CZ1497A3

CZ1497A3 - Polypeptide, its use and pharmaceutical composition based thereon, a nucleotide sequence and antibody

Info

Publication number: CZ1497A3
Application number: CZ9714A
Authority: CZ
Inventors: Larsen Christian Groenhoej; Borbala Gesser
Original assignee: Steeno Res Group As
Priority date: 1994-07-05
Filing date: 1995-06-07
Publication date: 1997-05-14
Also published as: NO970020L; US6599501B1; MX9606537A; HU220344B; ES2148525T3; HU9603615D0; DE69518156T2; EP0769054B1; HK1012416A1; PL319429A1; PT769054E; BR9508243A; AP690A; AP9700962A0; ATE195003T1; CA2194444A1; PL181042B1; RU2218348C2; EE9700029A; UA57702C2

Description

Polypeptid, jeho použití a farmaceutický prostředek~na~j’5íR>bázi, nukleotidová sekvence a protilátka

Oblast techniky t

ir si,

I +’ f

ř

Vynález se týká polypeptidu, jeho použití a farmaceutického prostředku na jeho bázi, nukleotidové sekvence, která jej kóduje a protilátky, která se k němu specificky váže. Zejména se vynález týká farmaceutického použití látky, která je agonistou interleukinu 10 (IL-10), zejména pak použití látky podle vynálezu pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci a/nebo léčení chorob, jejichž patogenese má vztah ke snížené produkci a/nebo funkci imunoinhibičních mediátorů, zejména cytokinů a/nebo ke zvýšené produkci a/nebo funkci určitých imuno-inflamatorních mediátorů, zejména cytokinů. Zvláště pak se vynález týká použití látky podle vynálezu pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci a/nebo léčení autoimunitních chorob (diabetes mellitus typu I; inflamatorních chorob gastrointestinálního traktu; rheumatoidní arthritis), arthritis urica (dny), kožní alergie; alergických reakcí kůže, plic a dýchacího traktu poškození tkáně v důsledku reperfuse); atherosklerošy; choroby; chronické myeloidní leukémie; rakoviny; reakce (včetně asthma bronchiale); hypoxie/ischemie (infarktu;

proriasis; granulomatosní leukémie; akutní myeloidní graft versus host a stavů spojených s odmítáním transplantátů; fibrosy plic; fibrosy jater; chronického neinfekčního zánětu plic; glomerulonefritis; předčasné práce k porodu; periodontitis; inflamatorních reakcí spojených s virovými infekcemi, osteoporosis, septického šoku a/nebo pro výrobu antikoncepčního činidla.

Dosavadní stav technikv koncentraci 10“¹⁵M. pro vývoj imunitních i,

Výzkum v posledních dvou desetiletích ukázal, že iniciace, regulace a terminace inflamatorních reakcí, jakož i regulace růstu a diferenciace v savčích organismech jsou. pod těsnou kontrolou speciální skupiny signálních polypeptidů, která se obecně nazývá cytokiny. Cytokiny jsou polypeptidy, které mohou být produkovány většinou jaderných buněk a které mohou přenášet regulační signály mezi buňkami za vzniku komunikační sítě mezi buňkami stejného, nebo odlišného typu v organismu. Cytokiny jsou extrémně účinné mediátory a jsou aktivní již při

Cytokiny jsou také klíčovými faktory reakcí buněk a tyto reakce tvoří základ klinických projevů zánětu vyvolaného infekcí, alergií, úrazem, reakcemi graft versus host a autoimunitními chorobami. Alergické a autoimunitní choroby jsou vysvětlovány abnormalitami imunitního systému, zejména imunity zprostředkované T-lymfocyty, ale obecně je etiologie těchto chorob neznámá. Studie in vitro, experimenty na zvířatech a klinické experimentální studie ukazují, že cytokiny hrají důležitou patofyziologickou úlohu v inflamatorních reakcích majících vztah k autoimunitním chorobám, alergii, ischemii, reperfušnímu poškození, úrazům a infekcím a jsou důležité pro vývoj rakoviny, atheřosklerosy, pro těhotenství a vývoj plodu a pro kostní homeostázu. Cytokiny se mohou podílet i na jiných imunoinflamatorních a proliferativních chorobách, jak to bude podrobněji popsáno dále.

Uvedené choroby^- jsou obvykle chronické á jejich léčení je paliativní, tj. většina léčiv, která jsou předepisována ve spojitosti s těmito chorobami, je zaměřena na zmírňování symptomů a obvykle nemá žádný kurativní účinek. Jiné druhy léčení jsou tzv. substituční terapie, při nichž se pacientovi celý život dodávají určité látky, například hormony, které pacient potřebuje v důsledku snížené/nedostatečné interní produkce těchto látek. Tyto způsoby léčení jsou často neuspokojivé, zahrnují nežádoucí a často vážné vedlejší účinky a pouze zpoždují postup choroby, ale nebrání mu. Proto přetrvává potřeba vyvinout zlepšené způsoby léčení a zlepšené farmaceutické prostředky pro výše uvedené účely.

Interleukin 10 (IL-10) je nedávno popsaný přírodní který byl identifikován interleukin 10 (mIL-10) faktor syntézy cytokinu endogenní imunosupresivní cytokin, v myším a lidském - organismu. Myší byl původně popsán jako inhibiční uvolňovaný z klonů TH2 pomocných T-buněk (TH2 helper T-cell dones). mIL-10 také vykazuje proliferativní účinky na různé podsoubory lymfocytů, jako je povzbuzující účinek na klonovací účinnost myších slezinných T-buněk CD4-,8⁺ (Fiorentino D. F., M. W. Bond a T. R. Mosmann 1989; Two types of mouše hepler T cell. IV. Th2 dones secrete a factor that inhibits cytokine production by Thl dones, J. Exp. Med., 170; 2081). Humánní interleukin 10 (hIL-10) byl nedávno .sekvenován a ukázalo se, že vykazuje vysokou homologii .s mIL-10 na úrovni sekvence DNA stejně tak, jako na úrovni aminokyselin. Kromě toho byl nedávno sekvenován také interleukin 10 vepře a ukázalo se, že také tento interleukin vykazuje vysokou homologii s humánním IL-10 jak na úrovni sekvence DNA, tak na úrovni aminokyselin (Blancho G., P. Gianello, Sh. Germana, M. Baetscher, D. H. Sachs a Chr. LeGuern (1995), Molecular identification of porcine interleukin 10; Regulation of expression in kidney allograf model, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 2800 až 2804), viz též obr. 2. hIL-10 vykazuje také vysokou homologii s otevřeným čtecím rámcem genomu viru Epstein-Barrové (BCRF1). Také virální IL-10 vykazuje určitou akvititu podobnou hIL-10 (srovnej obr. 1) (Viera P., R. de Wall-Malefyt, M.-N. Dang, K. E. Johnson, R. Kastelein, D. F. Fiorentiono, J. E. de Vries, M.-G. Roncarolo, T. R, Mosmann a K. W. Moore, 1991, /

/ t

/

Isolation and expression of human cytokine synthesis inhibitory factor /CSIF/IL-10) cDNA dones: homology to Epstein-Barr virus open reading f ráme BDRFI, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA), 88: 1172).

Humánní IL-10 je produkován aktivovanými klony T-buněk a immortalizovanými B-buňkami a kromě své účinnosti inhibičního faktoru syntézy cytokinů (CSIF), jež se projevuje inhibici cytokinů a faktorů produkci přírodního produkce několika pro-inflamatornxch stimulujících kolonie, také indukuje proteinu/peptidu, který je antagonistický vůči receptoru interleukinu 1 (IRAP) v jednojaderných buňkách, čímž nepřímo inhibuje účinnost IL-1. IL-10 také reguluje na nižší úroveň svou vlastní produkci v monocytech a inhibuje expresi třídy II MHC (de Spits H., et al., 1991, IL-10 reduce antigen-specific human

T cell proliferation by deminishing the antigen-presenting kapacity of monocytes via down-regulation of class II MHC expresion, J. Exp. Med. 174: 915 až 924).

Waal-Malefyt R., Haanen J. and viral IL-10 strongly hIL-10 snižuje dále antigen-specifickou proliferaci klonů humánních T-buněk a buněk CD4⁺ T, když se monocytů použije jako buněk poskytujících antigen. Experimenty in vivo na myších ukazují, že výsledek infekce Leishmania je závislý na profilu cytokinů z odpovídajících lymfocytů CD4⁺

T (Gazzinelli R. T., Oswald I. P., James S. L. , Sher A., _r, í

1992, IL-10 inhibits parasite killing and nitric oxide production by IFN-\-activated macrophages, J. Immunol. 148:

1792 až 1796)._ - - - - ,

U myší C57B1/6, které jsou resistentní vůči infekci Leishmania vykazují buňky CD4⁺ T odvedené z mízních uzlin regulaci směrem vzhůru u cytokinů IFN-gamma a IL-2, zatímco sensitivní myši Balb/C obsahují v mízních uzlinách CD4⁺ respondující T-buňky uvolňující IL-4 a IL-10. Lze prokázat jejich korelaci s postupem choroby (Gazzinelli R. Τ. , Oswald

I. P., James S. L., Sher A., 1992, IL-10 inhibits parasite killing and nitric oxide production by IFN-\-activated macrophages, J. Immunol. 148: 1792 až 1796).

IL-10 tedy může vykazovat silné regulační účinky na imunologické odpovědi jak in vitro, tak in vivo. Kromě toho IL-10 silně ovlivňuje chemokinovou biologii, poněvadž humánní interleukin-10 je specifickým chemotaktickým faktorem pro. T-buňky CD8+, zatímco IL-10 potlačuje schopnost T-buněk CD4+, ale nikoliv CD8+ migrovat v odpovědi na chemotaktický cytokin T-buněk, IL-8 (Jinquan Τ., Larsen C. G. , Gesser B. , Matsushima K., Thestrup-Pedersen K. , 1993, Human IL-10 is a chemoattractant for CD8+ T lymphocytes and an inhibitor of IL-8-induced CD4+ T lymphocyte Migration, Journal of Immunogy 151: 4545 až 4551). IL-10 také inhibuje chemotaktický účinek jiných chemokinů MCP-l/MCAF a RANTES (Larsen C. G., Jinquan Τ., Deleurant B., Thestrup-Pedersen K., 1993, IL-10 is a potent regulátor of the chemotactic response of mononuclear cells, but not of granulocytes, J. Invest. Dermatol. sv. 100, č. 6). Jelikož je IL-10 deaktivátorem funkcí monocytů (makrofágů) a inhibitorem aktivity Thl, mohou mít léčiva s úplnou nebo částečnou účinností typu IL-10 terapeutický účinek u chorob charakterizovaných nerovnováhou v produkci a/nebo účinnostech cytokinů.

Nedávno byla navržena příprava farmaceutických prostředků obsahujících hIL-10 nebo vIL-10 a použití hIL-10 nebo vIL-10 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení různých chorob, jako je septický nebo toxický šok, rheumatoidní arthritis, choroba graft versus host, odmítání tkání, diabetes mellitus, autoimunitní choroby, leukemie a rakovina (viz například WO93/02693 a W094/04180. Antagonisty IL-10, například protilátky, které se specificky vážou k IL-10 byly například popsány v EP 405 980 a W094/06473, přičemž byl učiněn předpoklad, že by tyto protilátky mohly být užitečné při léčení pacientů infikovaných HIV.

Podstata vynálezu

V souvislosti s vynálezem se zjistilo, že látky, která je odlišná od humánního interleukinu-10 a která vykazuje jednu nebo více následujících vlastností:

a) indukuje inhibici spontánní produkce IL-8 humánními monocyty,

b) indukuje inhibici IL-Ιβ indukované produkce IL-8 mononukleárními buňkami humánní periferní krve (PBMC),

c) indukuje produkci proteinu, který je antagonistický vůči receptorů interleukinu-1 (IRAP), humánními monocyty),

d) indukuje chemotaktickou migraci humánních Tlymfocytů CD8+ in vitro,

e) desensitizuje humánní T-buňky CD8+, což má za následek neresponsivitu vůči rhIL-10,

f) potlačuje chemotaktickou odpověd humánních Tlýmfocytů CD4+ vůči IL-8,

g) potlačuje chemotaktickou odpověd humánních monocytů vůči MCAF/MCP-1,

h) neinhibuje expresi molekul MHC z třídy II na humánních monocytech v kontrastu s humánním IL-10,

Ί

i) indukuje produkci IL-4 kultivovanými normálními humánními T-buňkami CD4+ a

j) snižuje produkci TNFa při reakci humánních smíšených leukocytú, jako je polypeptid vykazující aminokyselinovou sekvenci

Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-ILe-Arg-Asn nebo analogu nebo varianty této sekvence (nonapeptid s homologií sekvence vzhledem k hIL-10 označovaný názvem IT9302) a jejích derivátů se může používat pro prevenci a/nebo léčení různých forem inflamatorních procesů, zejména forem majících vztah k imunitnímu a/nebo hormonálnímu systému.

Předpokládá se (jak je to podrobně popsáno v dále uvedeném popisu imunologických mechanismů), že mechanismus působení probíhá přes interferenci s působením mediátoru imunitního systému, zejména cytokinů, jako jsou monokiny, lymfokiny, chemokiny a antagonisty receptorů monokinů, tj. že látka podle vynálezu interferuje s produkcí či potlačuje produkci a/nebo účinek určitých cytokinů, a tak inhibuje patologické procesy vedoucí k poškození tkáně. Dále se předpokládá, že látka podle vynálezu indukuje produkci přírodních antagonistů receptorů monokinů, a tak interferuje s účinkem či potlačuje účinek určitých cytokinů, což se projevuje inhibicí patologických procesů, které vedou k poškození tkáně.

Důležitým aspektem tohoto vynálezu je tedy farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že jako účinnou přísadu obsahuje .látku podle vynálezu. Další aspekty tohoto vynálezu zahrnují látku, která je schopna neutralizo8 vat jednu nebo více účinností a) až g) uvedených výše, například protilátku, a farmaceutický prostředek, který takovou látku obsahuje.

kinům, ptidu, tj. použití lymfokinu,

Dalším aspektem tohoto vynálezu je použití látky » podle vynálezu pro výrobu farmaceutického prostředku, který v podstatě inhibuje biologický účinek mající vztah k cytolátky podle vynálezu jako proteinu/pemonokinu, interleukinu, interferonu, chemokinu nebo faktoru stimulujícího kolonie, který je antagonistický vůči receptoru IL-1. Dalším aspektem tohoto vynálezu je použití látky podle vynálezu pro výrobu farmaceutického prostředku pro profylaxi nebo léčení chorob majících vztah k poruchám systému cytokinů, tj. k IL-1 receptor antagonistickému protein/peptidovému, lymfokinovému, monokinovému, interleukinovému, interferonovému, nebo chemokinovému systému nebo systému faktoru stimulujícího kolonie. Dalším aspektem tohoto vynálezu je způsob léčení vztah k poruchám cytokinového spočívá v tom, že se léčenému chorob člověka majících systému, jehož podstata subjektu podá účinné množství látky podle vynálezu.

Buněčný imunitní systém se podílí na vývoji takových chorob, jako jsou infekční, inflamatorní a neoplastické choroby. Imunokompetentní buňky a jejich produkty mohou hrát důležitou úlohu při iniciaci, progresi a možném chronickém vývoji inflamatorních chorob. Tyto poruchy často nemají žádnou známou etiologii a zahrnují běžné choroby, jako je diabetes mellitus, rheumatoidní arthritis a inflamatorní choroby gastrointestinálního traktu a kůže. Kromě těchto příkladů přispívají však imunita zprostředkovaná buňkami a pro-inflamatorní mediátory k mnohým inflamatorním a proliferativním chorobám (viz tabulka 2).

Tabulka 2

Některé choroby, u nichž jsou imunitní reakce zprostředkované makrofágy/T-lymfocyty považovány za patogeneticky důležité

Kožní choroby:

Psoriasis

Atopická dermatitida Kontaktní dermatitida Lymfom kožních T buněk (CTCL) Sézaryho syndrom Pemphigus vulgaris Pemphigoid bullosa Erythema nodosum Scleroderma

Autoimunitní choroby (včetně rheumatických): Uveitis

Bechetova choroba

Boeckova sarcoidosa

Sjógrenův syndrom

Rheumatoidní arthritis

Juvenilní arthritis

Reiterův syndrom

Dna

Osteoarthrosis

Systemický lupus erythematosus

Polymyositis

Myocarditis

Primární biliární cirhosa

Crohnova choroba

Ulcerativní colitis

Sclerosis multiplex a jiné demyelinační choroby Aplastická anémie

Idiopatická thrombocytopenická purpura

Mnohotný myelom a lymfom B buněk

Simmonsův panhypopituitarismus

Gravesova choroba a Gravesova oftalmopatie

Subakutní thyreoditis a Hashimotova choroba

Addisonova choroba

Insulin-dependentní diabetes mellitus (typ 1)

Jiné choroby

Různé klinické syndromy doprovázené vaskulitidou (například polyarteriitis nodosa, Wegenerova granulomatosa, obrovskobuněčná arteritiidis horečka, nevolnost)

Anorexia (například při akutních a chronických inflamatorních a infekčních chorobách)

Disseminovaná intravaskulární koagulace (DIC) Arteriosclerosis (atherosclerosis)

Šok (například při gram-negativni sepsi)

Kachexie (například při rakovině, chronických infekčních a chronických inflamatorních chorobách)

Odmítnutí transplantátu a choroba graft versus host

Cytokiny

T-lymfocyty zajišťují souhru při indukci a regulaci imunitních reakcí zprostředkovaných buňkami a cytokinové produkty (lymfokiny) T-buněk iniciují a řídí imunitní odpověď (Bendtzen K. Lymphokines in inflammation; Inflammation Basic Mechanisms Tissue Injuring Principles and Clinical Models (P. Venge & A. Lindbom eds.) 1985; Almqvist & Wiksell International, Stockholm: 187 až 217 a Bendtzen K. Interleukin-1, Interleukin-6, and tumor necrosis factor in infection, inflammation and immunity; Immunol Lett. 1988, 19: 183 až 192. Mediátory aktivující lymfocyty (lymfokiny) produkované buňkami poskytujícími antigen patří do skupiny polypeptidú, která se označuje názvem cytokiny. Cytokiny jsou přenašeče vzájemného spojení mezi buňkami, jak za fyziologických, tak za patofyziologických podmínek a mohou také působit jako hormony zajišťující signály mezi imunitním systémem a jinými tkáněmi a orgány. Cytokiny mohou být také produkovány buňkami vně imunitního systému a obecně se předpokládá, že všechny jádrové buňky jsou chopny produkovat jeden nebo více cytokinů. Tak například keratinocyty a fibroblasty jsou význačnými producenty cytokinů a v tomto systému mohou cytokiny působit jako autokrinní nebo parakrinní hormony nezávislé na imunitním systému (Larsen C.

G. Leukocyte activating and chemotactic cytokines in cell-mediated immune reactions of the human skin; Acta Dermatovenerol. 1991, suppl. 160: 1 až 48).

Interleukin-10

Myší interleukin 10 (mIL-10) byl původně popsán jako inhibiční faktor syntézy cytokinů (CSIF) uvolňovaný z klonů TH₂ pomocných T-buněk, ale také vykazuje proliferativní účinky na různé podsoubory lymfocytů, jako je povzbuzující účinek na klonovací účinnost myších slezinných T-buněk CD4-,8⁺ (Fiorentino D. F., M. W. Bond a T. R. Mosmann 1989; Two types of mouše helper T cell. IV. Th2 dones secrete a factor that inhibits cytokine production by Thl dones, J. Exp. Med., 170: 2081). Humánní interleukin 10 (hIL-10) byl nedávno popsán (Viera Ρ., R. de Wall-Malefyt, M.-N. Dang, K. E. Johnson, R. Kastelein, D. F. Fiorentiono, J. E. de Vries, M.-G. Roncarolo, T. R. Mosmann a K. W. Moore, 1991, Isolation and expression of human cytokine synthesis inhibitory factor /CSIF/IL-10) cDNA dones: homology to Epstein-Barr virus open reading frame BDRFI, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA), 88: 1172) a ukázalo se, že vykazuje vysokou homologii s otevřeným čtecím rámcem genomu viru Epstein-Barrové (BCRF1). Také virální IL-10 vykazuje určitou akvititu podobnou hIL-10. Dále je shrnuta biochemická, biologická, fyziologická a možná patofyziologická úloha IL-10.

Struktura IL-10

Primární struktury myšího IL-10 (mIL-10) a humánního IL-10 (hIL-10) vykazují vysoký stupeň homologie nukieotidové sekvence (nad 80 %) v celé délce sekvence (Fiorentino D. F., M. W. Bond a T. R. Mosmann 1989; Two types of mouše hepler T cell. IV. Th2 dones secrete a factor that inhibits cytokine production by Thl dones, J. Exp. Med., 170: 2081) a (Viera P., R. de Wall-Malefyt,

M.-N. Dang, K. E. Johnson, R. Kastelein, D. F. Fiorentiono,

J. E. de Vries, M.-G. Roncarolo, T. R. Mosmann a K. W. Moore, 1991, Isolation and expression of human cytokine synthesis inhibitory factor /CSIF/IL-10) cDNA dones: homology to Epstein-Barr virus open reading frame BDRFI, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA), 88: 1172). Jediným významným rozdílem je inserce první humánní repetitivní sekvence Alu v 3'-nepřeložené oblasti klonu cDNAhIL-10. cDNA mIL-10 a hIL-10 kódují velmi podobné otevřené čtecí rámce (ORF) 178 aminokyselin, včetně hydrofobní vedoucí sekvence, které vykazují 73% homologii aminokyselin. mIL-10, který je účinný u myších buněk významně křížové nereaguje u lidských buněk. hIL-10 je 18kDa polypeptid postrádající detegovatelný sacharid. Naproti tomu, mIL-10 je L-glykosylován v místě blízkém N-konci, které u hIL-10 chybí. Jak mIL-10, tak rekombinantní hIL-10 (rhlL-10) jsou exprimovány jako nekovalentní homodimery. Rozsah, v jakém jsou monomery mIL-10 nebo hIL-10 biologicky účinné, není dosud jistý. mIL-10 a hIL-10 s polypeptidovou značkou (tag) alespoň 8 aminokyselin u N-konce a 21 aminokyselin u C-konce nevykazují žádnou detegovatelnou ztrátu své účinnosti podle publikace Moore et al. Tito autoři byli první, kteří sekvenovali humánní IL-10 (Moore, K. W., O'Garra A., de Waal

!

Malefyt R., Vieira Mosmann T. R. 1993, lnterleukin-10, Annu Rev. Immunol, 11: 165-190). Označení C- a N- konce úplného IL-10 nemusí nutně vyvolávat funkční změny, ponvěvadž značení je příležitostné nebo náhodné. Vysoký počet možných aminokyselinových substitucí, který je podrobněji popsán dále, by také mohl vysvětlit, proč značení neukázalo chybějící funkce. Rekombinantní mIL-10 a hIL-10 byl exprimován v buňkách CDS7, myších myelomových buňkách, vaječníkových buňkách čínského křečka, expresním systému Baculoviru a E. coli. Biologické účinnosti těchto proteinů rIL-10 jsou až dosud nerozlišitelné (Moore,

K. W. , 0'Garra A., de Waal Malefyt R. , Vieira Mosmann T. R. 1993, lnterleukin-10, Annu Rev. Immunol, 11: 165-190).

Gen mIL-10 obsahuje pět exonů, které jsou uspořádáSamotný genomový klon kóduje Geny mIL-10 a hIL-10 jsou chromosomu 1 (Moore, K. W., Vieira Mosmann T. R. 1993, ny přes přibližně 5,1 kb DNA. exprimovatelný protein mIL-10 umístěny na myším a humánním O'Garra A., de Waal Malefyt R lnterleukin-10, Annu Rev. Immunol, 11: 165-190, (Kim J. Μ. , Brannan C. I., Copeland N. G., Jenkins N. A., Khan T. A., Moore, K. W. 1992, Structure of the mouše interleukin-10 gene and chromosomal localization of the mouše and human genes. J. Immunol. 148:3618-3623).

mIL-10 a hIL-10 vykazují silnou homologii sekvence DNA a aminokyselinové sekvence vzhledem k otevřenému čtecímu rámci v genomu viru Epstein-Barrové (BCRF1). Tato homologie je omezena na kódující sekvenci pro maturovaný protein a není detegována v signální sekvenci ani 5’a 3’-nepřelože- né sekvenci (Viera P., R. de Wall-Malefyt,

M.-N. Dang, K. E. Johnson, R. Kastelein, D. F. Fiorentiono,

J. E. de Vries, M.-G. Roncarolo, T. R. Mosmann a K. W. Moore, 1991, Isolation and expressionof human cytokine synthesis inhibitory factor /CSIF/IL-10) cDNA dones:

homology to Epstein-Barr virus open reading fráme BDRFI, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA), 88: 1172). Z těchto tří sekvencí představuje mIL-10 a hIL-10 dvojici s nejtěsnějším vztahem na úrovni sekvence DNA (81 %). Sekvence DNA kódující maturovaný protein hIL-10 a BCRF1 vykazují 71% homologii. Homologie mezi hIL-10 a BCRF1 na aminokyselinové úrovni je 84%. Existuje hypotéza, že geny mIL-10 a hIL-10 se vyvinuly ze společného předchůdce, zatímco BCRF1 představuje starší zpracovaný zachycený buněčný cytokinový gen a že BCRF1 protein je přinucen podobat se hIL-10. BCRF1 je exprimován během lytického cyklu EBV. BCRF1ORF kóduje 17kd sekretovaný polypeptid, který podobně jako hIL-10 obsahuje malou nebo neobsahuje žádnou glykosylaci. BCRF1 vykazuje určité

účinnosti IL-10 a byl	označován	názvem	virový IL-10
(vIL-10), přestože jeho hIL-10.	účinnost	odpovídá	10% účinnosti
Účinnost IL-10 na produkci	cytokinú
hIL-10 inhibuje	produkci	řady cytokinú, včetně

interferonu-gamma (IFN-gamma), faktoru nekrosy nádorů alfa (TNF-alfa), faktoru stimulujícího kolonie granulocytových makrofágů (GM-CSF), granulocyt-CSF (G-CSF), IL-lalfa, IL-lbeta, IL-2, IL-6, IL-8 a monocytového chemotaktického polypeptidu-1 (MCP-l/MCAF) monocyty/makrofágy a/nebo T-lymfocyty (Fiorentino D. F., M. W. Bond a T. R. Mosmann 1989; Two types of mouše hepler T cell. IV. Th2 dones secrete a factor that inhibits cytokine production by Thl dones, J. Exp. Med., 170: 2081 (5). IL-10 také inhibuje schopnost monocytů migrovat v odpovědi na chemokinový MCP-l/MCAF (Larsen C. G., Jinquan T., Deleurant B., Thestrup-Pedersen K., 1993, IL-10 is a potent regulátor of the chemotactic response of mononuclear cells, but not of granulocytes, J. Invest. Dermatol. sv. 100, č. 6). Dále hIL-10 indukuje produkci endogenního přírodního antagonisty vazby k IL-lalfa inhibičního antagonisty

J.-Jr 1994, receptoru interleukinu-1 (IRAP) (Moore, K. W., 0'Garra A., de Waal Malefyt R., Vieira Mosmann T. R. 1993, Interleukin-10, Annu Rev. Immunol, 11: 165-190), který inhibuje IL-lalfa, a IL-lbeta prostřednictvím kompetitivní receptoru. Jelikož je IL-8 silně indukovatelný a IL-lbeta, zprostředkovává IL-10 část svého účinku na produkci IL-8 stimulací produkce receptoru IL-1, IRAP. Posledně uvedený mechanismus má značnou důležitost pro tento vynález, jak je to popsáno a dokumentováno v příkladech dále. IRAP vykazuje antiinflamatorní účinky (Hannum C. Η., Wilcox C.J., Arend W. P. et al., 1990, Interleukin-1 receptor antagonist activity of a human interleukin-1 inhibitor; Nátuře 343: 336 až 340) a bylo postulováno, že bude mít terapeutický účinek na rheumatoidní arthrisis (Firestein G. S., Boyle D. L., Yu C. et al., 1994, Synovial interleukin-1 receptor antagonist and interleukin-1 balance in rheumatoid arthritis, Arthritis Rheum 37: 644 až 652). IRAP se také ukázal být účinným při léčení syndromu sepse. Při léčení pomocí IRAP byla konstatována na dávce závislá užitečnost této látky pro 28denní přežití při studii podle Fishera et al. (Fisher C.

G. J. , Opal S. Μ. , Pribble J. P. et al., evaluation of recombinant interleukin-1 receptor antagonist in the treatment of sepsis syndrome: a randomized, open-label, placebo-controlled multicenter trial, The IL-1RA Sepsis Syndrome Study Group, Crit-Care-Med, 22: 12 až 21) se statistickou významností p = 0,015. IRAP může vyvolávat část svých antiinflamatorních účinků prostřednictvím inhibice produkce chemokinu, jako produkce IL-8.

Slotman

Initial

Exprese IL-10 a protilátky

.....IL-10 inhibuje expresi MHC z třídy II v humánních monocytech (Carter D. B., Deibel M.R.-Jr., Dunn C. J. et al., 1990, Purification, cloning, exppresion and biological characterization of an interleukin-1 receptor antagonist protein: Nátuře 344: 633 až 638). Konstitutivní exprese

HLA-DR/PB a DQ nebo exprese HLA-DR/PB a DQ indukovaná IL-4 nebo IFN-gamma byla inhibována hIL-10. (de Waal-Malefyt R. ,

Haanen J. , Spits Η. , et al., 1991, IL-10 and viral IL-10 strongly reduce antigen-specific human T cell proliferation by deminishing the antigen-presenting kapacity of monocytes λ via down-regulation of class li MHC expresion, J. Exp. Med.

174: 915 až 924). Kromě toho, monocyty preinkukované * s hIL-10 vzdorují následující indukci exprese MHC z třídy II pomocí IL-4 nebo IFN-gamma. IL-10 inhibuje expresi třídy II humánními monocyty po aktivaci pomocí LPS (de Waal-Malefyt R. , Haanen J., Spits Η. , et al., 1991, IL-10 and viral IL-10 strongly reduce antigen-specific human T cell proliferation by deminishing the antigen-presenting kapacity of monocytes via down-regulation of class II MHC expresion,

J. Exp. Med. 174: 915 až 924) (Sankoff a Kruskal in kapitole 1 of Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison (Addison-Wesley, Reading, Mass. 1983)). Myši BALB/c, kterým se podává 1 až 10 mg IL-10 současné s lethální dávkou LPS, jsou ochráněny před smrtí (Moore, K. W., O'Garra A., de Waal Malefyt R., Vieira Mosmann T. R. 1993, Interleukin-10, Annu Rev. Immunol, 11: 165-190).

IL-10 inhibuje dusíkaté meziprodukty a hyperoxidové anionty. IL-10 také inhibuje reaktivní dusíkaté meziprodukty (oxid dusnatý) a reaktivní kyslíkaté meziprodukty (peroxid vodíku) prostřednictvím makrofágů po aktivaci IFN-gamma (Gazzinelli R. T., Oswald I. Ρ., James S. L., Sher

A., 1992, IL-10 inhibits parasite killing and nitric oxide production by IFN-\-activated macrophages, J. Immunol. 148:

1792 až 1796).

IL-10 a aktivita T-buněk

IL-10 také vykazuje modulační účinky na funkce/aktivitu T-buněk. hIL-10 je tedy silným chemostatickým faktorem pro T-lymfocyty CD8+, ale nevykazuje chemotaxi vůči T-buňkám CD4+ (Jinquan T., Larsen C. G., Gesser B., Matsushima K., Thestrup-Pedersen K., 1993, Human IL-10 is a chemoattractant for CD8+ T lymphocytes and an inhibitor of IL-8-induced CD4+ T lymphocyte Migration, Journal of Immunogy 151: 4545 až 4551). Kromě toho IL-10 potlačuje schopnost T-buněk CD4+ odpovídat na chemotaktické signály beta-chemokinu RANTES a alfa-chemokinu IL-8. hIL-10 také přímo inhibuje proliferaci T-buněk a T-buněčných klonů CD4+ z humánní periferní krve (Jinquan T., Larsen C. G., Gesser B., Matsushima K., Thestrup-Pedersen K., 1993, Human IL-10 is a chemoattractant for CD8+ T lymphocytes and an inhibitor of IL-8-induced CD4+ T lymphocyte Migration, Journal of Immunogy 151: 4545 až 4551).

IL-10 a B-lymfocyty hIL-10 ko-stimuluje proliferaci B-lymfocytú indukovanou síťujícím povrchovým Ig s imobilizovanou anti-IgM protilátkou a tento účinek se zvýší, když jsou B-buňky stimulovány zesíťováním jejich antigenu CD40 protilátkou anti-CD40 a myšími L-buňkami exprimujícími humánní FcgammaRII/CD32 (F. Rousset, E. Garcia, T. Defrance, C. Peronne, D.-H. Hsu, R. Kastelein, K. W. Moore a J. Banchereau, 1992, IL-10 is a potent growth and differentioation factor for activated human B lymphocytes, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 175: 671). Účinek IL-10 na proliferaci a diferenciaci aktivovaných humánních B-buněk ukazuje, že by tento cytokin mohl být důvodem značné části zvýšené schopnosti' T-buněk exprimovat hIL-10 pro pomoc odpovědím B-buněk.

IL-10 jako homeostatický faktor pro imunitní systém

Fyziologické důsledky funkcí IL-10 zmíněných výše představují pravděpodobně určitý stupeň homeostázy imunitního systému. IL-10 jasně inhibuje funkce pomocných T-buněk (helper) a pravděpodobně stimuluje supresorové funkce T-buněk. Proto se předpokládá, že podobně jako IL-4 také IL-10 reguluje rovnováhu mezi cytokinovými profily Thl a Th2 T-buněk. Zejména se předpokládá, že IL-10 inhibuje diferenciaci buněk Thl. Jelikož jsou buňky Thl charakteristické produkcí cytokinů (IFN-gamma a IL-2), které favorizuji imunitní odpovědi zprostředkované buňkami, zatímco buňky Th2 produkují cytokiny (IL-4, IL-5 a IL-10), které favorizují humorální odpovědi a potlačují imunitní odpověd zprostředkovanou buňkami, zdá se, že IL-10 potlačuje imunitní reakce zprostředkované T-buňkami, jako jsou hypersensitivitní reakce zpožděného typu, a naopak favorizuje humorální odpovědi.

V důsledku znaků IL-10, které byly uvedeny výše, se účinnost IL-10 popisuje jako účinnost inhibitoru syntézy makrofágů a cytokinů Thl. Proto bylo studováno, zda ztráta schopnosti produkovat IL-10 a/nebo ztráta účinnosti IL-10 může hrát úlohu u chorob, u nichž se imunoreaktivita zprostředkovaná buňkami považuje za důležitý faktor, jako například u autoimunitních chorob a inflamatorních chorob. Myši ošetřené anti-IL-10 protilátkou vykazují silnější inflamatorní odpověd na zánět vyvolaný monokinem a jsou podstatně susceptibilnější vůči smrti indukované septickým šokem vyvolaným LPS, což je monokinem zprostředkovaná inflamatorní reakce (Howard Μ., O'Garra A., Ishida, Η., de Waal Malefyt R., De Vries J., 1992, Biological properties of Interleukin-10, J. Clin. Immunol, 12: 239 až 247). U myší ochromených IL-10 se také spontánně vyvinou inflamatorní reakce střev, které jsou podobné colitis ulcerosa (Kuhn R.,

Lohler J. , Rennick D., Rajewsky K. , Muller W., 1993,

Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis, Cell 75: 263 až 274). Kromě toho, bylo zkoumáno, zda IL-10 má nějakou úlohu u různých parazitických, mykobakteriálních. nebo virových infekcí. Přitom se zjistilo, že IL-10 hraje patofyziologickou úlohu v imunoparéze mající vztah k infekci Schistosoma mansoni (Sher A., Fiorentino D. F., Caspar P., Pearce E., Mosmann T., 1991, Production of IL-10 by CD4+ lymphocytes correlates with down-regulation of Thl cytokine synthesis in helminth infection, J. Immunol. 147: .2713 až 2716). Také byla navržena úloha IL-10 u infekcí Mycobacterium leprae. Nedávno se zjistilo, že pacienti s AIDS se špatnou prognosou obsahují v plasmě zvýšenou hladinu IL-10 a byl učiněn předpoklad, že tato skutečnost přispívá k imunoparéze, která je známa z AIDS (Clerici M., Shearer G. M., 1993, Immunology Today 14: 107 až 111).

Terapeutické aspekty

Výsledky, či data, in vivo, které byly uvedeny výše, silně naznačují, že IL-10 vykazuje homeostatickou úlohu při řízení imunitní inflamače zprostředkované buňkami a zesílené monokiny a ukazují na širokou možnost terapeutických aplikací IL-10 nebo léčiv s účinností podobnou IL-10 při léčení chorob, jež jsou charakteristické sníženou/nedostatečnou produkcí a/nebo účinností IL-10. Jelikož látka podle vynálezu, jejímž příkladem je IT9302, vykazuje účinnost podobnou IL-10 v tom, že

1) indukuje produkci IRAP humánními monocyty,

2) inhibuje spontánní produkci IL-8 humánními monocyty,

3) inhibuje IL-lbeta-stimulovanou produkci IL-8 jednojadernými buňkami periferní krve (PBMC),

4) stimuluje chemotaktickou migraci T-lymfocytů CD8+, ale nikoliv CD4+,

5) desensitizuje humánní T-buňky CD8+ vůči chemotaktické migraci indukované rhIL-10,

6) inhibuje chemotaxi humánních T-buněk CD4+ zprostředkovanou IL-8,

7) inhibuje chemotaxi humánních monocytů zprostředkovanou MCP-l/MCAF,

8) indukuje produkci IL-4 kultivovanými normálními humánními T-buňkami CD4+ a

9) snižuje produkci TNFalfa při reakci humánních smíšených leukocytů, může tento polypeptid a jeho analogy poskytovat stejné terapeutické možnosti jako hIL-10. V tabulce 3 jsou uvedeny které choroby, při nichž může imunomodulátor podobný IL-10 nebo imunomodulátor s účinností podobnou účinnosti IL-10 vykazovat terapeutickou důležitost.

Tabulka 3

Některé choroby, u nichž může imunomodulátor s účinností podobnou účinnosti IL-10 vykazovat terapeutickou důležitost díky indukci produkce IRAP a/nebo inhibici produkce a/nebo účinnosti cytokinů (Bry K., Lappalainen U., 1994, Interleukin-4 and transforming growth factor-beta 1 modulate the production of interleukin-1 receptor antagonist and prostaglandin E2 by decidual cells, Am-J-obstet-Gynecol 170 (4): 1194 až 1198

Firestein G. S., Boyle D. L. , Yu C., Paine Μ. Μ., Whisenand

T. D. , Zvaifler N. J., Arend W. Ρ., 1994, Synovial interleukin-1 receptor antagonist and interleukin-1 balance in rheumatoid arthritis, Arthritis Rheum 37/5: 644 až 652

Roberge C. J. , De-Medicis R., Dayer J. Μ. ,

Rola-Pleszcyczynski Μ., Naccahe Ρ. Η., Poubelle P. E., s 1994, Crystal-induced neutrophil activation: V. Differential production of biologically active IL-1 receptor antagonist,

J. Immunol 152/11: 5485 až 5494 McCall R. D., Haskill S., Zimmermann Ε. Μ., Lund Ρ. K., / Thompson R. C., Sartor R. B., 1994, Tissue interleukin-1 and interleukin-1 receptor antagonist expression in enterocolitis in resistant and susceptible rats,

Gastroenterology (4): 960 až 972

Kimble R. B. , Vannice J. L. , Bloedow D. C. , Thompson R. C.,

Hopfer W. , Kung V. Τ. , Brownfield C. , Pacifici R. , 1994,

Interleukin-1 receptor antagonist decreases bone loss and ř- bone resorption in ovariectomized rats, J. Clin. Invest., f 93/5: 1959 až 1967

Kline J. Ν. , Geist L. J. , Monick Μ. Μ. , Stinski, M. F. ,

Hunninghake G., W., 1994, J. Immunol. 152 (5): 2351 až 2357 i’ Tompkins R. G., 1994, Human recombinant interleukin-1 _ _ _ . receptor antagonist in the treatment of sepsis syndrome * (editorial, comment), Crit-Care-Med., 22(1): 3, 22 (1): 12 až 21

Everaerdt B., Brouckaert P.,Fiers W., 1994, Recombination r

IL-1 receptor antagonist protects against TNF-induced lethality in mice, J. Immunol. 152/10: 5041 až 5049

Fischer C. J.-Jr., Slotman G. J., Opal S. M. , Pribble J. P. , Bone R. , C. , Emmanuel G. , Ng D., Bloedow D. C., Catalano M. A., 1994, Initial evaluation of human recombination interleukin-1- receptor antagonist in the sepsis syndrome: a randomized, placebo-controlled multicenter trial, The treatment of open-label, IL-1RA Sepsis

Syndrome Study Group (viz poznámky), Crit-Care-Med. 22(1): 12 až 21, 22(1): 3

Gomes-Reino-Carnoto J. J., 1994, New therapies in rheumatoid arthritis, Med. Clin. 543 až 545

Nishihara T., Ohsaki Y., Ueda N., Saito N., Mundy G. R. , 1994, Mouše interleukin-l-receptor antagonist induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans lipopolysaccharide blocks the effects of interleukin-1 on bone resorption and osteoclast-like cell formation, Infect-Immun. 62(2): 390 až 397

Simon C. , Frances A., Piguette G. N. , el-Danasouri I. , Zurawski G., Dang W. , Polán M. L. , 1994, Embryonic implantation in mice is blocked by interleukin-1 receptor antagonist (viz poznámky), Endocrinoiogy, 134(2): 521 až 528, 134(2): 519 až 520

Baergen R., Benirschke K., Ulich T. R., 1994, Cytokine expression in the placenta, The role of interleukin 1 and interleukin 1 receptor antagonist expression in chorioamnionitis and parturition, Arch-Pathol-Lab-Med, 118(1): 52—55

Tang W. W. , Feng L. , Vannice J. L., Wilson C. B. , 1994, Interleukin-1 receptor antagonist ameliorates experimental antiglomerular basement membrane antibody-associated glomeluronephritis, J. Clin-Invest. 93(1): 279-9

Cassatella Μ. A., Méda L., Gasperini S., Calzetti F., Bonara

S., 1994

Interleukin 10 (IL-lo) upregulates IL-1 receptor antagonist production from lipopolysaccharide-stimulated human polymorphonuclear leukocytes by delaying mRNA degradation, J. Exp-Med. 179/5: 1695 až 1699

Mancini R. , Bendetti A., Jezequel A. Μ., 1994, An interleukin-1 receptor antagonist decreases fibrosis induced by dimethylnitrosamine in rat liver, Virchows-Arch. 424/1: 25 až 31

Lukacs N. W. , Kunkel S. L. , Burdick M. D. , Lincoln Ρ. Μ. , Strieter R. Μ., 1993

Interleukin-1 receptor antagonist blocks chemokine production in the mixed lymphocyte reaction, Blood. 82(12): 3668 až 3674

Bandara G., Mueller G. Μ. , Galea-Lauri J. , Tindal Μ. Η., Georgescu Η. I., Suchánek Μ. K. , Hung G. L., Gloriso J. C., Robbins P. D., Evans C. Η., 1993

Intraarticular expression of biologically active interleukin-l-receptor-antagonist protein by ex vivo transfer, Proc-Natl-Acad-Sci-USA, 90(22): 10764-8

Dinarello, C. A., 1994, Anti-interleukin-1 strategies in the treatment of the septic shock syndrome, Can-J-Infect-Dis 5 (suppl. A): 9A až 16A

Oelmann Ε. , Topp M. S., Reufi Β., Papadimitriiou C. , Koeningsmann Μ., Oberberg D., Thiel E., Berdel W. Ε., 1994, Int-J-Oncol. 4/3: 555 až 558

Estrov Z, 1993, Interruption of autocrine and paracrine growth-stimulatory mechanisms: a new therapeutic stratégy for chronic myelogenous leukemia, Semin-Hematol. 30(3 suppl.

3):35 až 36

Wooley Ρ. Η., Whalen J. D., Chapman D. L. , Berger A. E. , Richard K. A., Aspar D. G., Staite N. D., 1993, The effect of an interleukin-1 receptor antagoníst protein on type II collagen-induced arthritis and antigen-induced arthritis in mice, Arthritis Rheum. 36(9): 1305 až 1314

Peterson C. Μ., Hales H. A., Hatasaka Η. Η., Mitchell M. D., Rittenhouse L., Jones K. P., 1993, Interleukin-1 beta (IL-1 beta) modulates prostaglandin production and the natural IL-1 receptor antagoníst inhibits ovulation in the optimally stimulated rat ovariat perfusion model, Endocrinology 133 (5): 2301 až 2306

Estrov Z., Kurzrock R. , Talpaz Μ. , 1993, Role of interleukin-1 inhibitory molecules in therapy of acute and chronic myelogenous leukemia, Leuk. Lymphoma 10 (6): 407 až 418

Chensue S. W. , Bienkowski Μ., Eessalu Τ. E., Warmington

K. S., Hershey S. D., Lukacz N. W., Kunkel S. L., 1993, IL-1 receptor antagoníst protein (IRAP) regulates schistosome agg granuloma formation and the regional lymphoid response, J. Immunol. 151(7): 3654 až 3662

Bowyer J. F., Davies D. L., Schmued L., Broening H. W., Newport G. D., Slikker W-Jr., Holson R. R., 1994, Further studies of the role of hyperthemia in methamphetamine neurotoxicity, J. Pharmacol. Exp. Ther. 268/3: 1571 až 1580

Cole O. F. , Sullivan Μ. H. F., Elder M. G., 1993, The 'interleukin-1 receptor antagonist' is a partial agonist of prostaglandin synthesis by human decidual cells, Prostaglandins 46/6: 493 až 498

Jenkins J. K., Arend W. P., 1993, Interleukin 1 receptor antagonist production in human monocytes is induced by IL-lalpha, IL-3 and IL-4 and GM-CSF, Cytokine 5/5: 407 až 415

Coceani F., Interleukin-1 interleukin-1 1596

Lees J., Redford J., Bishai I., receptor antagonist: effectiveness fever, Can. J. Pharmacol. 70 (12):

1992, against 1590 až

Schiro R., Longoni D., Rossi

M. Carrara G., Maséra G.,

V., Maglia O., Doni A., Arsura Vannier E., Dinarello C. A.,

Rambaldi A., Biondi A., 1994, Suppresion of juvenile chronic myelogenous leukemia colony growth by interleukin-1 receptor antagonist, Blood 83/2: 460 až 465

D., Bouřné A. D., Thompson R. C., Cytokines contribute to airway pulmonary eosinophil

Watson M. L., Smith Westwick J., 1993, dysfunction hyperreactivity, accumulation and tumor necrosis factor generation by pre-treatment with an interleukin-1 receptor antagonist, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 8 (4): 365 až 369

Abhyankar S., Gilliland D. G., Ferrara J. L. Μ., 1993, Interleukin-1 is a critical effector molecule during cytokine dysregulation in graft-versus-host disease to minor histocompability antigens, Transplantation 56/6: 1518 až 1523

Lan Η. Y., Nikolic Paterson D. J., Zarama Μ., Vannice J. L.,

Atkins R. C., 1993, Suppresion of experimental crescentic glomerulonephritis by the interleukin-1 receptor antagonist,

Kidney Int. 43(2): 479 až 485

Herve Ρ., 1993, Prevention and treatment of acute GvHD- New modalities; Noův. Rev. Fr. Hematol. 35/3: 295 až 297

Conti Ρ., Panara M. R., Barbacane R. C., Placido F. C. , Bongrazio Μ., Reále Μ., Dempsey R. A., Fiore S., 1992, Blocking the interleukin-1 receptor inhibits leukotriene B4 and prostaglandin E2 generation in human monocyte cultures, Cell Immunol. 145 (1): 199 až 209

Kristensen Μ., Deleuran Β., Eedy D. J., Feldmann Μ., Breathnach S. Μ. , Brennan F. Μ., 1992, Distribution of interleukin-1 receptor antagonist protein (IRAP), interleukin-1 receptor and interleukin-1 alpha in normál and psoriatic skin, Decreased expression of IRAP in psoriatic lesional epidermis, Br. J. Deřmatol. 127 (4): 305 až 311

Romero R., Sepulveda W., Mazor Μ., Brandt F., Cotton D. B., Dinarello C. A., Mitchell M. D., 1992, The natural interleukin-1 receptor antagonist in term and pre-term parturition, Am. J. Obstet. Gynecol., 167 (4 Pt 1): 863 až 872

Dinarello C. A., 1992, Reduction of inflammation by decreasing production of interleukin-1 or by specific receptor antagonism, Int. J. Tissue React 14(2): 65 až 75

Conti Ρ., Panara M. R., Barbacane R. C., Bongrazio Μ., Dempsey R. A., Reále Μ., 1993, Human recombinant IL.l receptor antagonist (iL-IRa) inhibits leukotriene B4 generation from humatemonocyte suspensions stimulated by lipopolysaccharide (LPS), Clin. Exp. Immunol. 91/3: 526 až 531

DeFroge L. E., Tracey D. E., Kenney J. S., Remick D. G., 1992, Interleukin-1 receptor antagonist protein inhibits interleukin-8 expression in lipopolysaccharide-stimuled human whole blood, Am. J. Pathol. 140(5): 1045 až 1054

Porat R., Poutsiaka D. D., Miller L. C., Granowitz Ε. V., Dinarello C. A.,. 1992,Interleukin-1 (IL-1) receptor. blockade reduces endotoxin and Borrealia burgdorferi-stimulated IL-8 synthesis in human mononuclear cells, Faseb. J. 6 (7): 2482 až 2486

Boermeester M. A., van Leeuwen P. A. M., Schneider A. J. , Houdijk A. P. J. , Ferwerda C. C. , Wesdorp R. I. C. , 1993, Interleukin-1 receptor antagonist: A new therapeutic agent in the treatment of septic syndrome. Ned. Tijd-schr. Geneesks. 137/7: 337 až 342

Smith R. J. , Chin J. E., Sam L. M. , Justen J. M. , 1991, Biologie effects of an interleukin-1 receptor antagonist protein on interleukin-l-stimulated cartilage erosion and chondrocyte responsiveness, Arthritis Rheum. 34(1): 78 až 83

Conti P. , Barbacane R. C. , Panara M. R. , Reále M. , Placido F. C., Fridas S., Bongrazio M., Dempsey R. A., 1992, Human recombinant interleukin-1 receptor antagonist hrlL-lra) enhances the stimuíatory effect of interleukin-2 on natural killer cell activity against MOLT-4 target cells, Int. J. Immunopharm. 14/6: 987 až 993

Selig W., Tocker J., 1992, Effect of interleukin-1 receptor antagonist on antigen-induced pulmonary responses in-guinea pigs, Eur. J. Pharmacol 313/3: 331 až 336

McCarthy P. L.-Jr., Abhyankar S., Neben s., Newman G. , Sieff C., Thompson R. C., Burakoff S. J., Ferrara J. L. Μ., 1991, Inhibition of interleukin-1 by an interleukin-1 receptor antagonist prevents graft-versus-host diseases, Blood 78/8: 1915 až 1918

Estrov Z., Kurzrock R., Wetzler Μ. , Kantarjian Η., Blake Μ., Harris D., Gutterman J. U., Talpaz Μ., 1991, Suppression of chronic myelongenous leukemia colony growth by interleukin-1 (IL-1) receptor antagonist and soluble IL-1 receptors: A novel application for inhibitors of IL-1 activity, Blood 78/6: 1476 až 1484

Thomas Τ. K., Will P. C., Srivastava A., Wilson C. L. , Harbison Μ., Little J., Chesonis R. s., Pignatello Μ., Schmolze D., Symington J., Kilin P. L., Thompson R. C., 1991, Evaluation of an interleukin-1 receptor antagonist in the rat acetic acid-induced colitis model, Agents Actions 34/1-2: 187 až 190

Carter D. B., Deibel M. R.-Jr., Dunn C. J., Tomich S. C. S., Laborde A. L., Slightom J. L., Berger A. E., Bienkowski

M. J. , Sun F. F., McEwan R. N., Harris P. K. W., Yem A. W., Waszak G. A., Chosay J. G., Sieu L. C., Hardee^M. Μ., Zurcher Neely H. A., Reardon I. Μ., Heinrikson R. L. et al., 1990, Purification, cloning expression and biological characterization of an interleukin-1 receptor antagonist protein, Nátuře 344/6267: 633 až 638

LarsěnČ. G., Anderson A. Ó., Ápella E., Oppenheim J. J. , Matsushima K. , 1989, Science 243: 1464 předčasná práce k porodu vyvolaná infekcí nebo jinými chorobami, rheumatoidní arthritis,

Lymeho arthritis, dna, septický syndrom, hyperthermie, vředová colitis nebo enterocolitis, osteoporosis, cytomegalovirus, periodontální choroby, glomerulonephritis, chronické neinfekční záněty plic(napříkladsarcoidosis a tzv. kuřácké plíce), tvorba granulomů, fibrosa jater, fibrosa plic, odmítání transplantátů, choroba graft vs. host, chronická myeloidni leukemie, akutní myeloidni leukemie, jiné neoplastické choroby, asthma bronchiale, diabetes mellitus typu I (insulin dependentní), arteriosclerosis/atherosclerosis, psoriasis, chronická leukemie lymfocytů B, běžná variabilní imunodeficience, vedlejší účinky za použití jiných modifikátorů biologické odpovědi, disseminovaná intravaskulární koagulace, systemická sklerosa, encephalomyelitis, zánět plic, hyper IgE syndrom, enterocolitis, metastázy a růst rakovinných nádorů, „ adoptivní imunitní terapie, získaný syndrom respiračního distresu, sepse, reperfusní syndrom, zánět po chirurgickém zákroku, transplantace orgánu a alopecie.

Následuje podrobný popis tohoto vynálezu.

Vývoj nonapeptidu homologického s IL-10 a vykazujícícho podobnou účinnost jako IL-10

Byla vybrána část sekvence hIL-10 o délce 9 aminokyselin na základě principu, že tato sekvence by měla vykazovat vysokou homologii mezi vIL-10 a hIL-10, ale co nejnižší homologii vůči mIL-10. Tato strategie je založena ns skutečnosti, že vIL-10 zčásti křížově reaguje s hIL-10, zatímco mIL-10 s hIL-10 křížově nereaguje (viz výše). Sekvence hIL-10 zodpovědné za určité aktivity v humánním organismu mohou být tedy umístěny v doménách, v nichž existuje vysoká homologie mezi hIL-10 a vIL-10, ale nízká homologie ve vztahu k mIL-10.

Předpokládá se, že signální poiypeptid hIL-10 se skládá z prvních 18 aminokyselin. Maturovaný protein začíná u aminokyseliny č. 19 (č. l ve funkčním proteinu, kterým je serin) a celý protein obsahuje 160 aminokyselin. Na základě prohlídky COOH-terminální sekvence humánního a virového IL-10 a zejména poloh 157 a 159 (lysinový a argininový zbytek) bylo zjištěno“, že tato doména je pravděpodobně zodpovědná za vazbu k receptoru (viz obr. 1 a 2).

Po screeningu několika kandidátů získaných chemickou syntézou na účinnost podobající se účinnosti IL-10 se zjistilo, že syntetický nonapeptid IT9302 vykazuje některé imunosupresivní účinnosti, které kopírují účinnosti hIL-10, jak je to podrobně popsáno dále v příkladech. IT9302 odpovídá sekvenci nonapeptidu od C-terminálního konce hIL-10 a vykazuje následující aminokyselinovou sekvenci

NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-ILe-Arg-Asn-COOH (SEQ ID NO: 1).

IT9302 vykazuje 100% homologii se segmentem hIL-10 odpovídajícím aminokyselinám č. 152 až 160 u C-terminálního konce. Kromě toho tato polypeptidová sekvence obsahuje šest aminokyselin, které jsou společné s aminokyselinami v odpovídající oblasti vIL-10 (viz obr. 1 a 2), což znamená, že šest z devíti amOinokyselin, tedy 66 % aminokyselin vykazuje výše definovanou homologii. Dále tato polypeptidová sekvence obsahuje čtyři aminokyseliny, které jsou společné s aminokyselinami v odpovídající oblasti mIL-10, což znamená homologii čtyř aminokyselin z devíti, tedy 44% homologii. Tento nonapeptid představuje jedinou sekvenci, která byla až dosud získána nebo odvozena z hIL-10 a podrobena zkoušení. Specifické vlastnosti tohoto nonapeptidu jsou uvedeny v příkladech. Podle přesvědčení původců tohoto vynálezu dosud nikdo předtím necharakterizoval tuto sekvenci jako funkční doménu.

V nejširším pojetí je předmětem vynálezu látka, vykazující hIL-10-agonistickou účinnost, tj. látka, která je odlišná od humánního interleukinu-10 a která vykazuje jednu nebo více následujících vlastností:

a) indukuje inhibici spontánní produkce IL-8 humánními monocyty,

c) indukuje produkci proteinu, který je antagonistický vůči receptoru interleukinu-1 (IRAP), humánními monocyty),

d) indukuje chemotaktickou migraci humánních Tlymfocytů CD8+ in vitro,

f) potlačuje chemotaktickou odpovědí humánních Tlymfocytů CD4+ vůči IL-8,

g) potlačuje chemotaktickou odpovědí humánních monocytů vůči MCAF/MCP-1,

j) snižuje produkci TNFa při reakci humánních smíšených leukocytů.

Z těchto účinností jsou účinnosti d) až g) považovány za zvláště jedinečné. Podle jednoho důležitého aspektu je předmětem tohoto vynálezu látka vykazující hIL-10 agonistickou účinnost, definovaná výše, vykazující aminókýšě1inovou sekvenci

Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-ILe-Arg-Asn nebo analog nebo variantu této sekvence. Tato sekvence stejně tak, jako všechny jiné polypeptidové sekvence v tomto popisu a nárocích, je v souhladu s běžnými konvencemi, pokud není uvedeno jinak, psána od N-konce k C-konci.

Nonapeptid IT9302 je schopen velmi silně indukovat různé funkce a je velmi stálý. Předpokládá se, že se nemůže nesprávně kopulovat k receptorúm. Tento nonapeptid byl zvolen z toho důvodu, že obecně je pro protein jedinečná devítiaminokyselinová polypeptidová sekvence. Je však třeba si všimnout, že šest aminokyselin na samém konci hIL-10 se zdá být nejdůležitéjších. Do rozsahutohoto vynálezu tedy spadá polypeptidová látka zahrnující subsekvenci aminokyselin

Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-ILe-Arg-Asn (SEQ. ID NO: 9)

Podobně se také předpokládá, že některé aminokyselinové substituce nebudou mít nepříznivé účinky na hIL-10 agonistickou účinnost definovanou v tomto popisu za předpokladu, že budou přítomny threonin, lysin a arginin, mezi nimiž bude umístěna jedna aminokyselina.

Do rozsahu tohoto vynálezu tedy také spadá polypeptid obecného vzorce

Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEQ ID NO: 19) kde

X₄ a X₅ nezávisle představuje vždy Met, Ile, Leu nebo Val a

Xg představuje zbytek Asn, Asp, Gin nebo Glu, přičemž tímto polypeptidem není polypeptid se sekvencí

Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn.

Do rozsahu tohoto vynálezu také spadá polypeptid obecného vzorce

X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEQ ID NO: 20) kde

X₃, X₄ a X₅ nezávisle představuje vždy Met, Ile, Leu nebo Val a

X₆ představuje zbytek Asn, Asp, Gin nebo Glu.

Do rozsahu tohoto vynálezu také spadá polypeptid obecného vzorce ^X2“^X3“^Thr~^X4“^Ly^s~^X5“^Arg^-X6 (^{SEQ ID N0: 21}) kde

X₂ představuje Tyr nebo Phe, ^χ3» ^x4 a X₅ nezávisle představuje vždy Met, Ile, Leu nebo Val a

Xg představuje zbytek Asn, Asp, Gin nebo Glu.

V přednostním provedení do rozsahu tohoto vynálezu spadá polypeptid obecného vzorce

X₁-X₂-X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆(SEQ IDNO: 22) kde

X_x představuje Ala nebo Gly,

X₂ představuje Tyr nebo Phe,

X₃, X₄ a X₅ nezávisle představuje vždy Met, Ile, Leu nebo

Val a

X₆ představuje zbytek Asn, Asp, Gin nebo Glu.

Předmětem vynálezu je tedy látka nebo polypeptid vykazující _Λ některou z aminokyselinových sekvencí uvedených výše, za předpokladu, že touto. látkou nebo polypeptidem není humánní IL-10.

Jako příklady specifických polypeptidů, u nichž se předpokládá hIL-10 agonistická účinnost definovaná výše, je možno uvést polypeptidy 1 až 16:

1. NH₂-Ala-Tvr-Met-Thr-Ile-Lys-Met-Arg-Asn-COOH (SEQ ID NO: 2}

2. NH₂-Ala-Phe-Met-Thr-Leu-Lvs-Leu-Arg-Asn-COOH (SEQ ID NO:3)

3. , ' NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lvs-Val-Arg-Glu-COOH (SEQ ID NO:4)

4. NH₂-Gly-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO:5)

5. NH₂-Ala-Phe-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO:6)

6. NH₂-Ala-Tyr-Ile-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO:7)

7. NH₂-Ala-Tyr-Leu-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO:8)

8. NH₂-Ala-Tyr-Val-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO:9)

9. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO: 10)

10. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Leu-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO: 11)

11. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Val-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID N0:12)

12. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO:13)

13. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Met-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO: 14)

14. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO: 15)

15. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Gln-COOH (SEQ ID NO: 16)

16. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Glu-COOH (SEQ ID NO: 17)

Pro srovnání byl syntetizován další nonapeptid označený názvem IT9301 vykazující 100% homologii vzhledem ·· ksekvenci hIL-10. Tento polypeptid, IT9301, odpovídá nonapeptidové sekvenci začínající u N-konce hIL-10 (aminokyse36 liny č. 19 až 27, t j . prvních 9 aminokyselin maturovaného proteinu). Jeho aminokyselinová sekvence je následující:

NH₂-Ser-Pro-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Ser-Glu-COOH (SEQ ID NQ: 18)

Tento polypeptid nevykazuje žádnou účinnost podobnou účinnosti IL-10 za použití technik popsaných níže a byl vybrán pouze z toho důvodu, že se jedná o nonapeptid umístěný u druhého konce hIL-10. Posledně uvedený nonapeptid sloužil pouze jako kontrola negativních výsledků. Nevykazuje vlastnosti C-terminální sekvence, pokud se týče sekvenční homologie vzhledem k vIL-10 a také neobsahuje příznivé aminokyseliny pro vazbu k receptorů. IT9301 byl zkoušen při IL-lbeta indukovaném systému jednojaderných buněk periferní krve na produkci IL-8, ale ukázalo se, že neindukuje vůbec žádnou inhibici produkce IL-8 těmito buňkami.

Pod označením hIL-10 agonistická látka podle vynálezu se v tomto ppisu a nárocích rozumí jakákoliv farmaceuticky účinná a vhodná sloučenina, která je identická s IT9302 nebo která je posledně uvedené látce strukturně podobná a která vykazuje relevantní biologické účinky podobné účinkům IT9302. Do rozsahu výše uvedeného pojmu spadají i deriváty IT9302, zejména farmaceuticky vhodné soli, estery a solváty, jakož i konjugáty IT9302 nebo derivátů IT9302, včetně peptidomimetik. Kovalentní kopulace IT9302 u NH₂-terminálního konce k příslušnému nosiči, například polyethylenglykolu nebo cukru, může prodloužit poločas životnosti tohoto polypeptidú in vivo.

V textu popisu vynálezu a nároků se používá termínů, z nichž některé jsou definovány dále:

Cytokin je obecný termín pro proteinový mediátor, který je uvolňován převážně, ale nikoliv výlučně buněčnou populací imunitního systému v odpovědi na specifické stimulační činidlo, například specifický antigen nebo alloantigen; nebo nespecifický polyklonální aktivátor, například endotoxin nebo jiné složky buněčné stěny gram-negativní bakterie.

Lymfokin je obecný termín pro proteinový mediátor, který je uvolňován sentisizovanými lymfocyty v odpovědi na stimulační činidlo, například specifický antigen nebo alloantigen; nebo lymfocytem, který je provokován polyklonálním aktivátorem, jako je například endotoxin nebo jiné složky buněčné stěny gram-negativní bakterie.

Interleukin je obecný termín pro proteinový mediátor, který je uvolňován převážně, ale nikoliv výlučně makrofágem, buňkou T, B nebo NK v odpovědi na stimulační činidlo, například specifický antigen nebo alloantigen; nebo lymfocytem, který je provokován polyklonálním aktivátorem, jako je například endotoxin nebo jiné složky buněčné stěny gram-negativní bakterie.

Monokin je obecný termín pro proteinový mediátor, který je uvolňován převážně, ale nikoliv výlučně mononukleárním monocytem (například monocytem, makrofágem, Kupfférovou buňkou /z jater/ nebo Langerhansovou buňkou /z kůže/) v odpovědi na jakékoliv stimulační činidlo.

Chemokin je obecný termín pro proteinový chemotaktický a/nebo leukocyt-aktivující mediátor, který je uvolňován převážně, ale nikoliv výlučně buněčnou populací imunitního systému v odpovědi na specifické stimulační činidlo, například specifický antigen nebo alloantigen; nebo nespecifický polyklonální aktivátor, například . endotoxin nebo jiné složky buněčné stěny gram-negativní bakterie a který náleží do zvláštní třídy genů, a to bučř do třídy genů chemokin-alfa nebo chemokin-beta.

Interferon je obecný termín pro proteinový protivirový a/nebo monocyt-aktivující mediátor, který je uvolňován převážně, ale nikoliv výlučně buněčnou populací imunitního systému v odpovědi na virový nebo interferonový induktor, jako polynukleotid; zejména pak buňkami imunitního Systému v odpovědi na specifické stimulační činidlo, například specifický antigen nebo alloantigen; nebo nespecifický polyklonální aktivátor, například endotoxin nebo jiné složky buněčné stěny gram-negativní bakterie.

Faktor stimulující kolonie je obecný termín pro proteinový, hematopoietický mediátor stimulující kolonie, který je uvolňován převážně, ale nikoliv výlučně buněčnou populací imunitního systému v odpovědi na stimulační činidlo, například specifický antigen nebo alloantigen; nebo nespecifický polyklonální aktivátor, například endotoxin nebo jiné složky buněčné stěny gram-negativní bakterie.

Polypeptid je termín, kterého se používá jak pro krátké peptidy s délkou alespoň dvou aminokyselinových zbytků a nejvýše 10 aminokyselinových zbytků, oligopeptidy (11 až 100 aminokyselinových zbytků), tak i delší peptidy (což představuje obvyklou interpretaci termínu polypeptid, tj. peptidy s více než 100 aminokyselinovými zbytky. Do rozsahu tohoto termínu jsou zahrnuty i proteiny (funkční entity zahrnující alespoň jeden peptid, oligopeptid nebo polypeptid, které mohou být chemicky modifikovány glykosylací, lipidací nebo které obsahují prostetické skupiny). Definice polypeptidů také zahrnuje nativní formy peptidů/ proteinů u člověka, jakož i rekombinantní proteiny nebo peptidy v jakémkoliv typu expresních vektorů transformu39 jícím jakýkoliv druh hostitele, a konečně také chemicky syntetizované peptidy.

Podle jednoho aspektu se vynález týká polypeptidu nesoucího subsekvenci sekvence humánního IL-10 vykazující stupeň homologie vzhledem k vIL-10 66 % a vzhledem k mIL-10 44 %, zejména pak SEQ ID NO: 1. Pod termínem homologie se rozumí totožnost sekvencí aminokyselin v segmentech dvou nebo více aminokyselin, které jsou shodné co do totožnosti a umístění s aminokyselinami v polypeptidech.

Termín homologie, jak se ho používá v tomto popisu, je tedy měřítkem podobnosti mezi dvěma aminokyselinovými (nebo nukleotidovými) sekvencemi. Homologie se vyjadřuje jako zlomek, či procentický podíl, shodujících se aminokyselin (nebo bází) poté co byly dvě sekvence (které nemusí mít stejnou délku) vzájemně přiřazeny do zákrytu. Pojmu přiřazení či přiřazení do zákrytu (alignment) se používá ve smyslu, který je definován v (Sankoff a Kruskal in kapitole 1 of Time Warps, String Edits, and

Macromolecules: The Theory

Comparison (Addison-Wesley, and Practice Reading, Mass.

of Sequence 1983)). Při přiřa- zování dvou sekvenci do zákrytu se zhruba postupuje tak, že se vyvíjí snaha maximalizovat počet shodujících se bází (nebo aminokyselin) mezi dvěma sekvencemi s minimalizací počtu vložených prázdných nebo nulových (blank, null) bází do kterékoliv sekvence pro zajištění maximálního překrývání.

Označení homologický nebo homologní se zde tedy používá mj. pro ilustraci stupně totožnosti mezi aminokyselinovou sekvencí daného polypeptidu a aminokyselinovou sekvencí IT9302. Aminokyselinová sekvence, která se porovnává s aminokyselinovou sekvenci. IT9302, může být dedukována z nukleotidové sekvence, jako sekvence DNA nebo

RNA, získané například hybridizaci charakterizovanou dále, nebo se může stanovit konvenčními sekvenačními metodami aminokyselin. Stupeň homologie se přednostně stanovuje na aminokyselinové sekvenci maturovaného polypeptidů, tj. nebere se v úvahu žádná vedoucí sekvence. Pro stanovení vnitřní homologie se při porovnávání nukleotidových sekvencí obvykle berou v úvahu pouze kódující oblasti.

Přestože se předpokládá, že podstatný stupeň homologie vzhledem k hIL-10 a vIL-10 je prospěšný, není nepravděpodobné, že by různé subsekvence subsekvence hIL-10 vykazující nižší stupeň homologie k vIL-10, řekněme například 50 %, 55 % nebo 60 %, nemohly také vykazovat jednu nebo více prospěšných hIL-10 agonistických vlastností. Kromě toho, jak to bylo uvedeno výše, není absolutně nutné, aby stupeň homologie vzhledem k hIL-10 byl 100 %. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají také polypeptidy vykazující nižší stupeň homologie k hIL-10, jako je stupeň homologie 75, 80, 85, 90 nebo 95 %, přestože 100% homologii se dává přednost.

Takové polypeptidy mohou být považovány za analogy nonapeptidu definovaného výše. Pod termínem analog nebo jeho varianta se tedy rozumí polypeptid, který nevykazuje přesnou sekvenci aminokyselin Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-ILeArg-Asn (SEQ ID NO: 1), ale stále ještě vykazuje hIL-10 agonistickou účinnost, jak je to definováno výše. Obvykle se budou takové polypeptidy v určitém rozsahu lišit od IT9302 popsaného v příkladech ve složení aminokyselin nebo budou zahrnovat posttranslační modifikace, například glykósyláci ňěbó fosforyláci.

Termínu analog nebo varianta se tedy používá v tomto kontextu pro označení proteinu nebo polypeptidů vykazujícího poněkud odlišnou, i když stále ještě podobnou aminokyselinovou sekvenci vzhledem k aminokyselinové sekvenci IT9302. Polypeptidové analogy nebo varianty IT9302 budou tedy obsahovat menší změny modifikující aminokyselinovou sekvenci, jako jsou delece, místně orientované mutace, inserce přídavných aminokyselin nebo jejich kombinace.

Jedním vhodným způsobem pro provedení konzervativních aminokyselinových substitucí apod. v sekvenci nativního proteinu je místně orientovaná mutagenese. Alternativně lze analogy připravit dobře známými způsoby syntézy polypeptidů v kapalné nebo tuhé fázi za použití postupné kopulace jednotlivých aminokyselin polypeptidové sekvence. Poiypeptid je také možno syntetizovat kopulací jednotlivých aminokyselinových fragmentů výsledné sekvence.

Pod označením konzervativní se zde rozumí

i) že alterace jsou konformačně co nejneutrálnější, tj. jsou navrženy tak, aby měly za následek minimální změny terciární struktury mutantních polypeptidů ve srovnání s nativním proteinem a ii) že alterace jsou antigenicky co nejneutrálnější, tj. jsou navrženy tak, aby vyvolaly minimální změny antigenických determinantů mutantních polypeptidů ve srovnání s nativním proteinem.

Konformační neutralita je žádoucí pro zachování biologické účinnosti a antigenická neutralita je žádoucí z toho důvodu, aby nebyly podáním látek podle vyálezu spuštěny imunogenní odpovědi u léčených humánních nebo živočišných pacientů. Ačkoliv je obtížné s absolutní určitostí určit, které alternativy budou konformačně a antigenicky neutrální, existují pravidla, kterých může odborník v tomto oboru použít jako vodítka pro alterace, u nichž je vysoká pravděpodobnost konformační a antigenické neutrality; viz například (Berzofsky, Science 229 (1985), 932 až 940 a Bowie et al., Science 247 (1990), 1306 až 1310). Některá z důležitějších pravidel zahrnují;

1) nahrazení hydrofobních zbytků vyvolá s menší pravděpodobností změny antigenicity, poněvadž tyto zbytky budou pravděpodobně umístěny uvnitř proteinu, srovnej například Berzofsky (výše uvedená citace) a Bowie et al. (výše uvedená citace);

2) nahrazení určitých zbytků fyzikálné-chemicky podobnými, tj. synonymními zbytky, povede méně pravděpodobně ke konformačním změnám, poněvadž nahrazující aminokyselina může hrát stejnou strukturní roli, jako nahrazovaná aminokyselina;

3) alterace evolučně konzervovaných sekvencí bude mít pravděpodobně škodlivé konformační účinky, poněvadž evoluční konzervace ukazuje na pravděpodobnou funkční důležitost těchto sekvencí.

Kromě těchto základních pravidel pro volbu muteinových sekvencí jsou k dispozici zkoušky pro potvrzení biologické účinnosti a konformace navržených molekul. Biologické zkoušky vhodné pro látky podle vynálezu jsou úplněji popsány v příkladech. Změny konformace je možno zkoušet přinejmenším dvěma známými zkušebními postupy, tj. mikrokomplementovou fixační metodou, která je popsána například v (Wasserman et al., j. immunól. 87, 1961, 290 až 295 a Levine et al., Methods in Enzymology 11, 1967, 928 až 936) a které se v širokém rozsahu používá v evolučních studiích terciárních struktur proteinů; a metodou, při níž se využívá afinit souborů konformačně specifických monoklonálních protilátek, jak je to například popsáno v (Lewis et al., Biochemistry 22, 1983, 948 až 954).

Důležitý aspekt tohoto vynálezu tedy zahrnuje polypeptid, v němž je alespoň jeden aminokyselinový zbytek nahrazen jiným aminokyselinovým zbytkem a/nebo v němž je alespoň jeden aminokyselinový zbytek vypuštěn nebo přidán za vzniku polypeptidu vykazujícího aminokyselinovou sekvenci odlišnou od aminokyselinové sekvence nebo subsekvence této aminokyselinové sekvence definované dále, přičemž však tento polypeptid v podstatě vykazuje hIL-10 agonistickou účinnost definovanou výše.

Zajímavým aspektem tohoto vynálezu je polypeptid, který je analogem a/nebo který zahrnuje alespoň část polypeptidu podle vynálezu o celkové délce v rozmezí od 10 do 100 aminokyselin, například alespoň 12 aminokyselin, alespoň 15 aminokyselin, alespoň 20 aminokyselin nebo alespoň 30 aminokyselin.

V přednostním provedení tohoto vynálezu se látky nebo polypeptidu používá v podstatě v čisté formě. Proto je někdy nutno polypeptid podrobit purifikaci. Příklady postupů vhodných pro purifikaci polypeptidů jsou uvedeny dále: i) imunoprecipitace nebo afinitní chromatograf ie s protilátkami, ii) afinitní chromatografie s vhodným ligandem, iii) jiné chromatografické postupy, jako je gelová filtrace, ionexová chromatografie nebo vysoce účinná kapalinová chromatografie a postupy odvozené z výše uvedených postupů, iv) elektroforetické postupy, jako je elektroforéza na polyakrylamidovém gelu, denaturační elektroforéza na polyakrylamidovém gelu, elektroforéza na agárosovém gelu a isoelektrická fokusace a v) jiné specifické solubilizační a/nebo purifikační techniky.

Do rozsahu tohoto vynálezu spadá také nukleotidová sekvence kódující výše definovaný polypeptid, zejména nukleotidová sekvence kódující polypeptid mající nebo zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1, například nukleotidová sekvence .

GCC TAC ATG ACA ATG AAG ATA CGA AAC (SEQ ID NO: 23) nebo nukleotidová sekvence kódující polypeptid obsahující subsekvenci výše uvedené aminokyselinové sekvence.

Do rozsahu tohoto vynálezu spadá také modifikovaná nukleotidová sekvence, která se liší od výše uvedené nukleotidové sekvence tím, že obsahuje alespoň jednu deleci, substituci, modifikaci nebo inserci nukleotidu za vzniku nukleotidové sekvence kódující polypeptid vykazující hIL-10 agonistickou účinnost.

Termínu subsekvence se v tomto popisu a nárocích používá pro charakterizaci sekvence, která přednostně obsahuje alespoň 18 nukleotidů, s výhodou alespoň 21 nukleotidů a nejvýhodněji alespoň 24 nukleotidů. V řadě případů provedení tohoto vynálezu budou subsekvence nebo analogy nukleotidové sekvence podle vynálezu obsahovat přinejmenším 27 nukleotidů, jako například přinejmenším 30 nukleotidů nebo přinejmenším 45 nukleotidů. Polypeptid kódovaný takovou subsekvenci by měl vyhovovat alespoň jednomu z kritérií a) až g) uvedených výše a/nebo by měla taková subsekvence hybridizovat s nukleotidovou sekvencí zahrnující sekvenci SEQ ID ŇO: 23 za podmínek vysoké stringence.

Pod označením podmínky vysoké stringence, pokud se ho používá v souvislosti s hybridizačními podmínkami, se rozumí teplota o 5 až 10°C nižší, než je teplota tání T_m, srovnej Sambrook et al., 1989, str. 11.45 až 11.49.

Pod označením analog, pokud se ho používá v souvislosti s fragmenty DNA podle vynálezu, se rozumí nukleotidová sekvence kódující polypeptid, který je identický, nebo v podstatě identický s polypeptidem kódovaným DNA uvedenou výše. Je dobře známo, že stejné aminokyseliny mohou být kódovány různými kodony, přičemž použití určitého kodonu má mj. vztah k preferenci daného organismu exprimujícího takovou nukleotidovou sekvenci. Jeden nebo více nukleotidů nebo kodonů ve fragmentu DNA podle vynálezu může být tedy vyměněno za jiné nukleotidy nebo kodony, a přitom se při expresi získá polypeptid, který je identický nebo v podstatě identický s polypeptidem kódovaným fragmentem DNA popsaným výše.

Do rozsahu termínů analog a subsekvence spadají také variace sekvence, jako jsou substituce, inserce (včetně intronů) adice a přesmyk jednoho nebo více nukleotidů, kteréžto variace nemají podstatný nepříznivý účinek na hIL-10 agonistickou účinnost polypeptidu kódovaného fragmentem DNA nebo jeho subsekvencí. Vynález tedy také zahrnuje nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid se subsekvencí odpovídající aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO; 1.

Polypeptidy podle vynálezu je možno připravovat za použití rekombinantní DNA technologie. Jeden důležitý aspekt tohoto» vynálezu se týká expresního systému zahrnujícího nukleotidovou sekvenci podle vynálezu. Do rozsahu tohoto vynálezu tedy také spadá expresní systém zahrnující nukleotidovou sekvenci podle vynálezu, jako je například replikovatelný expresní vektor, který nese výše uvedenou nukleotidovou sekvenci a je schopen ji zprostředkovat.

Organismem, kterého se používá pro produkci polypeptidu podle vynálezu, může být vyšší organismus, například živočich, nebo nižší organismus, například mikroorga46 nismus, jako Escherichia coli, kvasinka, prvok nebo buňka získaná z mnohabuněčného organismu, jako houbová buňka, hmyzí buňka, rostlinná buňka, savčí buňka nebo buněčná linie nesoucí expresní systém definovaný výše.

Bez ohledu na typ použitého organismu se fragment DNA podle tohoto vynálezu zavádí do organismu buď přímo nebo prostřednictvím vhodného vektoru. Alternativně se mohou polypeptidy produkovat v savčích buněčných liniích tak, že se zavede fragment DNA nebo jeho analog nebo subsekvence podle vynálezu buď přímo nebo pomocí expresního vektoru. Polypeptidy podle vynálezu lze také produkovat chemickou syntézou, jak to bylo popsáno výše.

Předmětem vynálezu je dále také plasmidový vektor obsahující sekvenci DNA kódující polypeptid podle vynálezu nebo fúzovaný polypeptid definovaný výše. Podle jednoho obzvláště důležitého provedení může být fragment DNA nebo jeho analog nebo subsekvence podle vynálezu nebo fúzovaný DNA fragment podle vynálezu definovaný v tomto popisu nesen replikovatelným expresním vektorem, který je schopen replikace v hostitelském organismu nebo buněčné linii.

Tímto vektorem může být zejména plasmid, fág, kosmid, minichromosom nebo virus. V zajímavém provedení tohoto vynálezu může být tímto vektorem vektor, který je po zavedení do hostitelské buňky integrován do genomu hostitelské buňky.

Polypeptid produkovaný výše popsanými způsoby je možno podrobit posttranslačním nebo postsyntetickým modifikacím, k nimž dochází v důsledku tepelného zpracování, chemického zpracování (za použití formaldehydu, glutaraldehydu atd.) nebo enzymatického zpracování (za použití peptidas, proteinas a proteinmodifikačních enzymů). Je-li polypeptid produkován v hostitelském organismu, na rozdíl od svého přirozeného produkčního prostředí, může být různým způsobem zpracován. Tak například, pokud je polypeptid exprimován buňkou vyššího organismu, jako kvasinkovou buňkou nebo přednostně savčí buňkou, dochází u něho často ke glykosylaci. Ke glykosylaci obvykle dochází u takových aminokyselinových zbytků, jako je Asn, Ser, Thr nebo hydroxylysin.

Předmětem vynálezu je tedy také způsob přípravy polypeptidů definovaného výše, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje

a) inserci nukleotidové sekvence definované výše do expresního vektoru,

b) transformaci vhodného hostitelského organismu vektorem získaným podle a),

c) kultivaci hostitelského organismu získaného podle stupně b) za vhodných podmínek pro expresi polypeptidu,

d) sklizení polypeptidů, a

e) případné podrobení polypeptidů posttranslační modifikaci.

Předpokládá se, že antagonistického účinku vůči hIL-10 nebo vIL-10 by bylo možno roj. dosáhnout za použití protilátek, které se specificky vážou k nonapeptidu IT9302 a že těchto protilátek by bylo možno použít při léčení spočívajícím v neutralizaci vysoké koncentrace IL-10. Předmětem vynálezu je tedy také protilátka, která se specificky váze k polypeptidů podle tohoto vynálezu.

Pod označením protilátka se zde rozumí látka, produkovaná savcem, nebo přesněji buňkou savčího původu patřící k imunitnímu systému, v odpovědi na expozici polypeptidovému antigenu podle tohoto vynálezu. V tomto popisu a nárocích je protilátka definována jako látka, která se v podstatě skládá ze specificky se vázající základní jednotky zahrnující dva těžké řetězce a dva lehké řetězce. V nejširším pojetí však může protilátka zahrnovat také například dimer nebo pentamer základní jednotky.

Variantní doména protilátky se skládá z variabilních a konstantních sekvencí. Variantní část této domény se nazývá idiotyp protilátky. Tato část protilátky je zodpověd ná za interakci s antigenem, vazbu antigenu. V dané souvislosti se pod termínem protilátka rozumí celá molekula protilátky nebo jakýkoliv její fragment. Protilátku lze fragmentovat během produkce a/nebo po ní. Také ji lze připravit zpočátku ve fragmentární formě a v této formě ji také dále používat nebo lze před použitím jednotlivé fragmenty spojit. Obzvláště zajímavými fragmenty jsou vazebné fragmenty protilátek podle vynálezu, například fragment Fab nebo Fab’.

Idiotypická (antigen vázající) struktura protilátky je antigenní a může proto vyvolat vznik specifických protilátek orientovaných proti této idiotypické struktuře. Protilátky vypěstované proti tomuto idiotypu se označují názvem antiidiotypické protilátky. Takové protilátky napodobují strukturu původního antigenu, a proto mohou fungovat jako původní antigeny a mohou nahradit původní antigen v části nebo ve všech jeho funkcích, takže vykazují použitelnost a vlastnosti původního polypeptidu podle vynálezu.

Protilátky podle vynálezu zahrnují jak polyklonální, tak monoklonální protilátky.

Protilátka nebo její fragmenty mohou být monospecifického (polyklonálního druhu). Monospecifickou protilátku je možno připravit tak, že se vhodnému živočichu vstříkne v podstatě čistý přípravek na bázi poiypeptidu podle vynálezu. Po tomto podání je možno provést jedno nebo více přeočkování ve vhodných intervalech před prvním odběrem krve. Odběr krve se provádí asi 5 až 7 dnů po každém očkování. Protilátky je popřípadě možno izolovat ze séra za použití standardních purifikačních postupů.

Zvířata používaná pro přípravu protilátek vázajících se k poiypeptidu podle vynálezu se přednostně volí ze souboru zahrnujícího králíky, opice, ovce, kozy, myši, krysy, vepře, koně a morčata. Buňkami produkujícími protilátky mohou být slezinné buňky nebo lymfocyty periferní krve.

i

Monoklonální protilátku nebo její fragmenty je možno vypěstovat proti podstatné složce poiypeptidu, tj.

proti epitopu. Monoklonální protilátky je možno připravovat konvenčními technologiemi (Kóhler a Milstein, 1975) za Y.^v>

použití hybridomální buněčné linie nebo jejích klonů nebo subklonů nebo za použití buněk nesoucích genetickou informaci z hybridomální buněčné linie produkující tuto monoklonální protilátku. Monoklonální protilátku je možno připravovat fúzí buněk produkujících tuto monoklonální protilátku s buňkami vhodné buněčné linie a klonoválním výsledných hybridomálních buněk produkujících tuto monoklonální protilátku. Alternativně lze monoklonální protilátku produkovat immortalizací nefúzované buněčně linie produkující tuto monoklonální protilátku. Nakonec se monoklonální protilátky slidí z růstového média pro buňky. Hybridomální buňky použité pro přípravu monoklonální protilátky je možno pěstovat in vitro nebo v tělesné dutině živočicha. Monoklonální protilátku nebo její fragmenty je také možno připravit rekombinantními DNA technologiemi (Huse et al._r1989).

Monoklonální protilátky je také možno připravit očkováním vhodných živočichů nepurifikovaným polypeptidovým přípravkem podle vynálezu. Výsledné hybridomální klony sekretující monoklonální protilátky je třeba podrobit screeningu na jejich schopnost vazby k polypeptidú, polypeptidům nebo jejich analogům.

Pro účely, při nichž se nevyžaduje vysoká specificita, může být protilátkou polyklonální protilátka. Polyklonální protilátky je možno získat například způsobem popsaným v Harboe a Ingild výše. Konkrétněji, pokud se mají .získat polyklonální protilátky, podá se polypeptid podle vynálezu nebo jeho analog, přednostně po přidání vhodného adjuvans, jako Freundova neúplného nebo úplného adjuvans, injekční cestou živočichovi. Krev se živočichům odebírá pravidelně, například v týdenních intervalech. Ze získané krve.se oddělí sérová frakce obsahující protilátku, a ta se popřípadě podrobí dalším konvenčním postupům purifikace protilátky a/nebo postupům za použití purifikovaného polypeptidu nebo jeho analogu.

Protilátkou může také být anti-anti-idiotýpická protilátka, zaměřená proti anti-idiotypické protilátce, jež je protilátkou zaměřenou proti místu protilátky, které je reaktivní s epitopem na antigenu. Antiidiotypickou protilátku je možno připravovat podobným způsobem, jaký byl popsán výše v souvislosti s přípravou monoklonální nebo polyklonální protilátky.

Do rozsahu tohoto vynálezu spadá protilátka, která se váže k látce nebo k polypeptidú definovanému výše, zejména protilátka, která se specificky váže k polypeptidú vykazujícímu aminokyselinovou sekvenci Ala-Tyr-Met-Thr-MetLys-Ile-Arg-Asn (SEQ ID NO: 1)

Podle nejširšího aspektu je tedy předmětem vynálezu látka, která je schopna neutralizovat jednu nebo více hIL-10 účinností a) až j), tj. látka vykazující hIL-10 antagonistickou účinnost, jako například protilátka s těmito vlastnostmi. Monoklonální protilátka 19F1 (Rene de Waal Malefyt, John Abrahams, Bruče Bennet, Carl G. Figdor and Jan

E. de Vries (1991J _,_Xnter2ejakin_10_(-IIcJl.OL)_Inh.ihits_-Cytokine. Synthesis by Human Monocytes: An Autoregulatory Role of IL-10 Produces by Monocytes, J. Exp. Med. 174, 1209 až 1220), která je schopna se specificky vázat k IL-10 je známa a tato protilátka může blokovat endogenní IL-10 produkovaný monocyty stimulovanými LPS, viz tabulka 1 (Rene de Waal Malefyt, John Abrahams, Bruče Bennet, Carl G. Figdor and Jan E. de Vries (1991), Interleukin 10 (IL-10) Inhibits Cytokine Synthesis by Human Monocytes: An Autoregulatory Role of IL-10 Produces by Monocytes, J. Exp. Med. 174, 1209 až 1220). Tato protilátka rozpoznává IL-10 s nativními záhyby, ale nutně nemusí rozpoznat celou funkční doménu. Specifickou vazbu k IT9302 však tato protilátka nevykazuje.

Do rozsahu tohoto vynálezu také spadá farmaceutický prostředek obsahující takovou látku, stejně tak jako farmaceutický prostředek obsahující látku nebo polypeptid podle vynálezu.

Velmi důležitým aspektem tohoto vynálezu je farmaceutický prostředek obsahující látku vykazující hIL-10 agonistickou účinnost nebo hIL-10 antagonistickou účinnost definovanou výše a farmaceuticky vhodný excipient. Prostředek podle vynálezu může obsahovat například purifikovaný syntetizovaný protein nebo purifikovaný rekombinantní polypeptid, monoklonální nebo polyklonální protilátku nebo jakoukoliv jinou látku splňující kritéria a) až j). Pokud se jedná o látku s hIL-10 antagonistickou účinností, měla by být tato látka schopna neutralizovat jednu nebo více účinností a) až

j) hIL-10.

IL-10 agonisty nebo antagonisty podle vynálezu je možno zpracovávat na farmaceutické prostředky za použití farmaceuticky vhodných médií, jako je například roztok chloridu sodného, roztok chloridu sodného pufrovaný fosforečnanem (PBS), Ringerův roztok, roztok dextrosy a chloridu sodného, Hankův roztok a glukosa. Tyto prostředky mohou obsahovat farmaceuticky vhodné pomocné látky podle potřeby, za účelem přizpůsobení fyziologickým podmínkám. Jedná se například o látky, jako jsou pufrovací činidla, činidla pro nastavení tonicity, smáčedla, detergenty apod. Přísady mohou též zahrnovat přídavné účinné složky, například baktericidní činidla nebo stabilizátory. Množství farmaceutického prostředku podávané pacientovi bude záviset na druhu prostředku, účelu jeho podávání (profylaxe nebo terapie), stavu pacienta, způsobu podávání apod.

Vhodné farmaceutické prostředky budou obvykle určeny pro transdermální nebo parenterální podávání, například intravenosní, subkutánní nebo intramuskulární podávání. Vhodné jsou též formy pro orální podávání, které je možno modifikovat tak, aby obešly prostředí žaludku. Prostředků podle vynálezu se může používat pro profylaktické a/nebo .t_erapeutigké_; ošetření. Přednostní cesta podávání farmaceutických prostředků podle vynálezu je intravenosní podávání. Ve výhodném provedení farmaceutického prostředku podle vynálezu obsahuje takový prostředek IL-10 agonistickou nebo antagonistickou látku rozpuštěnou nebo suspendovanou ve vhodném nosiči, přednostně vodném nosiči. Takové prostředky mohou být sterilizovány konvenčními ste53 rilizačními technologiemi nebo mohou být sterilizovány filtrací.

Výsledné vodné roztoky je možno balit pro aplikaci v tom stavu v jakém se vyrobí, nebo je možno je lyofilizovat. Lyofilizované přípravky jsou určeny pro rekonstituci před podáváním přídavkem sterilního vodného nosiče. IL-10 agonisty nebo antagonisty je také možno podávat s druhým biologicky účinným činidlem, jako například standardním chemo terapeutickým____činidlem._Jako neomezující__příklady:

vhodných látek je možno uvést vinkristin, daunorubicin, L-asparaginasu, mitoxantron a amsakrin.

Při terapeutických aplikacích se farmaceutické prostředky podle vynálezu podávají pacientovi v množství postačujícím pro dosažení požadovaného účinku. Toto množství se označuje termínem terapeuticky účinná dávka. Terapeuticky účinná dávka IL-10 agonisty nebo antagonisty bude kolísat například v závislosti na konkrétním léčebném, použití způsobu podávání, zdravotním stavu pacienta a úsudku ošetřujícího lékaře. Tak například v případě kontinuální infuse bude vhodná denní dávka v rozmezí od asi 500 ng do asi 800 ug, vztaženo na 70kg pacienta. Přednostně bude tato dávka ležet v rozmezí od asi 10 μ9 do asi 300 μ9· Zpravidla bude tato dávka ležet v rozmezí od 700 ng/kg/den do 16 μg/kg/den.

Koncentrace IL-10 agonisty nebo antagonisty ve farmaceutickém prostředku podle vynálezu se může měnit v širokém rozmezí, t j. od asi 10 μg/ml do asi 5 mg/ml, přednostně od asi 100 μg/ml do asi 2 mg/ml. Koncentrace bude obvykle určována především v závislosti na objemu tekutiny, její viskositě a konkrétním druhu zvoleného podávání. Typický farmaceutický prostředek určený pro intravenosní infusi může obsahovat 250 ml roztoku dextrosy a chloridu sodného a 2,5 mg agonisty nebo antagonisty IL-10 podle vynálezu.

V případě pevných farmaceutických prostředků se muže používat konvenčních netoxických pevných nosičů, které například zahrnují mannitol, laktosu, škrob, stearan hořečnatý, sodnou sůl sacharinu, mastek, celulosu, glukosu, sacharosu, uhličitan hořečnatý apod. Vždy se jedná o látky ve farmaceuticky vhodné čistotě. Farmaceutické prostředky pro orální podávání se vyrábějí smísením vhodných excipientů, například nosičů uvedených výše s účinnou přísadou, tj. agonistou nebo antagonistou IL-10, který je v takovém prostředku přítomen v množství v rozmezí od 10 do 95, s výhodou od 25 do 75 % hmotnostních.

V případě podávání ve formě aerosolu se IL-10 agonistická nebo antagonistická látka přednostně zpracovává na jemně rozdělenou formu spolu s povrchově aktivní látkou a hnacím plynem. Typický obsah IL-10 agonisty nebo antagonisty v aerosolovém prostředku leží v rozmezí od 0,01 do 20, přednostně od 1 do 10 % hmotnstních. Povrchově aktivní látka musí být samozřejmě netoxická a přednostně se jedná o látku rozpustnou v hnacím plynu. Jako reprezentativní příklady takových činidel je možno uvést estery nebo parciální estery mastných kyselin obsahujících 6 až 22 atomů uhlíku, jako je kyselina kapronová, kyselina oktanová, kyselina laurová, kyselina palmitová, kyselina stearová, kyselina linoleová, kyselina linolenová, kyselina olesterová a kyselina olejová, s alifatickými vícemocnými alkoholy nebo jejich cyklickými anhydridy, jako je například ethylenglykol, glycerol, erythritol, arbitol, mannitol, sorbitol a anhydridy hexitolu odvozené od sorbitolu, jakož i polyoxyethylenované a polyoxypropylenované deriváty takových esterů. Také se může použít směsných esterů, jako například směsných nebo přírodních glyceridů.

Povrchově aktivní látka může tvořit 0,1 až 20 % hmotnostních, přednostně 0,25 až 5 % hmotnostních takového prostředku. Zbytek prostředku tvoří běžný hnací plyn (propelent). Jako propelentů se obvykle používá látek, které jsou za podmínek okolí plynné a které jsou tlakem zkapalněny. Z vhodných zkapalněných hnacích plynů je možno uvést nižší alkany obsahující do 5 atomů uhlíku, jako je butan a propan a přednostně fluorované nebo fluorchlorované alkany. Také se může použít směsí výše uvedených plynů. Při výrobě aerosolu se zásobník vybavený vhodným ventilem naplní příslušným propelentem obsahujícím jemně rozdělený polypeptid (nebo polypeptidy) a povrchové aktivní látku. Složky jsou tedy udržovány při zvýšeném tlaku až do uvolnění tlaku spuštěním ventilu.

U IL-10 agonistů nebo antagonistu podle vynálezu je možno zvýšit poločas životnosti v séru zapouzdřením, zavedením do průsvitu liposomů, zpracováním na koloid nebo jinými konvenčními technologiemi zajišťujícími prodloužení životnosti polypeptidů. Podle určitého specifického provedení je tedy možno IL-10 agonisty nebo antagonisty zapouzdřit v liposomů. Pro výrobu liposomů je k dispozici celá řada metod, které jsou například popsány v dále uvedených citacích (Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9, 1980, 467; US patent č. 4 235 871; US patent č. 4 501 728; a US patent č. 4 837 028).

Jedním důležitým aspektem tohoto vynálezu je použití látky pro snížení nebo neutralizaci vysoké koncentrace hIL-10 a/nebo vIL-10, jako například použití látky vykazující hIL-10 antagonistické vlastnosti pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení nebo profylaxi rakoviny vaječníků a/nebo AIDS (Walter H. Gotlieb, John S. Abrams, Joanna M. Watson, Thierry J. Velu, Jonathan S. Berek, Otoniel Martinez-Meza (1992), Presence of interleukin 10 (IL-10) in the ascites of patients with ovarian and other intra-abdominal cancers, Cytokine 4, č. 5, 385 až 390) Clerici Μ., Shearer G. Μ., 1993, Immunology Today 14: 107 až 111).

spočívá v vyžaduj e,

Do rozsahu vynálezu spadá také způsob léčení a/nebo prevence rakoviny vaječníků a/nebo AIDS, který tom, že se pacientovi, který takové léčení podá terapeuticky nebo profylakticky účinné množství hIL-10 antagonistické látky. Do rozsahu vynálezu spadá i použití sloučeniny vykazující hIL-10 antagonistickou účinnost pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení nebo profylaxi rakoviny vaječníků a/nebo AIDS.

Použití látky podle vynálezu

Jak již bylo uvedeno výše, v souvislosti s vynálezem se zjistilo, že látka IT9302 a její analogy a varianty jsou užitečné pro prevenci účinků cytokinů, o nichž je známo, že se patogeneticky podílejí na výše uvedených patologických stavech.

Proto je u polypeptidu podle vynálezu nebo jeho analogů nebo derivátů předpokládán potenciál pro léčení výše uvedených chorob. Tento potenciál by měl být prozkoumán v souvislosti se všemi chorobami, kde lze očekávat terapeutický účinek hIL-10 a/nebo IRAP (viz tabulka 3 uvedená výše).

Velmi “ důležitými ~aspekty tohoto vynálezu jsou použití látky nebo polypeptidu podle vynálezu pro léčení nebo profylaxi jedné nebo více chorob uvedených v tabulce 3, použití látky nebo polypeptidu podle vynálezu pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení nebo profylaxi jedné nebo více chorob uvedených v tabulce 3, jakož i způsob léčení a/nebo prevence jedné nebo více chorob uvedených v tabulce 3, kterýžto způsob zahrnuje podávání terapeuticky nebo profylakticky účinného množství látky nebo polypeptidů podle vynálezu pacientovi, který takové léčení potřebuje.

Jedním důležitým aspektem tohoto vynálezu je tedy použití látky IT9302 nebo jejího funkčního derivátu pro výrobu farmaceutického prostředku pro v podstatě úplnou inhibici biologického účinku cytokinu, jako je lymfokin, interleukin, monokin, chemokin, interferon, faktor stimulující kolonie, prostaglandin a/nebo leukotrien, v těle člověka; pro profylaxi nebo léčení stavu spojeného s narušením systému cytokinu, jako je lymfokin, interleukin, monokin, chemokin, interferon, faktor stimulující kolonie a/nebo s narušením systému prostaglandinu a/nebo leukotrienu. Pod označením farmaceutický prostředek se rozumí jakákoliv směs vhodná pro humánní aplikaci. Podrobnosti vztahující se k farmaceutickým prostředkům jsou uvedeny výše.

Předmětem vynálezu je zejména použití IT9302 nebo jeho funkčního derivátu u člověka pro v podstatě úplnou inhibici biologického účinku majícího vztah k cytokinu za účelem profylaxe nebo léčení stavu majícího vztah k narušení systému cytokinu; a/nebo

- pro v podstatě úplnou inhibici biologického účinku majícího vztah k lymfokínu za účelem profylaxe nebo léčení stavu majícíhp vztah k narušení systému lymfokínu; a/nebo pro v podstatě úplnou inhibici biologického účinku majícího vztah, k interleukinu za účelem profylaxe nebo léčení stavu majícího vztah k narušení systému interleukinu; a/nebo

- pro v podstatě úplnou inhibici biologického účinku majícího vztah k monokinu za účelem profylaxe nebo léčení stavu majícího vztah k narušení systému monokinu; a/nebo

- pro v podstatě úplnou inhibici biologického účinku majícího vztah k chemokinu za účelem profylaxe nebo léčení stavu majícího vztah k narušení systému chemokinu; a/nebo

- pro v podstatě úplnou inhibici biologického účinku majícího vztah k lymfokinu za účelem profylaxe nebo léčení stavu majícího vztah k narušení systému lymfokinu; a/nebo pro v podstatě úplnou inhibici biologického účinku majícího vztah k interferonu za účelem profylaxe nebo léčení stavu majícího vztah k narušení systému interferonu; a/nebo

- pro v podstatě úplnou inhibici biologického účinku majícího vztah k faktoru stimulujícímu kolonie za účelem profylaxe nebo léčení stavu majícího vztah k narušení systému faktoru stimuluj icimu koluiiiei a/nebo

- pro v podstatě úplnou inhibici biologického účinku majícího vztah kprostáglándihú^ža účelem profylaxe nebo léčeni stavu majícího vztah k narušení systému prostaglandinu; a/nebo

- pro v podstatě úplnou inhibici biologického účinku majícího vztah k leukotrienu za účelem profylaxe nebo léčení stavu majícího vztah k narušení systému leukotrienu.

Přehled obr. na výkresech

Na obr. 1 je ukázáno porovnání předpovězených aminokyselinových sekvencí mIL-10, hIL-10 a BCRFI. Totožnosti v aminokyselinových sekvencích jsou označeny vertikálními čarami.

Na obr. 2 jsou znázorněna COOH-terminální póly-___ peptidová sekvence IL-10 zahrnující 9 aminokyselin ve srovnání s proteinem vepře, člověka, BCRFI a myši. Aminokyseliny označené hvězdičkou představují klíčové polohy pro vazbu k receptoru a jsou evolučně dobře konzervovány ' (srovnej s aminokyselinovou sekvencí IL-10 myši, která je zde také uvedena). Aminokyselinová sekvence IL-10 myši postrádá homologii, pokud se týče důležitých aminokyselin.

Na obr. 3 je znázorněn diagram, z něhož je zřejmé, že IT9302 inhibuje spontánní produkci IL-8 purifikovanými kultivovanými humánními monocyty. Plný trojúhelníček označuje hladinu IL-8 za použití rhIL-10 (100 ng/ml).

Na obr. 4 je znázorněn diagram ukazující, že IT9302 inhibuje produkci IL-8 indukovanou IL-1 (1 ng/ml) v mononukleárních buňkách humánní periferní krve.

Na obr. 5 je ilustrována produkce IRAP humánními monocyty stimulovanými IT9302.

Na obr. 6 je ilustrována produkce IRAP humánními monocyty stimulovanými IL-10.

Na obr. 7 je ilustrována chemotaktická účinnost IT9302 na T-buňky CD8+.

Na obr. 8 je ilustrována desensitizace T buněk CD8+ pomocí IT9302 projevující se v neresponsivitě T-buněk CD8+ vůči chemotaxi indukované IL-10 (10 ng/ml).

Na obr. 9 je ilustrováno potlačení účinnosti IL-8 pomocí IT9302, tj. účinek IT9302 na chemotaxi zprostředkovanou IL-8 (10 ng/ml).

Na obr. 10 je znázorněn diagram ukazující, že IT9302 inhibuje chemotaxi monocytů indukovanou MCAF/MCP-1.

Obr. 11 ukazuje produkci IL-4 v cytosolické frakci T-bunék CD4+ za použití metody ECL-Western Blotting. Při této metodě se používá kozí antihumánní IL-4 protilátky. Čísla 1, 2, 3, 4, 5 a 6 pod diagramem odpovídají třídenní stimulaci za použití následujících látek:

1. kontroní pokus

2. mon.anti-IL-8 protilátka WS.4 (10 μg/ml)

3. rIL-8 (100 ng/ml)

4. rIL-10 (100 ng/ml)

5. IT9302 (10 ng/ml)

6. rIFN gamma 10 ng/ml).

Obr. 12 ukazuje produkci TNF-alfa v cytosolické frakci humánní smíšené lymfocytové kultury za použití metody ECL-Western Blotting. Western Blotting v případě TNF-alfa se provádí způsobem popsaným v části Materiály a metody stati vztahující se k IL-4, ale za použití králičí antihumánní TNF-alfa protilátky (Pepro Tech. Inc., Londýn, Velká Británie) a křenovou peroxidasou značené sekundární protilátky (katalogové číslo P 217, Dako, Dánsko). Čísla 1 a 2 pod diagramem odpovídají dvacetičtyřhodinové stimulaci za použití následujících látek:

1. kontrolní pokus

2. IT9302 (10 ng/ml)

Obr. 13 ukazuje, že LPS indukovaný šok a leukopenie jsou modulovány IT9302, což je zřejmé z celkového počtu leukocytů. Je zde tedy ilustrován účinek IT9302 na septickou” leukocytopenii indukovanou LPS. IT9302 se injekčně podá 30 minut před injekcí LPS.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Materiály a metody

Cytokiny a chemoatraktanty

Rekombinantní hIL-10 byl získán od firmy Pepro Tech lne. NJ., USA (katalogové číslo 200 10). Rekombinantí hIL-1 beta a rekombinantní hIL-8 byly získány jako laskavý dar od firmy Dainippon Pharmaceutical Company, Osaka, Japonsko. Jako kultivačního média bylo použito RPMI 1640 GIBCO. Toto médium neobsahovalo LPS podle stanovení Limulus Amoebocyte, Lysáte (Sigma E-TOXATE Kit, katalogové číslo 210-A1). rhMCAF/MCP-1 byl získán jako laskavý dar od prof. Kouji Matsushimy, Kanazawa, Japonsko.

Stanovení chemotaxe leukocytů

Chemotaxe T-buhek

Podsoubory T-lymfocytů CD4+ a CD8+ charakteristické expresí bud antigenu CD4 nebo antigenu CD8 byly purifikovány z heparinizované krve normálních donorů. Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) byly tedy purifikovány z heparinizované krve tak, že 100 ml krve bylo zředěno

Hankovým vyváženým solným roztokem (HBSS) v poměru 1 s 1,· načež byla provedena separace usazením buněk za použití Lymphopac(^R) (Nycomed Pharma, Oslo, Norsko) a následnou gradientní centrifugací při frekvenci otáčení 2 000 min^-1 po dobu 24 minut. Mononukleární buňky byly třikrát promyty v HBSS a buněčná peleta byla zředěna 4 ml HBSS s obsahem 1 % fetálního telecího séra a rozdružena při 4’C za použití perel Dynabeads potažených monoklonální protilátkou vůči antigenu CD4 nebo CD8 (Dynabeads M-450 CD4, katalogové číslo

111.16; Dynabeads M-450 CD8, katalogové číslo 111.08, DETACHaBEAD, katalogové číslo 125.04). Poměr perel k buňkám byl 10 : 1 a inkubace trvala 1 hodinu. Perly byly odděleny přídavkem polyklonální antimyší protilátky podle instrukcí výrobce.

Chemotaktická zkouška byla provedena mikrokomorovou technikou (48 jamek) (Neuroprobe, Rockville, MD, USA) dříve popsaným způsobem (Larsen C. G., Anderson A. 0., Apella E., Oppenheim J. J., Matsushima K., 1989, Science 243: 1464 a Larsen C. G. Leukocyte activating and chemotactic cytokines in cell-mediated immune reactions of the human skin; Acta Dermatovenerol. 1991, suppl. 160: 1 až 48 a Jinquan Τ., Larsen C. G., Gesser B., Matsushima K., Thestrup-Pedersen K., 1993, Human IL-10 is a chemoattractant for CD8+ T lymphocytes and an inhibitor of IL-8-induced CD4+ T lymphocyte Migration, Journal of Immunogy 151: 4545 až 4551). Chemoatraktant byl zředěn pomocí RPMI 1640 (GIBCO), katalogové číslo 61870-010) s 1 % fetálního telecího séra sterilizovaného filtrací a výsledná směs byla umístěna do spodní 25μ1 komory.

V případě stanovení chemotaxe T-buněk byly T-buňky (5 χ 10⁶ ml) suspendovány v médiu a 50 μΐ suspenze bylo umístěno do horní komory oddělené od spodní komory polykarbonátovým filtrem s velikostí pórů 5 μιη, který neobsa63 hoval polyvinylpyrrolidon (Nucleopore Corp., Pleasanton, CA, USA) potaženým kolagenem typu IV (Sigma, katalogové číslo C 0543). Buňky byly ponechány migrovat 2 hodiny při 37C a pod atmosférou obsahující 5 % oxidu uhličitého. Poté byly filtry pečlivě vyjmuty, fixovány v 70% methanolu a 5 minut barveny modří Coomassie’s Brilliant Blue. Buňky připojené ke spodnímu povrchu filtru byly spočítány změřením jejich plochy za použití videokamery mikroskopu připojeného k počítačovému systému pro digitální analýzu podporovaného software pro objektivní stanoveni chemotaktické migrace.

Přibližně 5 % T- buněk spontánně migruje, což odpovídá 12 000 až 13 000 buňkám. Tento údaj se může měnit den ze dne, ale velmi málo se mění při experimentech prováděných týž den. Jak již bylo uvedeno dříve (Gazzinelli R. T., Oswald I.

P., James S. killing and macrophages, Larsen C. G.,

L., Sher A., 1992, IL-10 inhibits parasite nitric oxide production by IFN-\-activated J. Immunol. 148: 1792 až 1796 a Jinquan T., Gesser B., Matsushima K., Thestrup-Pedersen

K., 1993, Human IL-10 is a chemoattractant for CD8+ T lymphocytes and an inhibitor of IL-8-induced CD4+ T lymphocyte Migration, Journal of Immunogy 151: 4545 až 4551), výsledky byly vyjádřeny jako poměr mezi počtem buněk migrujících ve vzorku a v kontrolním vzorku, což reflektuje spontánní migraci. Tento poměr se označuje termínem chemotaktický index (Cl). Všechny vzorky byly analyzovány celkem 3 x a migrace buněk v každé jamce byla měřena ve třech polích před tím, než byla stanovena mediánová hodnota plochy. Při některých pokusech nebyla chemotaktická membrána potažena kolagenem, a v tomto případě spadne systém migrujících buněk na dno spodní jamky chemotaktické komory.

Při jednom experimentu bylo měření chemotaktické účinnosti prováděno zkoušením za použiti - sériových zředěné látky IT9302 přidané do spodní komory. Hodnocení chemotaxe bylo prováděno výše popsaným způsobem.

Při druhém pokusu byla studována schopnost IT9302 desensitizovat migraci T-buněk CD8+ v odpovědi na rhIL-10 (10 ng/ml). Přitom byla látka IT9302 přidána k terčovým buňkám 30 minut před chemotaxí. Látka IT9302 byla přidávána v sériově zředěné koncentraci a chemotaktická odpověď rhIL-10 byla hodnocena výše popsaným způsobem.

Při třetím pokusu byla studována schopnost látky IT9302 potlačovat chemotaktickou odpověď T-buněk CD4+ vzhledem k rhIL-8 (10 ng/ml). Látka IT9302 byla přidávána k terčovým buňkám 30 minut před prováděním chemotaxe. Látka IT9302 byla použita v sériově zředěných koncentracích a chemotaktická odpověď rhIL-8 byla hodnocena výše popsaným způsobem.

Chemotaxe monocytů

Chemotaxe monocytů byla měřena za použití stejného zařízení s Boydenovými komorami, jaké bylo popsáno v souvislosti se zkoušením za použití T-buněk (viz výše). Chemoatraktant MCAF/MCP-1 byl zředěn v médiu RPMI 1640 s 0,5 % hovězího sérového albuminu a zředěná směs byla přidána do spodní komory při koncentraci 10 ng/ml. Monocyty purifikované standardní technikou adherence k plastu z normálních humánních PBMC získaných výše uvedeným způsobem byly suspendovány v médiu RPMI 1640 s 0,5 % BSA a potom 30 minut inkubovány za přítomnosti různých koncentrací IT9302. Potom byly buňky přidány do horní chemotaktické komory při koncentraci Ϊ0⁶ buněk/mí. Horní komora je oddělena od spodní komory polykarbonátóvým“f iltřěm š vélikostí pórů 8 um, “který neobsahuje polyvinylpyrrolidon (Nucleopore Corp., Pleasanton, CA, USA). Komora byla inkubována 90 minut při 37*C. Membrány obsahující migrující buňky byly zpracovány výše popsaným způsobem a také byl výše uvedeným způsobem vypočítán chemotaktický index.

Produkce IL-8 mononukleárními buňkami normální humánní periferní krve (PBMC)

Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) byly purifikovány z heparinizované krve normálních humánních donorů. Po gradientní centrifugaci za použití Lymphoprep(^R) (Nycomed Pharma, Oslo, Norsko) byly mononukleární buňky zředěny na koncentraci 2 χ 10⁶ buněk/ml médiem RPMI 1640 bez LPS (GIBCO, katalogové číslo 6187-010) s obsahem 1 % filtrací sterilizovaného tepelně inaktivovaného fetálniho telecíhoséra, penicilinu (10 000 IE/ml), streptomycinu (10 mg/ml) a gentamycinu (2,5 mg/ml). Buňky byly kultivovány ve 24jamko- vé misce Nunc Micro Plates (Nunc, Dánsko) za přítomnosti různých koncentrací IT9302 (0, 1 μς, 100 ng, 10 ng, 1 ng, 0,1 ng a 0,01 ng/ml) po dobu 24 hodin). Po 24 hodinové inkubaci byla ještě jednou přidána další dávka IT9302 a za další hodinu byl ke každé buněčné kultuře přidán rhIL-lbeta (1 ng/ml). Supernatanty byly odděleny po 48 hodinách inkubace a koncentrace vyloučeného IL-8 byla změřena zkouškou IL-8 ELISA za použití soupravy IL-8 ELISA Kit (Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd. Osaka, Japonsko). Standardy a buněčné supernatanty byly inkubovány po dobu 1 hodiny (vždy 2 provedení) při 20’C ve třepačce pro mikromisky. Jednu hodinu pro promyti byla přidána druhá protilátka a po další jednohodinové inkubaci byl přidán peroxidasou značený kozí protikráličí IgG. Misky byly promyty a pomocí o-fenylendiaminu bylo provedeno vyvíjení reakce. Po dalších 30 minutách byla reakce zastavena 1,6N kyselinou sírovou. Optická densita (OD) byla změřena ve čtecím zařízení ELISA při 490 nm. Koncentrace IL-8 byla vypočtena z kalibrační křivky absorbance neznámého vzorku proti koncentraci IL-8 standardů.

Stanovení koncentrace IRAP

PBMC byly purifikovány výše uvedeným způsobem a poté kultivovány v RPMI 1640 s obsahem 10 % sterilizovaného tepelně inaktivovaného fetálního telecího, séra/ penicilinu (10 000 IE/ml), streptomycinu (10 mg/ml) a gentamycinu (2,5 mg/ml). Koncentrace buněk byla 5 x 10⁶buněk/ml. Monocyty byly purifikovány standardní metodou adherence k plastu a potom kultivovány v médiu RPMI 1640 s přísadou 2 % fetálního telecího séra (2,5 x 10⁶ buněk/ml) a s rhIL-10 nebo IT9302 v různém zředění. Buňky byly stimulovány po dobu 24 hodin a supernatanty byly odděleny pro stanovení IRAP. Toto stanovení bylo provedeno pomocí testu ELISA za použití soupravy Human IL-lra Quantikin Immunoassay Kit (R&D Systems Éurope Ltd. , katalogové číslo DRA 00, Abingdon, Oxon, Velká Británie).

Stanovení exprese antigenů MHC z třídy II v monocytech

PBMC byly purifikovány výše uvedeným způsobem. Monocyty byly izolovány standardní metodou adherence k plastu a potom kultivovány v médiu RPMI 1640 s přísadou 2 % fetálního telecího séra, penicilinu (10 000 IE/ml), streptomycinu (10 mg/ml) a gentamycinu (2,5 mg/ml). Koncentrace byla 3 x 10⁶ buněk/ml. Buňky byly stimulovány 40 hodin v mikrojamkách (Nunc, Dánsko), za použití 100 ng/ml rhIL-10 nebo za použití IT9302 při koncentraci 1 pg/ml, 100 ng/ml nebo 10 ng/ml. Na konci stimulace byly odstraněny šupeřnátántý a buňky byly odděleny od plastu 20minutovým zmrazením při- -20 *Cr*·Buňky byly shromážděny v 1 ml chladného HBSS s přísadou 1 % fetálního telecího séra a rozdruženy při 20’C za použití perel Dynabead M 450 (50 μΐ/ml) potažených monoklonální protilátkou pro beta-řetězec HLA z třídy II (katalogové číslo 210.03). Po 20 minutách inkubace byly buňky 3 x promyty chladným HBSS s přísadou 1 % fetálního te67 lecího séra a shromážděny v magnetickém separačním zařízení.

Buňky byly zředěny výše uvedeným pufrem a obarveny methylenovou modří a byly spočítány rosetující buňky (buňky nesoucí perly Dynabeads s monoklonální protilátkou (mAb) hLA z třídy II).

Stanovení produkce IL-4 v T-lymfocytech CD4+

Buněčné kultury

T-lymfocyty CD4+ byly purifikovány z heparinizované krve normálních donorú. Mononukleární buňky byly podrobeny gradientní centrifugací za použití Lymphoprep(^R) (Nycomed Pharma, Oslo, Norsko) a potom byly rozdruženy při 4’C za použití perel Dynabeads (Dynal AS Norsko) potažených monoklonální anti-CD4 protilátkou. Perly byly odděleny přídavkem polyklonální protimyší protilátky (Dynal AS Norsko). Čistota pozitivně selektovaných buněk byla podle analýzy FACS vyšší než 99 %. Nová produkce IL-4 v IL-8-stimulovaných T-buňkách byla zkoušena kultivací těchto T-buněk (5 x 10⁶/ml) v médiu RPMI 1640 bez LPS (GIBCO, katalogové číslo 61870-010) s obsahem 1 % filtrací sterilizovaného tepelně inaktivovaného fetálního telecího séra, penicilinu (10 000 IU/ml), strepto- mycinu (10 mg/ml) a gentamycinu (2,5 mg/ml). T-buňky byly stimulovány 3 dny za použití rIL-8 (100 ng/ml), rIL-10 (100 ng/ml), IT9302 (10 ng/ml) a IFN-gamma (10 ng/ml). Rekombi- nantní humánní IL-8 (rhIL-8) byl získán jako laskavý dar od firmy Dainippon Pharmaceuticals Co. Ltd. Osaka, Japonsko a IFN-gamma byl zakoupen od firmy Boehringer Ingelheim am Rhein, Německo. Pro specifickou inhibici IL-8 stimulace bylo použito neutralizační monoklonální anti-IL-8 protilátky (WS.4) (laskavý dar od Dr. K. Matsushimy, Japonsko). Rekombinantní IL-10 byl zakoupen od firmy Pepro Tech. Inc., Londýn, Velká Británie.

Příprava buněčného materiálu a supernatantu kultury pro gelovou elektroforézu

Kultivované T-buňky a kultivační média byly odděleny centrifugací po dobu 5 minut při frekvenci otáčení 2000 min”¹. Supernatanty byly lyofilizovány a potom rozpuštěny ve 100 μΐ lysačního pufru. Buňky byly přímo resuspendovány ve 100 μΐ gelového lysačního pufru (Hannum C. H., Wilcox C.J., Arend W. P. et al., 1990, Interleukin-1 receptor antagonist activity of a human interleukin-1 inhibitor; Nátuře 343: 336 až 340). Vzniklá látka byla až do zkoušení uchovávána při -80C.

Zkoušení proteinů z T-buněk CD4+ pomocí metody ECL-Western Blotting

Pro stanovení obsahu IL-4 proteinu bylo použito buněk nebo lyofilizovaných supeřnatantů z buněčných kultur. Proteiny z jednorozměrných gelů 15% SDS-PAGE byly přeneseny blotováním na nitrocelulosové membrány Hybond-ECL (Amersham, RPN 2020D, Velká Británie) a blokovány 5% hovězím sérovým albuminem (Sigma) v roztoku chloridu sodného pufrovaném Tris pufrem na pH 7,8 s přísadou 0,1 % smáčedla Tween-20. Bloty byly inkubovány s polyklonální kozí protilidskou IL-4 protilátkou (R&D Systems, Velká Británie) a poté se sekundární protilátkou značenou křenovou peroxidasou (katalogové číslo

Detekce byla yic· vedena 90sekundovou expozicí na film (Kodak X-OMAT-S, USA) za účelem vizualizace skvrn.

Specificita aminokyselinové sekvence IT9302

Hledání možné homologie sekvence IT9302 s jinými proteiny bylo provedeno rešerší v proteinové databázi EMBO,.

a -—---s laskavou pomocí Dr. Henric Lefferse z Ústavu pro lékařskou biochemii University v Aarhus, Dánsko.

Specificita aminokyselinové sekvence IT9302

Podle informací z proteinové databáze EMBO (Heidelberg), které byly získány rešerší provedenou 10. června 1994, vykazuje IT9302 100% homologii se sekvencí humánního IL-10 a 75% homologii se sekvencí proteinu pocházejícího z viru Epstein-Baarové, který je identický svIL-10. Pokud se týče jiných virových proteinů, byla zjištěna 75% totožnost s fágem T7 a 85 % totožnost s virem vyvolávajícím žloutnutí rajčatových listů (tomato yellow leaf curi virus).

Výsledky

Koncepce vynálezu byla vytvořena v říjnu a listopadu 1992, kdy byl na základě výše popsané strategie navržen nonapeptid označovaný názvem IT9302. O chemické syntéze prvního prototypu IT9302 bylo rozhodnuto, a tento úkol byl uložen 27. listopadu 1992. Očekávalo se, že by měl tento nonapeptid vykazovat imunoraodulační účinnosti, z nichž některé by mohly napodobovat účinnost podobnou účinnosti IL-10. Ve stejné době byly také naplánovány kontrolní pokusy (příklady). Chemická syntéza IT9302 byla provedena za použití automatického syntetizátoru polypeptidů. Syntézu tohoto peptidu provedla na placenou objednávku původců firma Carlbiotech Ltd. A/S, Dánsko. Poté byl protein purifikoVán za použití HPLC a jeho zjištěná čistota podle HPLC byla vyšší než 95 %. Tím se potvrdilo, že syntetizovaný produkt je identický s IT9302 navrženým původci v říjnu a listopadu 1992.

Přikladl

Inhibice spontánní produkce IL-8 humánními monocyty indukovaná IT9302

Zkouška byla provedena způsobem popsaným v části textu uvedené výše, označené nadpisem Produkce IL-8 mononukleárními buňkami normální humánní periferní krve (PBMC). Monocyty byly purifikovány technikou adherence k plastu a 3,0 x 10⁶ buněk/ml bylo podrobeno 40hodinové stimulaci. Jak je zřejmé z obr. 3, IT9302 inhibuje produkci IL-8 monocyty. Při koncentraci IT9302 0,1 ng/ml byla produkce IL-8 potlačena in vitro na 35 % hodnoty spontánní produkce. Životaschopnost buněk po jednom dni v kultuře byla vždy vyšší než 80% a přídavek IT9302 v jakékoliv koncentraci v rozmezí od 0,1 do 1000 ng/ml (molekulová hmotnost IT9302: 1127 Da, předpovězená molekulová hmotnost rhIL-10 18 400 Da) v tomto příkladu ani v následujících příkladech- nikdy neovlivnil tuto životaschopnost.

Příklad 2

IT9302-indukóvaná inhibice IL-lbeta-indukované produkce

IL-8 mononukleárními buňkami humánní periferní krve (PBMC)

Tato zkouška byla provedena způsobem popsaným v části textu uvedené výše, označené nadpisem Produkce IL-8 mononukleárními buňkami normální humánní periferní krve (PBMC). Jak je zřejmé z obr. 4, ÍT9302 inhibuje IL-lbetaindukovanou -produkci—IL-8“ mononukleárními buňkami humánní periferní krve in vitro způsobem, který je úměrný dávce. Potlačeni produkce IL-8 se ustálí (plato křivky) při koncentraci IT9302 v rozmezí od 0,01 do 100 ng/ml.

Příklad 3

IT9302-indukovaná produkce interleukin-1 receptor-antagonistického proteinu (IRAP) humánními monocyty

Tato zkouška byla provedena způsobem popsaným v části textu uvedené výše, označené nadpisem Stanovení koncentrace IRAP. Jak je zřejmé z obr. 5, IT9302 indukuje » produkci IRAP humánními monocyty způsobem, který je úměrný ___dávce.__Za použiti koncentrací IT9302 nad 10 ng/ml se ·*> produkce IRAP dramaticky zvýšila. Obr. 6 ukazuje indukci

IRAP rhIL-10. Jelikož má hIL-10 přibližně 20x větší molekulu než IT9302, v molárním vyjádření je koncentrace IT9302 10 ng/ml ekvivalentní koncentraci IL-10 200 ng/ml. Mohutnosti

.. účinnosti IT9302 a rhIL-10 jsou tedy srovnatelné a přibližně stejné, pokud se týče indukce IRAP při nižších koncentracích. Při koncentraci IT9302 převyšující hodnotu 10 ng/ml dochází však ke dramatickému zvýšení indukce IRAP dosahující hodnoty přibližně 700 ng/ml.

Příklad 4

Chemotaktický účinek IT9302 na humánní T-lymfocyty CD8+

Tato zkouška byla provedena způsobem popsaným v části textu uvedené výše, označené nadpisem Stanovení chemotaxe leukocytú. Jak je zřejmé z obr. 7, IT9302 indukuje chemotaktickou migraci humánních T-lymfocytů CD8+ in vitro, přičemž nemá žádný účinek na T-búňký” CD4+ (data ^J nejsou uvedena). I v tomto případě je mohutnost účinnosti

IT9302 uvedené v tomto experimentu srovnatelná s mohutností účinnosti rhIL-10 popsanou dříve (Jinquan T., Larsen C. G., Gesser B. , Matsushima K., Thestrup-Pedersen K., 1993, Human IL-10 is a chemoattractant for CD8+ T lymphocytes and an inhibitor of IL-8-induced CD4+ T lymphocyte Migration, Journal of Immunogy 151: 4545 až 4551).

Příklad 5

Desensitizace humánních T-buněk CD8+ mající za následek neresponsivitu vůči rhIL-10 působením IT9302

Tato zkouška byla provedena způsobem popsaným v části textu uvedené výše, označené nadpisem Stanovení chemotaxe leukocytů. Látka IT9302 byla přidána k suspenzi T-buněk CD8+ 30 minut před zkoušením těchto buněk na chemotaktickou odpovědi vůči rhIL-10. Jak je zřejmé z obr. 8, preinkubace buněk s IT9302 má za následek potlačenou responsivitu T-buněk CD8+ vůči rhIL-10. To ukazuje, že IT9302 může ovlivňovat vazbu rhIL-10 k receptoru IL-10.

Příklad 6

Potlačení chemotaktické odpovědi T-lymfocytů CD4+ na IL-8 vyvolané IT9302

Tato zkouška byla provedena způsobem popsaným v části textu uvedené výše, označené nadpisem Stanovení chemotaxe leukocytů. Jak je zřejmé z obr. 9, IT9302 po přidání k suspenzi humánních T-lymfocytů CD4+ inhibuje odpověď T—buněk CD4+ na IL-8 způsobem, který je úměrný dávce.

P ř i k 1 ad 7

Potlačení chemotaktické odpovědi humánních monocytů na MCAF/MCP-1 vyvolané IT9302

Tato zkouška byla provedena způsobem popsaným v části textu uvedené výše, označené nadpisem Chemotaxe monocytů. Jak je zřejmé z obr. 10, IT9302 po přidání k suspenzi humánních monocytů inhibuje chemotaktickou odpověď monocytů na MCAF/MCP-1 způsobem, který je úměrný dávce.

Příklad 8

IT9302 neinhibuje expresi molekuly MHC z třídy II v humánních monocytech

Tento pokus byl proveden způsobem popsaným v části Materiály a metody a ukazuje, že rhIL-10 inhibuje expresi MHC z třídy II na rozdíl od IT9302, který tak nečiní (viz tabulka 4, uvedená dále).

Tabulka 4

Stimulace Počet rosetujících monocytů

0			12,0	+	1,0	X	10
100	ng/ml	rhIL-10	4,6	+	1,4	X	10
1	μ9/ιη1	IT9302	11,0	+	3,0	X	10
100	ng/ml	IT9302	14,4	+	2,4	X	10
10	ng/ml	IT9302	11,2	+	3,2	X	10

Diskuse výsledků experimentů

Uvedená data ukazují, že existuje inhibiční účinek syntetického nonapeptidu IT9302, který je úměrný použité dávce, na procesy reflektující pro-inflamatorní činnost, jako je produkce IL-8 a migrace monocytů a/nebo T-buněk. Látka IT9302 je tedy schopna potlačovat spontánní produkci IL-8 humánními monocyty kultivovanými přes noc. Tento jev lze vysvětlit přímým inhibičním účinkem na produkci IL-8 mRNA a/nebo na následnou produkci a/nebo uvolňování proteinu. Jiný mechanismus lze vysvětlit skutečností, že

- 74 monocyty kultivované in vitro exprimuji a produkují IL-1, a posledně uvedená látka indukuje produkci IL-8. Tento mechanismus je podporován faktem, že bylo demonstrováno, že IT9302 mohutné indukuje produkci IRAP v monocytech. Látka IT9302 může proto také inhibovat spontánní produkci IL-8 interferencí s účinností IL-1. U pozorované indukce IRAP pomocí látky IT9302 se zdá být indukován biologicky účinný IRAP, poněvadž látka IT9302 přidaná ke kulturám působí proti s

IL-l-indukované produkci IL-8, ale pouze v tom případě, když se přidá alespoň 16 hodin před přídavkem IL-1 k těmto * kulturám. To by mohlo znamenat, že IT9302 inhibuje IL-1indukovanou produkci IL-8 indukcí produkce IRAP, přičemž posledně uvedená látka blokuje účinnost IL-1 prostřednictvím jeho receptoru. Kdyby látka IT9302 přímo inhibovala produkci IL-8 bylo by možno očekávat, že přídavek IT9302 ke kulturám 1 hodinu před přidáním IL-1 by měl inhibovat produkci IL-8, ale tak tomu není (data nejsou uvedena). Pozorovaná inhibice produkce IL-8 pomocí IT9302 je proto pravděpodobně důsledkem indukce produkce IRAP a pravděpodobně se tedy nejedná o přímou inhibici produkce IL-8. Tyto funkce IT9302 lze také nalézt u hIL-10, což ukazuje, že látka IT9302 vykazuje podobné účinnosti jako IL-10. Látka IT9302 také napodobuje účinnosti IL-10 potlačováním schopnosti T-bunék CD4+ migrovat v odpovědi na IL-8. Jelikož má IL-8 vztah k mnoha různým inflamatorním stavům, a jelikož T-buňky CD4+ se časně objevují v infiltrátu imunitního zánětu zprostředkovaného T-buňkami, jako je kožní alergie, může se tento znak projevit jako významný z terapeutického hlediska pro potlačování imunitních imflamačizprostředkovaných Ť-buňkami. - - - -.......... · · -......- ·-·*· —

Také chemotaktická účinnost IT9302 u T-buněk CD8+, jež je paralelní vzhledem k analogické účinnosti u IL-10, může znamenat, že IT9302 aktivuje populace T-buněk se supresorovou účinností, což přispívá k ukončení imunitního zánětu zprostředkovaného T-buňkami. Látka IT9302 vykazuje tedy podle výše uvedených příkladů terapeutickou užitečnost při chorobách, při nichž může vykazovat terapeutickou užitečnost IL-10 a/nebo IRAP. Kromě toho může být látka IT9302 terapeuticky užitečná při chorobách, při nichž se předpokládá patogenetická role IL-8 a/nebo MCAF a/nebo IL-1.

Příklad 9

Indukce produkce IL-4 v T-lymfocytech CD4+ prostřednictvím IT9302

Pozadí

Podobně jako IL-10, také IL-4 je produktem T-buněk CD4+ typu T_h2. Bylo pozorováno, že rekombinantní humánní IL-10 indukuje produkci IL-4 v kultuře humánních T-buněk CD4+. To znamená, že IL-10, kromě svých vlastních imunosupresivních funkcí, také indukuje produkci jiného imunosupresivního cytokinu, IL-4. Bylo proto zkoušeno, zda IT9302 také indukuje produkci IL-4 T-buňkami CD4+. Proto byly T-buňky CD4+ purifikovány způsobem popsaným v části popisu uvedené výše pod nadpisem Chemotaxe T-buněk a kultivovány způsobem popsaným v části Stanovení produkce IL-4 v T-lymfocytech CD4+ za použití třídenní stimulace pomocí IT93O2 (10 ng/ml) nebo IL-10 (100 ng/ml). Cytosolové frakce byly shromážděny a analyzovány na obsah IL-4 za použití metody Western Blotting (viz obr, 11) a za použití kozí antihumánní 11-4’polyklonální protilátky.

Jak je ukázáno na obr. 11, bylo pozorováno, že podobně jako IL-10 indukuje i IT9302 produkci IL-4 v kultuře normálních humánních T-buněk CD4+.

Příklad 10

T9302-inhibovaná produkce TNF-α při reakci směsných leukocytů (MLR)

Bylo ukázáno, že reakce směsných leukocytů je zčásti závislá na produkci TNF-α během reakce. Bylo ukázáno, že látka IT9302 podstatně nesnižuje MLR, ale zjistilo se, že dochází k významnému snížení produkce TNF-α v průběhu MLR.

K tomuto účelu byla provedena MLR tak, že byly purifikované humánní leukocyty od allogenních dárců 4 dny kultivovány při koncentraci 1 x 10⁶ buněk/ml. Před vytvořením kultur byla jedna skupina buněk 2 minuty ozařována β zářením. Cytosolové proteinové frakce byly purifikovány způsobem popsaným ve výše uvedené části popisu pod nadpisem Stanovení produkce IL-4 v T-lymfocytech CD4+ a bylo provedeno blotování Western za použití králičí antihumánní TNF-α protilátky.

Jak ukazuje obr. 12, bylo pozorováno významné snížení produkce TNF-α při reakci humánních směsných leukocytů.

Příklad 11 použití IT9302

Jelikožbylo zjištěno, že látka IT9302 moduluje produkci cytokinů, včetně TNF-α a IL-8 a jelikož byla publikována sekvence IL-10 vepře (Blancho et al., 1995) (srovnej homologii COOH-terminálního peptidu v obr. 2), bylo zkoušeno, zda bude látka IT9302 schopna modulovat průběh LPS-indukované leukopenie u vepře (obr. 13).

Při předběžném experimentu bylo zkoušeno, jak intravenosní injekce IT9302 v dávce 0,1 mg/kg moduluje účinek intravenosní injekce LPS v dávce 2 μg/kg u vepře (N =3). Látka IT9302 byla injekčně podána 30 minut před injekčním podáním LPS a krevní vzorky byly odebírány způsobem popsaným na obr. 13. Byl stanoven celkový počet leukocytů, jakož i diferenciální počet buněk a na základě těchto výsledků byl vypočten celkový počet neutrofilních leukocytů.

Jak je to ukázáno, bylo pozorováno, že injekce LPS vyvolává transientní leukopenii. Injekce IT9302 však této leukopenii zabraňuje (viz citovaný obr.).

Příklad 12

Protilátka proti syntetickému polypeptidú IT9302

Syntetický polypeptid IT9302 byl zakoupen od firmy Kem-En-Tec A/S, Kodaň, Dánsko a vykazoval čistotu vyšší než 95 %. Tento polypeptid byl také výrobcem konjugován k hemocyaninu Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH). Rozpustný konjugát IT9302/KLH je imunogennější než samotný polypeptid a může se ho také použít jako kontrolního proteinu pro zkoušky ELISA nebo Western Blotting.

250 μg konjugátu IT9302/KLH ve formě emulze v úplném Freundově adjuvans bylo použito pro intradermální nebo subkutánní injekční podání králíku.'Injekce byly podány celkem 4 x ve dvoutýdenních intervalech a 8 a 12 dnů na to byly králíkům odebrány krevní vzorky. Poté byly králíci subkutánně přeočkováni 250 μg konjugátu IT9302/KLH v neúplném Freundově adjuvans v jednoměsíčních intervalech. Tvorba IT9302 protilátky byla zjišťována imunoesejem dot-blot nebo metodou Western Blotting.

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL:

(A) JMÉNO: Nycomed DAK A/S (B) ULICE: P.O.Box 1911, Lergraversvej 59 (C) MÉSTO: Kodaň S (E) ZEMÉ: Dánsko (F) PSČ: 2300 (ZIP) (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Immunomodulators (Imunomodulátory) (iii) POČET SEKVENCÍ: 23 (iv) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP MEDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, verze#1.30 (EPO) (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina fr>\ Ď-prp-ťřrz.pnTrncrp · (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYPMOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:1:

Ala

Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

Ala Tyr Met Thr Ile Lys Met Arg Asn 1 5 (2) INFORMACE 0 SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

Ala Phe Met Thr 1

Leu Lys Leu Arg Asn 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:

Ala Tyr Met Thr Met Lys Val Arg Glu 1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:

Gly Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asp 1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:

Ala Phe Met Thr Met Lys Ile Arg Asp

1.......... ... ...... . ..... 5 ..._________ ________ _; _.....

(2) INFORMACE O SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:

Ala Tyr Ile Thr Met Lys Ile Arg Asp 1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

-------(a) DÉLKA: 9 aminokyselin-(B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

Ala Tyr Leu Thr Met Lys Ile Arg Asp 1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9:

Ala Tyr Val Thr Met Lys Ile Arg Asp 1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N0:10:

Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ile Arg Asp 1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:11:

Ala Tyr Met Thr 1

Leu Lys Ile Arg Asp 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:12:

Ala Tyr Met Thr Val Lys Ile Arg Asp ^{1 2 * * 5} (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST:

(D) TOPOLOGIE: lineární . __(ii) TYP MOLEKULY: peptid__ ti (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:13:

Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asp ,1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:14:

Ala Tyr Met Thr Met Lys Met Arg Asp 1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:15:

Ala Tyr Met Thr Met Lys Val Arg Asp 1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:16:

Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Gin ¹ 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:17:

Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Glu 15 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:18:

Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu 1 5 (2) INFORMACE 0 SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:19:

Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa 1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 7 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:20:

Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa

5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETÉZCOVOST: (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid * (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:21:

Xaa Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa

5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETÉZCOVOST:

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:22:

Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa >

5 (2) INFORMACE O SEQ ID NÓ: 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (Xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:23:

GCCTACATGA CAATGAAGAT ACGAAAC

Claims

1. Poiypeptid obecného vzorce

X₁-X₂-X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEQ ID NO: 22) kde

Xj představuje Ala nebo Gly,

X₂ představuje Tyr nebo Phe,

X₃, X₄ a X₅ nezávisle představuje vždy Met, Ile, Leu nebo Val a

Xg představuje zbytek Asn, Asp, Gin nebo Glu.

2. Poiypeptid obecného vzorce

X₂-X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEQ ID NO: 21) kde představuje Tyr nebo Phe,

V _ ^Λ5 ii&ttuvxoxc V XVAJf i'iCL / XXC/

Val a

Xg představuje zbytek Asn, Ašp, GlrTnebo Glu:

3. Poiypeptid obecného vzorce

X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆ (SEQ ID NO: 20) kde

X₃, X₄ a X₅ nezávisle představuje vždy Met, Ile, Leu nebo Val a

X₆ představuje zbytek Asn, Asp, Gin nebo Glu.

4. Polypeptid obecného vzorce ________ _ Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-Xg (SEQ ID NO: 19)__________________ kde

X₄ a Xg nezávisle představuje vždy Met, Ile, Leu nebo Val a

Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn.

5. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 4, kde v obecném vzorci Xj^ představuje Ala.

6. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 4, kde v obecném vzorci Xj^ představuje Gly.

7. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 6, kde v obecném vzorci X₂ představuje Tyr.

8. Polypeptid podle některého z nároků laž 6, kde v obecném vzorci X₂ představuje Phe.

9. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 8, kde v obecném vzorci X₃ představuje Met.

10. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 8, kde v obecném vzorci X₃ představuje Ile.

11. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 8, kde v obecném vzorci X₃ představuje Leu.

12. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 8, kde v obecném vzorci X₃ představuje Val.

13. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 12, kde v obecném vzorci X₄ představuje Met.

14. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 12, kde v obecném vzorci X₄ představuje Ile.

15. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 12, kde v obecném vzorci X₄ představuje Leu.

16. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 12, kde v obecném vzorci X₄ představuje Val.

17. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 16, kde v obecném vzorci X₅ představuje Met.

18. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 16, kde v obecném vzorci X₅ představuje Ile.

19. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 16, kde v obecném vzorci X₅ představuje Leu.

20. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 16, kde v obecném vzorci Xg představuje Val.

21. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 20, kde v obecném vzorci Xg představuje Asp.

22. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 20, kde v obecném vzorci X_g představuje Gin.

23. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 20, kde v obecném vzorci X_g představuje Glu.

24. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 20, kde v obecném vzorci X_g představuje Asn.

25. Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn.

26. Polypeptid zvolený ze souboru zahrnujícího

Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Met-Arg-Asn Ala-Phe-Met-Thr-Leu-Lys-Leu-Arg-Asn. Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Glu Gly-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Phe-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Ile-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Leu-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Va1-Thr-Me t-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Met-Thr-Leu-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Met-Thr-Val-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Met-Arg-Asp Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Asp Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Gln Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Glu

(SEQ ID NO:2), (SEQ ID NO:3), (SEQ ID NO:4), (SEQ ID NO:5), (SEQ ID NO:6), (SEQ ID NO:7), (SEQ ID NO:8), (SEQ ID NO:9), (SEQ ID NO:10), (SEQ ID NO:11), (SEQ ID NO:12), (SEQ ID NO:13), (SEQ ID NO:14), (SEQ ID NO:15), (SEQ ID NO:16), (SEQ ID NO:17).

27. Látka 1 až 26 v podstatě nebo polypeptid podle některého z nároků v čisté formě.

28. Látka nebo polypeptid vykazující aminokyselinovou sekvenci definovanou v některém z nároků 1 až 26, přičemž touto látkou nebo polypeptidem není humánní IL-10.

29. Nukleotidová sekvence kódující polypeptid podle některého z nároků 1 až 26.

30. Protilátka, která se specificky váže k látce nebo polypeptidú podle některého z nároků 1 až 26.

31. Protilátka, která se specificky vážek polypeptidu vykazujícímu aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1.

32. Protilátka podle nároku 30 nebo 31, kterou je polyklonální protilátka.

33. Monoklonální protilátka podle nároku 30 nebo 31, kterou je polyklonální protilátka.

34. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ιοί se t i m , že obsahuje látku nebo polypeptid podle některého z nároků 1 až 28.

35. Látka nebo polypeptid podle některého z nároků 1 až 28 pro použití jako léčivo pro léčení nebo profylaxi choroby zvolené ze souboru, do něhož spadá rheumatoidní arthritis, Lymeho arthritis, dna, septický syndrom, hyperthermie, vředová colitis nebo enterocolitis, osteoporosis, cytomegalovirus, periodontální choroby, glomerulonephritis, chronické neinfekční záněty plic (například sarcoidosis α lov · Λΐέΐ eiu;.A»ts pnue / _f υνυιυα yxonuxumu ₉ XJ.A/4.W0O javex _f fibrosa plic, odmítání transplantátů, choroba graft vs. host, chronická myeloidní íeukemie, akutní myeloiďní Íeukemie/ jiné neoplástičké choroby, asthma“bronchiale, diabetes mellitus typu I (insulin dependentní), arteriosclerosis/atherosclerosis, psoriasis, chronická Íeukemie lymfocytů B, běžná variabilní imunodeficience, vedlejší účinky za použití jiných modifikátorů biologické odpovědi, disseminovaná intravaskulární koagulace, systemická sklerosa, encephalomyelitis, zánět plic, hyper IgE syndrom, enterocolitis, metastázy a růst rakovinných nádorů, adoptivní imunitní terapie, získaný syndrom respiračního distresu, sepse, reperfusní syndrom, zánět po chirurgickém zákroku, transplantace orgánu a alopecie.

36. Použití látky nebo polypeptidu podle některého z nároku 1 až 28 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení nebo profylaxi jedné nebo více chorob uvedených v nároku 35.

01-2692-96-ČE /9 τι η /Λ mlLlO WPCSALLCCLLLLTCURISRGqYSREONNCTHFPVCqSHULLELRTAF

I ΙΙΙ IIII INI I I II I Ulil II II II hILlO WHSSALLCCLVLLTGVRASPCqCTqSENSCTHFPCNLPHULROLROAF

I lilii 1 II 7 Ίι lili IIIII 8 C R FI UERRLWTLqCLVLL—YLAPECGGTO---qCOHFP q~ ULROLRDAF i 30

SqVXTFFQTKOqLONILLTDSLUqOFXCYLCCqALSEAlIQFYLVEVWPQAEKHCPEIXEHLNSLC I liliu llllll U II II11111111111111111 11 Ulil I II i lili SRVXTFFquXDqLDNLLLXESLLEDFKCYLCCQALSEMIQFYLEEVMPqAEHqOPDIKAHyNSLC ΙΙΙΙΙΙ.ιΓη 11111111111111111 III111 Π 1111111111111II11 I Ulili SRVXTFFQTXDEVONLLLKESLLEOFXCYLCCqALSEMIQFYLEEVUPQAEXqDPEAXOHVNSLC <?S

3!

UL·

EKLKTLRURLRRCHRFLPCENXSKAVEqVKSDFNKLqDqCVYKAMNEFOIFINCIEAYWUIKUKS I Ulil 111111111111111111111! Ulil I lili lllllll Ulil I ENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEqVXNAFHKLqEKGIYXAUSEFOIFIHYIEAYWTUKIRH 11111 li 11 ii 11II11 i 1111111111 11II11IIIIIIIIIIII1III U 1111111 I 1 ENLXTLRLRLRRCHRFLPCENXSKAVEqiXNAFNXLqEXCIYXAMSEFDIFlNYIEAYUTIKAR

1 ^c O