcionális szempontból lényeges. A muteinszekvenciák kiválasztásának alapvető szabályai mellett léteznek olyan vizsgálatok, amelyekkel ellenőrizhető a manipulált molekulák biológiai aktivitása és konformációja. A találmány szerinti anyagok vizsgálatához alkalmas eljárásokat a példákban írjuk le részletesen. A konformációs változások legalább két jól ismert vizsgálattal tesztelhetők: az egyik a mikrokomplement fixációs eljárás [lásd például Wasserman és munkatársai: J. Immunoi. 87, 290 (1961); és Levine és munkatársai: Methods in Enzymology 11, 928 (1961)], amely széleskörűen alkalmazható a proteinek negyedleges szerkezetének evolúciós vizsgálatához; a másik pedig a konformációspecifikus monoklonális antitestekhez mutatott affinitáson alapuló eljárás [például Lewis és munkatársai: Biochemistry 22, 948 (1983)].

Ilyenformán a találmány egyik lényeges megvalósítási módját egy olyan polipeptid képezi, amelyben legalább egy aminosavat egy másik aminosavval helyettesítettünk és/vagy amelyben legalább egy aminosavat delécióval eltávolítottunk vagy addícióval az aminosavszekvenciához adtunk, miáltal az alábbiakban meghatározott aminosavszekvenciától vagy annak részszekvenciájától eltérő aminosavszekvenciát tartalmazó polipeptidet kaptunk, amely lényegében (a fentebb meghatározott) hIL-10-agonista-aktivitással rendelkezik.

A találmány egy érdekes megvalósítási módját olyan polipeptid képezi, amely a találmány szerinti polipeptid analógja és/vagy annak legalább egy részét összesen 10-100 aminosavat, például legalább 12, legalább 15, legalább 20 vagy legalább 30 aminosavat tartalmaz.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti anyagot vagy polipeptidet lényegében tiszta alakban alkalmazzuk. Ennek megvalósítása érdekében szükség lehet a polipeptid tisztítására. A polipeptidek tisztításához alkalmazható eljárások példái a következők: (i) antitestekkel végzett immunprecipitáció vagy affinitáskromatográfia; (ii) alkalmas ligandummal végzett affinitáskromatográfia; (iii) egyéb kromatográfiás eljárások, mint például gélfiltrációs kromatográfia, ioncserélő kromatográfia vagy nagy teljesítményű folyadékkromatográfia vagy ezek változatai; (iv) elektroforézises eljárások, mint például a poliakrilamid-gélelektroforézis, denaturáló poliakrilamid-gélelektroforézis, agaróz-gélelektroforézis és izolelektromos fokuszálás; és (v) bármilyen más, specifikus szolubilizációs és/vagy tisztítási eljárás.

Szintén a találmány tárgyát képezi egy nukleotidszekvencia, amely egy fentebb meghatározott polipeptidet kódol; közelebbről, egy olyan nukleotidszekvencia, amely az 1. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó vagy abból álló polipeptidet kódolja; például egy nukleotidszekvencia, amely a következő szekvenciát tartalmazza:

GCC TAC ATG ACA ATG AAG ATA CGA AAC (23. azonosítószámú szekvencia); vagy egy olyan nukleotidszekvencia, amely az említett aminosavszekvencia részszekvenciáját tartalmazó polipeptidet kódolja. A találmány tárgyát képezi továbbá egy módosított nukleotidszekvencia, amely annyiban tér el az előző nukleotidszekvenciától, hogy legalább egy nukleotidja deletált, szubsztituált vagy módosított, vagy legalább egy további inszertált nukleotidot tartalmaz, ami egy hIL- 10-agonista-aktivitással rendelkező polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát eredményez.

A leírásban és az igénypontokban a „részszekvencia” kifejezés olyan szekvenciára vonatkozik, amely előnyösen legalább 18 nukleotidot, előnyösebben legalább 21 nukleotidot, legelőnyösebben legalább 24 nukleotidot tartalmaz. A találmány számos megvalósítási módjában a találmány szerinti nukleotidszekvencia részszekvenciája vagy analógja legalább 27 nukleotidot, például legalább 30 nukleotidot vagy legalább 45 nukleotidot tartalmaz. A „részszekvencia” által kódolt polipeptidnek a fentebb felsorolt (a)-(g) kritériumok legalább egyikének kell megfelelnie és/vagy a nukleotid-„részszekvenciának” - rendkívül szigorú fel11

HU 220 344 Β tételek mellett - hibridizálódnia kell a 23. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó nukleotidszekvenciával.

A hibridizációs feltételekkel kapcsolatban alkalmazott „rendkívül szigorú” kifejezés - az idevonatkozó szakirodalomban található meghatározás szerint - az olvadáspontnál 5-10 °C-kal alacsonyabb hőmérsékletet jelent [vesd össze Sambrook és munkatársai 11.45-11.49 (1989)].

Az találmány szerinti DNS-fragmensekkel kapcsolatban alkalmazott „analóg” kifejezés olyan nukleotidszekvenciát jelent, amely a fentebb említett DNS által kódolt polipeptiddel azonos vagy lényegében azonos polipeptidet kódol. Jól ismert, hogy egy aminosavat több kodon is kódolja, s a kodonfelhasználás, többek között attól függ, hogy a nukleotidszekvenciát expresszáló organizmusban melyek az előnyösek. Ennek megfelelően a találmány szerinti DNS-fragmens egy vagy több nukleotidját vagy kodonját más nukleotidra vagy kodonra cserélhetjük, melyek expresszálódva a fentebb bemutatott DNS-fragmens által kódolt polipeptiddel azonos vagy lényegében azonos polipeptidet eredményeznek.

Ezenkívül az „analóg” és „részszekvencia” kifejezésen a szekvencia olyan változtatásait értjük, mint például szubsztitúciót, inszerciót (beleértve az intronokat), addíciót és egy vagy több nukleotid átrendeződését, amelyeknek - a DNS-fragmens vagy részszekvenciája által kódolt - polipeptid hIL-10-agonista-aktivitására nincs semmilyen jelentős káros hatásuk. Ilyenformán szintén a találmány tárgyát képezi egy nukleotidszekvencia, amely az 1. azonosítószámú aminosavszekvencia részszekvenciáját tartalmazó polipeptidet kódolja.

A találmány szerinti polipeptidek rekombináns DNS-technika alkalmazásával állíthatók elő. A találmány egy lényeges megvalósítási módját egy találmány szerinti nukleotidszekvenciát magában foglaló expressziós rendszer képezi. Ennek megfelelően szintén a találmány tárgyát képezi egy találmány szerinti nukleotidszekvenciát tartalmazó expressziós rendszer, mint például replikációra képes expressziós vektor, amely egy fentebb meghatározott nukleotidszekvenciát hordoz, és képes annak expresszióját közvetíteni.

A találmány szerinti polipeptid előállításához alkalmazhatunk magasabb rendű organizmust, például állatot, de alkalmazhatunk alacsonyabb rendű organizmust is, például mikroorganizmust (Escherichia colit, élesztőt, protozoát) vagy többsejtű organizmusból (például gombából, rovarból, növényből vagy emlősállatból) származó sejtet vagy sejtvonalat, melyek a fentebb leírt expressziós rendszert hordozzák.

A találmány szerinti DNS-fragmenst - az alkalmazott organizmus típusától függetlenül - közvetlenül vagy megfelelő vektor alkalmazásával visszük be az organizmusba. Más lehetőség szerint, a polipeptideket emlős sejtvonalakban állítjuk elő, melynek során a találmány szerinti DNS-fragmenst vagy analógját, vagy részszekvenciáját közvetlenül vagy expressziós vektor alkalmazásával visszük be a sejtekbe. A találmány szerinti polipeptidek kémiai szintézissel is előállíthatok, amint azt fentebb leírtuk.

Szintén a találmány tárgyát képezi egy plazmidvektor, amely egy találmány szerinti polipeptidet vagy fúziós polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módjában a találmány szerinti DNS-fragmenst (vagy analógját vagy részszekvenciáját) egy találmány szerinti, replikációra képes expressziós vektor hordozza, amely a gazdaorganizmusban vagy a sejtvonalban replikációra képes.

Vektorként alkalmazhatunk plazmidot, fágot, kozmidot, minikromoszómát vagy vírust. A találmány egy érdekes megvalósítási módjában a vektor a gazdasejtbe történő bevitelt követően a gazdasejt genomjába épül.

A fentebb leírtak szerint előállított polipeptidet poszttranszlációs vagy posztszintetikus módosításoknak vethetjük alá, melyeket hőkezeléssel, kémiai kezeléssel (formaldehiddel, glutáraldehiddel, stb.) vagy enzimes kezeléssel (peptidázok, proteinázok vagy más, proteinmódosító enzimek alkalmazásával) valósíthatunk meg. A polipeptid érése a természetestől eltérő módon is történhet, ha egy organizmusban állítjuk elő. Például a glikoziláció gyakran akkor következik be, ha a polipeptidet egy magasabb rendű organizmus, például élesztő vagy - előnyösen - emlősállat sejtjei expresszálják. A glikozilálás normális esetben az aszparaginnal, szerinnel, treoninnal vagy hidroxi-lizinnel kapcsolatban figyelhető meg.

A találmány egyik megvalósítási módja egy eljárás egy fentebb meghatározott polipeptid előállítására, melynek során (i) egy fentebb meghatározott nukleotidszekvenciát egy expressziós vektorba inszertálunk;

(ii) az (i) lépésben kapott vektorral egy megfelelő organizmust transzformálunk;

(iii) az (ii) lépésben kapott gazdaorganizmust a polipeptid expresszálására alkalmas feltételek mellett tenyésztjük;

(iv) összegyűjtjük a polipeptidet, és (v) adott esetben a polipeptidet poszttranszlációs módosításnak vetjük alá.

Úgy tartjuk, hogy a hIL-10- vagy vIL-10-antagonista hatás - többek között - az IT9 302 nonapeptidhez specifikusan kötődő antitestek alkalmazásával érhető el, és az ilyen antitestek felhasználhatók a nagy IL-10-koncentráció semlegesítését célzó gyógykezelésekben.

Ennek megfelelően szintén a találmány tárgyát képezi egy antitest, amely specifikusan kötődik a találmány szerinti polipeptidhez.

Az „antitest” kifejezésen olyan anyagot értünk, amelyet egy találmány szerinti polipeptidantigénre adott reakcióként egy emlősállat, pontosabban, egy emlősállat immunrendszerhez tartozó sejtje termel. A leírásban és az igénypontokban az „antitest” kifejezésen olyan antitestet értünk, amely lényegében a specifikusan kötődő alapegységből áll, amely két nehéz láncot és két könnyű láncot tartalmaz. Az antitest fogalma - tágabb értelemben - magában foglalhatja például az alapegység dimerét vagy pentamerét is.

Egy antitest változó doménje variábilis és konstans szekvenciákból áll. A dómén változó részét az antitest idiotípusának nevezzük. Az antitest e része felelős az

HU 220 344 Β antigénnel való kölcsönhatásért, vagyis az antigénkötésért. Ebben az összefüggésben az „antitest” kifejezésen a teljes antitestmolekulát, illetve bármely ffagmensét értjük. Egy antitest termelődése alatt és/vagy azt követően fragmentálódhat. Az antitest termelődhet ffagmentált alakban is, és így is felhasználható, továbbá alkalmazható a különböző fragmensek összekapcsolása után is. A különösen érdekes antitestfragmensek a találmány szerinti antitestek kötőfragmensei, például az Fab- vagy Fab’-fragmensek.

Az antitest idiotípusos (antigénkötő) struktúrája antigénhatású, így specifikus - az idiotípusos struktúra ellen irányuló - antitesteket alakíthat ki. Az idiotípus elleni antitesteket antiidiotípusos antitesteknek nevezzük. Az ilyen antitestek utánozhatják az eredeti antigén szerkezetét, s ezáltal eredeti antigénként funkcionálhatnak; továbbá képesek lehetnek arra, hogy a találmány szerinti, eredeti polipeptid funkcióinak, alkalmazhatóságának és tulajdonságainak részét vagy egészét az eredeti antigénnel helyettesítsék.

A találmány szerinti antitestek poliklonális antitestek, valamint monoklonális antitestek.

Az antitest vagy fragmense lehet monospecifikus (poliklonális). A monospecifikus antitestet úgy állíthatjuk elő, hogy egy megfelelő állatot a találmány szerinti polipeptidet tartalmazó, lényegében tiszta készítménnyel oltjuk be, majd az első vérvétel előtt, megfelelő időközönként egy vagy több emlékeztető oltást adunk. Az állatoktól - minden egyes immunizálás után 5-7 nappal - vért veszünk. A szérumból az antitesteket, adott esetben standard antitesttisztítási eljárások alkalmazásával tisztíthatjuk.

A találmány szerinti polipeptidhez kötődő antitestek előállításához előnyösen nyulat, majmot, juhot, kecskét, egeret, patkányt, sertést, lovat vagy tengerimalacot alkalmazunk. Az antitesteket termelő sejtek lépsejtek vagy perifériásvér-limfociták lehetnek.

A monoklonális antitestet vagy ffagmenseit a polipeptid kulcsfontosságú komponense ellen (azaz egy epitóp ellen) alakíthatjuk ki. A monoklonális antitestet hagyományos technikákkal [Köhler és Milstein (1975)] - hibridóma-sejtvonal (vagy annak kiónjai vagy szubklónjai), valamint az említett monoklonális antitestet termelő hibridóma-sejtvonalról genetikai információkat hordozó sejtek felhasználásával - állíthatjuk elő. A monoklonális antitestek előállítása érdekében a monoklonális antitestet termelő sejteket egy megfelelő sejtvonallal fuzionáljuk, és az így kapott - monoklonális antitestet termelő - hibridómasejteket klónozzuk. Más módon egy - monoklonális antitestet termelő nem fuzionált sejtvonalat immortalizálunk, majd a monoklonális antitesteket összegyűjtjük a sejtnövesztő tápközegből. A monoklonális antitest előállításához alkalmazott hibridómasejteket in vitro vagy egy állat testüregében növeszthetjük. A monoklonális antitest vagy fragmensei rekombináns DNS-technikák alkalmazásával is előállíthatok [Huse és munkatársai (1989)].

Monoklonális antitesteket előállíthatunk úgy is, hogy a találmány szerinti polipeptidet tartalmazó, tisztítás nélküli készítménnyel megfelelő állatokat immunizálunk. Az így kapott - monoklonális antitesteket szekretáló - hibridómaklónokat a polipeptid(ek)hez vagy analógjaihoz való kötődési képességükre vizsgáljuk.

A nagy specifitást nem igénylő célokra poliklonális antitesteket is alkalmazhatunk, melyeket például Harboe és Ingild által leírt módon állíthatunk elő [lásd fentebb]. Közelebbről, amennyiben poliklonális antitesteket kívánunk előállítani, a találmány szerinti polipeptidet vagy analógját - előnyösen megfelelő adjuváns (például Freund-féle inkomplett vagy komplett adjuváns) beadása után - egy állatba injektáljuk. Az állatoktól szabályos időközönként - például hetenként - vért veszünk, a kapott vérből elválasztjuk az antitesteket tartalmazó szérumfrakciót, és - adott esetben - ezt a frakciót további hagyományos antitesttisztítási eljárásoknak és/vagy a tisztított polipeptid vagy analógja alkalmazásával végzett eljárásoknak vetjük alá.

Antitestként alkalmazhatunk antiidiotípusos antitest ellen irányuló anti-antiidiotípusos antitestet is, amely az antitest azon részéhez kötődik, amely az antigén epitópjával reaktív. Az antiidiotípusos antitestet a monoklonális, illetve poliklonális antitestek előállításához fentebb leírt eljáráshoz hasonló módon állíthatjuk elő.

Szintén a találmány tárgyát képezi egy antitest, amely egy fentebb meghatározott anyaghoz vagy polipeptidhez kötődik; közelebbről egy olyan antitest, amely specifikusan kötődik az Ala-Tyr-Met-Thr-MetLys-Ile-Arg-Asn aminosavszekvenciát tartalmazó polipeptidhez.

Tágabb értelemben, a találmány tárgyát képezi egy olyan anyag, amely az (a)-(j) pontokban említett hIL-10-aktivitások közül egy vagy több semlegesítésére képes, vagyis hIL-10-antagonista-aktivitást mutat, például egy ilyen tulajdonságokkal bíró antitest. Ismeretes egy monoklonális antitest (19F1) [de Waal Maletyt és munkatársai: J. Exp. Med. 174, 1 209 (1991)], amely képes specifikusan kötődni az IL-10-hez, és képes blokkolni az LPS-sel stimulált monociták által termelt endogén IL-10-et (lásd 1. táblázat) [de Waal Maletyt, lásd fentebb]. Ez az antitest a natív konformációjú IL-10-et ismeri fel, de nem feltétlenül a teljes funkcionális domént. Ez az antitest nem kötődik specifikusan az IT9 302 nonapeptidhez.

Szintén a találmány tárgyát képezi egy gyógyászati készítmény, amely egy ilyen anyagot tartalmaz, valamint egy olyan gyógyászati készítmény, amely a találmány szerinti anyagot vagy polipeptidet tartalmazza.

A találmány egy nagyon fontos megvalósítási módját egy olyan gyógyászati készítmény képezi, amely hIL-10-agonista-aktivitást vagy a fentebb meghatározott hIL-10-antagonista aktivitást mutató anyagot, valamint gyógyászatilag elfogadható kötőanyagot hordozót tartalmaz. A készítmény tartalmazhat például tisztított, szintetizált proteint vagy tisztított, rekombináns polipeptidet, monoklonális vagy poliklonális antitestet vagy bármilyen, az (a)-(j) pontokban felsorolt kritériumoknak megfelelő vagy - amennyiben hIL- 10-antagonista-aktivitást mutató anyagról van szó - az (a)-(j) pontokban felsorolt hIL-10 aktivitások közül egyet vagy többet semlegesíteni képes anyagot.

HU 220 344 Β

A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításában alkalmazott IL- 10-agonistát vagy -antagonistát gyógyászatilag elfogadható közegben, például sóoldatban, foszfátpufferelt sóoldatban (PBS), Ringeroldatban, dextrózt tartalmazó sóoldatban, Hank-féle oldatban vagy glükózoldatban kialakított készítményként állíthatjuk elő. A készítmény tartalmazhat (a fiziológiai feltételek biztosításához szükséges) gyógyászati szempontból elfogadható kiegészítő anyagokat, mint például puffereket, tonicitást beállító anyagokat, nedvesítőszereket, detergenseket és hasonlókat. Adalékanyagokként alkalmazhatók még egyéb aktív alkotórészek, például baktericid anyagok vagy stabilizátorok is. A készítmény páciensnek beadott mennyisége az adott készítménytől, a beadás céljától (megelőzés vagy terápia), a páciens állapotától, a beadás módjától és hasonló tényezőktől függ.

A gyógyászati készítményeket jellemzően transzdermális vagy parenterális (például intravénás, szubkután vagy intramuszkuláris) alkalmazáshoz terveztük. A szájon át (orálisan) beadható alakokra szintén szükség van, s ezeket úgy állíthatjuk elő, hogy a készítményt a gyomor savas közegét elkerülése céljából módosítjuk. A készítmény megelőzés és/vagy gyógykezelés céljából alkalmazhatjuk. A gyógyászati készítményeket előnyösen intravénásán adjuk be. Ennek megfelelően, a találmány tárgyát képezik azok a készítmények, amelyek - elfogadható hordozóban, előnyösen vizes alapú hordozóban - oldott vagy szuszpendált, IL-10-agonista vagy IL-10-antagonista-aktivitású anyagot tartalmaznak. Ezeket a készítményeket hagyományos sterilizáló eljárásokkal vagy steril szűréssel sterilizálhatjuk.

A kapott vizes oldatokat a felhasználáshoz megfelelő módon csomagolhatjuk vagy liofilizálhatjuk. A liofilizált készítményt a beadás előtt steril, vizes hordozóval kell elegyíteni. Az IL-10-agonistát vagy -antagonistát egy második, biológiailag aktív anyaggal (például hagyományos kemoterápiás szerrel) együtt is alkalmazhatjuk. Az ilyen anyagok közé tartozik - nem kizárólagosan - a vincristine, daunorubicin, L-aszparagináz, mitoxantrone és amsacrine.

A terápiás alkalmazásokban a gyógyászati készítményeket a kívánt hatás eléréséhez hatásos mennyiségben, vagyis „gyógyászatilag hatásos dózisban” adjuk be a páciensnek. Az IL-10-agonista vagy -antagonista gyógyászatilag hatásos dózisa például az alkalmazás céljától, a beadás módjától, a páciens egészségi és fizikai állapotától, valamint a kezelőorvos előírásától függ. A folyamatos infúzióhoz alkalmas dózis - egy 70 kg testtömegű páciens esetében - rendszerint naponta körülbelül 500 ng-tól körülbelül 800 pg-ig, előnyösen körülbelül 10 pg-tól körülbelül 300 pg-ig terjed. Az alkalmazott dózis jellemzően naponta 700 pg/kg-tól 16 pg/kg-ig teqed.

A gyógyászati készítményekben az IL-10-agonista vagy -antagonista koncentrációja széles határok között változhat, azaz körülbelül 10 pg/ml-től körülbelül 5 mg/ml-ig, előnyösen körülbelül 100 pg/ml-től körülbelül 2 mg/ml-ig. A koncentrációt rendszerint elsősorban a folyadéktérfogat, a viszkozitás stb. alapján, az adott beadási mód függvényében választjuk meg. Ennek megfelelően egy jellemző, intravénás beadáshoz kialakított gyógyászati készítmény 250 ml dextróz/sóoldatot és 2,5 mg IL-10-agonistát vagy -antagonistát tartalmaz.

A szilárd halmazállapotú készítmények esetében hagyományos, nem toxikus, szilárd hordozókat alkalmazhatunk, például, többek között, gyógyszerészeti tisztaságú mannitolt, laktózt, keményítőt, magnézium-sztearátot, nátrium-szacharinátot, talkumot, cellulózt, glükózt, szacharózt, magnézium-karbonátot és hasonlókat. Az orális beadáshoz alkalmas, gyógyászati szempontból elfogadható, nem toxikus készítmény előállításához hagyományos kötőanyagokat, például a felsorolt hordozókat, valamint 10-95%, előnyösen 25-75% aktív alkotórészt, azaz IL-10-agonistát vagy -antagonistát alkalmazunk.

Az aeroszolos beadáshoz az IL-10-agonistát vagy IL-10-antagonistát előnyösen finoman szétoszlatott alakban egy felületaktív anyaggal és hajtóanyaggal együtt alkalmazzuk. Az ilyen készítményekben az IL-10-agonista vagy -antagonista jellemző hányada 0,01-20% (m/m), előnyösen 1-10%. A felületaktív anyag természetesen nem lehet toxikus, és oldhatónak kell lennie a hajtóanyagban. Az ilyen anyagok jellemző képviselői a 6-22 szénatomos zsírsavak - mint például a kapronsav, oktánsav, laurilsav, palmitinsav, sztearinsav, linolsav, linolénsav és olajsav - többértékű, alifás alkoholokkal vagy ciklusos anhidridjeikkel - mint például etilénglikollal, glicerinnel, eritrittel, arbitollal, mannitollal, szorbitollal, a szorbitolból származó hexitolanhidriddel - alkotott észterei vagy részleges észterei, valamint ezen észterek polioxi-etilén- és polioxipropilénszármazékai. A kevert észterek, mint például a kevert vagy természetes gliceridek szintén alkalmazhatók.

A felületaktív anyag a készítmény 0,1-20 (m/m)%át, előnyösen 0,25-5%-át képezheti. A készítmény többi részét rendszerint valamilyen hajtóanyag alkotja. A cseppfolyósított hajtóanyagok szobahőmérsékleten általában gáz halmazállapotúak, és nyomás alatt kondenzálják őket. A cseppfolyósított hajtóanyagok közül alkalmazhatók a kis szénatomszámú - legfeljebb öt szénatomot tartalmazó alkánok, mint például a bután és a propán, és előnyösek a fluort vagy fluort és klórt tartalmazó alkánok. Ezek elegyei szintén alkalmazhatók. Az aeroszol előállítása során egy alkalmas szeleppel ellátott tartályt megtöltünk a megfelelő - finoman szétoszlatott polipeptide(ke)t és a felületaktív anyagot tartalmazó - hajtóanyaggal. Ilyen módon az összetevők magas nyomáson vannak mindaddig, amíg a szelep működtetésével ki nem szabadulnak a tartályból.

A szérumban a felezési idő növelése érdekében az IL-10-agonistát vagy -antagonistát tokba zárhatjuk, kolloidként előállított liposzómák üregébe foglalhatjuk, vagy más hagyományos technika alkalmazásával biztosíthatjuk a polipeptidek hosszabb felezési idejét. Ilyenformán bizonyos megvalósítási módokban az IL-10agonistát vagy -antagonistát liposzómába zárhatjuk. A liposzómák előállítására számos eljárás ismert [lásd

HU 220 344 B például Szoka és munkatársai: Ann. Rév. Biophys. Bioeng. 9, 467 (1980); US 4,235,871; US 4,501,728; és US 4,837,028 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírások].

Ennek megfelelően a találmány egy előnyös megvalósítási módját egy anyag - nagy hIL-10- és/vagy vIL-10-koncentráció csökkentésére vagy semlegesítésére történő - alkalmazása, például, egy hIL-10-antagonista tulajdonságot mutató anyag - petefészekrák és/vagy AIDS kezelésében vagy megelőzésében alkalmazható - gyógyászati készítmény előállítására történő alkalmazása képezi [Walter és munkatársai: Cytokine 5, 385 (1992); Blancho és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2 800 (1995)].

Szintén a találmány tárgyát képezi egy eljárás petefészekrák és/vagy AIDS kezelésére és/vagy megelőzésére, melynek során egy ilyen kezelésre rászoruló páciensnek egy hIL-10-antagonista tulajdonságú anyag gyógykezelési vagy megelőzési szempontból hatásos mennyiségét adjuk be. Szintén a találmány tárgyát képezi egy hIL-10-antagonista aktivitást mutató vegyület alkalmazása - petefészekrák és/vagy AIDS kezelésében vagy megelőzésében alkalmazható - gyógyászati készítmény előállítására.

A találmány szerinti anyag alkalmazása

A találmány szerinti megoldás értelmében, amint azt fentebb leírtuk, felismertük, hogy az IT9 302 nonapeptid és analógjai, illetve változatai alkalmasak a citokinek hatásainak megakadályozására, melyekről ismert, hogy kóroktani szerepet játszanak a fentebb leírt kóros állapotokban.

Ennek megfelelően a találmány szerinti polipeptid (vagy analógjai, illetve származékai) alkalmazásával végzett gyógykezelést hatásosnak tartjuk, s hatását minden olyan betegség esetében meg kell vizsgálni, amelynél várható a hIL-10 és/vagy az IRAP gyógyászati hatása (lásd. 3. táblázat).

A találmány különösen előnyös megvalósítási módjait képezik: a találmány szerinti anyag vagy polipeptid alkalmazása egy vagy több - a 3. táblázatban említett - betegség kezelésére vagy megelőzésére; a találmány szerinti anyag vagy polipeptid alkalmazása egy vagy több - a 3. táblázatban említett - betegség kezelésére vagy megelőzésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására; valamint egy eljárás egy vagy több - a 3. táblázatban említett - betegség kezelésére vagy megelőzésére, melynek során egy arra rászoruló páciensnek a találmány szerinti anyag vagy polipeptid gyógykezelési vagy megelőzési szempontból hatásos mennyiségét adjuk be.

Ennek megfelelőn a találmány egy lényeges megvalósítási módját képezi az IT9 302 nonapeptid vagy funkcionális származékának alkalmazása gyógyászati készítmény előállítására, mely készítmény alapvetően gátolja emberekben a citokinekkel (például limfokinnel, interleukinnel/monokinnel, kemokinnel/interferonnal, kolóniastimuláló faktorral), valamint prosztaglandinnal és/vagy leukotriénnel kapcsolatos biológiai hatásokat; illetve alkalmas valamelyik citokinrendszerrel (például a limfokin-, interleukin-, monokin-, kemokin-, interferon vagy kolóniastimuláló faktorrendszerrel) és/vagy a prosztaglandinrendszer és/vagy a leukotrién-rendszer zavarával kapcsolatos állapot megelőzésére vagy kezelésére. Ahogy itt használjuk, a „gyógyászati készítmény” kifejezés bármilyen, humán felhasználásra alkalmas készítményre vonatkozik, amint azt fentebb részletesen leírtuk.

A találmány különösen előnyös megvalósítási módját képezi az IT9 302 nonapeptid vagy funkcionális származékának alkalmazása

- emberekben - a citokinrendszer zavarával kapcsolatos állapot megelőzése vagy kezelése céljából citokinnel kapcsolatos biológiai hatás alapvető gátlására; és/vagy

- emberekben - a limfokinrendszer zavarával kapcsolatos állapot megelőzése vagy kezelése céljából limfokinnel kapcsolatos biológiai hatás alapvető gátlására; és/vagy

- emberekben - az interleukinrendszer zavarával kapcsolatos állapot megelőzése vagy kezelése céljából interleukinnel kapcsolatos biológiai hatás alapvető gátlására; és/vagy

- emberekben - a monokinrendszer zavarával kapcsolatos állapot megelőzése vagy kezelése céljából monokinnel kapcsolatos biológiai hatás alapvető gátlására; és/vagy

- emberekben - a kemokinrendszer zavarával kapcsolatos állapot megelőzése vagy kezelése céljából kemokinnel kapcsolatos biológiai hatás alapvető gátlására; és/vagy

- emberekben - a limfokinrendszer zavarával kapcsolatos állapot megelőzése vagy kezelése céljából — limfokinnel kapcsolatos biológiai hatás alapvető gátlására; és/vagy

- emberekben - az interferonrendszer zavarával kapcsolatos állapot megelőzése vagy kezelése céljából interferonnal kapcsolatos biológiai hatás alapvető gátlására; és/vagy

- emberekben - a kolóniastimuláló faktorrendszer zavarával kapcsolatos állapot megelőzése vagy kezelése céljából - kolóniastimuláló faktorrendszerrel kapcsolatos biológiai hatás alapvető gátlására; és/vagy

- emberekben - a prosztaglandinrendszer zavarával kapcsolatos állapot megelőzése vagy kezelése céljából - prosztaglandinnal kapcsolatos biológiai hatás alapvető gátlására; és/vagy

- emberekben - a leukotriénrendszer zavarával kapcsolatos állapot megelőzése vagy kezelése céljából leukotriénnel kapcsolatos biológiai hatás alapvető gátlására.

Az ábrák rövid leírása

Az 1. ábrán az mIL-10, hIL-10 és BCRFI leszármaztatott aminosavszekvenciájának összehasonlítása látható. Az egyező aminosavak között függőleges vonalakat húztunk.

A 2. ábrán a sertés-IL-10, a humán IL-10, a BCRFI és az egér-IL-10 - 9 aminosavat tartalmazó C-terminális szekvenciáit hasonlítjuk össze.

A 3. ábrán látható diagramban azt mutatjuk be, hogy az IT9 302 nonapeptid gátolja a tisztított, tenyésztett humán monociták spontán IL-8-termelését.

HU 220 344 Β

A 4. ábrán látható diagramon azt mutatjuk be, hogy az IT9 302 nonapeptid gátolja a humán perifériás egymagvú vérsejtek - IL-l-gyel (1 ng/ml) indukált IL-8-termelését.

Az 5. ábrán az IT9 302 nonapeptiddel stimulált humán monociták IRAP-termelését mutatjuk be.

A 6. ábrán az IL-10-zel stimulált humán monociták IRAP-termelését mutatjuk be.

A 7. ábrán az IT9 302 nonapeptid CD8+ T-sejtekre gyakorolt kemotaktikus hatását mutatjuk be.

A 8. ábrán a CD8+ T-sejtek IT9 302 nonapeptiddel történő deszenzibilizálását mutatjuk be, ami a CD8+ T-sejtek - IL-10-zel (10 ng/ml) indukált - kemotaxisra való reagálóképtelenségét eredményezi.

A 9. ábrán az IT9 302 nonapeptid IL-8-aktivitást szuppresszáló hatását mutatjuk be.

A 10. ábrán diagramon mutatjuk be az IT9 302 MCAF/MCP-1 indukálta monocita-kemotaxist gátló hatását.

All. ábrán a CD4+ T-sejtek citoszol frakciójában ECL-westem-blot analízissel kimutatott IL-4-termelődést mutatjuk be.

A 12. ábrán a vegyes humán limfocitatenyészet citoszol frakciójában ECL-westem-blot analízissel kimutatott TNF-a-termelődést mutatjuk be. A TNF-a westem-blot analízisét az alábbiakban az IL-4 esetében leírttal azonos módon végeztük, azzal a különbséggel, hogy antihumán TNF-α antitestet (Pepro Tech. Inc., London, Anglia) és torma-peroxidázzal jelölt másodlagos antitestet (katalógusszám: P 217, Dako, Dánia) alkalmaztunk.

A 13. ábrán az IT9 302 nonapeptid LPS-sel indukált sokkra és leukopéniára gyakorolt hatását mutatjuk be (az összleukocitaszám alapján).

Anyagok és módszerek

Citokinek és kemoattraktánsok

Rekombináns hIL-10-et a Pepro Tech Inc.-től (NJ., katalógusszám: 200 10) kaptunk. A rekombináns hIL—Ιβ-t és a rekombináns hIL-8-at a Dainippon Pharmaceutical Company (Osaka, Japán) adományaként kaptuk. Tenyésztő tápközegként RPMI 1 640-et (GIBCO) alkalmaztunk, amely a „Limulus Amőbocita Lizátum” vizsgálat (Sigma E-TOXATE reagenskészlet, katalógusszám: 210-A1) szerint LPS-mentes volt. Az rhMCAF/MCPl-et professzor Kouji Matsushima (Kanazawa, Japán) adományaként kaptuk. Leukocita-kemotaxis-vizsgálat

T-sejt-kemotaxis

Egészséges donorokból származó, heparinnal kezelt vérből - CD4, illetve CD8 antigéneket expresszáló CD4+ és CD8+ T-limfocitákat tisztítottunk. Ennek érdekében a heparinnal kezelt vérből egymagvú perifériásvér-sejteket (PBMC) tisztítottunk oly módon, hogy a vér 100 ml-ét 1:1 arányban Hanks-féle egyensúlyi sóoldattal (HBSS) hígítottuk, és a sejteket Lymphopac™ (Nycomed Pharma, Oslo, Norvégia) alkalmazásával végzett rétegzéssel, majd percenkénti 2000-es fordulatszámmal 20 percig végzett gradienscentrifugálással elkülönítettük. Az egymagvú sejteket HBSS-ben háromszor mostuk, és a sejtüledéket 1% magzati borjúszérumot tartalmazó 4 ml HBSS-ben hígítottuk, és 4 °C-on

- CD4 vagy CD8 antigének elleni monoklonális antitestekkel bevont „Dynabead” gyöngyök (Dynabeads M-450 CD4, katalógusszám: 111.16; Dynabeads M-450 CD8, katalógusszám: 111.08; DETACHaBEAD, katalógusszám: 124.04) alkalmazásával osztályoztuk. A gyöngy:sejt arány 10:1, az inkubálási időtartam pedig egy óra volt. A gyöngyöket - a gyártó útmutatásai szerint - poliklonális antiegér antitest hozzáadásával választottuk le a sejtekről.

A kemotaxisvizsgálathoz 48 üregű mikrokamrás technikát (Neuroprobe, Rockville, MD) alkalmaztunk [Larsen és munkatársai: Science 243, 1 464 (1989); lásd Larsen, C. G.: Acta Dermatovenerol. Suppl. 160, 1 (1991); és Jinquan és munkatársai: J. of Immunology 151, 4 545 (1993)]. A kemoattraktánsokat 1% szűréssel sterilizált magzati borjúszérumot tartalmazó RPMI 1 640 tápközegben (GIBCO, katalógusszám: 61 870-010) hígítottuk, és az alsó 25 μΐ-es kamrába tettük. A T-sejt-kemotaxis meghatározása esetében a Tsejteket (5 x 10⁶/ml) a tápközegben hígítottuk, és az így kapott elegy 50 μΐ-ét az alsó kamrába helyeztük, amely az alsó kamrától - IV. típusú kollagénnel (Sigma, katalógusszám: C 0543) bevont - 5 pm-es pórusméretű polivinil-pirrolidon-mentes polikarbonát filterrel (Nucleopore Corp., Pleasanton, CA) volt elválasztva. A sejteket - 5% CO₂-ot tartalmazó atmoszférában 37 °C-on két óra hosszat hagytuk vándorolni. A filtereket ezután óvatosan eltávolítottuk, 70%-os metanolban fixáltuk, majd 5 percig „Coomassie’s Brilliant Blue” festékkel festettük. A filter alsó felületéhez tapadt sejteket felületük mérésével számoltuk, amihez - a digitális analízist végző számítógéphez csatlakoztatott - videokamerával felszerelt mikroszkópot, illetve (a kemotaktikus migráció objektív meghatározásához alkalmas) szoftvert alkalmaztunk. A T-sejtek hozzávetőleg 5%-a vándorolt, ami 12 000-13 000 sejtnek felelt meg; ez napról napra változhat, de az egy napon végzett kísérletek eredményei között nagyon kicsi az eltérés. Korábbi leírások alapján [Larsen, C. G.: Acta Dermatovenerol. Suppl. 160, 1 (1991); és Jinquan és munkatársai: J. of Immunology 757, 4 545 (1993)] az eredményeket a mintában lévő vándorló sejtek és a negatív kontroliban lévő (a spontán migrációt tükröző) vándorló sejtek arányaként fejezzük ki, s ezt az arányt kemotaktikus indexnek (Cl; „chemotactic index”) nevezzük. Valamennyi mintát háromszor vizsgáltuk, és az egyes üregekben a sejtvándorlást három mezőben mértük, majd meghatároztuk az átlagos területnagyságot. Néhány kísérletben a kemotaxismembránt nem vontuk be kollagénnel, s ilyen esetekben a vándorló sejtek a kemotaxiskamra alsó üregébe hullottak.

Az egyik kísérletben az IT9 302 nonapeptid CD8+T-sejtekre gyakorolt kemotaktikus hatásának vizsgálatát az alsó kamrához adott IT9 302-sorozathígítások tesztelésével végeztük (a kemotaxist ebben az esetben is a fentebb leírtak szerint értékeltük).

Egy másik kísérletben az IT9 302 nonapeptid CD8+ T-sejtek - rhIL-10 (10 ng/ml) hatására történő

- migrációját deszenzibilizáló képességét vizsgáltuk,

HU 220 344 Β melynek során a célsejtekhez - a kemotaxis előtt 30 perccel - az IT9 302 nonapeptid sorozathígításait adtuk, és az rhIL-10 kemotaktikus reakcióját a fentebb leírtak szerint értékeltük.

Egy harmadik kísérletben az IT9 302 nonapeptid CD4+T-sejtek rhIL-8 (10 ng/ml) felé irányuló kemotaxisát szuppresszáló képességét vizsgáltuk, melynek során a célsejtekhez - a kemotaxis előtt 30 perccel

- az IT9 302 nonapeptid sorozathígításait adtuk, és az rhIL-8 kemotaktikus reakcióját a fentebb leírtak szerint értékeltük.

Monocita-kemotaxis

A monociták kemotaxisát a fentebb leírt Boydenkamrás berendezés alkalmazásával mértük. Az MCAF/MCP-1 kemoattraktánst 0,5 BSA-t tartalmazó RPMI1 640 tápközegben hígítottuk, és az így kapott elegyet - 10 ng/ml koncentrációban - az alsó kamrába töltöttük. Az egészséges személyek véréből fentebb leírtak szerint kapott egymagvú perifériásvér-sejtekből (PBMC)

- standard „műanyaghoz tapadás” („plastic adherence”) technika alkalmazásával - tisztított monocitákat 0,5% BSA-t tartalmazó RPMI 1 640 tápközegben szuszpendáltuk, majd különböző koncentrációjú IT9 302 nonapeptid jelenlétében 30 percig inkubáltuk. Az inkubálás után a sejteket 10⁶ sejt/ml koncentrációban a felső kemotaxiskamrákba tettük. A felső és alsó kamrákat 8 pm pórusméretű, polivinil-pirrolidon-mentes polikarbonát filterrel (Nucleopore, Pleasanton, CA) választottuk el egymástól. A kamrát 37 °C-on 90 percig inkubáltuk. A vándorló sejteket tartalmazó membránokat a fentebb leírtak szerint kezeltük, s a kemotaktikus indexet szintén a fenti leírás szerint számítottuk ki.

A normális humán egymagvú perifériásvér-sejtek (PBMC) IL-8-termelése

A PBMC-ket egészséges személyektől vett, heparinnal kezelt vérből tisztítottuk. Lymphoprep™ (Nycomed Pharma, Oslo, Norvégia) alkalmazásával végzett gradienscentrifúgálás után az egymagvú sejteket - 1% (szűréssel sterilizált, hővel inaktivált) magzati borjúszérumot, valamint penicillint (10 000 NE/ml), sztreptomicint (10 mg/ml) és gentamicint (2,5 mg/ml) tartalmazó

- LPS-mentes RPMI 1 640 tápközegben (Gibco, katalógusszám: 6 187-010) 2χ10⁶ sejt/ml koncentrációra hígítottuk. A sejteket 24 üregű „Nunc Micro Plates” mikrotiter tálcákon (Nunc, Dánia), különböző koncentrációjú IT9 302 nonapeptid (0,1 pg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml) jelenlétében, 24 óra hosszat tenyésztettük. A 24 órás inkubálás után újabb IT9 302-dózist, majd egy órával később rhIL-ip-t (1 ng/ml) adtunk a sejttenyészetekhez. Összesen 48 órás inkubálás után a felülúszókat összegyűjtöttük, és a szekretált IL-8 koncentrációját IL-8-ELISA reagenskészlet (Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd., Osaka, Japán) alkalmazásával IL-8-ELISA vizsgálattal mértük. Röviden a standardokat és a sejttenyészeti felülúszókat mikrotálcarázó gépen, 20 °C-on két példányban inkubáltuk, majd mosás után egy órára egy második antitestet adtunk hozzájuk, és egy óra hosszat peroxidázzal jelölt kecske-antinyúl IgG-vel inkubáltuk. Mosás után a reakciót O-feniléndiaminnal hívtuk elő. A reakciót harminc perccel később 1,6 N kénsav hozzáadásával állítottuk le. Az optikai denzitást (OD) 490 nm-nél ELISA-leolvasóval mértük. Az IL-8 koncentrációját az ismeretlen abszorbanciájának az (IL-8-standardokkal készített) kalibrációs egyenessel végzett összevetésével határoztuk meg.

Az IRAP-koncentráció meghatározása

A fentebb leírtak szerint egymagvú perifériásvérsejteket tisztítottunk, és a tisztított egymagvú sejteket, 5xl0⁶ sejt/ml koncentrációban - 10% steril, hővel inaktivált magzati boqúszérumot, valamint penicillint (10 000 NE/ml), sztreptomicint (10 mg/ml) és gentamicint (2,5 mg/ml) tartalmazó - RPMI 1 640 tápközegben tenyésztettük. A monocitákat ezután standard „műanyaghoz tapadás” módszerrel tisztítottuk, és - 2% magzati boíjúszérumot, valamint különböző hígítású rhIL-10-et vagy IT9 302 nonapeptidet tartalmazó - RPMI 1 640 tápközegben, 2,5 χ 10⁶ sejt/ml koncentrációban tenyésztettük. A sejteket 24 óra hosszat stimuláltuk, majd a felülúszókat az IRAP-meghatározáshoz összegyűjtöttük. Az IRAP-ELISA vizsgálatot „Humán IL-lra Quantikin Immunoassay” reagenskészlet (katalógusszám: DRA 00; R&D Systems Europe Ltd., Abigdon, Oxon, Egyesült Királyság) alkalmazásával végeztük. MHC II. osztályú antigénexpresszió meghatározása monocitákon

A fentebb leírtak szerint egymagvú perifériásvérsejteket tisztítottunk, és „műanyaghoz tapadás” technikával monocitákat izoláltunk. A monocitákat - 2% magzati boíjúszérumot, valamint penicillint (10 000 NE/ml), sztreptomicint (10 mg/ml) és gentamicint (2,5 mg/ml) tartalmazó - RPMI 1640 tápközegben, 3xl0⁶ sejt/ml koncentrációban tenyésztettük. A sejteket mikrotiter tálcák üregeiben (Nunc, Dánia) 40 óra hosszat 100 ng/ml rhIL-10-zel, illetve 1 pg/ml, 100 ng/ml vagy 10 ng/ml IT9 302 nonapeptiddel stimuláltuk, majd a felülúszókat eltávolítottuk, és a sejteket - 20 percig -20 °C-ra fagyasztva - leválasztottuk a műanyagról. A sejteket 1% FCS-t tartalmazó hideg HBSS-be helyeztük, és 20 °C-on

- HLA II. típusú antigének β-láncára specifikus monoklonális antitesttel bevont - 50 μΐ/ml mennyiségű „Dynabeads M 450” gyöngyök (katalógusszám: 210.03) alkalmazásával osztályoztuk. 20 perces inkubálás után a sejteket 1% magzati borjúszérumot tartalmazó hideg HBSS-ben háromszor mostuk, majd mágneses elválasztóberendezés alkalmazásával összegyűjtöttük őket. A sejteket a fenti pufferben hígítottuk, metilénkékkel festettük, és számoltuk a rozettaképző (II. osztályú HLA monoklonális antitesteket tartalmazó,,Dynabeads” gyöngyöket hordozó) sejteket.

A CD4+ T-limfociták IL-4-termelésének meghatározása

Sejttenyészetek

Egészséges emberekből származó, heparinnal kezelt vérből CD4+ T-limfocitákat tisztítottunk. Lymphoprep™ (Nycomed Pharma, Oslo, Norvégia) alkalmazásával végzett gradienscentrifúgálás után az egymagvú sejteket 4 °C-on monoklonális anti-CD4 antitestekkel bevont

- „Dynabeads” gyöngyök (Dynal AS, Norvégia) alkalmazásával osztályoztuk. A sejtekről a gyöngyöket poli17

HU 220 344 Β klonális antiegérantitest (Dynal AS, Norvégia) hozzáadásával választottuk le. A pozitív módon szelektált sejtek tisztasága (FACS-analízis alapján) 99%-nál nagyobb volt. Az IL-8-serkentette T-sejtek de novo IL-4-termelésének vizsgálatához a T-sejteket 5 χ 10⁶ sejt/ml mennyiségben - 1% (szűréssel sterilizált, hővel inaktivált) magzati boíjúszérumot, valamint penicillint (10 000 NE/ml), sztreptomicint (10 mg/ml) és gentamicint (2,5 mg/ml) tartalmazó - LPS-mentes RPMI 1640 tápközegben (Gibco, katalógusszám: 61 870-010) tenyésztettük. A T-sejteket három napig rIL-8 (100 ng/ml), rIL-10 (100 ng/ml), IT9 302 nonapeptid (10 ng/ml) és IFN-γ (10 ng/ml) alkalmazásával serkentettük. A rekombináns humán IL-8-at (rhIL-8) a Dainippon Pharmaceuticals Co. Ltd. (Osaka, Japán) adományaként kaptuk, míg az IFN-y-t a Boehringer Ingelheim Am Rheintől (Németország) vásároltuk. Az IL-8 által kiváltott serkentés specifikus gátlásának elérése érdekében semlegesítő hatású monoklonális anti-IL-8 antitestet (WS.4) alkalmaztunk, melyet Dr. K. Matsushima-tól (Japán) kaptunk. A rekombináns IL-10-et a Pepro Tech. Inc.-től (London, Anglia) vásároltuk.

Sejtanyag és tenyészetfelülúszó előállítása gélelektroforézishez

A tenyésztett T-sejteket és a tenyésztő tápközeget percenként 2000-es fordulatszámmal 5 percig végzett centrifugálással választottuk el egymástól. A felülúszókat liofilizáltuk, majd 100 μΐ lízispufferben feloldottuk. A sejteket közvetlenül 100 μΐ gél-lízis pufferben [Hannum és munkatársai: Natúré 343, 336 (1990)] újraszuszpendáltuk. A kapott anyagot a későbbi vizsgálatig -80 °C-on tartottuk.

A CD+ T-sejlekből származó proteinek ECL-westernblot analízise

Az IL-4-tartalom meghatározásához sejteket vagy liofilizált sejttenyészet-felülúszókat alkalmaztunk. Az egydimenziós, 15%-os SDS-PAGE gélekről származó proteineket biotolással „Hybond-ECL” nitrocellulóz membránokra (Amersham, RPN 2020D, Egyesült Királyság) másoltuk, és 0,1% Tween-20-at tartalmazó Tris-pufferelt sóoldatban (pH=8) 5%-os szarvasmarha szérumalbuminnal (Sigma) blokkoltuk. A lenyomatokat poliklonális kecske antihumán IL-4 antitesttel (R&D Systems, Egyesült Királyság), majd torma-peroxidázzal jelölt másodlagos antitesttel (katalógusszám: RPN 2106 ECL; Amersham, Egyesült Királyság) inkubáltuk, és az immunfestődés detektálásához a lenyomatokat 90 másodpercig Kodak X-OMAT-S filmre exponáltuk.

Az IT9 302 nonapeptid aminosavszekvenciájának specifitása

Az IT9 302-szekvencia más, ismert proteinek szekvenciáival mutatott esetleges homológiáját az EMBO protein-adatbázis átvizsgálásával, Dr. Henrik Leffers (Institute fór Medical Biochemistry, University of Aarhus, Dánia) segítségével kutattuk.

Az IT9 302 aminosavszekvencia-specifitása

Az EMBO protein-adatbázis (Heildelberg) átvizsgálásával (1994. június 14.) kapott információk alapján, az IT9 302 nonapeptid a humán IL-10 egy szekvenciájával 100%-os, egy Epstein-Barr-vírusból származó protein (amely azonos a vIL-10-zel) szekvenciájával pedig 75%-os homológiát mutat. Más vírusproteinek, mint például a fág-T7 és a paradicsom sárga levélzsugorodását okozó vírus egy-egy proteinje 75%-os, illetve 85%-os szekvenciahomológiát mutattak.

A találmány szerinti megoldás alapötlete 1992. októberében és novemberében született, amikor - a fentebb vázolt stratégia alapján - megterveztük az IT9 302 nonapeptidet. Az első prototípus (IT9 302) kémiai szintézisét 1992. november 27-én határoztuk el, illetve rendeltük meg. Azt vártuk, hogy ez a nonapeptid olyan immunmodulátor-aktivitásokat fog kifejteni, amelyek közül néhány utánozza az IL-10 aktivitását. A későbbi kontrolikísérleteket (lásd a példákban) szintén ebben az időszakban dolgoztuk ki. Az IT9 302 kémiai szintézisére - fizetett rendelésünk alapján - a Carlbiotech Ltd. A/S-nél (Dánia), automata polipeptidszintetizáló berendezés alkalmazásával került sor. Ezután a proteint HPLC-vel tisztítottuk, s megállapítottuk, hogy tisztasága meghaladta a 95%-ot. Ezzel beigazolódott, hogy a szintetizált termék azonos volt az általunk 1992. októberében és novemberében tervezett IT9 302 nonapeptiddel.

1. példa

A humán monociták spontán IL-8-termelésének

IT9 302 nonapeptiddel indukált gátlása

A tesztet a fenti, „A normális humán egymagvú perifériásvér-sejtek (PBMC) IL-8-termelése” szakaszban leírt módon végeztük. A monocitákat a „műanyaghoz tapadás” technikával tisztítottuk, és 3,0 χ 10⁶ sejt/ml koncentrációban 40 óra hosszat stimuláltuk. Amint az a 3. ábrán látható, az IT9 302 gátolta a monociták IL-8termelését, és 0,1 ng/ml IT9 302-koncentrációnál az IL-8-termelés a spontán in vitro termelődés szintjének 35%-ára esett vissza. A sejtek életképessége a tenyészetben egy nap elteltével mindig meghaladta a 80%-ot, és az IT9 302 - 0,1 ng/ml és 1 000 ng/ml közötti koncentrációkban - sem ebben, sem a következő kísérletekben nem befolyásolta károsan a sejtek életképességét. Az IT9 302 molekulatömege 1 127 D, az rhIL-10 megjósolt molekulatömege 18 400 D.

2. példa

A humán egymagvú perifériásvér-sejtek (PBMC) IL-l$-val indukált - IL-8-termelésének

IT9 302 nonapeptiddel indukált gátlása

A tesztet a fenti, „A normális humán egymagvú perifériásvér-sejtek (PBMC) IL-8-termelése” szakaszban leírt módon végeztük. Amint az a 4. ábrán látható, az IT9 302 in vitro dózisfüggő módon gátolja a humán egymagvú perifériásvér-sejtek - IL-ip-val indukált IL-8-termelését. Az IL-8-termelés gátlása 0,01 ng/ml és 100 ng/ml IT9 302-koncentrációnál érte el maximumát.

3. példa

A humán monociták IT9 302 nonapeptiddel indukált interleukin-1 receptorantagonista protein (IRAP) termelése

HU 220 344 Β

A tesztet „Az IRAP-koncentráció meghatározása” szakaszban leírtak szerint végeztük. Amint az az 5. ábrán látható, az IT9 302 dózisfüggő módon indukálta a humán monociták IRAP-termelését. 10 ng/ml feletti IT9 302-koncentráció alkalmazásakor a termelődés ugrásszerűen emelkedett. A 6. ábrán az IRAP-termelódés rhIL-10-zel serkentett termelődését mutatjuk be, és mivel a hIL-10 molekulatömege hozzávetőleg 20-szor nagyobb, mint az IT9 302 molekulatömege, a moláris koncentráció tekintetében az IL-10 10 ng/ml koncentrációja az IT9 302 200 ng/ml koncentrációjának felel meg. E korrekcióval az IT9 302 és az rhIL-10 hatása összehasonlítható, és alacsony koncentrációk esetében az IRAP-termelődés indukálásában közel egyformán hatásosak. A 10 ng/ml feletti IT9 302-koncentrációknál az IRAP-termelődés indukciója ugrásszerűen növekedett, és az IRAP hozzávetőleg 700 ng/ml-es maximális koncentrációt ért el.

4. példa

Az IT9 302 nonapeptid humán CD8+ T-limfocitákra gyakorolt kemotaktikus hatása A kísérletet a „Leukocitakemotaxis-vizsgálat” szakaszban leírtak szerint végeztük. Amint az a 7. ábrán látható, az IT9 302 in vitro indukálta a humán CD8+ T-limfociták kemotaktikus vándorlását, a CD4+ Tsejtekre azonban nem volt ilyen hatása (az adatokat nem mutatjuk be). Az IT9 302 e kísérletben mutatott hatása hasonló az rhIL-10 - korábban kimutatott [lásd Jinquan és munkatársai: J. of Immunology 151, 4545 (1993)] - hatásához.

5. példa

Az IT9 302 deszenzibilizálja a humán CD8 + Tsejteket, ami az rhIL-10-re mutatott reagálóképesség megszűnését eredményezi

A kísérletet a „Leukocitakemotaxis-vizsgálat” szakaszban leírtak szerint végeztük. Az IT9 302 nonapeptidet 30 perccel azelőtt adtuk a CD8+ T-sejtek szuszpenziójához, hogy rhIL- 10-re adott kemotaktikus reakciójukat teszteltük volna. Amint az a 8. ábrán látható, a sejtek IT9 302-vel végzett előinkubálása a CD8+ T-sejtek hrIL-10-re vonatkozó - csökkent reagálóképességét eredményezi. Ez azt jelzi, hogy az IT9 302 befolyásolhatja az rhIL-10 IL-10-receptorhoz való kötődését.

6. példa

Az IT9 302 gátolja az CD4 + T-limfociták IL-8-ra adott kemotaktikus reakcióját A kísérletet a „Leukocitakemotaxis-vizsgálat” szakaszban leírtak szerint végeztük. Amint az a 9. ábrán látható, az IT9 302 - a humán CD4+ T-limfociták szuszpenziójához adva - dózisfüggő módon gátolja az CD4+ T-sejtek IL-8-ra adott reakcióját.

7. példa

Az IT9 302 gátolja a humán monociták

MCAF/MCPl-re adott kemotaktikus reakcióját

A kísérletet a „Monocita kemotaxis” szakaszban leírtak szerint végeztük. Amint az a 10. ábrán látható, az

IT9 302 - a humán monociták szuszpenziójához adva dózisfuggő módon gátolja a monociták MCAF/MCP-lre adott reakcióját.

8. példa

Az IT9 302 nem gátolja az MHC II. osztályú molekulák humán monocitákon történő expresszióját A kísérletet az, Anyagok és módszerek” szakaszban leírtak szerint végeztük. Kimutattuk, hogy az rhIL-10 gátolja az MHC II. osztályú molekulák expresszióját, az IT9 302 azonban nem (lásd 4. táblázat).

4. táblázat

Stimulálás	Rozettaképző monociták száma
0	12,0+Ι,ΟχΙΟ⁴
100 ng/ml rhIL-10	4,6+1,4 xlO⁴
1 pg/ml IT9 302	11,0+3,0x104
100 ng/ml IT9 302	14,4+2,4x104
10 ng/ml IT9 302	11,2+3,2x104

A kapott eredmények azt mutatják, hogy az IT9 303 elnevezésű szintetikus nonapeptid dózisfuggő gátlóhatást gyakorol a gyulladás előtti aktivitást (beleértve az IL-8-termelődést és a monocita- és/vagy Tsejt-vándorlást) mutató folyamatokra. Ilyenformán az IT9 302 képes volt gátolni az egy éjszakán át tenyésztett monociták spontán IL-8-termelését. Ez az IL-8 mRNS-termelódésre és/vagy az azt követő proteintermelődésre, vagy -felszabadulásra gyakorolt közvetlen gátlóhatással magyarázható. Egy másik mechanizmus azzal a ténnyel magyarázható, hogy az in vitro tenyésztett monociták IL-l-et expresszálnak és termelnek, ami viszont indukálja az IL-8 termelődését. Ezt alátámasztja az a tény, miszerint bizonyított, hogy az IT9 302 hatásosan indukálja a monociták IRAPtermelődését, következésképpen - az IL-l-aktivitás megzavarásával - szintén gátolhatja a spontán IL-8termelődést. Az IT9 302 megfigyelt IRAP-indukciója úgy tűnik, biológiailag aktív IRAP termelődését indukálja, mivel a tenyészetekhez adott IT9 302 megakadályozza az IL-1 indukálta IL-8-termelődést, de csak akkor, ha az IL-1 tenyészethez történő hozzáadása előtt legalább 16 órával alkalmazzuk. Ez azt jelentheti, hogy az IT9 302 az IL-1 indukálta IL-8-termelődést az IRAP termelődésének indukálásával gátolja, ami végül - receptorán keresztül - az IL-l-aktivitás blokkolását eredményezi. Ha az IT9 302 közvetlenül gátolná az IL-8-termelődést, azt várhatnánk, hogy az IT9 302 - a tenyészethez az IL-1 hozzáadása előtt egy órával adva - gátolja az IL-8-termelődést, ez azonban nincs így (az adatokat nem mutatjuk be). Éppen ezért, az IT9 302 IL-8-termelődést gátló hatása feltehetően inkább az IRAP-termelődés indukálásának, és nem az IL-8 termelődésének közvetlen gátlásának tudható be. Az IT9 302 e funkciói megfigyel19

HU 220 344 Β hetők a hIL-10 esetében is, ami azt jelzi, hogy az IT9 302 IL-10-szerű aktivitást mutat. Az IT9 302 abban is utánozza az IL-10-aktivitást, hogy gátolja a CD4+ T-sejtek - IL-8-ra adott reakcióként bekövetkező - migrációs képességét. Mivel az IL-8 a gyulladás sok különböző stádiumával áll kapcsolatban, és a CD4+ T-sejtek a T-sejt közvetítette immungyulladás (mint például a bőrallergia) kialakulásának korai fázisában jelennek meg, ez a sajátosság azt bizonyíthatja, hogy az IT9 302 jelentős gyógyászati értéket képvisel a T-sejt közvetítette immungyulladás kontrollálása terén.

Az IT9 302 bizonyított CD8+ T-sejt kemotaktikus aktivitása szintén hasonló az IL-10 ilyen aktivitásához, így az IT9 302 aktiválhatja a szuppresszor aktivitású T-sejt-populációkat, ami hozzájárul a T-sejt közvetítette immungyulladás leállításához. Ilyenformán az IT9 302 nonapeptid, a példákban leírtaknak megfelelően, gyógyászati értéket képvisel az olyan betegségek terén, ahol az IL-10 és/vagy az IRAP szintén gyógyászati jelentőséggel bír. Ezenfelül, az IT9 302-nek gyógyászati értéke lehet olyan betegségek esetében is, amelyekben az IL-8 és/vagy az MCAF és/vagy az IL—1 patogenetikus szerepet játszik.

9. példa

Az IT9 302 és az IL-10 CD4+ T-limfocitákban indukálja azlL-4 termelődését Az IL-4 - az IL-10-hez hasonlóan - a T_H2 típusú

CD4+ T-sejtek terméke. Megfigyeltük, hogy a rekombináns humán IL-10 indukálja a tenyésztett humán CD4+ T-sejtek IL-4-termelését. Ez azt jelenti, hogy az IL-10 - saját immunszuppresszív funkciói mellett - egy másik immunszuppresszív citokin, az IL-4 termelődését is indukálja. Ennek megfelelően azt teszteltük, hogy az IT9 302 szintén indukálja-e a CD4+ T-sejtek IL-4-termelését.

Ennek során a „T-sejt-kemotaxis” szakaszban leírtak szerint tisztított, és „A CD4+ T-limfociták IL-4termelésének meghatározása” szakaszban leírtak szerint tenyésztett CD4+T-sejteket 3 napon keresztül IT9 302-vel (10 ng/ml) vagy IL-10-zel (100 ng/ml) stimuláltuk. A sejtekből citoszolfrakciót nyertünk, és ezt westem-blot analízissel (és kecske-anti-hIL-4 poliklonális antitest alkalmazásával) IL-4-tartalmára vizsgáltuk (11. ábra).

Azt tapasztaltuk, hogy az IL-10 és az IT9 302 egyaránt indukálta a tenyésztett normális humán CD4+Tsejtek IL-4-termelését.

10. példa

Az IT9 302 gátolja a TNF-a - vegyesleukocitareakció (MLR) során bekövetkező - termelődését Bebizonyosodott, hogy a vegyesleukocita-reakció (MLR) részben a TNF-α - reakcióideje alatti - termelődésétől függ. Kimutattuk, hogy az IT9 302 nem csökkenti lényegesen a vegyesleukocita-reakciót, de azt találtuk, hogy az MLR során - IT9 302 jelenlétében - a TNF-α termelődésében nagymértékű csökkenés tapasztalható.

Vegyesleukocita-reakció létrehozása érdekében allogén donorokból származó humán leukocitákat tisztítottunk, és a sejteket négy napig egymillió sejt/ml mennyiségben tenyésztettük. A tenyészetek beindítása előtt a sejtek egy csoportját két percig β-sugárzással kezeltük. „A CD4+T-limfociták IL-4-termelésének meghatározása” szakaszban leírtak szerint citoszolos proteinfrakciókat tisztítottunk, és nyúl antihumán TNF-a antitest alkalmazásával westem-blot analízist végeztünk.

A vegyes humánleukocita-reakció során a TNF-a termelődésének jelentős csökkenését tapasztaltuk (12. ábra).

11. példa

LPS indukálta sokk és leukopénia enyhítése sertésben, IT9 302 alkalmazásával Mivel azt találtuk, hogy az IT9 302 módosítja a citokinek - köztük a TNF-α és az IL-8 - termelődését, továbbá jelentős mértékű homológiát mutat a sertés IL-10-szekvenciájával [Blancho, G. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2 800 (1995)] (lásd

2. ábra), azt teszteltük, hogy az IT9 302 képes-e sertésekben modulálni az LPS indukálta leukopénia lefolyását (13. ábra).

Egy előzetes kísérletben azt teszteltük, hogy sertésekben az intravénásán 0,1 mg/kg dózisban beadott IT9 302 hogyan módosította a 2 pg/kg dózisban ugyancsak intravénásán beadott - LPS hatását (N=3). Az IT9 302-t az LPS injektálása előtt 30 perccel adtuk be, és a 13. ábrán bemutatott időpontokban vérmintákat vettünk. Meghatároztuk az összes sejtszámot, illetve a különböző típusokba tartozó sejtek számát, és az eredmények alapján kiszámoltuk a neutrofil leukociták számát.

Azt találtuk, hogy az LPS injektálása ideiglenes leukopéniát okoz, azonban az IT9 302 beadása megakadályozta a leukopénia kialakulását (lásd 13. ábra).

12. példa

A szintetikus IT9 303 polipeptid elleni antitestek

Az IT9 302 szintetikus polipeptidet a Kem-En-Tec A/S-től (Koppenhága, Dánia) vásároltuk (tisztasága 95%-nál nagyobb volt). A gyártó a polipeptidet „Keyhole Limpet” hemocianinhoz (KLH) konjugálva is szállította. Az oldékony IT9 302/KLH immunogénebb, mint a polipeptid önmagában, és az ELISA és westem-blot analízisekben kontroll proteinként alkalmazható.

Nyulak immunizálása

Nyulak intradermális vagy szubkután injektálásához - komplett Freund-féle adjuvánssal alkotott emulzió formájában - 25 pg IT9 302/KLH konjugátumot alkalmaztunk. Az injekciókat kéthetes időközönként, összesen négy alkalommal ismételtük, és a nyulaktól az injektálások után 8 és 12 nappal vért vettünk. Később egy hónapos időközökkel, Freund-féle inkomplett adjuvánsban emulgeált 250 pg IT9 302/KLH konjugátum szubkután injektálásával emlékeztető oltásokat adtunk. Az IT9 302-antitest kialakulását „dot-blot”

HU 220 344 Β immunvizsgálattal és westem-blot analízissel teszteltük.

SZEKVENCIALISTA

SZEKVENCIÁK SZÁMA: 23

TUDNIVALÓK AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA:

Alá Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn

5

TUDNIVALÓK A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA:

Alá Tyr Met Thr Ile Lys Met Arg Asn

5

TUDNIVALÓK A 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA:

Alá Phe Met Thr Leu Lys Leu Arg Asn

5

TUDNIVALÓK A 4. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 4. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA:

Alá Tyr Met Thr Met Lys Val Arg Glu

5

TUDNIVALÓK AZ 5. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Gly Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asp

5

TUDNIVALÓK A 6. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZÉK VENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Alá Phe Met Thr Met Lys Ile Arg Asp

5

TUDNIVALÓK A 7. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZÉK VENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Alá Tyr Ile Thr Met Lys Ile Arg Asp

5

TUDNIVALÓK A 8. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZÉK VENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Alá Tyr Leu Thr Met Lys Ile Arg Asp

5

TUDNIVALÓK A 9. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZÉK VENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Alá Tyr Val Thr Met Lys Ile Arg Asp

HU 220 344 B

5

TUDNIVALÓK A 10. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 10. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA:

Alá Tyr Met Thr Ile Lys Ile Arg Asp

5

TUDNIVALÓK All. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 11. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA:

Alá Tyr Met Thr Leu Lys Ile Arg Asp

5

TUDNIVALÓK A 12. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 12. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA:

Alá Tyr Met Thr Val Lys Ile Arg Asp

5

TUDNIVALÓK A 13. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 13. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA:

Alá Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asp

5

TUDNIVALÓK A 14. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Alá Tyr Met Thr Met Lys Met Arg Asp

5

TUDNIVALÓK A 15. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZÉK VENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Alá Tyr Met Thr Met Lys Val Arg Asp

5

TUDNIVALÓK A 16. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZÉK VENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Alá Tyr Met Thr Met Lys Ile Asp Gin

5

TUDNIVALÓK A 17. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZÉK VENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Alá Tyr Met Thr Met Lys Ile Asp Glu

5

TUDNIVALÓK A 18. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZÉK VENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu

5

HU 220 344 Β

TUDNIVALÓK A 19. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 6 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 19. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA:

Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa

5

TUDNIVALÓK A 20. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 7 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 20. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA:

Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa

5

TUDNIVALÓK A 21. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 8 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi)SZEKVENCIALEÍRÁS: 21. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA:

Xaa Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa

5

TUDNIVALÓK A 22. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL:

(D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 22. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA:

Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa

5

TUDNIVALÓK A 23. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 27bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi)SZEKVENCIALEÍRÁS: 23. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA:

GCCTACATGA CAATGAAGAT ACGAAAC 27

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Polipeptid, amely összesen 7-20 aminosavat tartalmaz, és amely tartalmazza a következő képletű szekvenciát :

Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (19. azonosítószámú szekvencia), amelyben

X₄ és X₅ jelentése, egymástól függetlenül, Met, He, Leu vagy Val; és

X₆ jelentése Asn, Asp, Gin vagy Glu, és amely a következő tulajdonságok közül eggyel vagy többel rendelkezik:

a) a humán monociták spontán IL-8-termelésének gátlását indukálja,

b) a humán perifériás vér mononukleáris sejtek (PBMC) IL-Ιβ által indukált IL-8 termelésének gátlását indukálja,

c) a humán monociták interleukin-1 receptorantagonista protein (IRAP) termelését indukálja,

d) a CD8+ humán T-limfociták in vitro kemotaktikus migrációját indukálja,

e) a humán CD8+ T-sejteket rhIL-10-re való válaszképtelenséget eredményezően deszenzitivizálja,

f) a CD4+ humán T-limfociták IL-8-ra adott kemotaktikus válaszát szuppresszálja,

g) a humán monociták MCAF/MCP-l-re adott kemotaktikus válaszát szuppresszálja,

h) a humán IL- 10-zel szemben a MHCII-molekulák humán monocitákon történő kifejeződését nem gátolja,

i) a tenyésztett normál humán CD4+ T-sejtek IL-4termelését indukálja,

j) a humán kevert leukocita-reakcióban a TNFa termelését csökkenti.
2. Egy, az 1. igénypont szerinti polipeptid, amelynek általános képlete

X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (20. azonosítószámú szekvencia), amelyben

X₃, X₄ és X₅ jelentése, egymástól függetlenül, Met, He, Leu vagy Val; és

X₆ jelentése Asn, Asp, Gin vagy Glu.
3. Egy, az 1. igénypont szerinti polipeptid, amelynek általános képlete

X₂-X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (21. azonosítószámú szekvencia), amelyben

X₂ jelentése Tyr vagy Phe,

X₃, X₄ és X₅ jelentése, egymástól függetlenül, Met, He, Leu vagy Val; és

X₆ jelentése Asn, Asp, Gin vagy Glu.
4. Egy, az 1. igénypont szerinti polipeptid, amelynek általános képlete

HU 220 344 Β

X_rX₂-X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (22. azonosítószámú szekvencia), amelyben

X_t jelentése Alá vagy Gly,

X₂ jelentése Tyr vág Phe,

X₃, X₄ és X₅ jelentése, egymástól függetlenül, Met, Ile, Leu vagy Val; és

X₆ jelentése Asn, Asp, GLn vagy Glu.
5. Egy, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, amely legalább 12 aminosavat tartalmaz.
6. Egy, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, amely legalább 15 aminosavat tartalmaz.
7. Egy, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, amely legalább 11 aminosavat tartalmaz.
8. Egy, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, amely legalább 10 aminosavat tartalmaz.
9. Egy, az 1. igénypont szerinti polipeptid, amelynek általános képlete

Xi-X₂-X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (22. azonosítószámú szekvencia), amelyben

X! jelentése Alá vagy Gly,

X₂ jelentése Tyr vagy Phe,

X₃, X₄ és X₅ jelentése, egymástól függetlenül, Met, Ile, Leu vagy Val; és

X₆ jelentése Asn, Asp, Gin vagy Glu.
10. Egy, az 1. igénypont szerinti polipeptid, amelynek általános képlete

X₂-X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (21. azonosítószámú szekvencia), amelyben

X₂ jelentése Tyr vagy Phe,

X₃, X₄ és X₅ jelentése, egymástól függetlenül, Met, Ile, Leu vagy Val; és

X₆ jelentése Asn, Asp, Gin vagy Glu.
11. Egy, az 1. igénypont szerinti polipeptid, amelynek általános képlete

X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (20. azonosítószámú szekvencia), amelyben

X₃, X₄ és X₅ jelentése, egymástól függetlenül, Met, Ile, Leu vagy Val; és

X₆ jelentése Asn, Asp, Gin vagy Glu.
12. Egy, az 1. igénypont szerinti polipeptid, amelynek általános képlete

Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (19. azonosítószámú szekvencia), amelyben

X₄ és X₅ jelentése, egymástól függetlenül, Met, Ile, Leu vagy Val; és

X₆ jelentése Asn, Asp, Gin vagy Glu, azzal a feltétellel, hogy a polipeptid Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn képletű polipeptidtől eltérő.
13. Az 1. igénypont szerinti Ala-Tyr-Met-Thr-MetLys-Ile-Arg-Asn képletű polipeptid.
14. Egy, az 1. igénypont szerinti polipeptid, amely a következő szekvenciák valamelyikével rendelkezik:

Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Met-Arg-Asn (2. azonosítószámú szekvencia);

Ala-Phe-Met-Thr-Leu-Lys-Leu-Arg-Asn (3. azonosítószámú szekvencia);

Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Glu (4. azonosítószámú szekvencia);

Gly-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (5. azonosítószámú szekvencia);

Ala-Phe-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (6. azonosítószámú szekvencia);

Ala-Tyr-Ile-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (7. azonosítószámú szekvencia);

Ala-Tyr-Leu-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (8. azonosítószámú szekvencia);

Ala-Tyr-Val-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (9. azonosítószámú szekvencia);

Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Ile-Arg-Asp (10. azonosítószámú szekvencia);

Ala-Tyr-Met-Thr-Leu-Lys-Ile-Arg-Asp (11. azonosítószámú szekvencia);

Ala-Tyr-Met-Thr-Val-Lys-Ile-Arg-Asp (12. azonosítószámú szekvencia);

Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (13. azonosítószámú szekvencia);

Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Met-Arg-Asp (14. azonosítószámú szekvencia);

Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Asp (15. azonosítószámú szekvencia);

Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Gln (16. azonosítószámú szekvencia); és

Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Glu (17. azonosítószámú szekvencia).
15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti anyag vagy polipeptid, amely lényegében tiszta.
16. Anyag vagy polipeptid, amely egy az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti aminosavszekvenciát tartalmaz, azzal a feltétellel, hogy az anyag vagy polipeptid humán IL-10-től eltérő.
17. Nukleotidszekvencia, amely az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet kódolja.
18. Antitest, amely specifikusan kötődik az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti anyaghoz vagy polipeptidhez.
19. Antitest, amely specifikusan kötődik egy az 1. azonosítószámú szekvenciának megfelelő aminosavszekvenciával rendelkező polipeptidhez.
20. Egy, a 18. vagy 19. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy poliklonális antitest.
21. Egy, a 18. vagy 19. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy monoklonális antitest.
22. Gyógyszerkészítmények, amelyek egy, az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti anyagot vagy polipeptidet tartalmaznak.
23. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti anyag vagy polipeptid alkalmazása olyan gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek az alábbi betegségek közül egy vagy több kezelésére, vagy megelőzésére alkalmasak: reumatoid artritis, Lyme-artritis, köszvény, szeptikus tünetegyüttes, hipertermia, fekélyes vastagbélgyulladás vagy vékony- és vastagbélgyulladás, osteoporozis, cytomegalovírus, periodontális betegségek, glomerulonephritis, krónikus, nem fertőző tüdőgyulladás (például sarcoidosis és dohányzók tüdőgyulladása), granulomaképződés, májfibrózis, tüdőfibrózis, transzplantátumkilö24

HU 220 344 Β kődés, „graft-versus-host” betegség, krónikus myeloid leukémia, akut myeloid leukémia, egyéb daganatos betegségek, tüdőasztma, inzulinfüggő (I. típusú) diabetes mellitus, arteriosclerosis/atherosclerosis, psoriasis, krónikus B-limfocita-leukémia, általános, változatos immun- 5 hiány, egyéb biológiai reakciómodulátorok alkalmazásával kapcsolatos mellékhatások, disszeminált intravaszkuláris véralvadás, szisztémás sclerosis, encephalomyelitis, tüdőgyulladás, hiper-IgE-szindróma, enterocolitis, rákmetasztázis, adoptív immunterápia, szerzett légzési elégtelenség szindróma, szepszis, reperfuziós szindróma, műtét utáni gyulladás, szervátültetés, alopecia.