PL181042B1

PL181042B1 - Polipeptyd, przeciwciało i kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number: PL181042B1
Application number: PL95319429A
Authority: PL
Inventors: Larsen Christian Gronhoj; Borbala Gesser
Original assignee: Steeno Res Group As
Priority date: 1994-07-05
Filing date: 1997-02-26
Publication date: 2001-05-31
Also published as: ATE195003T1; EP0769054A1; AU2612195A; CZ1497A3; EP0769054B1; FI970009A0; CA2194444A1; WO1996001318A1; EE9700029A; EE03451B1; HUT76673A; EP1013764A1; AP9700962A0; CN1159830A; US6168791B1; MX9606537A; NO970020L; AP690A; DK0769054T3; RU2218348C2

Abstract

1. Polipeptyd liczacy od 7 do 20 aminokwasów, obejmujacy nastepujaca sekwencje: Thr-X4-Lys-X5 -Arg-X6 (Identyfikator Sekw. Nr 19), w której X4 i X5 sa niezaleznie wybrane z grupy skladajacej sie z Met, Ile, Leu i Val; oraz X6 jest wybrany z grupy skladajacej sie z Asn, Asp, Gln i Glu, który ma jedna lub wiecej sposród ponizszych wlasciwosci: a) wywolywania zahamowania spontanicznego wytwarzania IL-8 przez ludzkie monocyty, b) wywolywania zahamowania powodowania przez IL-1ß wytwarzania IL-1 ß przez ludzkie komórki jednojadrzaste krwi obwodowej (PBMC), c) wywolywania wytwarzania bialka antagonisty receptora interleukiny 1 (IRAP) przez ludz- kie monocyty, d) wywolywania migracji chemotaktycznej ludzkich limfocytów CD8+ in vitro, e) odczulania ludzkich limfocytów CD8+ powodujacego brak aktywnosci wobec rhIL-10, f) hamowania odpowiedzi chemotaktycznej ludzkich limfocytów T CD4+ wobec IL-8, g) hamowania odpowiedzi chemotaktycznej ludzkich monocytów wobec MCAF/MCP-1, h) wywolywania wytwarzania IL-4 przez hodowane normalne ludzkie limfocyty T CD4+ , i) zmniejszania wytwarzania TNF-a w reakcji mieszanych ludzkich leukocytów. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku sąpolipeptydy, przeciwciało i kompozycja farmaceutyczna.

Niniejszy wynalazek dotyczy polipeptydów, które sąagonistami interleukiny 10 (IL-10) oraz zawierającej je kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i/lub leczenia chorób, których patogeneza związana jest ze zmniejszeniem wytwarzania i/lub czynności mediatorów hamujących układ odpornościowy, zwłaszcza cytokin i/lub związanych ze zwiększeniem wytwarzania i/lub czynności pewnych mediatorów immunologiczno-zapalnych, zwłaszcza cytokin. W szczególności, wynalazek dotyczy zastosowania substancji według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i/lub leczenia chorób autoagresyjnych (cukrzycy typu I; chorób zapalnych przewodu pokarmowego; reumatoidalnego zapalenia stawów), zapalenia stawów w przebiegu skazy moczanowej (dny), alergii skórnej; reakcji alergicznych skóry, płuc i dróg oddechowych (włączywszy astmę oskrzelową); uszkodzenia tkanek z powodu hipoksji/niedokrwienia (zawału; reperfuzji); miażdżycy; łuszczycy; choroby ziaminiakowej; przewlekłej białaczki szpikowej; ostrej białaczki szpikowej; raka; reakcji przeszczep przeciwko gospodarzowi i stanów związanych z odrzuceniem przeszczepu; zwłóknienia płuc; zwłóknienia wątroby; przewlekłego niezakaźnego zapalenia płuc; kłębkowego zapalenia nerek; zapobiegania przedwczesnemu porodowi; zapobiegania i/lub leczenia paradontozy; reakcji zapalnych z powodu zakażenia wirusem, osteoporozy, wstrząsu septycznego i/lub do wytwarzania środków antykoncepcyjnych.

Badania ostatnich dwóch dekad wykazały, że zapoczątkowanie, regulacja i zakończenie reakcji zapalnych jak również regulacja wzrostu i różnicowania w organizmie ssaków znajduje się pod ścisłąkontroląspecjalnej grupy polipeptydów sygnałowych określanych ogólniejako cytokiny. Cytokiny są polipeptydami, które mogą być wytwarzane przez większość komórek jądrzastych i które przekazują sygnały regulacyjne pomiędzy komórkami, tworząc w ten sposób sieć komunikacyjną pomiędzy identycznymi lub różnymi rodzajami komórek organizmu. Cytokiny są niezwykle silnymi mediatorami i pozostają aktywne w stężeniach rzędu 10'¹⁵ M. Cytokiny są również kluczowymi czynnikami w rozwoju komórkowej odpowiedzi odpornościowej, która z kolei stanowi podstawę objawów klinicznych zapalenia z powodu zakażenia, alergii, urazu, reakcji przeszczepu przeciwko gospodarzowi i chorób autoagresyjnych. Choroby alergiczne i autoagresyjne są tłumaczone zaburzeniami w układzie odpornościowym, zwłaszcza w zakresie odporności zależnej od limfocytów T, chociaż etiologia tych chorób jest ogólnie nieznana. Bada

181 042 nia in vitro, doświadczenia na zwierzętach i, doświadczenia kliniczne wykazały, że cytokiny odgrywają istotną patofizjologiczną rolę w reakcjach zapalnych związanych z chorobami autoagresyjnymi, alergia, niedokrwieniem, uszkodzeniem w wyniku reperfuzji, urazem, zakażeniami, oraz sąistotne w rozwoju nowotworu, miażdżycy, rozwoju ciąży i płodu, homeostazy kości. Cytokiny mogąbyć związane z innymi chorobami zapalnymi na podłożu immunologicznym oraz chorobami proliferacyjnymi jak to będzie opisane dalej. Wspomniane choroby mają zwykle przebieg przewlekły zaś leczenie jest paliatywne, np. większość leków przepisywanych w tych chorobach ma na celu złagodzenie objawów i zwykle nie wywiera efektu leczniczego. Inne rodzaje leczenia, zwane leczeniem substytucyjnym, obejmująpodawanie pacjentowi przez całe życie substancji, np. hormonów, niezbędnych z powodu ich zmniejszone/niedostatecznej produkcji wewnętrznej. Takie leczenie jest często niezadowalające, wywołuje niepożądane i często poważne efekty uboczne, i tylko opóźnia, a nie zapobiega postępowi choroby. Tak więc, istniej e olbrzymie zapotrzebowanie na ulepszone sposoby leczenia i ulepszone kompozycje farmaceutyczne.

Interleukina 10 (IL-10) jest ostatnio opisaną naturalną endogenną cytokinąimmunosupresyjną znalezioną w organizmie ludzkim i mysim. Mysia interleukina 10 (mIL-10) była początkowo opisana jako czynnik hamujący syntezę cytokin, uwalniany z klonów limfocytów pomocniczych TH2, ale ma także wpływ proliferacyjny na wiele różnych podtypów limfocytów, wpływając między innymi na zwiększenie efektywności klonalnej mysich śledzionowych limfocytów T CD4'8⁺ (4). Ludzka interleukina 10 (hIL-10) została ostatnio zsekwencjonowana i wykazuje dużąhomologię z mIL-10 na poziomie DNA, jak również na poziomie aminokwasowym. Ponadto, świńska IL-10 została ostatnio zsekwencjowana i wykazuje znaczną holomogię z ludzką IL-10 na poziomie DNA, jak również na poziomie aminokwasowym (88), patrz również figura 2. hIL-10 wykazuje również dużąhomologię z otwartą ramką odczytu w genomie wirusa Epsteina-Barr, BCRF1, zaś wirusowa IL-10 wykazuje pewną aktywność podobną do hIL-10, patrz fig. 1(5).

Ludzka IL-10 jest wytwarzana przez pobudzone klony limfocytów T i unieśmiertelnione limfocyty B, i oprócz swojej aktywności czynnika hamującego syntezę cytokin (CSIF), hamującej wytwarzanie niektórych zapalnych cytokin i czynników pobudzających tworzenie kolonii, wywołuje także wytwarzanie białka/peptydu naturalnego antagonisty receptora interleukiny-1- (IRAP) przez komórki jednojądrzaste, hamując w ten sposób pośrednio aktywność IL-1. IL-10 obniża także produkcję jej przez monocyty i hamuje ekspresję MHC klasy II (12). Dalej, hIL-10 zmniejsza zależną od antygenu proliferację ludzkich limfocytów T i klonów CD4⁺ limfocytów T, jeżeli stosuje się monocyty jako komórki prezentujące antygen. Doświadczenia in vivo na myszach wskazują że przebieg zakażenia Leishmania jest zależny od profilu cytokin z reagujących limfocytów T CD4⁺ (13). U myszy C57BL/6, odpornych na zakażenie Leishmania, limfocyty T CD4⁺ zregionalnych węzłów chłonnych wykazują dodatniąregulację cytokin IFN-γ i IL-2, podczas gdy wrażliwe myszy BALB/c w swych regionalnych węzłach chłonnych posiadają limfocyty T CD4⁺ uwalniające IL-4 i IL-10, co, jak wykazano, koreluje z postępem choroby (13). Tak więc, IL-10 może wywierać silne działanie regulacyjne na odpowiedź odpornościową zarówno in vitro jakim vivo. Ponadto, IL-10 silnie wpływa na biologię chemokin, ponieważ ludzka interleukina 10 jest swoistym czynnikiem chemotaktycznym dla limfocytów T CD8⁺, ponieważ IL-10 hamuje zdolność limfocytów T CD4⁺, ale nie CD8⁺ do migracji pod wpływem cytokiny chemotaktycznej dla limfocytów T, IL-8 (14). IL-10 hamuje również wpływ chemotaktyczny innych chemokin, jak MCP-1/MCAF i RANTES (75). Ponieważ IL-10 dezaktywuje funkcje monocytów/makrofagów i hamuje aktywność Thl, leki o pełnej łub częściowej aktywności przypominającej IL-10 mogą wywierać wpływ leczniczy na choroby charakteryzujące się zaburzeniem równowagi produkcji i/lub czynności cytokin.

Uprzednio zaproponowano wytworzenie kompozycji farmaceutycznych zawierających hIL-10 albo vIL-10, zaś ich zastosowanie do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do leczenia różnych stanów, takich jak wstrząs septyczny albo toksyczny, reumatoidalne zapalenie stawów, choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi, odrzucenie przeszczepu, cukrzyca, zabudzenia autoagresyjne, białaczka i nowotwory ujawniono np. w WO93/02693 i WO94/04180.

181 042

Ponadto, antagoniści IL-10, np. przeciwciała swoiście wiążące IL-10, ujawniono w np. EP 405 980 i WO94/06473 i jak się uważa, przeciwciała te powinny być skuteczne w leczeniu pacjentów zakażonych HIV.

Według niniejszego wynalazku, stwierdzono, że substancja inna niż ludzka interleukina 10, która posiada jedną lub więcej poniższych właściwości:

a) wywołuje zahamowanie spontanicznego wytwarzania IL-8 przez ludzkie monocyty,

b) wywołuje zahamowanie produkcji IL-8 indukowanej przez IL-1 Pprzez ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC),

c) wywołuje wytwarzanie białka antagonisty receptora interleukiny 1 (IRAP) przez ludzkie monocyty,

d) wywołuje migracje chemotaktyczną ludzkich limfocytów CD8⁺ in vitro,

e) odczula ludzkie limfocyty CD8⁺ powodując brak aktywności wobec rhIL-10,

f) hamuje odpowiedź chemotaktyczną ludzkich limfocytów T CD4⁺ wobec IL-8,

g) hamuje odpowiedź chemotaktyczną ludzkich monocytów wobec MCAF/MCP-1,

h) nie hamuje ekspresji cząsteczki MHC klasy II na ludzkich monocytach, w przeciwieństwie do ludzkiej IL-10,

i) wywołuje wytwarzanie IL-4 przez hodowane normalne ludzkie limfocyty T CD4⁺, j) zmniejsza wytwarzanie TNF-α w reakcji mieszanych ludzkich leukocytów, taka jak polipeptyd, obejmujący sekwencję aminokwasową Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn albo analog albo odmianę tej sekwencji (nonapeptyd o sekwencji homologicznej z hIL-10, zwany IT9302) oraz ich pochodne, może być zastosowana do zapobiegania i/lub leczenia pewnych postaci procesów zapalnych, zwłaszcza postaci związanych z układem odpornościowym i/lub hormonalnym. Uważa się (jak to opisano szczegółowo w poniższym opisie mechanizmu immunologicznego), że mechanizm działania zachodzi przez zakłócanie z działaniem mediatorów układu odpornościowego, w szczególności cytokin takich jak monokiny, limfokiny, chemokiny i antagoności receptorów monokin, tzn. że substancja według wynalazku zakłóca/hamuje wytwarzanie i/lub czynność pewnych cytokin hamując w ten sposób procesy patologiczne prowadzące do uszkodzenia tkanek, oraz że substancja według wynalazku wywołuje wytwarzanie naturalnych antagonistów receptorów monokin zakłócaj ąc/hamując w ten sposób działanie pewnych cytokin i hamując procesy patalogiczne prowadzące do uszkodzenia tkanek. Istotne wykonanie wynalazku dotyczy więc kompozycji farmaceutycznej obejmującej, jako składnik czynny, substancję według wynalazku.. Inne wykonanie wynalazku stanowią substancję, którajest zdolna do neutralizacji jednej lub więcej aktywności od a) do g), wymienionych powyżej, np. przeciwciało, oraz kompozycję farmaceutyczną obejmującą taką substancję.

W dalszym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania substancji według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zasadniczego hamowania efektu biologicznego związanego z cytokiną tj. zastosowania substancji według wynalazku jako białka/peptydu antagonisty receptora interleukiny 1, limfokiny, monokiny, interleukiny, interferonu, chemokiny albo czynnika pobudzającego tworzenie kolonii. Inny aspekt dotyczy zastosowania substancji według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do profilaktyki albo leczenie stanów związanych z zaburzeniami układu cytokin, tj. białka/peptydu antagonisty receptora interleukiny 1, limfokiny, monokiny, interleukiny, interferonu, chemokiny albo czynnika pobudzającego tworzenie kolonii. W innym aspekcie, wynalazek dotyczy również sposobu leczenia u ludzi stanów związanych z zaburzeniami układu cytokin, obejmującego podawanie osobnikowi skutecznej ilości substancji według wynalazku.

Układ odporności komórkowej bierze udział w rozwoju takich zaburzeń jak choroby zakaźne, zapalne i nowotworowe. Komórki immunokompetentne i ich produkty mogą odgrywać istotną rolę w zapoczątkowaniu, postępie i prawdopodobnie przewlekłym przebiegu stanów zapalnych. Choroby te mają często nieznaną etiologię i obejmują tak powszechne choroby jak cukrzyca, reumatoidalne zapalenie stawów, choroby zapalne przewodu pokarmowego i skóry. Oprócz tych przykładów, odporność komórkowa albo mediatory zapalne przyczyniają się do wielu innych chorób zapalnych i proliferacyjnych (patrz tabela 2).

181 042

Tabela 2

Niektóre choroby, z którymi wiąże się patogenetyczny udział reakcji odpornościowych związanych z układem makrofagów/limfocytów T

Choroby skóry:

Łuszczyca

Atopowe zapalenie skóry

Kontaktiowe zapalenie skóry

Chłoniak skóry z limfocytów T (CTCL)

Zespół Sezar/ego

Pęcherzyca

Pemfigoid

Rumień guzowaty

Twardzina

Choroby autoagresyjne (włącznie z reumatoidalnymi):

Zapalenie błony naczyniowej oka

Choroba Becheta

Sarkoidoza Boecka

Zespół Sjoegrena

Reumatoidalne zapalenie stawów

Dziecięce zapalenie stawów

Zespół Reitera

Dna

Zapalenie kostno-stawowe

Toczeń rumieniowaty układowy

Zapalenie wielomięśniowe

Zapalenie mięśnia serca

Pierwotna marskość żółciowa

Choroba Crohna

Wrzodziejące zapalenie okrężnicy

Stwardnienie rozsiane i inne choroby demielinizacyjne

Anemia aplastyczna

Idiopatyczna trombocytopenia

Szpiczak mnogi i chłoniak z limfocytów B

Panhipopituitaryzm Simmonsa

Choroba Gravesa i oftalmopatia Grvesa

Podostre zapalenie tarczycy i choroba Hashimoto

Choroba Addisona

Cukrzyca insulino-zależna (typu I)

Inne choroby:

Różne zespoły przebiegające z zapaleniem naczyń (np. guzowate zapalenie tętnic, ziaminiak Wegenera, wielkokomórkowe zapalenie tętnic, gorączka, rozbicie)

Anoreksja (np. w ostrych i przewlekłych chorobach zapalnych i zakaźnych)

Rozsiane wykrzepianie wewnątrznaczyniowe (DIC)

Miażdżyca

Wstrząs (np. posocznica Gram-ujemna)

Kacheksja (np. w nowotworach, przewlekłych chorobach zakaźnych i przewlekłych chorobach zapalnych)

Odczucanie przeszczepu i choroba „przeszczep przeciwko gospodarzowi”

Cytokiny:

Limfocyty dyrygują wywołaniem i regulacjąkomórkowych reakcji odpornościowych, zaś cytokiny (limfokiny) limfocytów T zapoczątkowują i kontrolują odpowiedź odpornościową (1,2). Mediatory aktywujące limfocyty (limfokiny) wytwarzane przez komórki prezentujące antygen, należą do grupy polipeptydów zwanych cytokinami. Cytokiny są przekaźnikami w komunikacji międzykomórkowej w warunkach fizjologicznych jak patofizjologicznych, i mogą również działać jako hormony przekazując sygnały pomiędzy układem odpornościowym a innymi tkankami i narządami. Cytokiny mogąbyć również wytwarzane przez komórki poza układem odpornościowym i uważa się, że wszystkie jądrzaste komórki są zdolne do wytwarzania jednej lub kilku cytokin. Tak więc, np. keratynocyty i fibroblasty są silnymi producentami cytokin i w

181 042 tym układzie cytokiny mogą działać jako hormony autokrynne lub parakrynne, niezależne od układu odpornościowego (3).

Interleukina 10:

Mysia interleukina 10 (mIL-10) była początkowo opisana jako czynnik hamujący syntezę cytokin (CSIF), uwalniany z klonów limfocytów TH₂, ale wywiera ona także wpływ proliferacyjny na wiele różnych podtypów limfocytów, włącznie z wpływem zwiększającym efektywność klonalną mysich śledzionowych limfocytów T CD4'8⁺ (4). Ludzka interleukina 10 (hIL-10) została ostatnio opisana (5) i wykazuje dużąhomołogię z otwartą ramką odczytu w genomie wirusa Epsteina-Barr, BCRF1, zaś wirusowa IL-10 wykazuje pewną aktywność podobną do hIL-10. Poniżej, podsumowano biochemiczny, biologiczny, fizjologiczny i prawdopodobnie patofizjologiczny wpływ IL-10.

Budowa IL-10:

Budowa pierwszorzędowa mysiej (mIL-10) i ludzkiej IL-10 (hIL-10) wykazuje na całej długości znaczny stopień homologii sekwencji nukleotydowej (>80%) (4,5). Jedyna znacząca różnica polega na obecności ludzkiego elementu powtórzonych sekwencji Alu w nie ulegającym translacji regionie 3'klonu cDNA hIL-10. cDNA mIL-10 i hIL-10 kodująpodobne otwarte ramki odczytu (ORF) wielkości 178 aminokwasów, włącznie z hydrofobowymi sekwencjami liderowymi i odpowiadające 73% homologii aminokwasowej. mIL-10, która wywiera działanie na komórki mysie nie reaguje krzyżowo w sposób znaczący z komórkami ludzkimi. hIL-10 jest polipeptydem o wielkości 18 kDa, pozbawionym wykrywalnych węglowodanów, a mIL-10 jest N-glikozylowana w pobliżu końca N, czego pozbawiona jest hIL-10. Zarówno mIL-10, jak i rekombinowana hIL-10 (rhIL-10) powstają w wyniku ekspresji jako niekowalentne homodimery. Zakres, w jakim monomery mIL-10 albo hIL-10 są biologicznie czynne nie jest jeszcze pewny. Według publikacji Moore i in., w której po raz pierwszy opisano sekwencj ę ludzkiej IL-10 (6), mIL-10 i hIL-10 ze znacznikiem polipeptydowym, wielkości co najmniej 8 aminokwasów, na swym końcu N i 21 aminokwasów na swym końcu C, nie wykazywały wykrywalnej utraty aktywności. Znakowanie końców N i C kompletnej IL-10 nie powoduje zmian funkcjonalnych, o ile znakowanie jest okresowe albo przypadkowe. Znaczna liczba możliwych podstawień aminokwasowych, jak to dalej opisano szczegółowo, może również tłumaczyć czemu znakowanie nie wpływa na funkcję. RekombinowanąmIL-10 i hIL-10 otrzymano w wyniku ekspresji w: komórkach CDS7, komórkach mysiego szpiczaka, komórkach jajnika chomika chińskiego, układzie ekspresyjnym bakulowirusa oraz w E. coli. Działanie biologiczne tych białek rIL-10 było, jak dotąd, nierozróżnialne (6).

Gen mIL-10 obejmuje pięć egzonów, uszeregowanych na przestrzeni około 5,1 kb DNA. Klon genomowy sam koduje możliwe do ekspresji białko IL-10. Geny mIL-10 i hIL-10 znajdują się na mysim i ludzkim chromosomie 1 (6,7).

mIL-10 i hIL-10 wykazują silną homologię sekwencji DNA i aminokwasów z otwartą ramką odczytu genomu wirusa Epsteina-Barr, BCRF-1 zaś homologia dotyczy wyłącznie sekwencji kodującej dojrzałe białko i nie jest stwierdzana w sekwencji sygnałowej albo nie ulegających translacji sekwencjach 3'- i 5' (5). Wśród trzech sekwencji, mIL-10 i hIL-10 sąnabliżej spokrewnione na poziomie sekwencji DNA (81%), podczas gdy sekwencje DNA kodujące dojrzałe białka hIL-10 i BCRF-1 mają71% homologii. Homologiapomiędzy hIL-10 i BCRF-1 na poziomie aminokwasowym wynosi 84%. Uważa się, że geny mIL-10 i hIL-10 ewoluowały od wspólnego przodka, podczas gdy BCRF-1 stanowi obrobiony, zatrzymany w komórce gen wyjściowy cytokiny zaś białko BCRF-1 zostało przekształcone tak, by przypominało hIL-10. BCRF-1 powstaje w wyniku ekspresji podczas cyklu litycznego EBV. ORF BCRF-1 koduje peptyd wydzielniczy wielkości 17 kDa, który podobnie jak hIL-10 nie wykazuje lub wykazuje niewielkąglikozylację. BCRF-1 wykazuje pewne działanie hIL-10 i bywa określanajako wirusowa IL-10 (vIL-10), mimo iż jej aktywność stanowi 10% hIL-10.

Wpływ 1L-10 na wytwarzanie cytokin:

hIL-10 hamuje wytwarzanie wielu cytokin, włącznie z interferonem-γ (IFN-γ), czynnikiem martwicy nowotworu-α (TNF-a), czynnikiem pobudzającym kolonie granulocytów/ma

181 042 krofagów (GMCSF), granulocytamym CSF (G-CSF), IL-la, IL-Ιβ, IL-2, IL-6, IL-8 i monocytamym polipeptydem chemotaktycznym-1 (MCP-1 /MC AF) przez monocyty/makrofagi i/lub limfocyty T (4,5). IL-10 hamuje również zdolność monocytów do migracji w odpowiedzi na chemokinę MCP-l/MCAF (75). Ponadto, hIL-10 wywołuje wytwarzanie endogennego naturalnego antagonisty receptora interleukiny 1 (IRAP) (6), co hamuje IL-Ια i IL-Ιβ przez współzawodnictwo o wiązanie z receptorem. Ponieważ IL-8 ulega silnej indukcji przez IL-Ια i IL-Ιβ, IL-10 wywiera częściowo swój wpływ hamujący na wytwarzanie IL-8 przez pobudzanie wytwarzania antagonisty receptora IL-1 IRAP. Ten ostatni mechanizm jest szczególnie ważny dla niniejszego wynalazku jak to dalej opisano w przykładach. IRAP wykazuje działanie przeciwzapalne (9), i sugeruje się jego wpływ leniczny na reumatoidalne zapalenie stawów (10). Stwierdzono również skuteczność IRAP w leczeniu pasocznicy, zaś w badaniu Fishera i in., zależy od dawki, 28-dniowy wzrost przeżywalności związany był z leczeniem IRAP (p=0,015) (11). IRAP może wywierać część swego wpływu przeciwzapalnego przez hamowanie wytwarzania chemokin, takich jak IL-8.

IL-10 i ekspresja antygenów:

IL-10 hamuje ekspresję MHC klasy II na ludzkich monocytach (8). Konstytutywna i wywołana przez IL-4 i IFN-γ ekspresja HLA-DR/DP oraz DQ, hamowana była przez hIL-10 (12). Oprócz tego, monocyty preinkubowane z IL-10 były oporne na następującąpóźniej indukcję ekspresję MHC klasy II przez IL-4 i IFN-γ. IL-10 hamuje ekspresje MHC klasy II na ludzkich monocytach w następstwie aktywacji LPS (12,76). Myszy BALB/c, którym podano od 1 do 10 mg IL-10 równocześnie ze śmiercionośną dawką LPS były chronione przed śmiercią (6). IL-10 hamuje powstawanie związków przejściowych azotu i anionów nadtlenkowych. IL-10 hamuje również wytwarzanie przez makrofagi aktywnych związków pośrednich azotu (NO) jak również aktywnych związków pośrednich tlenu (H₂O₂) po aktywacji IFN-γ (13).

IL-10 i aktywność limfocytów T:

IL-10 wywiera również wpływ regulacyjny na działanie/aktywność limfocytów T. Tak więc, hIL-10 jest silnym czynnikiem chemotaktycznym dla limfocytów T CD8⁺, podczas gdy hIL-10 nie wykazuje chemotaksji wobec limfocytów T CD4⁺ (14). Oprócz tego, IL-10 hamuje zdolność limfocytów T CD4⁺ do odpowiedzi na sygnały chemotaktyczne β-chemokiny RANTES, jak również α-chemokiny IL-8. hIL-10 hamuje również bezpośrednio proliferację ludzkich obwodowych limfocytów T i klonów limfocytów CD4⁺ (14).

IL-10 i limfocyty B:

hIL-10 kostymuluje proliferacje limfocytów B wywołaną przez związanie krzyżowe powierzchniowych Ig, unieruchomionymi przeciwciałami przeciwko IgM, i działanie to jest wzmocnione gdy limfocyty B są pobudzane przez związanie ich antygenu CD40 przez przeciwciało przeciwko CD40 i mysie komórki L ekspresjonujące ludzką FcyRII/CD32 (15). Wpływ IL-10 na proliferację i różnicowanie pobudzonych ludzkich limfocytów B wskazuje, że ta cytokina może odpowiadać w znacznej mierze za doskonałą zdolność limfocytów T ekpresjonujących hIL-10 do wspomagania odpowiedzi limfocytów B.

IL-10 jako czynnik homeostatyczny dla układu odpornościowego:

Fizjologiczne konsekwencje działań IL-10, wymienione wyżej, są, jak się uważa, szczególnym punktem homeostazy układu odpornościowego. Tak więc, IL-10 hamuje działanie limfocytów T pomocniczych i prawdopodobnie pobudza limfocyty T o działaniu supresyjnym. Stąd, podobnie jak IL-4, IL-4, jak się uważa, reguluje równowagę pomiędzy profilami Thl i TH2 limfocytów T. Uważa się zwłaszcza, że IL-10 hamuje różnicowanie limfocytów Th 1. Ponieważ limfocyty Thl charakteryzują się wytwarzaniem cytokin (IFN-γ i IL-2), które faworyzują odpowiedzi odpornościowej typu komórkowego, zaś limfocyty Th2 wytwarzają cytokiny (IL-4, IL-5 i IL-10), które faworyzują odpowiedź humoralną i hamują odpowiedź odpornościową typu komórkowego, IL-10 wydaje się hamować reakcje komórkowe limfocytów T, takie jak reakcja nadwrażliwości typu późnego a faworyzuje odpowiedź humoralną.

W wyniku cech IL-10 opisanych wyżej, opisano aktywność IL-10 jako inhibitora makrofagów i syntezy cytokin Thl. Stąd, badano, czy brak wytwarzania i/lub czynności IL-10 może od

181 042 grywać rolę w chorobach, w których zwiększona komórkowa aktywność immunologiczna uważana jest za kluczową przyczynę choroby, takich jak choroby autoagresyjne i zapalne. Myszy traktowane przeciwciałami przeciwko IL-10 wykauzją silniejszą odpowiedź zapalną na zapalenie wywołane monokinami i są znacznie podatniejsze na śmierć wywołaną wstrząsem septycznym po podaniu LPS, reakcję zapalnąwywołanąmonokinami (16). Myszy z knock-oufem IL-10 samoistnienie rozwijają reakcje zapalne w jelitach, przypominające wrzodziejące zapalenie okrężnicy (17). Oprócz tego, badano czy IL-10 odgrywa rolę w różnych zakażeniach pasożytniczych, mykobakteryjnych albo wirusowych, i wykazano, że IL-10 odgrywa patofizjologiczną rolę w immunosupresji związanej z zakażeniem Schistosoma mansoni (18). Sugeruje się również rolę w zakażeniu Mycobacterium leprae. Ostatnio, odkryto, że u pacjentów z AIDS o złym rokowaniu stwierdza się wyższy poziom IL-10 w osoczu, i przyczynia się to, j ak się uważa, do imunosupresji spotykanej również w AIDS (19).

Rozważania terapeutyczne:

Te badania/dane in vivo wskazująsilnie na homeostatycznąrolę IL-10 w kontrolowaniu zapalnych komórkowych reakcji odpornościowych wzmaganych przez monokiny i wskazują na szerokie zastosowanie lecznicze IL-10 albo leku o aktywności IL-10 w leczeniu chorób charakteryzujących się zmniejszoną niewystarczająca produkcją i/lub aktywnościąIL-10. Ponieważ substancja według niniejszego wynalazku, na przykładzie IT9302, wywiera działanie przypominające IL-10 przez

1) indukcję wytwarzania IRAP przez ludzkie monocyty,

2) hamowanie samoistnego wytwarzania IL-8 przez ludzkie monocyty,

3) hamowanie wywołanego przez IL-β wytwarzania IL-8 przez jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC),

4) pobudzanie migracji chemotaktycznej ludzkich limfocytów CD8⁺, ale nie CD4⁺,

5) odczulanie ludzkich limfocytów T CD8⁺ wobec migracji chemotaktycznej wywołanej rhIL-10, 6) hamowanie chemotakcji ludzkich limfocytów T CD4⁺, wywołanej IL-8, i

7) hamowanie chemotaksji ludzkich monocytów, wywołanej MCP-l/MCAF,

8) wywołanie wytwarzania IL-4 przez hodowane normalne limfocyty T CD4⁺,

9) zmniejszanie wytwarzania TNF-α w reakcji mieszanych ludzkich leukocytów, polipeptyd ten i j ego analogi mogą więc posiadać te same możliwości terapeutyczne co IL-10. W tabeli 3 wymieniono niektóre choroby, w których immunomodulator jak IL-10 albo immunomodulator o aktywności przypominającej IL-10 może mieć znaczenie lecznicze.

Tabela 3

Niektóre choroby, w których immunomodulator o aktywności przypominającej IL-10, z powodu wywoływania wytwarzania IRAP i/lub zahamowanie wytwarzania i/lub działania cytokin może mieć znaczenie lecznicze (odnośniki 20-74)

Poród przedwczesny wywołany zakażeniem albo innymi czynnikami

Reumatoidalne zapalenie stawów

Zapalenie stawów Lyme

Dna

Zespół posocznicowy

Hipertermia

Wrzodziejące zapalenie okrężnicy albo okrężnicy i jelit

Osteoporoza

Cytomegalia

Paradontoza

Kłębkowe zapalenie nerek

Przewlekłe, niezakaźne zapalenie płuc (np. sarkoidoza i płuco palacza)

Tworzenie ziarniny

Zwłóknienie wątroby

Zwłóknienie płuc

Odrzucenie przeszczepu

181 042 cd. tabeli 3

Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi

Przewlekła białaczka szpikowa

Ostra białaczka szpikowa

Inne choroby nowotworowe

Astma oskrzelowa

Cukrzyca typu I (insulino-zależna)

Miażdżyca

Łuszczyca

Przewlekła białaczka z limfocytów B ***zmienny niedobór odporności

Efekty uboczne stosowania innych modyfikatorów odpowiedzi biologicznej

Rozsiane wykrzepianie wewnątrznaczyniowe

Stwardnienie układowe

Zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego

Zapalenie płuc

Zespół nadmiaru IgE

Zapalenie jelit i okrężnicy

Wzrost nowotworu i przerzuty

Immunoterapia adoptywna

Nabyty zespół niewydolności oddechowej

Posocznica

Zespół reperfuzyjny

Zapalenie pooperacyjne

Przeszczepianie narządów

Łysienie

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

Opracowanie nonapeptydu homologicznego z IL-10 o aktywności przypominającej IL-10:

W oparciu o zasadę, że sekwencje powinny posiadać znacznąhomologię pomiędzy vIL-10 i hIL-10, ale możliwie niską homologię z mIL-10, wybrano sekwencje częściowe hIL-10 o długości 9 aminokwasów. Strategia ta oparta była na efekcie, że vIL-10 częściowo reaguje krzyżowo z hIL-10, podczas gdy mIL-10 nie reaguje krzyżowo z hIL-10 (patrz wyżej). Tak więc, sekwencje hIL-10 odpowiedzialne za pewne aktywności w organizmie ludzkim mogąbyć położone w domenach gdzie istnieje silna homologia pomiędzy hll-10 i vIL-10, ale słaba w odniesieniu do mIL-10.

Polipeptyd sygnałowy hIL-10 obejmuje, jak się uważa, pierwsze 18 aminokwasów. Białko dojrzałe zaczyna się od aminokwasów nr 19 (nr 1 w białku funkcjonalnym, seryna), zaś całe białko składa się ze 160 aminokwasów. Przez przeszukiwanie sekwencji końca karboksylowego ludzkiej i wirusowej IL-10, a zwłaszcza pozycji 157 i 159, zawierających reszty lizyny i argininy, znaleziono tę domenę, która mogłaby być częściowo odpowiedzialna za wiązanie z receptorem (fig. 112).

Po przeszukaniu kilku kandydatów, uzyskanych przez syntezę chemiczną pod kątem aktywności przypominającej IL-10, stwierdzono, że syntetyczny nonapeptyd, IT9302, wykazuje pewne działanie imunosupresyjne, przypominające IL-10, jak to opisano dalej w przykładach. IT9302 odpowiada nonapeptydowej sekwencji końca C hIL-10 o następującej sekwencji aminokwasowej:

NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn-COOH (Identyfikator Sekw. Nr 1)

IT9302 wykazywał 100% homologii z segmentem hIL-10 odpowiadającym aminokwasom od nr 152 do 160 na końcu C. Ponadto, ta sekwencja polipeptydowa miała 6 aminokwasów wspólnych z wirusowąIL-10 w analogicznym regionie (patrz fig. 1 i 2), oznacza, że 6 spośród 9 albo 66% aminokwasów jest homologicznych, jak to określono wyżej, oraz 4 aminokwasy wspólne z mIL-10, tzn. 4 spośród 9 albo 44%. Ten nonapeptyd jest jedyną sekwencją uzyskaną z hIL-10 i dotąd zbadaną która posiada specjalne właściwości przedstawione w przykładach. Do momentu zbadania przez twórców niniejszego wynalazku, nikt nie wskazał na tę sekwencję jako domenę funkcjonalną

181 042

W swym najszerszym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy substancji wykazującej aktywność agonisty hIL-10, tj. substancji innej niż ludzka interleukina 10, która posiada jedną lub więcej poniższych właściwości:

a) wywołuje zahamowanie spontanicznego wytwarzania IL-8 przez ludzkie monocyty, b) wywołuje zahamowanie produkcji IL-8 indukowanej przez IL-1 βprzez ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC),

d) wywołuje migrację chemotaktyczną ludzkich limfocytów CD8⁺ in vitro,

e) odczula ludzkie limfocyty CD8⁺ powodujące brak aktywności wobec rhIL-10, f) hamuje odpowiedź chemotaktyczną ludzkich limfocytów T CD4⁺ wobec IL-8, g) hamuje odpowiedź chemotaktyczną ludzkich monocytów wobec MCAF/MCP-1, h) nie hamuje ekspresji cząsteczki MHC klasy II na ludzkich monocytach, w przeciwieństwie do ludzkiej IL-10,

i) wywołuje wytwarzanie IL-4 przez hodowane normalne ludzkie limfocyty T CD4⁺j) zmniejsza wytwarzanie TNT-oc w reakcji mieszanych ludzkich leukocytów.

Wśród tych aktywności, d) do g) uważane są za najbardziej unikalne. Jednym z ważnych wykonań wynalazku jest substancja, która wykazuje aktywność agonisty hIL-10 jak to określono wyżej, obejmująca sekwencję aminokwasową Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn albo analog albo odmianę tej sekwencji. Sekwencja ta i wszystkie inne sekwencje polipeptydowe w niniejszym opisie i zastrzeżeniach, są, nawet gdy nie zaznaczono tego wyraźnie, zapisane w formacie standardowym, od końca N do końca C.

Nonapeptyd IT9302 bardzo silnie wywołuje różne działanie i jest bardzo stabilny, oraz uważa się, że nie może niewłaściwie wiązać się z receptorami. Nonapeptyd wybrano, ponieważ polipeptyd z 9 aminokwasów jest unikalny dla białek. Jednakże, należy zaznaczyć, iż wydaje się, że sześć końcowych aminokwasów hIL-10 jest najbardziej istotnych. W zakresie niniejszego wynalazku znajduje się substancja albo polipeptyd obejmujący sekwencję częściową o sekwencji aminokwasowej Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (Identyfikator Sekw. Nr 1).

Uważa się również, że niektóre podstawienia aminokwasowe nie wy wrą negatywnego efektu na aktywność zdefiniowanego tu agonisty hIL-10, o ile obecne są treonina, lizyna i arginina z jednym aminokwasem znajdującym się pomiędzy nimi.

W jednym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy więc pohpeptydu o wzorze

Thr-X4-Lys-Xs-Arg-X6 (Identyfikator Sekw. Nr 19), w którym

X₄ i Χ5 są niezależnie wybrane z grupy składającej się z Met, Ile, Leui Val; oraz

X₆ jest wybrany z grupy składającej się z Asn, Asp, Gin i Glu, pod warunkiem, że polipeptyd nie jest Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn.

W innym aspekcie, wynalazek dotyczy polipeptydu o wzorze

X3-Thr-X4-Lys-Xs-Arg-X6 (Identyfikator Sekw. Nr 20), w którym

Χ3, Χ4 i Χ5 są niezależnie wybrane z grupy składającej się z Met, Ile, Leu i Val; oraz X₆ jest wybrany z grupy składającej się z Asn, Asp, Gin i Glu.

W jeszcze innym aspekcie, wynalazek dotyczy polipeptydu o wzorze

X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (Identyfikator Sekw. Nr 21), w którym

Χ2 oznacza Tyr albo Phe,

Korzystnie wykonania wynalazku stanowią polipeptydy o wzorze

Xi-X2-X3-Th-X4-Lys-X5-Arg-Xń (Identyfikator Sekw. Nr 22),

181 042 w którym

Xi oznacza Ala albo Gly, X₂ oznacza Tyr albo Phe,

Χ3, Χ4 i Χ5 są niezależnie wybrane z grupy składającej się z Met, Ile, Leu i Val; oraz

Xó jest wybrany z grupy składającej się z Asn, Asp, Gin i Glu.

Wynalazek dotyczy zatem substancji lub polipeptydu, który obejmuje sekwencję aminokwasową określoną powyżej, pod warunkiem, że ani substancja ani polipeptyd nie są ludzką IL-10.

Przykładami szczególnych polipeptydów, o domniemanej aktywności agonisty hTT ,-10, określonej wyżej, są:

1. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Met-Arg-Asn-COOH

2. NH₂-Ala-Phe-Met-Thr-Leu-Lys-Leu-Arg-Asn-COO

3. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Glu-COOH

4. NH₂-Gly-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH

5. NH₂-Ala-Phe-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH

6. NH₂-Ala-Tyr-Ile-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH

7. NH₂-Ala-Tyr-Leu-Thr-Met-Ly s-Ile-Arg-Asp- CO OH

8. NH₂-Ala-Tyr-Val-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH

9. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH

10. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Leu-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH

11. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Val-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH

12. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COHH

13. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Met-Arg-Asp-COOH

14. NH₂- Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val- Arg- Asp-COOH

15. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Gln-COOH

16. NH₂-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Glu-COOH (Identyfikator Sekw. Nr 2) (Identyfikator Sekw. Nr 3) (Identyfikator Sekw. Nr 4) (Identyfikator Sekw. Nr 5) (Identyfikator Sekw. Nr 6) (Identyfikator Sekw. Nr 7) (Identyfikator Sekw. Nr 8) (Identyfikator Sekw. Nr 9) (Identyfikator Sekw. Nr 10) (Identyfikator Sekw. Nr 11) (Identyfikator Sekw. Nr 12) (Identyfikator Sekw. Nr 13) (Identyfikator Sekw. Nr 14) (Identyfikator Sekw. Nr 15) (Identyfikator Sekw. Nr 16) (Identyfikator Sekw. Nr 17).

Dla porównania, zsyntetyzowano inny nonapeptyd zwany IT9301 o 100% homologii z sekwencja hIL-10. Polipeptyd te, IT9301, odpowiadał nonapeptydowej sekwencji zaczynającej się na końcu N hIL-10 (aminokwasy od 19 do 27, tj. pierwszych 9 aminokwasów dojrzałego białka), i miał sekwencję aminokwasową: NH₂-Ser-Pro-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Ser-Glu-COOH (Identy fikator Sekw. Nr 18)

Polipeptyd ten nie wykazywał aktywności przypominającej IL-10 przy zastosowaniu technik opisanych niżej i wybrano go wyłącznie z powodu jego położenia na przeciwnym końcu hIL-10 i służył przede wszystkim jako kontrola do negatywnych wyników. Nie posiadał on właściwości sekwencji C-końcowej w odniesieniu do homologii sekwencji z vIL-10, ani korzystnych aminokwasów do wiązania z receptorem. IT9301 badano na układzie wydzielania IL-8 przez indukowane IL-1 pjednojądrzaste komórki krwi obwodowej, ale nie wywoływał on żadnego zahamowania wytwarzania IL-8 przez te komórki.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, określenie „substancja o aktywności agonisty hIL-10 według wynalazku” obejmuje każdy farmaceutycznie czynny i dopuszczalny związek, który jest identyczny albo strukturalnie podobny do IT9302 i wykazuje odpowiednie działania biologiczne podobne do wywieranych przez IT9302, włącznie z pochodnymi IT9302, zwłaszcza dopuszczalnymi farmaceutycznie solami, estrami i solwatami, jak również koniugaty IT9302 albo pochodne IT9302 włącznie z peptydomimetykami. Wiązanie kowalencyjne IT9302 na końcu NH₂ z odpowiednim nośnikiem, np. poliglikolem etylenowym albo cukrem może wydłużyć okres półtrwania polipeptydu in vivo. W niniejszym tekście użyto następujących określeń: „Cytokina” jest pojęciem ogólnym dla białkowego przekaźnika uwalnianego przede wszystkim, choć nie wyłącznie przez populację komórek układu odpornościowego, w odpowiedzi na czynnik pobudzający swoisty, np. antygen swoisty albo alloantygen; albo nieswoisty aktywator poliklonalny, np. endotoksynę albo inny składnik błony komórkowej bakterii Gram-ujemnej. „Limfokina”jest pojęciem ogólnym dla białkowego przekaźnika uwalnianego przez pobudzone limfocyty w odpowiedzi na czynnik pobudzający, np. antygen swoisty albo alloantygen; albo przez limfocyty

181 042 eksponowane na aktywator poliklonalny, np. endotoksynę albo inny składnik błony komórkowej bakterii Gram-ujemnej.

„Interleukina” jest pojęciem ogólnym dla białkowego przekaźnika uwalnianego przede wszystkim, choć nie 'wyłącznie przez makrofaga, limfocyty T, B albo NK, w odpowiedzi na czynnik pobudzający, np. antygen swoisty albo alloantygen; albo przez limfocyty eksponowane na aktywator poliklonalny, np. endotoksynę albo inny składnik błony komórkowej bakterii Gram-Ujemnej.

„Monokina” jest pojęciem ogólnym dla białkowego przekaźnika uwalnianego przede wszystkim, choć nie wyłącznie przez fagocyta jednojądrzastego (np. monocyta albo makrofaga albo komórkę Kupfera (wątroba) albo komórkę Langerhansa (skóra)) w odpowiedzi na dowolny czynnik pobudzający.

„Chemokina” jest pojęciem ogólnym dla białkowego przekaźnika uwalnianego przede wszystkim, choć nie wyłącznie przez populację komórek układu odpornościowego, w odpowiedzi na czynnik pobudzający swoisty, np. antygen swoisty albo alloantygen; albo nieswoisty aktywator poliklonalny, np. endotoksynę albo inny składnik błony komórkowej bakterii Gram-ujemny, i należącego do pewnej szczególnej rodziny genów, rodziny genów chemokin-aalbo rodziny genów chemokin-β.

Interferon” jest pojęciem ogólnym dla białkowego przekaźnika antywirusowego i/lub aktywującego monocyty, uwalnianego przede wszystkim, choć nie wyłącznie przez populację komórek układu odpornościowego, w odpowiedzi na wirusa albo induktor interferonu taki jak polinukleotyd; w szczególności komórki układu odpornościowego w odpowiedzi na czynnik pobudzający swoisty, np. antygen swoisty albo alloantygen; albo nieswoisty aktywator polikłonalny, np. endotoksynę albo inny składnik błony komórkowej bakterii Gram-ujemnej.

„Czynnikpobudzający tworzenie kolonii” jest pojęciem ogólnym dla białkowego przekaźnika, pobudzającego tworzenie kolonii uwalnianego przede wszystkim, choć nie wyłącznie przez populację komórek układu odpornościowego, w odpowiedzi na czynnik pobudzający swoisty, np. antygen swoisty albo alloantygen; albo nieswoisty aktywator poliklonalny, np. endotoksynę albo inny składnik błony komórkowej bakterii Gram-ujemnej.

„Polipeptyd” w znaczeniu tu użytym oznacza zarówno krótkie peptydy o długości przynajmniej dwóch reszt aminokwasowych do najwyżej 10 reszt aminokwasowych, oligopeptydy (11-100 reszt aminokwasowych), dłuższe peptydy (powszechna interpretacja „polipeptydu”, tj. ponad 100 reszt aminokwasowych długości) jak również białka (funkcjonalna jednostka obejmująca co najmniej jeden peptyd, oligopeptyd albo polipeptyd, który może ulegać chemicznej modyfikacji przez glikozylację, lipidylację albo przez przyłączenie grup prostetycznych). Definicja polipeptydu obejmuje również natywne postacie peptydów/białek u ludzi, jak również białka albo peptydy rekombinowane w dowolnym rodzaju wektorów ekspresyjnych transformujących dowolny rodzaj gospodarza, jak również peptydy syntetyzowane chemicznie.

Jedno z wykonań niniejszego wynalazku dotyczy polipeptydu obejmującego sekwencję częściową sekwencji ludzkiej IL-10, której stopień homologii względem vIL-10 wynosi 66% zaś stopień homologii względem mIL-10 wynosi 44%, w szczególności określonej przez Identyfikator Sekw. Nr 1. Przez określenie „homologia” należy rozumieć identyczność sekwencji aminokwasów w segmenie dwóch lub więcej aminokwasów dobranych pod względem identyczności i pozycji aminokwasów w polipeptydzie.

Homologia w znaczeniu tu użytym jest więc miarą podobieństwa pomiędzy dwoma sekwencjami aminokwasów (albo nukleotydów). Homologia wyrażana jest jako frakcja lub procent dopasowanych aminokwasów (albo zasad) po przyrównaniu dwóch sekwencji (o ile to możliwe równych długością). Z grubsza, dwie sekwencje są przyrównane przez maksymalizację liczby dopasowanych zasad (albo aminokwasów) pomiędzy dwiema sekwencjami z wstawieniem minimalnej liczby „pustych” albo „zerowych” zasad do obu sekwencji tak aby doprowadzić do ich maksymalnego nałożenia się. Określenie „homologiczny” zostało tu użyte przede wszystkim w celu zilustrowania stopnia identyczności pomiędzy sekwencją aminokwasową danego polipeptydu a sekwencją aminokwasową IT9302. Sekwencja aminokwasowa porównywana z sek

181 042 wencją aminokwasową ΙΤ93 02 może być wywnioskowana z sekwencji nukleotydowej takie jak sekwencja DNA albo RNA, np. uzyskanej przez hybrydyzację zdefiniowaną poniżej, albo może być uzyskana konwencjonalnymi metodami sekwencjonowania aminokwasów. Stopień homologii jest korzystnie określany na sekwencji aminokwasowej dojrzałego polipeptydu tj. nie biorąc pod uwagę sekwencji liderowej. Ogólnie, przy porównywaniu sekwencji nukleotydowych w celu określenia ich wewnętrznej homologii stosuje się wyłącznie sekwencje kodujące.

Jakkolwiek, uważa się, że znaczny stopień homologii z hIL-10 i vIL-10 j est korzystny, j est możliwe, że sekwencje częściowe hIL-10 wykazujące niższy stopień homologii z vIL-10, np. 50%, 55% albo 60%, mogą również wykazywać jedną lub wiele korzystnych aktywności ML-10. Ponadto, jak to dyskutowano powyżej, nie uważa się za absolutnie konieczne aby stopień homologii z hIL-10 wynosił 100%. W zakresie niniejszego wynalazku są również polipeptydy o niższym stopniu homologii z hIL-10, jak 75%, 80%, 85%, 90% albo 95%, jakkolwiek 100% jest korzystne.

Polipeptydy takie mogą być uważane za analogi nonapeptydu. Przez określenie „analog albo odmiana” rozumie się polipeptyd nie posiadający dokładnie sekwencji Ala-Tyr-Met-ThrMet-Lys-Ile-Arg-Asn (Identyfikator Sekw. Nr 1), ale wciąż wykazujący, „aktywność agonisty hIL-10”, jak to określono powyżej. Ogólnie, polipeptydy takie sąpolipeptydami, które różniąsię np. do pewnego stopnia składem aminokwasowym albo modyfikacjąpotranslacyjnąnp. glikozylacją albo fosforylacją w porównaniu z IT9302, opisanym w przykładach.

Określenie „analog” albo „odmiana” zastosowano w tym kontekście w celu określenia białka albo polipeptydu posiadającego nieco inną, ale wciąż podobną do IT9302 sekwencję aminokwasową, z ewentualnymi małymi odmianami zmieniającymi sekwencję aminokwasową np. delecjami, ukierunkowanymi mutacjami, wstawkami dodatkowych aminokwasów albo ich kombinacją w celu wytworzenia analogu polipeptydowego IT9302.

Mutageneza ukierunkowana zapewnia jeden z wygodnych sposobów wywołania zakonserwowanego podstawienia aminokwasowego, i temu podobnych, w sekwencji białka natywnego. Alternatywnie, analogi można wytworzyć dobrze znanymi sposobami syntezy polipeptydów w fazie ciekłej albo stałej, stosując kolejne sprzęganie pojedynczych aminokwasów i tworząc fragmenty sekwencji polipeptydowej, które mogą być potem sprzęgane tworząc pożądany polipeptyd.

„Konserwatywne” w znaczeniu tu użytym oznacza (i), że zmiany są na tyle konformacyjnie neutralne na ile to możliwe, tzn. zaprojektowane tak aby spowodowały minimalne zmiany w strukturze trzeciorzędowej zmutowanego polipeptydu w porównaniu z białkiem natywnym, i (ii), że zmiany są na tyle antygenowe neutralne na ile to możliwe, tzn. zaprojektowane tak aby spowodowały minimalne zmiany w determinantach antygenowych zmuntowanego polipeptydu w porównaniu z białkiem natywnym. Neutralność konformacyjna jest pożądana do zachowania aktywności biologicznej, zaś obojętność antygenowa jest pożądana dla uniknięcia wywołania odpowiedzi odpornościowej u pacjentów albo zwierząt leczonych substancją według wynalazku. Jakkolwiek, trudno jest wybrać z całkowitą pewnością która alternatywnie będzie neutralna konformacyjnie i antygenowe, istnieją zasady, które mogąpokierować specjalistów, w kierunku wytworzenia zmian o wysokim prawdopodobieństwie neutralności konformacyjnej i antygenowej, patrz przykładowo (77) i (78). Niektóre z ważniejszych zasad obejmują (1) zastępowanie reszt hydrofobowych raczej nie powinno wywoływać zmian antygenowości, ponieważ znajdują się one raczej we wnętrzu białka, patrz Berzofsky (cytowany wyżej) i Bowie i in., (wyżej); (2) zastępowanie reszt podobnych fizykochemicznie, tj. synonimicznych, nie powinno powodować zmian konformacyjnych, ponieważ zastępujące aminokwasy mogą odgrywać podobną rolę strukturalną co aminokwas zastępowany; i (3) zmiany sekwencji zakonserwowanych ewolucyjnie powinny wywierać szkodliwy wpływ na konformację, ponieważ konserwatywność ewolucyjna wskazuje, że sekwencja może mieć znaczenie dla funkcji. Oprócz tych podstawowych zasad do wyboru sekwencji mutein, dostępne są testy do potwierdzenia aktywności biologicznej i konformacji wytworzonych cząsteczek.

181 042

Testy biologiczne dla substancji według wynalazku są w pełni opisane w przykładach. Zmiany konformacji mogąbyć badane co najmniej dwoma dobrze znanymi testami: metodą zwaną „microcomplement fixation”, np. (79) i (80) stosowaną szeroko w badaniach ewolucyjnych trzeciorzędowej struktury białek; i powinowactwa z zestawem przeciwciał monoklonalnych swoistych dla konformacji, np. (81).

Istotne wykonanie niniejszego wynalazku dotyczy więc polipeptydu, w którym co najmniej jedna reszta aminokwasowa została podstawiona inną resztą aminokwasową i/lub w którym przynajmniej jedna reszta aminokwasowa została usunięta albo dodana, tak, że powstaje polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową różną od sekwencji aminokwasowej albo sekwencji częściowej wspomnianej sekwencji aminokwasowej, określonej poniżej, ale zasadniczo zachowujący aktywność agonisty IL-10 jak to określono wyżej.

Ciekawe wykonanie wynalazku dotyczy polipeptydu, który jest analogiem i/lub obejmuje przynajmniej cześć polipeptydu według wynalazku, zawierającąod lOdo 100 aminokwasów, np. przynajmniej 12 aminokwasów, przynajmniej 15 aminokwasów, przynajmniej 20 aminokwasów albo przynajmniej 30 aminokwasów.

W korzystnym wykonaniu wynalazku, substancja albo polipeptyd stosowany jest w postaci zasadniczo czystej. W celu uzyskania tego, może być konieczne oczyszczanie polipeptydu. Przykładami procesów stosowanych do oczyszczania polipeptydów są: (i) immunoprecypitacja albo chromatografia powinowactwa z przeciwciałami, (ii) chromatografia powinowactwa z odpowiednim ligandem, (iii) inne procedury chromatograficzne, takie jak chromatografia żelowa, wymiana jonowa albo wysokosprawna chromatografia cieczowa albo pochodne któregoś z powyższych, (iv) procedury elektroforetyczne, takie jak elektroforeza na żelu poliakrylamidowym, elektroforeza denaturująca na żelu poliakrylamidowym, elektroforeza na żelu agarozowym i ogniskowanie izoelektryczne, (v) każda inna technika solubilizacji i/lub oczyszczania.

W zakresie niniejszego wynalazku jest również sekwencja nukleotydowa kodująca polipeptyd zdefiniowany wyżej, w szczególności polipeptyd obejmujący albo mający sekwencję aminokwasową o Identyfikatorze Sekw. Nr 1, np. sekwencja nukleotydowa obejmująca sekwencję GCC TAC ATG ACA ATG AAG ATA CGA AAC (Identyfikator Sekw. Nr 23) albo sekwencja nukleotydowa kodująca polipeptyd mający sekwencję częściową wspomnianej sekwencji aminokwasowej . Ponadto, zmodyfikowana sekwencja nukleotydowa różniąca się od powyższej sekwencji nukleotydowej tym, że przynajmniej jeden nukleotyd usunięto, podstawiono albo zmodyfikowano albo przynajmniej jeden dodatkowy nukleotyd wprowadzono, w taki sposób, że powstała sekwencja nukleotydowa kodująca polipetyd wykazujący właściwości agonisty IL-10, znajduje się w zakresie wynalazku.

W niniejszym opisie i zastrzeżeniach, określenie „sekwencja częściowa” oznacza sekwencję, która korzystnie ma długość przynajmniej 18 nukleotydów, korzystniej przynajmniej 21 nukleotydów, zaś jeszcze bardziej korzystnie przynajmniej 24 nukleotydów. W licznych wykonaniach wynalazku, sekwencja częściowa albo analog sekwencji nukleotydowej według wynalazku, obejmuje co najmniej 27 nukleotydów, tak jak co najmniej 30 nukleotydów albo co najmniej 40 nukleotydów. Polipeptyd kodowany przez sekwencję częściową powinien spełniać przynajmniej jedno z powyższych kryteriów a)-g) i/lub częściowa sekwencja nukleotydowa powinna hybrydyzować z sekwencjąnukleotydowąobejmującąsekwencję o Identyfikatorze Sekw. Nr 23 w surowych warunkach.

Określenie „surowe: użyte w powiązaniu z warunkami hybrydyzacji określone są w stanie techniki jak 5- 10°C poniżej punktu topnienia Tm, patrz Sambrooki in., 1989, str. 11,45-11.49.

Określenie „analog” w odniesieniu do fragmentów DNA według wynalazku obejmuje sekwencję nukleotydowąkodującąpolipeptyd identyczny albo zasadniczo identyczny z polipeptydem kodowanym przez DNA opisany wyżej. Wiadomo powszechnie, że ten sam aminokwas może być kodowany przez różne kodony, zaś stosowane kodony zależą, przede wszystkim, od preferencji danego organizmu ekspresjonującego sekwencję nukleotydową. Tak więc, jeden lub wiele nukleotydów albo kodonów fragmentu DNA według wynalazku może być wymieniane na

181 042 inne, które po ekspresji, dająpolipeptyd identyczny albo zasadniczo identyczny z polipeptydem kodowanym przez pokazany wyżej fragment DNA.

Ponadto, określenie „analog” albo „sekwencja częściowa” dopuszczają odmiany sekwencji takie jak podstawienie, insercja (z intronami włącznie), addycje i rearanżacje jednego lub wielu nukleotydów, które nie wywierają zasadniczo żadnego niekorzystnego efektu na aktywność agonisty hIL-10 polipeptydu kodowanego przez fragment DNA albo jego sekwencję częściową. Wynalazek obejmuje również sekwencję nukleotydową kodującąpolipeptyd o częściowej sekwencji aminokwasowej o Identyfikatorze Sekw. Nr 1.

Polipeptydy według wynalazku mogą być wytwarzane z zastosowaniem technologii rekombinacji DNA. Istotne wykonanie wynalazku dotyczy układu ekspresyjnego obejmującego sekwencję nukleotydową według wynalazku. W zakresie wynalazku leży również układ ekspresyjny obejmujący sekwencję nukleotydową według wynalazku, taką jak zdolny do replikacji wektor ekspresyjny, niosący sekwencję nukleotydową określoną powyżej i zdolny do jej ekspresji.

Organizm zastosowany do wytwarzania polipeptydu według wynalazku może być organizmem wyższym, np. zwierzęciem albo organizmem niższym, np. mikroorganizmem takim jak Escherichia coli, drożdże, pierwotniak albo komórka uzyskana z organizmu wielokomórkowego takiego jak grzyb, komórka owada, komórka roślinna, komórka ssaka albo linia komórkowa niosąca układ ekspresyjny określony powyżej.

Niezależnie od rodzaju zastosowanego organizmu, fragment DNA według wynalazku wprowadzany jest do organizmu bezpośrednio albo przy użyciu odpowiedniego wektora. Ewentualnie, polipeptydy mogąbyć wytwarzane w linii komórek ssaka przez wprowadzenie fragmentu DNA albo jego analoga albo sekwencji częściowej według wynalazku, bezpośrednio albo przez zastosowanie odpowiedniego wektora ekspresyjnego. Polipeptydy według wynalazku mogąbyć również wytwarzane syntezą chemiczną jak to dyskutowano powyżej.

Wynalazek dotyczy ponadto wektora plazmidowego zawierającego sekwencję DNA kodującą polippetyd według wynalazku albo polipeptyd fuzyjny. W jednym szczególnie istotnym wykonaniu, fragment DNA albo jego analog albo sekwencja częściowa według wynalazku albo fuzyjny fragment DNA według wynalazku, może być niesiony przez zdolny do replikacji wektor ekspresyjny, który jest zdolny do replikacji w organizmie gospodarza albo linii komórkowej. Wektor może być w szczególności plazmidem, fagiem, kosmidem, minichromosomem albo wirusem. W ciekawym, wykonaniu wynalazku wektor może być wektorem, który po wprowadzeniu do komórki gospodarza ulega integracji z genomem gospodarza.

Polipeptyd wytworzony w wyżej opisany sposób może być poddawany modyfikacjom potranslacyjnym albo posyntetycznym, w wyniku oddziaływania termicznego, chemicznego (formaldehyd), glutaraldehyd itp.) albo enzymatycznego (peptydazy, proteinazy i enzymy modyfikujące białko). W porównaniu z naturalnym otoczeniem, w którym jest wytwarzany, polipeptyd może być obrabiany w inny sposób jeżeli jest wytwarzany w organizmie. Przykładowo, gdy polipeptyd ulega ekspresji w komórce organizmu wyższego takiego jak drożdże lub korzystnie ssak, często podlega glikozylacji. Glikozylację zwykle spotyka się w powiązaniu z resztkami aminokwasowymi Asn, Ser, Thr albo hydroksylizyny.

Jedno z wykonań wynalazku dotyczy więc sposobu wytwarzania polipeptydu określonego powyżej, obejmującego następujące etapy:

(a) wprowadzenie sekwencji nukleotydówej określonej powyżej do wektora ekspresyjnego, (b) transformowanie odpowiedniego organizmu wektorem wytworzonym w etapie (a), (c) hodowanie organizmu gospodarza wytworzonego w etapie (b) w warunkach odpowiednich do ekspresji polipeptydu, (d) zbieranie polipeptydu, i (e) ewentualne poddanie polipeptydu modyfikacji potranslacyjnej.

Uważa się, że wpływ antagonisty wobec hIL-10 albo vIL-10 może być uzyskany przede wszystkim przez zastosowanie przeciwciał swoiście wiążących nonapeptyd IT9302, oraz, że mogąbyć one zastosowane do leczenia neutralizującego wysokie stężenia IL-10.

181 042

W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy więc przeciwciała, które wiąże się swoiście z polipeptydem według wynalazku.

Określenie „przeciwciało” dotyczy substancji wytwarzanej przez ssaka albo, precyzyjnej, komórkę pochodzenia ssaczego należącą do układu odpornościowego w odpowiedzi na ekspozycję na antygen polipeptydowy według wynalazku. W niniejszym opisie i zastrzeżeniach „przeciwciało” jest określone jako składające się z dwóch łańcuchów ciężkich i dwóch łańcuchów lekkich. W szerszym aspekcie, jednakże, pojęcie przeciwciała powinno obejmować również np. dimery albo pentamery jednostki podstawowej.

Domena zmienna przeciwciała jest zbudowana z sekwencji zmiennych i stałych. Część zmienna domeny określana jest jako idiotyp przeciwciała. Ta część przeciwciała jest odpowiedzialna za oddziaływanie z antygenem, wiązanie antygenu. W niniejszym kontekście, przez określenie „przeciwciało” rozumie się całą cząsteczkę przeciwciała albo jego dowolne fragmenty. Przeciwciało może ulec fragmentacji podczas i/lub po wytworzeniu. Może być ono również wytwarzane w postaci fragmentowanej od początku, stosowane jako takie albo stosowane po połączeniu różnych fragmentów. Szczególnie interesującymi fragmentami sąfragmenty wiążące przeciwciała według wynalazku, np. fragmenty Fab albo Fab'.

Struktura idiotypowa (wiążąca antygen) przeciwciała jest antygenowa i może wywoływać powstanie swoistych przeciwciał skierowanych przeciwko strukturze idiotypowej. Przeciwciała powstałe wobec idiotypu są nazywane przeciwciałami antyidiotypowymi. Przeciwciała takie mogąnaśladować strukturę oryginalnego antygenu, a więc mogą działać jak oryginalny antygen. Przeciwciała takie mogą być zdolne do zastępowania oryginalnego antygenu w części lub we wszystkich funkcjach, zastosowaniach i właściwościach oryginalnego polipeptydu według wynalazku.

Przeciwciała według wynalazku obejmująprzeciwciała poliklonalne jak również przeciwciała monoklonalne. Przeciwciało albo jego fragmenty mogą być monoswoiste (poliklonalne) Przeciwciało monoswoiste może być wytworzone przez wstrzyknięcie odpowiedniemu zwierzęciu zasadniczo czystego preparatu polipeptydu według wynalazku. Następnie może być podana jedna lub wiele dawek przypominających w odpowiednich odstępach czasu przed pierwszym skrwawieniem. Zwierzęta sąskrwawiane 5-7 dni po każdej immunizacji. Przeciwciała mogąbyć ewentualnie oczyszczane z surowicy z zastosowaniem standardowych technik oczyszczania przeciwciał. Zwierzę zastosowane do wytwarzania przeciwciał wiążących polipeptyd według wynalazku jest korzystnie wybrane z grupy składającej się z królika, małpy, owcy, kozy, myszy, szczura, świni, konia i świnki morskiej. Komórkami wytwarzającymi przeciwciała mogąbyć splenocyty albo limfocyty krwi obwodowej.

Przeciwciało monoklonalne, lub jego fragmenty, może być wywołane w stosunku do istotnego składnika polipeptydu, tzn. epitopu. Przeciwciało mnonokłonalne może być wytworzone z zastosowaniem technik standardowych (Koehler i Milstein, 1975) z użyciem linii hybrydomy albo jej klonów lub podklonów, albo komórek niosących informację genetyczną z linii komórek hybrydomy wytwarzającej wspomniane przeciwciało monoklonalne. Przeciwciało mónoklonalne może być wytworzone przez poddanie fuzji komórek wytwarzających wspomniane przeciwciało z komórkami odpowiadającej linii komórkowej, i klonowanie powstałych komórek hybrydomy wytwarzającej przeciwciało monoklonalne.

Alternatywnie, przeciwciało monoklonalne może być wytworzone przez unieśmiertelnienie linii komórkowej nie poddanej fuzji i wytwarzającej przeciwciało monoklonalne. Przeciwciała monoklonalne są bezwarunkowo zbierane z pożywki hodowlanej. Komórki hybrydomy stosowane do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych mogąbyć hodowane in vitro albo w jamie ciała zwierzęcia. Przeciwciało monoklonalne albo jego fragmenty mogą być również wytwarzane z użyciem technik rekombinacji DNA (Huse i in., 1989).

Przeciwciała monoklonalne mogąbyć również wytwarzane przez immunizację odpowiedniego zwierzęcia nieoczyszczonym preparatem polipeptydu według wynalazku. Powstałe klony

181 042 hybrydomy wydzielające przeciwciała monoklonalne powinny być przesiane w kierunku ich zdolności do wiązania polipeptydu(ów) albo jego analoga.

Dla zastosowań nie wymagających wysokiej swoistości, przeciwciało może być poliklonalne. Przeciwciała poliklonalne mogąbyć uzyskane, no., jak to opisano w Harboe i Ingiid, patrz wyżej. Konkretnie, jeżeli mają być uzyskane przeciwciała poliklonalne, polipeptyd według wynalazku albo jego analog, jest wstrzykiwany zwierzęciu, korzystnie z dodatkiem odpowiedniego adiuwantu, takiego jak kompletny albo niekompletny adiuwant Freunda. Zwierzęta sąregulamie skrwawiane, przykładowo w odstępach tygodniowych, zaś uzyskana krew jest rozdzielana na frakcję surowicy zawierającej przeciwciało, i ewentualnie, wspomniana frakcja jest dalej poddawana standardowym technikom oczyszczania i/lub procedurom z zastosowaniem oczyszczonego polipeptydu albo jego analoga. Przeciwciało może być również przeciwciałem antyantyidiotypowym, skierowanym przeciwko przeciwciału antyidiotypowemu, które jest przeciwciałem skierowanym przeciwko miejscu przeciwciała odpowiedzialnemu za wiązanie się z epitopem na antygenie. Przeciwciało antyidiotypowe może być wytworzone sposobem podobnym do opisanego dla przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych.

W zakresie wynalazku leży przeciwciało, które wiąże się z substancją albo polipeptydem określonym wyżej, w szczególności przeciwciało, które wiąże się z polipeptydem o sekwencji aminokwasowej Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn. W szerokim aspekcie, wynalazek dotyczy więc substancji, która jest zdolna do neutralizacji jednej lub wielu aktywności hIL-10 od a) do j), tj. wykazuje aktywność antagonisty IL-10 tak jak przeciwciało posiadające te właściwości. Przeciwciało monoklonalne 19F1 (82), zdolne do swoistego wiązania IL-10 jest znane i potrafi blokować endogenną IL-10 wytwarzaną przez pobudzane LPS monocyty, patrz tablica 1 (82). Przeciwciało to rozpoznaj e pofałdowaną natywnie IL-10, ale nie koniecznie całą domenę funkcjonalną; jednakże, przeciwciało to nie wiąże swoiście IT9302. W zakresie niniejszego wynalazku leży również kompozycja farmaceutyczna zawierająca tą substancję jak również kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję albo polipeptyd według wynalazku.

Bardzo ważny aspekt niniejszego wynalazku dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej substancję wykazującą aktywność agonisty hIL-10 albo aktywność antagonisty hIL-10 jak to określono wyżej oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik. Kompozycja może obejmować np. oczyszczone zsyntetyzowane białko albo oczyszczone rekombinowane białko, przeciwciało monoklonalne albo poliklonalne albo jakąkolwiek inną substancję spełniającąkryteria a) -j) albo jeżeli wykazuje aktywność antagonisty hIL-10, być zdolna do neutralizacji jednej lub wielu aktywności hIL-10 od a) do j).

Agonista albo antagonista IL-10 zastosowany w tym wynalazku może być wytworzony jako lek w podłożu dopuszczalnym farmaceutyczne, przykładowo, w roztworze soli, roztworze soli zbuforowanym fosforanem (PBS), roztworze Ringera, glukozie/roztworze soli, roztworze Hank’a i glukozie. Kompozycje mogą zawierać farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze, jak wymagane do wytwarzania warunków fizjologicznych, takie jak środki buforujące, środki osmotyczne, środki zwilżające, detergenty itp. Dodatki mogą obejmować również dodatkowe składniki czynne, np. środki bakteriobójcze albo stabilizatory. Ilość podawana pacjentowi będzie różna w zależności od tego co będzie podawane, celu podawania, takiego jak profilaktyka albo leczenie, stanu gospodarza, sposobu podawania itp.

Kompozycje farmaceutyczne są zwykle przeznaczone do podawania przezskómego albo pozajelitowego, np. dożylnie podskórnie albo domięśniowo. Postaci do podawania doustnego są również bardzo pożądane i mogąbyć podawane przez zmianę kompozycji w celu uniknięcia środowiska panującego w żołądku. Kompozycja może być stosowana w celu profilaktyki i/lub leczenia. Korzystnie, kompozycje farmaceutyczne są podawane dożylnie. Tak więc, wynalazek dostarcza kompozycji zawierających substancję będącą agonistą albo antagonistą IL-10 rozpuszczoną albo zawieszonąw dopuszczalnym nośniku, korzystnie nośniku wodnym. Kompozycje te mogąbyć sterylizowane standardowymi technikami sterylizacyjnymi albo mogąbyć sterylnie filtrowane.

181 042

Powstałe roztwory wodne mogąbyć pakowane do zastosowania w tej postaci albo liofilizowane, a liofilizowany preparat jest łączony ze sterylnym wodnym nośnikiem przed podaniem. Agonista albo antagonista IL-10 może być również podawany z drugim biologicznie czynnym składnikiem, jak standardowy środek chemioterapeutyczny. Środki takie obejmują choć nie wyłącznie winkrystynę, daunorubicynę, L-asparaginazę, mitoksantron i amsakrynę.

W zastosowaniach leczniczych, kompozycje farmaceutyczne podawane są pacjentowi w ilości wystarczającej do wywołania pożądanego efektu, określonej jako „dawka skuteczna terapeutycznie”. Dawka skuteczna terapeutycznie agonisty albo antagonisty IL-10 może być różna, przykładowo zależnie od powodu zastosowanego leczenia, sposobu podania, stanu i zdrowia pacjenta oraz oceny lekarza przepisującego. Przykładowo, dawka do ciągłej infuzji będzie w zakresie od około 500 ng do około 800 pg dziennie dla pacjenta wiążącego 70 kg, korzystnie pomiędzy około 10 pg a około 300 pg. Typowa dawka wynosić będzie od 700 ng/kg/dzień do 16 pg/kg/dzień. Stężenie agonisty albo antagonisty IL-10 w kompozycjach farmaceutycznych może być różne, tj. od około 10 pg do około 5 mg/ml, korzystnie pomiędzy około 100 pg a około 2 mg/ml. Stężenie będzie zwykle wybierane przede wszystkim w zależności od objętości płynów, lepkości itp., zgodnie z konkretnym wybranym sposobem podawania. Tak więc, typowa kompozycja farmaceutyczna do infuzji dożylnej może zostać wykonana z 250 ml roztwory glukozy/soli i 2,5 mg agonisty albo antagonisty IL-10.

Dla postaci stałych, mogąbyć zastosowane standardowe, nietoksyczne nośniki stałe, obejmujące przykładowo, farmaceutycznie czysty mannitol, laktozę, skrobię, stearynian magnezu, sacharynian sodu, talk, celulozę, glukozę, sacharozę, węglan magnezu itp. Do podawania doustnego, dopuszczalna farmaceutycznie, nietoksyczna kompozycja wytwarzana jest przez dodanie zwykle stosowanych zarobek, takichjak wymienione wcześniej nośniki, i ogólnie 10-95% składnika czystego, tj. substancji agonisty albo antagonisty, korzystnie 25-75%.

Do podawania wziewnego, agonista albo antagonista IL-10 jest zwykle dostarczany w silnie rozdrobnionej postaci wraz z surfaktantem i rozpylaczem. Typowe stężenie agonisty albo antagonisty IL-1- wynosi 0,01-20% wagowo, korzystnie 1-10%. Surfaktant musi oczywiście być nietoksyczny i korzystnie rozpuszczalny w rozpylaczu. Przedstawicielami takich czynników są estry albo estry częściowe kwasów tłuszczowych, zawierających od 6 do 22 atomów węgla, takichjak kwas kapronowy, oktanowy, laurynowy, palmitynowy, stearynowy, linolowy, linolenowy, oleinostearynowy i oleinowy z odpowiednim alifatycznym alkoholem wielowęglowodorowym, albo jego cyklicznym bezwodnikiem takim jak bezwodnik glikolu etylenowego, gliceryny, erytritolu, arbitolu, mannitolu, sorbitolu, heksytolu pochodzące od sorbitolu, oraz polioksyetylenowe i polioksypropylenowe pochodne tych estrów. Mogąbyć zastosowane estry mieszane, takie jak mieszane albo naturalne glicerydy.

Surfaktant może stanowić 0,1-20% wagowych kompozycji, korzystnie 0,25-5%. Dopełnieniem kompozycji jest zwykle rozpylacz. Skroplone rozpylacze są zwykle w warunkach pokojowych gazami, kondensującymi pod ciśnieniem. Wśród odpowiednich skroplonych rozpylaczy są niższe alkany, zawierające do 5 atomów węgla, takie jak butan i propan; korzystnie fluorowane albo fluorochlorowane alkany. Mogąbyć również zastosowane mieszaniny powyższych. W produkcji aerozlu, zasobnik wyposażony w odpowiedni zawór napełniany jest odpowiednim rozpylaczem, zawierającym drobno rozproszony polipeptyd(y) i surfaktant. Składniki sąutrzymywane pod podwyższonym ciśnieniem, do momentu uwolnienia przez zawór.

W celu przedłużenia okresu półtrwania w surowicy, agonista albo antagonista IL-10 może być kapsułkowany, wprowadzany do wewnątrz liposomów, wytworzony jako koloid albo może być zastosowana inna standardowa technika zapewniająca wydłużenie czasu trwania polipeptydów. Tak więc w szczególnych wykonaniach, agonista albo antagonista IL-10 może być kapsułkowany w liposomach. Dostępnych jest wiele sposobów wytwarzania liposomów, opisanych np. q (83), (84), (85) i (86). Jedno ważne wykonanie wynalazku dotyczy więc zastosowania substancji do zmniejszania albo neutralizacji wysokich stężeń hIL-10 i/lub vIL-10, takichjak zastosowanie substancji wykazującej właściwości antagonistyczne względem hIL-10, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia albo profilaktyki raka jajnika i/lub AIDS (87, 19).

181 042

W zakresie niniejszego wynalazku jest również sposób leczenia i/lub zapobiegania raka jajnika i/lub AIDS, sposób obejmujący podawanie wymagającemu tego pacjentowi, ilości skutecznej terapeutycznie albo profilaktycznie substancji antagonisty IL-10 jak również zastosowanie związku wykazującego aktywność antagonisty hIL-10 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia albo zapobiegania raka jajnika i/lub AIDS.

Zastosowanie substancji według mniejszego wynalazku

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, stwierdzono, że IT9302 oraz jego analogi i odmiany są skuteczne w zapobieganiu efektom cytokin związanych patogenetycznie z uprzednio opisanymi stanami patologicznymi. Stąd, rozważa się możliwość leczenia przez zastosowanie polipeptydu według wynalazku albo jego analogów albo odmian i należy zbadać to we wszystkich chorobach gdzie oczekuje się wpływu leczniczego hIL-10 i/lub IRAP (patrz wyżej, tabela 3).

Bardzo istotne wykonanie wynalazku dotyczy zastosowania substancji albo polipeptydu według wynalazku do leczenia albo zapobiegania jednej lub wielu chorób wspomnianych w tabeli 3, zastosowania substancji albo polipeptydu według wynalazku do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia albo zapobiegania jednej lub wielu chorób wymienionych w tabeli 3, jak również leczenia i/lub zapobiegania jednej lub wielu chorób wymienionych w tabeli 3, przez podawanie pacjentowi wymagającemu tego, terapeutycznie albo profilaktycznie skutecznej ilości substancji albo polipeptydu według wynalazku.

Istotny aspekt niniejszego wynalazku stanowi więc zastosowanie IT9302 albo jego funkcjonalnej pochodnej do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zasadniczego hamowania u ludzi efektów biologicznych związanych z cytokiną, taką jak limfokina, interleukina, monokina, chemokina, interferon, czynnik pobudzający tworzenie kolonii, prostaglandyna i/lub leukotrien, do zapobiegania albo leczenia stanów związanych z zaburzeniami układu cytokin takich jak limfokina, interleukina, monokina, chemokina, interferon, czynnik pobudzający tworzenie kolonii, zaburzeniami w układzie prostaglandyn i/lub leukotrienów. W znaczeniu tu zastosowanym, określenie,,kompozycja farmaceutyczna” obejmuje kompozycje odpowiednie do zastosowania u ludzi, jak to opisano powyżej.

Wynalazek w szczególności dotyczy zastosowania ΙΤ9302 albo jego funkcjonalnej pochodnej

- do zasadniczego zahamowania efektu biologicznego u ludzi, związanego cytokiną do zapobiegania albo leczenia stanów związanych z zaburzeniami układu cytokiny; i/lub

- do zasadniczego zahamowania efektu biologicznego u ludzi, związanego z limfokinądo zapobiegania albo leczenia stanów związanych z zaburzeniami układu limfokiny; i/lub

- do zasadniczego zahamowania efektu biologicznego u ludzi, związanego z interleukiną do zapobiegania albo leczenia stanów związanych z zaburzeniami układu interleukiny; i/lub

- do zasadniczego zahamowania efektu biologicznego u ludzi, związanego z monokinądo zapobiegania albo leczenia stanów związanych z zaburzeniami układu monokiny; i/lub

- do zasadniczego zahamowania efektu biologicznego u ludzi, związanego z chemokinądo zapobiegania albo leczenia stanów związanych z zaburzeniami układu chemokiny; i/lub

- do zasadniczego zahamowania efektu biologicznego u ludzi, związanego z interferonem do zapobiegania albo leczenia stanów związanych z zaburzeniami układu interferonu; i/lub

- do zasadniczego zahamowania efektu biologicznego u ludzi, związanego z czynnikiem pobudzającym tworzenie kolonii do zapobiegania albo leczenia stanów związanych z zaburzeniami układu czynnika pobudzającego tworzenie kolonii; i/lub

- do zasadniczego zahamowania efektu biologicznego u ludzi, związanego z prostagłandyną do zapobiegania albo leczenia stanów związanych z zaburzeniami układu prostaglandyny; i/lub

- do zasadniczego zahamowania efektu biologicznego u ludzi, związanego z leukotrienem do zapobiegania albo leczenia stanów związanych z zaburzeniami układu leukotrienu.

181 042

OPIS FIGUR:

Figura 1 pokazuje porównanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych mIL-10, hIL-10 i BCRFL Identyczne sekwencje aminokwasowe zaznaczone są pionowymi liniami.

Figura 2 pokazuje C-końcowe sekwencje pilipeptydów IL-10 obejmujące 9 aminokwasów i porównuje białka świńskie, ludzkie, BCRFI i mysie.

Figura 3 jest schematem pokazującym, że IT9302 hamuje spontaniczne wytwarzanie IL-8 przez hodowane ludzkie monocyty.

Figura 4 jest schematem pokazującym, że IT9302 hamuje pobudzone IL-1 (1 ng/ml) wytwarzanie IL-8 przez ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej.

Figura 5 pokazuje wytwarzanie IRAP przez pobudzane IT9302 ludzkie monocyty.

Figura 6 pokazuje wytwarzanie IRAP przez pobudzane IL-10 ludzkie monocyty.

Figura 7 pokazuje aktywność chemotaktycznąIT9302 wobec limfocytów T CD8⁺.

Figura 8 pokazuje odczulenie limfocytów T CD8⁺ przez IT9302, powodujące niewrażliwość limfocytów T CD8⁺ na wywoływanie chemotaksji przez IL-10 (10 ng/ml).

Figura 9 pokazuje zahowanie aktywności IL-8 przez IT9302.

Figura 10 jest schematem pokazującym, że IT9302 hamuje chemotaksję wywołaną przez MCAF/MCP-1.

Figura 11 pokazuje wytwarzanie IL-4 przez limfocyty T CD4⁺ we frakcji cytozolowej w badaniu metodą ECL - western blotting.

Figura 12 pokazuje wytwarzanie TNF-αprzez limfocyty T CD4⁺ we frakcji cytozolowej w badaniu metodą ECL - western blotting. Badanie metodą western blotting na TŃF-α przeprowadzono podobnie jak na IL-4 w materiałach i metodach, ale stosując królicze przeciwciało ludzkiemu TNF-α (Pepro Tech. Inc., Londyn, Anglia) oraz wtórne przeciwciało peroksydazą chrzanową (nr kat. P 217, Dako, Dania).

Figura 13 pokazuje, że wstrząs i lekopenia wywołane LPS są modulowane przez IT9302, co wykazano liczeniem całkowitej liczby leukocytów.

PRZYKŁADY

Materiały i Metody

Cytokiny i substancje chemotaktyczne

Rekombinowaną IL-10 uzyskano z Pepro Tech Inc., NJ. (nr kat. 20010). Rekombinowana hIL-Ιβ i rekombinowana hIL-8 były darem od Dainippon Pharmaceutical Company, Osaka, Japonia. Pożywką hodowlaną była RPMI 1640 Gibco, wolna od LPS co badano testem Limulus Amoebocyte Lysate (Sigma zestaw Ε-ΤΟΧΑΤΕ nr kat. 210-A1). rhMCAF/MCP-1 był darem od profesora Kouji Matsushima, Kanazawa, Japonia.

Test chemotaksji leukocytów

Chemotaksja limfocytów T

Podtypy limfocytów T CD4⁺ i CD8⁺ scharakteryzowane na podstawie ekspresji antygenów CD4 albo CD8 oczyszczono z krwi heparynizowanej normalnych dawców. Tak więc, jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) oczyszczono z heparynizowanej krwi prze rozcieńczenie 100 ml krwi buforowanym roztworem soli Hank’a (HBSS) Lii oddzielnie warstwy komórek na Lymphopac™ (Nycomed Pharma, Oslo, Norwegia) po wirowaniu na gradiencie przy 2000 obr/min., przez 20 minut. Komórki jednojądrzaste płukano trzykrotnie w 4 ml HBSS zawierającego 1 % surowicę płodowącielęcąi sortowano w4°C stosując Dynabeads opłaszczone przeciwciałem przeciwko antygenom CD4 i CD8 (Dynabeads M-450 CD4 nr kat. 111.16, Dynabeads M-450 CD8 nr kat. 111.08, DETACHaBEAD nr kat. 125.04). Stosunek perełek do komórek wynosił 10:1, zaś okres inkubacji wynosił 1 godzinę. Perełki odłączono przez dodanie poliklonalnego przeciwciała przeciw-mysiego, według instrukcji producenta. Test chemotakcsji wykonano technikąmikrokomór 48-studzienkowych (Neuroprobe, Rockville, MD) jak to opisano wcześniej (74, patrz odn. 3 i 4). Substancje chemotaktyczne rozcieńczono RPMI 1640 (GIBCO nr kat. 61870-010) z 1% sterylnie filtrowaną płodową surowicą cielęcą i umieszczono w dolnej komorze 25 μΐ. W przypadku oznaczania chemotaksji limfocytów T, limfocyty T (5xl0⁶/ml) za

181 042 wieszano w pożywce i 50 μΐ umieszczano w górnej komorze oddzielonej od dolnej komory wolnym od poliwinylopirolidonu filtrem poliwęglanowym o średnicy porów 5pm Nucleopore Corp. Pleasanton, CA) opłaszczonym kolagenem typu IV (Sigma nr kat. C 0543). Komórkom pozwolono migrować przez 2 godziny w 37°C i 55 CO₂. Następnie filtry delikatnie usuwano, utrwalano w 70% metanolu i barwiono przez 5 minut w barwniku Coomassie’s Brillant Blue. Komórki przytwierdzone do dolnej powierzchni filtra liczono przez pomiar ich powierzchni stosując kamerę wideo na mikroskopie połączonąz układem komputerowym do analizy cyfrowej, wyposażonym w oprogramowanie do obiektywnego określania migracji w odpowiedzi na czynnik chemotaktyczny. Około 5% limfocytów T migrowało spontanicznie co odpowiadało od 12000 do 13000 komórek, było to zmienne z dnia na dzień, ale różniło się nieznacznie w doświadczeniach tego samego dnia. Jak to opisano wcześniej (odn. 3 i 4), postanowiono opisać wyniki jako stosunek pomiędzy liczbąkomórek migrujących w próbce i kontroląnegatywną, pokazującą migrację samoistną. Stosunek ten określano jako wskaźnik chemotaktyczny (CI). Wszystkie próbki analizowano w trzykrotnym powtórzeniu, zaś migrację komórek w każdej ze studzienek mierzono w trzech polach i oznaczano wartość mediany pola powierzchni. W niektórych doświadczeniach membrany nie były opłaszczane kolagenem, stąd w niniejszym układzie testowym migrujące komórki spadały na dno komory chemotaktycznej.

W jednym doświadczeniu, badanie aktywności chemotaktycznej IT9302 wobec limfocytów T CD8⁺ badano w kolejnych rozcieńczeniach IT9302 dodawanego do komory dolnej i badano chemotaksję jak to opisano wyżej.

W drugim doświadczeniu, zdolność IT9302 do odczulania migracji limfocytów T CD8⁺w odpowiedzi na rhIL-10 (10 ng/ml) badano przez dodanie IT9302 do komórek docelowych na 30 minut przed chemotaksją. IT9302 dodawano w kolejnych stężeniach, zaś odpowiedź chemotaktycznąna rhIL-1- badano jak to opisano wyżej.

W trzecim doświadczeniu, zdolność IT9302 do zahamowania odpowiedzi chemotaktycznej limfocytów T CD4⁺ na rhIL-8 (10 ng/ml) badano przez dodanie IT9302 do komórek docelowych na 30 minut przed wykonaniem chemotaksji. IT9302 dodawano w kolejnych stężeniach, zaś odpowiedź chemotaktyczną na rhIL-8 badano jak to opisano wyżej.

Chemotaksje monocytów

Chemotaksję monocytówbadano stosując takąsamąkomorę Boydenajak to opisano dla limfocytów T powyżej. Chemoatraktant MCAF/MCP-1 rozcieńczono w RPMI1640 z dodatkiem 0,5% BSA i dodawano fdo komory dolnej w stężeniu 10 ng/ml. Monocyty, oczysczone standardową techniką przylegania do plastiku, z normalnych ludzkich PBM, uzyskanych jak to opisano wyżej, zawieszono w pożywce RPMI 1640 z dodatkiem 0,5% BSA i inkubowano przez 30 minut w obecności IT9302 w różnych stężeniach. Następnie, komórki dodawano do górnej komory chemotaktycznej w gęstości 10⁶ komórek/ml. Komory górna i dolna były oddzielone wolnym od poliwinylopirolidonu filtrem poliwęglanowym o średnicy porów 8 pm (Nucleopore, Pleasanton, CA). Komorę inkubowano w 37°C przez 90 minut. Membrany zawierające migrujące komórki traktowano jak to opisano wyżej, zaś wskaźnik chemotaktyczny obliczano techniką opisaną wyżej.

Wytwarzanie IL-8 przez normalne ludzkie komórki jednojądrzaste (PBMC)

PBMC oczyszczono z krwi heparynizowanej normalnych dawców. Po wirowaniu na gradiencie z Lymphoprep™ (Nycomed Pharma, Oslo, Norwegia), komórki jednojądrzaste rozcieńczono do 2x10⁶ komórek/ml w wolnej od LPS pożywce RPMI 1640 (GIBCOnrkat. 6187-010) zawierającej 1% filtrowanej na sterylnie inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy cielęcej i penicyliny (10000 ΙΕ/ml), streptomycyny (10 mg/ml) i gentamycyny (2,5 mg/ml). Komórki hodowano w 24-studzienkowych płytkach Nunc Micro plates (Nunc, Dania) i w obecności różnych stężeń IT9302 (0,1 pg, 100 ng, 10 ng, 1 ng, 0,1 ng, 0,01 ng/ml) przez 24 godziny. Po 24-godzinnej inkubacji jeszcze raz dodano dawkę IT9302, zaś po 1 godzinie do hodowli dodano rhIL-Ιβ (1 ng/ml). Nadsącza zbierano po 48 godzinach inkubacji, zaś stężenie wydzielonej IL-8 mierzono testem ELISA dla IL-8, stosując zestaw firmy Dainippon Pharmaceutical Co, Ltd, Osaka, Japonia. Pokrótce, standardy i nadsącza komórkowe inkubowano przez godzinę w powtórzeniach w 20°C na wytrząsarce do płytek. Po przepłukaniu, dodawano na godzinę przeciwciało wtórne,

181 042 po czym inkubowano przez godzinę z kozim przeciwciałem przeciwko króliczym IgG znakowanym peroksydazą. Po płukaniu, reakcję wywoływano O-fenylenodiaminą. Trzydzieści minut później reakcję zatrzymywano 1,6 N kwasem siarkowym. Gęstość optyczną (OD) mierzono w czytniku ELIS A przy długości fali 490 nm. Stężenie IL-8 obliczano w oparciu o krzywą kalibracji przez absorbancję badaną w stosunku do stężeń standardów IL-8.

Oznaczenie stężenia IRAP

PBMC oczyszczono w wyżej opisany sposób. PBMC hodowano w RPMI 1640, 10% inakty wowaną ciepłem surowicę płodową cielęcą (z dodatkiem penicyliny 10000 ΙΕ/ml, streptomycyny 10 mg/ml, gentamyzyny 2,5 mg/ml), oraz gęstości komórkowej równej 5x10⁶ komórek/ml. Monocyty oczyszczano standardową techniką przylegania do plastiku. Monocyty hodowano w RPMI 1640 z 2% FCS (2,5xl0⁶ komórek/ml) z różnymi rozcieńczeniami rhIL-10 albo IT9302. Komórki pobudzano przez 24 godziny, zaś nadsącza pobierano do oznaczenia IRAP. ELISA na IRAP przeprowadzono przez zastosowanie zestawu Humań ILlra Quantikin Immunoassay Kit firmy R&D Systems Europę Ltd. (nr kat. DRA 00, Abingdon, Oxon, UK).

Oznaczanie ekspresji antygenu MHC klasy lina monocytach

PBMC oczyszczono jak to opisano wyżej, zaś monocyty oczyszczone techniką przylegania do plastiku. Monocyty hodowano w RPMI 1640 z 2% FCS z dodatkiem penicyliny 10000 ΙΕ/ml, streptomycyny 10 mg/ml, gentamycyny 2,5 mg/ml oraz w gęstości komórkowej równej 3x10⁶ komórek/ml. Komórki pobudzano przez 40 godzin w mikrostudzienkach (Nunc, Dania) przy użyciu 100ng/mlrhIL-10alboIT9302 1 pg/ml, 100 ng/ml albo lOng/ml. Pod koniec stymulacji nadsącza usunięto, zaś komórki odklejono od plastiku przez zamrożenie w -20°C przez 20 minut. Komórki zebrano w 1 ml zimnego HBSS z 1 % FCS i sortowano w 20°C przez zastosowanie 50 μΐ/ml Dynabeads M 450 opłaszczonych przeciwciałem monoklonalnym przeciwko łańcuchowi β HLA klasy Π (nr kat. 210.03). Po 20 minutach inkubacji komórki przepłukano trzykrotnie zimnym HBSS z 1% FCS i zebrano na magnetycznym przyrządzie rozdzielczym. Komórki rozcieńczono w powyższym buforze i zabarwiono błękitem i metylenowym, po czym liczono komórki tworzące rozetki (komórki pokryte perełkami Dynabeads z przeciwciałem przeciwko HLA klasy II).

Oznaczenie wytwarzania IL-4 przez limfocyty CD4⁺

Hodowle komórkowe

Limfocyty CD4⁴ oczyszczono z normalnej ludzkiej krwi. Po wirowaniu na gradiencie Lymphoprep™ (Nycomed Pharma, Oslo, Norwegia), komórki jednojądrzaste sortowano dalej w 4°C stosując Dnabeads (Dynal As, Norwegia) opłaszczone przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD4. Perełki odczepiono przez dodanie poliklomalnego przeciwciała przeciw-mysiego (Dynal AS, Norwegia). Czystość selekcjonowanych pozytywnie komórek była wyższa niż 99% co oceniono analiząna urządzeniu FACS. Przy badaniu wytwarzania de novo IL-4 przez pobudzone IL-8 limfocyty T, stosowano hodowle limfocytów T, 5x10⁶ komórek/ml w wolnej od LPS pożywce RPMI 1640 (Gibco nr kat. 61870-010) zawierającej 1% filtrowanej sterylnie inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy cielęcej (FCS), penicyliny (10000 lU/ml), streptomycyny (10 mg/ml) i gentamycyny (2,5 mg/ml). Limfocyty T pobudzano przez 3 dni stosując rIL-8 (100 ng/ml), rIL-10 (100 ng/ml), IT9302 (10 ng/ml) iIFN-γ (10 ng/ml). Rekombinowana ludzka IL-8 (rhIL-8) była darem od Dainippon Pharmaceuticals Co. Ltd., Osaka, Japonia), zaś IFN-γ pochodził z Boehringer Ingelheim Am Rhein, Niemcy. W celu uzyskania swoistego zahamowania pobudzenia IL-8, zastosowano neutralizujące przeciwciało monoklonalne przeciwko IL-8 (WS.4) (dar od dr K. Matsushima, Japonia). Rekombinowaną IL-10 zakupiono w Pepro Tech. Inc. (Londyn, Anglia).

Wytwarzanie materiału komórkowego i nadsączy z hodowli do elektroforezy na żelu

Hodowane limfocyty T i pożywki hodowlane oddzielono przez wirowanie przy 2000 obr/min. przez 5 minut. Nadsącza liofilizowano, a następnie rozpuszczono w 100 pl buforu do lizy. Komórki zawieszono bezpośrednio w 100 pl buforu do lizy żelu (9). Materiał przechowywano w -80°C do dalszych badań.

181 042

Badanie białek uzyskanych z limfocytów T CD4⁺ metodą ECL-western blotting

Komórki i albo liofilizowane nadsącza hodowli komórek zastosowano do oznaczania zawartości białka IL-4. Białka z jednowymiarowego 15% żelu SDS-PAGE przeniesiono na membrany nitrocelulozowe Hybond-ECL (Amersham RPN 2020D, UK) i zablokowano 5% albuminą surowicy bydlęcej (Sigma) w roztworze soli buforowanym Tris pH 7,8, zawierającym 0,1% Tween-20. Następnie membrany inkubowano z poliklonalnym kozim przeciwciałem przeciwko ludzkiej IL-4 (R&D Systems, UK), a następnie z wtórnym przeciwciałem znakowanym peroksydazą chrzanową (nr kat. RPN 2106 ECL, Amersham, UK), zaś znakowanie immunologiczne wykrywano prze ekspozycję filmu (Kodak X-OMAT-S, USA) przez 90 sekund.

Swoistość sekwencji aminokwasowej IT9302

Poszukiwanie prawdopodobnej hodowli sekwencji IT9302 z innymi znanymi białkami przeprowadzono przez przeszukiwanie bazy danych białek EMBO, w czym pomagał dr Henrik Leffers, Institute for Medical Biochemistry, Uniwersytet w Aarhus, Dania.

Swoistość sekwencji aminokwasowej IT9302

Według informacji z bazy danych białek EMBO (Heidelberg) wykonanych 10 czerwca 1994, IT9302 wykazywał 100% homologię z sekwencją ludzkiej IL-10 i 75% homologię z sekwencjąbiałka uzyskanego z wirusa Epsteina-Barr, identycznym z vIL-10. Inne białka wirusowe takie jak faga T7 i wirusa zwijania liści pomidora wykazywały, odpowiednio, 75% i 85% identyczności.

Wyniki

Pomysł wynalazku realizowano w październiku i listopadzie 1992, kiedy to nonapeptyd oznaczony IT9302 zastał zaprojektowany według wyżej opisanej strategii, zaś synteza chemiczna prototypu (IT9302) została zarządzona i zlecona 27 listopada 1992. Oczekiwano, że ten nonapeptyd powinien wywierać aktywność immunomodulacyjną, która częściowo powinna naśladować aktywność podobną do IL-10, w tym okresie również zostały zaplanowane kolejne doświadczenia kontrolne (przykłady). Syntezę chemiczną IT9302 przeprowadzono na urządzeniu do automatycznej syntezy przez firmę CarłbiotechLtd. A/S, Dania, jako zlecenie płatne. Po oczyszczeniu białka przez HPLC jego czystość przekraczała 95% co zbadano HPLC. Potwierdzało to, że zsyntetyzowany produkt był identyczny z IT9302 zaprojektowanych przez wynalazców z październiku i listopadzie 1992.

Przykład 1. Zahamowanie spontanicznego wytwarzania IL-8 przez ludzkie monocyty, wywołane IT9302

Badanie wykonano w sposób opisany w części „wytwarzanie IL-8 przez normalne ludzkie komórki jednojądrzaste (PBMC)”. Monocyty oczyszczono techniką przylegania do plastiku i 3.0xl0⁶ komórek/ml pobudzano przez 40 godzin. Jak pokazano na fig. 3, IT9302 hamował wytwarzanie IL-8 przez monocyty, zaś przy stężeniu IT9302 0,1 ng/mł wytwarzanie IL-8 było zahamowane do 35% spontanicznego wytwarzania in vitro. Żywotność komórek zawsze przekraczała 80% po 1 -dniowej hodowli, zaś dodatek IT9302 nie wpływał na żywotność w tym ani w dalszych przykładach w żadnym ze stężeń pomiędzy 0,1 i 1000 ng/ml (ciężar cząsteczkowy IT9302:1127 Da, przewidywany ciężar cząsteczkowy rhIL-10: 18400 Da).

Przykład 2. Zahamowanie wywołanego IL-1$ wytwarzania IL-8 przez ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC), wywołane IT9302

Doświadczenie wykonano jak to opisano w „Wytwarzanie IL-8 przez normalne ludzkie komórki jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC)”. Jak pokazano na fig. 4. IT9302 w sposób zależny od dawki, hamował wywołanie, IL-Ιβ wytwarzanie IL-8 przez ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej in vitro.. Zahamowanie wytwarzania IL-8 osiągało plateau w stężeniu IT9302 pomiędzy 0,01 i 100 ng/ml.

Przykład 3. Wywołane IT9320 wytwarzanie białka antagonisty receptora interleukiny-1 (IRAP) przez łudzkie monocyty

Badanie wykonano jak to opisano w „Oznaczanie stężenia IRAP”. Jak pokazano na fig. 5, IT9302 w sposób zależny od dawki indukował wytwarzanie IRAP przez ludzkie monocyty. Wytwarzanie drastycznie zwiększało się w stężeniu IT9302 powyżej 10 ng/ml. Fig. 6 pokazuje indu

181 042 keję IRAP przez rhIL-10, ponieważ zaś hIL-10 jest około 20-krotnie większa niż IT9302, 10 ng/ml IT9302 równa się molamie 200 ng/ml IL-10. Stąd siły IT9302 i rhIL-10 sąporównywaIne i prawie równe w odniesieniu do indukcji IRAP w niskich stężeniach. Przy stężeniu IT9302 przekraczającym 10 ng/ml, indukcja IRAP gwałtownie zwiększała się i osiągała poziom rzędu 700 ng/ml.

Przykład 4. Wpływ chemotaktyczny IT9302 na ludzkie limfocyty T CD8⁺

Doświadczenie przeprowadzono jak to opisano w „Test chemotakcji leukocytów”. Jak pokazano na fig. 7, IT9302 wywoływał migrację chemotaktycznąludzkich limfocytów T CD8⁺in vitro, podczas gdy nie wywierał wpływu na limfocyty T CD4⁺ (dane nie pokazane). Ponownie, siła IT9302 pokazana w tym doświadczeniu jest porównywalna z rhIL-10 pokazana poprzednio (odn. 14).

Przykład 5. IT9302 odczula ludzkie limfocyty T CD8⁺ powodując niemożność reakcji wobec IL-10

Doświadczenie przeprowadzono jak to opisano w „Test chemotaksji leukocytów”. IT9302 dodawano do zawiesiny limfocytów T CD8⁺, 30 minut przed badaniem tych komórek na odpowiedź chemotaktycznąna rhIL-10. Jak pokazano na fig. 8, preinkubacja komórek z IT9302 powodowała osłabioną reaktywność limfocytów T CD8⁺ na hrlL-10. Wskazuje to, że IT9302 może zakłócić wiązanie rhIL-10 z receptorem IL-10.

Przykład 6. IT9302 hamuje odpowiedź chemotaktyczną limfocytów T CD4⁺ na IL-8 Doświadczenie przeprowadzono jak to opisano w „Test chemotaksji leukocytów”. Jak pokazano na fig. 9, IT9302 w sposób zależny od dawki, dodany do zawiesiny ludzkich limfocytów T CD4⁺, hamował odpowiedź limfocytów T CD4⁺ na IL-8.

Przykład 7. IT9302 hamuje odpowiedź chemotaktyczną ludzkich monocytów na MCAF/MCP-1

Doświadczenie przeprowadzono jak to opisano w „chemotaksja monocytów”. Jak pokazano na fig. 10, IT9302 w sposób zależny od dawki, dodany do zawiesiny ludzkich monocytów hamował odpowiedź monocytów na MCAF/MCP-1.

Przykład8. IT9302 nie hamuje ekspresji cząsteczki MHC klasy lina ludzkich monocytach Doświadczenie przeprowadzono jak to opisano w Materiałach i Metodach i wykazano, że rhIL-10 hamuje ekspresję MHC klasy II, zaś IT9302 nie, jak pokazano niżej na tabeli 4.

Tabela 4

Bodziec	Liczba monocytów tworzących rozetki
0	12,0 ± 1,0 x 10⁴
100 ng/ml rhIL-10	4,6 ± 1,4 x 10⁴
1 pg/ml IT9302	ll,0±3,0x 10⁴
100 ng/ml IT9302	14,4 ± 2,4 x 10⁴
10 ng/ml 1T9302	ll,2±3,2x 10⁴

Dyskusja doświadczeń pokrewnych

Niniejsze dane pokazują zależny od dawki wpływ hamujący syntetycznego nonapeptydu IT9302 na procesy, które odzwierciedlają aktywność zapalną włącznie z wytwarzaniem IL-8 i migracjąmonocytów i/lub limfocytów T. Tak więc, IT9302 był zdolny do hamowania spontanicznego wytwarzania IL-8 przez ludzkie monocyty hodowane przez noc. Może to być wytłumaczone bezpośrednim wpływem hamującym na wytwarzanie mRNA dla IL-8 i/lub następujące potem wytwarzanie białka i/lub wydzielanie. Inny mechanizm może być tłumaczony faktem, że monocyty hodowane in vitro ekspresjonująi wytwarzająIL-1, co z kolei wywołuje wytwarzanie IL-8. Jest to potwierdzane przez wykazany fakt, że IT9302 silnie wywołuje wytwarzanie IRAP przez monocyty. IT9302 może więc również hamować spontaniczne wytwarzanie IL-8 przez

181 042 zakłócanie aktywności IL-1. Obserwowana indukcja IRAP przez IT9302 wydaje się wywoływać biologicznie czynny IRAP, ponieważ IT9302 dodany do hodowli przeciwciała wywołanemu przez IL-1 wytwarzaniu IL-8, ale tylko gdy dodany jest przynajmniej 16 godzin przed dodaniem IL-1 do hodowli. Może to oznaczać, że IT9302 hamuje wywołane IL-1 wytwarzanie IL-8 przez wywołanie wytwarzania IRAP, co z kolei blokuje aktywność IL-1 przez jej receptor. Jeżeli IT9302 hamuje bezpośrednio wytwarzanie IL-8, należałoby oczekiwać, że dodanie IT9302 do hodowli na godzinę przed dodaniem IL-1 powinno zahamować wytwarzanie IL-8, co nie miało miejsca (dane nie pokazane). Stąd, obserwowane zahamowanie wytwarzania IL-8 przez IT9302 wydaje się być raczej spowodowane indukcją wytwarzania IRAP niż bezpośrednim hamowaniem wytwarzania IL-8. Te działanie IT9302 można również stwierdzić w przypadku IL-10, co wskazuje, że IT9302 posiada właściwości przypominające IL-10. IT9302 naśladuje również aktywność IL-10 jeżeli chodzi o zahamowanie zdolności limfocytów T CD4⁺ do migracji w odpowiedzi na IL-8. Ponieważ IL-8 jest skojarzona z wieloma stanami zapalnymi oraz limfocyty T CD4⁺ pojawiająsię wcześnie w nacieku zapalnym wywołanym zjawiskami odpornościowymi, w których uczestniczą limfocyty T, takimi jak alergia skorym ta właściwość może dostarczyć znacznej wartości terapeutycznej służącej kontrolowaniu zapalenia wywołanego odpornością komórkową.

Wykazana aktywność chemotaktyczną IT9302 wobec limfocytów T CD8⁺jest również podobna do IL-10, zaś IT9302 może więc aktywować populacje limfocytów T o aktywności supresyjnej, wpływającej na zakończenie zapalenia wywołanego odpornością komórkową. Tak więc, IT9302 według pokazanych wyżej przykładów, posiada wartość terapeutyczną w chorobach, w których IL-10 i/łub IRAP może mieć również wartość leczniczą. Dodatkowo, IT9302 może mieć wartość terapeutyczną w chorobach gdzie, jak się uważa, IL-8 i/lub MCAF/MCP-1 i/lub IL-1 może odgrywać rolę patogenną.

Przykład 9. IT9302 i IL-10 wywołują wytwarzanie IL-4 przez limfocyty T CD4⁺Podstawa

Podobnie jak IL-10, IL-4 jest produktem limfocytów T CD4⁺ typu T_H2. Obserwowano, że rekombinowana ludzka IL-10 wywołuje wytwarzanie IL-4 przez hodowane ludzkie limfocyty T CD4⁺. Oznacza to, że IL-10 oprócz swych funkcji immunosupresyjnych wywołuje również wytwarzanie innej cytokiny immunosupresyjnej, IL-4. Zbadano więc, czy IT9302 wywołuje również wytwarzanie IL-4 przez limfocyty T CD4⁺. Tak więc, limfocyty T CD4⁺ oczyszczone jak to opisano w „Metody badania chemotaksji limfocytów T” i hodowane jak to opisano w części „Oznaczanie wytwarzania IL-4 prze limfocyty T CD4⁺”, pobudzano prze 3 dni IT9302 (10 ng/ml) albo IL-10 (100 ng/ml). Pobierano frakcje cytozolowe badano na zawartość IL-4 stosując badanie western blotting (fig. 11) oraz kozie przeciwciało poliklonalne przeciwko ludzkiej IL-4. Jak pokazano na fig. 11, obserwowano, że IL-10 jak również IT9302 wywołuje wytwarzanie IL-4 przez hodowane normalne limfocyty T CD4⁺.

Przykład 10. IT9302 hamuje wytwarzanie TNF-apodczas reakcji mieszanych leukocytów (MLR)

Wykazano, że reakcja mieszanych leukocytów jest częściowo zależna od wytwarzania TNF-apodczas reakcji. Wykazano, że IT9302 nie zmniejsza istotnie MLR, ale odkryto, że znacznie zmniejsza wytwarzanie TNF-apodczas MLR. Tak więc, wykonano MLR przez oczyszczenie ludzkich leukocytów i hodowanie 1 miliona komórek/ml od dawców allogenicznych przez 4 dni. Przed założeniem hodowli, jedną grupę komórek napromieniowano przez 2 minuty promieniowaniem β. Białka frakcji cytozolowej oczyszczono jak to opisano w części „Oznaczanie wytwarzania IL-4 przez limfocyty T CD4⁺” i wykonano badanie western blotting stosując królicze przeciwciała przeciwko ludzkiemu TNF-α. Jak pokazano na fig. 12, znaczące zmniejszenie wytwarzania TNF-α obserwowano podczas reakcji mieszanych ludzkich leukocytów.

Przykład 11. Modulacja wstrząsu i leukopenii wywołanych LPS u świń przez zastosowanie IT9302

Ponieważ stwierdzono, że 1T9302 moduluje wytwarzanie cytokin, z TNF-α i IL-8 włącznie, oraz znano opublikowaną sekwencję świńskiej IL-10 (Blancho i in., 1995) (patrz, fig. 2, ho

181 042 mologia peptydu C-końcowego), zbadano czy IT9302 może modulować przebieg leukopenii wywołanej LPS u świń (fig. 13).

We wstępnych doświadczeniach, zbadano jak wstrzyknięcie dożylne IT9302 0,1 mg/kg moduluje wpływ dożylnego wstrzyknięcia 2 pg/kg LPS świniom (N=3). IT9302 wstrzyknięto 30 minut przed wstrzyknięciem LPS, po czym pobrano próbki krwi jak to opisano na fig. 13. Oznaczono całkowitą liczbę leukocytów, jak również policzono rozmaz leukocytów i na podstawie tych obliczeń określono całkowitą liczbę neutrofilów. Jak pokazano, obserwowano, że wstrzyknięcie LPS powoduje przejściowąleukopenię. Jednakże, wstrzyknięcie IT9302 zapobiegało leukopenii jak to pokazano na figurze.

Przykład 12. Przeciwciało przeciwko syntetycznemu połipeptydowi IT9302

Syntetyczny polipeptyd IT9302 nabyto od Kem-En-Tec A/S, Kopenhaga, Dania, o czystości powyżej 95% Polipeptyd ten był podany przez producenta koniugacji z hemocyjaniną skorupiaka zwanego Keyhole limpet (KLH). Rozpuszczalny IT9302/KLH jest bardziej immunogenny niż sam polipeptyd, może być więc zastosowany jako białko kontrolne do badań ELISA i western blotting.

Immunizacja królików

250 pg IT9302 sprzęgniętego z KLH, w postaci emulsji w kompletnym adiuwancie Freunda, zastosowano do wstrzyknięć śródskómych albo podskórnych. Wstrzyknięcia powtarzano czterokrotnie w odstępach dwutygodniowych, zaś króliki skrwawiano 8 i 12 dni później. Ostatnie wstrzyknięcia przypominające 250 pg IT9302/KLH w niekompletnym adiuwancie Freunda podano z jednomiesięcznymi odstępami stosując wstrzyknięcia podskórne. Tworzenie przeciwciał IT9302 badano w teście immunologicznym typu dot-blot albo western blotting.

181 042

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: Nycomed DAK A/S (B) ULICA: P.O. Box 1911, Lergraversvej 59 (C) MIASTO: Kopenhaga (E) KRAJ: Dania (F) KOD POCZTOWY: 2300 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Immunomodulatory (iii) LICZBA SEKWENCJI:

(iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: Kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC DOS/MS DOS (D) OPROGRAMOWANIE: PatentIn rei. #1.0, wersja

1.30 (EPO)(2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 1:

Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie

181 042 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 2: Ala Tyr Met Thr Ile Lys Met Arg Asn (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 3: Ala Phe Met Thr Leu Lys Leu Arg Asn (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 4: Ala Tyr Met Thr Met Lys VaL Arg Glu (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 5: Gly Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asp (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

181 042 (A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Ala Phe Met Thr Met Lys Ile Arg Asp (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 7:

(i) CHARAKTERYSTYKĄ SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Ala Tyr Ile Thr Met Lys Ile Arg Asp (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Ala Tyr Leu Thr Met Lys Ile Arg Asp

Nr 6 :

Nr 7:

Nr 8:

(2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa

181 042 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 9:

Ala Tyr Val Thr Met Lys Ile Arg Asp (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 10:

Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ile Arg Asp (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(Ą) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 11:

Ala Tyr Met Thr Leu Lys Ile Arg Asp (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 12:

Ala Tyr Met Thr Val Lys Ile Arg Asp

181 042 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 13: Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asp (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 14: Ala Tyr Met Thr Met Lys Met Arg Asp (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 15:

(i) CHARĄKTER.YSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 15: Ala Tyr Met Thr Met Lys Val Arg Asp (2) INFORMACJĄ DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(Ą) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas

181 042 (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 16: Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Gin (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 17: Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Glu (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 18: Ser Pro Giy Gin Gly Thr Gin Ser Glu (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 6 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie

181 042 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 19: Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 20: Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 21: Xaa Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 22: Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

	181 042 ³⁹
(A)	DŁUGOŚĆ: 27 par zasad
(B)	RODZAJ: kwas nukleinowy
(C)	NICIOWOŚĆ:
(D)	TOPOLOGIA: liniowa

(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: nie (ix) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 23: GCCTACATGA CAATGAAGAT ACGAAAC

181 042

LITERATURA

1. Bendtzen K. Lymphokines in inflammation. Inflammation Basic Mechanisms Tissue Injuring Principles and Clinical Models (P Venge & A Lindbom eds) 1985; Almqvist & Wiksell International. Stockholm: 187-217.

2. Bendtzen K. Interleukin-1, Interleukin-6, and tumor necrosis factor in infection, inflammation and immunity. Immunol Lett 1988;19:183-192.

3. Larsen C. G. Leukocyte activating and chemotactic cytokines in cell-mediated immune reactions of the human skin. Acta Dermatovenerol. 1991; Suppl. 160:1-48

4. Fiorentiono D. F., M. W. Bond. andT. R. Mosmann. 1989. Two types of mouse helper T celi. IV. Th2 clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Thl clones. J. Exp. Med., 170:2081.

5. Viera P., R. de Wall-Malefyt, Μ. -N. Dang, K. E. Johnson, R. Kastelein, D. F. Fiorentiono, J. E. de Vries, M. -G. Roncarolo, T. R. Mosmann, and K. W. Moore.1991, Isolation and expression of human cytokine synthesis inhibitory factor (CSIF/IL-10) cDNA clones: homology to Epstein-Barr virus open reading frame BCRFI. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 88:1172.

6. Moore, K. W., O’Garra A., de Waal Malefyt R. Vieira, Mosmann T.R. 1993. Interleukin-10, Annu Rev. Immunol, 11:165-90

7. Kim, J.M., Brannan, C.I. Copeland N.G., Jenkins, N.A., Khan, T.A., Moore, K.W. 1992. Structure of the mouse interleukin-10 gene and chromosomal localization of the mouse and human genes. J. Immunol 148:3618-23.

8. Carter. D. B., Deibel, M.R.-Jr, Dunn, C.J. et al. 1990. Purification, cloning, expression and biological characterization of an interleukin-1 receptor antagonist protein. NATURĘ 344:633-638.

9. Hannum, C.H., Wilcox, C.J., Arend, W.P. et al. 1990. Interleukin-1 receptor antagonist activity of a human interleukin-1 inhibitor. Naturę 343:336-40.

10. Firestein, G.S.,Boyle, D.L., Yu, C.,etal. 1994. Synovial interleukin-1 receptor antagonist and interleukin-1 balance in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 37:644-652.

11. Fisher, C.J. -Jr., Slotman, G.J., Opal, S.M., Pribble, J.P. et al. 1994. Initial evaluation of recombinant interleukin-1 receptor antagonist in the treatment of sepsis syndrome: a randomized, open-label, placebo-cointrolled multicenter trial. The IL-1RA Sepsis Syndrome Study Group. Crit-Care-Med. 22:12-21.

12. de Waal-Malefyt, R., Haanen J., Spits, H., etal. 1991. IL-10 and viral IL-10 stronglyreduce antigen-specific human T celi proliferation by diminishing the antigenpresenting capacity of monocytes via down-regulation of class IIMHC expression. J. Exp. Med. 174:915-24

13. Gazzinelli,R.T., Oswald, I.P., James, S.L., Sher, A., 1992. IL-10 inhibits parasite killing and nitric oxide production by IFN-/-activated macrophages. J. Immunol./ 148:1792-96.

181 042

14. Jinąuan, T., Larsen, C.G., Gesser, B., Matsushima, K., Thestrup-Pedersen, K. 1993. Humań IL-10 is a chemoattractant for CD8+ T lymphocytes and an inhibitor of IL-8- induced CD4+ T lymphocyte Migration. Journal of Immunology, 151:4545-4551.

15. Rousset F., E. Garcia, T. Defrance, C. Peronne, D.-H. Hsu, R. Kastelein, K. W. Moore, and J. Banachereau. 1992. IL-10 is a potent growth and differentiation factor for activated human B lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 175:671.

16. Howard, M., O’Garra, A., Ishida, H., de Waal Malefyt, R., de Vries, J. 1992. Biological properties of Interleukin-10. J. Clin. Immunol 12:239-47.

17. Kuhn, R., Lohler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Muller, W. 1993. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Celi 75:263-74.

18. Sher, A., Fiorentino, D.F., Caspar, P., Pearce, E., Mosmann, T. 1991. Production of IL-10 by CD4+ lymphocytes correlates with down-regulation of Thl cytokine synthesis in helminth infection. J. Immunol. 147:2713-16.

19. Clerici, M., Shearer, G.M. 1993 Immunology Today.l4:107-lll.

20. Bry, K., Lappalainen, U. 1994. Interleukin-4 and transforming growth factor-beta 1 modulate the production of interleukin-1 receptor antagonist and prostaglandin E2 by decidual cells. Am-J-obstet-Gynecol 170(4): 1194-1198.

21. Firestein, G., S., Boyle, D. L., Yu, C., Paine, Μ. M., Whisenand, T. D., Zvaifler, N. J., Arend, W. P. 1994. Synovial interleukin-1 receptor antagonist and interleukin-1 balance in rheumatoid arthritis. Arthritis-Rheum, 37/5: 644-652

22. Roberge, C.J., De-Medicis, R., Dayer, J. M., Rola-Pleszcyczynski, M., Naccahe, P. H., Poubelle, P. E. 1994. Crystal-inducedneutrophilactivation: V. Differential production ofbiologically active IL-1 receptor antagonist. J. Immunol 152/11: 5485-5494.

23. McCall, R.D.,Haskill, S., Zimmermann,E. M.,Lund,P. K., Thompson,R. C. Sartor, R. B. 1994. Tissue interleukin 1 and interkeukin-1 receptor antagonist expression in entercolitis in resistant and susceptible rats. Gastroenterology (4): 960-72

25. Kimble, R.B., Vannice, J. L, Bloedow, D.C., Thompson, R.C., Hopfer, W., Kung, V.T., Brownfield, C., Pacifici, R. 1994. Interleukin-1 receptor antagonist decreases bonę loss and bonę resorption in ovariectomized rats. J. Clin Invest. 93/5: 1959-1967

26. Kline, J.N., Geist, L. J., Moniek, M.M., Stinski, M.F., Hunninghake, G.W., 1994, J, Immunol. 152 (5):2351-7

27. Tompkins, R.G. 1994. Human recombinant interleukin-1 receptor antagonist in the treatment of sepsis syndrome (editorial; comment). Crit-Care-Med. 22 (1): 3, 22 (1):12-21.

28. Everaerdt, B., Brouckaert, P, Fiers, W. 1994. Recombination IL-1 receptor antagonist protects against TNF-induced lethality in mice. J. Immunol. 152/10: 5041-5049

29. Fischer, C.J. Jr., Slotman, G.J., Opal, S.M., Pribble, J.P., Bonę, R.C., Emmanuel, G., Ng, D., Bloedow, D.C., Catalano, M. A. 1994. Initial evalutaion of human recombination interleukin-1 receptor antagonist in the treatment of sepsis syndrome: a randomized, openlabel, placebo-controlled multicenter trial. The IL-1RA Sepsis Syndrome Study Group (see comments). Crit-Care-Med. 22(1): 12-21, 22(1): 3

30. Gomez-Reino-Camoto, J. J. 1994. New terapies in rheumatoid arthritis. Med-Clin 543-545.

181 042

32. Nishihara, T., Ohsaki, Y., Ueda, N., Saito, N., Mundy, G. R. 1994. Mouse Interleukin-1 receptor antagonist induced by actinobacillus actinomycetemcomitans lipopolysaccharide blocks the effects of interleukin-1 om bonę resorption and osteoclast-like celi formation. Infect-Immun. 62(2): 390-7

33. Simon, C., Frances, A., Piąuette, G.N., el-Danasouri, L,Żurawski, G., Dang, W., Polan, M L. 1994. Embryonic implantation in mice is blocked by interleukin-1 receptor antagonist (see comments). Endocrinology. 134(2): 521-8, 134(2): 519-20

34. Baergen, R., Benirschke, K., Ulich, T.R., 1994. Cytokine expression in the płacenia. The role of interleukin 1 and interleukin 1 receptor antagonist axpression in chorioamnionitis and parturition. Arch-Pathol-Lab-Med. 118(1): 52-5

35. Tang, W.W., Feng, L., Vannice, J. L., Wilson, C.B. 1994. Interleukin-1 receptor antagonist ameliorates experimental antiglomerular basement membranę antibodyassociated flomeulonephritis. J. Clin-Invest. 93(1): 279-9.

36. Cassatella, M.A., Meda, L., Gasperini, S., Calzetti, F., Bonara, S. 1994.

37. Interleukin 10 (IL-10) upregulates IL-1 receptor antagonist production from lipopolysaccharide-stimulated human polymorphonuclear leukocytes by delaying mRNA degradation. J. Exp-Med. 179/5: 1695-1699

38. Mancini, R., Bendetti, A., Jezeąueł, A.M. 1994. An interleukin-1 receptor antagonist decreases fibrosis induced by dimethylnitrorsamine in rat liver. Virchows-Arch. 424/1: 25-31

39. Lukacs, N.W., Kunkel, S.L., Burdick, M.D., Lincoln, P.M., Strieter, R.M. 1993.

40. Interleukin-1 receptor antagonist blocks chemokine production in the mixed lymphocyte reaction. Blood. 82(12): 3668-74

41. Bandara, G., Mueller, G.M., Galea-Lauri, J., Tindal, M.H., Georgescu, H.I., Suchanek, M.K., Hung, G.L., Gloriso, J.C., Robbins, P.D., Evans, C.H. 1993.

42. Intraarticular expression of biologically active interleukin 1 -receptor-antagonist protein by ex vivo transfer. Proc-Natl-Acad-Sci-U-S-A. 90(22): 10764-8

43. Dinarello, C.A. 1994. Anti-interleukin-1 strategies in the treatment of the septic shock syndrome. Can-J-infect-Dis. 5(suppl. A): 9A-16A

44. Oelmann, E., Topp, M.S., Reufi, B., Papadimitriiou, C., Koeningsmann, M., Oberberg, D., Thiel, E., Berdel, W.E. 1994. Int-J-Oncol. 4/3: 555-558

45. Estrov, Z. 1993. Interruption of autocrine and paracrine growth-stimolatory mechaisms: a new therapeutic stratefy for chronic myelogenous leukemia. Semin-Hematol. 30(3 suppl 3): 35-6

46. Wooley, RH. Whalen, J.D., Chapman, D.L., Berger, A.E., Richard, K.A., Aspar, D.G., Staite, N.D. 1993. The effect of an interleukin-1 receptor antagonist protein on type II collagen-induced arthritis and antigen-induced arthritis in mice. Arthritis Rheum. 36(9): 1305-1314

47. Peterson, C.M., Hales, H.A., Hatasaka, H.H., Mitchell, M.D., Rittenhouse, L., Jones, K.P. 1993. Interleukin-1 beta (IL-1 beta) modulates prostaglandin production and the natural IL-1 receptor antagonist inhibits ovulation in the optimally stimulated rat ovarian perfusion model. Endocrinology 133(5): 2301-2306

48. Estrov, Z., Kurzrock, R., Talpaz, M. 1993. Role of interleukin-1 inhibitory mołecules in therapy of acute and chronic myelogenous leukemia. Leuk. Lymphoma 10(6): 407-418

181 042

49. Chensue, S.W., Bieńkowski, M., Eessalu, T.E., Warmington, K.S., Hershey, S.D., Lukacs, N.W., Kunkel, S. L. 1993. nous IL-1 receptor antagonist protein (IRAP) regulates schistosome egg granuloma formation and the regional lymphoid response. J. Immunol. 151(7): 3654-3662

50. Bowyer, J.F., Davies, D.L., Schmued, L., Broening, H. W., Newport, G.D., Slikker, W.Jr., Holson, R.R.1994. Further studies of the role f hyperthermia in methamphetamine neurotoxicity. J. Pharmacol. Exp. Ther. 268/3: 1571-1580

51. Cole, O.F., Sullivan, M.H.F., Elder, M.G. 1993. The’interleukin-1 receptor antagonist’ is a partial agonist of prostaglandin synthesis by human decidual cells. Prostaglandins 46/6: 493-498

52. Jenkins, J.K., Arend, W.P. 1993. Interleukin 1 receptor antagonist production inhuman monocytes in induced by IL-lalpha, IL-3, and IL-4 and GM-CSF. Cytokine 5/5: 407-415

53. Coceani, F., Lees, J., Redford, L, Bishai, I. 1992. Interleukin-1 receptor antagonist: effectiveness against interleukin-1 fever. Can. J. Pharmacol. 70(12): 1590-1596

54. Schiro, R., Longoni, D., Rossi, V., Maglia, O., Doni, A., Arsura, M., Carrara, G., Masera, G., Vannier, E., Dinarello, C.A., Rambaldi, A., Biondi, A. 1994. Suppression of juvenile chronić myelogenous leukemia colony growth by interleukin-1 receptor antagonist. Blood 83/2: 460-465

55. Watson, M.L., Smith, D., Boume, A.D., Thompson, R.C., Westwick, J. 1993. Cytokines contribute to airway dysfunction hyperreactivity, pulmonary eosinophil accumulation and tumor necrosis factor generation by pre-treatmet with an interleukin-1 receptor antagonist. Am. J. Respir. Celi Mol, Biol, 8(4): 365-369

56. Abhyankar, S., Gilliland, D.G., Ferrara, J.L.M. 1993. Interleukin-1 is a critical effector molecule during cytokine dysregulation in graft-versus-host disease to minor histocompatibility antigens. Transplantation 56/6: 1518-1523

57. Lan, H.Y., Nikolic Paterson, D.J. Zarama, M., Vannice, J.L., Atkins, R.C. 1993. Suppression of experimental crescentic glomerulonephitis by the interleukin-1 receptor antagonist. Kidney Int. 43(2): 479-485

58. Herve, P. 1993. Prevention and treatment of acute GvHD - New modalities. Nouv. Rev. Fr. Hematol. 35/3: 295-297

59. Conti, P, Panara. M.R., Barbacane, R.C. Placido, F.C., Bongrazio, M., Reale, M., Dempsey, R.A., Fiore, S. 1992. Blocking the interleukin-1 receptor inhibits leukotriene B4 and prostaglandin E2 generation in human monocyte cultures. Celi Immunol. 145(1): 199-209

60. Kristensen, M., Deleuran, B., Eedy, D.J., Feldmann, M., Breathnach, S.M., Brennan, F.M. 1992. Distribution of interleukin-1 receptor antagonist protein (IRAP), interleukin-1 receptor, and interleukin-1 alpha in normal and psoriatic skin, Decreased expression of IRAP in psoriatic lesional epidermis. Br. J. Dermatol. 127(4): 305-311

61. Romero, R., Sepulveda, W., Mazor, M., Brandt, F., Cotton, D.B., Dinarello, C.A:, Mitchell, M.D. 1992. The natural interleukin-1 receptor antagonist in term and pre-term parturition. Am. J. Obstet. Gynecol. 167 (4 Pt 1): 863-872

62. Dinarello, C.A. 1992. Reduction of inflammation by decreasing production of interleukin-1 orby specific receptor antagonism. Int. J. Tissue, React. 14(2): 65-75

63. Conti, R, Panara, M.R., Barbacane, R.C., Bongrazio, M:, Dempsey, R.A., Reale, M. 1993. Human recombinant IL. 1 receptor antagonist (IL-1 Ra) inhibits leukotriene B4 generation

181 042 from human monocyte suspensions stimulated by lipopolysaccharide (LPS). Clin. Exp. Immunol. 91/3: 526-531

64. DeForge, L.E., Tracey, D.E., Kenney, J.S., Remick, D.G. 1992. Interleukin-1 receptor atagonist protein inhibits interleukin-8 expressio lipopolysaccharide-stimuled human whole blood. Am. J. Pathol. 140(5): 1045-1054

65. Porat, R., Poutsiaka, D.D., Miller, L.C., Granowitz, E.V., Dinarello, C.A. 1992. Interleukin-1 (IL-1) receptor blockade reduces endotoxin and Borrealia burgdorferi-stimulated IL-8 synthesis in human monoclear cells. Faseb.J. 6(7): 2482-2486

66. Boermeester, M.A., van Leeuwen, P.A.M., Schnęider, A.J., Houdijk, A.P.J., Ferwerda, C.C. Wesdorp, R.I.C. 1993 .Interleukin-1 receptor antagonist: A new therapeutic agent in the treatment of septic syndrome. Ned. Tijdschr. Geneesks. 137/7: 337-342

67. Smith, R.J., Chin, J.E., Sam, L.M., Justen, J.M. 1991.Biologic effects of an interleukin-1 receptor antagonist protein on interleukin-1 stimulated cartilage erosion and chondrocyte responsiveness. Arthsitis Rheum, 34(1): 78-83

68. Conti, P. Barbacane, R.C. Panara, M.R. Reale, M., Placido, F.C., Fridas, S., Bongrazio, M., Dempsey, R.A. 1992. Human recombinant interleukin-1 rteceptor antagonist (hrlL-lra) enhances the stimulatory effect of interleukin-2 on natural killer celi activity against MOLT-4 target cells. Int. J. Immunopharm. 14/6: 987-993

69. Selig, W., Tocker, J. 1992. Effect of interleukin-1 receptor antagonist on antigen-induced pulmonary responses in guinea pigs. Eur. J. Pharmacol. 213/3: 331-336

70. McCarthy, P.L. Jr., Abhyankar, S., Neben, S., Newman, G., Sieff, C., Thompson, R.C., Burakoff, S. L, Ferrara, J.L.M. 1991. Inhibition of interleukin-1 by an interleukin-1 receptor antagonist prevents graft-versus-host diseases. Blood 78/8: 1915-1918

71. Estrov. Z, Kurzrock, R., Wetzler, M., Kantaijian, H., Blake, M., Harris, D., Gutterman, J.U., Talpaz, M. 1991. Suppression of chronic myelongenous leukemia colony growth by interleukin- 1 (IL-1) receptor antagonist and soluble IL-1 receptors: A novel application for inhibitors of IL-1 activity, Blood 78/6: 1476-1484

72. Thomas, T.K., Will, P.C. Srivastava, A., Wilson, C.L., Harbison, M., Little, L, Chesonis, R.S. Pignatello, M., Schmolze, D., Symington, J., Kilin, P.L., Thompson, R.C. 1991. Evaluation of an interleukin-1 receptor antagonist in the rat acetic acid-induced colitis model. Agents Actions 34/1-2: 187-190

73. Carter, D.B., Deibel, M.R. Jr., Dunn, C.J. Tomich, C.S.C., Laborde, A.L., Slightom, J.L., Berger, A.E., Bieńkowski, M.J., Sun, F.F., McEwan, R.N., Harris, P.K.W., Yem, A.W., Waszak, G.A., Chosay, J.G., Sieu, L.C., Hardee, M.M., ZurcherNeely, H.A., Reardon, I.M., Heinrikson, R.L. et al. 1990. Purification, cloning expression and biological characterization of an interleukin-1 receptor antagonist protein. Naturę 344/6267: 633-638

74. Larsen C.G, Anderson A.O, Apella E., Oppenheim J.J., Matsushima K., 1989. Science 243:1464;

75. Larsen C.G., Jinąuan T., Deleurant B., Thestrup Pedersen K. 1993, IL-10 is a potent regulator of the chemotactic response of mononuclear cells, but not of granulocytes. J. Invest. Dermatol. Vol 100, No 6

76. Sankoff and Kruskal in chapter 1 of „Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Seąuence Comparison” (Addison-Wesley, Reading, Mass. 1983).

181 042

77. Berzofsky, Science 229, (1985) 932-940

78. Bowie et al., Science 247, (1990) 1306-1310

79. Wasserman et al., J. Immunol. 87, 1961, 290-295

80. Levine et al., Methods in Enzymology 11, 1967, 928-936

81. Lewis et al., Biochemistry 22, 1983, 948-954

82. Rene de Waal Maletyt, John Abrahams, Bruce Bennet, Carl G. Figdor and Jan E. de Vries (1991), Interleukin 10 (IL-10) Inhibits Cytokine Synthesis by Humań Monocytes: An Autoregulatory Role of IL-10 Produced by Monocytes. J. Exp. Med. 174, 1209-1220

83. Szoka et al., Ann. Rev. Biophys Bioeng. 9, 1980, 467

84. US Patent No. 4,235,871

85. US 4,501,728

86. US 4,837,028.

87. Walter H. Gotlieb, John S. Abrams, Joanna M. Watson, Thierry J. Velu, Jonathan S. Berek, Otoniel Martinez-Meza (1992), Presence of interleukin 10 (IL-10) in the ascites of patients with ovarian and other intra-abdominal cancers. Cytokine 4, No. 5, 385-390

88. Blancho G., P. Gianello, Sh. Germana, M. Baetscher, D.H. Sachs and Chr. LeGuem (1995), Molecular Identification ofporcine interleukin 10: Regulation of expression inkidney allograf model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2800-2804

181 042

-X- i mILlO UPGSALLCCLLLLTGURISRGQYSREDNNCTHFPVCQSHULLELRTAF lllllll llll I I II I lilii II II II

HIL10 MHSSALLCCLVLLTGVRASPCQGTQSENSCTHFPGNLPNULROLRDAF

I I llll 1 II Ύ II Ίιιιιηιι

BCRFI MERRLWTLQCLVLL—YLAPECGGTD QCDNFPQ----ULRDLROAF i 30

SQVKTFFQTKDQLONILLTOSLMQOFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLG i unii nim ιι ιι 1111111111111111111 mmi ι ιι i im SRYKTFFąUKOGUDNLLLKESLLEDFKGYLGCąALSEWiąFYLEEYUPąAENąOPDIKAHyNSLG 11111 i.i Γ11 mmmmiiiimimimmmmmm i inni SRVKTFFqTKOEVDNLLLKESLLEDFKGYLCCqALSEMiąFYLEEVMPQAENQOPEAKOHVNSLG.-, ___ 2' u,

EKLKTLRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQOQGVYKAMNEFOIFINCIEAYMUIKUKS i mu mmmmmiiiim mu i im mmi mu i ENLKTLRLRLRRęHRFLPCEHKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAUSEFDIFINYIEAYMTMKIRN 111111111111 i 111111111111111 mmmmmmmmmmi ι i ENLKTI_RLRLRRCHRFLPCENKSKAVEąiKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTIKAR q 6

Fig. 1. Comparison of the predicted amino acid seęuences of mIL-ΊΟ, hIL-10, and BCRFI. Amino acid sequence identities are indicated by venicai lines.

Fig. 1. Porównanie przewidzianych sekwencji aminokwasowych mILelO, hIL-10 i BCRFI. Identyczność sekwencji aminokwasowej zaznaczono pionowymi kreskami.

Fig. 1

181 042

Peptydowe sekwencje C-końcowe IL-10 obejmujące 9 aminokwasów białka świńskiego, ludzkiego i wirusowego

COOH TERMINAL PEPTIDE SEQUENCES OF IL-10 INCLUDING 9 AMINO ACIDS OF PORCINE, HUMAŃ and VIRUS PROTEINS.

Świńska IL-10

PORCINE IL-10 PIT .

Ludzka IL-10

HUMAŃ IL-10 IT 9302

BCRFI IL-10 VIT * * - T - Μ - K * *

- T - Μ - K * *

- T - I - K *

M - R - K - N ★

I - R - N *

A - R -

1) Aminoacids marked with * represent key position for receptor binding and are evolutionary well conserved. Compare the IL-10 aminoacid seguence from mouse below. Mysia IL-10 MOUSE IL-10 *

MIT “A-Y-M—M-I—K-M-K-S

2) This seguence is lacking the homology to the important amino acids.

1) Aminokwasy zaznaczone * przedstawiają kluczowe pozycje dla wiązani z receptorem i są dobrze zakonserwowane ewolucyjnie. Dla porównania sekwencja mysia.

2) Sekwencja ta jest pozbawiona homologii istotnych aminokwasów

Fig. 2

181 042

IL-8 (ng/ml·

O 0.01 0.1 1 10 100 1000

IT9302 (ng/ml)

IT9302 inhibits spontanous IL-8 production by purified cultured monocytes. (A) Indicates the level of IL-8 when using rh IL-10 (100 ng/ml).

IT9302 hamuje spontaniczne wytwarzanie IL-8 przez oczyszczone hodowane monocyty.

(A) oznacza poziom IL-8 z zastosowanim IL-10 (100 ng/ml).

181 042

ΙΤ9302 hamuje wywołane IL-1 (1 ng/ml) wytwarzanie IL-8 przez ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej IT9302 inhibits IL-l induced (l ng/ml) IL-8

IT9302 (ng/ml) οοοαοαοοο coc^-colq'«tcoc4^,,,“ uoponpoid §-n jo uopTąppi •g-qX ETuezjeMąAft exueftomeqez ąuaoojd

181 042

ΙΤ9302 stimulated human monocytes

(|uj/6u) dVdl

181 042

IRAP (ng/ml)

IL-10 stimulated human monocytes

Fig. 6

181 042

Aktywność chemotaktyczna IT93O2 wobec limfocytów T CD8+

Chemotactic activity of IT9302 on CD8+ T cells

CD8+ T celi chemotactic ąctiviiy Aktywność.chemotaktyczna limfocytów T CD8+

IT9302 (ng/ml)

Fig. 7

181 042 o c •N

O hO s o

S Vc O

Ł, CU o

+803 1 MęąAoojWTp osąon OL-ΊΙ euzoXą^eąoraeqo osouAAą^y siiao i +8QO uo quj/6u ot) 01-ΊΙ1° ΛρΛίρο ομοοιοωθΜο

Conc. of FT9302 (ng/ml) In Top-well Chemotaxls Chamber .

Stężenie IT9302 (ng/ml) w górnej komorze chemotaktyęznej

181 042

Hamowanie aktywności IL-8 przez IT93O2

Suppression of IL-8 octivity by IT9302

Effect of IT9302 on IL-8 (10 ng/ml) mediated chemotaxis.

Wpływ IT93O2 na cjEmotaksję wywołaną IL-8 (10 ng/ml) cn

IT9302 CONCENTRATION (ng/ml)

Stężenie IT9302 )ng/ml)

Fig. 9

181 042

ΙΤ9302 inhibits MCAF/MCP-1 induced monocyte chemotaxis

IT93O2 hamuje chemothksję monocytów wywołaną T MCAF/MCP-1 n

Neg Cont 0 0.1 1 10 100 kontrola IT9302 conc (ng/ml negatywna stężenie IT9302 (ng/ml)

Fig. 10

181 042

Badanie metodą ECL-Western blotting białek cytozolu limfocytów T CD4+ z zastosowanim kozich przeciwciał przeciwko ludzkiej IL-4

ECL-Western Blotting of CD4+ T celi cytosolic proteina using a goat anti-human IL-4 antibody.

Pobudzanie przez 3 dni przez:

Stimulation for 3 days with:

1. Control 2. mon.anti-IL-8 antibody WS.4 10 Mg/ml,

3. rIL-8 100 ng/ml, 4. rIL-10 100 ng/ml,

5. IT9302 10 ng/ml, 6. rlFN gamma 10 ng/ml.

1. Kontrola 2. przeciwciało monoklonalne przeciwko interleukinie 8 WS.4

Fig. 11

181 042

Badanie metodą ECL-Western blotting białek cytozolu mieszanej hodowli ludzkich leukocytów przy użyciu króliczych przeciwciał przeciwko ludzkiemu TNF.cC,

ECL-Western Blotting of Humań Mixed lympłiocyte culture cytosolic proteins using a rabbit antihuman TNF-α antibody.

— 17kDa

Pobudzenie przez 24 godz.

Stimulation for 24 hours with:

1. Control Kontrola

2. IT9302 10 ng/ml

181 042

Hours

Godziny

(Aązoji;

eaaosabzood ąuaooadi «oąAooynai υςζοτχ eą-Ęwo^jeo ’ Qunoo ρμιυι p θοο^θοίθό) junoo θ|Λοο>;ηθ| ρ;οχ

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Polipeptyd liczący od 7 do 20 aminokwasów, obejmujący następującą sekwencję:

Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (Identyfikator Sekw. Nr 19), w której

Χ4 i Χ5 są niezależnie wybrane z grupy składającej się z Met, Ile, Leu i Val; oraz

Xń jest wybrany z grupy składającej się z Asn, Asp, Gin i Glu, który ina jedną lub więcej spośród poniższych właściwości: a) wywoływania zahamowania spontanicznego wytwarzania IL-8 przez ludzkie monocyty, b) wywoływania zahamowania powodowania przez IL-Ιβ wytwarzania IL-8 przez ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC), c) wywoływania wytwarzania białka antagonisty receptora interleukiny 1 (IRAP) przez ludzkie monocyty, d) wywoływania migracji chemotaktycznej ludzkich limfocytów CD8 in vitro, e) odczulania ludzkich limfocytów CD8⁺ powodującego brak aktywności wobec rhIL-10, f) hamowania odpowiedzi chemotaktycznej ludzkich limfocytów T CD4⁺ wobec IL-8, g) hamowania odpowiedzi chemotaktycznej ludzkich monocytów wobec MCAF/MCP-1, h) wywoływania wytwarzania IL-4 przez hodowane normalne ludzkie limfocyty T CD4⁺, i) zmniejszania wytwarzania TNF-α w reakcji mieszanych ludzkich leukocytów.

2)

2. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje następującą sekwencję:

X3-Thr-X4-Lys-Xs-Arg-X6 (Identyfikator Sekw. Nr 20), w której

Χ3, Χ4 i Χ5 są niezależnie wybrane z grupy składającej się z Met, Ile, Leu i Val; oraz Xć jest wybrany z grupy składającej się z Asn, Asp, Gin i Glu.

3)

3. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje następującą sekwencję

X₂-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (Identyfikator Sekw. Nr 21), w której

Χ2 oznacza Tyr albo Phe,

4)

4. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje następującą sekwencję

Xi-X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (Identyfikator Sekw. Nr 22), w której

Xi oznacza Ala albo Gly,

Χ2 oznacza Tyr albo Phe,

Χ3, Χ4 i Χ5 są niezależnie wybrane z grupy składającej się z Met, Ile, Leu i Val; oraz Xe jest wybrany z grupy składającej się z Asn, Asp, Gin i Glu.

5)

5. Polipeptyd według zastrz. 4, znamienny tym, że X] oznacza Ala.

6)

6. Polipeptyd według zastrz. 4, znamienny tym, że X! oznacza Gly.

7)

7. Polipeptyd według zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, że X₂ oznacza Tyr.

8)

8. Polipeptyd według zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, że X₂ oznacza Phe.

9) (Identyfikator Sekw. Nr 10) (Identyfikator Sekw. Nr 11) (Identyfikator Sekw. Nr 12) (Identyfikator Sekw. Nr 13) (Identyfikator Sekw. Nr 14) (Identyfikator Sekw. Nr 15) (Identyfikator Sekw. Nr 16) i (Identyfikator Sekw. Nr 17).

9. Polipeptyd według zastrz. 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że X₃ oznacza Met.

10. Polipeptyd według zastrz. 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że X₃ oznacza Ile

11. Polipeptyd według zastrz. 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że X₃ oznacza Leu.

12. Polipeptyd według zastrz. 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że X₃ oznacza Val.

13. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że X₄ oznacza Met.

181 042

14. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że X₄ oznacza Ile.

15. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że X₄ oznacza Leu.

16. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że X₄ oznacza Val.

17. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że X₅ oznacza Met.

18. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że X₅ oznacza Ile.

19. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że X₅ oznacza Leu.

20. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że X₅ oznacza Val.

21. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że X₆ oznacza Asn.

22. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, X₆ oznacza Asp.

23. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że X₆ oznacza Gin.

24. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że X₆ oznacza Glu.

25. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że obejmuje przynajmniej 12 aminokwasów.

26. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że obejmuje przynajmniej 15 aminokwasów.

27. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że obejmuje 11 aminokwasów.

28. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że obejmuje 10 aminokwasów.

29. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że jest w postaci zasadniczo czystej.

30. Polipeptyd o wzorze

Xi-X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (Identyfikator Sekw. Nr 22), w którym

Xi oznacza Ala albo Gly,

Χ2 oznacza Tyr albo Phe,

Xó jest wybrany z grupy składającej się z Asn, Asp, Gin i Glu.

31. Polipeptyd według zastrz. 30, znamienny tym, że X] oznacza Ala.

32. Polipeptyd według zastrz. 30, znamienny tym, że X, oznacza Gly.

33. Polipeptyd według zastrz. 30 albo 31 albo 32, znamienny tym, że X₂ oznacza Tyr.

34. Polipeptyd według zastrz. 30 albo 31 albo 32, znamienny tym, że X₂ oznacza Phe.

35. Polipeptyd według zastrz. 30 albo 31 albo 32, znamienny tym, że X₃ oznacza Met.

36. Polipeptyd według zastrz. 30 albo 31 albo 32, znamienny tym, że X₃ oznacza Ile.

37. Polipeptyd według zastrz. 30 albo 31 albo 32, znamienny tym, że X₃ oznacza Leu.

38. Polipeptyd według zastrz. 30 albo 31 albo 32, znamienny tym, że X₃ oznacza Val.

39. Polipeptyd według zastrz. 30 albo 31 albo 32, znamienny tym, że X₄ oznacza Met.

40. Polipeptyd według zastrz. 30 albo 31 albo 32, znamienny tym, że X₄ oznacza Ile.

41. Polipeptyd według zastrz. 30 albo 31 albo 32, znamienny tym, że X₄ oznacza Leu.

42. Polipeptyd według zastrz. 30 albo 31 albo 32, znamienny tym, że X₄ oznacza Val.

43. Polipeptyd według zastrz. 30 albo 31 albo 32, znamienny tym, ze X₅ oznacza Met.

44. Polipeptyd według zastrz. 30 albo 31 albo 32, znamienny tym, że X₅ oznacza Ile.

45. Polipeptyd według zastrz. 30 albo 31 albo 32, znamienny tym, że X₅ oznacza Leu.

46. Polipeptyd według zastrz. 30 albo 31 albo 32, znamienny tym, że X₅ oznacza Val.

47. Polipeptyd według zastrz. 30 albo 31 albo 32, znamienny tym, że X₆ oznacza Asn.

48. Polipeptyd według zastrz. 30 albo 31 albo 32, znamienny tym, że X₆ oznacza Asp.

49. Polipeptyd według zastrz. 30 albo 31 albo 32, znamienny tym, że X₆ oznacza Gin.

50. Polipeptyd według zastrz. 30 albo 31 albo 32, znamienny tym, że X₆ oznacza Glu.

51. Polipeptyd według zastrz. 30, znamienny tym, że jest w postaci zasadniczo czystej.

181 042

52. Polipeptyd o wzorze

X2-X3-Thr-X4-Lys-Xs-Arg-X6 (Identyfikator Sekw. Nr 21), w którym

X₂ oznacza Tyr albo Phe,

Χ3, Χ4 ί Χ5 są niezależnie wybrane z grupy składającej się z Met, Ile, Leu i Val; oraz Xć jest wybrany z grupy składającej się z Asn, Asp, Gin i Glu.

53. Polipeptyd według zastrz. 52, znamienny tym, że X₂ oznacza Tyr.

54. Polipeptyd według zastrz. 52, znamienny tym, że X₂ oznacza Phe.

55. Polipeptyd według zastrz. 52, znamienny tym, że X₃ oznacza Met.

56. Polipeptyd według zastrz. 52, znamienny tym, że X₃ oznacza Ile.

57. Polipeptyd według zastrz. 52, znamienny tym, że X₃ oznacza Leu.

58. Polipeptyd według zastrz. 52, znamienny tym, że X₃ oznacza Val.

59. Polipeptyd według zastrz. 52, znamienny tym, że X₄ oznacza Met.

60. Polipeptyd według zastrz. 52, znamienny tym, że X₄ oznacza Ile.

61. Polipeptyd według zastrz. 52, znamienny tym, że X₄ oznacza Leu.

62. Polipeptyd według zastrz. 52, znamienny tym, że X₄ oznacza Val.

63. Polipeptyd według zastrz. 52, znamienny tym, że X₅ oznacza Met.

64. Polipeptyd według zastrz. 52, znamienny tym, że X₅ oznacza Ile.

65. Polipeptyd według zastrz. 52, znamienny tym, że X₅ oznacza Leu.

66. Polipeptyd według zastrz. 52, znamienny tym, że X₅ oznacza Val.

67. Polipeptyd według zastrz. 52, znamienny tym, że X₆ oznacza Asn.

68. Polipeptyd według zastrz. 52, znamienny tym, że X₆ oznacza Asp.

69. Polipeptyd według zastrz. 52, znamienny tym, że X₆ oznacza Gin.

70. Polipeptyd według zastrz. 52, znamienny tym, że X₆ oznacza Glu.

71. Polipeptyd według zastrz. 52, znamienny tym, że jest w postaci zasadniczo czystej.

72. Polipeptyd o wzorze

X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-Xó (Identyfikator Sekw. Br 20), w którym

Χ3, Χ4 i Χ5 są niezależnie wybrane z grupy składającej się z Met, Ile, Leu i Val; oraz Xó jest wybrany z grupy składającej się z Asn, Asp, Gin i Glu.

73. Polipeptyd według zastrz. 72, znamienny tym, że X₃ oznacza Met.

74. Polipeptyd według zastrz. 72, znamienny tym, że X₃ oznacza Ile.

75. Polipeptyd według zastrz. 72, znamienny tym, że X₃ oznacza Leu.

76. Polipeptyd według zastrz. 72, znamienny tym, że X₃ oznacza Val.

77. Polipeptyd według zastrz. 72, znamienny tym, że X₄ oznacza Met.

78. Polipeptyd według zastrz. 72, znamienny tym, że X₄ oznacza Ile.

79. Polipeptyd według zastrz. 72, znamienny tym, że X₄ oznacza Leu.

80. Polipeptyd według zastrz. 72, znamienny tym, że X₄ oznacza Val.

81. Polipeptyd według zastrz. 72, znamienny tym, ze X₅ oznacza Met.

82. Polipeptyd według zastrz. 72, znamienny tym, że X₅ oznacza Ile.

83. Polipeptyd według zastrz. 72, znamienny tym, że X₅ oznacza Leu.

84. Polipeptyd według zastrz. 72, znamienny tym, że X₅ oznacza Val.

85. Polipeptyd według zastrz. 72, znamienny tym, że X₆ oznacza Asn.

86. Polipeptyd według zastrz. 72, znamienny tym, że X₆ oznacza Asp.

87. Polipeptyd według zastrz. 72, znamienny tym, że X₆ oznacza Gin.

88. Polipeptyd według zastrz. 72, znamienny tym, że X₆ oznacza Glu.

89. Polipeptyd według zastrz. 72, znamienny tym, że jest w postaci zasadniczo czystej.

90. Polipeptyd o wzorze

Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (Identyfikator Sekw. Nr 19),

181 042 w którym

Xó jest wybrany z grupy składającej się z Asn, Asp, Gin i Glu, pod warunkiem, że polipeptyd ten nie jest Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn.

91. Polipeptyd według zastrz. 90, znamienny tym, że X₄ oznacza Met.

92. Polipeptyd według zastrz. 90, znamienny tym, że X₄ oznacza Ile.

93. Polipeptyd według zastrz. 90, znamienny tym, że X₄ oznacza Leu.

94. Polipeptyd według zastrz. 90, znamienny tym, że X₄ oznacza Val.

95. Polipeptyd według zastrz. 90, znamienny tym, że X₅ oznacza Met.

96. Polipeptyd według zastrz. 90, znamienny tym, że X₅ oznacza Ile.

97. Polipeptyd według zastrz. 90, znamienny tym, że X₅ oznacza Leu.

98. Polipeptyd według zastrz. 90, znamienny tym, że X₅ oznacza Val.

99. Polipeptyd według zastrz. 90, znamienny tym, że X₆ oznacza Asn.

100. Polipeptyd według zastrz. 90, znamienny tym, że X₆ oznacza Asp.

101. Polipeptyd według zastrz. 90, znamienny tym, że X₆ oznacza Gin.

102. Polipeptyd według zastrz. 90, znamienny tym, że X₆ oznacza Glu.

103. Polipeptyd według zastrz. 90, znamienny tym, żejestwpostaci zasadniczo czystej.

104. Polipeptyd o wzorze Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn.

105. Polipeptyd według zastrz. 104, znamienny tym, że jest w postaci zasadniczo czystej.

106. Polipeptyd wybrany z grupy składającej się z :

Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Met-Arg-Asn Ala-Phe-Met-Thr-Leu-Lys-Leu-Arg-Asn Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Glu Gly-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Phe-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Ile-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Leu-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Val-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Met-Thr-Leu-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Met-Thr-Val-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Met-Arg-Asp Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Asp Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Gln Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Glu (Identyfikator Sekw. Nr (Identyfikator Sekw. Nr (Identyfikator Sekw. Nr (Identyfikator Sekw. Nr (Identyfikator Sekw. Nr (Identyfikator Sekw. Nr (Identyfikator Sekw. Nr (Identyfikator Sekw. Nr

107. Polipeptyd według zastrz. 106, znamienny tym, że jest w postaci zasadniczo czystej.

108. Przeciwciało wiążące swoiście polipeptyd o sekwencji aminokwasowej Ala-TyrMet-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn (Identyfikator Sekw. Nr 1).

109. Przeciwciało według zastrz. 108, znamienne tym, że jest przeciwciałem poliklonalnym.

110. Przeciwciało według zastrz. 108, znamienne tym, że jest przeciwciałem monoklonalnym.

111. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera polipeptyd liczący od 7 do 20 aminokwasów, obejmujący następującą sekwencję:

Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (Identyfikator Sekw. Nr 19), w której

Χ4 i Χ5 są niezależnie wybrane z grupy składającej się z Met, Ile, Leu i Val; oraz Xó jest wybrany z grupy składającej się z Asn, Asp, Gin i Glu.

112. Kompozycja według zastrz. 111, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera polipeptyd, który obejmuje następującą sekwencję:

X₃-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (Identyfikator Sekw. Nr 20),

181 042 w której

X₃, X₄ i Χ5 są niezależnie wybrane z grupy składającej się z Met, Ile, Leu i Val; oraz Xó jest wybrany z grupy składającej się z Asn, Asp, Gin i Glu.

113. Kompozycja według zastrz. 111, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera polipeptyd, ktęry obejmuje następującą sekwencję

X2-X₃-Thr-X₄-Lys-X5-Arg-X6 (Identyfikator Sekw. Nr 21), w której

Χ2 oznacza Tyr albo Phe,

X₃, X₄ i Χ5 są niezależnie wybrane z grupy składającej się z Met, Ile, Leu i Val; oraz

Xó jest wybrany z grupy składającej się z Asn, Asp, Gin i Glu.

114. Kompozycja według zastrz. 111, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera polipeptyd, który obejmuje następującą sekwencję

Xi-X2-X₃-Thr-X₄-Lys-X5-Arg-X6 (Identyfikator Sekw. Nr 22), w której

Xi oznacza Ala albo Gly,

Χ2 oznacza Tyr albo Phe,

X₃, Χ4 i Χ5 są niezależnie wybrane z grupy składającej się z Met, Ile, Leu i Val; oraz

Xń jest wybrany z grupy składającej się z Asn, Asp, Gin i Glu.

115. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynnąi farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera polipeptyd o wzorze

Xi’X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6 (identyfikator Sekw. Br 22), w którym

Xi oznacza Ala albo Gly,

Χ2 oznacza Tyr albo Phe,

Χδ jest wybrany z grupy składającej się z Asn, Asp, Gin i Glu.

116. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynnąi farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera polipeptyd o wzorze

X2-X₃-Thr-X₄-Lys-X5-Arg-Xó (Identyfikator Sekw. Nr 21), w którym

Χ2 oznacza Tyr albo Phe,

Χδ jest wybrany z grupy składającej się z Asn, Asp, Gin i Glu.

117. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynnąi farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynna zawiera polipeptyd o wzorze

X₃-Thr-X₄-Lys-X5-Arg-Xó (Identyfikator Sekw. Nr 20), w którym

Χδ jest wybrany z grupy składającej się z Asn, Asp, Gin i Glu.

118. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynnąi farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera polipeptyd o wzorze

Thr-X₄-Lys-X5-Arg-Xć (Identyfikator Sekw. Nr 19), w którym

X₄ i Χ5 są niezależnie wybrane z grupy składającej się z Met, Ile, Leu i Val; oraz

X₆ jest wybrany z grupy składającej się z Asn, Asp, Gin i Glu, pod warunkiem, że polipeptyd ten nie jest Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn.

119. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynnąi farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancje czynną zawiera polipeptyd o wzorze

Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn.

181 042

120. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynnąi farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynnązawiera polipeptyd wybrany z grupy składającej się z:

Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Met-Arg-Asn Ala-Phe-Met-Thr-Leu-Lys-Leu-Arg-Asn Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Glu Gly-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Phe-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Ile-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Leu-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Val-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Ile-Arg-Asn Ala-Tyr-Met-Thr-Leu-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Met-Thr-Val-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Met-Arg-Asp Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Asp Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Gln Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Glu (Identyfikator Sekw. Nr 2) (Identyfikator Sekw. Nr 3) (Identyfikator Sekw. Nr 4) (Identyfikator Sekw. Nr 5) (Identyfikator Sekw. Nr 6) (Identyfikator Sekw. Nr 7) (Identyfikator Sekw. Nr 8) (Identyfikator Sekw. Nr 9) (Identyfikator Sekw. Nr 10) (Identyfikator Sekw. Nr 11) (Identyfikator Sekw. Nr 12) (Identyfikator Sekw. Nr 13) (Identyfikator Sekw. Nr 14) (Identyfikator Sekw. Nr 15) (Identyfikator Sekw. Nr 16) i (Identyfikator Sekw. Nr 17).