JPH07504437A

JPH07504437A - 対宿主性移植片病を抑制するインターロイキン−１０の使用

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Publication number: JPH07504437A
Application number: JP5515744A
Authority: JP
Inventors: ロンカロロ，マリア−グラジア; デ・ワール・マレフィト，レネ; バチェッタ，ロサ
Original assignee: シェリング・コーポレーション
Priority date: 1992-03-04
Filing date: 1993-03-02
Publication date: 1995-05-18
Also published as: MX9301192A; IL104916A0; ZA931489B; KR950700079A; AU679908B2; AU3732893A; EP0629130A1; CA2131524A1; NZ249754A; CN1079166A; WO1993017698A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】対宿主性移植片病を抑制するインターロイキン−１０の使用発明の分野本発明は、概して、有効量のインターロイキン−１０を患者に投与することによって対宿主性移植片病または組織拒絶を治療するおよび阻止するための方法に関する。

発明の概要本発明は、対宿主性移植片病または移植された組織の拒絶を抑制するためのイン９−ｏイキン−１０（Ｉ　Ｌ−１０）の使用に関する。本発明は、更に、インターロイキン−１０またはその活性変異体を含む薬剤組成物を包含する。好ましくは、本発明のインターロイキン−１０は、本明細書中において、標準的な三文字（ＨＪＩはいずれも特許請求の範囲の直前４譚されている）で与えられたアミノ酸ＥＦＩによって定義される読み取り枠を有する成熟ポリペプチドから成る群より選択される。これらの２種類の形のＩＬ−１０は、しばしば、ヒトＩＬ−１０（すなわちヒトサイトカイン合成阻害因子）およびウィルスＩＬ−１０（すなわちＢＣＲＦＩ）とそれぞれ称される。例えば、ムーア（Ｍｏｏｒｅ）ら、２〜１１７６頁（１９９１）；フィオレンチノ（Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ）ら、詳しくは、本発明の方法において用いられる成熟ＩＬ−１０またはその変異体は、本明細書中において配列番号３および４で与えられたアミノ酸配列によって定義される読み取り枠を有する成熟ポリペプチドから成る群より選択される。

図１は、哺乳動物細胞中においてＩＬ−１０を発現させるのに用いられるベクターｐｃＤ（ＳＲα）の図面である。

図２は、細菌中においてＩＬ−１０を発現させるのに用いられるベクターＴＲＰ −Ｃ１ｌの図面である。

図３は、マウスＩ　Ｌ−１０、ウィルスＩＬ−１０またはヒトＩＬ−１０のｘｈＯＩ制限部位に挿入されたその読み取り枠（ＯＲＦ）を有するプラスミドｐＧＳＲＧを示し；それは、更に、最終構築物（ＴＡＣ−ＲＢＳと称する）のＰＢＳ− ＡＴＧ−ポリリンカー領域の配列を示す。

図４は、ＭＬＣにおける増殖性応答に対する内因性および外因性ＩＬ−１０の作用を示す。ＰＢＭＣ（１ｘｌＯ５／ウエル）および同種異系照射ＰＢＭＣ（１ｘ１０５／ウエル）（ＰＢＭＣドナーＡｘＰＢＭＣドナーＢ　（Ａ）、ＰＢＭＣドナーＢ　ｘ　Ｐ　ＢＭＣドナーＡ　（Ｂ））を、増加濃度のＩＬ−１０（中空棒）および抗ＩＬ−１０ｍＡｂ（中実棒）の存在下で５日間培養した。ＭＬＣは、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−１０および増加濃度の抗ＩＬ−１０ｍＡｂの不存在下（中実棒）または存在下調線棒）で行なった（Ｃ）。

ＥＢＶ−ＬＣＬ　（１ｘｌＯ４／ウエル）　（Ｄ）と−緒に、増加濃度のＩＬ− １０存在下で５日間培養した。

照射ＰＢＭＣ（ＩＸＩＯ５／ウェル）を５日間培養した。示された濃度のＩＬ− １０を示された時間に加えた。

）を、増加濃度のＩＬ−１０と一緒におよび抗ＩＬ−２Ｒ抗体ＢＢＩＯの１０μ ｇ／ｍｌの存在下または不存在下で培養した。３日後に上澄みを採収し且つそれらのＩＬ−２含量をサイトカイン特異的エリザによって検定し九図８は、ＩＬ− １０によって誘導されたＴ細胞の減少したアロ抗原誘導増殖性／ｍｌのＩＬ−１０の不存在下（中空記号）または存在下（閉記号）において培養した。

発明の詳細な説明本発明は、個体、例えば、移植患者における対宿主性移植片病または組織拒絶を抑制するためのＩＬ−１０またはそのアゴニストの使用法に関する。本発明は、更に、該方法を実施するためのＩＬ−１０を含む薬剤組成物を包含する。本発明において用いるためのＩＬ−１０は、アメリカンφタイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ。

ｎ）（ＡＴＣＣ）　、ロックビル、メリーランド州に寄託されているｐＨ５ＣＳｐＨ１５ＣおよびｐＢＣＲＦｌ　（ＳＲａ）のｃＤＮＡインサート（こよって定義された読み取り枠によってコードされている成熟ポリペプチド並びにそれらの活性変異体、例えば、アゴニストの群より選択される。アゴニストとしては、突然変異タンパク質と、プロセッシング、切断、グルコシル化などの翻訳後変異体の双方がある。

■、インターロイキンー１０の検定Ｉ　Ｌ−１０は、検定および単位の根拠を形成しうるいくつかの生物学的活性を示す。特に、ＩＬ−１０は、ＩＦＮ−γ、リンホトキシン、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＧＭ−Ｃ８Ｆから成る群のサイトカインの１種類またはそれ以上を同系抗原提示細胞（ＡＰＣ）および抗原に対する暴露によって合成するように誘導されたＴヘルパー細胞の集団において、これらのサイトカインの少なくとも１種類の合成を阻害する性質を有する。この活性において、ＡＰＣは、それらが複製不能であるがそれらの抗原提示機序は機能する状態のままであるように処理される。

これは、便宜上、ＡＰＣをＴ細胞と混合する前に、例えば、約１５００〜３０００Ｒ（ガンマまたはＸ線）を照射することによって達成される。

或いは、サイトカイン阻害は、−次または、好ましくは二次混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において検定することができ、その場合、同系ＡＰＣを用いる必要はない。ＭＬＲは当該技術分野において周知である。例えば、ブラドリー（Ｆｒｅｅｍａｎ）、サンフランシスコ、１９８０年）、１６２〜１６６頁；およびパティスト（Ｂａｔｔｉｓｔｏ）ら、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、。

１５０巻、８３〜９１頁（１９８７）。簡単にいうと、同種異系リンパ系細胞の２集団を混合し、集団の一方は、例えば、照射によって増殖を防止するように混合前に処理された。好ましくは、細胞集団を、補足培地、例えば、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ　１６４０中において細胞濃度約２ｘ１０６個／ｍｌで調製する。対照および試験培養物双方に対して、検定用の各集団０．１ｍｌを混合する。二次ＭＬＲのために、−次ＭＬＲにおいて７日後に残留している細胞を、新たに調製された照射刺激細胞によって再度刺激する。ＩＬ−１０を含むと考えられる試料を試験培養物に対して混合時に加えてよいし、対照および試験培養物双方のサイトカイン生産を、混合して１〜３日後に検定することができる。

ＩＬ−１０検定用のＴ細胞集団および／またはＡＰＣ集団の入手は、ディサバ）（ＤｉＳａｂａｔｏ）ら監修、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１０８巻（１９８４）に充分に記載されている、当該技術分野において周知の技法を用いる。好ましいＩ　Ｌ−１０検定用のＡＰＣは末梢血液単球である。これらは、例えば、いずれも参考として本明細書中に包含される、ボイム（Ｂｏｙｕｍ）、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、、１０８巻、８８〜１０２頁（１９８４）；マジエ（Ｍａｇｅ）、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、、１０８巻、１１８〜１３２頁（１９８４）、リトヴイン（Ｌ　ｉ　ｔ　ｖ　ｉ　ｎ）ら、Ｍｅｔｈ、ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ、、１０８巻、２９８〜３０２頁（１９８４）；Ｘティーブンソン（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ）、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、、１０８巻、２４２〜２４９頁（１９８９）；およびロメイン（Ｒｏｍａ　ｉ　ｎ）　、Ｍｅ　ｔ　ｈ。

ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、、１０８巻、１４８〜１５３頁（１９８４）＋：記載の標準的な技法を用いて得られる。好ましくは、ヘルパーＴ細胞はＩＬ−１０検定において用いられ、それは、最初に末梢血液からリンパ球を分離した後、商業的に入手可能な抗ＣＤ４抗体、例えば、米国特許第４．３８１，２９５号明細書に記載され且つオルト拳ファーマソイティカノいコーポレーション（Ｏｒｔｈ。

Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、）から入手可能な０ＫＴ４を用いて、例えば、パニングまたは流動血球計算法によってヘルパー細胞を選択することによって得られる。必要な技法は、ボイムによって、Ｓ　ｃ　ａ　ｎ　ｄ、Ｊ。

ＣＩ　ｉｎ、Ｌａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、、２１巻（補遺９７）、７７頁（１９６８）およびＭｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、、１０８巻（上記に引用）並びにプラム（１３ｒａｍ）ら、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１２１巻、７３７〜７４８頁（１９８６）に充分に開示されている。概して、ＰＢＬは、フィコール・ハイパクー密度勾配遠心分離によって新鮮な血液から得られる。

種々の抗原、例えば、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、トリのγ−グロブリンまたは類似のものを検定において用いることができる。更に好ましくは、抗原の代わりにヘルパーＴ細胞を、検定において抗ＣＤ３単クローン性抗体、例えば、米国特許第４，３６１，５４９号明細書で開示された０ＫＴ３で刺激する対照および試験試料中のサイトカイン濃度を、標準的な生物学的および／または免疫化学的検定によって測定する。具体的なサイトカインに関する免疫化学的検定の構成は、精製されたサイトカインが入手可能である場合、当該技術分野において周知である。例えば、カンブベル（Ｃａｍｐｂｅ　ｌ　ｌ）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　（エルセピア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、アムステルダム、１９８４年）；テユ’）セン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）　ら、Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒ　ｏｆＥｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（エルセピア、アムステルダム５１９８５年）；および米国特許第４．４８６，５３０号明細書は、当主層についての広範囲にわたる文献を代表するものである。ヒトＩＬ−２、ヒトＩＬ−３およびヒトＧＭ−Ｃ３Ｆのためのエリザキットは、ジエンザイム・コーポレーション（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｒｐ、）（ボストン、ＭＡ）から商業的に入手可能であり；そしてヒトＩＦＮ−γのためのエリザキットは、エンドジエン・インコーホレーテッド（Ｅｎｄｇ’ｅｎ、Ｉｎｃ、）（ボストン、ＭＡ）から商業的に入手可能である。ヒドリンホトキシンに特異的な多クローン性抗体はジェンザイム・コーポレーションから入手可能であり、それをヒドリンホトキシンに関するラジオイムノアッセイにおいて用いることができる。例えば、チャード（Ｃｈａｒｄ）、Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　（エルセピア、アムステルダム、１９８２年）。

上記に挙げたサイトカインの生物学的検定は、更に、ＩＬ−１０活性を決定するのに用いることができる。ヒドリンホトキシンに関する生物学的活性は、アガワール（Ａｇｇａｒｗａｌ）、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、、１１６巻。

４４１〜４４７頁（１９８５）およびマシューズ（Ｍａ　ｔ　ｔ　ｈ　ｅｗｓ）ら、クレメンス（Ｃｌｅｍｅｎｓ）ら監修のＬ　ｍｐｈｏｋｉｎｅｓ　ａｎｄｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ　ｒｏａｃｈ（ＩＲＬプレス、ワシントン、Ｄ、Ｃ，，１９８７年）の２２１〜２２５頁に開示されている。ヒトＩＬ２およびＧＭ−ＣＳＦは、ＡＴＣＣからそれぞれ受託番号ＴｌＢ２１４およびＣＣＬ２４６として入手可能な因子依存性細胞系ＣＴＬＬ−２およびＫＧ−１を用いて検定することができる。ヒトＩＬ−３は、例えば、メトカーフ（Ｍｅｔｃａｌｆ）、Ｔｈｅ　Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　ＣｏｌｏｎＳｔｉｍｕｌａｔｉｎ　Ｆａｃｔｏｒｓ　（エルセピア、アムステルダム、１９８４年）に記載されたように、軟質寒天培養における広範囲の造血系細胞コロニーの形成を刺激するその能力によって検定することができる。ＩＦＮ−γは、抗ウイルス検定を用いて定量することができる。例えば、ミーガー（Ｍｅａｇｅｒ）、クレメンスら監修上記に引用）の１２９〜１４７頁。ロイド（Ｒｏ　Ｌ　ｔ　ｔ）（１９９２）Ｅｎｃ　ｃｌｏ　ｅｄｉａ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク；およびコリガン（Ｃｏ　ｌ　ｉｇａｎ）（１９９２年および定期補遺）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）／ワイジー（Ｗｉ　ｌ　ｅ　ｙ）　、ニューヨークも参照されたい。

サイトカイン生産は、ｍＲＮＡ分析によっても決定することができる。サイトカインｍＲＮＡは、ホワイト（Ｗｈ　ｉ　ｔ　ｅ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５７巻、８５６９〜８５７２頁（１９８２）およびガレスピー（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ）ら、米国特許第４．４８３，９２０号明細書に記載されたように、細胞質ドツトハイブリッド形成によって測定することができる。したがって、これらの参考文献は参考として包含される。他の方法としては、精製ＲＮＡを用いるドツトブロッティングがある。例えば、ヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）ら監修、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｆｄｉｚａｔｉｏｎ　ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ　ｒｏａｃｈ（ＩＲＬブレス、ワシントン、Ｄ、Ｃ０，１９８５年）の第６章。

ＩＬ−１０活性に関して検査されるいくつかの試料は、検定の妨げになるかもしれない予め決定されたサイトカインを除去するための前処理を必要とすることがある。例えば、ＩＬ−２は、若干の細胞においてＩＦＮ−γの生産を増加させる。このように、検定において用いられるヘルパーＴ細胞に応じて、検査される試料からＩＬ−２を除去すべきであることがある。このような除去は、便宜上、標準的な抗すイトカインアフィニティーカラムに試料を通過させることによって達成される。

便宜上、ＩＬ−１０活性の単位は、米国特許第４，５５９．３１０号明細書に記載され且つＡＴＣＣから受託番号ＣＲＬ８３０６として入手可能なＭＣ／９細胞のＩＬ−４誘導増殖を増加させるＩＬ−１０の能力によって定義される。１単位／ｍｌは、引き続きの検定においてＩＬ−４の量を上回ってＭＣ／９増殖の最大刺激の５０％を与えるＩＬ−１０の濃度として定義される。標準的な微量滴定プレート中の培地５０μｍ／ウェル中のＩＬ−４およびＩ　Ｌ−１０の二重反復または三重反復希釈を調製する。培地は、ＲＰＭＩ　１６４０．１０％ウシ胎児血清、５０μＭ　２−メルカプトエタノール、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／Ｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／Ｌ）から成る。培地中でチミジン（例えば、培地中５０μＣｉ／ｍｌ）を０．５〜１、ＱｉＣｉ／ウェルで加え、再度細胞を一晩中インキュベートし；次に、細胞を採取し、そして取込まれた放射能を測定する。

本明細書中に記載のＩＬ−１０の変異体および類似体は、例えば、サムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　コールド−スプリング・ハーバ−・プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ）、　コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク；若しくはオースベル（１９８７年および定期補遺）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ旦ｍ、グリーン／ワイジー、ニューヨークに記載の組換え手段によって；またはアサトン（Ａｔｈｅｒｔｏｎ）ら（１９８９）Ｓｏｌ　１ｄＰｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬブレス、オックスフォードに記載の合成技術によって製造することができる。

Ｉｌ、精製および薬剤組成物本発明のポリペプチドが可溶性の形で、例えば、形質転換された酵母または哺乳動物細胞の分泌産物として発現される場合、それらは、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィーおよび／または類似のものを含む当該技術分野の標準法にしたがって精製することができる。例えば、「酵素精製および関連技術（ＥｎｚｙｍｅＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）ＪＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ　、２２：２３３〜５７７　（１９７７）；およびスコープス（Ｓｃｏｐｅｓ）Ｒ，、ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ（スプリンガー拳フエアジーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク、１９８２年）は、このような精製における指針を提供する。同様に、本発明のポリペプチドが不溶性の形で、例えば、凝集体、封入体または類似のものとして発現される場合、それらは、遠心扮離によって破壊された宿主細胞から封入体を分離し、カオトロピック物質および還元剤によって封入体を可溶化し、可溶化された混合物を希釈し、そしてポリペプチドが生物学的に活性のコンホメーシヨンをとるようにカオトロピック物質および還元剤の濃度を低下させることを含む当該技術分野における標準法によって精製することができる。後者の手順は、参考として包含される以下の参考文献に開示されている。すなわち、ウィンクラ−（Ｗｉ　ｎｋ　ｌ　ｅ　ｒ）　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５：４０４１〜４０４５　（１９８６）；ウィンクラ−ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　、３：９９２〜９９８　（１９８５）　；コス（Ｋｏ　ｔ　ｈ）ら、米国特許第４．５６９，７９０号明細書；および欧州特許出願第８６３０６９１７．５号明細書および同第８６３０６３５３．３号明細書。

本明細書中で用いられる「有効」とは、体宿主性移植片病または組織拒絶を減少させるかまたは防止するのに十分な量を意味する。例えば、ポール（Ｐａｕｌ）　（１９８９）　Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ラヴエン° ブレス（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨークを参照されたい。特定の患者に対する有効量は、移植された組織の状態、種類および量、患者の全体的健康状態、投与法、副作用の苛酷さ等のような因子に応じて変更することができる。概して、ＩＬ−１０は、有効量のＩＬ−１０および薬剤担体を含む薬剤組成物として投与される。薬剤担体は、本発明の組成物を患者に与えるのに適当な何等かの相溶性無毒性物質でありうる。概して、このような薬剤の非経口投与に有用な組成物は周知である。例えば、Ｒｅｍｆｎ　ｔｏｎ’　ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、１５版（マッグ・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、イーストン、ＰＡ　１９８０年）。或いは、本発明の組成物は、植込み可能なまたは注射可能な薬剤デリバリ −システムによって患者に導入することができる。例えば、アーカート（Ｕｒｑｕｈａｒｔ）ら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｔｏｘｉｃｏｌ、、２４巻、１９９〜２３６頁（１９８４）；ルイス（Ｌｅｗｉｓ）　ら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　ｏｆＰｅｓｔｉｃｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（プレナム争ブレス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８１年）；米国特許東３，７７３，９１９号明細書；米国特許第３，２７０．９６０号明細書；等。

非経口投与される場合、ＩＬ−１０は、薬剤担体と一緒に注射可能な単位剤形（溶液・懸濁液、エマルジョン）中に配合される。このような担体の例は、規定食塩水、リンガ−液、デキストロース溶液およびハンクス液である。非水性担体、例えば、固定油およびオレイン酸エチルを用いてもよい。好ましい担体は、５％デキストロース／食塩水である。担体は、少量の添加剤、例えば、等優性および化学安定性を増強する物質、例えば、緩衝剤および保存剤を含むことができる。

ＩＬ−１０は、好ましくは、凝集体および他のタンパク質を実質的に含まない精製された状態において約５〜２０μｇ／ｍｌの範囲の濃度で配合される。好ましくは、ＩＬ−１０は、約５０〜８００μｇ／日の範囲の量が与えられるように（すなわち、約１〜１６μｇ／ｋｇ／日）連続注入によって投与される。毎日の注入量は、副作用および血球計数の監視に基いて変更することができる。

実施例以下の実施例は、本発明を例証するのに役立つ。選択されたベクターおよび宿主、試薬の濃度、温度並びに他の変数値は、本発明の適用を単に例示するためのものであり、本発明を制限するものと考えられるべきではない。

実施例１．細菌宿主におけるヒトＣ３ｌＦの発現合成ヒトＣ３ｌＦ遺伝子を、多数の化学的に合成された二本鎖ＤＮＡフラグメントから組み立てて、ＴＡＣ−ＲＢＳ−ｈＣ３ＩＦと称する発現ベクターを生成する。クローニングおよび発現は、標準的な細菌システム、例えば、ヴイエラ（Ｖｉｅｒａ）およびメリック（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、Ｇｅｎｅ、１９巻、２５９〜２６８頁（１９８２）に記載された大腸菌（Ｅ、ｃｏ　ｌ　ｉ）　Ｋ−１２菌株ＪＭＩ０１、ＪＭ１０３または類似のものにおいて行なわれる。制限エンドヌクレアーゼ消化およびリガーゼ反応は、標準的なプロトコルを用いて実施される。例えば、マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　（）−ルド・スプリングＩＩハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク、１９８２年）。

アルカリ法（マニアナイスら、上記に引用）は、小規模のプラスミド製造に用いられる。大規模製造用には、等容量のイソプロパツールを用いて核酸を透明な溶菌液から沈殿させるアルカリ法の変法を用いる。塩化セシウム平衡密度遠心分離および臭化エチジウムによる検出の前に、冷２．５Ｍ酢酸アンモニウムによる沈殿を用いてＲＮＡを除去する。

濾紙ハイブリッド形成のために、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）５４０円形フイルターを用いてコロニーを取り上げた後、それを０．５Ｍ　ＮａＯＨ，１，５Ｍ　ＮａＣ１；ＬＭ）リスＨＣＩ　ｐＨ８，０，１，５Ｍ　ＮａＣ１で連続処理しくそれぞれ２分間）；且っ８０℃で２時間加熱することによって溶解させ且つ固定させる。ハイブリッド形成は、６ｘＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、０．１である。（２０ｘＳＳＰＥは、８００　ｍ　ｌ　）Ｈ２０中ｉ、ニーＮａＣ１を１７４ｇ。

ＮａＨ２ＰＯ４・９Ｈ２０を２７．６ｇおよびＥＤＴＡを７．４ｇ溶解させることによって調製される。ｐＨをＮａＯＨで７．４に調整し、容量を１リツトルに調整し、そして全部をオートクレーブによって滅菌する。）フィルターを１ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄する（１５分間、室釦。オートラジオグラフィー（フジ（Ｆｕｊ　１）ＲＸフィルム）後、陽性コロニーは、フィルター上において再増殖コロニーを青色染色コロニーと並べることによって位置決定される。ＤＮＡは、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、７４巻、５４６３頁（１９７７）のジデオキシ法によって翫ｌり決定される。ジデオキシ反応の鋳型は、Ｍ１３ｍｐベクター中に再クローン化された適切な部分の一本鎖ＤＮＡ、例えば、メリックら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、９巻、３０９頁（１９８１）；かまたは、ミニアルカリ法によって製造され且つ０．２Ｍ　ＮａＯＨで変性され（５分間、室温）、そして２容量のエタノールを加えることによって０．２Ｍ　ＮａＯＨ，１，４３Ｍ酢酸アンモニウムから沈殿した二本鎖ＤＮＡである。ＤＮＡは、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３８０Ａ合成機を用いてホスポルアミダイト化学によって合成される。合成、脱保護、切断および精製（７Ｍ尿素ＰＡＧＥ、溶離、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィー）は、３８０Ａ合成機マニュアルに記載されたように行なわれる。

クローン化される合成りＮＡの相補鎖（それぞれ４００　ｎ　ｇ）を混合し、そして反応容量５０μｍ中においてポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化する。このＤＮＡを、適当な制限酵素によって消化されたベクターＤＮＡ１μｇと連結させ、連結反応は容量５０μＩ中において室温で４〜１２時間である。リン酸化、制限酵素消化、ポリラーゼ反応および連結反応のための条件は記載されている（マニアナイスら、上記に引用）。コロニーは、アンピシリン、イソプロピル−１ −チオーβ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）（０，４ｍＭ）および５−ブロモ− ４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｘ−ｇａｌ）（４０ｍｇ／ｍｌ）を補足したＬ寒天上に平板培養することによって（望まれる場合）１ａｃＺ　と印される。

ＴＡＣ−ＲＢＳベクターは、ＤＮＡポリメラーゼを用いてｔａｃＰ含有プラスミドｐＤＲ５４０（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））の単−ＢａｍＨ１部位をフィルインすることによって構築される。次に、これを非リン酸化合成オリゴヌクレオチド（ファーマシア）に対して連結して、本明細書中において配列番号５で与えられ且っＲＢＳと称される共通リポソーム結合部位をコードしている二本鎖フラグメントを生成する。連結反応後、混合物をリン酸化し且っ５ｓｔｌリンカ−ＡＴＧＡＧＣＴＣＡＴと再連結させる。次に、この複合体を５ｓｔｌおよびＥｃｏＲＩで切断し、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって１７３塩基対（ｂ　ｐ）の７ラグメントを単離し且っＥｃｏＲＩ−８ｓ　ｔ■制限ｐＵｃ１９　（）７−マシア）（以下に記載）中にクローン化する。最終構築物（ＴＡＣ−ＲＢＳと称する）のＲＢＳ−ＡＴＧ−ポリリンカー領域の配列を図２に示す。

合成ＩＬ−１０遺伝子は、８工程でｐＵｃ１９プラスミドに組み立てられる。

各工程での欠失のないインサートおよび／またはインサートは、工程１において挿入されたＡＴＧ出発コドンを有する枠中のｐＵｃ１９の遺伝子１ａｃＺ（α）を維持することによってクローニング後に検出することができる。欠失のあるクローンおよび／または挿入変化は、ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有するＬ−アンピシリンプレート上の青色コロニーに印をつけることによって濾去することができる。或いは、各工程でのインサートの配列は、例えば、ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から入手可能な小規模プラスミドＤＮＡ標品上の普遍的配列決定用プライマーを用いて容易に確認することができる。

工程１において、ＴＡＣ−ＲＢＳベクターを５ｓｔＩで消化し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ（その３′−エキソヌクレアーゼ活性は、５ｓｔｌカツトの３′突出鎖を消化してプラント末端フラグメントを生成する）で処理し、モしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼの失活後にＥｃｏＲＩで処理して、ＴＡＣ−ＲＢＳ部分を含み且つＡＴＧ出発コドンのところにプラント末端および反対側の末端にＥｃｏＲＩカットを有する１７３ｂｐフラグメントを生成する。最後に、１７３ｂｐのＴＡＣ −ＲＢＳフラグメントを単離する。

工程２において、工程１の単離されたＴＡＣ−ＲＢＳフラグメントを、ＥＣ０Ｒ１／ＫｐｎＩ消化プラスミドｐＵｃ１９と、核酸配列が本明細書中において配列番号６および７で示されていて、その上流末端にプラント末端およびその下流末端のところにＫｐｎｌカットに対応するスタッガー末端を有する合成フラグメントＩＡ／Ｂと混合する。このＫｐｎｌ末端は、Ｂｓ　ｔＥＩ　Ｉ部位に隣接し且つその下流にある。フラグメントを連結して工程２のｐＵｃ１９を生成する。

工程３において、合成フラグメント２Ａ／Ｂおよび３Ａ／Ｂを工程２のＢｓｔＥｌｌ／ＳｍａＩ消化ｐＵｃ１９と混合しく増幅および精製後）且つ連結して、工程３のｐＵｃ１９を生成する。合成フラグメント２Ａ／Ｂの核酸配列を本明細書中においてｉｉＪ＋１番号８および９で示し且つ合成フラグメント３Ａ／Ｂの核酸配列を本明細書中において配列番号１０および１１で示す。フラグメント３Ａ／Ｂの下流末端が、Ｓｍａ　Ｉプラント末端を形成するエキストラ塩基を有することに注目されたい。これらのエキストラ塩基を工程４において切断する。更に、フラグメント２Ａ／Ｂおよび３Ａ／Ｂは相補的９残基一本鎖末端を有し、それらは混合の際にアニールして２Ａ／Ｂの上流ＢｓｔＥＩＩカットおよび３Ａ／Ｂの下流プラント末端を残してｐＵｃ１９に対して連結する。

工程４において、工程３のｐＵｃ１９をＡｆ　１１１／ＸｂａＩで消化し、増幅させ、精製し、再精製し、核酸配列が本明細書中において配７１番号１２および１３で示されている合成フラグメント４Ａ／Ｂと混合し、そして連結させて工程４のｐＵｃ１９を生成する。

工程５において、工程４のｐＵｃ１９をＸｂａＩ／５ａｌｌで消化し、増幅させ且つ精製し、そして核酸配列が本明細書中において配列番号１４および１５で示されている合成フラグメント５Ａ／Ｂと混合し且つ連結させて工程５のｐＵＣ１９を生成する。フラグメント５Ａ／Ｂの５ａｌＩスタツガー末端は、工程６でのＨｐａｌによる消化によって除去されることに注目されたい。

工程６において、工程５のｐＵｃ１９をＨｐａＩ／Ｐｓｔｌで消化し、増幅させ且つ精製し、そして核酸配列が本明細書中において配７１番号１６および１７で示されている合成フラグメント６Ａ／Ｂと混合し且つ連結させて、工程６のｐＵＣ１９を生成する。

工程７において、工程６のｐＵｃ１９をＣ１ａＩ／５ｐｈｌで消化し、増幅させ且つ精製し、そして核酸配７１Ｊが本明細書中において配列番号１８および１９で示されている合成フラグメント７Ａ／Ｂと混合し且つ連結させて、工程７のｐｔｒＣ１９を生成する。

工程８において、工程７のｐＵｃ１９をＭｌｕＩ／ＨｉｎｄｌＩＩで消化し、増幅させ且つ精製し、そして合成フラグメント８Ａ／Ｂおよび９Ａ／Ｂと混合し且つ連結させて最終構築物を生成した後、それを、例えば、ＡＴＣＣから受託番号３３８７６として入手可能な大腸菌に一１２菌株ＪＭＩＯＩ中に標準的な技法によって挿入する。合成フラグメント８Ａ／Ｂの核酸配列を本明細書中において配列番号２０および２１で示し且つ合成フラグメント９Ａ／Ｂの核酸ＩＥＦＩＪを本明細書中においてＥ９す番号２２および２３で示す。培養後、タンパク質をＪＭＩＯ１細胞から抽出し、そして該抽出物の希釈液の生物学的活性を検査する。

実施例２．Ｃ０Ｓ７サル細胞におけるｖｌＬ−１０の発現ｖＩＬ−１０の読み取り枠をコードしている遺伝子を、増幅されたフラグメントをＥｃｏＲＩ消化ｐｃＤ（ＳＲα）ベクター（図１）中に後で挿入可能にするプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させた。挿入されたフラグメントのコーディング鎖を、本明細書中において配列番号１５で示す。

適当な配向のインサートを有するクローンを、ｖＩＬ−１０の発現および／または制限消化の電気泳動パターンによって識別した。ｖＩＬ−１０遺伝子を有する一つのこのようなベクターをｐＢｃＲＦｌ　（ＳＲα）と称し且つＡＴＣＣに受託番号６８１９３として寄託した。ｐＢｃＲＦｌ　（ＳＲα）を大腸菌ＭＣ１０６１中で増幅させ、標準的な技法によって単離し、そして以下のようにＣＯ３７サル細胞をトランスフェクトするのに用いた。すなわち、トランスフェクシヨンの前日こ、ＣＯ５７サル細胞約１．５Ｘ１０６個を、それぞれ１００ｍｍプレート上の５％ウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ）および２ｍＭグルタミンを含むダルベツコ修飾イーグル培地（ＤＭＥ）中に播種した。トランスフェクションを実施するために、トリプシンとのインキュベーションによってＣ０８７細胞を皿から取出し、血清不含ＤＭＥで２回洗浄し、そして血清不含ＤＭＥ中に細胞１０７個／ｍｌまで懸濁させた。アリコート０．７５ｍ１ＧＤＮＡ２０μｇと混合し、そして滅菌０．４ｃｍエレクトロボレーシコンキュベツトに移した。１０分後、細胞をバイオラド・ジーン争パルサー（ＢｉｏＲａｄ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒ）装置中において２００ボルト、９６０μＦでパルスした。更に１０分後、細胞をキュベツトから取出し、そして５％ＦＣ３，２ｍＭグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンを含むＤＭＥ２０ｍｌに加えた。混合物を４個の１００ｍｍ組織培養皿に分別した。３７℃、５％ＣＯ２で１２〜２４時間後、培地を、１％ＦＣ３のみを含む同様の培地と交換し、インキュベーションを３７ ℃、５％ＣＯ２で更に７２時間続けた後、培地を集め、そしてＩＦＮゴ合成を阻害するその能力を検定した。

新たに単離されたＰＢＬ　（細胞約２Ｘ１０６個／ｍｌ）のアリコート１０ｍ１を、（ｉ）５％ＦＣ３および２ｍＭグルタミンを補足した９０％ＤＭＥ；と、（ｉ　１）ｐＢｃＲＦｌ　（ＳＲα）で予めトランスフェクトされたＣＯ３７細胞からの１０％上澄みとから成る培地中においてＰＨＡ　（１００ｎｇ／ｍ１）と −緒に３７℃でインキュベートした。２４時間後、細胞および上澄みを採取して、ＩＦＮ−７ｍＲＮＡかまたはＩＦＮ−γタンパク質の存在をそれぞれ検定した。対照は、１０％上澄みが、無関係のｃＤＮＡインサートを有するプラスミドで予めトランスフェクトされたＣＯ３７培養物からであったことを除き、同様に処理された。ｖＩＬ−４０で処理された試料は、対照に相対してＩＦＮ−７合成を約５０％阻害した。

実施例３．大腸菌におけるｖｌＬ−１０の発現本明細書中において配列番号４で示した成熟ｖｌＬ−１０をコードしている遺伝子は、大腸菌において発現させることができる。

ｐＢｃＲＦｌ（ＳＲα）のｃＤＮＡインサートをＭ１３プラスミド中に再クローン化し、そこにおいてそれは、特定部位の突然変異誘発によって２回変化する。

すなわち、最初に、成熟ｖｌＬ−１０ポリペプチドのコーディング領域の５′末端にＣｌａｌ部位を形成し、そして２回目に、成熟ｖｌＬ−１０ポリペプチドのコーディング領域の３′末端にＢａｍＨ１部位を形成する。次に、突然変異した配列は、以下に記載したＴＲＰＣＩＩ発現ベクター中に容易に挿入される。

ＴＲＰＣＩＩベクターは、合成共通ＲＢＳフラグメントをＣ１ａＩリンカ−（ＡＴＧＣＡＴ）に対して連結することによっておよび得られたフラグメントを（Ｃｌａｌ部位を含むように予め修飾された）Ｃ１ａｌ制限ｐＭＴ１１ｈｃ中にクローニングすることによって構築された。ｐＭＴｌｌｈｃは、πｖＸプラスミドＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉポリリンカー領域を有するｐＢＲ３２２の小型の（２，３キロベース）高コピーＡＭＰＲ，ＴＥＴＳ誘導体である。（πｖｘは、マラトリー、１９８２年に記載されている）。これを、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでｐＭＴｌｌｈｃを制限し、得られた付着末端をフィルインし、そしてＣ１ａＩリンカ−（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）と連結し、それによってＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位を復元し且つＳｍａ１部位をＣｌａｌ部位で置換することによってＣｌａｌ部位を含むように修飾した。ＴＲＰＣＩＩ構築からの一つの形質転換細胞は、ＣｌａＩ部位を隣接させたタンデムＲＢＳ配７１を有した。ＣｌａＩ部位の一つおよびＲＢ　５ＷｉＪ１の第二コピーの一部分を、ＰｓｔＩでプラスミドを消化し、Ｂａ１３１ヌクレアーゼで処理し、ＥＣ０Ｒ１で制限し、そして全４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下において７４　ＤＮＡポリメラーゼで処理することによって除去した。得られた３０〜４０ｂｐフラグメントをＰＡＧＥによって回収し、そしてＳｍａ　Ｉ制限ｐＵｃ１２中にクローン化した。

次に、仁コルス（Ｎｉｃｈｏｌｓ）らによってＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１巻、１５５頁（アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、Ｎ、Ｙ、１９８３）に記載された）ｐＫＣ１０１由来の２４８ｂｐの大腸菌ｔ　ｒｐＰ含有ＥｃｏＲＩフラグメントをＥｃ。

Ｒ１部位中にクローン化して、図２に図示されているＴＲＰＣＩＩ構築を完了した。ＴＲＰＣＩＩは、最初にそれをＣ１ａｌおよびＢａｍＨＩで消化し、それを精製した後、標準的な連結反応溶液中において成熟ＢＣＲＦ１をコードしているヌクレオチド配ｙすを有するＭ１３のＣ１ａｌ−ＢａｍＨＩフラグメントとそれを混合することによってｖＩＬ−１０のベクターとして用いられる。ＴＲＰＣＩＩ−ＢＣＲＦｌと称するインサート含有ＴＲＰＣＩＩを、例えば、ＡＴＣＣから受託番号３３８７６として入手可能な大腸菌に１２菌株ＪＭ１０１中において増殖この実施例は、ベジャラノ（Ｂｅｊａｒａｎｏ）ら（１９８２）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　４：１３８９〜１３９７によって本文書の優先日後に開示された。それは、適当な環境におけるＩＬ−１０処理の有効性についてのインビトロの証拠を提供する。更に詳しくは、それは、ＩＬ−１０が、 −次混合リンパ球培養（ＭＬＣ）において生じた同種異系増殖性および細胞障害性Ｔ細胞応答を阻害することを実証する。

この実施例は、Ｉ　Ｌ−１０がアロ抗原誘導増殖性応答を用量依存型でどのように阻害したかを示す。抑制作用は、Ｉ　Ｌ−１０を培養の開始時に加えた場合に最適であって、それがＴ細胞活性化の初期段階に作用することが示唆された。増殖性応答は、抗ＩＬ−ＬＯｍＡｂの存在下において増加して、内因的に生じたＩＬ−１０が一次ＭＬＣにおける増殖を抑制することが示された。刺激細胞が、照射された同種異系末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、精製された単球またはＢ細胞であろうとなかろうと、ＩＬ−１０の阻害作用はなお観察された。減少された増殖性応答が高濃度の外因性ＩＬ−２によって回復されることはなく、ＩＬ−１０の作用がＩＬ−２合成の阻害にのみ関係しているのではないことが示された。更に、−次ＭＬＣにおけるＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＴＮＦ−αの生産は、ＩＬ−１０によって低下し且つ抗ＩＬ−１０ｍＡｂの存在下で増加した。最も強い作用は、ＩＦＮ−７の生産において観察された。ＩＬ− １０は増殖性応答を減少させるが、ＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３”ＣＤ８”Ｏ比率は、ＩＬ−１０で処理された培養物および対照培養物において同様のままであった。しかしながら、ＣＤ２５＋およびＨＬＡ−ＤＲ＋発現によって判断きれる活性化ＣＤ３　Ｔ細胞の百分率は、ＩＬ−４０の存在下において一貫して減少した。

Ｉ　Ｌ−１０は、同種異系特異的増殖性応答およびサイトカイン生産を阻害する。更に、減少した増殖性応答を外因性ＩＬ−１２によって復元することはできなかったことが実証さね、Ｉ　Ｌ−１０は、主として刺激細胞の刺激能力を低減させることによって同種異系特異的増殖性Ｔ細胞応答を阻害することが示唆された。

これらのデータは、ＩＬ−１０がインビトロの同種異系応答に対して重要な調節作用を有することを示す。

培地および試薬細胞を、１０％プール熱失活ヒトＡＢ血清を補足したイセル（Ｙｓｓｅｌ’ｓ）培地中で培養した。イセルら（１９８６）Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６＋１１８７〜　を参照されたい。

中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂ　１９Ｆ１をｖｌＬ−１０に対して増加させ、そしてｈＩＬ−１０およびｖＩＬ−１０を効率よく中和した。ベジャラノら（１９８５）Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　３５：３２７；および１９９０年６月２８日に寄託されたＡＴＣＣ寄託ＨＢ１０４８７を参照されたい。ＩＬ−２Ｒｐ５５鎖を認識するＢＢｌｏｍＡｂは、Ｊ、ライジェネス博士（Ｄｒ、Ｊ。

Ｗｉ　ｊｄｅｎｅｓ）（ＣＲＴＳ、ブザンソン、フランス；）１−ブ（Ｈｅｒｖｅ）ら（１９）Ｂｌｏｏｄ　７５：１０１７〜１０２３を参照された（′Ｉ）から快く贈呈された。ネズミ抗ＣＤ３　（抗Ｌｅｕ−４、ＩｇＧ１）、抗ＣＤ４　（抗Ｌｅｕ　３ａＳＩｇＧ１）、抗ＣＤ８　（抗Ｌｅｕ−２ａ、ＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ１４（抗Ｌｅｕ−Ｍ３、）ｇＧ２ｂ）　、抗ＣＤ１９（抗Ｌｅｕ−１２、ＩｇＧ１）、抗ＣＤ２５　（抗ＩＬ２Ｒｐ５５、Ｉ　ｇＧｌ）　、抗ＣＤ５６　（抗Ｌｅｕ−１９、ＩｇＧ１）、抗ＨＬＡ−ＤＲ（クローンＬ２４３、Ｉ　ｇＧ２ａ）ｍＡｂおよび適当なイソタイプの対照ｍＡｂは、ベクトン・デイキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）（マウンテン・ビュー、ＣＡ）から購入された。

細胞調製試料バフィーコート調製試料は、スタッフォード大学病因の血液銀行（ｔｈｅＢｌｏｏｄ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　５ｔａｎｆｏｒｄ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｏ５ｐｉｔａｌ）から入手した。ＰＢＭＣは、フィコールハイバク（Ｆｉｃｏｌｌｈｙｐａｑｕｅ）（７７−ｖシア、ウプサラ、スウェーデン）上の密度勾配遠心分離によって単離した。

Ｔ細胞の精製用に、ＰＢＭＣは、プラスチック付着性および鉄食作用によって単球を除去された。ベジャラノら（１９８５）Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　３５：３２７〜　を参照されたい。非付着細胞をナイロンクールに通過させ（シュリアＸ（Ｊｕｌｉｕｓ）ら（１９７３）Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、３：６４５〜　）、そして次に、ＮＫ細胞を磁気ビーズによる除去によって除去した。簡単にいうと、飽和濃度の抗ＣＤ５６ｍＡｂを用いて４℃で３０分間染色した後、細胞をハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、次に、ヒツジ抗マウスＩｇＧで被覆された磁気ビーズ（ダインビーズ（Ｄｙｎｂｅａｄｓ）Ｍ−４５０ヒツジ抗マウスＩｇＧ、ダイナル（Ｄｙｎａ　１）ＡＳ、オス口、ノルウェイ）をビーズ：細胞比４０：１で用いてロゼツト形成させた。混合物を穏やかに振とうしながら４℃で３０分間インキュベートした後、製造者の推奨にしたがって磁気粒子コンセントレータ−を用いてロゼツト形成した細胞を除去した。得られた細胞調製試料は、〉９９％がＣＤ３　、〈１％がＣＤ１４　、＜１％がＣＤＩ＋９　、〈１％がＣＤ５６　；であった。

＋ＣＤ１４　単球の単離のために、ＰＢＭＣをＰＥ結合ＣＤ１４ｍＡｂ　（ベクトン・ディキンソン、マウンテン・ビュー、ＣＡ）で染色し、ＨＢＳＳ中で２回洗浄した後、ファクスター・プラス（ＦＡＣ３ｔａｒ−Ｐｌｕｓ）（ベクトン・ディキンソン、サニーベーノ区ＣＡ）を用いてＣＤ１４＋およびＣＤ１４−集団に選別した。Ｗｌされた集団の再分析により、９９．５％より大の精製された細胞がＣＤ１４　であったことが分かった。いくつかの実験において、単球は、血液成分分離器中での密度遠心分離に続いて遠心水筆によって末梢血液から単離された（フィグド−（Ｆ　ｉ　ｇｄｏ　ｒ）　ら（１９８４）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　６８：６８〜　を参照されたい）。これらの単球調製試料は、非特異的エステラーゼ染色によって判断したところ、〉９５％純度であった。

精製された８９２８球は、磁気ビーズ除去によって得られた。簡単にいうと、非付着ＰＢＭＣを、飽和濃度の抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１４および抗ＣＤ５６ｍＡｂと一緒に４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＨＢＳＳ中で２回洗浄した後、ヒツジ抗マウスエｇｃで被覆された磁気ビーズ（ダイナルＡＳ、オスロ、ノルウェイ）をビーズ：細胞比４ｏ：１で用いてロゼツト形成させた。次に、ロゼツト形成した細胞を前記のように除去した。得られた集団は〉９８％のＣＤ１９　細胞から成った。

増殖検定ＰＢＭＣまたは高度に精製されたＴ細胞（細胞１ｘ１ｏ５個／ウェノりを種々の照射（４０００ラド）同種異系刺激細胞によって刺激した。ＰＢＭＣ，ＣＤＩ＋４　単球、遠心水筆によって分離された単球および精製８９２８球を、刺激細胞としてＲ：Ｓ比それぞれ１：１．５二１．５：１および３：１で用いた。培養は、９６ウ工ル平底微量滴定プレート中の培地２００ｕｌ中のＩＬ−１０不存在下（中実棒：図５〜７）または存在下調線棒）において三重反復試験で行なった培養物を［３ＨコＴｄＲによって５日間の培養期間の最後の１０時間パルスさせ且つガラス繊維フィルター上に採取し、そして放射能を液体シンチレーション計数によって測定した。結果を図４において［３８１ＴｄＲ取込みｃ、ｐ、　ｍ。

として表わし、それらは三重反復培養の平均である。

大量培養ＰＢＭＣまたは高度に精製されたＴ細胞を、５０ｍ１フラスコ中において前記のＲ：Ｓ比での照射同種異系細胞と一緒に、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−１０の不存在下または存在下において応答細胞濃度１ｘ１ｏ６個／ｍｌで培養した。５〜６日後、上澄みを集め且つそれらのサイトカイン含量の測定用に一２０℃で凍結させたが、細胞は表現型分析用に回収された。

蛍光分析大量培養から回収された細胞（１０５個）を、■字型底微量滴定プレート（フロー・ラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ｖクリーン、Ｖａ）中において精製されたＰＥ結合ｍＡｂｌｏμｍと一緒に４℃で３０分間インキュベートした。二重標識実験において、ＦＩＴＣ標識後に細胞を１％正常マウス血清中で２回洗浄し、そしてＰＥ結合ｍＡｂを加えた。細胞を、１％ＢＳＡおよび０−　０２Ｍ　ＮａＮａを含むＨＢＳＳで２回洗浄した後、ファクスカン（ＦＡＣ５ｃａｎ）で分析した。

リンホカイン測定大量培養から５日目または６日目に集められた上澄みの、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、ＩＦＮ −γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、Ｉ　Ｌ−５およびＩＬ、−６の含量をリンホカイン特異的エリザ（バケッタ（Ｂａｃｃｈｅｔｔａ）ら（１９８９）Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４４＋９０２〜　）によって検定した。ＩＬ−２生産の定量化のために、ＩＬ−２消費を最小限にするように、抗ＩＬ−２受容体抗体ＢＢＩＯの１０ｍｇ／ｍｌ存在下において培養を行なった。上澄みを７２時間後に採取し、そしてＩＬ−２濃度を特異的エリザによって決定した。各種エリザの感度は、ＩＬ−４に関して４０ｐｇ／ｍｌ　；　ＩＬ−２、ＩＬ−５およびＩＬ−６に関して２０１）ｇ／ｍｌ　；ＧＭ−Ｃ３Ｆに関して５０ｐｇ／ｍｌ；そしてＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γに関して１１００ｐ／ｍ１であった。

ＩＬ−１０はＭＬＣにおける増殖性応答を阻害する古典的ワンウェイ−次ＭＬＣにおける増殖性応答に対するＩＬ−１０の作用を決定するために、ＰＢＭＣを、種々の濃度のＩＬ−１０の不存在下または存在下において同種異系ＰＢＭＣを用いて刺激した。図４は、ＩＬ−１０が用量依存型で増殖性応答を阻害したことを示している。有意の阻害作用は、ＩＵ／ｍ１程度の低いＩＬ−１０濃度で既に観察されたが、（種々の実験において３３〜９５％阻害である）最大阻害作用は１００Ｕ／ｍｌのＩ　Ｌ−１０濃度で得られた。ＩＬ−１０のこれらの阻害作用は、阻害の特異性を示す抗ＩＬ−１０ｍＡｂによって完全に中和された（図４ｃ）。実際に、中和性抗ＩＬ−１０ｍＡｂの存在下で行なわれたＭＬＣにおける増殖性応答は有意に増加して、内因的に生じたＩＬ−１０が一次ＭＬＣにおける増殖性応答の抑制を招くことが示された。

ＭＬＣにおけるＩＬ−１０の阻害作用に対する単球の作用ＩＬ−１０は、クラスＩＩＭＨＣ抗原の下方制御によって単球のＡｇ提示（ＡＰ）能力を強（低減させることが知られている。対照的に、エプスタイン・バールウィルス（ＥＢＶ）で形質転換されたＢ細胞（ＥＢＶで形質転換されたリンパ芽球様細胞系、ＥＢＶ− ＬＣＬ）のクラスＩＩＭＭＣ発現およびＡＰ能力はＩＬ−１０による影響を受けない。

この実験において、負の選択によって得られた高度に強化されたＴ細胞を応答細胞として用いる。遠心水筆によってかまたはＰＢＭＣからＣＤ１４　細胞を直接選】りすることによって強化された精製単球集団、精製８９２８球およびＥＢＶ −ＬＣＬを刺激細胞として用いる。ＩＬ−１０は、単球が遠心水筆によって得られたか（図５ａ）またはＦＡＣ８によって正にｇｌＪされたか（図５ｂ）とは無関係に、同種異系単球によって誘導された増殖性応答を強く阻害したが；同種異系ＥＢＶ−ＬＣＬに対する増殖性応答は依然として影響を受けなかった（図５ｄ）。可溶性抗原にたいする具体的な増殖性応答で観察されたように、これらの結果は、同種異系ＥＢＶ−ＬＣＬではな（同種異系単球を刺激細胞として用いる場合に同種異系特異的増殖が阻止されることを示している。新たに単離され高度に精製された同種異系Ｂ細胞によって誘導された増殖性応答は、更に、ＩＬ−１０によって阻害され（図５ｃＬ　ＩＬ−１０がこれらの細胞でのクラス■またはクラス１１ＭＭＣ発現に対して測定しつるほどに作用しないという事実にもかかわらず、ＩＬ−１０の抑制作用はＢ細胞を刺激剤として用いる場合にも存在することが示された。

速度論的実験は、ＭＬＣに誘導された増殖に対するＩＬ−１０の作用が、時間経過に伴って徐々に減少することを示した。ＩＬ−１０は、−次培養の開始時に加えられた場合に最も有効であった；すなわち、培養の開始後２日目または３日目に加えられた場合、その作用は最低にすぎなかったし、しかも明瞭な用量応答作用は観察されなかった（図６）。これらの結果は、Ｉ　Ｌ−１０が、ＭＬＣにおけるＴ細胞の活性化の初期段階に作用することを示した。

ＩＬ−１０はＭＬＣにおけるサイトカイン生産を妨げるＩＬ−１０は、抗ＣＤ３またはＰＨＡによって活性化されたＰＢＭＣによる■ＦＮ−γおよびＧＭ−Ｃ３Ｆ生産を減少させることが分かっている。更に、ＩＬ−１０は、単球によるサイトカインの生産を阻害する。ワンウェイＭＬＣにおけるサイトカイン生産に対するＩＬ−１０の作用を決定するために、同種異系ＰＢＭＣを応答細胞としておよび刺激細胞として用いた。培養は、ＩＬ−１０または抗ＩＬ−１０ｍＡｂの不存在下または存在下において行なわれ一上澄みを５日目に集め、そしてそれらのサイトカイン含量を検定した。表１は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＴＮＦ−αがＭＬ、Ｃにおいて生産されたこと並びにＩＬ−１０がこれらのサイトカインの生産を様々な程度に阻害したことを示している。有意のＩＬ−４生産は観察されなかったし、ＩＬ−５の濃度は１１００ｐ／ｍ１未満であった。ＩＬ−１０の生産は、種々の実験において１０００〜３０００　ｐ　ｇ／ｍ　ｌであった。外因性ＩＬ−１０の最も強い阻害作用はＩＦＮ−γの生産において観察されたが、最も弱い阻害作用はＩＬ−６生産において観察された。

増加したＩＦＮ−７、ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＴＮＦ−ａ濃度は、抗ＩＬ−１０ｍＡｂの存在下で行なわれたＭＬＣの上澄みにおいて観察された（表１）。サイトカイン生産に対する抗ＩＬ−１０ｍＡｂのこれらの増強作用は用量依存性であった。総合すると、これらの結果は、内因性および外因性双方のＩＬ−１０が、検査されたサイトカインの生産を減少させることを示している。ＭＬＣにおけるＩＬ −２生産に対するＩＬ−１０の作用を評価するために、および活性化Ｔ細胞によるＩＬ−２消費を最小限にするために、培養は、ＩＬ−１０および抗Ｉ　Ｌ−２受容体ｍＡｂＢＢ１０の存在下または不存在下において行なった。これらの実験において、ＩＬ−１０はＩＬ−２生産を用量依存型で妨げた（図７）。ＩＬ（０を１００Ｕ／ｍｌで加えた場合、測定しうる濃度のＩＬ−２を検出することはできなかった。

」２アロ抗原に刺激されたリンパ球によるサイトカイン生産に対する外因性および内因性ＩＬ−１０の作用条件　サイトカインＵ／ｍｌ）　（ｐｇ／ｍｌ）　（ｎ　／ｍｌｌ　（ｎ　／ｍｌ）　／ｍｌ　／ｍｌ　ｎ　／ｍｌＡ　Ｏ２２，２５７２１０９７９＜１１　２０．５　４１　６１　＜１１０　１３．０　１１　３８　＜１１００　１２．１　１６　４７　（１０，０５２２，９１４４１４４＜１０．５　２５．８１６５　１１１　＜１５　２４．９　１７２　５１　＜１Ａ＋Ｂ　Ｏ３５，４１４７３１７４４１４１２９，５１３５，３９２Ｂ　１５１　２０．８１０　２３．９　７８４　８２　１８．１１００　２４．７　６１２　６６　１＋、４０．０５　３６．９　２３７２　１３７　３３．１０．５　３９．＋　２３５５　１３７　４５．３５　３９．１　３４８７　２５０　４３．８ヒトＰＢＭＣ（Ａ）を単独でまたは同種異系照射ＰＢＭＣ（Ｂ）と−緒に、ＩＬ−１０または抗ＩＬ−１０ｍＡｂ　１９Ｆ１の不存在下または存在下において５日間培養した。サイトカイン生産をサイトカイン特異的エリザによって上澄み中において測定した。

表１は、４回の実験の内の一〇の結果を示す。

ＩＬ−ＩＱの阻害作用を外因性ＩＬ−２によって復元することはできないＩＬ− ＩＱの阻害作用が外因性ＩＬ−２の存在下において観察されたがどうかを研究するために、ＭＬＣを種々の濃度のＩＬ−２と一緒に行なった。図８は、精製Ｔ細胞を応答細胞としておよびＰＢＭＣまたは精製Ｂ細胞を刺激細胞として用いたＭＬＣに対して増加量のＩＬ−２を加えた場合、ＩＬ−１０の不存在下でも存在下でも増殖が増加したことを示している。しかしながら、Ｉ　Ｌ−１０の阻害作用は、ＩＬ−２を最大１００Ｕ／ｍｌまでの濃度で加えた場合になお存在していたし；しかも、ＩＯＵ／ｍｌは高親和性ＩＬ−２Ｒを飽和するのに十分であることに留意すべきである。同様に、Ｔ細胞増殖因子活性を有するＩＬ−４を４００Ｕ／ｍｌ加えることで、ＩＬ−１０によって誘導された減少した増殖性応答を復元することはできな力じた。総合すると、これらの結果は、ＩＬ−２の不足が、ＩＬ−１０の存在下でＭＬＣを行なう場合に観察される減少した増殖性応答を招（制限因子ではないということを示している。

Ｄ８＋Ｔ細胞サブセットに示差的影響を与えたかどうかを確認するために、ＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の比率を測定した。表２において、全Ｔ細胞数は、Ｔ細胞をＩＬ−１０存在下において同種異系ＰＢＭＣ，精製単球またはＢ細胞によって刺激した場合に３０〜６０％まで減少したことが示されている。しかしながら、ＣＤ４　およびＣＤ８”Ｔ細胞の比率は依然として同じ状態＋のままであって、ＩＬ−１０がこれらのＴ細胞サブセットそれぞれに対して優先的に作用しないことが示された。

対照的に、ＣＤ２５およびＨＬＡ−ＤＲ抗原を発現する活性化Ｔ細胞の比率は、ＩＬ−１０含有培養において一貫して減少した。最も強い減少は、通常、精製ＣＤ３　Ｔ細胞を精製Ｂ細胞または単球によって刺激した場合のＭＬＣにおいて観察された。

精製Ｔ細胞を、同種異系照射ＰＢＭＣ，精製Ｂ細胞または単球と一緒に、ＩＬ− １０（１００Ｕ／ｍｌ）の不存在下または存在下において培養した。６日後、回収されたＴ細胞を計数し且つ間接免疫蛍光法によって表現型を決定した。

本結果は、２種類の異なるドナーの同種異系ＰＢＭＣをそれぞれ応答細胞および照射刺激細胞として用いた古典的ワンウェイ−次ＭＬＣにおける同種異系応答性Ｔ細胞の増殖をＩＬ−１０が用量依存型で減少させたことを示している。これらの阻害作用は抗ＩＬ−１０ｍＡｂによって完全に中和されて、阻害の特異性が実証された。更に、増殖性応答は抗ＩＬ−１０ｍＡｂの存在下においてかなり増加したことが示されており、内因性ＩＬ−１０生産がＭＬＣにおける増殖性応答抑制の原因であることが示された。

更に、ＩＬ−１０は、高度に精製されたＴ細胞を応答細胞としておよび精製された単球を刺激細胞として用いた場合のＭＬＣにおいて増殖性応答を減少させた。

興味深いことに、ＩＬ−１０は、精製Ｔ細胞を照射同種異系ＥＢＶ−ＬＣＬによって刺激した場合には有効ではなかった。図５ｂを参照されたい。これらのデータは、ＥＢＶ−ＬＣＬではなく単球を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いた場合に、ＩＬ−１０が可溶性抗原または抗原ペプチドに対するＴ細胞またはＴ細胞クローンの特異的増殖性応答を強く阻止したという前の知見と一致する。この減少した抗原提示能力は、単球でのクラスエエ　ＭＨＣ発現に対するＩ　Ｌ−１０の下方制御作用に関係していることが分かった。対照的に、ＩＬ−１０はＥＢＶ− ＬＣＬでのクラスＩＩＭＨＣ発現に影響を与えなかった。これらのデータから、減少した抗原特異的増殖性Ｔ細胞応答は、Ｔ細胞増殖に対する直接的抑制作用よりもむしろ応答細胞の活性化の防止に反映されたことが結論付けられた。この結論は、更に、ＩＬ−１０の存在下で活性化された応答Ｔ細胞クローンにおける減少したＣａ２＋フラツクスによって支持された。

ＭＬＣに誘導された増殖は、単球を刺激細胞として用いた場合のみならず、精製Ｂ細胞を用いた場合にもＩＬ−１０によって阻害された。いくつかの実験により、ＭＨＣアロ抗原のＴ細胞認識は、ウィルス、細菌または他の異種タンパク質抗原の認識と機構的に同様であることが分かった。最近になって、がなりの比率のＭＨＣクラス冊同種異系反応性Ｔ細胞クローンが、同種異系クラスＩ１分子と結合したヒト血清タンパク質からのプロセス決定基を認識することが分かった。新規のＭＨＣ−ペプチド複合体が抗原特異的Ｔ細胞クローンを活性化するように生成されるべきである状況とは対照的に、新規のアロＭＨＣ−ペプチド複合体がＭＬＣにおいてＴ細胞を刺激するように単球およびＢ細胞で生成されるべきであるということを示す根拠はない。更に、ＩＬ−１０はヒトＢ細胞でのクラス■Ｉ　ＭＨＣ膜発現に影響を与えない。したがって、ＭＬＣに誘導されたＴ細胞増殖に対するＩＬ−１０の阻害作用が、単に、単球でのＭＨＣクラス７Ｎ発現の下方制御のためでありうるとは考えられない。今のところ定義されでいない他の機序が、ＩＬ−１０の存在下でのＢ細胞の減少した刺激能力をもたらしている可能性がある。

特異的アロ抗原によるＴＣＲ／ＣＤ３複合体の架橋に加えて、同種異系特異的Ｔ細胞によるサイトカイン生産にはＬＦＡ−１−ＩＣＡＭ−１相互作用が必要とされることが実証された。更に、ＣＤ２８−Ｂ７／ＢＢＩ相互作用は、サイトカイン生産、増殖および細胞障害性活性を引起こす休止Ｔ細胞のアロ抗原特異的活性化の誘導に不可欠であることが分かった。Ｂ７は、休止Ｂ細胞および単球で僅かに発現されるが、これらの細胞の活性化後に増加する。しかしながら、減少した増殖性および細胞障害性同種異系応答が、ＴＣＲ／ＣＤ３かまたはこれらのアクセサウー分子の発現に対するＩＬ−１０の下方制御作用に依ったということは除外されると考えられる。ＩＬ−１０は、応答Ｔ細胞でのＴＣＲ／ＣＤ３、ＬＦＡ −１発現または、刺激細胞として用いられたＢ細胞若しくは単球でのＩＣＡＭ− １およびＢ７発現に影響を与えなかった。

更に、ここで報告されたデータは、アロ抗原に対する減少した増殖性応答が、応答Ｔ細胞の活性化の防止にも反映されることを示している。ＩＬ−１０は、その最大阻害作用を働かせるために、培養の開始から存在しているべきであった。

更に、ＣＤ２５およびＨＬＡ　ＤＲ抗原の発現によって判断される活性化Ｔ細胞の比率は、対照ＭＬＣにおいてよりもＩＬ−１０含有培養においてかなり低かった。ＩＬ−１０存在下で行なわれたＭＬＣにおいて生じたＣＤ３　Ｔ細胞の総数は減少したが、ＣＤ４　およびＣＤ８　Ｔ細胞サブセットの比率がＩＬ−１０不存在下で行なわれた対照ＭＬＣでの比率に匹敵したことから、ＩＬ−１０はＣＤ４　またはＣＤ８＋Ｔ細胞の応答に優先的に影響を与えてはいなかった。ＣＤＺ＋５の減少した発現は、ＭＬＣにおけるＴ細胞増殖に対する阻害作用が、ＩＬ−１０のサイトカイン阻害活性の単なる結果ではないことを示し；そしてこれは、高親和性ＩＬ−２受容体を飽和するのに十分である濃度で外因性ＩＬ−２が加えられる場合にＩＬ−１０もまた増殖性応答を減少させるという知見によって支持される（図８）。総合的に、これらのデータは、ＩＬ−１０が、ＭＬＣにおけるＰＢＭＣ，単球および正常Ｂ細胞の刺激能力を減少させることを示唆している。ＩＬ−１０がＴ細胞に対しても直接的に作用するという可能性を完全に除外することはできない。しかしながら、ＥＢＶ−ＬＣＬを刺激細胞として用いて生じたＭＬＣがＩＬ−１０によって阻害されないという事実は、ＥＢＶ−ＬＣＬがＩＬ− １０の阻害作用を無効にしつる場合を除いては、この概念に反論する。

全部の同種異系ＰＢＭＣを応答細胞および刺激細胞として用いたＭＬＣにおいて生産されたサイトカイン濃度は、更に、外因性ＩＬ−１０の存在下で有意に減少した。ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−Ｃ３Ｆの量は、ＩＬ−１０不存在下において行なわれた対照ＭＬＣの場合よりも約２〜３倍下回った。

ＩＬ−６生産が受けた影響ははるかに少なかったが；これは、ＩＬ−１０の抑制活性が有効になる前に、これらの培養中に存在している単球が、活性化後の極めて初期にこのサイトカインのかなりの量を既に生産していることによるかもしれない。

したがって、本結果は、ＩＬ−４０がインビトロでの下方制御性同種異系応答性に重要な役割を果たしていることを明確に示している。これらのインビトロの観察と、アロ抗原が移植された組織の具体的な免疫学的拒絶の主要標的であるという考察とから、ＩＬ−１０は、インビボでの同種異系移植後の寛容性の誘導または維持においである役割を果たしていると予想しつる。

実施例５以下の実施例は、ロンカクロ（Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ）およびバチェツタ（Ｂａｃｃｈｅｔｔａ）（１９９２）によって、Ｂｏｎｅ　ＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　ｏｆＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　Ｇｅｎｅ、胎児幹細胞移植後の寛容性におけるＴ細胞レパートリ−の重要性のインビボでの根拠を提供する。

寛容性のＴ細胞レパートリ−および機序を、ＨＬＡ不適合胎児肝幹細胞を移植された苛酷な複合型免疫欠損の二人の患者において研究した。彼等は１８歳および６歳で（１９９３年現在）且つ健康であり、そして抗原を呼び起こす正常な免疫応答を示す。彼等のＴ細胞はドナー起源であるが、単球およびＢ細胞は依然として宿主からのものであった。一方の患者のＮＫｍ胞はドナー由来であり且つもう一方の患者では宿主由来であるので、ＮＫ細胞の起源は異なる。ドナーおよび宿主細胞間のＨＬＡ不適合にもかかわらず、急性または慢性の対宿主性移植片病は観察されなかった。ＰＢＭＣを用いるインビトロ実験は、宿主細胞によって発現されたＨＬＡ抗原に特異的な非応答性を示した。しかしながら、広範囲にわたるクローン分析により、宿主のクラスＩＩおよびクラスＩ　ＨＬＡ分子をそれぞれ認識するＣＤ４＋およびＣＤ８＋宿主反応性Ｔ細胞クローンが、両方の患者の＋末梢血液中に存在していたことが分かった。限界希釈実験により、ＣＤ８　宿主反応性細胞の頻度は、同種異系反応性Ｔ細胞で観察されたのと同様の範囲内であることが示された。対照的に、ドナー反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することはできなかった。宿主反応性ＣＤ４＋およびＣＤ８″−Ｔ細胞クローンは、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＩＬ−５を生産するそれらの能力において正常であったが、それらはＩＬ−４を合成することが全くできなかった。更に、患者ＲＶからのＣＤ４＋Ｔ細胞クローンは極めて高濃度のＩＬ−１０を分泌した。

興味深いことに、外因性ＩＬ−１０は、ＣＤ４＋宿主反応性Ｔ細胞クローンの増殖性応答を阻害することができた。これらのデータは、同種異系胎児肝幹細胞移植後のドナーＴ細胞レパートリ−から宿主反応性細胞を欠損していないことを実証している。したがって、宿主およびドナー間のインビボ寛容性は、サイトカインがある役割を果たしているかもしれない末梢自己調節機序によって維持されている。

ＨＬＡ同一ドナーからの骨髄移植は、苛酷な複合型免疫欠損（Ｓ　ＣＩ　Ｄ）の子供に選択された療法である。しかしながら、不適合ドナーからの造血系胎児肝細胞（ＦＬＴ）の移植は、持続した移植状態を与え且っＨＬＡ同一骨髄ドナーが存在しない場合に可能な治療法を提供することができる。例えば、トゥレーヌ（Ｔｏｕｒａｉｎｅ）ら（１９８７）１旦り見見！　１０　：　７５〜　を参照されたい。このような患者において、ＨＬＡ型によって決定されるドナー起源の免疫担当Ｔリンパ球は、移植後２〜３か月の間確認されることができた。末梢１９２８球キメラ現象は、胎児針幹細胞を移植された５ＣＩＤの子供において日常的に検出されるが、８９２８球キメラ現象の欠損は珍しくはない。これらの患者の免疫学的評価は、Ｔ前駆体細胞間のＨＬＡ不適合のインビボ条件および分化環境下におけるヒトＴ細胞分化および自己／非自己識別を研究する独特の可能性を提供する。

完全にＨＬＡ異種のドナーから胎児針幹細胞を移植された１８歳および６歳の二人の５ＣＩＤの子供に関するこの報告は、免疫系の調節におけるＩＬ−１０のインビボ活性の根拠、特に、宿主反応性細胞によって生産されたＩＬ−１０が、インビボでのそれらの応答を下方制御する場合に重要な役割を果たしているかもしれないという根拠を提供する。

患者ＳＰは、同系胎児胸腺の同時注入による２種類の胎児肝幹細胞移植を受けた。標準的なＨＬＡ型判定によって、第二ドナーからのみの細胞の移植状態が示されたが、多形性ＨＬＡ決定基に特異的な単クローン性抗体を用いる更に正確な細胞蛍光定量分析によると、実際には、Ｔリンパ球の１０〜２０％が第一ドナーからのものであったことが示された。第二の患者ＲＶは、７種類の胎児肝幹細胞移植を受けたが、１種類のドナー細胞集団のみを末梢血液中において確認することができた。ロンカクロら（１９８６）Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔｉ　、７７：６７３〜　を参照されたい。

ＨＬＡ型Ａ　ＣＢ　ＤＲＤＱ受容者　３〜３３　６　１４〜４７　４〜５３第一ドナー　２〜１１　４　２７〜６２　１〜８１第二ドナー　１〜２　７　８〜１８　３〜９３旦ｙ受容者　２〜１３　４〜７　ｘ〜６２　８〜１０　４〜５ドナー　２〜３０　４　８〜３５　１１〜１３　６〜７このような患者において、ドナーＴ細胞の持続した移植状態が移植後に観察されたが、Ｂ細胞および単球は宿主起源であった。

表４．キメラ現象 αβＴＣＲＴ細胞　ドナー起源 γδＴＣＲＴ細胞ＮＫ細胞　宿主起源−〉患者ｓｐドナー起源−〉患者ＲＶ免疫系の細胞の範囲内のスプリットキメラ現象のこの状態にもかかわらず、完全な再構築が達成さね、そして抗原を呼び起こす正常なインビボおよびインビトロ抗体応答が観察された。これは、同種異系の障害を越えて宿主の抗原提示細胞（ＡＰＣ）と協力するドナーＴ細胞の能力による。特に、患者ＳＰの末梢血液から単離されたドナー起源の破傷風トキソイド特異的子細胞クローンは、宿主Ｂ細胞、ＥＢｖで形質転換されたＢ細胞系およびＮＫ細胞クローンによってプロセシングされた且つ提示された抗原（Ａｇ）を認識することができた。対照的に、これまでに検査されたＡｇ特異的Ｔ細胞クローンの内で、ドナー細胞によって発現されたクラスＩＩ　ＨＬＡ抗原によって制限されたものはなかった。ロンカクロら（１９８８）Ｊ、Ｅｘ　ｔ’　ｌ　Ｍｅｄ、１６７：１５２３〜　；ロンカクロら（１９９１）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４７：７８１〜　を参照されたい。

ＮＫ集団におけるキメラ現象は、二人の患者で異なった（表４）。一方の患者において、新しいＮＫ細胞およびＮＫ細胞クローンは、宿主のＨＬＡ表現型を示したが；もう一方の患者において、それらはドナー起源であった。これらのＮＫ細胞は、ＣＤ１６ＣＤ５６抗原を発現し且つ様々なＮＫ感受性標的に対する正常な細胞障害活性を示した。これらの知見は、宿主またはドナーの機能性ＮＫ細胞の存在が、胎児幹細胞移植後のドナーＴ細胞の安定した移植状態の妨げにならないということを示唆している。主要および／または微量組織適合性抗原差を有するリンパ系細胞の共存にもかかわらず、これらの二人の患者においてインビボでの完全な寛容性が達成され、そし、て急性または慢性の対宿主性移植片病の徴候は観察されなかった。更に、インビトロ実験により、宿主によって発現されたＨＬＡ抗原に対するドナーＴ細胞による特異的非応答性は、−次混合白血球培養において存在したが、同種異系細胞に対する増殖性応答は正常であったことが示された。しかしながら、クローンレベルでの知見は異なった。ＨＬＡクラスＩかまたはＨＬＡクラスＩｌ抗原を認識するドナー起源の宿主反応性細胞障害性Ｔ細胞クローンは、両方の患者の末梢血液由来であった。ＨＬＡハプロ同−親ドナーからの骨髄を移植されたＳ］Ｄ患者において報告されたこととは対照的に、ドナー反応性丁細胞クローンをこれらの二人の患者で単離することはできなかった。更に、患者ＲＶにおいて、宿主が関与したＨＬＡクラスＩ遺伝遺伝子抗Ａ抗原異的なＴ細胞クローンを確認することはできなかった。修正された限界希釈検定（ヴアンデカーコーヴ（Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ）ら（１９９２）Ｊ。

主反応性Ｔ細胞の頻度は、第三者ＨＬＡ抗原に対して反応するＴ細胞の頻度と同様の範囲内であったことが実証された。これらの知見は、宿主反応性細胞が、ドナーＴ細胞レパートリ−からクローン欠如していないことを実証している。これらの患者における対宿主性移植片病の臨床的発現は明白ではなかったので、明らかに、このような宿主反応性Ｔ細胞は制御されている。宿主反応性細胞がインビボでアネルギーであることおよびインビトロではＩＬ−２存在下の刺激がこのアネルギーを破壊しうることは可能である。

宿主反応性Ｔ細胞は、多クローン性および抗原特異的刺激後にリンホカイン生産の独特のパターンを示す。ＣＤ４　またはＣＤ８　Ｔ細胞クローンの内でＩＬ− ４を分泌することができるものはないが、それらは普通の濃度のＩＬ−２、ＩＬ −５およびＧＭ−Ｃ３Ｆを合成する。これらのクローンによるＩＦＮ−γ生産は、通常、極めて高い。更に、患者ＲＶのＣＤ４　宿主反応性クローンにょるＩＬ −１０生産は、抗原特異的刺激後に極めて高く、低Ｉ−２合成と逆の関係にあると考えられる。更に、外因性Ｉ　Ｌ−Ｉ　Ｑを加えることにより、インビトロでの＋ＣＤ４　宿主反応性Ｔ細胞クローンの増殖性応答を有意に抑制することができる。これは、宿主反応性細胞によるＩＬ−ＩＱの生産が、インビボでのそれらの応答を下方制御する場合に重要な役割を果たしつるという根拠を提供する。

この実施例は、同種異系幹細胞を移植された５ＣＩＤ患者におけるＩＬ−１０生産を研究している。苛酷な混合型免疫欠損（Ｓ　ＣＩ　Ｄ）の子供は、ＨＬＡ不適合胎児幹細胞を移植されることができ、そして免疫学的認識は、ドナーのＴ細胞のみの移植の場合にも得られる。宿主に対する寛容性にもかかわらず、宿主反応性Ｔ細胞は、なおこれらの患者の末梢血液中に高顕度で存在し、自己ｇＲｓ抑制機序がインビボのホメオスタシスの原因となりうることが示唆される。最近、ＩＬ−１０は、（アロ）抗原特異的Ｔ細胞の活性化および増殖を妨げることができる抑制性サイトカインとして記載された。二人の患者からの全末梢血液単核細胞の半定量ＰＣＲにより、ＩＬ−１０ｍＲＮＡ濃度は正常ドナーの場合よりもはるかに高かったが、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−Ｃ５ＦｍＲＮＡは同様であることが示された。精製単球、ＢおよびＴ細胞のＰＣＲ分析により、宿主起源の単球が、増加したＩＬ−１０生産をもたらしたことが実証された。一方の患者において、高濃度のＩＬ−１０ｍＲＮＡは、精製された全Ｔ細胞においても観察された。更に、ＣＤ４＋宿主反応性Ｔ細胞による高濃度のＩＬ−１０生産は、宿主細胞に応答したこれらの細胞の増殖を自己調節方式で抑制した。これらの結果は、高度の内因性Ｉ　Ｌ−１０生産が、幹細胞移植後の同種異系反応性の抑制の要因でありうることを示唆している。

１９８９年１２月２０日、出願人は、ｐＨ５Ｃ１ｐＨ１５ｃおよびｐＢＣＲＦｌ（ＳＲα）を有する大腸菌ＭＣ１０６１の別々の培養物を、アメリカン・タイプ・カルチャー＊：ｌレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ロー、クビル、　ＭＤ、米国（ＡＴＣＣ）に、それぞれ受託番号６８１９１．６８１９２および６８１９３として寄託した。これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託に関するＡＴＣＣの承認に基いて与えられる条件に基いて行なったものであり、それによって、寄託は、米国成文法３５条１２２および米国規制基準３７条１．１４にしたがって米国特許商標局長に対して利用可能にさせるものであることおよび米国特許証の公的発行に対して利用可能にさせるものであることが保証さね、それによって寄託が維持されることが必要とされる。寄託された菌株の入手可能性は、いかなる政府のその特許法による代理権に基いて付与された権利に違反して本発明を実施する許可として解釈されるべきではない。

寄託は、ブダペスト条約の要件を満たすように修正された。

本発明の前述の実施態様の説明は、例証および説明の目的で示してきた。それらは、本発明を、開示された正確な形式に徹底させるためのものでも制限するためのものではなく、明らかに、前記の教示に照らして多数の修正および変更が可能である。本発明の原理を最もよく説明し、それによって当業者が、予想される特定の使用に適当であるような様々な実施態様においておよび様々な修正を伴って本発明を最もよく利用することを可能にするために、実施態様を選択し且つ記載した。本発明の範囲は特許請求の範囲によって定義されるものである。

ｙ烈衣（２）配列番号＝１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ＝１７８アミノ酸（Ｂ）種類二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二直鎮状（目）分子種類：タンパク質（ｖｉ）起源：（ｉｘ）特徴：（ｘｉ）配ｙり種類：配列番号：１（２）しり番号：２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１７０アミノ酸（Ｂ）種類二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ）分子種類：タンパク質（ｖｉ）起源：（Ａ）生物：Ｂ９５−８エプスタイン・バールウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　Ｖｉｒｕｓ）（ｉｘ）特徴；（Ｄ）他の情報：ウィルスＩＬ−１０（ＢＣＲＦＩ）（ｘｔ）Ｅ３Ｆ１１ｍ［：　ＥＦり番号：２（２）配タリ番号：３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１６０アミノ酸（Ｂ）種類二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ）分子種類：タンパク質（ｉｘ）特徴：（ｘ　ｉ　）　Ｅ３’ｌＪ酬：ＶＪり番号＝３（２）ｖり番号：４の情報：（ｉ）配ｙりの特徴：（Ａ）長さ＝１４７アミノ酸ＣＢ）種類二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ）分子種類：タンパク質（ｉｘ）特徴：（Ｄ）他の情報：成熟ウィルスＩＬ−１０（ＢＣＲＦＩ）（ｘｉ）配列種類：配列番号：４Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　入ｓｐ　八ｓｎ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　入ｒｇＡｓｐ　入１ａ　Ｐｈｅ　Ｓａｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　ＧｌｕＶａｌ　Ｊｌｕｐ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＬｙＳ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ：　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｊｐ　Ｐｈｅ　ＬｙｓＧｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　八ｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｍａｔ　工ｌｅ　Ｇｉｎ　Ｐｈｉ　ＴｙｒＬｙｓ　Ａｓｐ　ＨＬｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇｌｌｏ　８５　９０Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　入ｒ９　人ｘｑ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　入ｓｎ　Ｌｙｓ９５　Ｚｏｏ　’　１０５Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　八Ｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｉａ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇ１ｎＧｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　工１ｅ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｓｅ：　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　工ｌｅ　Ｐｈｅ　ＸＬｅ（２）配ｌり番号：５の情報：（ｉ）Ｗｉ！Ｊりの特徴：（Ａ）長さ＝１５塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖＝１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）特徴：（Ｄ）他の情報二二本鎖フラグメントとして、共通リポソーム結合正部位をコードする。

（ｘｉ）配列種類：配列番号：５ＧＴＭＧＧＡＧＧ’ｒ　ＴＴＡＡＣ１５（２）配列番号二６の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ二６０塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖＝１本（Ｄ）　Ｉ−ボロジー：直鎖状（ｉｘ）特徴：（Ｄ）他の情報＝５１位および５６〜６０位のＴおよびＧＧＴＡＣは、天然の配列のそれらとは異なり；　ＥＷす番号７と一緒に、ｉ？ｌＪ番号６は、４塩基材着末端を５７〜６０位に有する合成Ｃ３ｌＦ遺伝子の二本鎖フラグメントＩＡ／Ｂを形成する。

（ｘｉ）　西１−テリＢ：西ｉｆｆり番号＝６人ＧＣＣＣＡＧＧ（：Ｃ入ＧＧＧＣＡＣＣＣＡ　ＧＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣ入ＣＣＣ入ＣＴＴＣＣＣＡＧＧ　５Ｃτ入八ＣＣＧＧτ入Ｃ６０（２）配ｌり番号＝７の情報：（ｉ）配ｊりの特徴：（Ａ）長さ：５６塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）特徴：ＣＤ）他の情報：１位および６位のＣおよびＡは、天然の配ｌすのそれらとは異なり；　１ｉ７１番号６と一緒に、ＥＦｌｊ番号７は、合成Ｃ９ＩＦ遺伝子の二本鎖フラグメントＩＡ／Ｂを形成する。

（ｘｉ）　酒ｉシタリａｉｔ　：　Ｉｉｉ！７り番号＝７ＣＧＧＴＴＡＣＣＴＧ　ＧＧ鮎ＧＴＧＧＧＴ　ＧＣＡにＣＴＧττＣＴＣＡＧＡＣＴＧＧＧ　ＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＳＣ丁ＧＧＯＣＴ（２）配ｙり番号：８の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ二６２塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）特徴：（Ｄ）他の情報＝２位のＴは、天然の配列のそれとは異なり；配列番号９と一緒に、配７１１番号８は、５塩基および９塩基材着末端を１〜５位および５４〜６２位に有する合成Ｃ３ｌＦ遺伝子の二本鎖フラグメント２Ａ／Ｂを形成する。

（ｘｉ）配、Ｆ＋１種類：配列番号：８（２）Ｅり番号：９の情報：（ｉ）Ｅｆｔりの特徴：（Ａ）長さ：４８塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）特徴：（Ｄ）他の情報二８り番号８と一緒に、配ＪＩＪ番号９は、合成Ｃ３ｌＦ遺伝子の二本鎖フラグメント２Ａ／Ｂを形成する。

（ｘ　ｉ　）　Ｅ３１１闘：　西ｉｔり番号＝９ＣＴＴＣＡＣＴＣＴＧ　ＣＴＧＡＡＧＧＣＡＴ　ＣＴＣＧＧＭ；ＡＴＣＴＣＧＡＡＧＣＡＴＧ　ｒｒＡＧＧＣＡＧ　４８（２）配プリ番号：１０の情報：（Ｄ　Ｅｆｔりの特徴：（Ａ）長さ：３５塩基対（Ｂ）　１１顕：核酸（Ｃ）ｌｌ：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）特徴：ＣＤ）他の情報：３０位および３２位のＣおよびＴは、天然の配列のそれらとは異なり；配列番号１ニー緒に、配列番号１ｏは、合成Ｃ３ｌＦ遺伝子の二本鎖フラグメント３Ａ／Ｂを形成する。

（ｘ　ｉ　）　ＥＪｌｌｌｌｉｉ　：　Ｗｚ！ｉり番号：１゜ＣＭＡＴＧＭＧＧ　ＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡ　ＣＡＡＣＴＴＧＴＴＣＴＴＡＡＧ　３５（２）配ソリ番号：ｌｌの情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：４４塩基対（Ｂ）皿類：核酸（、Ｃ）鎖：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）特徴：（Ｄ）他の情報：４位および６位のＡおよびＧは、天然の配テリのそれらとは異なり；ｖり番号１ｏと一緒に、配列番号１１は、９塩基材着末端を３６〜４４位に有する合成Ｃ３ｌＦ遺伝子の二本鎖フラグメント３Ａ／Ｂを形成する。

（ｘｉ）配列種類：しり番号：１１ＣＴＴＡＡＧＡＡＣＡ　ＡＧＴＴＧＴＣＣＡＧ　ＣＴＧＡＴＣＣＴＴＣＡＴＴＴＧＡＡＡＧＡ　ＡＡＧＴ　４４（２）配ツリ番号＝１２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ二６９塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖＝１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）特徴：（Ｄ）他の情報二６９位のＴは、天然の配列のそれとは異なり；　ＥＷｌｊ番号１３と一緒に、配列番号１２は、合成Ｃ３ｌＦ遺伝子の二本鎖フラグメント４Ａ／Ｂを形成する。

（ｘ　ｉ　）　１ｉＪＩＩＢ：　ｆＪり番号：１２（２）　ｉｉＪり番号＝１３の情報：（ｉ）　ｖりの特徴：（Ａ）長さニア３塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）特徴：（Ｄ）他の情報：２位および５位のＴおよびＡは、天然の配Ｊ１１のそれらとは異なり；配列番号１２と一緒に、ＩＢり番号１３は、４塩基対着末端を１〜４位（こ有する合成Ｃ３ｌＦ遺伝子の二本鎖フラグメント４Ａ／Ｂを形成する。

（ｘｉ）配列種類：ＷｉＪす番号：１３（２）　Ｅ３’す番号＝１４の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６１塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）特徴：（Ｄ）他の情報＝３位、５７位および６１位のＡＳＴおよびＧは、天然の配列のそれらとは異なり；ＥＶ１番号１５と一緒に、ＥＷす番号１４は、合成Ｃ３ｌＦ遺伝子の二本鎖フラグメント５Ａ／Ｂを形成する。

（ｘ　ｉ　）　ＶＪＩＪｌｌｊｉｉ　：　ＦＪり番号：１４（２）配ｌり番号：１５の情報：（ｉ）　ＷｉＪりの特徴：（Ａ）長さ二６５塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）　暢［：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）特徴：（Ｄ）他の情報；１〜５位、９位および６３位のＴＣＧＡＣ，ＡおよびＴは、天然の配列のそれらとは異なり、　ＥＦす番号１４と一緒に、配列番号１５は、４塩基対着末端を１〜４位に有する合成Ｃ３ｌＦ遺伝子の二本鎖フラグメント５Ａ／Ｂを形成する。

（ｘｉ）　西１都クリ１Ｍ　：　８１番号：１５（２）配ｊり番号＝１６の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６３塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖＝１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）特徴：（Ｄ）他の情報二５８〜６３位のＣＴＧＣＡは、天然の配列のそれらとは異なり、　ｉｉ！ＪＩＪ番号１７と一緒に、配列番号１６は、４塩基対着末端を５９〜６３位に有する合成Ｃ３ｌＦ遺伝子の二本鎖フラグメント６Ａ／Ｂを形成する。

（ｘｉ）配列種類：Ｖり番号：１６ＴＣＡＴＣＧＡＴＣＴ　ＧＣＡ　６３（２）Ｕり番号：１７の情報：（ｉ）配ｙりの特徴：（Ａ）長さ：５９塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）特徴：（Ｄ）他の情報；１位のＧは、天然の配列のそれとは異なり；配列番号１６と一緒に、配列番号１７は、合成Ｃ５ＩＦ遺伝子の二本鎖フラグメント６Ａ／Ｂを形成する。

（ｘ　ｉ　）　！１ｉＪＩＩｔ１］喝Ｉ：ＷＥｑ番−号−１７ＧＡＴＣＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＣＣＧτ八Ｇ　ＣＣＴへＡＧＣＣＴＧ　ＡＧＧＧＴＣＴ？ＣＡ　ＧＣ；ＴＴＣＴＣＣＣＣＳ。

ＣＡＧＧＧＡＧＴＴ　５９（２）配ｊす番号：１８の情報：（ｉ）配Ｉりの特徴：（Ａ）長さ二６０塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖＝１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）特徴：（Ｄ）他の情報２５１位、５４位および５６〜６０位のＣ，ＧおよびＧＣＡＴＧは、天然の配７１のそれらとは異なり；　ｉ！１ｉＪＩＪ番号１９と一緒に、配列番号１８は、２塩基および４塩基対着末端を１〜２位および５７〜６０位に有する合成Ｃ５ＩＦ遺伝子の二本鎖フラグメント７Ａ／Ｂを形成する。

（ｘｉ）ｖ！Ｊり闘二Ｕり番号：１８（２）　ＶＪり番号：１９の情報；（ｉ）８りの特徴：（Ａ）長さ：５４塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）特徴：（Ｄ）他の情報２１位、３位および６位のＣ，ＣおよびＧは、天然の配７１のそれらとは異なり：配列番号１８と一緒に、配列番号１９は、合成Ｃ３ｌＦ遺伝子の二本鎖フラグメント７Ａ／Ｂを形成する。

（ｘｉ）配７１１種類：配列番号：１９（２）Ｕり番号：２０の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：５８塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖＝１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）特徴：（Ｄ）他の情報：配列番号２１と一緒に、ＥＦす番号２０は、４塩基および９塩基付着末端を１〜４位および５０〜５８位に有する合成Ｃ３ｌＦ遺伝子の二本鎖フラグメント８Ａ／Ｂを形成する。

（Ｘｉ）配列種類：配列番号：２０（２）配ｌり番号＝２１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：４５塩基対ＣＢ）種類二核酸（Ｃ）鎖：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）特徴：（Ｄ）他の情報：Ｕり番号２０と一緒に、配列番号２１は、合成Ｃ５ＩＦ遺伝子の二本鎖フラグメント８Ａ／Ｂを形成する。

（ｘｉ）配列種類：配列番号＝２１八ＣＴＣＡＴＧＧＣＴ　ＴＴＧＴＡＧＡＴＧＣＣＴ７ＴＧＴＣＴＴＧ　ＧＡＧＣＴＴＡＴＴ入　ＴＴλＡ＾　４５（２）配ｊす番号＝２２の情報：（ｉ）配Ｊりの特徴：（Ａ）長さ：５１塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）特徴：（Ｄ）他の情報：　ＥＦＩＪ番号２３と一緒に、ＥＦす番号２２は、合成Ｃ３ｌＦ遺伝子の二本鎖フラグメント９Ａ／Ｂを形成する。

（ｘｉ）配列種類：配ｌり番号：２２ＡＴＣＴＴＣＡＴＣ入　入ＣＴＡＣＡＴ入ＧＡ　ＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧ　入Ｃ入ＡＴＧ入入Ｇ入　丁入ＣＧ入入入Ｃ丁Ｇ　入　５１（２）翫ｌり番号：２３の情報：（ｉ）配ｌりの特徴：（Ａ）長さ二６４塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｘ）特徴：（Ｄ）他の情報＝１〜４位のＡＧＣＴは、天然の配列のそれらとは異なり：Ｅ３ ’１番号２２と一緒に、配列番号２３は、４塩基および９塩基付着末端を１〜４位および５６〜６４位に有する合成Ｃ３ｌＦ遺伝子の二本鎖フラグメント９Ａ／Ｂを形成する。

（ｘｉ）　西ｉ９すＵ　：　！！り番号：２３（２）配列番号：２４の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：５１９塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖：１本（Ｄ）トポロジー二直鎖状（ｉｘ）特徴：（Ｄ）他の情報：ウィルスＩ　Ｌ−１０をコードしている。

（ｘ　ｉ　）　Ｅ３’ｌｌ闘：　Ｉｉｉ！Ｊ７１Ｊ番号：　２４入入ＴＴＣ入ＴＧ　ＧＡＧ　ＣＧＡ　ＡＧＧ　ＴＴＡ　ＧＴＧ　ＧＴＣＡＣＴ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＴＧＣＣＴＧ　ＧＴＧ　４４ＣＴＧ　Ｃ”Ｊ”ｌ’　ＴＡＣＣＴＧ　ＧＣＡ　ＣＣＴ　ＧＡＧ　ＴＧＴ　ＧＧＡ　ＧＧＴ　ＡＣＡ　ＧＡＣＣＡＡ　ＴＣＴ　８６ＧＡＣ入ＡＴ　ＴＴＴ　ＣＣＣＣＭ　ＡＴＧ　ＴＴＧ　ＡＧＧ　ＧＡＣＣＴＡ　ＡＧＡ　ＧＡＴ　ＧＣＣＴＴＣ１２８λＧＴ　ＣＧＴ　ＧＴＴ　ＡＡＡ　入ＣＣＴＴＴ　ＴＴＣＣＡＧ　ＡＣＡ　ＡＡＧ　ＧＡＣＧＡＧ　ＧＴＡ　ＧＡＴ　１７０ＡＡＣＣＴ’ｒ　ＴＴＧ　ＣＴＣＡＡＧ　ＧＡＧ　ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＣＴＡ　ＧＡＧ　ＧＡＣＴＴＴ　ＡＡＧ　ＧＧＣ２１２τＡＣＣＴＴ　ＧＧＡ　ＴＧＣＣＡＣＧＣＣＣＴＧ　Ｔ（Ｊ　ＧＡＡ　ＡＴＧ　ＡＴＣＣＡＡ　ＴＴＣＴＡＣ２５４ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＧＴＣＡＴＧ　ＣＣＡ　ＣＡＧ　ＧＣＴ　ＣＡＡ　ＡＡＣＣＡＧ　ＧＡＧ　ＣＣＧ　ＧＡＧ　２９６ＧＣＴ　入ＡＧ　ＧＡＣＣＡＴ　ＧＴＣ入Ａτ　ＴＣＴ　ＴＴＧ　ＧＧＴ　ＧＡＡ　人ＡＴ　ＣＴＡ　人ＡＧ　ＡＣＣ３３８ＣＴＡ　ＣＧＧ　ＣＴＣＣＧＣＣＴＧ　ＣＧＣＡＧＧ　ＴＧＣＣＡＣＡＧＧ　ＴＴＣＣＴＧ　ＣＣＧ　ＴＧＴ　３ＥＩＯＧＡＧ　ＡＡＣ入ＡＧ　ＡＧＴ　ＡＡＡ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＧＡＡ　ＣＡＧ　ＡＴＪ’、入八Ａ　入ＡＴ　ＧＣＣＴＴＴ　４２２ＡＡＣ八人ＧＣτＧ　ＣＡＧ　ＧＡＡ　υス　ＧＣＪｔ　ＡＴＴ　ＴＡＣ入ＡＡ　ＧＣＣＡＴＧ　ＡＧＴ　ＣＡＡ　４６４τＴＴ　ＧＡＧ　へτ丁　ＴＴＴ　ＡＴＴ　ＡＡＣＴ；ｌＣＡＴＡ　ＣＡＡ　ＧＣＡ　ＴＡＣＡＴＧ　ＡＣＡ　ＡＴＴ　５０６黒ＧＣＣＡＧＧ　τＧＡ　Ｇ　５１９Ｃ１ａＩ０　１　ｉｏ　１００５０．５０．０５補正書の翻訳文提出書ＩＬ−２（Ｌｌ／ｍｌ）　ＦＩＧＵＲＥ　８ＡＯ＋　１０　１００　１００１０００ＩＬ−２（Ｕｌ　ＦＩＧＵＲＥ　８Ｂ３４条補正１．　個体における対宿主性移植片病を抑制する方法であって、有効量のインターロイキン−１０またはそのアゴニストを該個体に対して投与する工程を含む上記方法。

２、　前記インターロイキン−１０が、ウィルスインターロイキン−１０およびヒトインターロイキン−１０から成る群より選択される請求項１に記載の方法３、　個体における対宿主性移植片病を抑制する方法であって、有効量のインターロイキン−１０を該個体に対して投与する工程を含む上記方法。

４、　前記インターロイキン−１０が、ウィルスインターロイキン−１０およびヒトインターロイキン−１０から成る群より選択される請求項３に記載の方法５、　個体における組織拒絶を抑制する方法であって、有効量のインターロイキン −１０を該個体に対して投与する工程を含む上記方法。

６、　前記インターロイキン−１０が、ウィルスインターロイキン−１０およびヒトインターロイキン−１０から成る群より選択される請求項５に記載の方法７、　前記インターロイキン−１０が、翻訳後変異体または突然変異タンパク質である請求項１に記載の方法。

８、　個体における対宿主性移植片病を抑制する方法であって、本明細書中においてＥｅ１番号３で定義の有効量のインターロイキン−１０を該個体に対して投与する工程を含む上記方法。

９、　前記インターロイキン−１０が、ウィルスインターロイキン−１０およびヒトインターロイキン−１０から成る群より選択される請求項８に記載の方法１０、対宿主性移植片病を治療するためのインターロイキン−１０の使用。

１１、対宿主性移植片病の治療用薬剤の製造のためのインターロイキン−１０の使用。

１２、対宿主性移植片病の患者の治療法であって、有効量のインターロイキン− １０を該患者に対して投与することを含む上記方法。

１３、対宿主性移植片病の治療用のインターロイキン−１００１４、対宿主性移植片病の治療用のインターロイキン−１０を含む薬剤組成物の使用。

１５、対宿主性移植片病の治療に有用な薬剤組成物を製造するためのインターロイキン−１０の使用。

閑際調査報失ＰＣＴ／ＩＩｓ　９３１０１６６５フロントページの続き（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＺ、Ｆｌ。

ＨＵ、ＪＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＫ、ＵＡ（７２）発明者　バチェッタ、ロサアメリカ合衆国カリフォルニア州９４３０６゜パロ・アルド、シェリダン・アヴエニュー３４５、ナンバーあ

Claims

【特許請求の範囲】１．個体における対宿主性移植片病または組織拒絶を抑制する方法であって、有効量のインターロイキン−１０またはそのアゴニストを該個体に対して投与する工程を含む上記方法。２．前記インターロイキン−１０が、ウイルスインターロイキン−１０およびヒトインターロイキン−１０から成る群より選択される請求項１に記載の方法３．個体における対宿主性移植片病または組織拒絶を抑制する方法であって、有効量のインターロイキン−１０を該個体に対して投与する工程を含む上記方法。４．前記インターロイキン−１０が、ウイルスインターロイキン−１０およびヒトインターロイキン−１０から成る群より選択される請求項３に記載の方法５．個体における組織拒絶を抑制する方法であって、有効量のインターロイキン−１０を該個体に対して投与する工程を含む上記方法。６．前記インターロイキン−１０が、ウイルスインターロイキン−１０およびヒトインターロイキン−１０から成る群より選択される請求項５に記載の方法７．前記インターロイキン−１０が、翻訳後変異体または突然変異タンパク質である請求項１に記載の方法。８．個体における対宿主性移植片病または組織拒絶を抑制する方法であって、本明細書中において配列番号３で定義の有効量のインターロイキン−１０を該個体に対して投与する工程を含む上記方法。９．前記インターロイキン−１０が、ウイルスインターロイキン−１０およびヒトインターロイキン−１０から成る群より選択される請求項８に記載の方法１０．対宿主性移植片病または組織拒絶を治療するためのインターロイキン−１０の使用。１１．対宿主性移植片病または組織拒絶の治療用薬剤の製造のためのインターロイキン−１０の使用。１２．対宿主性移植片病の患者の治療法であって、有効量のインターロイキン− １０を該患者に対して投与することを含む上記方法。１３．対宿主性移植片病または組織拒絶の治療用のインターロイキン−１０。１４．対宿主性移植片病または組織拒絶の治療用のインターロイ千ン−１０を含む薬剤組成物の使用。１５．対宿主性移植片病または組織拒絶の治療に有用な薬剤組成物を製造するためのインターロイキン−１０の使用。