RO118758B1 - Peptide cu rol de imunomodulatori, secvenţă de nucleotide, anticorp şi compoziţie farmaceutic - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la polipeptide diferite de interleukină umană, care au cel puţin una din următoarele proprietăţi, induc inhibiţie producţiei spontane de IL-8 de către monocitele umane, induc inhibiţia producţiei de IL-8 care induce IL-1 beta, de către celulele mononucleare sangvine periferice umane, induc producţia de proteină antagonistică receptorului interleukinei -1 de către monocitele umane, induc migrarea chemotectică a CD8 + limfocitele T umane in vitro, desensibilizează celulele CD8 + T umane in vitro, desensibilizează celulele CD8 + T umane, care rezultă ca insensibile faţă de rhIL-10, suprimă răspunsul cheractactic al CD 4 + T limfocitele umane faţă de IL-8, suprimă răspunsul chermotactic al monocitelor umane faţă de MCA F/ MCP-1, nu inhibă clasa II MPC de molecule cu expresie a monocitelor umane, în contrast cu IL-10 umane, induc producţia de IL-4 prin cultura celulelor umane CD4+T, reduc producţia de TNF alfa la oameni în reacţia leucocitelor mixte. În special, invenţia se referă la nonopeptide Ala-Pyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn, la analogii şi la variantele acesteia. ŕ

Description

Prezenta invenție se referă la polipeptide cu rol de imunomodulatori care se utilizează pentru prepararea unei compoziții farmaceutice utilizată în prevenirea și/sau tratamentul unor maladii, a căror patogeneză se referă la producția și/sau funcția scăzută a mediatorilor imunoinhibitori, în special, a citokinelor și/sau se referă la producția și/sau funcția crescută a anumitor mediatori imuno-inflamatori, în special, a citokinelor, se referă la o secvență de nucleotide și la un anticorp de legătură a peptidelor.

Prezenta invenție se referă la polipeptide cu rol de imunomodulatori utilizați pentru prepararea unei compoziții farmaceutice, utilizată în prevenirea și/sau tratamentul maladiilor auto-imune (diabetul mellitus, tipul I; maladiile inflamatorii ale tractului gastro-intestinal; artrita reumatoidă), artrita urica (guta), alergia pielei; reacțiile alergice ale pielei, plămânilor și tractului respirator (incluzând astmul broncheal); vătămarea țesutului ca rezultat al hipoxinei/ischemiei (infarct; reperfuzie); ateroscleroză; psoriazis; maladia granulomatoasă; leucemia mieloidă cronică; leucemia mieloidă acută; cancerul; reacția organismului de respingere a grefei și condițiile referitoare la rejecția transplantului; fibroză pulmonară; fibroză ficatului; inflamația cronică neinfecțioasă a plămânului; glomerulonefrita; naștere prematură; periodontitis; reacțiile inflamatorii datorate infecțiilor virale, osteoporoza, șocul septic și/sau pentru prepararea unui agent anti-conceptiv.

Cercetările din ultimele două decade au arătat că inițierea, reglarea și sfârșitul reacțiilor inflamatorii, ca și reglarea dezvoltării și diferențierii organismelor mamiferelor, se află sub controlul strâns al grupului de specialiști al polipeptidelor de semnal, denumite în general, citokine.

Citokinele sunt polipeptidele care pot fi produse de majoritatea celulelor nucleate și care transmit semnalele de reglare, între celule, formând astfel o legătură de comunicare între tipurile celulare identice sau diferite, ale organismului. Citokinele sunt mediatori extrem de puternici și activează la concentrații sub 10'¹⁵M. Citokinele sunt așadar, factorii cheie pentru dezvoltarea reacțiilor imune celulare, care la rândul lor formează baza manifestărilor clinice ale inflamației, datorată infecției, alergiei, traumei, reacțiilor organismului de respingere a grefei și maladiilor auto-imune. Maladiile alergice și maladiile auto-imune, sunt explicate prin anomaliile în sistemul imunitar, în special, prin imunitatea mediată de limfocitele T, dar în general, aceste maladii sunt de etiologie necunoscută.

Studiile efectuate - in vitro -, experimentele pe animale și studiile clinice experimentale, au arătat că citokinele joacă un rol important patofiziologic, pentru reacțiile inflamatorii legate de maladiile auto-imune, alergie, ischemie, vătămare prin reperfuzie, traumă, infecții și sunt importante pentru dezvoltarea cancerului, aterosclerozei, în pregnanță și pentru dezvoltarea fetală, în homeostazia caselor. Citokinele pot fi, de asemenea, implicate în alte maladii imunoinflamatorii și maladii proliferative, așa cum se va descrie în detalii, în continuare.

Maladiile menționate sunt de obicei cronice și tratamentul este paliativ, de exemplu, majoritatea medicamentelor prescrise în legătură cu aceste maladii, se adresează ameliorări simptomelor și de obicei nu au efect curativ. Alte tratamente sunt așa numitele terapii de substituție care sunt implicate în prelungirea vieții pacienților cu aceste substanțe, de exemplu, hormonii necesari datorită unei producții interne redusă sau insuficientă, în aceste substanțe. Aceste tratamente sunt adesea nesatisfăcătoare, implicând efecte adverse neașteptate, adesea, serioase și mai degrabă o întârziere, decât prevenirea progresiei maladiei. Astfel, sunt foarte necesare metode îmbunătățite de tratament și compoziții farmaceutice îmbunătățite.

Interleukina -10 (IL-10) este o citokină imunosupresivă endogenă, naturală, descrisă recent, identificată, atât în organismul murinelor, cât și în organismul uman. Interleukina 10 (mlL-10) murinică a fost descrisă original, ca un factor inhibitor al sintezei de citokine,

R0118758 Β1 eliberat din clonele TH2 helper T-celulare, dar care poartă, de asemenea, efecte proliferative 50 asupra diferitelor subgrupe de limfocite, incluzând un efect de creștere a efectului de clonizare al celulelor T splenice CD4-, 8 + murinice (4). Interleukina umană 10 (hlL-10) a fost recent secvențată și relevată a avea o omologie superioară cu mlL-10, la nivelul secvenței de acid dezoxiribonucleic DNA, ca și la nivelul de amino acizi. Mai mult decât atât, interleukina 10 de la porcine, a fost recent secvențată și relevată ca având o omologie superioară 55 cu IL-10 umană, la nivelul secvenței de acid dezoxiribonucleic DNA, ca și la nivelul de amino acizi (88), așa cum este prezentat în fig.2. De asemenea, hlL-10 are o omologie superioară cu un cadru deschis de citire în cazul genomului virusului Epstein-Barr, BCRF1 și IL-10 viral, care prezintă o activitate oarecum similară cu cea a hlL-10. Conform fig.1 (5). IL-10 uman se produce de clonele T celulare activate și celulele B imortalizate și în adiție la activitatea 60 factorului de inhibiție a sintezei de citokine (CSIF), inhibând producția diferitelor citokine proinflamatorii și factorilor de stimulare a coloniilor, ceea ce induce producția de proteine/peptide (IRAP) antagoniste receptorilor interleukinei -1 naturale, de celulele mononucleare și astfel, indirect are loc inhibiția activității IL-1-.

Așadar, IL-10 reglează direct producția proprie, prin monocite și inhibă expresia cla- 65 sei II MHC (12). Mai mult decât atât, hlL-10 reduce proliferarea specifică antigenului, a celulelor T umane și clonelor celulare CD4 + T, atunci când se utilizează monocitele ca celule de prezentare a antigenului. Experimentele - in vivo - pe șoareci arată că apariția infecției cu Leisbmania este dependentă de profilul citokinei din limfocitele de răspuns CD4+T (13).

La șoarecii C57BL/6 rezistenți la infecția cu Leishmania, celulele CD4 + T obținute prin 70 drenarea nodulilor limfatici prezintă o reglare superioară a IFN-gamma și citokinelor IL-2 și astfel BALB/c sensibili în drenarea nodulilor limfatici având celulele T CD4+ de răspuns, eliberează IL-4 și IL-10, ceea ce ar putea fi demonstrat prin corelarea cu progresul maladiei (13). Astfel, IL-10 poate exercita efecte de reglare puternice asupra răspunsurilor imunologice, atât in vitro-, cât și - in vivo -. De asemenea, IL-10 afectează puternic chemokina 75 biologică, deoarece interleukina 10 umană este un factor chemotactic specific în raport cu celulele CD8 + T, doarece IL-10 suprimă abilitatea CD4+, dar nu și pe cea a CD8+ a celulelor T, pentru a migra în răspunsul față de citokină chemotactică T celulară, IL-8 (14). Așadar, IL-10 inhibă efectul chemotactic al altor chemokine MCP-1/MCAF și RANTES (75).

Deoarece, IL-10 este un dezactivator al funcțiilor monocite/macrofage și un inhibitor al 80 activității Thl, medicamentele având o activitate completă sau parțială asemănătoare IL-10, pot să posede efecte terapeutice în maladiile caracterizate prin dezechilibrul în producția și/sau activitățile citokinelor.

Astfel, s-a propus mai înainte, prepararea compozițiilor farmaceutice care să cuprindă hlL-10 sau vlL-10 și utilizarea hlL-10 sau vlL-10 pentru prepararea unei compoziții 85 farmaceutice utilizată în tratamentul diferitelor condiții, cum ar fi șocul septic sau șocul toxicoseptic, artrita reumatoidă, respingerea grefei de către organismul gazdă, rejecția tisulară, diabetul mellitus, tulburările autoimune, leucemia și cancerul, care s-au descris în WO93/02693 și 94/04180. Mai mult decât atât, antagoniștii IL-10, de exemplu, anticorpii specific legțăturii la IL-10, au fost descriși, de exemplu, în EP 405980 și WO94/06473 și s-a con- 90 templat utilizarea unor astfel de anticorpi, în tratamentul pacienților infectați cu HIV.

Invenția se referă la polipeptide cu rol de imunomodulatori cu formula:

X, - X₂ - X₃ -Thr - X₄ - Lys - X₅ - Arg -X₆ (secvența ID Nr.22) în care:

X, este Ala sau Gly, X₂ este Tyr sau Phe, 95

X₃, X₄ și Xg sunt independent selectați dintr-o grupare care constă din Met, lle, Leu,

Val

X₆ este selectat dintr-o grupare care constă din Asn, Asp, Gin, Glu.

RO 118758 Β1

Polipeptide cu rol de imunomodulatori pot fi cu formula:

X₂ - X₃ -Thr - X₄ - Lys - X₅ - Arg -X₆ (secvența ID Nr.21) în care: ,

X₂ este Tyr sau Phe,

X₃, X₄ și X₅sunt independent selectați dintr-o grupare care constă din Met, lle, Leu, Val

Xe este selectat dintr-o grupare care constă din Asn, Asp, Gin, Glu.

Polipeptide cu rol de imunomodulatori pot fi cu formula:

X₃ -Thr - X₄ - Lys - X₅ - Arg -X₆ (secvența ID Nr.20) în care:

X₃, X₄ și XgSunt independent selectați dintr-o grupare care constă din Met, lle, Leu, Val

Χθ este selectat dintr-o grupare care constă din Asn, Asp, Gin, Glu.

Polipeptide cu rol de imunomodulatori pot fi cu formula:

Thr - X₄ - Lys - X₅ - Arg -Χβ (secvența ID Nr.19) în care:

X₄ și X₅sunt independent selectați dintr-o grupare care constă din Met, lle, Leu, Val

Xe este selectat dintr-o grupare care constă din Asn, Asp, Gin, Glu.

Aceste polipeptide pot cuprinde cel puțin 12 aminoacizi; cel puțin 15 aminoacizi; cel puțin 11 aminoacizi; cel puțin 10 aminoacizi; X, este Ala; X, este Gly; X₂ este Tyr; X₂ este Phe; X₃ este Met; X₃ este lle; X₃ este Leu; X₃ este Val; X4 este Met; X4 este lle; Xj este Leu; X₄ este Val; X₅ este Met; X₅ este lle; X₅ este Leu; X₅ este Val; X₆ este Asp; X₆ este Gin; Χβ este Glu; Χβ este Asn; polipeptidele sunt selectate din: Ala-Tyr-Met-Thr-lle-Lys-Met-Arg-Asn (secvența 2) Ala-Phe-Met-Thr-Leu-Lys-Leu-Arg-Asn (secvența 3) Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Glu (secvența 4) Gly-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp (secvența 5) Ala-Phe-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp (secvența 6) Ala-Tyr-lle-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp (secvența 7) Ala-Tyr-Leu-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp (secvența 8) Ala-Tyr-Val-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp (secvența 9) Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp(secvența 10) Ala-Tyr-Met-Thr-Leu-Lys-lle-Arg-Asp(secvența 11) Ala-Tyr-Met-Thr-Val-Lys-lle-Arg-Asn (secvența 12) Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp (secvența 13) Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Asp (secvența 14) Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Asp (secvența 15) Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Gln(secvența 16) Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Glu(secvența 17);

sunt sub formă efectiv pură; sunt diferite de IL-10 uman,într-o compoziție farmaceutică se aplică în tratamentul și profilaxia unei maladii selectată dintr-o grupare care constă din nașterea prematură cauzată de infecție sau alte cauze, artrita reumatoidă, artrita Lyme, guta, dindromul sepsis, hipertermia, colită ulcerativă sau enterocolită, osteoporoză, citomegalovirus, maladia periodontală, glomerulonefrita, inflamația cronică neinfecțioasă a plămânului, formarea de granuloame, fibroza ficatului, fibroza plămânului, respingere de transplant, maladia respingerii grefei de către organismul gazdă, leucemie mieloidă cronică, leucemie mieloidă acută, alte maladii neoplazice, astm bronșic, diabetul mellitus tip I, arterioscleroza și arteroscleroza, psoriazisul, leucemia cronică a limfocitelor B, imunodeficiența variabilă comună, efecte secundare utilizând alți modificatori ai răspunsului

RO 118758 Β1 biologic, coagularea intravasculară diseminată, scleroza sistemică, encefalomielita, inflamarea plămânului, sindromul hiper IgE, enterocolităâ, metastază și avansarea cancerului, terapie imună adoptivă, sindromul distres respirator dobândit, sepsis, sindromul reperfuziei, 150 inflamația postchirurgicală, transplantul de organe și alopecia.

Invenția se referă și la o secvență de nucleotide care codifică o polipeptidă ca imunomodulator, și la un anticorp care se leagă de o polipeptidă ca imunomodulator.

Conform prezentei invenții și ca avantaje ale invenției s-a dezvăluit că o substanță diferită de interleukina 10 umană, are una sau mai multe din următoarele proprietăți: 155

a) induce inhibiția producției spontane de IL-8, prin monocitele umane,

b) induce inhibiția IL-1 beta indus prin producția de IL-8, prin celulele mono-nucleare sanghine periferice, umane (PBMC),

c) induce producția de proteine (IRAP) antagonistica receptorilor interleukinei -1, prin monocitele umane, 160

d) induce migrarea chemotactică a limfocitelor CD8+ T umane in vitro,

e) desensibilizează celulele CD8+ T umane rezultând ca insensibile față de rHil-10,

f) suprimă răspunsul chemotactic al CD4+ T limfocitelor umane față de IL-8,

g) suprimă răspunsul chemostatic al monocitelor umane față de MCAF/MCP-1,

h) nu inhibă clasa II MHC de molecule ca expresie a monocitelor umane, în con-trast 165 cu IL-10 umane,

i) induce producția de IL-4 prin cultura celulelor umane CD4+T,

j) reduce producția de TNF alfa la oameni în reacția leucocitelor mixte, cum ar fi, polipeptidă care cuprinde secvența de amino acizi Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-lleArg-Asn sau un analog sau o variantă a acestei secvențe (o nona-peptidă cu secvența 170 omologă celei a hlL-10, numită IT 9302) și derivații acesteia care pot fi utilizați pentru prevenirea și/sau tratamentul anumitor forme de procese inflamatorii, în special, formele referitaore la sistemul imunitar și/sau sistemul hormonal. Este consemnat faptul că (așa cum se descrie în detaliu în următoarea descriere a mecanismelor imunologice) mecanismul de acțiune interferează cu acțiunea mediatorilor sistemului imnitar, în special, citokinele ca 175 monokine, limfokine, chemokine și monokine - receptor antagoniști, de exemplu, substanța prezentei invenții interferează cu/suprimă producția și/sau acțiunea anumitor citokine și astfel, inhibă procesele patologice care conduc la vătămarea tisulară și că substanța prezentei invenții induce producția de antagoniști receptori de monokină naturală, astfel interferând cu/suprimând acțiunea anumitor citokine și prin aceasta inhibând procesele 180 patologice care conduc la vătămarea tisulară.

în urma cercetărilor s-au formulat compoziții care cuprind ca ingredient activ, substanța prezentei invenții. S-a cercetat substanța care este capabilă de a neutraliza una sau mai multe activități a) până la g) menționate mai înainte, de exemplu, un anticorp și compoziția farmaceutică cuprinzând această substanță. 185

Se pot prepara compoziții farmaceutice pentru inhibarea substanțială a efectului biologic referitor la citokină, de exemplu, utilizarea substanței prezentei invenții, ca proteină/peptidă antagonist receptor IL-1, limfokină, monokină, interleukină, interferon, chemokină sau factor de stimulare a coloanei, precum și compoziții farmaceutice, utilizate în profilaxia sau tratamentul unei condiții referitoare la o tulburare a sistemului citokin, de 190 exemplu, proteina/peptida antagonist receptor IL-1, limfokină, monokină, interleukina, interferonul, chemokina sau sistemul factor de stimulare a coloniei.

S-a studiat o metodă de tratare a condiției umane referitoare la o tulburare în sistemul citokinei, metodă care cuprinde administrarea la subiect, a unei cantități efective din substanța prezentei invenții. 195

RO 118758 Β1

Sistemul imunitar celular ia parte la dezvoltarea acestor tulburări, ca infecții, maladii inflamatorii și maladii neoplazice.

Celulele imunocompetente și produsele acestora joacă roluri importante în inițierea, progresarea și natura cronică posibilă a dezvoltării condițiilor inflamatorii. Aceste tulburări sunt adesea fără etiologie cunoscută și includ maladii comune cum ar fi, diabetul mellitus, artrita reumatoidă, maladiile inflamatorii ale tractului gastro-intestinal și ale pielei. Plecând de la aceste exemple, mediatorii imunității celular mediate sau mediatorii pro-inflamatori, cu toate acestea, contribuie la multe alte maladii inflamatorii și proliferative (tabelul 2).

Tabelul 2 Unele maladii in care reacțiile imunitare sunt mediate de T-limfocite/macrofage, sunt considerate importante patogenetic

Maladiile pieii: Psoriazis

Dermatita atopică Dermatita de contact Limfoamele T celulare cutanate (CTCL) Sindromul Sezary Pemphigus vulgaris Bullous pemphigoid

Erythema nodosum

Scleroderma

Maladii auto-imune (inclusiv reumatice):

Uveitis

Maladia Bechet Sarcodioza Boeck Sindromul Sjogren Artrita reumatoidă Artrita juvenilă Sindromul Reiter Guta

Osteoasrtroza

Lupusul sistemic eritematos

Polimiozita

Miocardita

Ciroza biliară primară

Maladia Crohn

Colita ulcerativă

Scleroza multiplă și alte maladii demielinizante

Anemia aplazică

Purpura trombocitopenică idiopatică

Mielomul multiplu și limfomul B celular

Panhypopituitarismul Simmons

Maladia Graves și Oftalmopatia Graves

Tireoditisul subacut și Maladia Hashimoto

Maladia Addison

Diabetul mellitus insulinodependent (tipul 1)

RO 118758 Β1

Alte maladii:

Diferite sindromuri clinice cu vasculită (exemplu, poliarteritis nodosa, Wegener’s granulomatosis, arterita cu celule gigante, febra malaiză).

Anorexia (de exemplu, în maladiile infecțioase și inflamatorii, acute și cronice). Coagularea intravasculară diseminată (DUC)

Arterioscleroza (ateroscleroza)

Șocul (de exemplu, în sepsisul gram negativ)

Cașexia (de exemplu, în cancer, în maladiile inflamatorii cronice și în maladiile infecțioase cronice).

Rejecția de transplant și maladia de respingere a grefei de organismul gazdă. ___________Citokinele:

T-limfocitele dirijează inducția și reglarea reacțiilor imunitare mediate de celule și produsele de citokină (limfokinele) ale celulelor T, inițiază și controlează răspunsul imunitar (1.2).

Mediatorii de activare limfocitară (limfokinele) produși de celulele ce prezintă antigenul, aparțin unui grup de polipeptide denumite citokine. Citokinele sunt transmi-țătorii comunicației de la o celulă la alta, atât în condiții fiziologice, cât și în condiții patofiziologice și pot așadat funcționa ca hormoni, furnizând semnale între sistemul imunitar și alte țesuturi și organe. Citokinele pot fi așadar produse celule, în afara sistemului imunitar și aceasta se crede în general, prin toate celulele nucleate care sunt capabile de a produce una sau diferite citokine. Astfel, de exemplu, keratinocitele și fibroblaștele sunt producători puternici de citokine și în acest sistem, citokinele pot funcționa ca hormoni autocrine sau paracrine, independent de sistemul imunitar (3).

Interleukina -10:

Interleukina murinică 10 (mlL-10) a fost descrisă original, ca un factor inhibitor de sinteză a citokinei (CSIF), eliberaat de clonele TH₂ helper a celulelor T, dar acesta are, de asemenea, efecte proliferative asupra diferitelor subgrupe de limfocite, incluzând o creștere a efectului asupra eficacității de clonizare a celulelor T splenice, murinice, CD4-, 8+ (4). Interleukina 10 umană (jlL-10) a fost recent descrisă (5) și aceasta are omologie superioară cu cadrul de citire deschis în genomul virusului Epstein-Barr, BCRF1 și IL-10 viral prezintă oarecare activitate similară cu cea a hlL-10.

în cele ce urmează, vor fi arătate rolurile biochimice, biologice, fiziologice și posibil patofiziologice ale IL-10.

Structura IL-10:

Structurile primare ale mlL-10 la șoarece și IL-10 (hlL-10) uman, prezintă un grad înalt de omologie a secvenței nucleotidei (> 80%) pe întreaga lor lungime (4,5). Diferența semnificativă este numai inserția elementului secvențial repetitive a Alu uman în regiunea 3'-netranslatată a clonei hlL-10 cDNA. Encoda cNDAs mlL-10 și hlL-10 cu cadrele de citire deschisă foarte similare (ORF) ale celor 178 de amino acizi, incluzând secvențele principale hidrofobe și care corespund la 73% omologie a aminoacizilor, mlL-10 care este activă asupra celulelor murinice, nu reacționează semnificativ în cruciș, asupra celulelor umane.

HlL-10 este o polipeptidă 18 kDa, căreia îi lipsește carbohidratul detectabil, dar mlL10 este N-glicozilat la porțiunea de lângă N terminus, acesta lipsind din hlL-10. Atât, mlL-10, cât și jlL-10 recombinant (rhlL-10) se exprimă ca homodimeri necovalenți.

Extensia la care mlL-10 sau hlL-10 ca monomeri sunt biologic activi, nu este încă sigură. MlL-10 și hlL-10 cu polipeptidele de “capăt” având cel puțin 8 amino acizi la Nterminus și 21 de amino acizi la C-terminus, nu arată nici o pierdere detectabilă a activității conform publicației Moore și colaboratori, acestea (umane IL-10) fiind prima dată secvențiate de autorul publicației (6). Capetele marcate C și N terminale ale IL-10 în întregime nu

245

250

255

260

265

270

275

280

285

290

RO 118758 Β1 determină în mod necesar schimbări funcționale, deoarece marcarea este ocazională sau incidentală. Numărul mare al posibililor substituții de amino acizi așa cum s-a descris în detaliu în cele ce urmează, poate fi așadar explicat deoarece marcarea tinde să arate funcțiile care lipsesc. MIL-10 și hlL-10 recombinante s-au exprimat ca: celule CDS7, celule mieloma la șoarece, celule ale ovarului de hamster chinezesc, sistemul de exprimare a baculovirusului și Escherichia coli. Activitățile biologice ale acestor proteine rlL-10 sunt în continuare, neremarcabile (6).

Gena mlL-10 cuprinde cinci exoni ordonați peste aproximativ 5,1 kb ale acidului dezoxiribonucleic DNA. Clona genomică însăși cuprinde proteina exprimată mll_-10. Genele mlL-10 și hlL-10 sunt pe cromozomii de șoarece și om, 1 (6,7).

MlL-10 și hlL-10 prezintă DNA puternic și secvența de amino acizi omologă cadrului de citire deschisă în genomul virusului Epstein-Barr, BCRF1 și omologia este încredințată secvenței coding a proteinei mature și nu se detectează în secvența de semnal sau secvențele 5' și 3' netranslatate (5). Din cele trei secvențe, mlL-10 și hlL-10 sunt cele mai apropiate referitor la perechea de secvențe la nivelul DNA (81 %), în timp ce secvențele DNA care codifică proteinele mature hlL-10 și BCRF1, au omologie de 71%. Omologia între hlL10 și B CRF1 este de 84% la nivelul aminoacizilor. Se face ipoteza că genele mlL-10 și hlL10 se dezvoltă dintr-un accesor comun, în timp ce BCRF1 reprezintă un proces ancestral, gena citokina celulară capturată și cea a proteinei BCFR1 fiind constrânse să fie similare cu hlL-10. BCFR1 se exprimă în timpul ciclului litic al EBV. BCFR1 ORF codifică polipeptidă secretată 17 kDA, care, asemănător hlL-10, conține puțin sau deloc glicozilare. BCFR1 prezintă unele activități ale IL-10 și a fost numită IL-10 viral (vlL-10), așadar, activitatea acesteia a fost găsită a fi 10% din hlL-10.

Activitatea IL-10 asupra producției de citokine :

hlL-10 inhibă producția unui număr de citokine, incluzând interferonul - gamma (IFN Y). Factorul alfa de necroză tumorală (TNF-α). Factorul de stimulare a coloniei macrofage de granulocite (GM-CSF)-Granulocitele CSF (G-CSF), IL-1a, IL-1 β, IL-2, IL-6, IL-8 și polipeptida-1 chemotactică monocitară (MCP-1/MCAF), prin macrofage/monocite și/sau T limfocite (4,5). IL-10 inhibă așadar abilitatea monocitelor de a migra ca răspuns la chemokina MCP-1/MCAF (75). în continuare, hlL-10 induce producția unui antagonist receptor al interleukinei -1 naturale, endogene (IRAP)(6), care inhibă IL-1a și IL-1 β prin competiția cu receptorul de legătură. Deoarece, IL-8 este puternic inducibil prin IL-1a și prin IL-1 β, IL-10 exercită parțial efectul său inhibitor asupra producției de IL-8, prin stimularea producției antagonistului receptor IL-1, IRAP. Acest ultim mecanism este de o importanță considerabilă pentru prezenta invenție, așa cum se va descrie și exemplifica în cele ce urmează. IRAP are activități anti-inflamatorii (9) și efectul său terapeutic a fost sugerat în artrita reumatoidă (10). Așadar, IRAP pare a fi efectiv în tratamentul sindromului sepsis și dependent de doză, și un beneficiu de supraviețuire cu 28 de zile, a fost asociată cu tratamentul IRAP (p - 0,015) întrun studiu, de Fisher et al. (11). IRAP poate exercita parțial din efectele sale anti-inflamatorii, prin inhibarea producției de chemokine așa cum ar fi, producția de IL-8.

IL-10 și exprimarea antigenului:

IL-10 inhibă exprimarea clasei II MHC asupra monocitelor umane (8).

D este inhibat prin hlL-10 (12). în plus, monocitele pre-incubate cu IL-10 sunt refractare pentru inducția ulterioară a expresiei clasei II MHC, prin IL-4 sau IFN-gamma. IL10 inhibă exprimarea monocitelor umane după activarea prin LPS (12, 76). BALB/c la șoarece duce la obținerea a 1 până la 10 mg de IL-10 concomitent cu doza letală a LPS, care se protejează de deces (6). IL-10 inhibă intermediarii de nitrogen și anionii superoxizilor. IL-10 inhibă așadar intermediarul nitrogenului reactiv (NO) ca și intermediarii cu oxigen reactiv (H₂O₂, prin macrofage, după activare prin IFN - γ (13).

R0118758 Β1

345

IL-10 și activitatea celulelor T:

IL-10 are așadar efecte modulatoare asupra funcțiilor/activității celulelor T.

Astfel, hlL-10 este un factor chemotactic puternic față de limfocitele CD8 + T, în timp ce hlL10 nu prezintă chemotaxis față de celulele CD4 + T (14). Adițional, IL-10 suprimă capacitatea celulelor CD4+ T la răspunsul semnalelor chemotactice ale beta-chemokinei RANTES, ca și ale alfa-chemokinei IL-8. Așadar, hlL-10 inhibă direct proliferarea celulelor T sanghine periferice umane și a clonelor celulare CD4 + T (14).

IL-10 și limfocitele B:

hlL-10 costimulează proliferarea limfocitelor B induse prin suprafața Ig de legare în cruciș cu anticorpul anti-lgM imobilizat și acest efect este crescut atunci când celulele B sunt stimulate prin legarea în cruciș a antigenului CD40 cu anticorpul anti-CD40 și cu celulele L la șoarece exprimând Fc γ RII/CD 32 uman (15). Efectul IL-10 asupra proliferării și diferențierii celulelor B umane activate sugerează că această citokină poate lua în considerație mult din abilitatea superioară a celulelor T exprimând hlL-10 pentru a furniza ajutor în răspunsurile celulelor B.

IL-10 ca factor homeostatic pentru sistemul imunitar:

Consecințele fiziologice ale funcțiilor IL-10 menționate mai sus, se cred a fi un anumit grad de homeostazie asupra sistemului imunitar. Astfel, IL-10 inhibă clar funcțiile helper T celulare și probabil stimulează celulele T cu funcții supresoare. De aceea, asemănător IL-4, se crede că IL-10 reglează echilibrul între profilul citokinelor Th1 și Th2 ale celulelor T. Se crede în special că, IL-10 inhibă diferențierea celulelor Th1. Deoarece, celulele Th1 sunt caracterizate prin producția de citokine (IFN-gamma și IL2) care favorizează răspunsurile imunitare mediate de celule și celulele Th2 produc citokine (IL-4, IL-5 și IL-10) care favorizează răspunsul umoral și suprimă răspunsul imunitar mediat de celule, IL-10 suprimă în mod asemănător reacția imunitară mediată de celulele T, prin întârzierea reacțiilor tipului de hipersensibilitate, favorizând însă răspunsurile umorale.

Ca o consecință a caracteristicilor IL-10 menționate mai sus, activitatea IL-10 a fost descrisă ca inhibitor de macrofage și de sinteză a citokinei Th1. Deoarece s-a studiat dacă lipsa producției de IL-10 și/sau activitate a IL-10 pot juca un rol în maladiile în care creșterea imunoreactivității mediată de celule se crede a juca un rol pentru acea maladie, cum ar fi, în maladiile autoimunitare și în inflamații. Șoarecele tratat cu anticorp anti-IL-10 prezintă un răspuns inflamator puternic la inflamația indusă de monokină, aceștia fiind mult mai susceptibili decesului indus prin șocul septic indus de LPS și reacția inflamatorie mediată de monokină (16). Așadar, prin knock-outul IL-10 la șoarece se dezvoltă spontan reacții inflamatorii similare, la organele interne, cu cele ale colitei ulceroase (17). Adițional, s-a investigat faptul că, dacă IL-10 joacă un rol în diferitele infecții cu paraziți, virale sau micobacteriene și IL-10 arată că joacă un rol patofiziologic în imunopareză, aceasta se datorează infecției cu Schistosoma amnsoni (18). S-a sugerat așadar un rol în infecțiile cu Mycobacterium leprae. Recent, s-a găsit că pacienții cu SIDA cu o prognoză săracă, au un nivel superior de IL-10 în plasmă și s-a sugerat că aceasta contribuie la imunopareză, maladia cunoscută în cazul SIDEI (19).

Considerații terapeutice

Aceste date/rezultate - in vivo - sugerează puternic un rol al IL-10, homeostatic, în controlul inflamației imune amplificat de monokine și mediat de celule și se arată că o gamă largă de aplicații terapeutice ale IL-10 sau ale unui medicament cu activitate asemănătoare

IL-10 în tratamentul acestor maladii, sunt caracterizate prin producția insuficientă sau descrescândă și/sau activitatea insuficientă sau descrescândă a IL-10.

350

355

360

365

370

375

380

385

RO 118758 Β1

Deoarece, substanța prezentei invenții exemplificată prin IT 9302 exercită o activitate asemănătoare IL-10 prin:

1) inducerea producției de IRAP prin monocitele umane;

2) inhibarea spontană a producției de IL-8 prin monocitele umane;

3) inhibarea producției IL-8 stimulată IL-1 beta prin celulele mononucleare sanghine periferice (PBMC);

4) stimularea migrării chemotactice a aCD8+ limfocitelor T umane, dar nu și a limfocitelor CD4+ T umane;

5) desensibilizarea celulelor CD8+ T umane în raport cu migrarea chemotactică indusă de rhlL-10;

6) inhibarea chemotaxisului celular uman CD4+ T mrfisz fr IL-8 și

7) inhibarea chemotaxisului monocitelor umane mediat de MCP-1/MCAF;

8) inducerea producției de IL-4 prin culturi celulare umane, normale CD4+ T;

9) reducerea producției de TNF alfa în reacția leucocitelor mixte umane.

Această polipeptidă și analogii acesteia pot poseda astfel, aceleași posibilități terapeutice ca și hlL-10. Tabelul 3 prezintă unele maladii în care un imunomodulator asemănător 11-10 sau un imunomodulator cu activitate asemănătoare IL-10, poate avea o importanță terapeutică:

Tabelul 3 Câteva maladii în care un imunomodulator cu activitate asemănătoare IL-10, datorită inducției acestuia în producția de IRAP și/sau inhibiției producției de citokine și/sau a activității acesteia, poate avea o importanță terapeutică

Naștere prematură cauzată de infecție sau alte condiții

Artrita reumatoidă

Artrita Lyme

Guta

Sindromul sepsis

Hipertermia

Colita ulcerativă sau enterocolita

Osteoporoza

Citomegalovirusul

Maladiile periodontale

Glomerulonefrita

Inflamația neinfecțioasă, cronică a plămânului (exemplu, sarcoidoza și plămânul fumătorului) Formațiunea granulomatoasă

Fibroza ficatului

Fibroza plămânului

Rejecția transplantului

Maladia de respingere a grefei de organismul gazdă

Leucemia mieloidă cronică

Leucemia mieloidă acută

Alte maladii neoplazice

Astmul bronșic

Diabetul mellitus, tipul I (insulino dependent)

Arterioscleroză/steroscleroză

Psoriazis

Leucemia cronică cu limfocitele B

Imunodeficiență variabilă comună

Efectele secundare utilizând alte modificări ale răspunsului biologic

R0118758 Β1

Coagularea intravasculară diseminată

Scleroza sistemică

Encefalomielita

Inflamația pulmonară Sindromul hiper IgE Enterocolita

Cancerul în dezvoltare și metastaze

Terapia imuno adoptivă

Sindromul distres respirator dobândit Sepsis

Sindromul reperfuziei Inflamația postchirurgicală Transplantarea organelor Alopecia _________ Dezvoltarea nonapeptidei omologe IL-10 cu activitate asemănătoare IL-10

Secvențele parțiale ale hlL-10 având o lungime de 9 amino acizi au fost alese, conform principiului în care secvențele vor poseda omologie superioară între vlL-10 și hlL10, dar și o omologie cu mlL-10 cât mai scăzută posibil. Această strategie se bazează pe faptul că vlL-10 reacționează parțial în cruciș cu hlL-10, în timp ce mlL-10 nu reacționează în cruciș cu hlL-10 (vezi mai sus).

Astfel, secvențele hlL-10 responsabile de anumite activități în organismul uman, pot fi localizate în domeniile în care este o omologie superioară între hlL-10 și vlL-10, dar scăzută față de mlL-10.

Se presupune că polipeptidă de semnal a hlL-10 constă din primii 18 amino acizi. Proteina matură pornește de la amino acidul No. 19 (No.1 în proteina funcțională, care este serina) și proteina totală conține 160 amino acizi. Cu privire la secvențele IL-10 COOHterminale virale și umane și în special la poziția 157 și 159, conținând reziduuri de lizină și arginină, acest domeniu este favorabil pentru a fi responsabil parțial de legătura cu receptorul (fig.1 și 2).

După screeningul diferiților candidați, obținut prin sinteză chimică pentru activitatea asemănătoare IL-10, s-a găsit că nonapeptida sintetică IT 9302 posedă o oarecare activitate imunosupresoare care mimează cu cea a hlL-10 așa cum se va descrie mai departe în exemplele care urmează. IT 9302 corespunde la secvența nonapeptidei de la capătul terminal C al hlL-10 cu următoarea secvență de amino acizi:

NHj-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asn-COOH (Secvența ID No.1)IT 9302 are omologie 100% cu un segment al hlL-10 corespunzător la amino acizii No. 152 până la 160 la capătul terminal C. Mai mult decât atât, această secvență de polipeptidă are 6 amino acizi în comun cu virusul vlL-10 în aria corespunzătoare, așa cum se vede în fig. 1 și 2, ceea ce înseamnă că 6 din 9 sau 66% din amino acizi sunt omologi, așa cum s-a definit aici și 4 amino acizi în comun cu mlL-10, de exemplu, 4 din 9 sau 44%. Această nonapeptida este numai secvența obținută sau derivată de la hlL-10 și examinată până în prezent, care are proprietăți speciale demonstrate în exemple. Până la contemplarea prin prezenții inventatori, nimeni n-a marcat această secvență ca un domeniu funcțional.

în aspectul cel mai larg al prezentei invenții, se face referire la substanța care prezintă o activitate agonistă hlL-10, substanța fiind diferită de interleuklina 10 umană, care are una sau mai multe dintre proprietățile următoare:

a) induce inhibiția producției spontane de IL-8, prin monocitele umane,

b) induce inhibiția producției de IL-8 indusă de IL-1 beta, prin celulele mononucleare sanghine periferice umane (PBMC),

440

445

450

455

460

465

470

475

480

485

RO 118758 Β1

c) induce producția proteinei antagoniste receptorului interleukinei -1 (IRAP) prin monocitele umane,

d) induce migrarea chemotactică a limfocitelor CD8+ T umane in vitro,

e) desensibilizează celulele CD8+ T umane rezultând o insensibilitate față de rhlL-10,

f) suprimarea răspunsului chemotactic al limfocitelor CD4' T umane față de IL-8,

g) suprimarea răspunsului chemotactic al monocitelor umane față de MCAF/MCP-1,

h) nu inhibă clasa II MHC de molecule ca expresie a monocitelor umane, în contrast cu IL-10 uman,

i) induce producția de IL-4 prin cultura celulelor CD4' T umane, normale,

j) reduce producția TNF alfa în reacția leucocitelor mixte, umane.

Printre aceste activități, d) până la g) sunt considerate unice.

O întruchipare importantă a prezentei invenții este substanța care prezintă o activitate agonistă hlL-10 așa cum s-a definit mai înainte, și care cuprinde secvența de amino acizi Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys, Ile-Arg-Asn sau un analaog sau variant al acestei secvențe.

Această secvență și toate celelalte secvențe de polipeptide din prezenta specificație și din revendicări, atunci când nu este specificat, sunt scrise de la N-terminal la capătul Cterminal în format convențional.

Nonapeptida IT 9302 este foarte puternică pentru a induce diferitele funcții și este foarte stabilă și se presupune că nu poate fi cuplată incorect la receptori. O nonapeptidă a fost aleasă deoarece, în general, o polipeptidă cu 9 amino acizi este o secvență unică pentru o proteină. Cu toate acestea, este de notat că cei 6 amino acizi la același capăt al hlL-10, par a fi cei mai importanți. Conform scopului prezentei invenții este deci substanța sau polipeptida cuprinzând o subsecvență a secvenței de amino acizi Ala-Tyr-Met-Thr-Met-LysIle-Arg-Asn (secvența ID No.1).

Se consideră în mod asemănător că prin unele substituiri de amino acizi, nu se obțin efecte adverse privind activitatea agonistă hlL-10 așa cum se definește aici, atât timp cât treonina, lizină și arginina sunt prezente și având un amino acid plasat între acestea.

Un aspect al acestei invenții este acela prin care se face referire la polipeptidă având formula următoare:

Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆(Secvența ID No.19), în care: X₄ și Xg sunt independent selectați dintr-o grupare care constă din Met, Ile, Leu și Val și X₆ este selectat dintr-o grupă care constă din Asn, Asp, Gin și Glu, cu condiția ca polipeptida să nu fie Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asn.

Potrivit altui aspect, prezenta invenție face referire la o polipeptidă având formula următoare:

X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆(Secvența ID No.20), în care: X,, X* și Xg sunt independent selectați dintr-o grupare care constă din Met, Ile, Leu și Val și X₆ este selectat dintr-o grupare care constă din Asn, Asp, Gin și Glu.

Conform unui alt aspect prezenta invenție se referă la polipeptide având formula următoare:

X₂-X₃-Thr-X₄-Lys-Xg-Arg-X₆(Secvența ID 9.21), în care: X₂ este Tyr sau Phe,

X₃,X₄ și Xg sunt independent selectați dintr-o grupare care constă din: Met, Ile, Leu și Val și X₆ este selectat dintr-o grupare care constă din Asn, Asp, Gin și Glu.

Variantele preferate ale prezentei invenții sunt polipeptidele având formula următoare:

X^X^Xa-Thr-X^Lys-Xg-Arg-XgțSecvența ID No.9.22), în care: X, este Ala sau Gly,

X₂ este Tyr sau Phe, X₃, X₄ și Xg sunt independent selectați dintr-o grupare care constă din

Met, Ile, Leu și Val și X₆ este selectat dintr-o grupare care constă din Asn, Asp, Gin și Glu.

R0118758 Β1

Variantele preferate ale prezentei invenții sunt polipetidele având următoarea formulă:

X₁-X₂-X₃-Thr-X₄-Lys-X₅-Arg-X₆(SecvențalDNo.9.22),încare: X| este Ala sau 535 Gly, X₂ este Tyr sau Phe, X₃, X, și Xg sunt independent selectați dintr-o grupare care constă din Met, Ile, Leu X₆ este selectat dintr-o grupare care constă din Asn, Asp, Gin și Glu.

Prezenta invenție se referă astfel la o substanță sau la o polipeptidă care cuprinde o secvență de amino acizi așa cum s-a definit mai sus, cu condiția ca substanța sau polipeptida să nu fie IL-10 uman. 540

Exemplele de polipeptide specifice care sunt presupuse ca având activitate agonistică hlL-10 așa cum s-a definit mai sus, sunt următoarele:

1. NHo-Ala-Tvr-Met-Thr-lle-Lvs-Met-Arq-Asn-COOH (Secvența ID No.2);

2. NHo-Ala-Phe-Met-Thr-Leu-Lvs-Leu-Arq-Asn-COOH (Secvența ID No.3);

3. NH,-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arq-Glu-COOH (Secvența ID No.4); 545

4. NH₂-Gly-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp-COOH (Secvența ID No.5);

5. NH₂-Ala-Phe-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp-COOH (Secvența ID No.6);

6. NH₂-Ala-Tyr-lle-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp-COOH (Secvența ID No.7);

7. NH₂-Ala-Tyr-Leu-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp-COOH (Secvența ID No.8);

8. NH₂-Ala-Tyr-Val-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp-COOH (Secvența ID No.9); 550

9. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-lle-Lys-lle-Arg-Asp-COOH (Secvența ID No.10);

10. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Leu-Lys-lle-Arg-Asp-COOH (Secvența ID No.11);

11. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Val-Lys-lle-Arg-Asp-COOH (Secvența ID No.12);

12. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp-COOH (Secvența ID No.13);

13. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Met-Arg-Asp-COOH (Secvența ID No.14); 555

14. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Asp-COOH (Secvența ID No.15);

15. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Gln-COOH (Secvența ID No.16);

16. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Glu-COOH (Secvența ID No.17). Pentru comparație, o altă nonapeptidă numită IT 9301 100% omologie la o secvență a hlL-10 a fost sintetizată. Această polipeptidă, IT 9301, corespunde la o secvență de 560 nonapeptidă plecând de la N-terminatul hlL-10 (aminoacizi No.19 până la 27, de exemplu, primii 9 amino acizi ai proteinei mature) având următoarea secvență de aminoacizi: NH₂-Ser-Pro-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Ser-Gly-COOH (Secvența ID No.18).

Această polipeptidă arată că nu există nici o activitate asemănătoare IL-10, utilizând tehnicile descrise în continuare și aceasta s-a ales, deoarece se află la alt capăt al hlL-10 565 servind mai mult pentru controlul rezultatelor negative. Aceasta nu are caracteristicile secvenței C terminale cu privire la omologia secvenței vlL-10, fiind favorabilă pentru amino acizii de legare la receptor. Secvența IT9301 a fost testată în sistemul celular mononuclear sanguin periferic inclus la IL-beta, pentru producția de IL-8, dar nu are loc nici o inhibiție privind producția II-8 din celule. 570 în conformitate cu prezenta invenție, termenul “substanța invenției, agonistă hlL-10 cuprinde orice compus acceptabil și activ farmaceutic, care este identic sau are structură similară cu IT 9302 și care prezintă acțiuni biologice relevante, similare cu cele ale IT 9302, incluzând derivații IT 9302, în special, sărurile acceptabile farmaceutic, esterii și solvații, ca și conjugații IT 9302 sau derivații IT 9302 incluzând peptido-mimeticele. Cuplarea covalentă 575 a IT 9302 la NH₂-terminal la substanțe suport corespunzătoare, de exemplu, polietilenglicolul sau zahărul, care ar putea mări perioada de înjumătățire a polipeptidei in vivo.

în prezentul text, sunt utilizate următoarele definiții:

“Citokina” este un termen general pentru mediatorul proteinaceu eliberat în primul rând, dar nu exclusiv de o populație celulară a unui sistem imunitar ca răspuns la un agent 580 de stimulare specifică, de exemplu, un antigen specific sau un alloantigen sau un activator policlonal specific, de exemplu, o endotoxină sau alte componente ale peretelui celular al bacteriei gram-negative.

RO 118758 Β1 “Limfokina” este termenul general pentru un mediator proteinaceu eliberat de limfocitele sintetizate, ca răspuns la agentul de stimulare, de exemplu, un antigen specific sau un alloantigen sau o limfocită solicitată de activatorul policlonal, de exemplu, o endotoxină sau componentele peretelui celular al bacetriei gram-negativă.

“Interleucina” este termenul general pentru mediatorul proteinaceu eliberat în primul rând, dar nu exclusiv de un macrofag cu celule T, B sau NK, ca răspuns la agentul de stimulare, de exemplu, un antigen specific sau un alloantigen sau de limfocitele solicitate de activatorul policlonal, de exemplu, o endotoxină sau alte componente ale peretelui celular al bacteriei gram-negativă.

“Monokina” este termenul general pentru mediatorul proteinaceu eliberat în primul rând dar nu exclusiv de către un fagocit mono nuclear (de exemplu, un monocit sau un macrofag sau o celulă Kupffer (din ficat) sau celule Langerhans (din piele), ca răspuns la orice agent de stimulare.

“Chemokina” este termenul general pentru un mediator proteinaceu chemotactic și/sau un mediator de activare a leucocitelor, eliberat în primul rând, dar nu exclusiv, de o populație celulară a sistemului imunitar, cu răspuns la un agent de stimulare specific, de exemplu, un antigen specific sau un alloantigen; sau un activator policlonal, nespecific, de exemplu, o endotoxină sau alte componente ale peretelui celular al bacteriei gram-negative și aparținând la o familie genetică specială, la o familie de gene alfa chemokină sau la o familie de gene beta chemokină.

“Interferonul” este termenul general pentru un mediator proteinaceu antiviral și/sau un mediator de activare a monocitelor, eliberat în primul rând, dar nu exclusiv, de o populație celulară a unui sistem imunitar, ca răspuns la un virus sau la un inductor de interferon, cum ar fi, polinucleotida; în special celulele sistemului imunitar, ca răspuns la un agent de stimulare specific, de exemplu, un antigen specific sau un alloantigen sau un activator policlonal, nespecific, de exemplu, o endotoxină sau alte componente ale peretelui celular al bacteriei gram-negative.

“Factorul de stimulare a coloniei” este termenul general pentru un mediator proteinaceu de stimulare a coloniei, mediator hemastopoietic, eliberat în primul rând, dar nu exclusiv de o populație celulară a sistemului imunitar, ca răspuns la un agent de stimulare specific, de exemplu, un antigen specific sau un alloantigen; sau un activator policlonal, nespecific, de exemplu, o endotoxină sau alte componente ale peretelui celular al bacteriei gram negativă.

“Polipeptidă” așa cum se utilizează aici reprezintă, atât peptidele scurte cu o lungime de cel puțin două reziduuri de aminoacizi și de cel mult 10 reziduuri de amino acizi, oligopeptide (reziduuri de la 11 la 100 amino acizi) și peptide lungi (interpretarea obișnuită a “polipeptidei” fiind, de exemplu, pentru lungimea de mai mult decât 100 reziduuri de amino acizi), ca și proteinele (entitatea funcțională cuprinzând cel puțin o peptidă, oligopeptidă sau polipeptidă care ar putea fi modificată chimic fiind glicozilată, lipidată sau cuprinzând grupări prostatice). Definiția polipeptidelor cuprinde așadar forme native de peptide/proteine umane, ca și proteine recombinante sau peptide recombinante de orice tip al vectorilor de exprimare, care transformă orice fel de organism, și, de asemenea, peptide sintetizate chimic.

O întruchipare a prezentei invenții se referă la o polipeptidă care cuprinde o subsecvență a secvenței de IL-10 uman și care are un grad de omologie la vlL-10 care este de

66% și un grad de omologie la mlL-10 care este de 44%, în special, Secvența ID No.1.

Prin termenul de “omologie” se înțelege identitatea în secvențele de amino acizi, în segmentele a doi sau mai mulți amino acizi atunci când acestea se potrivesc cu identitatea și poziția amino acizilor polipeptidelor.

RO 118758 Β1

635

Termenul de omologie utilizat aici este astfel o măsură de similaritate între două secvențe de amino acizi (sau nucleotide).

Omologia se exprimă ca fracțiune sau procent al amino acizilor (sau bazelor) care se potrivesc, după ce două secvențe (posibil ca lungimi neegale) au fost aliniate. Termenul de aliniament este utilizat în sensul definit (76). în mod obișnuit, două secvențe sunt aliniate prin maximizarea numărului de baze (sau amino acizi) potrivite între cele două secvențe cu inserția unui număr minim de baze “libere” sau “nule” în fiecare secvență pentru a obține o maximă suprapunere.

Termenul de “omolog” este astfel utilizat aici, inter alia, pentru a ilustra gradul de identitate între secvența de amino acizi a polipeptidei date și secvența de amino acizi a IT 9302. Secvența de amino acizi care se compară cu secvența de amino acizi a IT 9302, poate fi dedusă din secvența nucleotidei, cum ar fi, secvența acidului ribonucleic RNA sau a acidului dezoxiribonucleic DNA, de exemplu, cea obținută prin hibridizare, așa cum se va defini mai departe sau poate fi obținută prin metode de secvențare a aminoacizilor, convenționale. Bradul de omologie este, de preferință, determinat pe secvența de amino acizi a polipeptidei mature, de exemplu, fără a se lua în considerație orice secvență principală.

în general, numai regiunile de codificare sunt utilizate atunci când se compară secvențele nucleotidelor în vederea determinării omologiei interne a acestora.

Așadar se contemplează faptul că gradul substanțial de omologie la hlL-10 și vlL-10 este benefic, și este puțin probabil că sub secvențele subsecvenței hlL-10 care arată un grad scăzut de omologie cu vll_-10, de exemplu, de 50%, 55% sau 60%, prezintă, de asemenea, activități agoniste hlL-10 mult mai benefice. Mai mult decât atât, așa cum s-a discutat mai sus, nu se consideră absolut necesar ca gradul de omologie la hlL-10 să fie de 100%. Conform scopului prezentei invenții, sunt deci polipeptidele având un grad de omologie scăzut la hlL-10, de 75%, 80%, 85%, 90% sau 95%, iar cel de 100% fiind preferat.

Astfel de polipeptide pot fi considerate analoge nonapeptidei.

Prin termenul de “un analog sau variantă a acesteia” se înțelege o polipeptidă care nu are exact secvența de amino acizi Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (Secvența ID No.1), dar care are încă “activitate agonistă hlL-10 așa cum s-a definit mai sus.

în general, astfel de polipeptide vor fi acele polipeptide care variază, de exemplu, într-o anumită extindere a compoziției de amino acizi sau de modificări post-translaționale, de exemplu, glicozilarea sau fosforilarea, așa cum se compară cu IT 9302 descrise în exemple.

Termenul de “analog” sau “variant” este astfel utilizat în prezentul context, pentru a indica o proteină sau o polipeptidă având o secvență de amino acizi întrucâtva diferită, dar totuși similară cu secvența de amino acizi a IT 9302, permițând variații minore care să schimbe secvența aminoacizilor, de exemplu, scoaterea de aminoacizi din secvență, mutații directe pe porțiuni, inserții de extra amino acizi sau combinații ale acestora, pentru a genera polipeptide analoge IT 9302.

Mutageneza directă pe porțiuni este o cale convenabilă de substituție a amino acizilor cu efect conservativ și altele, în secvența proteinei native. Alternativ, compușii analogi pot fi preparați prin metode bine cunoscute de sinteză de polipeptide în fază solidă sau în fază lichidă, utilizând cuplări succesive ale aminoacizilor individuali din secvența polipeptidei sau polipeptidă poate fi sintetizată prin cuplarea amino acizilor individuali formând fragmente din secvența polipeptidei, astfel ca, să rezulte polipeptidă dorită.

Termenul de “conservativ” utilizat reprezintă (i) modificări care sunt cât mai conformațional neutral posibile, desemnate pentru a produce schimbări minimale în structura terțiară a polipeptidelor mutanți, în comparație cu proteina nativă și (ii) modificările sunt antigenic neutrale cât mai multe posibile, acestea fiind desemnate pentru a produce schimbări

640

645

650

655

660

665

670

675

680

RO 118758 Β1 minimale în determinanții antigenici ai polipeptidelor mutanți, comparându-se cu proteina nativă. Neutralitatea conformațională este de dorit pentru o activitate biologică de conservare și neutralitatea antigenică este de dorit pentru a se evita activarea răspunsurilor imunogenice la pacienții sau la animalele tratate cu substanța invenției.

Așadar, este dificil de a se selecta cu o absolută siguranță care alternează a fi conformațional neutral sau antigenic neutral, regulele existente în domeniu de specialitate pot fi utilizate pentru a efectua modificările care au probabilitățile cele mai mari de a fi neutral conformaționale sau neutral antigenici, așa cum este menționat în (77) și (78). Câteva din cele mai importante reguli includ (1) înlocuirea reziduurilor hidrofobe care este mai puțin asemănătoare producerii de schimbări în antigenitate, deoarece acestea sunt asemănătoare pentru a fi localizate la interiorul proteinelor, de exemplu Berzofsky (citat mai sus) și Bowie și alții (citați mai sus); (2) înlocuirea reziduurilor similare fizicochimic, de exemplu, reziduurile sinonime, datorită cărora este mai puțin asemănător să se producă schimbări conformâționale, datorită înlocuirii amino acizilor și (3) modificarea secvențelor conservate în timpul dezvoltării poate produce asemănător, efecte conformaționale dăunătoare, deoarece conservarea în timpul dezvoltării sugerează secvențe care pot fi funcțional importante. în plus, față de aceste reguli de bază pentru selectarea secvențelor muteinice, analizele sunt în măsură să confirme activitatea biologică și conformația moleculelor proiectate. Analizele biologice pentru substanțele prezentei invenții sunt descrise mult mai complet în exemplu. Schimbările în conformație, pot fi testate prin cel puțin două analize bine cunoscute: metoda de fixare a microcomplementului, de exemplu (79) și (80) utilizează pe scară largă studii în dezvoltare a structurilor terțiare a proteinelor; și afinitățile pentru definirea anticorpilor monoclonali cu conformație specifică, (81).

O variantă importantă a prezentei invenții se referă la o polipeptidă în care cel puțin un reziduu de aminoacid a fost substituit cu un reziduu diferit de aminoacid și/sau în care cel puțin un reziduu de amino acid a fost scos sau adăugat, rezultând astfel o polipeptidă cuprinzând o secvență de amino acizi fiind diferită de secvența de amino acid sau subsecvența acestei secvențe de amino acid, așa cum se va defini mai departe, dar având în esență o activitate agonistă hlL-10, cum s-a arătat mai sus.

O variantă interesantă a prezentei invenții se referă la o polipeptidă care este un analog și/sau cuprinde cel puțin o parte din polipeptidă conform prezentei invenții, având în total de la 10 până la 100 amino acizi, de exemplu, cel puțin 12 aminoacizi, cel puțin 15 amino acizi, cel puțin 20 de amino acizi sau cel puțin 30 de amino acizi.

într-o variantă preferată a prezentei invenții, substanța sau polipeptidă este utilizată în formă substanțial pură. Pentru a obține aceasta, se poate realiza purificarea polipeptidei. Exemplele utilizate pentru purificarea polipeptidei sunt: (i) imunoprecipitarea sau afinitatea cromatografică cu anticorpi, (ii) afinitatea cromatografică cu un ligand convenabil, (iii) alte procedee cromatografice cum ar fi, filtrarea pe gel, cromatografia cu schimbători de ioni sau cromatografia lichidă de înaltă performanță sau derivații ale oricărei metode de mai sus, (iv) procedee electroforetice cum ar fi, electroforeza pe gel de poliacrilamidă, electroforeza în gel de poliacrilamidă denaturată, electroforeza în gel de agaroză și focalizarea izoelectrică, (v) oricare altă solubilizare specifică și/sau tehnicii de purificare.

în scopul prezentei invenții se află, de asemenea, o secvență de nucleotidă codificând polipeptidă așa cum arătat mai sus, în special, o secvență de nucleotidă codificând o polipeptidă care cuprinde sau care este formată din secvențe de aminoacizi ID No.1, de exemplu, o secvență de nucleotidă cuprinzând secvența GCC TAC ATG ACA ATG AAG

ATA CGA AAC (Secvența ID No.93) sau secvență de nucleotidă codificând o polipeptidă având o secvență a acestei secvențe de aminoacizi. Mai mult decât atât, o secvență de nucleotidă, modificată care diferă de secvența nucleotidei de mai sus în care cel puțin o

R0118758 Β1 nucleotidă a fost scoasă, substituită sau modificată sau cel puțin o nucleotidă adițională a fost inserată astfel ca să rezulte o secvență de nucleotidă care codifică o polipeptidă având o activitâte de agonist al hlL-10, conform scopului prezentei invenții.

în specificația prezentă și revendicări, termenul de “subsec vență” desemnează o secvență care, de preferință, are un număr de cel puțin 18 nucleotide, mult mai preferabil de cel puțin 21 de nucleotide și mult mai preferabil de cel puțin 24 nucleotide.

într-un număr de întruchipări ale invenției, secvența sau un analog al secvenței de nucleotide, conform invenției, va cuprinde cel puțin 27 de nucleotide, cum ar fi, cel puțin 30 de nucleotide sau cel puțin 45 de nucleotide. Polipeptidă codificată de “subsecvență” va fi conform cu cel puțin 1 din criteriile de la a) la g) ca mai sus și/sau “subsecvență” nucleotidei va hibridiza cu secvența nucleotidei cuprinzând secvența ID No. 23 în condiții foarte severe.

Termenul de “severitate puternică” utilizat în conjuncție cu condițiile de hibridizare se află definit în literatură ca fiind de 5 - 10°C sub punctul de topire T_m, conform Sambrook et., 1989, pp.1145-1149.

Termenul de “analog” cu privire la fragmentele de acid de dezoxiboronucleic, conform prezentei invenții, include o secvență de nucleotidă care codifică o polipeptidă identică sau substanțial identică polipeptidei care codifică prin acidul dezoxiboronucleic ca mai sus.

Este bine cunoscut faptul că aceiași amino acizi pot fi codificați de diferiți codoni, utilizarea codonului fiind referitoare, interalia, la preferința organismului referitoare la exprimarea secvenței de nucleotide. Astfel, una sau mai multe nucleotide sau unul sau mai mulți codoni ai fragmentului de acid dezoxiribonucleic DNA, conform prezentei invenții, pot fi schimbați cu alții care prin exprimare au ca rezultat o polipeptidă identică sau substanțial identică cu polipeptidă codificată de fragmentul de acid dezoxiribonucleic DNA, așa cum s-a arătat mai sus.

Mai mult decât atât, termenii de “analog” și “subsecvență” intenționează să permită variații în secvență, cum ar fi, substituția, inserția (incluzând intronii), adiția și rearanjarea uneia sau a mai multor nucleotide, ale căror variații nu au efecte adverse substanțiale asupra activității de agonist hlL-10, privind polipeptidă codificată prin fragmentul DAN sau o subsecvență a acestuia. Invenția include așadar o secvență de nucleotidă care codifică polipeptidă având o subsecvență din secvența de aminoacid, secvența ID No.1. Polipetidele invenției pot fi produse utilizând tehnologia acidului dezoxiribonucleic DNA recombinant. O importantă întruchipare a prezentei invenții se referă la un sistem de exprimare cuprinzând o secvență de nucleotidă, conform prezentei invenții. Conform scopului prezentei invenții, sistemul de exprimare cuprinde așadar o secvență din nucleotidă invenției, cum ar fi, un vector de exprimare replicabilă care conține secvența nucleotidei și care este capabil de a media exprimarea secvenței nucleotidei, cum s-a definit mai sus.

Organismul care este utilizat pentru producția polipeptidei, conform prezentei invenții, poate fi un organism superior, ca de exemplu, un animal sau un organism inferior, ca de exemplu, un microorganism, ca de exemplu Escherichia coli, o drojdie, un protozoar sau celule derivate dintr-un organism multicelular cum este fungusul, celule de insecte, celule din plante, celule de mamifere sau o linie celulară care conține un sistem de exprimare, așa cum s-a definit mai sus.

Făcând abstracție de organismul utilizat, fragmentul de acid dezoxiribonucleic DNA, conform prezentei invenții, este introdus în organism, fie direct sau cu ajutorul unui vector convenabil. Alternativ, polipeptidele pot fi produse în liniile celulare ale mamiferelor prin introducerea fragmentului de acid dezoxiribonucleic DNA sau a unui analog sau subsecvență a acestuia, conform prezentei invenții, fie direct sau cu ajutorul unui vector de exprimare.

Polipeptidele prezentei invenții pot produce așadar prin sinteză chimică, așa cum s-a discutat mai înainte.

730

735

740

745

750

755

760

765

770

775

RO 118758 Β1

Mai mult decât atât, invenția se referă la un vector plasmidă care conține secvența acidului dezoxiribonucleic DNA cu codificarea polipeptidei, conform invenției sau o fuziune de polipeptide, așa cum s-a definit aici. într-o întruchipare, în special, importantă, fragmentul de acid dezoxiribonucleic DNA sau un analog sau o subsecvență a acestuia, conform invenției, sau o fuziune din fragmentul de acid dezoxiribonucleic DNA conform invenției, așa cum s-a definit aici, poate fi purtat de un vector de exprimare replicabilă care este capabil de replicare în organismul gazdă sau în linia celulară.

Vectorul poate fi, în special, o plasmidă, un element de fagocitoză, un cosmid, un minicromozom sau un virus. într-o întruchipare interesantă, conform prezentei invenții, vectorul poate fi un vector care atunci când este introdus în celulele gazdă, este integrat în genomul celulelor gazdă.

Polipeptida produsă așa cum s-a descris mai sus, poate fi supusă la modificări de post-translație sau modificări post-sintetice, ca rezultat al unui tratament termal, a unui tratament chimic (cu formaldehidă, glutaraldehidă, etc.) sau un tratament cu enzime (peptidaze, proteinaze și enzime cu modificări de proteine). Polipeptida poate fi prelucrată pe diferite căi, când se produce într-un organism în comparație cu zona de producție naturală. Ca un exemplu, glicozilarea este adesea obținută atunci când polipeptida se exprimă prin celulele unui organism superior cum ar fi drojdia sau de preferință un mamifer. Glicozilarea este normal obținută în legătură cu reziduurile de amino acizi Asn, Ser, Thr sau hidroxilizina.

Metoda de producere a polipeptidei așa cum s-a definit mai sus, cuprinde următoarele faze:

(a) inserția secvenței de nucleotide, așa cum s-a definit mai sus în vectorul de exprimare, (b) transformarea organismului gazdă convenabil, cu un vector produs în faza (a), (c) dezvoltarea prin cultură a organismului gazdă produs în faza (b), în condiții convenabile, pentru exprimarea polipeptidei, (d) recoltarea polipeptidei și (e) supunerea opțională a polipeptidei la o modificare de post.stație.

Este contemplat faptul că, efectele antagoniste față de hlL-10 sau vlL-10 pot fi obținute, inter alia, utilizând anticorpii legați specific la nonapeptida IT 9302 și că acestea pot fi utilizate în terapie pentru neutralizarea unei concentrații ridicate de IL-10.

într-un alt aspect, prezenta invenție se referă la un anticorp care se leagă specific la polipeptida conform prezentei invenții.

Termenul de “anticorp” se referă la o substanță care este produsă de un mamifer sau mult mai precis, o celulă de origine mamiferă care aparține unui sistem imunitar, ca răspuns la expunerea la antigenul polipeptidei, conform invenției. în prezenta specificație și în revendicări, “un anticorp” este definit ce constând în esență din unitatea de bază a legăturii specifice care cuprinde două catene grele și două catene ușoare. în aspectul cel mai larg, totuși,conceptul de anticorp va include așadar, de exemplu un dimer sau un pentamer, ca unitate de baz.

Domeniul variant al anticorpului este compus din secvențe variabile și constante. Partea variantă a domeniului este denumită un un idiotip al anticorpului. Această parte de anticorp este responsabilă de interacțiunea cu antigen, acesta fiind antigenul de legătură. Această parte a anticorpului este responsabilă de interacțiunea cu antigenul. în prezentul context, termenul de anticorp este înțeles ca o moleculă întreagă de anticorp sau ca fragmente de aceste molecule. Un anticorp poate fi fragmentat în timpul producției /și/ sau după producție. Aceasta se poate realiza în formă fragmentată la început, fiind utilizat ca atare sau după unirea diferitelor fragmente. De un interes special sunt fragmentele de legătură ale anticorpilor prezentei invenții, de exemplu, fragmentele Fab sau fragmentele Fab’.

R0118758 Β1

Structura idiotipică (antigenul de legătură) al anticorpului este antigenică și astfel aceasta poate fi ridicată la nivelul anticorpilor specifici, dirijați față de structura idiotipică. Anticorpii ridicați la nivelul idiotipic se numesc anticorpi anti-idiotipici.

Astfel de anticorpi pot mima structura antigenului original și de aceea pot funcționa ca antigeni originali. Astfel de anticorpi pot fi capabili de substituție a antigenului original pentru o parte din funcții sau pentru toate funcțiile, posibilitatea de utilizare și proprietățile polipeptidei originale conform prezentei invenții.

Anticorpii invenției cuprind anticorpii policlonali, ca și anticorpii monoclonali.

Anticorpul sau fragmentul acestuia pot fi de un fel monospecific (policlonal). Anticorpul monospecific poate fi preparat prin injectarea la un animal convenabil a unui preparat depolipeptidă cu substanță pură, conform prezentei invenții. Aceasta poate fi urmată de una sau mai multe injecții de susținere, la intervale convenabile înainte de sângerare. Animalele sunt însângerate cu aproximativ 5 - 7 zile după fiecare imunizare. Anticorpii pot fi opțional izolați din ser, utilizând tehnici standard de purificare a anticorpilor.

Animalul utilizat pentru prepararea anticorpilor de legătură la polipeptida invenției, sunt selectați de preferință dintr-o grupare care constă din șobolani, maimuțe, oi, capre, șoareci, iepuri, porci, cai și cobai. Celulele producătoare de anticorpi pot fi celulele splenice sau limfocitele sângelui periferic.

Un anticorp monoclonal sau fragmentele acestuia pot fi dezvoltate față de un component esențial al polipeptidei, de exemplu, un epitop.

Anticorpul monoclonal poate fi produs utilizând tehnici convenționale (Kohler și Milstein, 1975) prin utiliazrea unei linii celulare hibridoma sau prin clonele sau subclonele acesteia sau prin celulele care poartă informația genetică din linia celulară hibridoma care produce acest anticorp monoclonal. Anticorpul monoclonal poate fi produs prin fuziunea celulelor care produc acest anticorp monoclonal, cu celule de o linie celulară convenabilă și prin clonizarea celulelor hibridoma rezultate, care produc anticorpul monoclonal.

Alternativ, anticorpul monoclonal poater fi produs prin imortalizarea unei linii celulare nefuzionate care produce acest anticorp monoclonal. Anticorpii monoclonali sunt în cele din urmă recoltați dintr-un mediu de dezvoltare celulară. Celulele hibridoma utilizate pentru obținerea anticorpului monoclonal se pot dezvolta - in vitro - sau într-o cavitate a organismului animal. Anticorpul monoclonal sau fragmentele acestuia pot fi astfel produse utilizând tehnicile recombinante ale acidului dezoxiribonucleic DNA (Huse et al.1989).

Anticorpii monoclonali pot fi, de asemenea, obținuți prin imunizarea animalelor corespunzătoare cu un preparat nepurificat de polipeptidă conform prezentei invenții. Clonele hibridoma rezultate, care secretă anticorpii monoclonali se supun apoi unui screening privind capacitatea lor de legare a polipeptidei (polipeptidelor) sau analogiilor acestora.

Pentru scopuri care nu necesită o specificitate înaltă, anticorpul poate fi un anticorp policlonal. Anticorpii pliclonali pot fi obținuți, de exemplu, așa cum s-a descris de Harboe și Ingild, ca mai sus. Mult mai specific, când anticorpii policlonali trebuie obținuți, polipeptida invenției sau un analog al acesteia este, de preferință, după adiția unui adjuvant convenabil, cum ar fi, de exemplu, un adjuvant Freund complet sau incomplet, injectat într-un animal. Animalele sunt însângerate în mod regulat, de exemplu, la intervale de săptămâni și sângele obținut este separat într-o fracțiune serică care conține anticorpul și, opțional, această fracțiune este supusă unor procedee convenționale suplimentare, pentru purificarea anticorpului și/sau la procedee care cuprind utilizarea polipeptidei purificate sau a analogului acesteia.

Un anticorp poate fi așadar un anticorp anti anti-idiotipic, dirijat față de anticorpul antiidiotipic care este un anticorp dirijat față de porțiunea unui anticorp care este reactiv cu epitopul asupra antigenului. Anticorpul anti-idiotipic poate fi preparat printr-o metodă similară cu cea menționată mai sus, pentru anticorpul monoclonal sau policlonal.

830

835

840

845

850

855

860

865

870

875

RO 118758 Β1

Conform scopului prezentei invenții, anticorpul se leagă la o substanță sau o polipeptidă definită mai sus, în special, un anticorp se leagă în mod specific la o polipeptidă având o secvență de amino-acizi Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asn.

într-un aspect mai larg, invenția se referă la o substanță care este capabilă de neutralizarea uneia sau multor activități ale hlL-10 a) până la j), de exemplu, având o activitate antagonistă hlL-10, ca de exemplu, un anticorp care are aceste proprietăți. Un anticorp monoclonal 19F1 (82) care este capabil de o legătură specifică la IL-10 este cunoscut și acesta poate bloca IL-10 produs endogen, de monocitele LPS simulate. Acest anticorp recunoaște IL-10 nativ, dublat, dar nu este necesar un întreg domeniu funcțional; cu toate acestea, acest anticorp nu se leagă specific la IT 9302.

Conform scopului prezentei invenții se prevede o compoziție farmaceutică cuprinzând o astfel de substanță, ca și o compoziție farmaceutică conținând substanța sau polipeptidă conform prezentei invenții. Un aspect foarte important al invenției se referă la compoziția farmaceutică care conține substanța având o activitate agonistă hlL-10 sau o activitate antagonistă hlL-10 așa cum s-a definit mai sus și un excipient acceptalbil farmaceutic. Compoziția poate cuprinde, de exemplu, o proteină sintetizată purificată sau o polipeptidă recombinantă, purificată, un anticorp monoclonal sau policlonal sau orice altă substanță care îndeplinește criteriile de la a) la j) sau care are o activitate antagonistă hlL-10, fiind capabilă de neutralizarea uneia sau mai multor activități ale hlL-10 de la a) la j).

Substanța antagonistă sau agonistă IL-10 utilizată în prezenta invenție poate fi preparată ca formule în mediu acceptabil farmaceutic, de exemplu, în mediu salin, în mediu salin tamponat cu fostat (PBS), soluție Ringer, soluție salină/dextroză, soluție Hank și glucoză. Compozițiile pot conține substanțe auxiliare acceptabile farmaceutic așa cum se necesită pentru condiții fiziologice asemănătoare, cum sunt agenții de tamponare, agenții de ajustare a tonicității, agenții de umectare, detergenții și alții. Substanțele aditive pot include, de asemenea, ingredientele active adiționale, de exemplu, agenții bactericizi sau agenții de stabilizare. Cantitatea administrată pacientului va fi variabilă dependent de compusul administrat, de scopul administrării, cum ar fi, profilaxie sau terapie, starea pacientului, modul de administrare și altele.

Compozițiile farmaceutice sunt tipic intenționate pentru administrare trans-dermală sau parenterală, de exemplu, administrare intravenoasă, subcutanată sau intramusculară. Formele de administrare orale sunt, de asemenea, dorite și acestea pot fi prevăzute prin modificarea compoziției pentru trecerea prin regiunea stomacală. Compoziția poate fi utilizată pentru tratamentul profilactic și/sau tratamentul terapeutic. De preferință, compozițiile farmaceutice sunt administrate intravenos. Astfel, invenția prevede compoziții care cuprind o substanță antagonistă sau agonistă IL-10, dizolvată sau suspendată într-un vehicul acceptabil, de preferință, un vehicul apos. Aceste compoziții pot fi sterilizate prin tehnici de sterilizare convenționale sau pot fi filtrate steril.

Soluțiile apoase rezultate pot fi ambalate pentru utilizare sau liofilizate, preparatul liofilizat fiind combinat cu un vehicul apos steril, înainte de administrare. Substanța antagonistă sau agonistă IL-10 poate fi așadar administrată ca un agent secundar biologic activ, cum ar fi, de exemplu, un agent standard, chemoterapeutic.

Astfel de agenți includ, fără a se limita la acestea, vincristina, daunorubicina, Lasparagina, mitoxantrona și amsacrina.

în aplicațiile terapeutice, compozițiile farmaceutice sunt administrate la pacient într-o cantitate suficientă pentru a produce efectul dorit, definită ca “doză efectivă terapeutic”.

Doza efectivă terapeutic de antagonist sau agonist IL-10 va fi variabilă, de exemplu, dependent de utilizarea specială pentru care se efectuează tratamentul, modul de administrare, starea de sănătate și condiția pacientului și discernământul medicului care prescrie

R0118758 Β1 medicamentul. De exemplu, o doză pentru perfuzie continuă va fi tipic de ordinul a aproximativ 500 ng până la aproximativ 800 pg pe zi, pentru un pacient de 70 kg, de preferință, de la aproximativ 10 pg și până la aproximativ 300 pg. Doza va fi cuprinsă tipic între 700 ng/kg/zi și 16 Mg/kg/zi.

Concentrația de antagonist sau agonist IL-10 în formulele farmaceutice poate varia pe scară largă, de exemplu, de la aproximativ 10 pg până la aproximativ 5 mg/ml, de preferință, între aproximativ 100 pg și aproximativ 2 mg/ml. Concentrația va fi în mod obișnuit selectată în primul rând din volume fluide, viscozități fluide, etc, conform cu modul special de administrare, selectat. Astfel, o compoziție tipic farmaceutică pentru perfuzie intravenoasă poate fi preparată astfel ca să conțină 250 ml soluție salină de dextroză și 2,5 mg de substanță antagonistă sau agonistă IL-10.

Pentru compozițiile solide, se pot utiliza vehicule solide, netoxice, convenționale, care includ, de exemplu, categorii farmaceutice de manitol, lactoză, amidon, stearat de magneziu, zaharină sodică, talc, celuloză, glucoză, sucroză, carbonat de magneziu și altele.

Pentru administrarea orală, o compoziție farmaceutică, acceptabilă, netoxică, este formată prin încorporarea excipientelor normal utilizate, cum ar fi, vehiculele menționate mai sus și în general 10-95% din ingredientul activ, care este substanța antagonistă sau agonistă IL-10, de preferință, de 25-75%.

Pentru administrare sub formă de aerosoli, substanța antagonistă sau agonistă IL-10 este, de preferință, utilizată în formă fin divizată la un loc cu un agent tensioactiv și un propulsor. Procentajele tipice de antagoniști și agoniști IL-10 sunt de 0,01 - 20% în greutate, de preferință, de la 1 -10%. Agentul tensioactiv trebuie desigur să fie netoxic și, de preferință, solubil în propulsor. Ca stfel de agenți reprezentativi sunt esterii sau esterii parțiali ai acizilor grași conținând de la 6 la 22 atomi de carbon, cum ar fi, de exemplu, acizii caproic, octanoic, lauric, palmitic, stearic, linoleic, linolenic, olesteric și oleic, cu alcooli polihidrici alifatici sau cu anhidridele ciclice ale acestora, de exemplu, anhidridele ca: etilen glicol, glicerol, eritritol, arbitol, manitol, sorbitol, hexitol derivate de sorbitol și derivații de polioxietilen și derivații de polioxipropilen ai acestor esteri. Se pot utiliza, de asemenea, și amestecuri de esteri cum ar fi, gliceride naturale sau în amestec.

Agentul tensioactiv poate constitui 0,1-20% în greutate din compoziție, de preferință, 0,25-5%. Echilibrul compoziției este de obicei propulsorul. Propulsoarele lichefiate sunt gaze tipice în condiții ambiante și sunt condensate sub presiune. Printre propulsorii lichefiați convenabili sunt alcanele inferioare conținând peste 5 atomi de carbon, cum ar fi, de exemplu, butanul și propanul și, de preferință, se utilizează compușii fluorurați și fluoroclorurați.

Amestecurile compușilor de mai sus pot fi, de asemenea, utilizate.

Pentru obținerea aerosolilor, un conteiner prevăzut cu o valvă corespunzătoare este umplut cu un propulsor convenabil, conținând polipeptida (polipeptidele) fin divizate și agentul tensioactiv.lngredientele sunt astfel menținute la o presiune ridicată, până când sunt eliberate sub acțiunea valvei.

Pentru mărirea perioadei de înjumătățire a aerului, substanța antagonistă sau agonistă IL-10 trebuie să fie încapsulată, introdusă în lumeul lipozomilor, preparată ca un coloid, sau se pot utiliza alte tehnici convenționale care pot determina o prelungire a timpului de viață a polipeptidelor. Astfel, în anumite întruchipări, substanța antagonist sau agonist IL-10 poate fi încapsulată într-un lipozom. O varietate de metode sunt convenabile pentru prepararea lipozomilor, așa cum se descrie, de exemplu, în (83), (84), (85) și (86). O întruchipare importantă a prezentei invenții se referă astfel, la utilizarea unei substanșe pentru diminuarea sau neutralizarea concentrației ridicate a hlL-10 și/sau hlL-10, cum ar fi utilizarea unei substanțe având proprietăți antagonistice hlL-10, pentru prepararea compoziției farmaceutice pentru tratamentul sau profilaxia cancerului de ovar și/sau al SIDEI (87,19).

930

935

940

945

950

955

960

965

970

RO 118758 Β1

Scopul prezentei invenții este, de asemenea, o metodă de tratament și/sau prevenirea cancerului de ovar și/sau pentru SIA și această metodă cuprinde administrarea la un pacient care necesită aceasta, a unei cantități efective profilactic sau terapeutic, din substanța antagonistă hlL-10, ca și utilizarea unui compus care are o activitate antagonistă hlL-10 pentru prepararea compoziției farmaceutice, utilizată în tratamentul sau profilaxia cancerului de ovar și/sau SIDA.

Utilizarea substanței conform prezentei invenții în conformitate cu prezenta invenție, s-a găsit, așa cum s-a descris mai sus, că IT 9302 și analogii și variații acestuia sunt utilizați pentru efectele de prevenire ale citokinelor cunoscute a fi patogenetic implicate în condițiile patologice descrise mai sus. De aceea, potențialele terapiei prin utilizarea polipeptidei prezentei invenții sau analaogilor sau derivaților acesteia sunt contemplate și se vor investiga în toate maladiile în care efectul terapeutic al hlL-10 și/sau IRAP, este așteptat (vezi tabelul 3 mai sus).

Substanța sau polipeptidă, conform invenției, se utilizează pentru tratamentul sau profilaxia uneia sau a mai multor maladii menționate în tabelul 3, pentru utilizarea unei substanțe sau polipeptide, conform prezentei invenții, pentru prepararea compoziției farmaceutice utilizate în tratamentul sau profilaxia unei maladii sau a mai multor maladii menționate în tabelul 3, ca și metoda de tratament și/sau prevenire a unei maladii sau a mai multor maladii menționate în tabelul 3, metoda cuprinzând administrarea la un pacient care are nevoie, a unei cantități efective terapeutic sau profilactic din substanța sau polipeptidă, conform prezentei invenții.

Un aspect important al prezentei invenții este așadar utilizarea IT 9302 sau a unui derivat funcțional al acestuia, pentru prepararea unei compoziții farmaceutice, pentru inhibiția substanțială a efectului biologic la om, referitor la citokina, ca de exemplu, limfokină, interleukina, monokină, chemokina, interferonul, factorul de stimulare a dezvoltării coloniei, prostaglandina și/sau leucotriena, pentru profilaxia sau tratamentul unei condiții referitoare la o tulburare a sistemului citokinei, cum ar fi, limfokină, interleukina, monokină, chemokina, interferonul sau sistemul factorilor de stimulare a dezvoltării coloniei și/sau o tulburare în sistemul prostaglandinei și/sau leukotrienei. Așa cum se utilizează aici, termenul de “compoziție farmaceutică” cuprinde orice compoziție convenabilă pentru utilizare umană, așa cum s-a descris mai sus, în detaliu.

Invenția se referă, în special, la utilizarea IT 9302 sau a derivatului funcțional al acestuia:

- pentru inhibarea substanțială a efectului biologic la om, legat de citokina pentru profilaxia sau tratamentul unei condiții referitoare la o tulburare a sistemului citokinei și/sau

- pentru inhibiția substanțială a efectului biologic la om, în legătură cu citokina, limfokină, pentru profilaxia sau tratamentul unei condiții referitoare la o tulburare a sistemului limfokinei și/sau

- pentru inhibiția substanțială a efectului biologic la om, în legătură cu interleukina pentru profilaxia sau tratamentul unei condiții referitoare la o tulburare a sistemului interleukinei și/sau

- pentru inhibiția substanțială a efectului biologic la om, în legătură cu monokină, pentru profilaxia sau tratamentul unei condiții referitoare la o tulburare a sistemului monokinei; și/sau

- pentru inhibiția substanțială a efectului biologic la om, în legătură cu chemokina, pentru profilaxia sau tratamentul unei condiții referitoare la o tulburare a sistemului chemokinei; și/sau

- pentru inhibiția substanțială a efectului biologic la om, în legătură cu limfokină, pentru profilaxia sau tratamentul unei condiții referitoare la o tulburare a sistemului limfokinei; și/sau

R0118758 Β1

1025

- pentru inhibiția substanțială a efectului biologic la om, în legătură cu interferonul, pentru profilaxia sau tratamentul unei condiții referitoare la o tulburare a sistemului interferdnului și/sau

- pentru inhibiția substanțială a efectului biologic la om, în legătură cu factorul de stimulare a dezvoltării coloniei, pentru profilaxia sau tratamentul unei condiții referitoare la o tulburare a sistemului factorului de stimulare a dezvoltării coloniei și/sau

- pentru inhibiția substanțială a efectului biologic la om, în legătură cu prostaglandina, pentru profilaxia sau tratamentul unei condiții referitoare la o tulburare a sistemului prostaglandinei; și/sau

- pentru inhibiția substanțială a efectului biologic la om, în legătură cu leukotriena, pentru profilaxia sau tratamentul unei condiții referitoare la o tulburare a sistemului leukotrienei.

- fig. 1, prezintă o comparație a secvențelor de amino acizi prevăzute pentru mlL-10, hlL-10 și BCRF1. Identitățile secvenței de amino acizi sunt indicate prin linii verticale;

-fig.2, prezintă secvențele de polipeptide cu COOH terminal, ale IL-10, incluzând 9 amino acizi și comparând proteinele de la porcine, om, BCRF1 și șoarece;

- fig.3, prin monocitele umane în culturi purificate;

- fig.4, este o diagramă arătând că IT 9302 inhibă producția de IL-8 lângă mililitru, indusă de IL-1, de către celulele mononucleare sanghine, periferice, umane;

- fig.5, ilustrează producția de IRAP prin monocitele umane stimulate de IT 9302;

- fig.6, ilustrează producția de IRAP prin monocitele umane stimulate de IL-10;

- fig.7, ilustrează activitatea chemotactică a IT 92302 asupra celulelor CD8+T;

- fig.8, ilustrează desensibilizarea celulelor DC8 + T, prin IT 9302, rezultând în insensibilizarea celulelor CD8+T față de chemotaxisul indus de IL-0 (10 ng/ml);

- fig.9, ilustrează suprimarea activității IL-8 prin IT 9302;

- fig.10, este o diagramă arătând că IT 9302 inhibă chemotaxisul monocitar indus de MCAF/MCP-1;

- fig.11, arată producția IL-4 în fracțiunile citosolice a celulelor CD4 + T, prin absorbția ECL-Western;

- fig. 12, arată producția de TNF-alfa în fracțiunile citosolice în cultura de limfocite mixte umane, prin absorbția ECL-Estern.

Absorbția Western a TNF-alfa a fost efectuată așa cum s-a descris cu IL-4, în materiale și metode, dar utilizând un anticorp TNF.alfa antiuman de iepure (Pepro Tech.lnc., London, England) și un anticorp secundar cu peroxidază marcată, din hrean (Cat, no. P 217, Dako, Denmark);

- fig. 13, arată că șocul indus de LPS și leukopenia sunt modulate de IT 9302, prin numărul total de leucocite.

Materiale și metode

Citokine și chemoatractanți. HIL-10 recombinant se obține de la Prepro Tech.Inc.NJ. (Cat.No.200 10). HIL-1 beta recombinant și hil-8 recombinant au fost un fel de donație de la Company Pharmaceutical Dainippon, Osaka, Japan. Mediul de cultură a fost RPMI 1640 GIBCO, LPS liber conform analizei Lizat de Amoebocite Limulus (Sigma E-TOXATE Kit Cat.No.210-AI), rhMCAF/MCP-1 a fost la fel o donație de la profesorul Kouji Matsushima, Kanazawa, Japan.

Analiza chemotaxis leucocitară, Chemotaxis T celular

Subsortimentele de limfocite T CD4+ și CD8+ caracterizate prin exprimarea antigenilor CD4 sau CD8, se purifică din sângele heparinizat al donorilor normali. Astfel, celulele mononucleare sanghine periferice (PBMC) sunt purificate din sângele heparinizat, prin diluarea a 100 ml de sânge, cu o soluție salină echilibrată de tip Hank (HBSS) 1:1 și apoi

1030

1035

1040

1045

1050

1055

1060

1065

1070

RO 118758 Β1 straturile se separă pe Lymphopac™ (Nycomed Pharma, Oslo, Norway) și celulele se centrifughează în gradient la 2000 rot/min, timp de 20 min. Celulele mononucleare se spală apoi de trei ori în soluție HBSS și peletele celulare se diluează în 4 ml de soluție HPSS conținând 1% ser de vițel fetal și apoi, se sortează la temperatura de 4°C, utilizând Dynabeads acoperit cu anticorpi monoclonali față de antigenul CD4 sau CD8 (Dynabeads M-450 CD4 Cat.No.111,16, Dynabeads M-450 CD8 Cat.No.111,08, DETACHaBEAD Cat.No.125, 04).

Raportul granulă: celulă este de 10:1 și timpul de incubare este de o oră. Granulele sunt apoi desprinse prin adăugare de anticorpi policlonali anti-șoarece, conform instrucțiunilor de preparare.

Analiza chemotaxus este o tehnică în cameră micro cu 48 de concavități (Neuroprobe, Rockville, MD) așa cum s-a descris mai înainte (74; vezi referința 3 și referința 14). Chemoatractanții se diluează în RPM11640 (GIBCO Cat.No.61870-010) cu 1% ser steril de vițel fetal, filtrat și plasat în camera inferioară de 25 μΙ. în cazul determinării chemotaxisului celulelor T, celulele T (5 x 10⁶/ml) sunt suspendate în mediu și 50 μΙ se plasează în camera superioară, separate de camera inferioară printr-un filtru de 5 μπι dimensiunea porilor, de policarbonat, fără polivinilpirolidonă (Nucelopore Corp., Pleasanton, CA) acoperit cu colagen de tip II (Sigma No.C 0543). Celulele sunt lăsate să migreze timp de 2 h la temperatura de 37°C la 5% CO₂. Filtrele sunt apoi îndepărtate cu atenție, fixate în metanol 70% și colorate timp de 5 min în Coomassie’s Brilliant Blue. Celulele atașate la suprafața inferioară a filtrului, sunt numărate prin măsurarea suprafețelor, utilizând o cameră video cu microscop conectat la un sistem computer pentru analiza digitală și având un suport de produs moale, pentru determinarea obiectivului de migrare chemotactică. Aproximativ 5% din celulele T vor migra spontan corespunzător celulelor, între 12000 și 13000 de celule; aceasta poate varia de la o zi la alta, dar foarte puțin în experimentele efectuate în aceeași zi.

Așa cum s-a descris mai înainte (referințele 3 și 14), s-a ales raportarea rezultatelor ca raportul între numărul celulelor care migrează în probă și în controlul negativ, care reflectă migrarea spotană. Acest raport se referă la indicele chemotactic (Cl).

Toate probele sunt analizate în triplicat și migrarea celulelor în care cavitate, este măsurată în trei zone înainte ca valoarea medie să fie estimată pentru acea suprafață. în unele experimente, membrana chemotaxie nu este acoperită cu colagen și în prezent sistemul de analiză a celulelor care migrează va fi adus la partea inferioară a cavității în camera chemotaxis.

într-un experiment, activitatea chemotactică a IT 9302 a celulelor CD8+ T a fost desfășurată prin diluții de testare în serie cu IT 9302 adăugate camerei inferioare și evaluarea chemotaxisului s-a realizat așa cum s-a descris mai sus.

în cel de-al doilea experiment, abilitatea IT 9302 de a desensibiliza migrarea celulelor CD8+ T ca răspuns la rhlL-10 (10 ng/ml) a fost studiată prin adăugarea IT 9302 la celulele țintă, cu 30 min înainte de chemotaxis. IT 9302 se adaugă în concentrații seriale și răspunsul chemotactic al rhlL-10 este evaluat ca mai sus.

în cel de-al treilea experiment, abilitatea IT 9302 de suprimare a răspunsului chemotactic, al celulelor CD4+ T față de rhlL-8 (10/ng/ml), s-a studiat prin adăugarea IT 9302, la celulele țintă cu 30 min înaintea efectuării analizei chemotaxis. IT 9302 se adaugă în concentrații seriale și răspunsul chemotactic al rhlL-8 a fost evaluat așa cum s-a descris mai înainte.

Chemotaxisul monocitelor

Chhemotaxisul monocitelor este măsurat utilizând aceeași cameră Boyden cu echipamentul descris pentru celulele T, ca mai sus.

RO 118758 Β1

1125

Chemoatractantul MCAF/MCP-1 se diluează în mediul de RPM1 1640, cu 0,5% PSA și se adaugă în camera inferioară la o concentrație de 10 ng/ml. Monocitele, purificate printro tehnică standard de aderență plastică, de la PBMC uman normal, obținut așa cum s-a descris mai sus, sunt suspendate în mediul de RPMI 1640 cu 0,5% BSA și apoi sunt incubate timp de 30 min în prezența IT 9302, la diferite concentrații. în mod suplimentar, celulele sunt adăugate în camera chemotaxis superioară, la o concentrație de LO⁶ celule/ml. Camerele superioară și inferioară sunt separate printr-un filtru de polivinil policarbonat fără pirolidonă, având dimensiunea porilor de 8 Mm. (Nucleopore, Pleasanton, CA). Camera a fost incubată la temperatura de 37°C, timp de 90 min. Membranele conținând celulele care migrează, sunt tratate așa cum s-a descris mai sus și indicele chemotactic a fost calculat conform tehnicii de mai sus.

Producția celulelor mononucleare periferice umane, normele de IL-8 (IPMC)

IPMC se purifică din sângele heparinizat al donatorului uman, normal. Prin centrifugarea în gradient cu Lymphoprep™ (Nycomed Pharma, Oslo, Norway), celulele mononucleare sunt diluate la 2 x 10⁶ celule/ml în mediul RPMI 1640, fără LPS (Gibco Cat.No.6187-010) conținând 1% ser de vițel fetal inactivat la cald, filtrat steril și penicilină (10,000 IE/ml=, streptomicină (10 mg/ml) și gentamicină (2,5 mg/ml). Celulele sunt cultivate pe plăci Micro Nune având 24 de cavități (Nune, Danmark) și în prezența unor concentrații diferite de IT 9302 (0 Mg, 100 Mg, 10 ng, 1 ng, 0,1 ng, 0,01 ng/ml), timp de 24 h. După incubarea timp de 24 h, se adaugă încă o dată o doză de IT 9302 și apoi după o oră, se adaugă r-hlL-1 β (1 ng/ml), la culturile celulare. După o perioadă totală de incubare de 48 h, se colectează supernatanții și concentrația de IL-8 secretat, se măsoară prin ELISA IL-8, prin utilizarea kitului ELISA IL-8 (Dainippon Pharmaceutical Co.Ltd.Osaka, KâJapan).

Pe scurt, supernatanții celulari și standard sunt incubați timp de o oră și se reproduc la temperaturi de 20°C pe o micro-placă sub agitare. Apoi, după spălare, se adaugă timp de o oră, un al doilea anticorp, după care urmează o oră de incubație cu peroxidază marcată IgG anti-iepure, de capră. După spălare, reacția este dezvoltată cu O-fenilendiamină. După 30 min, reacția este oprită cu acid sulfuric 1,6 N. Densitatea optică (OD) este măsurată în sistem ELISA cu citire la 490 nm. Concentrația de IL-8 este calculată prin curba de calibrare a absorbanței pentru concentrații vs necunoscute de IL-8 standard.

Determinarea concentrației IRAP *

PBMC se purifică așa cum s-a descris mai sus, PBMC se cultivă în RMPI 1640 în 10% ser de vițel fetal, steril, inactivat la cald (incluzând penicilină 10000 ΙΕ/ml, streptomicină 10 mg/ml, gentamicină 2,5 ml/ml), concentrația celulară fiind de 5 x 10® celule/ml. Monocitele sunt apoi purificate prin tehnica standard de aderență plastică. Monocitele sunt apoi cultivate în RPMI 1640 cu 2% FCS (2,5 x 10® celule/ml) și cu diluții diferite de rhlL-10 sau IT 9302. Celulele sunt stimulate pentru 24 h și supernatanții se colectează pentru determinarea IRAP. Se efectuează analiza ELISA a IRAP, utilizând kituri de imunoanaliză Quantikin IL-Ira umane, de la R & D Systems Europe Ltd. (Cat.No.DRA 00, Abingdon, Oxon, UK).

Determinarea exprimării antigenului MHC clasa II, asupra monocitelor

PBMC se purifică așa cum s-a descris mai sus și monocitele se izolează prin tehnica aderenței plastice. Monocitele sunt apoi cultivate în RPMI 1640, cu 2% FCS incluzând penicilină 10,000 ΙΕ/ml, streptomicină 10 mg/ml, gentamicină 2,5 mg/ml, la o concentrație de 3 x 10®/ml. Celulele sunt stimulate timp de 40 h, în microcavități (Nune, Denmark) cu 100 ng/ml rhlL-10 sau IT 9302 1 Mg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml. La sfârșitul perioadei de stimulare, supernatanții se îndepărtează și celulele sunt detașate de materialul plastic prin congelare la temperatura de - 20°C, timp de 20 min. Celulele sunt colectate într-un mililitru de HBSS rece cu 1 % FCS și se sortează la 20°C, utilizând 50 Ml/ml Dynabrads M 450 acoperite cu anticorpi monoclonali pentru catena β HLA clasa II (Cat.No.210, 03). După 20 min de

1130

1135

1140

1145

1150

1155

1160

1165

RO 118758 Β1 incubare, celulele se spală de 3 ori cu HBSS rece, cu 1% FCS și se colectează pe un dispozitiv de separare, magnetic. Celulele sunt apoi diluate în soluția tampon de mai sus și colorate cu albastru de metilen și se numără apoi celulele sub formă de rozetă (Dynabeads care poartă celule cu HLA clasa II mAb).

Determinarea producției de IL-4 prin limfocitele CD4 + T

Culturile de celule. Limfocitele CD4 + T sunt purificate din sânge uman, normal, heparinizat. După centrifugare în gradient cu Lymphoprep™ (Nycomed Pharma, Oslo, Norway), celulele mononucleare sunt sortate în continuare la 4°C, utilizând Dynabeads (Dynal AS, Norway), acoperite cu anticorpi anti-CD4, monoclonali. Apoi, granulele sunt detașate prin adiția de anticorpi anti-șoarece, policlonali (Dynal AS, Norway. Puritatea celulelor selectate pozitiv, a fost mai mare decât 99%, așa cum a reieșit din analiza FACS. Când se examinează producția, de novo, a IL-4 prin celulele T de stimulare a IL-4, celulele T sunt cultivate, ca 5 x 10⁶ celule/mililitru în RPMI 1640 fără LPS (Gibco Cat.No.61870 - 010) conținând 1% ser de vițel, fetal, inactivat la cald, filtrat steril (FCS), penicilină (10000 lU/ml), streptomicină (10 mg/ml) și gentamicină (2,5 mg/ml).

Celulele T sunt stimale timp de 3 zile, utilizând rlL-8 (100 ng/ml), rlL-10 (100 ng/ml), IT 9302 (10 ng/ml) și IFN-gamme (10 ng/ml). IL-8 uman recombinant (rh IL-8) a fost un fel de donație de la Dainippon Pharmaceutical Co.Ltd.Osaka, Japan)și IFN-γ a fost dobândit de la Boehringer Ingelheim Am Rhein, Germany. Pentru a se obține o inhibiție specifică a stimulării IL-8, se utilizează un anticorp (WS.4) anti-IL-8 monoclonal de neutralizare (un fel de donație de la Dr.K.Metsushima, Japan). IL-10 recp.bomamt a fost dobândit de la Pepro Tech.lnc. (London, England).

Prepararea materialului celular și a culturii de supernatant, pentru gel electroforeză.

Cultura de celule T și mediul de cultură se separă prin centrifugare la 2000 rpm timp de 5 min. Supernatantul se usucă prin congelare și apoi se dizolvă în 100 μ\ soluție tampon pentru liză (9). Materialul cellar este resuspendat direct în 100 μΙ soluție tampon pentru liză. Materialul este menținut la temperatura de - 80°C până la o altă examinare.

Absorbția ECL-Western a proteinelor derivate din celule CD4+ T

Celulele sau cultura de supernatant celular uscată prin congelare, se utilizează pentru determinarea conținutului de proteine IL-4. Proteinele din gelurile unidimensionale cu 15% SDS-PAGE, au fost transferate prin absorbție în membranele de nitroceluloză HybondECL (Ameraham RPN 202OD, UK) și blocate cu albumină serică bovină 5% (Sigma) în soluție salină Tris tamponată, la un pH=7,8 conținând 0,1% Tween 20. Petele de absorbție sunt apoi incubate cu anticorpi IL-4 anti-umani, policlonali de capră (R&D Systems, UK) și apoi, cu anticorpi secundari de peroxidază, marcați, de hrean (Cat.no.RPM 2106 ECL, Amersham, UK) și imunocolorația a fost detectată prin expunerea filmului (Kodak x-OMAT-S, USA) timp de 90 s.

Specificitatea secvenței de amino acid a IT 9302

Cercetarea amănunțită pentru o posibilă omologie a secvenței de IT 9302 cu alte proteine cunoscute, a fost efectuată prin cercetarea amănunțită a bazei de date pentru proteine EMBO, asistată prin amabilitatea Dr.Henrik Leffers, (Institute for Medical Biochemistry, University of Aarhus, Denmark).

Specificitatea secvenței de amino acizi ai IT 9302

Conform informației din baza de date pentru proteine EMBO (Heidel berg) realizată în 10 iunie 1994, IT 9302 are 100% omologie cu o secvență a IL-10 uman și 75% cu o secvență a virusului Epstein -Barr a cărui proteină derivată este identică cu vlL-10. Alte proteine ca, de exemplu, proteinele virale ca fagocitul T7 și proteina virusului din frunza creață, din tomatele galbene, prezintă o identitate de 75% și respectiv de 85%.

R0118758 Β1

1220

Rezultate

Concepția, conform prezentei invenții, a apărut în octombrie și noiembrie 1992, când o nonapeptidă desemnată IT 9302 a fost construită, conform strategiei menționate mai sus, și prin sinteza chimică a primului prototiop (IT 9302), hotărât și ordonat în 27 noiembrie 1992. A fost de așteptat ca această nonapeptidă să exercite activități imunomodulatoare dintre care, câteva să mimeze activitatea asemănătoare IL-10, și experimentele următoare (exemplele) au fost planificate, de asemenea, în timpul acelei perioade. Sinteza chimică a IT 9302 a fost efectuată prin utilizarea unui sintetizator automatic de polipeptide, realizat de Carlbiotech Ltd. A/S, Denmark, ca un ordin plătit de către inventatori. După ce proteina a fost purificată prin cromatografie lichidă de înaltă performanță HPLC, puritatea a fost confirmată ca fiind de peste 95%, prin HPLC. Acest fapt a confirmat că produsul sintetizat a fost identic cu IT 9302 desemnat de către inventatori, în octombrie și noiembrie 1992.

Se dau, mai jos, mai multe exemplele de realizare ale invenției.

Exemplul 1. Inhibiția indusă de IT 9302 privind producția de IL-8, prin monocitele umane

Testul a fost realizat așa cum s-a descris în “Producția de IL-8 prin celule mononucleare periferice umane, normale (PBMC)”. Monocitele au fost purificate prin tehnica aderenței plastice și 3,0 x 10⁶ celule/ml, au fost stimulate timp de 40 h.

Așa cum s-a arătat în fig.3, IT 9302 a inhibat producția de IL-8 prin monocite și la 0,1 ng/ml de IT 9302, producția de IL-8 a fost suprimată la 35% din producția spontană, in vitro.

Viabilitatea celulelor depășește întotdeauna 80% după o zi de cultură și adiția de IT 9302 nu afectează în acest exemplu sau în exemplele care urmează, viabilitatea la orice concentrație a IT 9302 de la 0,1 la 1000 ng/ml (IT 9302 MW : 1,127 Da rhlL-10 prevăzut pentru MW: 18,400 Da).

Exemplul 2. Inhibiția indusă de IT9302 asupra producției de IL-8 indusă de IL-Ιβ, prin celulele mononucleare sanghine, periferice, umane (PBMC)

Testul este efectuat așa cum s-a descris în “Producția de IL-8 prin celulele mononucleare sanghine periferice, umane, normale (PBMC)”. Așa cum s-a arătat în fig. 4, IT 9302 a inhibat într-un mod dependent de doză, producția de IL-8 indusă de IL-1 β, prin celulele mononucleare sanghine, periferice, umane, in vitro.

Suprimarea producției de IL-8 s-a stabilit la concentrații de IT 9302 cuprinse între 0,01 și 100 ng/ml.

Exemplul 3. Producția proteinei antagoniste receptorului interleukinei-1, indusă de IT 9302 (IRAP), prin monocitele umane

Testul a fost realizat așa cum s-a descris în “Determinarea concentrației de IRAP”. Așa cum s-a arătat în fig.5, producția de IRAP este indusă de IT 9302 dependent de doză, prin monocitele umane. Producția este mult crescută, atunci când se utilizează concentrații de IT 9302 de peste 10 ng/ml. Fig.6 arată inducția IRAP prin rhlL-10 și deoarece hlL-10 este de aproximativ 20 de ori mai mare decât IT 9302, long/ml de IT 9302, sunt egali în molaritate cu 200 ng/ml de IL-10. De aceea, potențialul IZ 9302 și rhlL-10 sunt comparabile și aproximativ egale cu referire la inducția de IRAP la concentrații scăzută.

La concentrațiile IT 9302 care depășesc 10 ng/ml, inducția IRAP crește puternic și nivelele ajung la aproximativ 700 ng/ml.

Exemplul 4. Efectul chemotactic al IT 9302 asupra limfocitelor umane CD8 + T

Experimentul este efectuat așa cum s-a descris în “Analiza chemotaxis leucocitară”.

Așa cum s-a arătat în fig.7, IT 9302 induce migrarea chemotactică a limfocitelor T umane

CD8', in vitro,în timp ce nu apare nici un efect asupra celulelor CD4+ T (datele nu sunt prezentate). Din nou, potențialul IT 9302 arătat în acest experiment, este comparabil cu cel al rhlL-10 arătat mai înainte (referința 14).

1225

1230

1235

1240

1245

1250

1255

1260

1265

RO 118758 Β1

1270

1275

1280

1285

1290

Exemplul 5. IT9302 desensibilizează celulele T umane CD8', care rezultă în insensibilitatea fată de rhlL-10 f

Experimentul a fost efectuat așa cum s-a descris în “Analiza chemotaxis leucocitară”. IT 9302 s-a adăugat la o suspensie de celule CD8+T cu 30 min înainte de testarea acestor celule față de răspunsul acesdtora la rhlL-10. Așa cum s-a arătat în fig.8, preincubarea celulelor cu IT 9302 are ca rezultat suprimarea sensibilității celulelor CD8+T față de rhlL-10. Aceasta indică faptul că, IT 9302 poate influența legarea rhlL-10 la receptorul IL-10.

Exemplul 6. IT 9302 suprimă răspunsul chemeotactic al limfocitelor CD4+ T față de IL-8

Experimentul este efectuat așa cum s-a descris mai sus, în “Analiza chemotaxis leucocitară”. Așa cum s-a arătat în fig.9, IT 9302, într-un mod dependent de doză și prin adăugare la suspensia de limfocite umane CD4+ T, inhibă răspunsul celulelor CD4+T față de IL-8.

Exemplul 7. IT 9302 suprimă răspunsul chemotactic al monocitelor umane față de MCAF/MCP-1

Experimentul este efectuat așa cum s-a descris în “chemotaxisul monocitelor”. Așa cum s-a arătat în fig.10, IT 9302, într-un mod dependent de doză și prin adăugare la suspensia de monocite umane, inhibă răspunsul chemotactic al monocitelor, față de MCAF/MCP-1.

Exemplul 8. IT 9302 nu inhibă exprimarea moleculei MHC clasa II asupra monocitelor umane

Experimentul este efectuat așa cum s-a descris în Materiale și Metode și se arată că rhlL-10 inhibă expresia MHC clasa II, dar nu pe cea a IT 9302, așa cum se vede din tabelul 4.

1295

Tabelul 4

Stimularea	Numărul de monocite în formă de rozetă
0	12,0 ± 1,0 x 104
100 ng/ml rhlL-10	4,6 ± 1,4 x 104
1 /zg/ml IT 9302	11,0 ± 3,0 x104
100 ng/ml IT 9302	14,4 ± 2,0 x 104
10 ng/ml IT 9302	11,2 ± 3,2 x104

1300

1305

1310

Discuția referitoare la experimente

Datele prezente demonstrează efectul inhibitor dependent de doză al nonapeptidei sintetice, IT 9302 asupra proceselor care reflectă o activitate pro-inflamatorie, incluzând producția de IL-8 și monocite și migrarea celulelor T. Astfel, IT 9302 este capabilă de a suprima producția spontană de IL-8 prkin monocitele umane cultivate până a doua zi. Acest fapt ar putea fi explicat prin efectul inhibitor direct asupra producției de IL-8 mRNA și/sau producția suplimentară a proteinei și/sau eliberarea acesteia. Un alt mecanism ar putea fi explciat prin faptul că, monocitele cultivate in vitro, vor exprima și produce IL-1, care apoi la rândul acestuia, va induce producția de IL-8. Acest fapt este susținut fiindcă s-a demonstrat că IT 9302 induce potențial producția de IRAP din monocite. De aceea, IT 9302 poate să inhibe, de asemenea, producția spontană de IL-8, prin interferență cu activitatea 1-1. Inducerea observată de IRAP, prin IT 9302, pare o inducție biologic activă a IRAP, deoarece IT 9302 se adaugă la culturi contracarând producția de IL-8 indusă de IL-1, dar numai când se adaugă cu cel puțin 16 h înainte de adăugarea IL-1 la acesdte culturi. Aceasta ar însemna că IT 9302 inhibă producția de IL-8 indusă de IL-1, prin inducerea

L

RO 118758 Β1

1315 producției de IRAP, care la rândul lui blochează activitatea IL-1 prin receptorul acestuia. Dacă IT 9302 inhibă direct producția de IL-8, ar fi de așteptat ca adiția de IT 9302 la culturi înainte cu o oră de adăugarea IL-1, să inhibe producția de IL-8, care nu a constituit un caz (datele nu sunt prezentate). De aceea, inhibiția observată în producția de IL-8 a IT 9302 este asemănător datorată unei inducții a producției de IRAP mai degrabă, decât o inhibiție directă a producției de IL-8. Aceste funcții ale IT 9302 pot fi așadar găsite pentru ca hlL-10 să indice că IT 9302 posedă activități asemănătoare IL-10. IT 9302 mimează așadar o activitate asemănătoare IL-10, prin suprimarea abilității celulelor CD4+ T de a migra ca răspuns la IL-8. Deoarece, IL-8 se referă la multe și diferite stări de inflamație și deoarece, celulele CD4+ T apar mai devreme în infiltratul inflamației imune mediată de celulele T cum ar fi, de exemplu, alergia pielei, această caracteristică poate fi probată ca având o valoare terapeutică semnificativă pentru controlul inflamației imune mediată de celulele T.

Activitatea chemotactică a IT 9302 demonstrată asupra celulelor CD8+ T este așadar paralelă cu cea a IL-10 și IT 9302 poate astfel să activeze populația celulelor T privind activitatea supresoare contribuind deci la terminarea inflamației imune mediată de celule la T.De aceea, IT 9302 conform exemplelor care au fost demonstrate mai sus, posedă o valoare terapeutică în maladiile în care IL-10 și/sau IRAP, pot avea așadar o valoare terapeutică. Adițional, IT 9302 poate avea o valoare terapeutică în maladiile în care IL-8 și/sau MCAF și/sau IL-1 se cred a avea roluri catogenetice.

Exemplul 9. IT 9302 și IL-10 induc producția de IL-4 în limfocitele CD4+ T Condiții

Asemănător IL-10, IL-4 este un produs al celulelor CD4+ T de tipul TH2. S-a observat că, IL-10 uman recombinant induce producția de IL-4 în cultură de celule umane CD+ T. Aceasta înseamnă că, în adiția în funcțiile imunosupresoare proprii, acesta induce și producția unei alte citokine imunosupresoare, IL-4. S-a testat de aceea dacă IT 9302 induce, de asemenea, producția de IL-4 prin celulele CD4+ T. Astfel, celulele CD4+ T, purificate așa cum s-a descris în “Metodele pentru chemotaxisul celulelor T și aduse în cultură așa cum s-a descris în secția “Determinarea producției de IL-4 prin limfocitele CD4+ T”, fiind stimulate timp de 3 zile cu IL-4 prin limfocitele CD4+ T, fiind stimulate timp de 3 zile cu IT 9302 (10 ng/ml) sau IL-10 (100 ng/ml).

Fracțiunile citosolice sunt colectate și analizate pentru conținutul lor de IL-4, utilizând metoda de absorbție Western (fig.11) și un anticorp policlonal IL-4 anti-uman de capră.

Așa cum s-a demonstrat în fig.11, s-a observat că IL-10, ca și IT 9302 induc producția de IL-4 prin celulele CD4+ T în cultură umană, normală.

Exemplul 10. IT 9302 inhibă producția de TNF-α în timpul reacției de leucocite mixte (MRL)

S-a demonstrat că, reacția leucocitelor mixte este parțial dependentă de producția TNF-α în timpul reacției. S-a arătat, de asemenea că, IT 9302 nu reduce semnificativ MRL, dar s-a găsit că există o reducere semnificativă în producția de TNF-α în timpul MRL.

Astfel, MRL se efectuează prin purificarea celulelor leucocite umane și apoi prin cultivarea a 1 milion de celule/ml de la donatorii allogenici, timp de 4 zile. înainte de stabilirea culturilor, o grupă de celule a fost iradiată timp de 2 min utilizând iradiația beta. Fracțiunile de proteine citosolice sunt purificate așa cum s-a descris în secțiunea “Determinarea producției de IL-4 prin limfocitele CD4+ T” și analiza de absorbție Western s-a efectuat utilizând un anticorp TNF-α anti-uman de iepure.

Așa cum s-a demonstrat în fig. 12, s-a observat o reducere semnificativă în producția de TNF-α în timpul reacției leucocitelor mixte, umane.

1320

1325

1330

1335

1340

1345

1350

1355

1360

RO 118758 Β1

Exemplul 11. Modularea șocului indus de LPS și leucopenia la porcine, utilizând IT

9302

Deoarece, s-a găsit că IT 9302 modulează producția de citokine incluzând TNF-α și IL-8 și cu ajutorul secvenței publicate IL-10 pentru porcine (Blancho et al., 1995) (vezi fig.2 pentru omologie cu peptidă COOH terminală), s-a testat dacă IT 9302 a fost capabilă să moduleze cursul leucopeniei indusă de LPS la porcine (fig.13).

într-un experiment preliminar, s-a testat modul în care prin injectarea intravenoasă de IT 9302 a 0,1 mg/kg se modulează efectul injecției intravenoase cu 2 ^g/kg de LPSIa porcine (N = 3). IT 9302 se injectează timp de 30 min înainte de injectarea LPS și probele de sânge sunt prelucrate așa cum s-a descris în fig.13. Numărul total de leucocite, ca și numărul de celule diferențiate a fost determinat și numărul total de leucocite neutrofilice a fost calculat pe baza acestor rezultate.

Așa cum s-a demonstrat, s-a observat că injectarea de LPS provoacă o leucopenie transientă. Totuși, așa cum s-a demonstrat în figură, injectarea de IT 9302, previne leucopenia.

Exemplul 12. Anticorpul față de polipeptida sintetică IT 9302

Polipeptida sintetică IT 9302 a fost dobândită de la Kem-En-Tec A/S Copenhage, Denmark, cu o puritate mai mare decât 95%. Această polipeptidă a fost așadar conjugată la Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) de către producător. IT 9302/KLH solubilă este mult mai imunogenică decât polipeptida singură și aceasta poate fi utilizată pentru controlul proteinei prin analizele ELISA sau Absorbția Western.

Imunizarea iepurilor

O cantitate de 250 pg de IT 9302 cuplată la KHL și sub formă de emulsie cu adjuvantul Freund complet, se utilizează pentru injecțiile intradermice sau pentru injecțiile subcutanate. Injectarea se repetă de patru ori la intervale de două săptămâno și iepurii sunt sacrificați după 8 zile și după 12 zile de la injectare. Se mai administrează apoi injecții auxiliare cu 250 pg de IT 9302/KLH în adjuvant Freund complet, la intervale de o lună, utilizând injectarea subcutanată. Formarea anticorpului IT 9302 este testată, de asemenea, prin imunoanaliza dot-blot (pată punctiformă) și prin analiza de absorbție Western.

LISTA DE SECVENȚE (1) INFORMAȚIE GENERALĂ:

(i) APLICANT:

(A) NUME: Nycomed DAK A/S (B) STRADA: P.O.Box 1911, Lergraversvej 59 (C) ORAȘUL: Copenhagen S (D) ȚARA: Denmark (E) CODUL POȘTAL (ZIP): 2300 (ii) TITLUL INVENȚIEI: Imunomodulatori (iii) NUMĂRUL DE SECVENȚE: 23 (iv) FORMA ACCESIBILĂ PE COMPUTER:

(A) TIPUL DE MEDIU: disc moale (B) COMPUTER: IBM PC compatibil (C) SISTEM DE OPERARE: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patent în emitere # 1,0, versiunea # 1,30 (EPO)

RO 118758 Β1

1410 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.1:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME : o amino acizi (B) TIPUL: amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ: peptidă (iii) IPOTETIC: NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID No.1: Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn

5 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.2:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME : 9 amino acizi (B) TIPUL: amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ : peptidă (iii) IPOTETIC: NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI : SECVENȚA ID No.2: Ala Tyr Met Thr Ile Lys Met Arg Asn

5 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.3:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME : 9 amino acizi (B) TIPUL : amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ : peptidă (iii) IPOTETIC: NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID No.3: Ala Phe Met Thr Leu Lys Leu Arg Asn

5 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.4:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME : 9 amino acizi (B) TIPUL : amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ : peptidă (iii) IPOTETIC : NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID No.4: Ala Tyr Met Thr Met Lys Val Arg Glu

5 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.5:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI :

(A) LUNGIME : 9 amino acizi (B) TIPUL : amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE : lineară

1415

1420

1425

1430

1435

1440

1445

1450

1455

RO 118758 Β1 (ii) TIPUL DE MOLECULĂ : peptidă (iii) IPOTETIC: NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI : SECVENȚA ID No.5: Gly Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asp

5 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.6 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI :

(A) LUNGIME : 9 amino acizi (B) TIPUL : amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE : lineară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ : peptidă (iii) IPOTETIC : NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID No.6 Ala Phe Met Thr Met Lys Ile Arg Asp

5 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.7:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME : 9 amino acizi (B) TIPUL : amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE : lineară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ : peptidă (iii) IPOTETIC : NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID No.7: Ala Tyr Ile Thr Met Lys Ile Arg Asp

5 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.8:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME : 9 amino acizi (B) TIPUL: amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE : lineară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ : peptidă (iii) IPOTETIC : NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID No.8: Ala Tyr Leu Thr Met Lys Ile Arg Asp

5 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.9:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI :

(A) LUNGIME : 9 amino acizi (B) TIPUL : amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE : lineară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ : peptidă (iii) IPOTETIC : NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI : SECVENȚA ID No.9:

Ala Tyr Val Thr Met Lys Ile Arg Asp

5

RO 118758 Β1

1510 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.10:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

' (A) LUNGIME : 9 amino acizi (B) TIPUL: amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ: peptidă (iii) IPOTETIC : NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID No.10 Ala Tyr Met Thr lle Lys lle Arg Asp

5 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.11:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI :

(A) LUNGIME : 9 amino acizi (B) TIPUL : amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ : peptidă (iii) IPOTETIC : NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID No.11: Ala Tyr Met Thr Leu Lys lle Arg Asp

5 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.12:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME : 9 amino acizi (B) TIPUL: amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ: peptidă (iii) IPOTETIC : NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI : SECVENȚA ID No.12: Ala Tyr Met Thr Val Lys lle Arg Asp

5 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.13:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI :

(A) LUNGIME : 9 amino acizi (B) TIPUL : amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE : lineară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ : peptidă (iii) IPOTETIC : NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID No.13: Ala Tyr Met Thr Met Lys lle Arg Asp

5 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.14:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI :

(A) LUNGIME : 9 amino acizi (B) TIPUL : amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE : lineară

1515

1520

1525

1530

1535

1540

1545

1550

1555

RO 118758 Β1 (ii) TIPUL DE MOLECULĂ : peptidă (iii) IPOTETIC: NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID No.14: Ala Tyr Met Thr Met Lys Met Arg Asp

5 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.15:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME : 9 amino acizi (B) TIPUL: amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ : peptidă (iii) IPOTETIC: NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID No.15: Ala Tyr Met Thr Met Lys Val Arg Asp

5 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.16:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI :

(A) LUNGIME : 9 amino acizi (B) TIPUL: amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE : lineară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ : peptidă (iii) IPOTETIC: NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID No.16: Ala Tyr Met Thr Met Lys lle Arg Gin

5 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.17:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI :

(A) LUNGIME : 9 amino acizi (B) TIPUL : amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE : lineară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ : peptidă (iii) IPOTETIC: NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID No.17: Ala Tyr Met Thr Met Lys lle Arg Glu

5 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.18:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI :

(A) LUNGIME : 9 amino acizi (B) TIPUL : amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE : lineară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ : peptidă (iii) IPOTETIC : NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI : SECVENȚA ID No.18:

Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu

5

RO 118758 Β1

1605 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.19:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI :

(A) LUNGIME : 6 amino acizi (B) TIPUL: amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ : peptidă (iii) IPOTETIC: NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI : SECVENȚA ID No.19:

Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa

5 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.20:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME : 7 amino acizi (B) TIPUL : amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE : lineară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ : peptidă (iii) IPOTETIC : NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID No.20:

Xaa Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa

5 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.21 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI :

(A) LUNGIME : 9 amino acizi (B) TIPUL : amino acid (C) TIPUL DE RĂSUCIRE :

(D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ : peptidă (iii) IPOTETIC : NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID No.21

Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa

5 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID No.23:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI :

(A) LUNGIME : 27 perechi de bază (B) TIPUL : acid nucleic (C) TIPUL DE RĂSUCIRE : simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ : DNA (genomic) (iii) IPOTETIC : NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECVENȚA ID No.23:

GCCTACATGA CAATGAAGAT ACGAAAC

Claims (40)

1. Revendicări

   1. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, caracterizate prin aceea că au formula:

   X, - X₂ - X₃ -Thr - X₄ - Lys - X₅ - Arg -X₆ (secvența ID Nr.22)

   1610

   1615

   1620

   1625

   1630

   1635

   1640

   1645

   1650

   RO 118758 Β1 în care:

   X, este Ala sau Gly, X₂ este Tyr sau Phe,

   X₃, X₄ și XsSunt independent selectați dintr-o grupare care constă din Met, lle, Leu, Val,

   X₆ este selectat dintr-o grupare care constă din Asn, Asp, Gin, Glu.
2. 2. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că au formula:

   X₂ - X₃ -Thr - X₄ - Lys - X₅ - Arg -X₆ (secvența ID Nr.21) în care:

   X₂ este Tyr sau Phe,

   X₃, X₄ și XgSunt independent selectați dintr-o grupare care constă din Met, lle, Leu, Val,

   X₆ este selectat dintr-o grupare care constă din Asn, Asp, Gin, Glu.
3. 3. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că au formula:

   X₃ -Thr - X₄ - Lys - X₅ - Arg -X₆ (secvența ID Nr.20) în care:

   X₃, X₄ și Xg sunt independent selectați dintr-o grupare care constă din Met, lle, Leu, Val,

   X₆ este selectat dintr-o grupare care constă din Asn, Asp, Gin, Glu.
4. 4. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că au formula:

   Thr - X₄ - Lys - X₅ - Arg -Xg (secvența ID Nr.19) în care:

   X₄ și XgSunt independent selectați dintr-o grupare care constă din Met, lle, Leu, Val

   X₆ este selectat dintr-o grupare care constă din Asn, Asp, Gin, Glu.
5. 5. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 4, caracterizate prin aceea că, cuprind cel puțin 12 aminoacizi.
6. 6. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 4, caracterizate prin aceea că, cuprind cel puțin 15 aminoacizi.
7. 7. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor 1 și 4, caracterizate prin aceea că, cuprind cel puțin 11 aminoacizi.
8. 8. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor 1 și 4, caracterizate prin aceea că, cuprind cel puțin 10 aminoacizi.
9. 9. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, X, este Ala.
10. 10. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, X, este Gly.
11. 11. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, X₂ este Tyr.
12. 12. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, X₂ este Phe.
13. 13. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, X₃ este Met.
14. 14. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, X₃ este lle.
15. 15. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, X₃ este Leu.

    RO 118758 Β1

    1705
16. 16. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, X₃ este Val.
17. 17. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, X₄ este Met.
18. 18. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, X₄ este Ile.
19. 19. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, X₄ este Leu.
20. 20. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, X₄ este Val.
21. 21. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, X₅ este Met.
22. 22. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, X₅ este Ile.
23. 23. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, X₅ este Leu.
24. 24. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, X₅ este Val.
25. 25. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, X₆ este Asp.
26. 26. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, Χθ este Gin.
27. 27. Polipeptide cu rol de imunomodulatori .conform revendicărilor de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, X₆ este Glu.
28. 28. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 8, caracterizate prin aceea că, X₆ este Asn.
29. 29. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 29, caracterizate prin aceea că sunt selectate dintre : Ala-Tyr-Met-Thr-lle-Lys-Met-Arg-Asn (secvența 2) Ala-Phe-Met-Thr-Leu-Lys-Leu-Arg-Asn (secvența 3) Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Glu (secvența 4) Gly-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp (secvența 5) Ala-Phe-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp (secvența 6) Ala-Tyr-lle-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp (secvența 7) Ala-Tyr-Leu-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp (secvența 8) Ala-Tyr-Val-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp (secvența 9) Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp(secvența 10) Ala-Tyr-Met-Thr-Leu-Lys-lle-Arg-Asp(secvența 11) Ala-Tyr-Met-Thr-Val-Lys-lle-Arg-Asn (secvența 12) Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asp (secvența 13) Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Asp (secvența 14) Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Asp (secvența 15) Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Gln(secvența 16) Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Glu(secvența 17).
30. 30. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 28, caracterizate prin aceea că sunt sub formă efectiv pură.
31. 31. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 26, caracterizate prin aceea că sunt diferite de IL-10 uman.

    1710

    1715

    1720

    1725

    1730

    1735

    1740

    1745

    RO 118758 Β1
32. 32. Polipeptide cu rol de imunomodulatori, conform revendicărilor de la 1 la 31, caracterizate prin aceea că se utilizează compoziția farmaceutică în tratamentul și profilaxia unei maladii selectată dintr-o grupare care constă din nașterea prematură cauzată de infecție sau alte cauze, artrita reumatoidă, artrita Lyme, guta, sindromul sepsis, hipertermia, colită ulcerativă sau enterocolită, osteoporoză, citomegalovirus, maladia periodontală, glomerulonefrita, inflamația cronică neinfecțioasă a plămânului, formarea de granuloame, fibroză ficatului, fibroză plămânului, respingere de transplant, maladia respingerii grefei de către organismul gazdă, leucemie mieloidă cronică, leucemie mieloidă acută, alte maladii neoplazice, astm bronșic, diabetul mellitus tip I, arterioscleroza și arteroscleroza, psoriazisul, leucemia cronică a limfocitelor B, imunodeficiența variabilă comună, efecte secundare utilizând alți modificatori ai răspunsului biologic, coagularea intravasculară diseminată, scleroza sistemică, encefalomielită, inflamarea plămânului, sindromul hiper IgE, enterocolită, metastază și avansarea cancerului, terapie imună adoptivă, sindromul distres respirator dobândit, sepsis, sindromul reperfuziei, inflamația postchirurgicală, transplantul de organe și alopecia.
33. 33. Secvență de nucleotide, caracterizată prin aceea că, codifică o polipeptidă ca imunomodulator, descrisă în oricare din revendicările de la 1 la 30.
34. 34. Anticorp, caracterizat prin aceea că se leagă de o polipeptidă ca imunomodulator, descrisă în oricare din revendicările de la 1 la 30.
35. 35. Anticorp, caracterizat prin aceea că se leagă specific la o polipeptidă având secvența de aminoacizii, Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-lle-Arg-Asn (SECVENȚA ID No.1).
36. 36. Anticorp, conform revendicărilor 34 și 35, caracterizat prin aceea că este un anticorp policlonal.
37. 37. Anticorp, conform revendicărilor 34 și 35, caracterizat prin aceea că este un anticorp monoclonal.
38. 38. Anticorp, conform cu oricare din revendicările de la 33 la 37, caracterizat prin aceea că este capabil să neutralizeze una sau mai multe din următoarele proprietăți: inducerea inhibiției producției spontane de IL-8 prin monocite umane, inducerea inhibiției producției de IL-8 indusă de IL-1 β prin celulele mononucleare sanguine periferice umane, inducerea producției de proteină antagonistă receptorului interleuchinei -1 prin monocite umane, inducerea migrării chemotactice a limfocitelor CD8+T umane, - in vitro, desensibilizarea celulelor CD8+T umane, rezultând în insensibilitatea față de rh1L-10, suprimarea răspunsului chemotactic al limfocitelor CD4+T umane față de IL-8, suprimarea răspunsului chemotactic al monocitelor umane față de MCAF/MCP-1.
39. 39. Anticorp, conform cu oricare din revendicările de la 34 și 35, caracterizat prin aceea că este altul decât anticorpul monoclonal 19F1 și este capabil să neutralizeze una sau mai multe din următoarele proprietăți:inducerea inhibiției producției spontane de IL-8 prin monocite umane, inducerea inhibiției producției de IL-8 indusă de IL-β prin celulele mononucleare sanguine periferice umane, inducerea producției de proteină antagonistă receptorului interleuchinei -1 prin monocite umane, inducerea migrării chemotactice a limfocitelor CD8+T umane, - in vitro, desensibilizarea celulelor CD8+T umane, rezultând în insensibilitatea față de rh1 L-10, suprimarea răspunsului chemotactic al limfocitelor CD4+T umane față de IL-8, suprimarea răspunsului chemotactic al monocitelor umane față de MCAF/MCP-1, înnobilarea exprimării moleculei MHC clasa II asupra monocitelor umane, în contrast cu IL10 uman, inducerea producției de IL-4 prin cultura celulelor CD4-T umane normale, reducerea producției de TNFa în reacția leucocitelor mixte umane.

    R0118758 Β1
40. 40. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin aceea că, conține de la 0,01 la 95% în greutate polipeptidă, definită în oricare din revendicările de la 1 la 33 și până la 99,99% unul saii mai mulți excipienți acceptabili farmaceutic.