CN1295482A - 炎性介质拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及OSM拮抗剂诸如抗体或小分子在制备用于治疗或预防炎性关节病或炎性疾病的药物中的用途,还涉及OSM在筛选这类拮抗剂中的应用。

Description

炎性介质拮抗剂
本发明涉及OSM拮抗剂在制备用于治疗或预防炎性关节病或炎性疾病的药物中的用途，以及筛选这类拮抗剂的方法。
类风湿性关节炎(RA)是一种影响关节的慢性炎性疾病，其特征是滑膜增生和被单核细胞与多形核白细胞(PMN)广泛地细胞浸润。原有细胞型和浸润细胞型之间复杂且尚不清楚的相互作用导致了金属蛋白酶(MMP)的长期分泌，使得关节软骨、韧带和软骨下骨遭到破坏(Firestein GS，《风湿病学流行观点》4：348-54，1992)。在牵涉推进RA关节病变的大量促炎细胞因子中，已显示TNFα起了关键作用，而抗TNFα治疗也显示出明确的好处(E1liott MJ等，《柳叶刀》344(8930)：1105-10，1994)。TNFα介导数种病理性作用，包括诱导MMP(Dayer JM.等，《实验医学杂志》162(6)：2163-8，1985)，上调其它促炎细胞因子(Haworth C.等，《欧洲免疫学杂志》21(10)：2575-9，1991和Dinarello CA.等，《实验医学杂志》163(6)：1433-50，1986)和增加PMN粘附以及经内皮细胞的迁移(Smart SJ.Casale TB，《美国生理学杂志》266：L238-45，1994)。尽管目前TNFα被认为是促炎细胞因子级联的引发剂，但对其正向调节所知非常少(Feldmann M.等，《免疫学年评》14：397-440，1996)。
制瘤素M(OSM)(Rose TM.Bruce AG.，《美国国家科学院院报》88(19)：8641-5，1991)是一种28KDa的糖蛋白，它属于包含IL-6、IL-11、白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)和促心激素1(cardiotrophin 1)(CT-1)的细胞因子家族(Taga T.Kishimoto T.，《免疫学年评》15：797-819，1997)。作为复杂的异源二聚物受体和同源二聚物受体家族的一部分，所有成员都有一个共同信号链gp130(Grotzinger J.等，[文章]蛋白质27(1)：96-109，1997)。OSM有与LIF共同的异源二聚物受体(LIFr：gp130，Ⅰ型)，此外它还有自身独特的受体，包括OSMrβ链和gp130(Ⅱ型)(MosleyB.等，[文章]《生物化学杂志》271(51)：32635-32643，1996)。早已知道了OSM对细胞生长和分化的作用(Horn D.等，[杂志文章]《生长因子》2(2-3)：157-65，1990)。最近，又知道了OSM在体内对小鼠具有强促炎性能(Modur V.等，《临床研究杂志》100：158-168，1997)，并且证实其与IL-1能来自体内地有效地协同加速模型系统的关节软骨退化(Cawston T.，《生物化学与生物物理学研究通讯》215(1)：377-85，1995)。
OSM诱导内皮细胞中P选择蛋白(和E选择蛋白)的长期增加(YaoL.等，《(实验医学杂志》184(1)：81-92，1996)，刺激人滑膜成纤维细胞中尿激酶型纤溶酶原激活物的活性(Hamilton J.等，《生物化学与生物物理学研究通讯》180(2)：652-9，1991)，并且是使内皮细胞产生IL-6的强大诱导物(Brown Tj.等，《免疫学杂志》147(7)：2175-80，1991年10月1日)。最近已测量了RA中而不是OA滑液(Hui W.等，风湿病纪事56(3)：184-187，1997)和滑膜中的OSM，它们的产生已局限于巨噬细胞(1997年，Okamoto H等，《关节炎与风湿病》40(6)：1096-1105；和Cawston等，1998年，《关节炎与风湿病》41(10)：1760-1771)。迄今为止，在该领域中的其他实验也已在IL-6亚族成员之间的相似性基础上进行了推测(Carroll G.等，《炎症研究》47(1988)1-7)。
本发明人已发现，OSM具有诱导巨噬细胞中TNFα分泌的能力。最新资料提示，OSM能上调金属蛋白酶1(TIMP-1)的组织抑制剂的产生(Nemoto等，1996年，《关节炎与风湿病》39(4)，560-566)，它与MMP-1复合并灭活MMP-1，由此可预期其能减少胶原的释放。而与此相反，本发明人却发现OSM能诱导TNFα分泌，这提示他们，OSM事实上可能在介导软骨的破坏中起作用。基于这一发现，本发明人已证实，对小鼠模型治疗性给药，中和抗OSM抗体而不抑制其他IL-6族成员，可仅仅改善其胶原诱导的关节炎。随后T.Cawston等也显示，OSM与TNFα协同促进了胶原从软骨的释放(1998年，《关节炎与风湿病》41(10)，1760-1771)。
因此，本发明提供了OSM拮抗剂在制备用于治疗或预防炎性关节病或炎性疾病的药物中的用途。OSM拮抗剂的一个特定用途是制备用于防止或减少胶原从软骨中释放的药物。本发明还提供了治疗或预防炎性关节病或炎性疾病的方法，该方法包括对患有这种疾病的患者给药有效量的OSM拮抗剂。
该拮抗剂可通过阻断OSM与OSM受体gp130，或其它OSM受体OSMrβ链或LIFr之间的相互作用而起作用，或者通过阻断这些蛋白质的异源二聚物的形成而起作用，就这样阻止OSM结合和发信号，由此减少促炎细胞因子和/或MMP的合成。因此，本发明的拮抗剂可以是OSM的配体，或者是一种或多种OSM受体(gp130，OSMrβ或LIFr)的配体，或者是能以影响OSM生物活性的方式干扰这些相互作用的试剂。下文中所称的OSM拮抗剂可以是指OSM自身的拮抗剂，或者是其受体之一的拮抗剂。
本发明人已证实，在类风湿性关节炎的滑膜血管内皮中，P选择蛋白和E选择蛋白与gp130定位于一处，其中gp130是Ⅰ型和Ⅱ型OSM受体的信号元件。不受理论的束缚，上述事实指示：由滑膜巨噬细胞产生的OSM可能通过上调P选择蛋白和E选择蛋白而引发RA血管内皮，从而促进白细胞募集。L选择蛋白借助于特异性抗体或岩藻多糖(L选择蛋白兴奋剂)的连接反应驱动人单核细胞分泌OSM，这一发现在炎性应答的扩增方面可能是非常显著的，因为它提供了驱动TNFα和P选择蛋白与E选择蛋白的另外的OSM局部来源。
已鉴定出对于OSM与gp130的相互作用来说重要的氨基酸残基。从已公布的OSM氨基酸序列来看(Malik等，1989年，《分子与细胞生物学》9(7)，2847-53，DNA序列条目M27288在EMBL资料库中，蛋白质序列条目P13725在Swissprot资料库中)，它们是G120、Q16和Q20；N123和N124也可能起作用(参见SEQ ID 12及下文)。起始25个残基是信号肽，成熟蛋白从序列AAIGS(SEQ ID 13)开始。从该成熟蛋白的第一个氨基酸开始计算的序列如下所示。SEQ ID 12
                         1   5           15          25          35MGVLLTQRTL  LSLVLALLFP  SMASMAAIGS  CSKEYRVLLG  QLQKQTDLMQ  DTSRLLDPYI
     45          55          65          75          85          95RIQGLDVPKL  REHCRERPGA  FPSEETLRGL  GRRGFLQTLN  ATLGCVLHRL  ADLEQRLPKA
     105         115         125         135         145         155QDLERSGLNI  EDLEKLQMAR  PNILGLRNNI  YCMAQLLDNS  DTAEPTKAGR   GASQPPTPTP
     165         175         185         195         205         215ASDAFQRKLE  GCRFLHGYHR  FMHSVGRVFS  KWGESPNRSR  RHSPHQALRK   GVRRTRPSRK
     225  227GKRLMTRGQL  PR
因此，本发明还提供了能与这些特异性残基和或结合位点中的一个或多个相互作用的拮抗剂或试剂，它们帮助在OSM上限定以改变OSM的生物活性。
可以按照本发明进行治疗的炎性关节病包括类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、青年期关节炎、炎性骨关节炎和/或反应性关节炎。可治疗的炎性疾病包括，尤其是节段性回肠炎、溃疡性结膜炎、胃炎例如由幽门螺杆菌感染引起的胃炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、早老性痴呆、多发性硬化和牛皮癣。
可能的OSM拮抗剂包括有机小分子，与OSM特异性作用的离子例如底物，可能是天然底物，细胞膜组分，受体或天然配体，其片段或肽或其它蛋白质分子，特别优选的是将阻断OSM与OSM受体结合的非信号突变型OSM，不过也可以是修饰OSM分子。这些拮抗剂可以是编码蛋白质或肽的DNA形式，也可以被释放后在体内表达所述拮抗剂。拮抗剂可以是含有这类蛋白质或肽分子或DNA的疫苗，设计这些疫苗用于通过在体内诱导针对天然OSM的抗体应答而产生对OSM的拮抗作用。这类拮抗剂还可包括抗体，抗体衍生的试剂或嵌合分子。在拮抗剂的定义中包括上述任何一种这类分子的结构或功能模拟物。还包括核酸分子如DNA或RNA aptamer。
优选的拮抗剂包括有机小分子。这类化合物可以是来自任何种类的化合物，不过将在它们通过上述某种机制影响OSM生物活性的能力的基础上进行选择，并且它们将是生理学上可接受的，即无毒的或显示出可接受水平的毒性或其它副作用。可提供有用的拮抗剂的一类化合物是核糖核苷，诸如N-(1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-4-基)苯甲酰胺(Davoll和Kerridge，《英国化学会志》2589，1961)。
其它优选的拮抗剂包括抗体，其片段或含有抗体或其片段的人工构建物，或设计用于模拟抗体或其片段结合的人工构建物。Dougall等在《Tibtech》12，372-379页(1994)中讨论了这类构建物。
抗体的定义中还包括重组抗体，诸如可使用的重组人抗体。可以改变这些抗体，即，它们可以是包含供体抗体的可变区和人抗体的恒定区的“嵌合”抗体(如WO 86/01533所述)，或者它们可以是“人源化”抗体，其中只有CDR衍生自与抗体可变区的构架不同的种类(如EP-A-0239400所述)。互补决定区(CDR)可以衍生自啮齿动物或灵长类单克隆抗体。已改变的抗体的可变区和恒定区的构架通常来自于人抗体。与由人对完全外源抗体诸如来自啮齿动物的某个抗体建立的免疫应答相比，当这种人源化抗体对人给药时不会引起同样显著的免疫应答。
优选的拮抗剂包括完整抗体、F(ab’)2片段、Fab片段、Fv片段、ScFv片段、其它片段、CDR肽和模拟物。它们可以由本领域技术人员得到/制备。例如，可以用酶切消化得到F(ab’)2片段和Fab片段(通过使IgG分子分别经受胃蛋白酶或木瓜蛋白酶切割)。关于在下面的说明书中提到的“抗体”，应当包括上述所有可能性。
正如本领域技术人员将领会的那样，当在本文中描述特异性蛋白质或肽拮抗剂时，也可以使用这些拮抗剂的衍生物。术语“衍生物”包括所述拮抗剂的变体，它们具有相对于所述拮抗剂的一个或多个氨基酸取代、缺失或插入部分，同时仍然具有所述结合活性。这些衍生物优选具有与特定拮抗剂基本相同的氨基酸序列。
氨基酸序列的同一性可以利用程序诸如“bestfit”(Smith和Waterman，《应用数学进展》482-489(1981))来计算，以找出任何两个序列之间的最佳类似区段。使利用氨基酸类似基块得到的分数最大化，在此基础上进行对齐，诸如Schwarz和Dayhof(1979)在《蛋白质序列与结构图谱》Dayhof，M.O.编著，353-358页中描述的那样。
序列的同一性优选至少为50％，更优选至少为75％。最优选至少有90％或至少有95％的序列同一性。尽管如此，但技术人员将理解，序列的高同一性并不是必需的，因为经常可以用各种氨基酸代替具有类似性能的其它氨基酸，而不会实质改变或不利影响蛋白质的某些性能。有时将这称之为“保守性”氨基酸改变。因此，甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸等氨基酸经常可以相互替代，此外可相互替代的氨基酸还包括：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香侧链的氨基酸)；赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)，以及半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。因此术语“衍生物”还可包括含有一种或多种这类相对于所述序列的“保守性”变化的氨基酸序列的变体。
本发明还包括仍具有所述结合活性的本发明拮抗剂的片段或其衍生物。优选的片段至少有10个氨基酸长，不过它们也可以是更长的(例如，不超过50个氨基酸长或不超过100个氨基酸长)。
用于本发明的其它优选的OSM拮抗剂是寡核苷酸配体。指数式富集法配体系统进化(SELEX)是一个方案，其中对大型单链寡核苷酸文库进行筛选，选出具有针对靶蛋白质或其它分子的所需活性的那些(Tuerk & Gold，1990年，《科学》249，505-510；Green等，1991年，《酶学方法学》2，75-86；Gold等，1995年，《生物化学年评》64，763-797；Uphof等，1996年，《结构生物学流行观点》6，281-288)。此筛选的产物是具有所需活性的、称为aptamer的单寡核苷酸序列，通常与靶蛋白质高度亲和结合。SELEX过程通常用由一些1014-1015的随机寡核苷酸序列组成的RNA或DNA文库引发。在完全随机化的寡核苷酸文库中，每个分子将显示出独特的三级结构，该结构将完全取决于该分子的核苷酸序列。因此，当针对靶蛋白质进行筛选时，寡核苷酸对该蛋白质的结合亲和力将由该寡核苷酸的形状与该靶蛋白质上的表位之间的适合情况决定。由于是从大型多样性文库开始的，因此通常能够用与具有全面结构同源性的其它蛋白相比对该靶蛋白较高的选择性来鉴别对靶蛋白具有亚nM亲和力的aptamer(Tuerk &Gold，1990年，同上；Green等，1991年，同上；Gold等，1995年，同上；Uphof等，1996年，同上)。使用SELEX方法已生成了超过100个蛋白质和小分子的RNA或DNA aptamer，所述分子包括多巴胺(Mannironi等，1997年，《生物化学》36，9726-9734)，P物质(Nieuwlandt等，1995年，《生物化学》34，5651-5659)，人嗜中性白细胞弹性蛋白酶(Bless等，1997年，《当前生物学》7，877-880)，血小板衍生生长因子(PDGF)(Green等，1996年，《生物化学》35，14413-14424)，血管内皮生长因子(VEGF)(Green等，1995年，《化学与生物学》2，683-695)，凝血酶(Bock等，1992年，《自然》355，564-66)和L选择蛋白(O’Connell等，1996年，《美国国家科学院院报》93，5883-5887)。
许多aptamer已证实具有生物活性，通常是在体外和体内的受体拮抗作用或酶抑制作用。例如通过混合SELEX产生了对人嗜中性白细胞弹性蛋白酶(hNE)具有高亲和力和抑制活性的RNA aptamer(Bless等，1997年，同上)。经过SELEX后修饰提高了体内稳定性之后，检验肺炎大鼠模型中的aptamer(Bless等，1997年，同上)。在第二个例子中，生成了对蛋白质具有nM亲和力的人L选择蛋白的49个核苷酸长的DNA aptamer(O’Connell等，1996年，同上)。该aptamer对L选择蛋白显示出比对E选择蛋白高600倍的选择性，和比对P选择蛋白高10000倍的选择性。静脉注射aptamer的PEG制剂以剂量依赖性方式抑制了放射标记的人PBMC向淋巴结而不是其它器官的运输(Hicke等，1996年，《临床研究杂志》98，2688-2692)。在第三个例子中，形成了针对人VEGF的高亲和力的RNA aptamer，以研究VEGF在血管生成中的作用(Jellinek等，1994年，《生物化学》33，10450-10456；Green等，1995年；Puckman等，1998年，《生物化学杂志》273，20556-20567；Willis等，1998年，《生物缀合化学》9，573-582)。VEGF aptamer的脂质体制剂在体外抑制了VEGF诱导的内皮细胞的增殖，在体内抑制了血管渗透性的增加和血管生成(Willis等，1998年，同上)。因此，提供了用于本发明的OSM的寡核苷酸配体或OSM受体(OSMR、LIFR、gpl30)。
为了产生如上所述用于本发明的aptamer，OSM或受体必须首先与用于筛选的培养板结合。然后按照Fitzwater和Polisky的方法(《酶学方法学》267，275-301)进行选择和扩增重复循环(即SELEX过程)，以生成人OSM的RNA或DNA aptamer。一般这些aptamer是修饰RNA aptamer，因为RNA提供了最大的结构多样性，并由此提供生成高亲和力分子的可能性。生成了高亲和力的aptamer后，可以执行多种SELEX后优化方案，提高aptamer的稳定性；将该aptamer截短成更适合于固相合成的核心序列(aptamer一般是100聚物或更短)，由此降低合成成本；和开发体内使用的制剂。
在这些过程的开始，可以先将aptamer截短，从而将该分子的长度减少至活性所需的核心序列。通常在20至40个核苷酸长度内的短核心序列将更便宜而又迅速地合成，并且具有增加的生物利用率。有关该核心序列组成的信息可以从序列同源性对比获得。不过，截短实验通常涉及合成依次变短的aptamer，直至产生了活性所需的最小序列。这通常牵涉到要去除固定序列，但在许多实例中，固定序列中的核苷酸对aptamer的亲和力有影响(Fitzwater和Polisky，1996年，同上；Puckman J.等，1998年，《生物化学杂志》273，20556-20567；Green等，1995年，同上)。因此，本发明可提供一些aptamer，它们是选定aptamer的截短或延伸变型，或者是与选定aptamer的序列同源性大于70％的某个aptamer。
将许多碱基截短后，可以进行修饰实验，通过保护aptamer免受核糖核酸酶切割而提高其稳定性。在SELEX过程中，不可能包括2’修饰嘌呤碱，因为用于体外转录的T7聚合酶将不容许这种修饰。因此，SELEX后，为了提高aptamer的稳定性，通常在aptamer中用2’修饰嘌呤替代嘌呤碱。这种修饰通常是通过使用2’-O-甲基嘌呤进行的，尽管也可以使用其它修饰嘌呤包括2’-氨基嘌呤或2’-氟嘌呤(Ruckman等，1998年，同上；Green等，1995年，同上)。这种修饰必须逐步进行，因为在SELEX后，此修饰也可能导致亲和力的丧失(Green等，1995年，同上)。
截短和稳定化作用后，有可能生成非常大量的短的全修饰aptamer，它们可以借助于化学固态合成法合成。可以将许多分子加入到aptamer的5’端，以促进aptamer的应用，或配制用于体内释放的aptamer。这包括帮助成象的茏形部分(Hnatowich D.J.，(1996)Q，《核医学杂志》40，202-8)，帮助分子检测的荧光素(German等，1998年，《分析化学》70，4540-5)，帮助插入到脂质体中(Willis等，1998年，同上)或与小分子药物或肽缀合(Charlton J等，(1997b)，《生物化学》36，3018-3026)的脂基。通常，在aptamer的5’端加入一个分子不会导致亲和力或特异性的丧失。
为了提高体内半衰期，通过加入聚乙二醇(PEG)分子或通过引入到脂质体中对aptamer进行修饰。在这两种情况下，这样的修饰都可使体内半衰期明显增加(Willis等，1998年，同上)。
除了脂质体制剂以外，还用20K和40K的PEG配制aptamer，以增加其体内血清稳定性。已生成了针对人L选择蛋白的DNA aptamer。为了增加体内稳定性，将一个20K PEG酯通过N末端胺部分与aptamer偶联。该PEG缀合aptamer证实可阻断SCID小鼠体内的依赖于L选择蛋白的淋巴细胞运输(Hicke等，1996年，同上)。因此，提供了用于本发明的aptamer和载体分子例如PEG的缀合物。在该实施方案中，aptamer和载体将例如通过N末端胺部分连接。此外，还提供了用于本发明的、包含aptamer和释放分子例如脂质体的制剂或组合物。在该实施方案中，aptamer和载体之间可能没有连接，aptamer可简单地通过该载体胶囊化、分散或分配。
此研究中分离出的aptamer也可修饰后用作诊断分子，用于检测血清、组织或其它来自体内的样品中是否存在人OSM，或者用于在完整躯体的体内成象研究中检测人OSM(Charlton J等，(1997)，《化学与生物学》4，809-816；Hnatowich，1996年，同上)。可以将荧光素或其它荧光检测基团加入aptamer分子的5’端，以帮助某些应用中的荧光检测，所述应用是诸如FACS(荧光激活细胞分选)(Davis KA.等，1996年，《核酸研究》24，702-6；Charlton等，1997年，同上)，ELONA测定(酶联寡核苷酸测定)(Drolet DW等，1996年，《自然生物工程》14，1021-1025)，以及其它诊断应用。锝-99m(Tc99m)螫合肽笼，诸如MAG3(Fritzberg A.R.等，《核医学杂志》1986：27，111-6)的出现已大大促进了各式各样分子(Kubo A.等，1998年，《Kaku Igaku》35，909-28)和大分子(Taillefer R.等，1995年，《欧洲核医学杂志》22，453-64)的使用，它们用于成象体内存在的靶蛋白大分子(Pallela V.R.等，1999年，《核医学》40，352-60)。图象借助于γ照相机显现出来，并已在从小鼠到人的各种各样的物种中实现这一点。新近对Tc99m螯合剂的修饰已使得能够在温和条件下更有效而稳定地标记分子(Hnatowich D.J.，1998年，《核医学》39，56-64)。放射性标记单链寡核苷酸的方法已经研制出来，已初步研究了这种未修饰的标记的寡核苷酸在体内的命运(Hnatowich，1996年，同上)。
当然，应当理解，用于本发明的、基于任何肽、蛋白质或核酸的拮抗剂将优选为纯化形式，即不含天然状态下与该分子伴随的物质或者由于制备过程引入的物质，特别是纯度大于70％，但更优选纯度大于80％或90％。
本发明的拮抗剂可以单独使用，或者与免疫抑制剂结合使用，所述免疫抑制剂是诸如类固醇(泼尼松等)、环磷酰胺、环孢菌素A或嘌呤类似物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤或类似物质)，或者与抗体诸如抗淋巴细胞抗体结合使用，或者更优选与耐受诱导剂、抗自身免疫剂或抗炎剂结合使用，它们是诸如CD4+T细胞抑制剂，例如抗CD4抗体(优选阻断抗体或非排除抗体)、抗CD8抗体、抗CD23抗体，TNF拮抗剂例如抗TNF抗体，或TNF抑制剂例如可溶性TNF受体，或者诸如NSAID或其它细胞因子抑制剂等试剂。
本发明拮抗剂的适宜剂量将根据多种因素而变化，所述因素是诸如要治疗的疾病、给药途径和要治疗的个体的年龄和体重以及拮抗剂的性质。不受任何特定剂量的限制，我们相信例如对于非肠道给药来说，治疗普通成人时合适的每日剂量可能是0.01-20mg/kg的本发明抗体(或其它大分子)(通常如上所示作为药物组合物的一部分存在)。更合适的剂量可能是0.1-5mg/kg，诸如0.1-2mg/kg。适宜的单位剂量将是1-400mg。有机小分子的适宜剂量与之类似，而寡核苷酸配体的适宜剂量将是例如0.1-10mg/kg。
本发明还提供了一种药物组合物，它包含可药用载体或稀释剂以及作为活性成分的本发明的拮抗剂，还可可选地包含另一种如上所述的治疗剂。本发明的拮抗剂及其药物组合物特别适用于非肠道给药，即皮下、肌内或静脉给药，但根据拮抗剂的性质，其它给药途径诸如口服、吸入、经鼻、局部或经关节给药也可能是更适当的。
用于非肠道给药的组合物一般将包含拮抗剂或其鸡尾酒合剂溶解于可药用载体中形成的溶液，所述栽体优选含水载体。可以使用各种各样的含水载体，例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸，等等。这些溶液是无菌的，一般不含微粒物质。这些组合物可以用常规的公知灭菌技术灭菌。按照要接近生理学条件的需要，该组合物可含有可药用辅助物质诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。按照所选定的具体给药方式，抗体或其它拮抗剂在这些制剂中的浓度可以在较宽范围内变化，例如从小于约0.5％，通常是或至少是约1％，直至差不多15％或20％重量，主要将在液体体积、粘度等基础上进行选择。
因此，用于肌内注射的典型药物组合物可以制成含有1ml无菌缓冲水和50mg拮抗剂。用于静脉输注的典型组合物可以制成含有250ml无菌林格溶液和150mg本发明的抗体或其它拮抗剂。对于本领域技术人员来说，可非肠道给药组合物的实际制备方法是公知或显而易见的，并且在例如《Remington’s药物科学》第15版，Mack出版公司，Easton，Pennsylvania(1980)中作了更详细的描述。上面讨论了核酸拮抗剂的适宜制剂。
本发明的蛋白质拮抗剂诸如抗体可以冻干储存，并在使用前用合适的载体重新配制。采用免疫球蛋白的该技术已显示是有效的。可以采用任何适宜的冻干和重配制技术。本领域技术人员将理解，冻干和重配制可导致不同程度的抗体活性损失(例如，采用常规免疫球蛋白时，IgM抗体比IgG抗体容易产生更大的活性损失)，因此必须调整使用浓度以补偿这一损失。
该组合物可以按照治疗医师选定的剂量水平和模式单次或多次给药。无论如何，该药物制剂应当提供足以有效治疗患者的适量的本发明抗体或其它拮抗剂。
本发明的范围内包括一种用于确定与OSM结合的特定试剂是否能用于治疗炎性疾病的检定法。因此，本发明包含一种用于鉴定OSM拮抗剂的检定法，该方法包括使OSM与待测试剂结合，并测定该试剂是否能阻断OSM与OSM受体之间的相互作用，或是通过标记分子的差异表达影响OSM的生物活性。
为了选出上述用于本发明的拮抗剂，首先必须得到OSM、呈递在载体上或是其中结合位点已被限定方式的上述OSM的关键结合残基(“OSM结合部分”)、或OSM受体。可以基于EMBL序列(登记号M27288)合成产生编码人OSM的cDNA，将其克隆到适当的表达载体中，用于转化适宜的宿主诸如大肠杆菌。然后从培养基中纯化得到人OSM蛋白质，并将其结合到用于筛选的培养板上。
OSM、OSM结合部分和/或OSM受体可以用于评定例如细胞、无细胞的制剂、化学文库和天然产物混合物中，小分子底物与配体的结合情况。因此，本发明提供了一种用于鉴定OSM拮抗剂的检定法，该方法包括让OSM与待测试剂接触和测量结合情况。这些底物和配体可以是天然底物和配体，也可以是结构或功能模拟物。这些分子包括在OSM拮抗剂的定义内。筛选方法可能与高流通量有关。例如，为了筛选拮抗剂，可以从表达OSM受体的细胞制备合成反应混合物、细胞区室诸如细胞膜、细胞包膜或细胞壁、或上述任何一种物质的制剂。然后该制剂在有或没有候选分子存在的条件下用标记的OSM温育。候选分子结合OSM受体的能力反映为标记的OSM的结合减少。义务结合的分子，即不诱导OSM的功能作用的分子，是最有可能的良好拮抗剂。此检定法可以反向进行，标记的OSM受体可以与未标记的OSM一起使用。也可以用另一种采用ELISA形式的筛选来鉴别OSM拮抗剂，此时，对候选分子阻止OSM受体缀合物诸如gp130-Fc融合蛋白与固定于培养板上的OSM结合的能力进行测量。在该检定法中，结合gp130-Fc借助于酶标记的抗Fc抗体和比色测定法进行检测。
例如，通过测定候选分子与细胞或适宜的细胞制剂相互作用后受体系统的活性，并将结果与采用OSM或对OSM显示出相同作用的分子获得的结果进行比较，就可以测量出潜在拮抗剂的功能作用。可能在这方面有用的报道系统包括但不限于：转变到产物中的比色标记的底物，对OSM受体功能活性的变化敏感的报道基因，和本领域中公知的结合测定。
附图：
图1a：滑膜活检培养物中，显示制瘤素M的来自体内的分泌的ELISA。
图1b：在发炎滑膜的培养物中，制瘤素M的来自体内的自发分泌，而在未发炎滑膜的培养物中则没有。
图2：在PMA分化的THP-1细胞中，rhOSM对TNFα生成的作用。
图3a和3b：OSM与TNFα促进来自体内的胶原释放的协同作用。
图4a：抗L选择蛋白抗体介导的OSM的分泌。
图4b：岩藻多糖诱导的OSM分泌。
图5a-d：使用gp130 P和E选择抗体，证实RA血管内皮染色的显微照片。
图6：来自对照和CII关节炎小鼠的关节中的OSM RNA信息。
图7：用山羊抗OSM抗体或对照山羊IgG处理的关节炎DBA-1小鼠。7a=临床打分。7b=爪厚度。
图8：胶原诱导的关节炎小鼠中，关节浸润和软骨损害的组织学对比数据。
8a和8b：对照小鼠显示出PMN和单核细胞对关节的广泛浸润(8a)和关节软骨的表面破坏，特征是普遍的嗜中性白细胞浸润(8b)。
8c和8d：用抗OSM处理过的正常/轻度关节炎动物的典型关节，显示了水平明显降低的细胞浸润，有完整的关节软骨。
图9：对N-(1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-4-基)苯甲酰胺的HepG2 B6sPAP和MTS测定，显示了对OSM诱导的sPAP释放的浓度依赖性抑制。
图10：对N-(1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-4-基)苯甲酰胺的TNFαsPAP和MTS测定，显示了对TNFα诱导的从A549细胞释放sPAP的有限抑制。
图11：HepG2 B6测定中，对sPAP生成的抗体抑制。M2-M4指示来自四只独立小鼠的血清；OM5-6.1、OM5-6.10、OM5-10.111指示实验产生的杂交瘤上清液。
图12：在ELISA中，野生型和突变型OSM-GST融合蛋白与束缚在培养板上的野生型OSM竞争与gp130-Fc结合。
图13：在HepG2细胞中，显示出最小的驱动sPAP生成活性的三种突变型OSM-GST的光密度图。
现在将利用实施例仅参照附图来描述本发明；其中：
实施例1：检测来自体内的滑膜组织培养物中的OSM。
实验1：
使用无菌皮下注射针将从被诊断为患有类风湿性关节炎、骨关节炎或拇趾囊肿的患者身上新近切除的滑膜组织机械切割成大约1mm3的片段。将它们置于96孔组织培养板(Costar)的200μl平底池中，向该培养板中加入添加有10％热灭活的AB+雄性血清(North LondonBlood Transfusion Centre)、10mM hepes、1％丙酮酸钠、1％非必需氨基酸(均来自Sigma)、4mM L-谷氨酰胺(Hyclone)、100U/ml青霉素+100μg/ml链霉素(Hyclone)的PRMI 1640(Sigma)(完全人类培养基，CHM)，在37℃下温育。
在20℃下冷冻的第0、2、5和9天时，收集100ul/孔的培养物上清液样品，然后借助于ELISA检验OSM。图1a中显示了(QuantikineR&D Systems)数据。在来自于RA的滑膜样品中检测到了分泌的OSM，但在来自于OA或无关节炎的对照患者的滑膜中未检测到。在温育的第5天左右，OSM在RA组织培养物中的含量最大，达到大约1400pg/ml浓度，并且在第9天时仍保持大于800gp/ml。
实验2：
滑膜组织用PBS清洗并去除脂肪组织。用无菌剪刀将该组织剪成小(1-4mm)片段。此组织在使用前用PBS清洗。将该组织称重后直接铺板到24或48孔培养板(Costar)上，每孔100mg。该组织在37℃和5％CO2条件下，在添加有10％热灭活的AB+人血清(Sigma)、2mML-谷氨酰胺(Life Technologies)、200U/ml青霉素和200μg/ml链霉素(Life Technologies)、480U/ml制霉菌素(Sigma)、50μg/ml庆大霉素(Life Technologies)和10mM Hepes(Sigma)的1.5mlDulbecco改进的Eagle培养基(Sigma)中培养，过滤灭菌。第3天时取出上清液，使用成对抗体(R&D Systems)用ELISA检验OSM。
来自RA或炎性OA患者膝部活检的滑膜组织培养物自发地分泌OSM。温育了3天后，来自RA培养物的培养物上清液中OSM的平均含量是246pg/ml(从30至982，n=12)，来自OA培养物的是473pg/ml(从44至2001，n=14)。炎性滑膜组织分泌OSM，而静止滑膜组织则不分泌(图1b)。
实施例2a：THP-1细胞的分化
使人前单核细胞系THP-1细胞(ECACC)每周两次通过添加了10％热灭活的FCS、10mM hepes、1％非必需氨基酸(均来自Sigma)、4mML-谷氨酰胺(Hyclone)、100U/ml青霉素+100μg/ml链霉素(Hyclone)的RPMI(完全培养基，CM)，然后以1ug/ml的浓度加入PMA(Sigma)洗涤细胞，并在37℃下温育30分钟。细胞用预热的PBS洗涤三次，再悬浮于CM中，以1.5×105细胞/ml的密度铺板到96孔平底培养板(Costar)中。培养板在37℃、5％CO2条件下温育48小时，然后用PBS洗涤，置换培养基，再温育24小时。细胞在使用前用PBS洗涤1次。
实施例2b：制备IFNγ刺激的血液单核细胞
人血沉棕黄层(North London Blood Transfusion Centre)用PBS 1∶3倍稀释，分层堆积到Lymphoprep(Nycomed UK)上，在室温下以600xg离心30分钟。收获的PBMC用PBS洗涤3次，计数，以5×106细胞/ml的密度再悬浮于80ml RPMI 1640/10％FCS中。向4个175cm2的烧瓶中各加入20ml并在37℃下温育过夜，使单核细胞粘附。用冰冷的维尔烯在4℃温育15分钟后，弃去未粘附的细胞，刮下粘附细胞。这些细胞用PBS洗涤2次，以6.9×105细胞/ml再悬浮于RPMI 1640+10％热灭活的人血清(Sigma)中，向96孔平底培养板(Costar)的每个孔中加入250μl细胞悬液。向培养板的一半孔中加入100IU/ml IFNγ(Genzyme)，剩下的另一半作为对照。测定前，培养板在37℃、5％CO2条件下温育过夜。
实施例2c：刺激TNFα释放：
从R&D Systems购得冻干的重组人制瘤素M(rhOSM)，用无菌PBS+0.1％BSA(Sigma)将其稀释成10μg/ml，等分试样在-20℃下储存直至使用。将rhOSM、大肠杆菌衍生的LPS或CM加入到一式三份的加有如上制备的巨噬细胞、单核细胞或Thp-1细胞的孔中，在37℃、5％CO2条件下温育7小时。收获上清液，在-20℃下冷冻，直至借助于ELISA检验TNFa蛋白质。在设计用于共同测定TNFαmRNA的测定中，细胞如上温育4小时，用PBS洗涤1次，在RNA提取缓冲液(RNAzole)中裂解。
如下所述检测RNA。按照制造商的指示制得总RNA并在-80℃下储存于DEPC处理的水中。对于RT-PCR，使用寡dT引发(第一链cDNA合成试剂盒，Pharmacia Biotech)将大约1ug RNA逆转录，所得cDNA使用下列TNFα的引物(Clontech扩增引物)经历30次PCR循环：正向-GAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCA(SEQ ID 1)，反向-GCAATGATCCCAAAGTAGACCTGCCCAGAC(SEQ ID 2)。扩增产物(444bp)利用琼脂糖胶(2％)电泳分离，用溴化乙锭染色法显现出来。
实施例2d：在单核细胞谱系的人细胞中，OSM诱导TNFα生成
使用PMA诱导人前单核细胞系Thp-1分化，将其充分洗涤，如上所述用重组人OSM温育。第8小时的时候取出培养物上清液，借助于特异性ELISA(TNF Quantikine，R&D Systems)按照制造商的指示检验TNFα的产生情况。OSM诱导TNFα的剂量相关释放，可测量的值在1ng/ml OSM之上，最大为200-500ng/ml，常规达到的分泌水平大于2500pg/ml TNFα。典型实验显示在图2中。如上所述借助于RT-PCR测量的TNFα信息的表达，在用100ng/ml OSM温育了4小时的THP-1细胞中相对于未刺激的对照细胞有显著增加(图2)。
重要的是，TNFα的诱导不是由于污染内毒素的作用，因为OSM的预先煮沸完全切除了TNFα的分泌(数据未显示)。而且，使用特异性抗体借助免疫沉淀除去OSM后也消除了活性(数据未显示)。这些发现进一步扩展到包括用干扰素-γ预先活化的人血液单核细胞，和在培养物中分化了7天的人血液巨噬细胞。这两种细胞型，当与OSM共温育8小时后，借助ELISA测量显示它们分泌了TNFα。单核细胞分泌的TNFα的平均值为1447pg/ml(范围从137-4709pg/ml；n=4个供体)，巨噬细胞分泌的均值为542pg/ml(范围从62-1428pg/ml；n=3个供体)。
实施例3a：软骨降解测定
牛屠杀后，将其鼻中隔软骨在4℃下保存过夜。从2mm切片上切下直径2mm的圆片，用HBSS洗涤2次。在24孔平板(Costar)的每个孔中放入3个圆片，在37℃、5％CO2条件下，在600μl体积的含有25mM HEPES并添加了2mM谷氨酰胺、100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素和2.5μg/ml两性霉素B的DMEM(Sigma)(软骨降解培养基，CDM)中温育24小时。软骨以一式四份在下列培养基中培养：单独的600μl CDM，单独的2、10或50ng/ml人重组TNFα，单独的10ng/mlrhOSM(R&D Systems)或TNFα+OSM，并在37℃、5％CO2条件下温育7天。收获上清液，用含有与第1天时相同的测试试剂的新鲜培养基置换旧培养基。该实验再继续进行7天，第14天时，除去所有的培养基，剩余的软骨用含有5mM EDTA和5mM盐酸半胱氨酸的、用0.1M磷酸缓冲液pH6.5配制的4.5mg/ml木瓜蛋白酶(Sigma)消化，在65℃温育16小时，从而确定该软骨片段中剩余的羟脯氨酸含量。第14天时，如下所述测量释放到培养基中的羟脯氨酸的累积含量，并表示为总释放量的百分数。
实施例3b：羟脯氨酸测定
使用(Bergmann I和Ioxley R.(1963)《分析生物化学》35，1961-1965)中的微量滴定板改进法测定羟脯氨酸的释放(作为胶原降解的量度)。用醋酸柠檬酸缓冲液(每升水中加57g醋酸钠，37.5g柠檬酸三钠，5.5g柠檬酸，385ml丙-2-醇)将氯胺T(7％，w/v)稀释1∶4倍。用丙-2-醇将对二甲氨基苯甲醛(DAB；20g溶于30ml 60％高氯酸)稀释1∶3倍。样品在105℃下在6M HCl中水解20小时，水解产物使用Savant Speed Vac借助于NaOH真空干燥而中和。将残余物溶于水，向微量滴定板中加入40ul样品或标准物(羟脯氨酸；5-30ug/ml)和氯胺T试剂，4分钟后加入DAB试剂(150ul)。将滴定板加热至65℃达35分钟，冷却并在560nm测定吸光度。
实施例3c：OSM与TNFα来自体内地协同增加MMP1和胶原从软骨外植块的释放。
如上所述，牛鼻软骨一式四份在有或没有单独的OSM或TNFα(二者均来自R&D Systems)或二者的混合物的条件下培养14天。第7天时，测定培养物上清液的总胶原酶活性，第14天时，测定所释放的胶原。图3b的数据表明，分别以10ng/ml或50ng/ml使用的单独的OSM或TNFα均没有诱导明显的MMP1分泌。但是，以这些浓度使用的OSM和TNFα的混合物却诱导了可测量的MMP1释放。在这些发现的同时还发现OSM和TNFα之间对于增加胶原从软骨的释放有显著的协同作用。图3a显示，10ng/ml的单独的OSM没有诱导胶原释放，仅有以最高浓度(50ng/ml)使用的TNFα具有很小但可证明的作用(小于10％)。但是，10ng/ml OSM与50或10ng/ml TNFα的混合物分别导致了大于80％和30％的胶原释放。
实施例4a：经L选择蛋白刺激PBMC
如上所述从人血沉棕黄层分离得到单核细胞。5×105细胞以0.5ml体积涂敷，在37℃、5％CO2条件下，与60-80 kD M.wt.岩藻多糖(Sigma)抗L选择蛋白单克隆抗体，LAM1-3和TQ1或同种型匹配的对照IgG抗体(均来自Coulter)一起温育24小时。使用特异性ELISA测定(Quantiline,R&D Systems)按照制造商的指示检测上清液中的OSM。
实施例4b：L选择蛋白的连接反应诱导OSM分泌
来自健康供体的单核细胞与抗人L选择蛋白抗体(TQ1或LAM-1)或同种型匹配的对照抗体一起温育24小时，利用ELISA测定培养物上清液中的OSM。图4a中的数据显示了使用两种抗L选择蛋白抗体产生的对OSM的剂量依赖性诱导。对照抗体的作用最小。然后研究L选择蛋白刺激岩藻多糖从单核细胞培养物诱导OSM的能力。图4b显示，岩藻多糖是OSM分泌的强刺激剂，诱导产生的含量与在RA和OA滑膜活检培养物(实施例1，实验2，图1b)中观察到的类似。
实施例5a：免疫组织化学
新鲜的人组织样品在CO2冷却的液态己烷中冷冻并储存于汽相液氮中，直至使用。将7mm低温控制切片切割到涂敷有3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APES)(Maddox P等，《临床病理学杂志》40；1256-1260，1987)的载玻片上，在4℃下用2％多聚甲醛固定10分钟。用0.05％H2O2将内源过氧化物酶活性阻断20分钟。从以下来源得到未缀合的第一单克隆抗体：CD62P，CLB，荷兰；CD62E和gp130，R&D Systems，英国。第一抗体以最佳稀释度在室温下应用45分钟。阴性对照切片与抗BrdU单克隆抗体(SIGMA)一起温育，所用的BrdU单克隆抗体的蛋白质浓度与待测抗体的相等。先用生物素化第二抗体、再用过氧化物酶标记的ABC(Vector Elite)标记该第一抗体。过氧化物酶用DAB(3，3’二氨基联苯胺)底物(SIGMA)显色。
实施例5b：选择蛋白和OSM受体在RA滑膜中的共同分布
如上所述，炎性RA滑膜组织的冷冻切片使用gp130的特异性抗体以及P和E选择蛋白染色。图5中的显微照片(a)显示，RA血管内皮对于gp130显著地阳性染色。
关于P和E选择蛋白表达的RA滑膜的染色显示出与gp130相同的染色模式，局限于血管内皮细胞(分别见图5b和5c)。注意在图5c中，血管周单核细胞浸润与E选择蛋白染色联合。使用对照第一抗体的系列切片的染色对于血管内皮细胞是阴性的(图5中的图片c和d)。
实施例6a：对胶原诱导的关节炎的抗OSM抗体治疗。
如以前所描述的(Plater-zyberk C.，《临床与实验免疫学》98：442-7，1994和Plater-zyberk C.《自然医学》1：781-5，1995)，通过用天然牛Ⅱ型胶原(CⅡ)接种而使雄性DBA/1小鼠(8-12周龄)产生胶原诱导的关节炎。从CⅡ免疫接种后的第16天开始，每日监测小鼠关节发红和肿胀的迹象。从第一次出现临床症状开始，小鼠每周检查3次，使用以下目测打分表对每个肢体的疾病严重度分级：0=正常；0.5=有2个或多个趾出现关节炎；1=爪轻微肿胀和红斑，没有牵连到趾；1.5=与1相同，牵连到趾；2=脚爪出现更明显的肿胀和红斑，但没有牵连到趾；2.5=与2相同，牵连到趾；3=严重肿胀，活动减少；3.5=与3相同，牵连到趾。使用卡钳(Proctest2T，Kroeplin Langenmesstechnik)测量脚爪的厚度。
CⅡ免疫接种的DBA/1小鼠的疾病临床发作后，通过腹膜注射100mg山羊抗小鼠OSM抗体(R&D Systems,cat.no.AF-495-NA)进行治疗。如上所述评定疾病的进程。发作后第14天时，利用颈椎脱位将小鼠处死，收集脚爪用于组织病理学检验。
实施例6b：对关节炎小鼠关节的组织学评定
剥去腿上的皮肤，切下膝盖和脚爪。关节在10％缓冲福尔马林中固定4天(膝盖)或1天(脚爪)，用25％甲酸脱钙3天，脱水并嵌入石蜡中。将这些关节的矢状切片(5-7mm)脱蜡并用番红O、固绿/铁苏木精复染剂染色(如同上面Palter-Zyberk在《自然医学》中所述)。滑膜炎盲目地分为0(没有浸润)到3级(广泛浸润和滑膜增生)。指示软骨蛋白多糖缺失的番红O染色强度的损失程度计分为0(完全染色的软骨)到3(软骨完全缺失和损失)。
实施例6c：检测胶原关节炎小鼠关节组织中的OSM mRNA。
将关节炎小鼠和未处理的对照小鼠处死，取下它们的脚爪和足，在液氮中迅速冷冻，然后储存于-80℃。使用ultraturrax机械匀浆器在PNAzole中研磨每个肢体而制备RNA。使颗粒物质沉降，然后将上清液与1/10体积的氯仿混合并旋转，以分离出含有RNA的水相。RNA使用RNAmate(BioChain Institute Inc，San Leandro，California)沉淀，以除去污染的蛋白多糖。用75％乙醇洗涤后，将总RNA溶于DEPC水，使用Pharmacia第一链eDNA试剂盒和寡dT引物进行逆转录。使用衍生自小鼠OSM序列的下列引物(LifeTechnologies特制引物)进行PCR反应(Yoshimura A.等，《EMBO杂志》15，1055-1063，1996)：GGGTGTCCTACCAAGGAACA(SEQ ID 3)，CTGAGACCTTTCAAGAGGAC(SEQ ID 4)。30次PCR循环后，使用琼脂糖胶电泳检测反应产物(379bp)。如上所述，用RT-PCR检测关节炎小鼠脚爪中的OSM mRNA。图6显示，随着临床疾病得分的逐渐升高，在这些动物的关节中，OSM特异性PCR产物的含量也逐渐增加。与此相比，在对照动物中检测到很少或没有检测到OSM信息。
实施例6d：中和OSM改善了胶原诱导的关节炎状况
为了直接检验有关中和有可能改善关节炎的临床症状的假设的正确性，在一个包括6只小鼠的组中，在第一次出现关节炎临床症状后的第1天和第3天，腹膜内注射两次100μg的OSM的中和多克隆抗体。平行地，对第二个包括6只关节炎小鼠的组进行同样处理，但使用非免疫山羊IgG代替抗OSM。对小鼠关节炎的临床严重度打分，在第二次抗体注射后接下来的11天里，测量每个脚爪的肿胀情况。用对照山羊IgG处理的小鼠显现出进行性的关节炎，同时伴随有脚爪肿胀增加。
在显著性对比中，用抗OSM抗体处理的小鼠在临床打分和脚爪肿胀方面显示出显著更小的关节炎严重度(图7a和b)。而且，与IgG处理的对照动物相比，用抗OSM处理的小鼠，其关节炎脚爪的数目也显著减少了，这证实此治疗方案能有效地保护已确认患病的动物，使其疾病不再进一步发展(数据未显示)。使用每组7只小鼠以相同的方式重复该实验，得到了近似的匹配数据(数据未显示)。
用抗OSM抗体治疗后临床严重度的降低借助于在疾病发作后第14天对关节炎脚爪的死后组织学检查得以证实。图8中显示了用对照IgG或抗OSM抗体处理的胶原关节炎小鼠在第14天时有关关节浸润和软骨损伤的组织学对比数据。用IgG处理的对照小鼠显示关节被PMN和单核细胞广泛浸润(图8a)。还伴有关节软骨的表面破坏，特征是普遍的嗜中性白细胞浸润(图8b)。与之相比，图8c和d显示了用抗OSM处理的、关节炎非常轻微的动物的典型关节，证实细胞浸润的水平明显降低，有完整的关节软骨。此外，根据软骨和滑膜的组织病理学表现盲目地对关节打分，并报道为正常、中度或重度三级。对每个治疗组的总共73个独立的关节进行评定，数据总结于表1中。在用抗OSM处理的动物中，所检查的关节中有47％是正常的或显示出轻度滑膜炎，与此相比，在用IgG处理的对照组中仅为6％。类似地，在用抗OSM处理的小鼠中，所检查的关节中有58％显示出很小或没有软骨损害，而在用IgG处理的对照组中为21％。在处理的第1天时有明显的关节发红和肿胀症状的小鼠两次用抗OSM处理后，显示关节炎完全得到改善，且无论是软骨还是滑膜都没有显示细胞浸润或可见的异常现象(数据未显示)。
表1：用抗OSM或对照IgG处理的小鼠关节的组织学得分处理    正常/轻度       中度            重度
    软骨    滑膜    软骨    滑膜    软骨    滑膜抗OSM   58％    47％    21％    23％    22％    31％IgG     21％    6％     26％    37％    53％    57％
所检查的关节总数：73个关节/处理
实施例7：有机小分子拮抗剂的鉴定。
OSM的有机小分子拮抗剂借助于对来自报道细胞系的OSM诱导的生物应答的抑制而没有引起明显的细胞毒性得以鉴定。作为对照，还检验了化合物对TNFα敏感细胞系的作用。
实施例7a：人OSM的表达和纯化。
具有25个氨基酸前导序列的编码人OSM(hOSM)的DNA片段使用聚合酶链反应(PCR)从活化白细胞cDNA文库进行扩增，其中使用从hOSM的EMBL序列(登记号M27288)设计的合成寡核苷酸引物5’-GCATAGGATCCGCGGCTATAGGCAGCTGCTCG-3’(SEQ ID 5)和5’-ATCGCGAATTCCTACCGGGGCAGCTGTCCCCT-3’(SEQ ID 6)。将该PCR产物亚克隆到pCR2.1(Invitrogen)中，得到pCR2.1hOSM。
在细菌表达载体pGEX-3X(Pharmacia)的Xa因子部位中，通过使用“快速变化”位点定向诱变试剂盒(Stratagene)插入AC代替TG而制造一个SalⅠ限制性内切核酸酶切割位点，从而创造出下示序列(SEQ ID 7)：
                                    BamHⅠ        EcoRlAAA TCG GAT CTG ATC GAA GGT CGA CGG ATC CCC GGG AAT TCA TCGK    S   D   L   I   E   G   R   R   I   P   G    N    S    S(SEQ ID 14)
                     Factor Xa
经过对插入在pCR2.1hOSM中的OSM的序列测定后，编码成熟型人OSM的DNA从该载体开始PCR扩增，其中使用含有BsmBⅠ限制性内切核酸酶位点(下划线部分)的正向引物5’-GATACGATCGTCTCATCGAGCGGCTATAGGCAGCTGC-3’(SEQ ID 8)和含有EcoRⅠ位点(下划线部分)的反向引物5’-ATTACATGGAATTCCTATCTCCGGCTCCGGTTCGG-3’(SEQ ID 9)。该PCR产物含有成熟型人OSM，但不含前导序列且不含从C末端开始的31个氨基酸，它们已随着蛋白质的成熟而除去。PCR之后，将扩增的DNA片段纯化，用限制酶BsmBⅠ和EcoRⅠ消化，并亚克隆到已用SalⅠ和EcoRⅠ限制的修饰pGEX-3X载体(Pharmacia：含有编码GST的DNA)中，生成一个质粒，称为pGEX 196。经过测序证实后，将质粒pGEX196转化到大肠杆菌BLR-DE3(Novagen)中。该转化细胞在添加了100ug/ml氨苄青霉素的2xYT+G培养基(胰胨16g/l；酵母提取物10g/l；NaCl 5g/1；用NaOH调至pH7.0；2％葡萄糖)中培养。
为了制备纯蛋白质，将在大肠杆菌BLR-DE3中的pGEXl96的过夜培养物稀释1∶100倍，该培养物在37℃下生长，直至A600nm为0.8。通过加入0.1mM IPTG(异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷)诱导GST-hOSM融合蛋白的表达，该培养物再保持2小时。
通过分批式纯化从大肠杆菌培养物分离出GST-hOSM。通过在3000rpm下离心收获3升细菌培养物，所得颗粒再悬浮于含有蛋白酶抑制剂片剂(Boerhinger)的50ml冰冷的PBS(磷酸缓冲盐水)中。加入5ml溶菌酶，该细胞悬液在冰上培养5分钟。这些细胞在4℃下超声处理，加入1％Triton X100和10mM二硫苏糖醇。该溶菌产物在4℃下不断混合10分钟，然后在14000g离心。将上清液加入谷胱甘肽琼脂糖(Sigma cat n0.G4510)，在4℃下不断混合30分钟。将该悬液轻轻地离心，抽出上清液，沉降的琼脂糖用冰冷的PBS清洗两次。加入洗脱缓冲液(20mM谷胱甘肽，100mM Tris pH8.0，100mM NaCl；再次调至pH8.0)，该悬液在冰上培养5分钟。收集上清液，各级分利用十二烷基硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析，接着用考马斯亮蓝染料染色，以确认纯蛋白质的完整性。
使用Xa因子和凝血酶建立蛋白水解切割优化实验，利用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析证实凝血酶产生了最佳量的h0SM。利用离子交换层析实现GST和OSM产物的分离，通过N末端测序和质谱检定纯OSM产物。
实施例7b：HepG2 B6：OSM诱导的sPAP测定
HepG2细胞系(ECACC)如下所述用sPAP(分泌型胎盘碱性磷酸酶)cDNA上游的六个功能性STAT3反应元件(RE)稳定地转染形成HepG2B6。STAT3(信号转导及转录活化蛋白)是IL-6细胞因子族胞内信号级联中的一个中间体，细胞表面受体二聚化后，将STAT3磷酰化，然后与核中的DNA RE结合并激活DNA下游，在此构建物中，DNA是sPAP。于是，可以通过用制瘤素M过夜培养而驱动此细胞系生成sPAP。
如下所述构建STAT效应分泌型胎盘碱性磷酸酶(sPAP)报道基因。一开始，将含有三个回文STAT3反应元件拷贝的寡核苷酸对(Wegenka U.M等，《分子与细胞生物学》1993，第13卷，276-288页，277页上的表1)和一个5’Xhol位点克隆到质粒pBluescripttkSPAP的单一Sal1位点中形成pllP3-tk-SPAP。然后将另6个在血纤蛋白原β启动子中发现的编码STAT3反应元件的合成寡核苷酸(Dalmon等，《分子与细胞生物学》1993年；13：1183-1193，图9，hβFG序列，包括IL6RE共有基元和TTG前导区，没有GAT尾部)的拷贝克隆到pllP3-tk-SPAP的Xhol位点中生成pllx6/llP3-tk-SPAP。经过测序确认了反应元件的数目后，pllx6/llP3-tk-SPAP用Nrul和Xbal消化，以分离出含有9STAT反应元件和tk-SPAP编码序列的DNA片段。随后将其转移到质粒pcDNA4(Invitrogen)的Nrul和Xbal位点之间(替换CMV启动子)，制成含有9 STAT3反应元件和SPAP报道基因，和用于HepG2细胞系建立的NeoR可选标记。
HepG2细胞(ECACC)在37℃、5％CO2气氛、92％湿度下，在添加了2mM L-谷氨酰胺、1％NEAA和10％HI胎牛血清的DMEM培养基中生长。为了用STAT-sPAP报道基因转染，将细胞以1％汇合铺板到10cm组织培养皿中，使用磷酸钙转染试剂盒(Invitrogen)用10ugSTAT-sPAP报道基因载体转染。在1mg/ml G418存在条件下进行了克隆选择后，针对IL-6使来自于STATsPAP报道基因的sPAP的表达增加的能力，对独立的细胞系进行筛选。
将在100μl培养基(DMEM(Sigma)，10％HTFCS，1％非必需氨基酸，2mM谷氨酰胺，500μg/ml G418(均来自Life Technologies))中的HepG2B6细胞铺板到96孔平板中，使终浓度为3×104细胞/孔。使细胞平衡48小时。用DMSO将推定的抗OSM固体化合物制成20mM的母稀释液，并用DMSO系列稀释1∶3倍。然后再进一步用HepG2B6测定培养基(此培养基与上面的培养基类似，但是用1％热灭活的FCS，低碱性磷酸酶活性(Life Technologies)替换了10％ HI FCS)稀释。将化合物从最高浓度200μM开始按1∶3倍稀释，直至其在1％终浓度的DMSO中的终浓度为0.09μM。(即200、66.67、22.22、7.41、2.47、0.82、0.27、0.09和0μM)。除去孔中的旧培养基，替换为还含有2ng/ml OSM(R&D Systems)的稀释化合物。细胞再培养20小时。每种稀释液以一式三份进行实验。从每个孔中取出20μl培养基，使用pNPP(对硝基苯基磷酸酯；Sigma)作为底物测定sPAP的活性。用L-高精氨酸阻断内源碱性磷酸酶。在405-650nm读取底物的光密度。将化合物的浓度对作为生成的sPAP的量度的光密度作图，并可对其进行分析以确定IC50值。
实施例7c：A549细胞：TNFα诱导的sPAP测定
该测定使用已用报道基因稳定转染的A549细胞，包含与碱性磷酸酶偶联的E选择蛋白基因的细胞因子反应区(Ray等，《生物化学杂志》328：707-715，1997)。通过用TNFα培养过夜可驱动此转染细胞系产生sPAP。
将存在于100μl培养基中的A549细胞铺板到96孔平板中，使终浓度为5×104细胞/孔。使细胞平衡24小时。用DMSO将推定的抗OSM固体化合物制成20mM的母稀释液，并用DMSO系列稀释1∶3倍。然后再进一步用培养基(DMEM，1％热灭活的FCS，低碱性磷酸酶活性，1％非必需氨基酸，2mM谷氨酰胺，500μg/ml G418(均来自LifeTechnologies)稀释，使在1％终浓度的DMSO中产生0.09-200μM浓度反应。除去孔中的旧培养基，替换为还含有3ng/ml TNFα(R&DSystems)的稀释化合物。细胞再培养20小时。每种稀释液以一式三份进行实验。从每个孔中取出20μl培养基，使用对硝基苯基磷酸酯(Sigma)作为底物测定sPAP的活性。用L-高精氨酸(Sigma)阻断内源碱性磷酸酶。在405-650nm读取底物的光密度。将化合物的浓度对作为生成的sPAP的量度的光密度作图，并可对其进行分析以确定IC50值。
实施例7d：细胞活力测定
细胞活力测量为脱氢酶在代谢活性细胞中将四唑化合物(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，内盐；MTS还原为可在490nm直接测量的可溶性甲_产物的能力。
用Dulbeccos PBS制备含有0.046μg/ml甲硫酸吩嗪(PMS；Sigma)的2mg/ml MTS(Promega)的溶液。取出用于sPAP活性测定的培养基后，加入20μl/孔MTS/PMS。细胞再温育45分钟。使用630nm对照测量490nm的吸光度。
实施例7e：拮抗剂
N-(1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-4-基)苯甲酰胺(Davoll和Kerridge，《英国化学会志》2589，1961年)(GW 340442X)对OSM诱导的sPAP释放产生了浓度依赖性抑制，IC50为0.3μM(图9)，但对TNFα诱导的sPAP的抑制效力要小得多(IC50值约为92μM)(图10)。因此该化合物对OSM具有比对TNFα高100倍的选择性。
实施例8a：抗人OSM抗体的产生和检验
如下所示在小鼠中产生针对人OSM(R&D Systems)的单克隆抗体；SJL雄性小鼠(Jackson Inc.Bar Harbor，MA)用重组人OSM(R&D Systems)免疫接种，同时，或者在第0、3、5和24天时，皮下注射用RIBI佐剂(RIBI，Hamilton，MT)乳化的1μg重组人OSM抗原和腹膜内注射在Freund’s完全佐剂中的1μg抗原(第27天时，小鼠腹膜内注射1μg在盐水中的抗原)；或者在第0、3、5、24和53天时，腹膜内注射用RIBI佐剂乳化的1μg抗原(第54天时，小鼠腹膜内注射1.5μg在盐水中的抗原)。
最后一次接种24小时后，将小鼠处死，收获并制备用于融合的脾细胞。融合过程如Su J-L等在《杂交瘤》1998年，17(1)：47-53中所述。简言之，脾细胞和骨髓瘤细胞P3X63Bcl-2-13(KilpatrickKE等，《杂交瘤》1997年，16(4)：387-395)使用聚乙二醇1500(Boehringer Mannheim，Germany)以5∶1或1∶1的比例融合。将融合细胞以1×106细胞/ml再悬浮于杂交瘤生长培养基中，该培养基由等体积的RPMI 1640(Life Technologies，Inc.，Gaithesberg，MD)和EXCELL-610(JRH Biosciences，Lenexa，KS)组成，还添加了10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)，1 X Origen杂交瘤克隆因子(Igen，Gaithersburg，MD)，2mM L-谷氨酰胺，和青霉素/链霉素。细胞以1ml/孔铺板在24孔微量滴定板(Costar，Cambridge，MA)上。24小时后，向每个孔中加入1ml 2x HAT-选择培养基；存在于杂交瘤生长培养基中的100μM次黄嘌呤，0.4μM氨基蝶呤，16μM胸腺嘧啶(Life Technologies)。在37℃、5％CO2条件下培养2周后，利用ELISA筛选出分泌抗OSM抗体的杂交瘤上清液。对选定的杂交瘤进行有限稀释克隆。
杂交瘤上清液和稀释血清在含有结合人OSM的96孔平板中温育。利用碱性磷酸酶抗小鼠抗体检测抗hOSM抗体。表2中给出了产生阳性结果的抗体的光密度值，一式两份。
表2
杂交瘤 OD 1∶10 OD 1∶100 OD 1∶1000
OM5-6.1 1.3461.329 0.9010.929 0.3020.249
OM5-6.10 1.3471.434 1.0171.122 0.2960.352
OM6-10.111 1.771.615 1.0731.557 0.360.524
小鼠血清 OD 1∶500 OD 1∶2500 OD 1∶5000
M1 0.0060.006 00.001 0.0050.003
M2 1.8431.86 1.0861.052 0.730.794
M3 1.4051.338 0.4450.324 0.1980.217
M4 1.481.631 0.5370.484 0.180.18
在ELISA中，有三个上清液和除一个以外的所有小鼠血清都产生了阳性结果。利用ELISA数据确定抗体浓度的粗略估量值，然后用实施例7b中描述的HepG2 B6 sPAP测定，针对2ng/ml OSM对阳性抗体进行滴定。总之，抗体在4℃下用细胞因子培养过夜，之后用HepG2 B6细胞培养。如实施例7b中所述测定sPAP的生成。图11中显示了杂交瘤上清液和小鼠血清对sPAP生成的抑制。
实施例9a：OSM上受体的关键结合残基的鉴定。
最初，参照IL6族细胞因子的有关成员来鉴别hOSM上的受体结合位点。位点1和3被认为将牵涉到与受体的细胞因子特异性链的结合，而位点2被认为将牵涉到与普通受体组分gp130的结合。对在IL-6族细胞因子白血病抑制因子(LIF)(Hudson等(1996)，《生物化学杂志》271，11971-11978)、白介素-6(IL-6)(Paonessa等(1995)，《EMBO杂志》14，1942-1951和Savino等，(1994)，《EMBO杂志》13，1357-1367)中的位点2上的突变的研究提示，改变位点2中的残基可导致改变与gp130的结合。为了研究OSM的对其与gp130间的相互作用来说重要的残基，必需鉴别出在位点2区域中将被暴露在OSM表面的那些残基。使用来自核磁共振实验的信息(Hoffman等，(1996)，《J.Biomol.NMR》7，273-282)和已公开的LIF的结构(Robinson等，(1994)，《细胞》77，1101-16)构建一个OSM的同源性模型。在该模型中选择在位点2区域中的占据表面位置的残基用于诱变。生长激素(OSM的一个同系物)和其受体之间形成的复合物的结构已被确定(De Vos等，(1992)，《科学》255，306)。通过将OSM的模型与生长激素叠加，鉴别出了OSM和gp130之间的其它可能的相互作用位点。
在这些模型化研究的基础上，在OSM中选择27个位点用于突变，以研究其与gp130的相互作用。参见表3。在这些位点中的每一个上，用丙氨酸残基代替了野生型残基。
表3
位点 位置 备注
Ser 7 N末端区
Lys 8 N末端区
Glu 9 N末端区
Tyr 10 螺旋A
Arg 11 螺旋A
Leu 13 螺旋A 在当前模型中，这些亮氨酸的暴露是不明确的。如果残基17下面的螺旋中有变形，则螺旋1的上部可能旋转，这些残基被掩盖起来。
Leu 14 螺旋A
Leu 17 螺旋A
Gly 15 螺旋A
Gln 16 螺旋A 残基16-22是一段几乎连续的亲水残基，如果此时在下面的结构是螺旋状的，则它们中的一些可能被掩盖在蛋白质的核心中，并推测它们具有结合了氢的配对残基。或者，在此区域中的螺旋被扭曲，这些残基中的大多数是暴露的。
Gln 18 螺旋A
Lys 19 螺旋A
Gln 20 螺旋A
Thr 21 螺旋A
Asp 22 螺旋A
Gln 25 螺旋A
Asp 26 螺旋A
Met 113 螺旋C
Pro 116 螺旋C
Asn 117 螺旋C
Leu 119 螺旋C
Gly 120 螺旋C 侧链中没有功能，但人LIF的一个四重突变体影响gp130结合
Arg 122 螺旋C
Asn 123 螺旋C
Asn 124 螺旋C
Tyr 126 螺旋C
Gln 130 螺旋C
实施例9b：突变体OSM-GST融合分子的合成
为27个突变的每一个设计一对诱变寡核苷酸。它们大约有33个碱基长，并优选在两端具有G或C残基。将它们退火，在lac(/IPTG诱导型)启动子(Pharmacia)的控制下进行含有’野生型’OSM DNA(参见SEQ ID 12)的pGEX(Pharmacia)衍生的表达，并使用天然pfu聚合酶(Stratagene)扩展。原始模板DNA用Dpnl(New EnglandBiolabs)消化，将最近合成的质粒(它不是Dpnl的底物)转化到大肠杆菌菌株DH5α(GibclBBL/Life Technologies)中。精选一小组(一般是4个)菌落，分离出质粒DNA并测定DNA序列。将每种突变的典型突变体菌落以及类似的野生型转化到用于重组蛋白质表达的大肠杆菌菌株BLR(无DE3：Nowagen)中。确立0.51培养物并在OD550约为0.5时进行诱导。诱导3小时后，通过离心使细胞沉淀，使用溶菌酶和超声处理组合法进行裂解。既然重组突变体蛋白表达为带有GST的融合蛋白，于是用谷胱甘肽琼脂糖柱来结合该融合蛋白。然后使用游离谷胱甘肽从柱上洗脱融合蛋白，在室温下用10mm DTT温育4小时以除去肽加合物，在-80℃下储存。
实施例9c：在ELISA法中，点突变对OSM-GST与野生型OSM竞争结合gp130-Fc的能力的影响
Nunc免疫培养板(F6 Maxisorp，Life Technologies)用野生型OSM(按照实施例7a生产；50μl/孔，用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH9.4配制成lμg/ml)包被过夜(4℃)。洗涤培养板(用PBS 0.05％吐温20洗涤6次，使用Skatron Plate洗涤器)，轻拍干燥并阻断，以减少非特异性结合(200μl/孔，1％BSA/PBS)。(室温下，在摇动平台上)培养1小时后，将培养板轻拍干燥，加入野生型(wt)或来自实施例9b的突变体OSM-GST(50μl/孔，20-0.002μg/ml，用1％BSA/PBS滴定)。作为阳性对照，还检验了多克隆抗人OSM抗体(R&DSystems)(20-0.02μg/ml)。当试剂低于试验规定后，立即加入存在于1％BSA/PBS中的gpl30-Fc(如下生产，300ng/ml)和抗人IgG碱性磷酸酶缀合物的复合物(1∶500，Sigma)(50μl/孔)。(室温下，在摇动平台上)培养5小时后，洗涤培养板(6次)，并使用ELISA扩增系统(Life Technologies)按照制造商的指示进行显色，在490nm下测量光密度。在每个培养板上，利用gpl30-Fc/缀合物和OSM在1％BSA/PBS存在下测定总结合量，利用gp130-Fc/缀合物在没有OSM的条件下测定非特异性结合量，或测定在没有gp130-Fc的条件下结合OSM的缀合物。
编码人gp130的细胞外结构域的DNA借助于聚合酶链式反应(PCR)进行扩增，其中使用合成寡核苷酸引物，正向引物：5′CATCGGATCCAAGCTTTACAGTTACTGAGCACAGGACCTCACC SEQ ID 10
  BamHⅠ HindⅢ        5′UTR 序列ATGTTGACGTTGCAGACTTGM  L  T  L  Q  T(SEQ ID 15)和反向引物：5’CATCCTCGAGTTTCTCCTTGAGCAAACTTTGG SEQ ID 11
    XhoⅠ
这些引物是从人gp130的GenBank数据库序列(登记号M57230)设计的。正向引物含有BamHⅠ和HindⅢ限制性内切核酸酶位点，以及一个共有5’非翻译序列，接着是与gp130编码序列的起点互补的DNA序列。反向引物含有一个XhoⅠ限制性内切核酸酶位点，接着是与gp130编码序列的细胞外结构域的3’端互补的NDA序列。将该PCR片段纯化，并亚克隆到pCR2.1(Invitrogen)中，产生pCR2.1gp130。
质粒pCR2.1gp130用限制酶BamHⅠ和XhoⅠ消化，将gp130片段纯化，并亚克隆到质粒的BamHⅠ和XhoⅠ内切核酸酶位点中，该质粒含有编码人IgG1的Fc片段的DNA序列。然后该质粒用限制酶HindⅢ消化，将所得gp130Fc片段纯化，亚克隆到杆状病毒表达载体pFastBac1(Life Technologies)的HindⅢ位点中，生成一个质粒，命名为pBACgpFc。
融合蛋白gp130Fc使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(LifeTechnologies)在昆虫细胞中表达，然后借助于蛋白A亲和柱层析从细胞培养物上清液中纯化，使用购得的抗gp130和抗hIgG抗体借助于考马斯亮蓝染色SDS-PAGE和蛋白质印迹分析进行检定。
用3-6次实验检测突变体和野生型OSM-GST，得到IC50。存在OSM和gp130-Fc但不存在竞争配体时的平均光密度(即总结合量)为1.157(从0.825至1.807)，非特异性结合小于0.08。在所有测定中，抗OSM抗体产生浓度依赖性抑制(1μg/ml时为74±1％抑制)。野生型OSM-GST与结合在培养板上的OSM竞争产生浓度依赖性抑制(图12)，用6次独立的实验测得IC50为0.139±0.0258μg/ml。表4中总结了与结合在培养板上的野生型OSM竞争条件下的突变体OSM-GST的效力。使得与野生型OSM竞争gp130结合的能力实质降低的突变是L13A、Q16A、Q20A、G120A、N123A和N124A。其中，Q20A和Q16A是最弱的；在最大测试浓度(10μg/ml)时，Q20A产生了66±2.3％的抑制，而Q16A仅产生了15±8％的抑制(图12)。
表4：在ELISA中，在与结合在培养板上的野生型OSM竞争结合gp130-Fc的条件下，野生型和突变体OSM-GST的效力。用3-6次独立实验测定IC50值。
突变体 IC50[μg／ml] 均值 标准误差
野生型(1)S7A(2)K8A(3)E9A(4)Y10A(5)R11A(6)L13A(7)L14A(8)G15A(9)Q16A(10)L17A(11)Q18A(12)K19A(13)Q20A(14)T21A(15)D22(16)M113A(17)P116A(18)N117A(19)L119A(20)G120A(21)R122A(22)N123A(23)N124A(24)Y126A(25)Y130A(26)Q25A(27)D26A     0．110    0．120    0．2570．136    0．070    0．1420．199    0．078    0．1210．252    0．055    0．1060．208    0．163    0．0970．320    0．180    0．1680 181     0．255    0 2802．960    1．990    2．6400．660    0．470    0．4120．090    0．203    0．171＞10      ＞10      ＞102．210    1．900    1．3500．320    0．310    0．5550．047    0．075    0．300    0．0404．130    5．570    4．100    6．2000．108    0．044    0．1010．040    0．080    0．0920．511    0．199    0．2520．232    0．169    0．1970．983    0．756    0．6170．272    0．266    0．2273．650    2．680    2．9500．140    0．220    0．1674．750    1．570    2．5601．630    1．950    2．3800．386    0．359    0．4000．145    0．180    0．0940．042    0．036    0．0550．170    0．280    0．481     0．1390．1330．1380．1560．2230．2392．5300．5140．155＞101．8200．3950．1165．0000．0840．0710．3210．1990．7850．2553．0900．1762．9601．9900．3820．1400．0440．310     0．0260．0350．0590．0320．0490．0300．2850．0750．0340．2510．0800．0620．5270．0200．0160．0960．0180．1070．0140．2890．0240．9400．2170．0120．0250．0060．091
实施例9d：在HepG2 B6体外测定中，OSM中的点突变对OSM驱动的sPAP生成的影响
采用在上述实施例7b中描述的测定法。使用在实施例9b中生成的已知浓度的完整OSM突变体将OSM-GST突变体稀释至浓度为100ng/ml。野生型OSM-GST被包括在内用于对照。稀释物用带有1％热灭活FCS、低碱性磷酸酶活性的HepG2 B6培养基处理，然后制成系列1∶3稀释物(100；33.33；11.11；3.7；1.23；0.4ng/ml)。将在100μl培养基中的3×104 HepG2 B6分配到96孔平板的每个孔中。使细胞平衡48小时。然后除去培养基，替换为100μl稀释的OSM-GST突变体。细胞再培养20小时。每种稀释物以一式三份进行实验。取出20μl培养基，使用pNPP作为底物测定sPAP。用L-高精氨酸阻断内源ALP。在405-650nm下读取光密度值。实验重复进行两次。
大多数突变体能以与野生型类似的方式驱动sPAP释放。有三种突变体产生了非常低水平的sPAP。从这些突变体未得到EC50。(图13)显示了从突变体9(Q16A)、13(Q20A)和20(G120A)得到的光密度图，它们驱动sPAP生成的有效性较低。显示野生型OSM-GST用于对比。用这些数据来计算EC50值。表5中显示了每种突变体的实际EC50并表示为野生型的百分数。
表5
突变体 实验1％ 实验1EC50 ngml-1 实验2％ 实验EC50ml-1  2实验  3实验  3平均％  ‘效力’ng ％      EC50ng ml-1
 WT1 S7A2 K8A3 E9A4 Y10A5 R11A6 L13A7 L14A8 G15A9 Q16A10 L17A11 Q18A12 K19A13 Q20A14 T21A15 D2216 M113A17 P116A18 N117A19 L119A20 G120A21 R122A22 N123A23 N124A24 Y126A25 Q130A26 Q25A27 D26A     1005066981341182698187301849871152106104241115135157125386525581     24121623．632．428．665．719．421NC72．720．223．6NC1736．725．6255827．8NC32．437．930．29312．513．319．5  100693827256861717755174683733507847132724315411332264179  3222．212．58．98227．754．924．917．8NC5621．711．9NC10．516251542．523NC13．849．736．210．38．21325．5     10059．5    更大52       更大62．5    更大195      更小102      相等220      更小79       更大71       更大无237．5   更小76       更大67．5    更大无52       更大101      相等92       相等75．5    更大186．5   更小93．5    相等无124      47．3    101    相等155．5   更小119      相等106．5   40．8    175    更小39       更大48       更大80       相等
表中显示了表示为野生型EC50的百分数的EC50值和实际的EC50值。小于80％为比野生型更有效；80-120％为等效；大于120％为比野生型效力低。
NC-未计算
对该表的检查显示，根据该相对打分系统，这些突变体中的在ELISA法中基本不同于野生型的三种：6-L12A、10-L17A和22-N123A在该sPAP测定中的效力也较低，第四种：23-N124A则刚刚落入相等效力级别内。除了根本不驱动sPAP的那些突变体(Q16A，Q20A，G120A)以外，在驱动sPAP生成方面，有几种突变体比野生型的‘效力’低，但在两个实验之间有差异。该测定结果指示，G120A、Q16A和Q20A作用于OSM与gp130的结合。N123A和N124A看来也对与gp130的相互作用有一些影响。
实施例10：OSM在胃炎中的作用。
幽门螺杆菌是一种与引起胃炎、消化性溃疡疾病和胃癌有牵连的革兰氏阴性螺旋形细菌。幽门螺杆菌Cag+菌株比幽门螺杆菌Cag-菌株与溃疡的关联性更高。幽门螺杆菌菌株(特别是致病的Cag+和Cag-)在体外与胃上皮细胞系KATOⅢ(ECACC)共同培养，以借助于不同的基因表达分析法研究宿主对幽门螺杆菌感染的应答。在时间点：45分钟、3小时和24小时分离mRNA，使衍生放射性探针杂交到高密度cDNA基因阵列(含有大约136个人类基因，包括细胞因子、细胞因子受体和粘附分子)中。对所得到的基因表达分布图的分析显示了对幽门螺杆菌菌株有反应的多数基因的诱导/抑制。与接触弱致病性幽门螺杆菌(Cag-)的细胞或未经处理的对照细胞相比，在接触高致病性幽门螺杆菌菌株(Cag+)的细胞中发现诱导产生了制瘤素M。

Claims (14)

1、OSM拮抗剂或OSM受体在制备用于治疗炎性关节病或炎性疾病的药物中的用途。
2、按照权利要求1的用途，其中的拮抗剂是人OSM拮抗剂。
3、按照权利要求2的用途，其中的拮抗剂与人OSM的残基G120、Q16、Q20、N123或N124中的一个或多个相互作用。
4、按照权利要求1的用途，其中的拮抗剂是OSM受体gp130的拮抗剂。
5、按照上述权利要求中任一项所述的用途，其中的拮抗剂是有机小分子。
6、按照权利要求1-4中任一项所述的用途，其中的拮抗剂是抗体。
7、按照权利要求6的用途，其中的抗体是人源化或嵌合化的。
8、按照上述权利要求中任一项所述的用途，其中的药物是用于防止或减少胶原从软骨的释放。
9、按照上述权利要求中任一项所述的用途，它是用于治疗类风湿性关节炎。
10、一种药物组合物，它的单位剂量包含至少1mg OSM拮抗剂和可药用载体。
11、按照上述权利要求中任一项所述的用途或药物组合物，其中的拮抗剂与免疫抑制剂、耐受诱导剂或抗炎剂结合。
12、按照权利要求11的用途或药物组合物，其中的拮抗剂与CD4+T细胞抑制剂、抗CD23抗体或TNF拮抗剂结合。
13、一种用于鉴定OSM拮抗剂的检定法，它包含使OSM或OSM结合部分和OSM受体或受体缀合物与待测试剂结合，和监测OSM或OSM结合部分与OSM受体或受体缀合物之间相互作用的阻断情况。
14、按照权利要求13的检定法，其中的受体缀合物是一种gp130-Fc融合蛋白。
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