KR20010034672A - 염증성 매개체 길항제 - Google Patents

염증성 매개체 길항제 Download PDF

Info

Publication number
KR20010034672A
KR20010034672A KR1020007010639A KR20007010639A KR20010034672A KR 20010034672 A KR20010034672 A KR 20010034672A KR 1020007010639 A KR1020007010639 A KR 1020007010639A KR 20007010639 A KR20007010639 A KR 20007010639A KR 20010034672 A KR20010034672 A KR 20010034672A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
osm
antagonist
antibody
human
cells
Prior art date
Application number
KR1020007010639A
Other languages
English (en)
Inventor
폴 프레드릭크 라이프
Original Assignee
그레이엄 브레레톤
글락소 그룹 리미티드
레슬리 에드워즈
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 그레이엄 브레레톤, 글락소 그룹 리미티드, 레슬리 에드워즈 filed Critical 그레이엄 브레레톤
Publication of KR20010034672A publication Critical patent/KR20010034672A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/248—IL-6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)

Abstract

본 발명은 염증성 관절병 또는 염증성 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하는데 사용되는 OSM의 길항제, 예를 들어 항체 또는 작은 분자의 용도, 및 이와 같은 길항제를 선별하는(screening) 방법에 관한 것이다.

Description

염증성 매개체 길항제{Inflammatory Mediator Antagonists}
도1a: 활액 생검 배양(synovial biopsy cultures)에 의한 온코스타틴 M의 탈체 분비를 나타내는 ELISA.
도 1b: 감염된 활액 배양물에 의해서는 분비되나, 감염되지 않은 경우 분비되지 않은, 온코스테인 M의 자발적인 탈체 분비.
도 2: PMA 분화(diffentiation)된 THP-1 세포에 의한 TNF 알파 생성에 대한 rhOSM의 영향.
도 3a 및 b: 콜라겐의 탈체 방출을 촉진시킴에 있어 TNFα과 OSM의 상승효과.
도 4a: OSM의 항-L-셀렉틴 항체 매개 분비.
도 4b: 푸코이단 유도 OSM 분비.
도 5a-d : gp130P 및 E-셀렉틴 항체를 사용한 RA 혈관 내피의 착색을 나타낸 현미경 사진.
도 6: 대조군 ＆ CII-관절염에 걸린 마우스로부터의 관절내의 OSM RNA 전달(message).
도 7: 염소 항-OSM 항체 또는 대조군 염소의 IgG로 처리된 관절염에 걸린 DBA-1 마우스. 7a= 임상 스코어. 7b= 발 두께.
도8: 콜라겐-관절염을 갖는 마우스의 관절 침윤 및 연골 손상을 비교한 조직학 데이타.
8a ＆ b: PMNs 및 단핵세포에 의한 광범위한 관절 침윤을 나타내는 대조군 마우스의 광범위하게 퍼진 호중구 침윤(8b)에 특징이 있는(8a), 및 관절 연골의 표면 파괴를 나타내는 대조군 마우스.
8c ＆ 8d: 비손상 관절연골과 함께 현저히 감소된 정도의 세포 침윤을 나타내는, 정상적이고 가벼운 관절염을 가진 항-OSM 처리 동물의 대표적인 관절.
도 9: OSM-유도 sPAP 방출의 농도 의존적 억제를 보이는 N-(1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-일)벤자미드에 대한 HepG2 B6 sPAP 및 MTS 시험.
도 10: A549 세포로부터의 TNFα-유도 sPAP 방출의 제한적 억제성을 나타내는, N-(1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-일)벤자미드에 대한 TNFα sPAP 및 MTS 시험.
도 11: HepG2 B6 시험에서 sPAP 생성의 항체 억제. M2-M4는 4마리의 마우스로부터의 마우스 혈청을 나타내고, OM5-6.1, OM5-6.10, OM6-10.111은 실험적으로 유도된 히브리도마 상청액을 나타낸다.
도 12: 엘리사(Elisa)에서 gp130-Fc와 결합하기 위한 야생형(wild type) 및 돌연 변이체 OSM-GST의 융합물과 플레이트-결합된 야생형 OSM의 경쟁.
도 13: HepG2 세포에서 sPAP 생성을 유도함에 있어 최소한의 활성을 나타내는 3종의 돌연변이체 OSM-GSTs 의 O.D. 플롯.
지금부터, 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 실시예에 의해 기술할 것이다.
본 발명은 염증성 관절병 또는 염증성 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하는데 사용되는 OSM 길항제의 용도 및 이와 같은 길항제를 선별하는(screening) 방법에 관한 것이다.
류머티스관절염(RA)은 활액과형성 및 단핵세포와 다형핵백혈구(PMN)에 의한 광범위한 세포침윤으로 특징지워지는, 관절 부위에 영향을 미치는 만성염증질환이다. 정주(resident) 및 침윤 세포형사이의 복잡하고 난해한 상호작용으로 인해, 금속단백질분해효소(MMPs)의 만성적인 분비가 초래되고, 그 결과 관절연골, 인대 및 연골하골이 파괴된다(Firestein GS Current Opinion in Rheumatology. 4:348-54, 1992). RA 관절 병변을 일으키는데 관계되는 많은 프로(pro)-염증성 시토킨류중에서, TNFα는 중추적 역활을 수행하고, 따라서 항-TNFα치료는 맹백한 이점을 나타낸다(Elliott MJ. et al. Lancet. 344(8930):1105-10, 1994). TNFα는 MMPs의 유도{Dayer JM. et al Journal of Experimental Medicine. 162(6):2163-8, 1985} 및 다른 프로-염증성 시토킨류의 상향조절(upregulation){Haworth C. et al. European Journal of Immunology. 21(10):2575-9, 1991 및 Dinarello CA. et al. Journal of Experimental Medicine. 163(6):1433-50, 1986} 및 증가된 PMN 유착과 내피세포를 통한 이동(Smart SJ. Casale TB American Journal of Physiology. 266: L238-45, 1994)을 포함한 몇 몇 병리학적 효과를 매개한다. 현재 TNFα은 프로-염증성 시토킨 다단계의 개시제로서 생각되지만, 그의 실제적 조절에 대해서는 비교적 덜 알려져 있다(Feldmann M. et al. Annual Review of Immunology. 14:397-440, 1996).
온코스타틴(Oncostatin) M(OSM){Rose TM. Bruce AG. PNAS USA 88(19):8641-5, 1991}은 IL-6, IL-11, 백혈병(leukaemia) 억제 인자(LIF), 섬모향신경성인자(CNTF) 및 카르디오트로핀(cardiotrophin) 1(CT-1)(Taga T. Kishimoto T. Annual Review of Immunology. 15:797-819, 1997)을 포함하는 시토킨류에 속하는 28 kDa 당단백질이다. 모든 구성원들(members)은 헤테로-이량체성 및 호모-이량체성 수용체의 복합물(complex family)의 일부로서 통상적인 신호 사슬(common signalling chain), gp130을 공유한다{Grotzinger J. et al [Article] Proteins. 27(1):96-109, 1997}. OSM은 LIF와 통상적인 헤테로이량체성 수용체(LIFr: gp130, 제1형)을 공유하고, OSMrβ 사슬 및 gp130(제2형)을 포함하는 그 자신만의 독특한 수용체를 갖는다{Mosley B. et al.[Article] Journal of Biological Chemistry. 271(51):32635-32643, 1996}. OSM은 세포 성장 및 분화에 대해 영향을 미치는 것으로 잘 알려져 있다{Horn D. et al[Journal Article] Growth Factors. 2(2-3):157-65, 1990}.
최근, OSM은 또한 마우스의 생체내에서 강력한 프로-염증성 특성을 가지는 것으로 밝혀졌고(Modur V. et al. J. Clin Invest. 100:158-168, 1997), IL-1과 강력한 상승작용을 일으켜 탈체(ex-vivo) 모델 시스템에서 관절연골의 퇴행을 촉진시키는 것으로 확인되었다{Cawston T. Biochemical ＆ Biophysical Research Communications. 215(1):377-85, 1995}.
OSM은 내피세포에서 P-셀렉틴(P-selectin)(및 E-셀렉틴)의 연장된 증가를 유도하고{Yao L. et al. Journal of Experimental Medicine. 184(1):81-92, 1996}, 인간의 활액 섬유아세포에서 유로키나제-형 플라스미노젠 활성체의 활성을 자극하고{Hamilton J. et al Biochemical ＆ Biophysical Research Communications. 180(2):652-9, 1991}, 내피세포로부터의 IL-6의 강력한 유도물질이다{Brown Tj.et Val. Journal of Immunology. 147(7):2175-80, 1991. 10. 1}. OSM을 OA 활액 유체{Hui W. et al. Annals of the Rheumatic Diseases. 56(3):184-187, 1997} 및 활막이 아닌 RA에서 최근 측정하였고, 그 제조는 대식세포{1997, Okamoto H et al. Arthritis and Rheumatism 40(6):1096-1105} 및 {Cawston et al 1998, Arthritis and Rheumatism, 41(10) 1760-1771}에 국한되어왔다. 지금까지, 이 분야에서 추가적인 실험은 IL-6 아과 원들(subfamily members)의 유사성을 기초로 이론적이었다{Carroll G. et al Inflamm. Res. 47(1998)1-7}.
본 발명자들은 OSM이 대식세포에서 TNFα을 유도하는 능력을 가진다는 사실을 발견하였다. OSM이 MMP-1과 착체를 형성하여 MMP-1을 불활성화하고, 이에 따라 콜라겐 방출을 감소시킬 것으로 예측되는 금속단백질분해효소의 조직 억제제-1(TIMP-1)의 생성을 상향조절함을 암시하는 최근의 데이타{Nemoto et al 1996, A ＆ R 39(4), 560-566}와는 반대로, OSM이 TNFα분비를 유도한다는 본 발명자들의 발견은 OSM이 실제 연골 파괴를 매개하는 역할을 수행할 수 있음을 암시한다. 이 발견을 기초로, 본 발명자들은 다른 IL-6 과원들(family members)을 억제하지 않고 항-OSM 항체를 중화시키는 치료양으로 투여함으로써 마우스 모델에서 콜라겐 유도 관절염을 단독으로 호전시킬 수 있다는 것을 증명하였다. OSM이 TNFα과 상승작용을 하여 연골로부터 콜라겐 방출을 촉진시킬 수 있다는 것은 후속 문헌{1998, Arthritis and Rheumatism, 41(10) 1760-1771}에 의해 밝혀졌다.
따라서 본 발명은 염증성 관절병 또는 염증성 장애의 치료 또는 예방을 위한 약제를 제조함에 있어 OSM의 길항제의 용도를 제공하는 것이다. OSM의 길항제의 특별한 용도는 연골로부터 콜라겐의 방출을 방지 또는 경감시키기 위한 약제를 제조하는 것이다. 본 발명은, 유효량의 OSM의 길항제를 염증성 관절염 또는 염증성 장애를 겪는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 염증성 관절병 또는 염증성 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 또한 제공한다.
길항제는 OSM이 OSM 수용체 gp130 또는 다른 OSM 수용체, OSMrβ사슬 또는 LIFr과 상호작용을 하는 것을 막거나, 또는 이들 단백질의 헤테로이량체의 형성을 막음으로써 작용하고, 따라서 OSM 결합 및 시그널링(signalling)을 막고, 그 결과 프로-염증성 시토킨류 및(또는) MMPs의 합성을 감소시킨다. 따라서 본 발명에 따른 길항제는 OSM 또는 하나 이상의 OSM 수용체(gp130, OSMrβ또는 LIFr)에 대한 리간드, 또는 OSM 생물학적 활성에 영향을 주는 방법으로 이 상호작용을 방해할 수 있는 제제일 수 있다. 이하에서 언급되는 OSM 대한 길항제는 OSM 그 자체에 대한 길항제 또는 그 수용체중 하나에 대한 길항제를 의미하는 것으로 사용될 수 있다.
본 발명자들은 또한 류머티스 관절염 활액혈관내피에서 P 및 E-셀렉틴이 제1형 및 제2형 OSM 수용체의 시그널링 성분인 gp130과 함께 편재해 있을 수 있다는 것을 발견하였다. 이론에 구애받길 원하는 것은 아니지만, 이 사실은 활액 대식세포에 의해 생산된 OSM이 RA 혈관 내피를 자극하여(priming) p 및 E-셀렉틴의 상향조정을 통해 백혈구를 용이하게 보충할 수 있다는 것을 의미한다. 특정 항체 또는 퓨코이단(fucoidan)(L-셀렉틴 길항제)에 의해 L-셀렉틴을 라이게이션(ligation)함으로써 인간 단핵세포가 OSM의 분비를 촉진시킨다는 발견은, OSM의 추가적인 국부원(local source)을 제공하여 TNFα와 P 및 E-셀렉틴을 촉진(driving)함으로써 염증성반응을 증폭시킨다는 점에서 매우 중요할 수 있다.
OSM이 gp130과 상호작용함에 있어 중요한 아미노산 잔기는 이미 확인되었다. OSM의 공표된 아미노산 서열{Malik et al., 1989, Mol. Cell Biol., 9(7), 2847-53, DNA sequence entry M27288 in EMBL database, protein sequence entry P13725 in Swissprot)로부터, 이들은 G120, Q16 및 Q20이고, N123 및 N124가 또한 역할을 할 수 있다(서열 번호 12 및 아래 참조). 처음 25 잔기는 신호 단백질(signal protein)이고, 성숙 단백질(mature protein)은 서열 AAIGS(서열번호 13)에서 시작한다. 서열은 하기와 같이 성숙 단백질의 최초 아미노산으로부터 번호를 매긴다.
서열번호 12
따라서 본 발명은 하나 이상의 특정 잔기 및(또는) 결합 부위와 상호작용할 수 있는 길항제 또는 제제를 추가로 제공하고, 이들은 OSM상에서 OSM의 생물학적 활성을 변경하는데 도움을 준다.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 염증성 관절병에는 류머티스관절염, 건선관절염, 유년기 관절염(juvenile arthritis), 염증성골관절증 및(또는) 반응성 관절염이 있다. 치료가능한 염증성 장애에는, 특히 크론병, 궤양성대장염, 위염{예를 들어, 에이치. 필로이(H. pylori) 감염에 의한 위염}, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 알쯔하이머병, 다발성경화증 및 건선을 들 수 있다.
OSM의 잠재적인 길항제로는 작은 유기 분자, OSM과 특이적으로 상호작용할 수 있는 이온, 예를 들면, 기질(천연 기질도 가능함), 세포막 성분, 수용체 또는 천연 리간드, 그의 단편(fragment) 또는 단백질 또는 다른 단백성 분자를 들 수 있고, OSM과 OSM 수용체의 결합을 막을 OSM의 비-시그널링(non-signaling) 변이체외에 변형된 OSM 분자가 특히 바람직하다. 이와 같은 길항제는 단백질 또는 펩티드를 암호화(encoding)하는 DNA 형태일 수 있고, 상기 길항제의 생체내 발현(expression)을 위해 전달(delivering)될 수 있다. 길항제는 천연 OSM을 표적으로 한 항체의 생체내 반응을 유발시켜 OSM에 대해 길항 작용을 유발하도록 고안된, 그러한 단백질 또는 펩티드 분자 또는 DNA를 포함하는 백신일 수 있다. 이와 같은 길항제는 또한 항체, 항체 유발 시약 또는 키메라 분자일 수 있다. 상기 기술된 임의의 분자의 구조적 또는 기능적 유사체(memetic)도 길항제의 정의안에 포함될 수 있다. 핵산 분자, 예를 들어 DNA 또는 RNA 앱타머(aptamers)도 또한 포함될 수 있다.
길항제의 예로는 작은 유기 분자가 바람직하다. 이와 같은 화합물은 임의의 화합물 종에서 얻을 수 있으나, 화합물은 전술한 메카니즘중 하나를 통해 OSM의 생물학적 활성에 영향을 주는 능력에 의해 선별되고, 생리학적으로 허용가능하여, 즉 무독성이거나 허용가능한 수준의 독성 또는 다른 부작용을 보여야 할 것이다. 유용한 길항제를 제공할 수 있는 화합물 종의 하나로는 라이보뉴클레오사이드, 예를 들어 N-(1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-일)벤자미드(Davoll and Kerridge, J. Chem Soc., 2589, 1961)를 들 수 있다.
기타 바람직한 길항제로는 항체 또는 그의 단편, 항체 또는 그의 단편을 포함하는 인공 제작물 또는 항체 그의 단편의 결합을 모방하도록 고안된 인공 제작물일 수 있다. 이와 같은 제작물은 문헌{Dougall et al in Tibtech 12, 372-379(1994)}에서 논의된다.
또한 항체의 정의에는 사용할 수 있는 재조합 인간 항체와 같은 재조합 항체가 포함된다. 항체는 변형될 수 있다. 즉, 항체는 국제 공개 공보 WO 제86/01533호에 기술된 바와 같이 공여자 항체의 가변 도메인(domain) 및 인간 항체의 일정 도메인을 포함하는 "키메라" 항체일 수 있거나, 또는 유럽특허공개공보 제0239400호에 개시된 바와 같이 CDRs 만이 항체의 가변 도메인의 구조(framework)와 다른 종으로부터 유래된, 휴머나이즈된humanised) 항체일 수 있다. 상보성 결정 영역(CDRs)은 설치류 또는 영장류 단일클론성 항체로부터 유도될 수 있다. 변형된 항체의 가변 도메인 및 일정 도메인의 구조는 보통 인간 항체로부터 유발될 수 있다. 이와 같은 휴머나이즈된 항체는, 인간에게 투여시 아주 이질적인 항체(예를 들어, 설치류로부터 유발된 항체)에 대해 인간에 의해 촉발된 면역 반응만큼 큰 면역 반응을 유발하여서는 안된다.
바람직한 길항제는 완전항체, F(ab')2단편, Fab 단편, Fv 단편, ScFv 단편, 다른 단편, CDR 펩티드 및 유사체(mimetics)을 들 수 있다. 이들은 구입할 수 있거나 당업자들에 의해 제조가능하다. 예를 들면, 효소분해를 이용하여 IgG 분자가 펩신 또는 파파인(papain) 절단을 받게 함으로써 각각 F(ab')2및 Fab 단편을 얻을 수 있다. 하기에서 "항체"에 대한 언급은 상기 모든 가능성을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
당업자들이 인식하는 바와 같이, 특정 단백질 또는 펩티드 길항제를 상세한 설명에서 기술할 경우, 이와 같은 길항제의 유도체를 또한 사용할 수 있다. "유도체"라는 용어는 여전히 기술한 결합 활성을 여전히 가지면서 상기 길항제에 비해 하나 이상의 아미노산 치환체, 결손체 또는 삽입체를 갖는 상기 길항제의 변형체를 포함한다. 이 유도체들은 아미노산 서열이 특정 길항제와 거의 일치하는 것이 바람직하다.
아미노산 서열의 동일 정도는 임의의 두 서열간의 유사성을 최적으로 갖는 분절을 탐지하기 위한 "베스트피트(bestfit)"{Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489(1981)}와 같은 프로그램을 사용하여 계산할 수 있다. 배열은 문헌{Schwarz and Dayhof(1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M.O., Ed pp 353-358}에 기술된 바와 같은 아미노산 유사체의 기질(matrix)을 사용하여 달성되는 스코어(score)를 최대화하는 것에 기초한다.
서열의 동일도(degree of sequence identity)는 바람직하게는 50% 이상, 더 바람직하게는 75% 이상이다. 서열 동일도는 90% 이상 또는 95% 이상이 가장 바람직하다. 그럼에도 불구하고, 단백질의 특정 성질을 실질적으로 변경하거나 나쁜 영향을 주지 않고 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 다양한 아미노산을 종종 대체할 수 있기 때문에, 당업자들은 고도의 서열동일도가 필요하지 않다는 것을 인식할 것이다. 때때로, 이들은 "보존적(conservative)" 아미노산 변화로서 언급된다. 따라서, 페닐알라닌, 티로신과 트립토판(방향족 측쇄를 갖는 아미노산); 리신, 아르기닌과 히스티딘(염기성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스팔레이트와 글루타메이트(산성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파라긴과 글루타민(아미드 측쇄를 갖는 아미노산) 및 시스테인과 메티오닌(황 함유 측쇄를 갖는 아미노산)을 포함하여 아미노산 글리신, 발린, 류신 또는 이소류신은 종종 서로 대체될 수 있다. 따라서 "유도체"라는 용어는 또한 상기 서열에 대응하는 하나 이상의 이와 같은 "보존적" 변화를 포함하는 아미노산 서열의 변이체를 포함한다.
본 발명은 본발명의 길항제의 단편 또는 상기 결합 활성을 여전히 갖는 그의 유도체를 또한 포함한다. 적어도 10개의 아미노산 길이를 갖는 단편이 바람직하나, 더 길 수도 있다(예를 들면, 50 또는 100개의 아미노산 길이까지).
본 발명에서 사용하기 위한 OSM의 길항제의 바람직한 추가예는 올리고뉴클레오티드 리간드이다. 지수적 증강에 의한 리간드의 체계적인 진화(SELEX)는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 광대한 라이브러리가 표적 단백질 또는 다른 분자에 대한 원하는 활성에 대해 선별되는 프로토콜이다(Tuerk ＆ Gold 1990 Science 249, 505-510, Green et al, 1991 Meths. Enzymol. 2 75-86; Gold et al., 1995 Annu. Rev Beochem 64, 763-797; Uphof et al., 1996 Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 281-288). 이 선별에 의한 생성물은 표적 단백질에 대한 원하는 활성, 보통 높은 친화 결합성을 갖는 앱타머라 불리는 단일 올리고뉴클레오티드 서열이다. SELEX 절차는 1014-1015불규칙 올리고뉴클레오티드 서열로 구성된 RNA 또는 DNA 라이브러리로 보통 시작된다. 완전히 불규칙적인 올리고뉴클레오티드 라이브러리에서, 각각의 분자는 해당 분자의 뉴클레오티드 서열에 전적으로 의존하는 독특한 3차 구조를 나타낼 것이다. 따라서, 표적 단백질에 대해 선별될때, 해당 단백질에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합 친화도는 표적 단백질상의 올리고뉴클레오티드 및 에피토프의 형태간의 일치성에 의해 정해질 것이다. 매우 다양한 라이브러리에서 시작하는 결과, 전체적인 구조적 동질성을 갖는 다른 단백질중에서 해당 표적 단백질에 대한 선택성을 갖는 표적 단백질에 대한 서브-nM 친화성을 갖는 앱타머를 보통 식별 가능하다(Tuerk ＆ Gold 1990 supra, Green et al, 1991 supra; Gold et al, 1995 supra; Uphof et al., 1996 supra). SELEX 법을 사용함으로써 RNA 또는 DNA 앱타머를 도파민(Mannironi et al, 1997 Biochemistry 36, 9726-9734), 물질 P(Nieuwlandt et al, 1995 biochemistry 34, 5651-5659), 인간 호중구 엘라스타제(Bless et al., 1997 Current bial. 7, 877-880) 혈소판 유도 성장 인자(PDGF)(Green et al, 1996 Biochemistry 35, 14413-14424), 혈관 내피 성장 인자(VEGF)(Green et al., 1995 Chem Biol., 2, 683-695), 트롬빈(Bock et al., 1992 Nature 355, 564-66) 및 L-셀렉틴(O' Connell et al., 1996 PNAS USA 93,5883-5887)을 포함하는, 100이상의 단백질 및 작은 분자로 생성시킬 수 있다.
상당수의 앱타머가 생물학적 활성, 보통 시험관내 및 생체외의 수용체 길항작용 또는 효소 억제성을 갖는다는 것이 입증되었다. 예를 들면, 인간 호중구 엘라스타제(hNE)에 대한 높은 친화성 및 억제 활성을 갖는 RNA 앱타머는 블렌딩된 SELEX에 의해 발생되었다(Bless et al., 1997 supra). 생체내 안정성을 증가시키기 위한 포스트- SELEX 변형에 이어서, 앱타머를 허파 염증을 갖는 마우스 모델에서 시험하였다(Bless et al., 1997supra). 두번째 예로, 49 뉴클레오티드 길이의 DNA 앱타머를 단백질에 대한 nM 친화성을 갖는 인간 L-셀렉틴으로 발생시켰다(O'Connel et al., 1996 Supra). 앱타머는 E-셀렉틴에 비해 L-셀렉틴에 대해 600배의 선택성 및 P-셀렉틴에 비해 10000배의 선택성을 나타낸다. 앱타머의 PEG 제제의 정맥 주사는 투여량에 의존하는 방식으로 방사능 표지된 인간 PBMC의 다른 기관이 아닌 림프절에 전달하는 것을 억제한다. 세번째 예로, 높은 친화성 RNA 앱타머를 인간 VEGF에 대해 배양(raising)하여 혈관형성에 있어 VEGF의 역할을 조사하였다(Jellinek et al., 1994 Biochemistry 33, 10450-10456: Green et al., 1995; Ruckman et al., 1998. J. Biol. Chem 273, 20556-20567; Wills et al., 1998 Bioconjug. Chem. 9,573-582). VEGF 앱타머의 리포이드성(liposomal) 제제는 시험관내에서 VEGF 유도 세포외 증식 및 혈관 투과성 증가 및 생체내에서 혈관형성을 억제한다(Willis et al., 1998 supra). 따라서, 본 발명은 본 발명에 사용하기 위한 OSM의 올리고뉴클레오티드 리간드 또는 OSM 수용체(OSMR, LIFR, gp130)을 제공한다.
상기와 같이 본 발명에 사용하기 위한 앱타머를 배양하기 위해서는, 먼저 OSM 또는 수용체를 선별용 플레이트에 결합시켜야 한다. 이어서, "Fitzwater and Polisky"의 방법(즉, SELEX 절차)에 따라 선별 및 증폭을 반복하여 인간 OSM에 대한 RNA 또는 DNA 앱타머를 발생시킬 수 있다. RNA는 구조적으로 매우 다양하고 따라서 높은 친화성 분자를 발생시킬 가능성을 제공하기 때문에 이 앱타머는 전형적으로 변형된 RNA 앱타머이다. 높은 친화성 앱타머를 발생시킨 후, 상당수의 포스트-SELEX 최적화 프로토콜을 수행하여 앱타머의 안정성을 증가시키고, 앱타머를 고상 합성에 더 적합하고 그 결과 합성비용을 감소시키는 코어 서열(앱타머는 전형적으로 100mers이하)로 절단하고, 생체내에서 사용하기 위한 제제를 개발할 수 있다.
이 절차중 처음 단계로, 앱타머를 절단하여 활성에 요구되는 코어 서열로 분자 길이를 줄일 수 있다. 짧은 코어 서열(종종 20 내지 40 뉴클레오티드 길이)가 합성 비용이 더 적게 들고, 더 단시간내에 합성하고, 생체내이용효율을을 더 높일 수 있다. 코어 서열의 조성에 관한 정보는 서열 동질성 대조로부터 얻을 수 있다. 그러나, 절단 실험은 활성에 필요한 최소 서열이 생성될 때까지 더 짧은 서열의 앱타머를 합성함을 보통 포함한다. 이것은 고정 서열의 제거를 보통 포함하나, 고정 서열내의 뉴클레오티드가 앱타머 친화성에 기여하는 예가 다수 많다{Fitzwater and Polisky, 1996 supra; Ruckman J. et al(1998) J. Biol. Chem. 273, 20556-20557. Green et al., 1995 supra}. 따라서, 본 발명은 선별된 앱타머의 절단되거나 확장된 형(version)의 앱타머 또는 선별된 앱타머와 서열상 70% 보다 큰 동질성을 나타내는 앱타머를 제공한다.
절단후, 많은 염기 변형 실험을 수행하여 리보뉴클레아제 절단으로부터 보호함으로써 앱타머의 안정성을 증가시킬 수 있다. SELEX 동안 시험관내 전사에 사용되는 T7 중합효소는 이 변경을 견디지 못하기 때문에 2'변형 푸린 염기를 포함하는 것은 불가능하다. 그러므로, 앱타머의 안정성을 증가시키기 위해(포스트-SELEX), 앱타머내의 푸린 염기를 2'변형된 푸린으로 대체하는 것이 통상적이다. 2'-아미노 푸린 또는 2'-플루오로 푸린을 포함하여 다른 변형 푸린을 사용할 수 있지만, 이 변형은 2'-0-메틸 푸린의 사용에 의한 것이 보통이다(Ruckman et al., 1998 supra; Green et al., 1995 supra). 이 변형 즉, 포스트-SELEX 은 또한 친화성의 손실을 초래할 수 있기 때문에 연속적으로 수행하여야 한다(Green et al., 1995 supra).
절단 및 안정화후, 화학적 고체 스케일 합성에 의해 합성가능한 완전히 변형된 짧은 앱타머를 매우 다량으로 발생시키는 것이 가능하다. 다수의 분자를 앱타머의 5' 말단에 첨가하여 앱타머 사용을 용이하게 하거나, 생체내 전달을 위한 앱타머를 제형화할 수 있다. 이에는 이미징(imiging)을 돕기 위한 케이징된 부분(caged moiety){Hnatowich D. J.(1996) Q. J. Nucl. Med. 40, 202-8}, 분자 탐지를 돕기 위한 플루오레신(German et al., 1998 Anal. Chem. 70, 4540-5), 리포좀으로의 삽입을 돕기 위한 지질군(Willis et al., 1998 supra), 또는 작은 분자 약물 또는 펩티드에 대한 결합{Charlton J, et al(1997b) Biochemistry 36, 3018-3026}이 있다. 앱타머의 5'말단부에 분자를 첨가하여도 친화성 또는 특이성의 손실을 초래하지 않는 것이 일반적이다.
생체내 반감기를 증가시키기 위해, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 분자를 첨가하거나 리포좀에 혼입시켜 앱타머를 변형시켰다. 두 경우 모두, 이와 같은 변형은 생체내 반감기를 상당히 증가시킬 수 있다(Willis et al, 1998 supra).
리포좀성 제형외에, 앱타머를 20K 및 40K PEG 와 함께 배합하여 생체내 혈청 안정성을 증가시켰다. DNA 앱타머를 인간 L-셀렉틴에 대해 발생시켰다. 생체내 안정성을 증가시키기 위해, 20K PEG 에스테르를 N-말단 아민 부분을 통해 앱타머에 결합시켰다. PEG 결합(conjugated) 앱타머는 생체내 실험으로 SCID 마우스에서 L-셀렉틴-의존성 림프구 왕래(trafficking)를 차단한다는 것으로 나타났다(Hicke et al., 1996 supra). 따라서, 본 발명은 앱타머 및 담체 분자, 예를 들어 PEG의 결합체(conjugate)의 용도를 제공한다. 이 실시태양에서, 앱타머와 담체는 예를 들어, N-말단 아민 부분을 통해 결합될 것이다. 또한, 앱타머 및 전달 분자, 예를 들어, 리포좀을 포함하는, 본 발명에 사용하기 위한 제형 또는 조성물이 제공된다. 이 실시태양에서, 앱타머와 담체간에는 결합이 없을 수도 있고, 단순히 앱타머를 캡슐에 넣거나, 또는 담체를 통해 분산시키거나 분배시킬 수 있다.
본 연구에서 분리된 앱타머를 또한 혈청, 조직 또는 다른 탈체 샘플중의 인간 OSM의 존재를 탐지하기 위한 진단용 분자, 또는 전신의 생체내 이미징 연구에서 인간 OSM의 탐지용으로 변형시킬 수 있다{Charlton J, et al(1997) Chemistry and Biology 4, 809-816.; Hnatowich, 1996 supra}. 플루오레세인 또는 다른 형광성 탐지그룹을 앱타머 분자의 5'말단에 첨가하여 응용분야, 예를 들면, FACS(형광 활성 세포 분류){Davis KA. Et al(1996) Nuc. Acids Res. 24, 702-6.; Charlton et al., 1997supra}, ELONA(효소 결합 올리고누클레오티드 분석)분석{Drolet DW, et al(1996) Nature Biotech. 14, 1021-1025} 및 기타 진단분야에서 형광 탐지를 도울 수 있다. 테크네티움-99m(Tc99m) 킬레이팅 펩티드 케이지, 예를 들어 MAG3(Fritzberg A. R., et al J Nucl Med. 1986:27, 111-6)의 출현으로 인해, 생체내에서 표적 단백질의 존재를 영상화(imaging){Taillefer R. et al, (1995)Eur.J.Nucl.Med.22, 453-64.}함에 있어, 광범위한 분자{Kubo A. et al, (1998) Kaku Igaku 35, 909-28} 및 거대분자{Taillefer R. et al, (1995) Eur.J. Nucl. Med. 22, 453-64}의 사용이 매우 용이해졌다. 상은 γ-카메라의 도움을 받아 불 수 있고, 마우스부터 인간까지 광범위한 종에서 달성하였다. 최근 Tc99m 킬레이터를 변형시켜 온화한 조건하에서 더 효과적이고 안정한 분자의 표지가 가능하게 되었다(Hnatowich D. J. 1998 Nucl Med 39, 56-54). 단일 가닥의 올리고누클레오티드를 방사능표지하는 방법이 이미 개발되었고, 이와 같이 비변형되고 표지된 생체내 올리고누클레오티드의 운명이 이미 조사완료되었다(Hnatowich, 1996 supra).
물론, 중요한 점은 본 발명에 사용하기 위한 펩티드, 단백질 또는 핵산에 기초한 길항제가 순수한 형태인 것, 즉 자연상태에서 또는 제조의 결과로서 분자와 관련된 문제에서 자유로운것이 바람직하다는 것이며, 특히 순도는 70% 이상 순수하나, 80% 또는 90% 이상 순수한 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 길항제는 단독으로 사용되거나, 또는 면역억제제{예를 들어, 스테로이드(프레드니손 등), 시클로포스파미드, 시클로스포린 A 또는 푸린 유사체(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토푸린 등)}, 또는 항체(예를 들어, 항림프구 항체)와 함께 사용되거나, 더욱 바람직하게는 CD4+T 세포 억제제{예를 들어, 항-CD4 항체 바람직하게는, 차단(blocking) 또는 비고갈(non-depleting) 항체, 항-CD8 항체, 항-CD23 항체, TNF 길항제(예를 들어, 항-TNF 항체) 또는 TNF 억제제(예를 들어,가용성 TNF 수용체)} 또는 기타 약제(예를 들어, NSAIDs 또는 다른 시토킨 억제제)와 같은 면역 관용(tolerance inducing), 항자기면역 또는 항염증제와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 길항제의 적합한 투약량은 여러 인자, 예를 들어 치료하고자 하는 질환 또는 증상, 투여 경로 및 치료하고자 하는 개인의 연령 및 체중 및 길항제의 성질에 따라 변할 것이다. 어느 특정한 투약량에 구애받는 것은 아니지만, 예를 들어 비경구적 투여를 위한 일일 투약량으로는, 0.01 내지 20mg/kg의 본 발명(상기 언급된 바와 같이 약학 조성물의 일부로서 보통 존재함)의 항체(또는 다른 거대 분자)가 전형적인 성인을 치료하는데 적합한 것으로 생각된다. 또한, 0.1 내지 5 mg/kg, 예를 들면 0.1 내지 2 mg/kg의 투약량이 더 적합할 것이다. 단위 투약량은 1-400 mg이 적합할 것이다. 작은 유기 분자의 적합한 투약량은 이와 유사하고, 올리고누클레오티드 리간드의 적합한 투약량은 예를 들어, 0.1-10 mg/kg일 것이다.
나아가, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제, 활성 성분으로서 본 발명에 따른 길항제 및 선택적으로, 상기 언급된 또 다른 치료제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 길항제 및 그의 약학 조성물은 특히 비경구적 투여, 즉 피하, 근육내 또는 정맥 투여에 특히 유용하나, 길항제의 성질에 따라 다른 경로, 예를 들어 경구, 흡입, 비강내, 경피, 또는 관절내 투여가 더 적합할 수 있다.
비경구적 투여를 위한 조성물은 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체에 용해된 길항제 용액 또는 그의 칵테일을 일반적으로 포함할 것이다. 각종 수성 담체, 예를 들어 물, 완충수, 0.4% 염수, 0.3% 글리신 등을 사용할 수 있다. 이 용액은 무균성이고 특정한 문제가 없는 것이 일반적이다. 이 조성물은 통상적이고 공지된 살균 기술에 의해 살균될 수 있다. 이 조성물은 생리조건에 가깝게 하는데 필요한 pH 조정 및 완충제, 독성조절제 등과 같은 약학적으로 허용가능한 보조 물질, 예를 들어 나트륨 아세테이트, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 나트륨 락테이트 등을 함유할 수 있다. 이들 제제중의 항체 또는 다른 길항제의 농도는 예를 들어, 0.5 중량% 미만, 보통은 약 1중량% 이상부터 15 또는 20 중량%까지 광범위하게 변할 수 있으며, 어떠한 투여 방식을 선택하는가에 따라 유체 부피, 점도 등에 우선적으로 기초하여 선택될 것이다.
따라서, 근육내 주사를 위한 전형적인 약학 조성물은 무균성 완충수 1ml 및 길항제 50 mg을 함유하도록 제조될 수 있다. 정맥내 주입을 위한 전형적인 조성물은무균성 링거액 250 ml, 및 본 발명에 따른 항체 길항제 150 mg을 함유하도록 제조될 수 있다. 비경구적 투여를 위한 조성물의 실질적인 제조방법은 공지되어 있거나, 당업자에게 자명하며, 문헌{예를 들어, Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania(1980)}에 상세하게 기술되어 있다. 핵산 길항제에 적합한 제형은 전술한 바 있다.
본 발명의 단백질 길항제, 예를 들어 항체를 저장을 위해 동결할 수 있고, 사용하기 전에 적합한 담체중에서 원상태로 회복시킬 수 있다. 이 기술은 통상적인 면역글로불린의 경우 효과적인 것으로 알려져 있다. 임의의 적합한 동결 및 복원 기술을 사용할 수 있다. 당업자들은 동결 및 복원이 다양한 정도의 항체 활성 손실(예를 들자면, 통상적인 면역글로불린의 경우, IgM 항체는 IgG 항체보다 더 큰 활성손실을 갖는 경향이 있음)을 초래할 수 있고, 이를 보충하기 위해서는 사용 양을 조절하여야 한다는 것을 인식할 것이다.
치료의사에 의해 선택되는 투약량 수준 및 패턴으로 조성물을 1회 또는 수회 투여할 수 있다. 어느 경우든, 약제는 환자를 효과적으로 치료하기에 충분한 양의 본 발명의 항체 또는 다른 길항제를 제공하여야 한다.
본 발명은 OSM에 결합한 특정 약제가 염증성 질환을 치료하는데 유용할 수 있는지의 여부를 측정하는 시험을 본 발명의 범주내에 포함한다. 따라서, 본 발명은 OSM을 시제와 결합시키고 시제가 OSM과 OSM 수용체간의 상호작용을 막을 수 있는지 또는 표시 분자(marker molecule)의 미분식(differential expression)을 통해 OSM의 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 측정하는 것을 포함하는, OSM의 길항제의 식별 시험을 포함한다.
상기와 같이 본 발명에 사용하기 위한 OSM 길항제를 선별하기 위하여, 상기와 같은 OSM의 주요 결합 잔기는 담체상에 나타나 있거나 또는 결합위치가 정의되는("OSM 결합 부분") 방식으로 제공되거나, 또는 OSM 수용체를 먼저 얻어야 한다. 인간 OSM을 코드화하는 cDNA를 EMBL 서열(등록 번호 제M27288호)에 기초하여 합성적으로 발생시킬 수 있고, 적합한 발현 매개체(expression vehicle)에 클로닝하여, 적합한 숙주(host)(예를 들어, E. Coli.)를 변형시키는데 사용할 수 있다. 이어서, 인간 OSM 단백질을 배양 배지로부터 정제하여, 선별을 위한 플레이트에 결합시킨다.
OSM, OSM 결합 부분 및(또는) OSM 수용체를 사용하여 예를 들어, 세포, 세포가 없는 제조물, 화학적 라이브러리 및 천연 생성물의 혼합물내의 작은 분자 기질 및 리간드의 결합을 평가할 수 있다. 따라서, 본 발명은 OSM을 시제와 접촉시키고 결합을 측정하는 것을 포함하는, OSM의 길항제의 식별법을 제공한다. 이 기질 및 리간드는 천연 기질일 수 있고, 리간드는 구조적 또는 기능적 유사체일 수 있다. 이와 같은 분자는 OSM의 길항제의 정의에 포함된다. 선별법은 고효율을 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 길항제를 선별하기 위하여, 합성 반응 혼합물, 세포구획(예를 들어, 멤브레인, 세포 엔벨로프 또는 세포벽), 또는 그의 제조물을 OSM 수용체를 발현하는 세포로부터 제조할 수있다. 이어서 제조물은 후보 분자의 존재 또는 부재하에서 표지된 OSM과 함께 배양할 수 있다. 후보 분자가 OSM에 결합하는 능력은 표지된 OSM의 감소된 결합으로 알 수 있다. 무상으로, 즉 OSM의 기능적 효과를 야기하지 않고 결합하는 분자는 좋은 길항제로서 가장 바람직할 수 있다. 이 시험은 가역적일 수 있고, 표지된 OSM 수용체는 비표지 OSM과 함께 사용될 수 있다. OSM 길항제를 식별하기 위해, ELISA 포맷을 갖는 스크린을 또한 사용할 수 있는데, 여기서는 OSM 수용체 컨주게이트(예를 들어, gp-130-Fc 융합 단백질)가 플레이트상에서 고정된 OSM에 결합하는 것을 막는 후보 분자의 능력을 측정하며, 이 시험에서 결합된 gp130Fc는 효소 표지된 항-Fc 항체 및 비색법에 의해 검출된다.
잠재적 길항제의 기능적 효과는, 예를 들어 후보 분자와 세포 또는 적합한 세포 제조물(cell preparation)의 상호작용에 이어 리포터 시스템(reporter system)의 활성을 측정하고, 그 효과를 OSM 또는 OSM에 대해 동일한 효과를 가져오는 분자의 효과와 비교함으로써 측정할 수 있다. 이와 관련하여, 유용할 수 있는 리포터 계는 생성물로 전환된 비색 표시 기질, OSM 수용체의 기능적 활성의 변화에 민감한 리포터 유전자(reporter gene) 및 당업계에 공지된 결합 분석시험을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 탈체 활액 분비 조직 배양물에서 OSM 검출
실험 1:
류머티스 관절염, 골관절염 또는 건막류에 걸린 것으로 진단된 환자로부터 갓 절제한 활액조직을 살균된 피하주입용 바늘을 사용하여 기계적으로 절단하여 약 1 mm3단편을 만들었다. 이 단편을 96 웰 조직 배양 플레이트(Costar)상의 바닥이 평평한 200 ㎕ 웰에 평판배양하고, 여기에 10%의 열활성화된 AB+수컷 혈청(North London Blood Transfusion Centre), 헤페스(hepes) 10mM, 1%의 나트륨 피루베이트, 1%의 비필수 아미노산(이상 모두 Sigma로부터 입수됨), 4mM의 L-글루타민(Hyclone), 100 U/ml 페니실린 + 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(Hyclone)(완전인간 배지, CHM)으로 보충된 RPMI 1640(Sigma)를 첨가하고, 37℃에서 배양하였다.
배양 상청액 100㎕/웰 시료를 0, 2, 5 및 9 일에 각각 수거하고, 20℃에서 동결시킨 후, ELISA(Quantikine R ＆ D 시스템)에 의해 OSM에 대해 시험하였다. 데이타는 도 1a에 나타내었다. 분비된 OSM을 RA-유도 활액 샘플로부터 검출하였으나, OA 또는 비관절염 대조군 환자로부터 유도된 활막으로부터는 검출하지 못하였다. RA 조직 배양물에서의 OSM 양은 배양 5일 경 최대, 즉 약 1400 pg/ml의 농도에 도달하였고, 9일째는 800 pg/ml보다 많이 잔존하였다.
실험 2:
활액 분비 조직을 PBS중에서 세척하고, 지방 조직은 제거하였다. 살균된 가위를 사용하여 조직을 작은(1-4mm) 단편으로 절단하였다. 이 조직을 사용하기 전에 PBS중에서 세척하였다. 이 조직의 무게를 측정하고, 24 또는 48 웰 플레이트(Costar), 100mg/well에 평판배양하였다. 이 조직을 37℃ 의 온도, 및 10%의 열불활성화된 AB+ 인간 혈청(Sigma), L-글루타민(Life Technologies) 2 mM, 페니실린 200 U/ml과 스트렙토마이신(Life Technologies) 200 ㎍/ml, 니스타틴(Sigma) 480 U/ml, 젠타마이신(Life Technologies) 50㎍/ml 및 헤페스 10 mM(Sigma)로 보충된 돌베코(Dulbecco)의 개질된 이글(Eagle's) 배지중의 CO25%의 조건하에서 배양하고, 여과 살균하였다. 3일째 되는 날에, 상청액을 제거하고, 쌍(paired) 항체(R ＆ D 시스템)를 사용하여 ELISA에서 OSM에 대해 시험하였다.
RA 또는 염증이 유발된 OA를 갖는 환자의 무릎 생체조직으로부터의 활액 분비 조직 배양물은 자발적으로 OSM을 분비한다. 3일간의 배양기간을 거친 후, RA 배양물로부터의 배양물 상청액중의 OSM의 평균 양은 246 pg/ml{30 내지 982의 범위, n=12}였고, OA 배양물로부터는 473 pg/ml{44 내지 2001의 범위, n=14}였다. OSM은 감염된 조직에 의해서는 분비되었으나, 휴지 활액분비조직에 의해서는 분비되지 않았다(도 1b).
실시예 2a: THP-1 세포의 분화(differentiation)
인간의 프로-단구성 라인(pro-monocytic line) THP-1 세포를 10% 열불활성화된 FCS, 헤페스 10 mM, 1% 비필수 아미노산(Sigma로부터 모두 입수됨), L-글루타민(Hyclone) 4 mM, 100 U/ml 페니실린 + 100 ㎍/ml 스트렙토미신(Hyclone)(완전배지, CM) 보충된 RPMI에 주당 2회 계대배양시킨 후, PMA(Sigma) 1 ㎍/ml를 세척한 세포에 가하고, 37℃에서 30분간 배양하였다. 세포를 미리 가온시킨 PBS중에서 3회 세척하고, CM에 재현탁시키고, 96-웰의 바닥이 평평한 플레이트(Costar)에서 1.5 x 105세포/ml로 평판배양했다. 플레이트를 37℃, CO25%의 조건에서 48시간 동안 배양하고, 이어서 PBS로 세척하고, 배지를 교체하고, 24 시간 더 배양하였다. 세포를 사용하기 앞서 PBS 중에서 1회 세척하였다.
실시예 2b: IFN에 의해 자극된 혈액 단구의 제조
인간의 버피 코트(buffy coat)(North London Blood Transfusion Cenetre)을 PBS를 사용하여 1:3으로 희석시키고, 림포프레프(Lymphoprep)(Nycomed UK)상에서 층을 이루게 하고, 실온에서 30분간 600g로 원심분리시켰다. 수거한 PBMC를 PBS로 3회 세척하고, 계수하고, 5 x 106세포/ml로 RPMI 1640 80ml/10% FCS중에서 재현탁시켰다. 20 ml를 4개의 플라스크(175cm2) 각각에 넣고, 37℃에서 밤새 배양하여 단구가 유착되도록 하였다. 비유착 세포는 버리고, 유착 세포는 4℃에서 15분간 차가운 버센(EDTA)으로 배양한 후 긁어 내었다. 세포를 PBS 중에서 2회 세척하고, RPMI 1640 + 10% 열불활성 인간 혈청(Sigma)중에서 6.9 x 105/ml로 재현탁시키고, 250㎕ 세포 현탁물을 바닥이 평평한 66-웰 플레이트(Costar)에 평판배열하였다. 100 IU/ml IFN γ(Genzyme)을 플레이트의 반에 가하고, 나머지 반은 대조군으로 남겨 놓았다. 플레이트를 시험하기 전에 37℃, 5% CO2에서 밤새 교반하였다.
실시예 2c: TNFα 방출 유도(stimulation)
동결 건조된 재조합 인간 온코스테틴 M(rhOSM)을 "R ＆ D 시스템"으로부터 구입하고, 무균성 PBS + 0.1% BSA(Sigma)중에서 10㎍/ml로 희석시키고, 분취량을 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다. rhOSM, 이 콜라이(E. coli)-유도 LPS 또는 CM을 상기와 같이 제조된 대식세포, 단구 또는 Thp-1 세포의 3개씩의 웰에 가하고, 37℃, 5% CO2에서 7시간 동안 배양하였다. 상청액을 수거하고, ELISA 에 의해 TNFα단백질에 대해 시험할 때까지 -20℃에서 냉동시켰다. TNFα mRNA에 대하여 공동시험을 할 목적으로 고안된 시험기에서, 세포를 4시간 동안 상기와 같이 배양하고, PBS에서 1회 세척하고, RNA 추출 완충제(RNAzole)에 용해시켰다.
RNA는 다음과 같이 검출하였다. 전체 RNA는 제조자의 지침에 따라 제조하였고, DEPC 처리된 물중에서 -80℃에서 저장하였다. RT-PCR을 위해, RNA 약 1㎍을 올리고 dT 프라이밍{제1 스트랜드(strand) cDNA 합성 키트, Pharmacia Biotech}을 사용하여 역전사시키고, 생성되는 cDNA를 TNFα에 대한 하기 프라이머(Clontech amplifier), 즉 정방향(forward)-GAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCA(서열 번호 1), 역방향(reverse)-GCAATGATCCCAAAGTAGACCTGCCCAGAC(서열 번호 2)를 사용하여 30회의 PCR에 적용시켰다. 증폭된 생성물(444bp)을 아가로우즈 겔(2%) 전기이동법에 의해 분리시키고, 에티디움 브롬화물 염색법에 의해 가시화하였다.
실시예 2d: OSM이 단구계(monocyte lineage)의 인간 세포에서 TNFα 생성을 유도함을 나타내는 예
PMA를 사용하여 분화되도록 유도된 인간 프로-단핵 라인 Thp-1를 충분히 세척하고, 상기와 같이 재조합 인간 OSM과 함께 배양하였다. 배양 상청액을 8 시간째에 제거하고, 제조자 지침에 따라 특정 ELISA(TNF Quantikine, R ＆ D Systems)을 사용하여 TNFα생산에 대하여 시험하였다. OSM은 투약량과 관련된 TNFα의 방출을 유도하였고, 이때 OSM이 1 ng/ml이상에서 측정가능하며, 200-500 ng/ml에서 최대이고, 일반적으로는 2500 pg/ml 보다 큰 TNFα분비 수준에 도달하였다. 대표적인 실험결과를 표2에 나타냈다. 상기와 같이 RT-PCR에 의해 측정된 TNFα메시지의 발현(expression)은 비자극 대조군 세포에 비해 OSM 100 ng/ml으로 4 시간 동안 배양된 THP-1 세포에서 매우 증가되었다(도 2).
중요한 점은, OSM을 예비 비등시키면 TNFα분비가 완전히 감소되기 때문에, TNFα유도는 오염된 내독소로 인한 것은 아니었다(데이타에는 나타나지 않음). 또한, 특정 항체를 사용한 면역침천법에 의해 OSM을 제거함으로써 활성을 제거하였다(데이타에 나타나지 않음). 이 발견들은 7일간의 배양에서 분화되고, 인터페론-γ및 인간 혈액 대식세포로 미리 활성화된 인간 혈액 단구를 포함하는 것까지 확장 해석된다. 이 두 세포형은 8시간 동안 OSM과 함께 배양될 때 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 TNFα를 분비하였다. 단구에 의한 평균 TNFα분비는 1447 pg/ml(범위는 137-4709 mg/ml이고; n=4 공여자) 및 대식세포당 542 pg/ml(범위는 62-1428 pg/ml이고; n=3 공여자) 이었다.
실시예 3a: 연골 분해(degradation) 시험
소의 비중격(nasal septum) 연골을 도살후 4℃로 밤새 유지시켰다. 직경이 2 mm인 원반을 2mm의 슬라이스로부터 절단하고, HBSS로 2회 세척하였다. 24 웰 플레이트(Costar)의 웰당 3개의 원반을 글루타민 2 mM, 스트렙토미신 100 ㎍/ml, 페니실린 100 U/ml 및 앰포테리신 B 2.5㎍/ml(연골 분해 배지, CDM)으로 보충된 HEPES 25 mM를 함유하는 DMEM(Sigma) 600㎕중, 37℃, 5% CO2에서 24 시간 동안 배양하였다. 연골을 CDM 600 ㎕ 단독, 인간 재조합 TNFα2, 10 또는 50 ng/ml 단독, rhOSM(R ＆ D systems) 10 ng/ml 단독중에서 또는 TNFα+ OSM 10 ng/ml중에서 4개씩의 웰에서 배양하고, 37℃, 5% CO2에서 7일간 배양하였다. 상청액을 수거하고, 1일과 동일한 시제를 함유하는 신선한 배지로 대체하였다. 실험을 7일간 더 계속하고, 14일째 되는 날 모든 배지를 제거하고, 잔존하는 연골을 EDTA 5mM 및 시스테인 염산염 5 mM를 함유하는 인산염 완충제(pH 6.5) 0.1 M중의 파파인(Sigma) 4.5 mg/ml로 소화시키고, 65℃에서 16 시간 동안 배양하여 연골 단편의 잔존 히드록시프롤린 함량을 결정하였다. 14일까지 배지에 방출된 OH-프롤린의 누적 량을 측정하고, 하기와 같이 방출된 총량의 전체%로 나타냈다.
실시예 3b: 히드록시프롤린 분석
히도록시프롤린 방출 시험(콜라겐 분해의 척도)을 문헌{Bergmann I and loxley R. (1963) Anal. Biochem. 35 1961-1965.}에 기재된 방법의 미세역가판 변형을 사용하여 클로로아민(Chloramine) T(7%) w/v 을수행하고, 아세테이트 시트레이트 완충제(나트륨 아세테이트 57g, 트리-나트륨 시트레이트 37.5 g, 시트르산 5.5 g, 물 1L당 프로판-2-올 385 ml)로 희석시켰다(1:4). P-디메틸아미노벤즈알데히드(DAB; 60% 과염소산 30 ml중 20g)를 프로판-2-올을 사용하여 1:3으로 희석시켰다. 시험물(specimen)을 105℃에서 20 시간 동안 HCl 6M중에서 가수분해시키고, 가수분해물을 "Savant Speed Vac"를 사용하여 NaOH상에서 진공 건조시켜 중화시켰다. 잔류물을 물에 용해시키고, 샘플 또는 표준물(히드록시프롤린; 5-30 ㎍/ml) 40 ㎕를 "클로라민(Chloramine)-T" 시약 및 이어서 4분후 DAB 시약(150 ㎕)과 함께 미세역가판에 가하였다. 판을 35분 동안 65℃로 가열하고, 냉각시키고 560nm에서 흡광도를 측정했다.
실시예 3c: 탈체 연골 외이식편으로부터의 MMP1 및 콜라겐 방출을 증가시킴에 있어 TNFα와의 OSM의 상승작용
소의 비 연골을 OSM 단독 또는 TNFα단독(모두 R＆D Systems 제품임), 또는 OSM과 TNFα의 조합물이 존재하거나 없을 때, 14일 간 4개씩의 웰중에서 상기와 같이 배양하였다. 배양 상청액을 7일째 되는 날에 총 콜라게나아제 활성에 대해 분석하고, 14일째 되는 날에 방출된 콜라겐에 대해 분석하였다. 도 3b의 데이타는 각각 10 ng/ml 또는 50 ng/ml로 사용된 OSM 또는 TNFα중 어느 것도 유의적인 MMP1 분비를 유도하지 않았다는 것을 보여준다. 그러나, 상기 농도로 사용된 OSM과 TNFα의 조합물은 측정가능한 MMP1 방출을 유도하였다. 이 발견과 함께, OSM과 TNFα간의 현저한 상승작용에 의해 연골로부터 콜라겐 방출이 증가되었다는 사실이 아울러 발견되었다. 도 3a는 10 ng/ml 농도의 OSM만으로는 콜라겐 방출을 유도할 수 없지만, 사용된 TNFα의 농도가 가장 높을 때(50ng/ml), 적지만 명백한 효과(10% 미만)을 갖는다는 것을 보인다. 그러나, OSM 10 ng/ml과 TNFα50 또는 10 ng/ml을 함께 사용한 경우, 각각 콜라겐이 80% 및 30% 이상 방출되었다.
실시예 4a: L-셀렉틴을 통한 PBMC의 자극
단핵 세포를 인간 버피 코오트로부터 상기와 같이 분리하였다. 세포 5 x 105을 0.5 ml 부피로 평판배향하고, 분자량이 60 내지 80 kD인 푸코이단(Sigma) 항-L-셀렉틴 단클론성 항체, LAM1-3 및 TQI 또는 이소타입 대조군 IgG 항체(모두 Coulter 제품임)와 함께 37℃, 5% CO2중에서 24시간 동안 배양하였다. 상청액을 제조자 지침에 따라 특정 ELISA 분석(Quantikine, R＆D Systems)을 사용하여 OSM에 대해 시험하였다.
실시예 4b: L-셀렉틴의 라이게이션이 OSM 분비를 유도하는 예
건강한 공여자로부터 얻은 단핵세포를 항-인간 L-셀렉틴 항체(TQ1 또는 LAM-1) 또는 배양 상청액을 이소타입 대조군 항체와 24 시간 동안 배양하고, ELISA을 사용하여 OSM에 대해 분석하였다. 도 4a의 데이타는 항-L-셀렉틴 항체를 사용한 둘 다에서 OSM의 방출이 투약량에 의존한다는 것을 나타낸다. 대조군 항체는 최소한 효과를 나타내었다. 이어서, L-셀렉틴 작동제 푸코이단이 단핵 세포 배양물로부터 OSM을 유도하는 능력을 조사하였다. 도 4b는 푸코이단이 RA 및 OA 활액 생검 배양물에서 보여지는 것과 유사한 정도의 분비를 유도하는, OSM 분비의 강력한 자극제임을 나타낸다(실시예 1, 실험 2, 도 1b 참조).
실시예 5a; 면역조직화학
신선한 인간 조직 샘플을 CO2냉각 액체 헥산중에 동결시키고, 사용하기 앞서 액체 N2의 기상중에 저장하였다. 7 mm의 동결절편 부분(cryostat)을 절단하여 3-아미노프로필트리에톡시실란(APES)(Maddox P. et al J. Clin Path. 40; 1256-1260, 1987)으로 코팅된 유리 슬라이드에 놓고, 2%의 파라포름알데히드중, 4℃에서 10분간 고정시켰다. 내인성 과산화효소 활성을 0.05%의 H2O2중에서 20분간 봉쇄하였다. 비결합(unconjugated) 일차 단일클론항체를 "CD62P(CLB, 네덜란드), CD62E 및 gp130 (R＆D Systems, 영국)로부터 입수하였다. 일차 항체를 실온에서 45분간 최적으로 희석시켰다. 음성대조 절편을 시험 항체와 동일한 단백질 농도로 사용된 항-BrdU 단일클론항체(SIGMA)와 함께 배양하였다. 비오 티닐화된 2차 항체에 이어 과산화효소 표지된 ABC(Vector Elite)를 사용하여 1차 항체를 표지하였다. 과산화효소를 DAB(3,3' 디아미노벤지딘) 기질(SIGMA)로 발현시켰다.
실시예 5b: RA 활액에서의 셀렉틴 및 OSM 수용체의 공동 분포(co-distribution)
감염된 RA 활액 조직의 동결 절편을 전술한 바와 같이 gp130 및 P 및 E 셀렉틴에 대한 특정 항체를 사용하여 염색하였다. 도 5의 현미경사진은 RA 혈관 내피가 gp130에 대해 강한 양성으로 염색되었음을 나타낸다. P- 및 E-셀렉틴 발현을 위해 RA 활액을 염색한 결과 혈관 내피 세포에 한정된, gp130과 동일한 염색패턴을 나타냈다(각각 도 5 b 및 c). 도 5c에서 E-셀렉틴 염색과 관련한 혈관주위의 단핵세포침투를 주목할 필요가 있다. 대조군으로 일차 항체를 사용한 연속 절편의 염색은 혈관내피세포상에서 음성이었다(도 5 패널 c 및 d).
실시예 6a: 콜라겐 유도 관절염의 항-OSM 항체 처리
콜라겐 유도 관절염을 소의 음성 제2형 콜라겐(CII)으로 면역성을 부여하여 상기한 바와 같이 숫컷 DBA/1 마우스(8 내지 12주)에서 유도했다(Plater-zyberk C. Clin. Exp. Immunol 98:442-7 1994 and Plater-zyberk C. Nature Medicine 1: 781-5, 1995). CII 면역부여후 16일째 되는날 부터, 마우스를 모니터링하여 관절 붉기(joint redness) 및 팽윤(swelling)의 증상을 탐지하였다. 임상적 증상이 처음 나타냈을 때부터, 마우스를 주당 3회 조사하고, 각각의 사지(limb)를 가시적인 스코어(즉, 0 = 정상, 0.5 = 2 이상의 지(digit)에서의 관절염, 1 = 지와 관계없는 발의 미세한 팽윤 및 홍반, 1.5 = 지와 관계있는 점을 제외하고 1과 동일, 2 = 지와 관계 없는 발의 홍반과 관계된 더 명백한 팽윤, 3 = 운동의 손상이 있는 심한 팽윤, 3.5 = 지와 관계 있고 3과 동일함)를 사용하여 질환의 중증도를 평가하였다. 발의 두께를 캘리퍼스를 이용하여 측정했다(Proctest 2T, Kroeplin Langenmesstechnik).
CII 면역화된 DBA/1 마우스를 질환을 임상적으로 발생시킨 후 염소의 항-마우스 OSM 항체(R and D systems, cat.no. AF-495-NA)의 복강내 주입에 의해 치료하였다. 질환의 진행을 상기와 같이 평가하였다. 발병후 14일째 되는 날에 마우스를 경관탈구(servical dislocation)시켜 죽이고, 발을 조직병리학 시험을 위해 수거하였다.
실시예 6b: 관절염에 걸린 마우스 관절의 조직학적 평가
다리의 피부를 벗기고, 무릎 및 발을 절단하여 제거하였다. 관절을 10%의 완충 포르말린중에 4일(무릎) 또는 하루(발)동안 고정시키고, 25%의 포름산중에서 3일간 탈회시키고(decalcification), 탈수시키고, 파라핀 왁스에 담그었다. 관절의 시상 절편(5-7 mm)에서 왁스를 제거하고, "사프라닌 O, 패스트 그린/철 헤마톡실린(Safranin O, fast green/iron hematoxylin)" 대비염색법(상기 "Plater-zyberk Nature Medicine"에서 언급된 바와 같음)으로 염색하였다. 활막염은 0(침윤이 없음)에서 3(광범위한 침윤 및 활액과형성)까지 임의로 분류되었다. 연골의 프로테오글라이칸 고갈을 나타내는 사프라닌 O 염색 강도의 손실 정도를 0(완전히 염색된 연골)에서 3(연골의 완전한 고갈 및 손상)까지의 범위로 점수를 매겼다.
실시예 6c: 콜라겐 관절염에 걸린 마우스의 관절 조직에서 OSM mRNA의 검출
관절염에 걸린 마우스와 미처리된 대조군 동물을 죽이고, 발(foot과 paw를 모두 포함)을 제거하고, 액체 질소에 즉석 냉동(snap frozing)시킨 다음, -80℃에서 저장하였다. 울트라튜락스(ultraturrax) 기계적 균질기를 사용하여 RNAzole에서 각각의 사지(limb)를 분쇄함으로써 RNA를 준비했다. 특정 물질을 고정시키고, 이어서 상청액을 클로로포름 1/10th 부피와 혼합하고, 스피닝(spinning)하여 RNA 함유 액상을 분리하였다. RNA를 RNAmate(BioChain Institute Inc. San Leandro, California)를 사용하여 침전시켜 오염된 프로테오글라이칸을 제거하였다. 에탄올 75%중에 세척한 다음, 전체 RNA를 DEPC-물에 용해시키고, "파마시아(Pharmacia) 제1 스트랜드 cDNA 키트" 및 "올리고 dT 프라이밍"을 사용하여 역전사시켰다. PCR 반응을 마우스의 OSM 서열(Yoshimura A. et al EMBO Journal 15 1055-1063, 1996)으로부터 유도된 프라이머(Life Technologies custom primers){즉, GGGTGTCCTACCAAGGAACA(서열 번호 3), CTGAGACCTTTCAAGAGGAC(서열 번호 4)}를 사용하여 수행하였다. 30회의 PCR후, 반응 생성물(379bp)을 아가로스겔전기영동법을 사용하여 검출하였다. RT-PCR을 사용하여 관절염에 걸린 마우스의 OSM mRNA를 상기한 바와 같이 검출하였다. 도 6은 OSM-특이 PCR 생성물의 양이 임상적 증상 스코어가 점진적으로 증가되는 동물로부터 취해진 관절에서 증가되었음을 보여준다. 대조적으로, 대조군 동물에서는 아무런 OSM 메세지를 탐지하지 못하였다.
실시예 6d: OSM의 중화가 콜라겐 유도 관절염을 호전시키는 예
중화가 관절염의 임상적 증후를 개선시킨다는 가설을 직접 시험하기 위하여, OSM에 대한 다클론항체를 중화시키는 두가지 주입액 100㎍을 6마리 마우스로 이루어진 군에서 임상적 관절염이 처음 나타난 후, 1일 및 3일째 되는 날에 복강내로 투여하였다. 동시에, 관절염에 걸린 6마리 마우스로 아루어진 두번째 군을 항-OSM 대신 면역화되지 않은 염소의 IgG를 사용하여 동일하게 처리하였다. 마우스를 관절염의 임상적 중증도에 대해 점수를 매기고, 개체의 발 팽윤을 2차 항체 주입후 11일 동안 측정하였다. 대조군 염소 IgG로 처리된 마우스는 관절염이 점진적으로 진행되었고, 발 팽윤이 수반되었다.
항-OSM 항체로 처리된 마우스 및 n 표시된 대조군에서는 임상적 스코어 및 발 팽윤면에서 유의적으로 덜 심각한 관절염이 진행되었다(도 7a 및 b). 또한, 관절염이 있는 발의 수는 대조군 IgG-처리된 동물과 비교시 처리된 항-OSM 에서 유의적으로 감소하였고, 이는 상기 치료적 프로토콜이 이미 진행된 질환을 갖는 동물에서 질환이 더 진행 되는 것을 효과적으로 막는다는 것을 나타낸다(데이타에 안나타남). 이 실험을 군(group)당 7마리 마우스를 사용하여 동일하게 반복했으며, 아주 유사한 데이타를 나타내었다(데이타에 안나타남).
항-OSM 항체로 처리함으로써 임상적 중증도가 감소된다는 사실은 발병 14일째 되는 날에 관절염이 있는 발의 사후적인 조직학 검시에 의해 확인되었다. 콜라겐-관절염에 걸린 마우스를 대조 IgG 또는 항-OSM 항체로 처리한 후 14일이 경과한 시점에 관절 침윤 및 연골 손상을 비교하는 조직학적 데이타가 도 8에 나타나 있다. 대조군 IgG로 처리된 마우스는 PMNs 및 단핵 세포에 의한 광범위한 관절 침윤을 보였다(도 8a). 이것은 광범위한 호중구 침윤을 특징으로 하는, 관절 연골의 표면 파괴를 수반한다(도 8b). 이와는 대조적으로, 도 8c 및 d는 경미한 관절염을 갖는 항-OSM 처리된 동물의 대표적인 관절을 보여주며, 온전한 관절연골과 함께 현저하게 감소된 수준의 세포 침윤을 나타낸다. 더욱이, 관절을 연골 및 활액의 조직병리학적 외관에 대해 맹검(blindly) 스코링하였고, 정상, 중간, 심각함 3종류로 보고하였다. 치료군당 총 73개의 개별 관절을 평가 하였다. 데이타를 표1에 나타냈다. 항-OSM 처리된 동물에서, 조사된 관절중 47%가 정상이거나 가벼운 활막염을 나타낸 반면, IgG 처리된 대조군중에서는 21%에 불과하였다. 유사하게, 항-OSM 처리된 마우스에서는 조사된 관절중 58%가 연골손상을 거의 나타내지 않은 반면, IgG 처리된 군에서는 21%에 불과하였다. 처리후 1일째 되는 날에 관절붉음 및 팽윤의 명확한 표시를 나타낸 2 마리의 항-OSM 처리된 마우스중 관절은 관절염이 완전하게 호전되었음을 나타내며, 연골 또는 활막에의 세포침윤 또는 가시적인 비정상을 나타내지 않았다(데이타에 안나타남).
항-OSM 또는 대조군 IgG로 처리된 마우스로부터의 관절의 조직학적 스코링
처리 정상/가벼운 증상 보통 심각
연골 활막 연골 활막 연골 활막
항-OSM 58% 47% 21% 23% 22% 31%
IgG 21% 6% 26% 37% 53% 57%
조사된 전체 관절: 73 관절/처리
실시예 7: 작은 유기 분자 길항제의 식별
명백한 세포 독성을 야기함이 없이 리포터 세포주로부터 OSM-유도 생물학적 반응을 억제함으로써 OSM의 작은 유기 분자 길항제를 식별하였다. 대조군으로서, TNFα-반응성 세포주에 대한 화합물의 영향을 또한 시험하였다.
실시예 7a: 인간 OSM의 발현 및 정제
제거된 25 아미노산 선도서열(leader sequence)을 갖는 인간 OSM(hOSM)을 인코딩하는 DNA 단편을 hOSM에 대한 EMBL 서열(등록 번호 제M27288호)로부터 고안된 합성 올리고누클레오티드 프라이머 5'-GCATAGGATCCGCGGCTATAGGCAGCTGCTCG-3'(서열번호 5) 및 5'-ATCGCGAATTCCTACCGGGGCAGCTGTCCCCT-3'(서열번호 6)를 사용하여 활성 백혈구 cDNA 라이브러리로부터의 중합효소 연쇄반응(PCR)를 사용하여 증폭시켰다. 이 PCR 생성물을 pCR2.1(Invitrogen)로 서브클로닝하여 pCR2.1hOSM을 얻었다.
SalI 제한 엔도뉴클레에이스 절단부위를 ''Quickchange" 부위에 관계된 돌연변이 생성 키트(Stratagene)를 사용하여 TG에 AC를 삽입함으로써 세균성 발현 벡터 pGEX-3X(Pharmacia)내의 인자(Factor) Xa 부위내에 만들어 하기와 같이 묘사되는 서열을 생성하였다(서열 번호 7):
pCR2.1hOSM내의 OSM 삽입체(insert)의 서열을 확인한 후, 인간 OSM의 성숙된 형태를 인코딩하는 DNA를 BsmBI 제한 엔도뉴클레에이스 부위(밑줄친 부분)를 함유하는 정방향 프라이머 5'-GATACGATCGTCTCATCGAGCGGCTATAGGCAGCTGC-3'(서열 번호 8) 및 EcoRI 자리(밑줄친 부분)를 함유하는 역방향 프라이머 5'-ATTACATGGAATTCCTATCTCCGGCTCCGGTTCGG-3'(서열 번호 9)를 사용하여 이 벡터로부터 PCR 증폭시켰다. 이 PCR 생성물은 선도서열이 없고, 단백질 성숙과정에서 제거되는 C-말단으로부터의 31 아미노산 없이 인간 OSM의 성숙된 형태를 포함한다. PCR에 이어서, 증폭된 DNA 단편을 정제하고, 제한 효소 BsmBI 및 EcoRI로 소화시키고, SalI 및 EcoRI로 제한된 변형 pGEX-3X 벡터(Pharmacia: GST를 인코딩하는 DNA 함유)로 서브클로닝(sub-cloning)하여 플라스미드 지정 pGEX 196을 발생시켰다. 서열을 확인한 후, 플라스미드 pGEX196을 E.coli, BLR-DE3(Novagen)로 변형시켰다. 변형된 세포를 암피실린 100 ㎍/ml으로 보충된 2 x YT + G 배지(트립톤 16g/l; 효모 추출물 10g/l; NaCl 5g/l; NaOH에 의한 pH 7.0; 글루코오스 2%)중에서 배양하였다.
정제한 단백질을 제조하기 위해, 이 콜라이 BLR-DE3중에 pGEX를 밤새 배양시키고 1:100으로 희석시키고, 37℃에서 0.8의 A600nm으로 성장시켰다. GST-hOSM 융합 단백질에 IPTG(이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노사이드) 0.1mM 를 가함으로써 발현을 유도하고, 배양을 2 시간 더 지속하였다.
GST-hOSM을 배치 정제에 의해 이 콜라이 배양액으로부터 분리하였다. 세균성 배양물 3L를 원심분리(3000 rpm)에 의해 수거하고, 생성되는 펠렛을 프로티나제 억제제 정제(Proteinase inhibiter tablets)(Boerhinger)을 함유하는 아주 차가운 50 ml PBS(인산염 완충 용액)중에 재현탁시켰다. 리소짐 5 ml를 가하고, 세포 현탁액을 얼음위에서 5분간 배양하였다. 세포를 4℃에서 초음파처리하고, 트리톤 X100 1% 및 디티오트레이톨 10mM를 가하였다. 이어서, 용해물을 4℃에서 10분간 반복적으로(end over end) 혼합한 다음, 원심분리시켰다(14000g). 상청액을 글루타티온 아가로우즈(Sigma cat no. G4510)에 가하고, 4℃에서 30분간 반복적으로 혼합하였다. 이 현탁액을 가볍게 원심분리하고, 상청액을 흡인하여 제거하고, 침강된 아가로우스를 매우 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 용리 완충제{글루타치온 20 mM, 트리스(pH 8.0) 100 mM, NaCl 100 mM, 다시 pH 8.0}을 가하고, 현탁액을 얼음위에서 5분간 배양하였다. 상청액을 수거하고, 분획을 "나트륨 도데실 황산염/폴리아크릴아미드 겔 전기영동법"(SDS-PAGE)을 사용하여 분석하고, 이어서 "코마ㅆ에 브릴리언트 블루 염료(Coomassie brilliant blue dye)"로 염색하여 정제 단백질의 일체성(integrity)을 확인하였다.
단백분해성 절단 최적화 실험을 인자 Xa 및 트롬빈을 사용하여 세팅하였다(트롬빈은 "코마씨에 브릴리언트 블루" 염색된 SDS-PAGE 분석에 의해 확인된 바와 같이 최적량의 hOSM을 산출함). GST 및 OSM 생성물을 이온교환크로마토그래피로 분리시키고, 정제 OSM 생성물을 N-말단 서열화(N-terminal siquencing) 및 질량분광법에 의해 확인하였다.
실시예 7b: HepG2 B6: OSM-유도 sPAP 분석
HepG2 세포주(ECACC)을 하기에 기술한 바와 같은 sPAP(분비된 태반의 알칼리성 포스파타제) cDNA의 6개의 기능성 STAT3 반응 요소(REs) 업스트림(upstream)으로 안정하게 형질감염시켜 HepG2B6을 형성하였다. STAT3(전사의 시그널 트랜스듀서 및 활성제)은 IL-6 시토킨류(family) 세포간 시그널링 다단계에서의 중간체이다. 세포 표면 수용체를 이합체화한 후, STAT3를 가인산반응(phosphorylation)시킨 다음, 핵내의 DNA REs에 결합시키고, DNA 가 sPAP인 이 구조물에서 DNA 다운스트림을 활성화한다. 따라서, 이 라인을 구동시켜 온코스타틴 M중에서 밤새 배양함으로써 sPAP를 만들 수 있다.
STAT 반응성 분비 태반성 알칼리성 포스파타제(sPAP) 리포터 유전자를 다음과 같이 제작하였다. 초기에, 재발성 STAT3 반응 요소(Wegena U.M et al Mol Cell. Biol, 1993 Vol 13 p276-288 Table 1 on p277) 및 5'Xhol 부위의 3카피를 함유하는 올리고뉴클레오티드 쌍을 플라스미드 pBluescript tkSPAP의 독특한 Sall 부위에로 클로닝하여 p11P3-tk-SPAP를 만들었다. 이어서, 피보리노겐 β프로모터(Dalmon et al, Mol Cell Biol; 1993; 13: 1183-1193, 도 9는 GAT 꼬리부가 없는 TTG 선도부 및 IL5RE 콘센서스 모티브를 포함한 hβ FG 서열을 나타냄)에서 발견되는 STAT3 반응 요소를 코드화하는 합성 올리고뉴클레오티드의 추가적인 6 카피를 p11P3-tk-SPAP의 Xhol 부위에로 클로닝하여 pllx6/llP3-tk-SPAP를 발생시켰다. 반응 요소의 수를 확인하기 위하여 서열화한 후, pllx6/llp3-tk-SPAP를 Nrul 및 Xbal로 소화시켜서 9STAT 반응 요소 및 tk-SPAP 코딩 서열을 함유하는 DNA의 단편을 분리하였다. 이어서, 이것을 플라스미드 pcDNA4(Invitrogen)(CMV 프로모터를 대체함)의 Xbal 부위와 Nrul사이로 전달하여 9STAT3 반응성 요소 함유 SPAP 리포터 유전자 및 HepG2 세포주의 확립에 대한 선택성 마커인 NeoR을 만들었다.
HepG2 세포(ECACC)를 CO25%, 습도 92%의 분위기, 37℃의 온도에서, 2 mM L-글루타민, NEAA 1%, HI 태아 송아지 혈청 10%로 보충된 DMEM 배지중에서 성장시켰다. STAT-sPAP 리포터로 형질감염시키기 위해 세포를 10 cm의 조직 배양 원반중에서 1% 컨플루언스로 놓고, 인산칼슘 형질감염 키트(Invitrogen)을 사용하여 STAT-sPAP 리포터 벡터 10㎍으로 형질감염시켰다. 1 mg/ml G418의 존재하에서 클론 선별을 한 후, 개별 세포주를 IL-6가 STATsPAP 리포터 유전자로부터의 sPAP의 발현의 증가를 야기하는 능력에 대해 선별하였다.
HepG2B6 세포를 배지{DMEM(Sigma), HI FCS 10%, 비필수 아미노산 1%, 글루타민 2mM, G418 500㎍ml-1, 모두 "Life Technologies" 제품임} 100㎕ 중의 웰당 3 x 104세포의 최종 농도로 96웰 플레이트에 넣었다. 세포를 48 시간 동안 평형이 되게 하였다. 추정(putative) 항-OSM 고체 화합물을 사용하여 DMSO 중의 20 mM의 스톡 희석액(stock dilution)으로 만들고, DMSO로 연속 희석(1:3)시켰다. 이어서, 이것을 HepG26B 시험 배지중에서 더 희석시켰고, 이 배지는 HI FCS 10% 대신에 10% 열 불활성화된 FCS를 사용하고, 낮은 알칼리성 포스파타제 활성(Life Technologies)을 가짐을 제외하고 상기 배지와 같다. 화합물을 200 μM의 탑 농도 내지 1%의 DMSO 최종 농도중의 0.09㎛의 최종 농도로 희석(1:3)시켰다(즉, 200, 66.67, 22.22, 7.47, 2.47, 0.82, 0.27, 0.09 및 0 μM). 기존 배지를 웰로부터 제거하고, OSM( 2ng ml-1) 함유 희석된 화합물(R ＆ D Systems)로 대체하고, 세포를 20 시간 더 배양하였다. 각각의 희석을 3회 수행하였다. 배지 20㎕를 각각의 웰로부터 제거하고, 기질로서 pNPP(p-니트로페닐 포스페이트;Sigma)을 사용하여 sPAP 활성에 대해 분석하였다. 내인성 알칼리 포스파타제를 L-호모아르기닌으로 차단하였다. 기질의 광학 밀도를 405-650 nm에서 판독하였다. 화합물의 농도를 생성된 sPAP의 척도로써 OD에 대해 플로팅하고, 이를 분석하여 IC50값을 결정할 수 있다.
실시예 7c: A549세포: TNFα유도 sPAP 분석
이 분석에서는 알칼리성 포스파타제에 결합된 E-셀렉틴 유전자의 시토킨 반응 영역을 포함하는, 리포터 유전자로 안정하게 형질감염된 A549 세포를 사용하였다(Ray et al., Biochem J. 328:707-715, 1997). 이 형질감염된 세포주를 구동시켜 TNFα와 함께 밤새 배양함으로써 sPAP를 생성할 수 있다.
A549 세포를 96 웰 플레이트에 평판배양하는데 최종농도를 배지 100㎕중에서 웰당 5 x 104세포로 하였다. 세포를 24시간 동안 평형화시켰다. 추정 항-OSM 고체 화합물을 사용하여 DMSO중의 스톡 희석액 20 mM로 하였고, DMSO중에서 연속해서 희석시켰다(1:3). 이어서, 이것을 배지{DMEM, 열 활성화된 FCS 1%, 낮은 알칼리 포스파타제 활성을 가짐, 비필수 아미노산 1%, 글루타민 2mM, G418 500㎍ ml-1, (모두 "Life Technologies" 제품임)}중에서 추가로 희석시켜 1%의 DMSO 최종농도중에서 0.09-200 μM의 농도반응을 얻었다. 기존 배지를 웰로부터 제거하고, TNFα(R＆D System) 3ng ml-1를 또한 함유하는 희석된 화합물로 대체하였다. 세포를 20시간 더 배양하였다. 각각의 희석을 3회 수행하였다. 배지 20㎕를 각각의 웰로부터 제거하고, 기질로서 p-니트로페닐 포스페이트(Sigma)를 사용하여 sPAP 활성 시험을 하였다. 내인성 알칼리 포스파타제를 L-호모아르기닌(Sigma)으로 차단하였다. 기질의 광학 밀도를 405-650 nm에서 판독하였다. 화합물의 농도를 생성된 sPAP의 척도로 OD에 대해 플로팅하고, 이를 분석하여 IC50값을 결정할 수 있다.
실시예 7d: 세포 생존도 분석
세포 생존도를 대사활성 세포에서 탈수소효소가 테트라졸륨 화합물{3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸륨}, 내부 염 MTS를 490nm에서 직접 측정될 수 있는 가용성 포르마잔 생성물로 환원시키는 능력으로써 측정하였다.
페나진 메토술페이트(PMS; Sigma) 0.046㎍/ml 를 함유하는 MTS(Promega) 2mg/ml 용액을 돌베코 PBS중에서 제조하였다. sPAP 활성 시험을 위해 배지를 제거한 후, MTS/PMS 20㎕/웰을 가하였다. 이어서, 세포를 45분간 더 배양하였다. 이어서, 490nm에서의 흡광도를 630 nm의 레퍼런스(reference)를 사용하여 측정하였다.
실시예 7e: 길항제
N-(1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4일)벤자미드(Davoll and Kerridge, J. Chem. Soc. 2589, 1961)(GW 340442X)은 OSM 유도 sPAP 방출의 농도 의존적인 억제(IC50값은 0.3μM임)의 결과를 낳았으나(도 9), TNFα유도된 sPAP의 억제력은 훨씬 덜 강력하였다(IC50값은 약 92μM임)(도 10). 따라서, 이 화합물은 TNFα보다 OSM에 대한 선별성이 크다(100배 보다 큼).
실시예 8a: 항-인간 OSM 항체의 발생 및 시험
단일클론 항체를 마우스에서 인간 OSM(R+D Systems)에 대해 다음과 같이 발생시켰다. 0, 3, 5 및 24일째(27일째, 염수중의 항원 1㎍을 복강내로 마우스에 주입함)되는 날에 각각 피하 또는 복강내로 주입된, RIBI 애쥬번트(RIBI, Hamilton, MT)중에 유화된 재조합 인간 OSM 항원 1㎍ 및 프레운트(Freund's) 완전 애쥬번트중의 항원 1㎍ 의 조합, 또는 0, 3, 5, 24 및 53일째에(54일째 되는 날에 염수중의 항원 1.5 ㎍을 복강내로 마우스에 주입함) 복강내로 주입된, RIBI 애쥬번트중에 유화된 항원 1㎍과 함께, 재조합 인간 OSM 항원(R ＆ D Systems)으로 SJL 암컷 마우스(Jackson Inc. Bar Harbor, MA)에 면역성을 부여하였다.
최종적으로 면역성을 부여한 후 24시간 되는 시점에서, 마우스를 죽이고, 비세포를 수거하고 융합준비를 하였다. 융합 절차는 문헌{Su J-L et al: Hybridoma 1998; 17(1): 47-53}에 기술되었다. 요약하면, 비세포와 골수종 세포 P3X63Bcl-2-13{Kilpatrick KE, et al Hybridoma 1997; 16(4): 387-395}( 5:1 또는 1:1의 비)을 폴리에틸렌글리콜 1500(Boehringer Mannheim, 독일)을 사용하여 융합하였다. 융합 세포를 태아 송아지 혈청(Hyclone, Logan, UT), "1 X Origen Hybridoma Cloning Factor"(Igen, Gaithersburg, MD), L-글루타민 2mM 및 페니실린/스트렙토미신으로 보충된, 동일한 부피의 RPMI 1640(Life Technologies, Inc., Gaithesburg, MD) 및 EXCELL-610(JRH Biosciences, Lenexa, KS)로 이루어진, 히브리도마 성장 배지중의 1 x 106세포/ml로 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 24-웰 미세가역판(Costar, Cambridge, MA)에 1 ml/웰로 평판배양했다. 24시간 후, 히브리도마 성장 배지중의 2x HAT-선택 배지 1 ml, 히포크산틴 100 μM, 아미노프테린 0.4 μM, 티민 16 μM(Life Technologies, Inc.)을 각각의 웰에 가하였다. 37℃, CO25%에서 2주간 배양한 후, 히브리도마 상청액을 ELISA에 의해 항-OSM 항체의 분비에 대해 선별하였다. 제한적 희석 클로닝(limiting dilution cloning)을 선별된 히브리도마상에서 수행하였다.
히브리도마 상청액 및 희석된 혈청을 결합된(bound) 인간 OSM 함유 96 웰 플레이트에서 배양하였다. 항-hOSM 항체를 알칼리성 포스파타제 항-마우스 항체에 의해 검출하였다. 양성 결과를 나타내는 항체에 대한 중복(duplicate) O.D. 값을 표 2에 나타내었다.
3개의 상청액 및 하나만 빼고 모든 마우스 혈청이 ELISA에서 양성결과를 보였다. ELISA 데이터를 사용하여, 항체 농도치를 대략적으로 결정하고, 이어서 양성 항체를 실시예 7b에 기재된 HepG2 B6 sPAP 분석을 사용하여 2 ng ml-1 OSM에 대해 적정하였다. 요약하면, 항체를 HepG2 B6 세포와 함께 배양하기 전에 4℃에서 시토킨으로 밤새 배양하였다. sPAP 생성 시험을 실시예 7b에 기술된 바와 같이 수행하였다. 히브리도마 상청액 및 마우스 혈청에 의한 sPAP 생성의 억제력을 도 11에 나타내었다.
실시예 9a: OSM상의 수용체에 대한 주요 결합 잔기의 식별
hOSM상의 수용체 결합 부위를 초기에 시토킨의 IL-6-과(family)의 관련 구성원을 참조하여 식별하였다. 부위 1 및 3은 수용체의 시토킨 특정 사슬(들)과의 결합에 관계된 것으로 생각되며, 한편 부위 2는 보통의 수용체 성분 gp130과의 결합에 관계된 것으로 생각된다. IL-6-과 시토킨 백혈병 억제 인자(LIF){Hudson et al(1996) J. Biol Chem 271, 11971-11978}, 인터류킨-6(IL-6){Paonessa et al(1995) EMBO J. 14, 1942-1951 and Savino et al(1994) EMBO J. 13 1357-1367}의 부위 2에서의 변이에 대해 연구한 결과, 부위 2내의 잔기에 대한 변경은 gp130와의 변경된 결합을 초래할 수 있다는 사실이 제안되었다. gp130과 OSM과의 상호작용에 중요한 OSM의 잔기를 조사하기 위하여, 부위 2의 영역에서 OSM의 표면에 노출될 잔기를 조사하는 것이 필수적이었다. nmr 실험으로부터의 정보{Hoffman et al(1996) J. Biomol. NMR 7 273-282} 및 LIF의 공표된 구조{Robison et al(1994) Cell 77 1101-16}를 사용하여 OSM의 상동 모델을 만들었다. 부위 2 영역에서 이 모델의 표면 위치를 점하는 잔기를 돌연변이생성을 위해 선별하였다. 성장 호르몬(OSM의 동족체)과 그의 수용체사이에서 형성된 착체의 구조를 결정하였다{De Vos et al(1992) Science 255 306}. OSM 모델을 성장 호르몬에 겹쳐놓음으로써, OSM과 gp130사이의 잠재적인 상호작용의 추가 부위를 식별하였다.
이 모델링 연구에 기초하여, 27개의 부위를 OSM에서의 돌연변이를 위해 선별하여 gp130과 OSM의 상호작용을 조사하였다(표 3 참조). 각각의 이들 부위에서, 알라닌 잔기로 야생형 잔기를 대체하였다.
부위 위치(Location) 주석
Ser 7 N 말단 영역
Lys 8 N 말단 영역
Glu 9 N 말단 영역
Tyr 10 헬릭스(Helix)A
Arg 11 헬릭스 A
Leu 13 헬릭스 A 현재의 모델에서, 이 류신의 노출(exposure)은 불명료하다. 만약 잔기 17 밑의 헬릭스에 변형을 주면, 헬릭스 1의 상부는 회전할 수 있고, 이들 잔기들은 감추어질 수 있다(buried).
Leu 14 헬릭스 A
Leu 17 헬릭스 A
Gly 15 헬릭스 A
Gln 16 헬릭스 A 잔기 16-22는, 만약 그 기초 구조가 나선형이고 따라서 그 일부가 단백질의 코어(core)에 감추어질 수 있고, 수소결합을 형성하는 짝 잔기(partnering residues)를 가질 수 있다면, 친수성 잔기의 거의 연속적인 런(run)이다. 다르게는, 헬릭스는 이 영역에서 변형되고, 이들 잔기의 대부분이 노출된다.
Gln 18 헬릭스 A
Lys 19 헬릭스 A
Gln 20 헬릭스 A
Thr 21 헬릭스 A
Asp 22 헬릭스 A
Gln 25 헬릭스 A
Asp 26 헬릭스 A
Met 113 헬릭스 C
Pro 116 헬릭스 C
Asn 117 헬릭스 C
Leu 119 헬릭스 C
Gly 120 헬릭스 C 측쇄에는 기능성이 없으나, gp130 결합에 영향을 주는 인간 LIF 의 4개 돌연변이체중 하나에는 기능성 이 있음.
Arg 122 헬릭스 C
Asn 123 헬릭스 C
Asn 124 헬릭스 C
Tyr 126 헬릭스 C
Gln 130 헬릭스 C
실시예 9b: 돌연변이체 OSM-GST 융합 분자의 합성
각각의 27 돌연변이에 대해, 한쌍의 변이유발성 올리고누클레오티드를 고안하였다. 이들은 약 33개의 염기 길이를 가지며, 양 말단에 G 또는 C 잔기를 갖는 것이 바람직하다. 이들을 lac(/IPTG 유도성) 프로모터(Pharmacia)의 조절하에서 야생형 OSM DNA(서열 번호 12 참조)를 함유하는 pGEX(Pharmacia) 유도 발현물에 어닐링하고, 천연 Pfu 중합효소(Stratagene)를 사용하여 확장하였다. 원형 DNA(original template DNA)를 Dpn1(New England Biolabs)로 절단하고, 새로 합성된 플라스미드(Dpn1에 대한 기질은 아님)를 이 콜라이 균주 DH5alpha(GibcoBBL/Life Technologies)로 변형시켰다. 작은 세트(전형적으로는 4)의 콜로니를 집어내, 플라스미드 DNA를 분리하고, DNA 서열을 결정하였다. 유사하게 만들어진 야생형과 함께 각각의 돌연변이를 위한 대표 돌연변이체 클론을 재조합 단백질의 발현을 위해 이 콜라이 균주(non DE3: Nobagen)로 변형시켰다. 0.51 배양물을 만들고, 약 0.5의 OD550에서 유도하였다. 유도 3시간 후, 세포를 원심분리에 의해 펠렛으로 만들고, 리소자임과 초음파처리가 결합된 방법을 사용하여 용해시켰다. 재조합 돌연변이체 단백질은 GST와의 융합물로써 발현되기 때문에, 글루타치온 세파로오즈 관을 사용하여 융합물을 결합시켰다. 이어서, 융합 단백질을 자유 글루타치온을 사용하여 관으로부터 용리하고, 이어서 실온에서 4시간 동안 DTT 10 mm중에 배양시켜 글루타치온 부가물을 제거하고, -80℃에서 저장하였다.
실시예 9C: ELISA에서 gp130-Fc와 결합하는 야생형 OSM과 경쟁하는 OSM-GST의 능력에 대한 포인트 돌연변이(point mutation)의 영향
넌크 이뮤노플레이트(Nunc Immunoplates)(F6 Maxisorp, Life Technologies)를 야생형 OSM{실시예 7a에 따라 제조됨; 탄산염/탄산수소염 완충액(pH 9.4)중 50㎕/웰, 1㎕/웰}으로 밤새(4℃) 코팅하였다. 플레이트를 세척하고(PBS 0.05% 트윈 20중에서 6회, "Skatron Plate" 세척기 사용), 태핑 건조 및 블로킹하여 비특이 결합(200㎕/웰, BSA/PBS 1%)을 감소시켰다. 한시간 동안 배양{진탕 플랫폼(shaking platform)위 및 실온에서 수행함)한 후, 플레이트를 태핑 건조시키고 실시예 9로부터 얻은 야생형(wt) 또는 돌연변이체 OSM-GST를 가하였다(50㎕/웰, 20-0.002 ㎍/ml, BSA/PBS 1%중에서 적정함). 양성 대조군으로서, 다클론성 항-인간 OSM 항체(R＆D Systems)을 또한 시험하였다(20-0.02㎍/ml). BSA/PBS 1%(50㎕/웰)중의 gp130-Fc(300 ng/ml 미만으로 제조됨)과 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제 콘주게이트(1:500, Sigma)의 착체를 시제를 가한 직후 가하였다. 5 시간 동안의 배양(진탕 플래트폼위, 실온에서)후, 플레이트를 세척하고(6회), 제조자 지침에 따라 ELISA 증폭 시스템(Life Technologies)을 사용하여 진행시키고, OD를 490nm에서 측정하였다. 각각의 플레이트상에서, BSA/PBS 1%의 존재하에서 gp130-Fc/컨주게이트 및 OSM에 의해 전체 결합을 결정하고, OSM이 없는 조건에서 gp130-Fc/컨주게이트에 의해 비특이 결합을, 또는 gp130-Fc이 없는 조건하에서 OSM과의 컨주게이트 결합을 결정하였다.
인간 gp130의 세포외 도메인을 코드화하는 DNA를 하기의 합성 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하여 "중합효소연쇄반응(PCR)"에 의해 증폭시켰다.
상기 프라이머는 인간 gp130에 대한 유전자은행(GenBank) 데이타베이스 서열(등록번호 제M57230호)로부터 고안되었다. 정방향(forward) 프라이머는 BamHI, 및 HindIII 제한 엔도누클레오티드 부위, 및 컨센서스 5'비번역 서열에 이어 gp130 코딩 서열의 출발점에 상보적인 DNA 서열을 함유하였다. 역방향 프라이머는 Xhol 제한 엔도뉴클레오티드 부위에 이어 gp130 코딩 서열의 세포외 도메인의 3'-말단에 상보적인 DNA 서열을 함유하였다. 이 PCR 단편을 정제하고, pCR2.1(Invitrogen)에 서브클로닝하여 pCR2.1gp130을 얻었다.
플라스미드 pCR2.1gp130을 제한효소 BamHI 및 XhoI로 절단하고, gp130 단편을 정제하고, 인간 IgGI의 Fc 단편을 코드화하는 DNA 서열 함유 플라스미드중에서 BamHI 및 XhoI 엔도뉴클레아제 부위에 서브클로닝하였다. 이어서, 플라스미드를 제한효소 HindIII로 절단하고, 생성되는 gp130Fc 단편을 정제하고, 바쿨로바이러스 발현 벡터, pFastBac1(Life Technologies)의 HindIII 부위로 서브클로닝하여 플라스미드 지정 pBACgpFc를 발생시켰다.
융합 단백질 gp130Fc를 Bac-to-Bac 바쿨로바이러스 발현 시스템(Life Technologies)을 사용하여 곤충의 세포에서 발현시키고, 이어서 단백질 A 친화성 칼럼 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하고, 코마씨에 브릴리언트 블루 염색된 SDS-PAGE, 및 시판되는 항-gp130 및 항-hIgG 항체를 사용한 웨스턴 블로트 분석에 의해 확인하였다.
돌연변이체 및 wt OSM-GST를 시험하여 3 내지 6회의 실험에서 IC50을 얻었다. 경쟁 리간드없이 OSM 및 gp130-Fc의 존재하에서의 평균 OD(즉, 전체 결합)는 1.157(0.082-1.807 범위)이었고, 비특이 결합은 0.08 미만이었다. 항-OSM 항체는 모든 시험에서 농도 의존적인 억제율을 나타내었다(1㎍/ml에서 74 ±1% 억제율). wt OSM-GST는 플레이트에 결합된 OSM과 경쟁하여 농도 의존적 억제율을 나타내었다(도 12)(6회의 독립적인 실험에서 결정된 IC50 값은 0.139 ±0.0258㎍/ml임). 플레이트에 결합된 wt OSM과 경쟁하는 돌연변이 OSM-GST의 능력(potency)은 하기 표 4에 요약되어 있다. gp130 결합을 위해 wt OSM과 경쟁하는 능력을 실질적으로 감소시키는 결과를 초래하는 돌연변이는 L13A, Q16A, Q20A, G120A, N123A 및 N124A 이었다. 이들 중, Q20A 및 Q16A가 가장 약했다{최대 농도(10㎍/ml)에서, Q20A는 66 ±2.3%를 나타냈고, Q20A는 오직 15 ±8% 억제율을 나타냈음(도 12)}.
하기 표 4는 ELISA에서 gp130-Fc와의 결합을 위해 플레이트 결합된 wt OSM과 경쟁함에 있어 wt 및 돌연변이체 OSM-GST의 능력(potency)을 시험한 것이다. IC50값은 3-6회의 독립된 시험에서 결정하였다.
실시예 9d: HepG2B6 시험관내 분석에서 OSM 유도 sPAP의 생성에 미치는 OSM중의 포인트 돌연변이(point mutations)의 영향
실시예 7b에 기술된 분석을 사용하였다. OSM-GST 돌연변이체를 실시예 9b에서 발생된 무손상(intact) OSM 돌연변이체의 알려진 농도를 사용하여 100 ng/ml의 농도로 희석시켰다. 야생형 OSM-GST를 대조목적으로 포함시켰다. 희석액을 열불활성화된 FCS 1%, 낮은 알칼리성 포스파타제 활성으로 HepG2 B6 배지중에서 제조하였다. 이어서, 연속적인 1:3 희석액을 제조하였다(100, 33.33, 11.11, 3.7, 1.23, 0.4 ng/ml). HepG2 B6 3 x 104을 배지 100㎕중의 96웰 플레이트의 개별 웰에 분배하였다. 세포를 48 시간 동안 평형화하였다. 이어서, 배지를 제거하고, 희석된 OSM-GST 돌연변이체 100㎕로 대체하였다. 세포를 20 시간 더 배양하였다. 각각의 희석을 3회 수행하였다. 배지 20㎕를 제거하고, 기질로서 pNPP를 사용하여 sPAP 를 분석 하였다. 내생 ALP를 L-호모아르기닌으로 차단하였다. O.D.를 405-650nm에 판독하였다. 같은 실험을 2회 반복하였다.
변이체 대부분은 야생형과 유사한 방법으로 sPAP 방출을 유도할 수 있다. 3종의 변이체는 매우 낮은 양의 sPAP를 생산하였다. EC50은 이들 돌연변이체로부터는 얻어지지 않았다. 도 13은 sPAP 생산을 촉진하는데 있어 덜 효과적인, 돌연변이체 9(Q16A), 13(Q20A) 및 20(G120A)로부터 얻어진 O.D. 플롯을 보여준다. wt OSM-GST를 대조 목적으로 나타내었다. 이 데이타를 사용하여 EC50값을 계산하였다. 야생형의 %로써 표현되고 각각의 돌연변이체에 대한 실제 EC50값을 표 5에 나타내었다.
돌연 변이체 실험1% 실험 1EC50ng/ml 실험 2% 실험 2EC50ng/ml 실험 3% 실험 3EC50ng/ml 평균% 능력
WT 100 24 100 32 100
1S7A 50 12 69 22.2 59.5 더 큼
2K8A 66 16 38 12.5 52 더 큼
3E9A 98 23.6 27 8.9 62.5 더 큼
4Y10A 134 32.4 256 82 195 더 작음
5R11A 118 28.6 86 27.7 102 동일
6L13A 269 65.7 171 54.9 220 더 작음
7L14A 81 19.4 77 24.9 79 더 큼
8G15A 87 21 55 17.8 71 더 큼
9Q16A NC NC 없음
10L17A 301 72.7 174 56 237.5 더 작음
11Q18A 84 20.2 68 21.7 76 더 큼
12K19A 98 23.6 37 11.9 67.5 더 큼
13Q20A NC NC 없음
14T21A 71 17 33 10.5 52 더 큼
15D22 152 36.7 50 16 101 동일
16M113A 106 25.6 78 25 92 동일
17P116A 104 25 47 15 75.5 더 큼
18N117A 241 58 132 42.5 186.5 더 작음
29L119A 115 27.8 72 23 93.5 더 큼
20G120A NC NC 없음
21R112A 135 32.4 43 13.8 124 47.3 101 동일
22N123A 157 37.9 154 49.7 155.5 더 작음
23N124A 125 30.2 113 36.2 119 동일
24Y126A 386 93 32 10.3 106.5 40.8 175 더 작음
25Q130A 52 12.5 26 8.2 39 더 큼
26Q25A 55 13.3 41 13 48 더 큼
27D26A 81 19.5 79 25.5 80 동일
위 표는 와일드 형 EC50값 및 실제 EC50값의 %로 표시된 EC50값을 나타낸다. 80% 미만은 야생형 보다 더 능력(potency)이 좋음, 80-120%는 야생형과 동일한 능력임, 120% 이상은 야생형보다 능력이 작음. NC-계산되지 않음을 나타냄.
상기 표를 검토해보면, ELISA에서의 wt와 거의 다른 돌연변이체중 3종이 또한 sPAP 분석에서 더 작은 능력을 가지며, 6-L13A, 10-L17A, 22-N123A 및 23-N124A가 임의적인 스코링 시스템에 의해 동일한 능력 등급을 갖는다는 것을 알 수 있다. 이와 같이 두가지 분석법은 좋은 일치성을 보여준다. 돌연변이체중 몇몇은 sPAP 생산을 유도함에 있어 야생형보다 능력에서 떨어지나, sPAP를 전혀 유도하지 않은 호스 돌연변이체(hose mutant)를 제외하고는, 두 실험간 변동이 있다. 시험 결과는 G120A, Q16A 및 Q20A이 gp130에 대한 OSM의 결합에 영향을 미친다는 것을 보여준다. 또한, N123A 및 N124A도 gp130과의 상호작용에 일부 영향을 미치는 것으로 나타났.
실시예 10: 위염에 대한 OSM의 역활
에이치 필로리(H.pylori)는 위염, 위궤양 질환 및 위암을 야기시키는 것으로관계된 그램음성 나선형 세균이다. 에이치 필로리 Cag+균주는 에이치 필로리 Cag-균주보다 궤양의 발생도가 더 높다. 에이치 필로리 균주(더 병원성인 Cat+, 및 Cat-)를 위 상피 세포주 KATO III(ECACC)와 함께 시험관내에서 공동배양하여 시차유전자발현분석(differential gene expression analysis)에 의해 에이치 필로리에 대한 숙주반응을 조사하였다. mRNA를 45분, 3시간 및 24시간의 시점에서 분리시키고, 유도된 방사능활성 프로브를 히브리드형성하여(hybridising) 고밀도의 cDNA 유전자 배열(array){시토킨류, 시토킨 수용체 및 유착 분자를 포함하는 약 136개의 인간 유전자를 함유함}로 하였다. 얻어진 유전자 발현 프로파일을 분석한 결과 에이치 피로리 균주에 대한 반응에서 상당수의 유전자를 유도/억제하는 것으로 밝혀졌다. 약한 병원성 에이치 필로리(Cat-) 또는 미처리된 대조군 세포에 노출된 세포에 비해, 매우 높은 병원성 에이치 필로리(Cat+)에 노출된 세포에서 온코스타틴 M이 유도되었다는 사실을 발견하였다.
＜110＞ Glaxo Wellcome PLC
＜120＞ Inflammatory Mediator Antagonists
＜130＞ PG3455
＜150＞ GB 9806530.3
＜151＞ 1998-03-26
＜160＞ 17
＜170＞ KOPATIN 1.5
＜210＞ 1
＜211＞ 31
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Primer
＜400＞ 1
gagtgacaag cctgtagccc atgttgtagc a 31
＜210＞ 2
＜211＞ 30
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Primer
＜400＞ 2
gcaatgatcc caaagtagac ctgcccagac 30
＜210＞ 3
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Primer
＜400＞ 3
gggtgtccta ccaaggaaca 20
＜210＞ 4
＜211＞ 20
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Primer
＜400＞ 4
ctgagacctt tcaagaggac 20
＜210＞ 5
＜211＞ 32
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Primer
＜400＞ 5
gcataggatc cgcggctata ggcagctgct cg 32
＜210＞ 6
＜211＞ 32
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Primer
＜400＞ 6
atcgcgaatt cctaccgggg cagctgtccc ct 32
＜210＞ 7
＜211＞ 45
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Synthetic sequence
＜220＞
＜221＞ CDS
＜222＞ (1)..(45)
＜400＞ 7
aaa tcg gat ctg atc gaa ggt cga cgg atc ccc ggg aat tca tcg 45
Lys Ser Asp Leu Ile Glu Gly Arg Arg Ile Pro Gly Asn Ser Ser
1 5 10 15
＜210＞ 8
＜211＞ 37
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Primer
＜400＞ 8
gatacgatcg tctcatcgag cggctatagg cagctgc 37
＜210＞ 9
＜211＞ 35
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Primer
＜400＞ 9
attacatgga attcctatct ccggctccgg ttcgg 35
＜210＞ 10
＜211＞ 63
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Synthetic sequence
＜220＞
＜221＞ CDS
＜222＞ (44)..(61)
＜400＞ 10
catcggatcc aagctttaca gttactgagc acaggacctc acc atg ttg acg 52
Met Leu Thr
1
ttg cag act tg 63
Leu Gln Thr
5
＜210＞ 11
＜211＞ 32
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequenc: Primer
＜400＞ 11
catcctcgag tttctccttg agcaaacttt gg 32
＜210＞ 12
＜211＞ 252
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 12
Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Ala Ile Gly Ser Cys Ser
20 25 30
Lys Glu Tyr Arg Val Leu Leu Gly Gln Leu Gln Lys Gln Thr Asp Leu
35 40 45
Met Gln Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp Pro Tyr Ile Arg Ile Gln Gly
50 55 60
Leu Asp Val Pro Lys Leu Arg Glu His Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala
65 70 75 80
Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu
85 90 95
Gln Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly Cys Val Leu His Arg Leu Ala Asp
100 105 110
Leu Glu Gln Arg Leu Pro Lys Ala Gln Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu
115 120 125
Asn Ile Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gln Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu
130 135 140
Gly Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met Ala Gln Leu Leu Asp Asn Ser
145 150 155 160
Asp Thr Ala Glu Pro Thr Lys Ala Gly Arg Gly Ala Ser Gln Pro Pro
165 170 175
Thr Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ala Phe Gln Arg Lys Leu Glu Gly Cys
180 185 190
Arg Phe Leu His Gly Tyr His Arg Phe Met His Ser Val Gly Arg Val
195 200 205
Phe Ser Lys Trp Gly Glu Ser Pro Asn Arg Ser Arg Arg His Ser Pro
210 215 220
His Gln Ala Leu Arg Lys Gly Val Arg Arg Thr Arg Pro Ser Arg Lys
225 230 235 240
Gly Lys Arg Leu Met Thr Arg Gly Gln Leu Pro Arg
245 250
＜210＞ 13
＜211＞ 5
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 13
Ala Ala Ile Gly Ser
1 5
＜210＞ 14
＜211＞ 15
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Synthetic Sequence
＜400＞ 14
Lys Ser Asp Leu Ile Glu Gly Arg Arg Ile Pro Gly Asn Ser Ser
1 5 10 15
＜210＞ 15
＜211＞ 6
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Synthetic sequence
＜400＞ 15
Met Leu Thr Leu Gln Thr
1 5

Claims (14)

  1. 염증성 관절장애 또는 염증 질환의 치료용 약제를 제조하기 위한, OSM 또는 OSM 수용체에 대한 길항제의 용도.
  2. 제1항에 있어서, 길항제가 인간 OSM에 대한 길항제인 용도
  3. 제2항에 있어서, 길항제가 인간 OSM의 1 이상의 잔기 G120, Q16, Q20, N123 또는 N124와 상호작용을 하는 것인 용도.
  4. 제1항에 있어서, 길항제가 OSM 수용체 gp130의 길항제인 용도.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 길항제가 작은 유기 분자인 용도.
  6. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 길항제가 항체인 용도.
  7. 제6항에 있어서, 항체가 휴머나이징(humanising)되고 키메라이징(chimerising )된 것인 용도.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서, 약제를 사용하여 연골로부터의 콜라겐 방출을 막거나 줄이는 용도.
  9. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 류머티스관절염 치료를 위한 용도.
  10. 1mg 이상의 단위복용량의 OSM에 대한 길항제 및 그의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서, 길항제가 면역억제제, 면역관용 유도제(tolerance inducing agent) 또는 항염증제와 함께 사용되는 것인 용도 또는 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 길항제가 CD4+T 세포 억제제, 항-CD23 항체 또는 TNF 길항제와 함께 사용되는 것인 용도 또는 약학 조성물.
  13. OSM 또는 OSM 결합 부분 및 OSM 수용체 또는 수용체 컨주게이트를 시제(test agent)와 결합시키고, OSM 또는 OSM 결합 부분과 OSM 수용체 또는 수용체 컨주게이트사이의 상호작용의 차단을 모니터링하는 것을 포함하는, OSM의 길항제의 식별 분석법.
  14. 제13항에 있어서, 수용체 컨주게이트가 gp130-Fc 융합(fusion) 단백질인 분석법.
KR1020007010639A 1998-03-26 1999-03-25 염증성 매개체 길항제 KR20010034672A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9806530.3A GB9806530D0 (en) 1998-03-26 1998-03-26 Inflammatory mediator
GB9806530.3 1998-03-26
PCT/GB1999/000943 WO1999048523A2 (en) 1998-03-26 1999-03-25 Antagonists of the inflammatory mediator oncostatin m (osm)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20010034672A true KR20010034672A (ko) 2001-04-25

Family

ID=10829337

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020007010639A KR20010034672A (ko) 1998-03-26 1999-03-25 염증성 매개체 길항제

Country Status (20)

Country Link
US (5) US6706266B1 (ko)
EP (2) EP1849478A3 (ko)
JP (2) JP3825255B2 (ko)
KR (1) KR20010034672A (ko)
CN (1) CN1295482A (ko)
AT (1) ATE338565T1 (ko)
AU (1) AU3046399A (ko)
BR (1) BR9909077A (ko)
CA (1) CA2325585A1 (ko)
CY (1) CY1105722T1 (ko)
DE (1) DE69933115T2 (ko)
DK (1) DK1071449T3 (ko)
ES (1) ES2272058T3 (ko)
GB (1) GB9806530D0 (ko)
HU (1) HUP0101690A2 (ko)
IL (1) IL138604A0 (ko)
PL (1) PL343431A1 (ko)
PT (1) PT1071449E (ko)
WO (1) WO1999048523A2 (ko)
ZA (1) ZA200005076B (ko)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9806530D0 (en) * 1998-03-26 1998-05-27 Glaxo Group Ltd Inflammatory mediator
WO2001081345A1 (fr) * 2000-04-20 2001-11-01 Mitsubishi Pharma Corporation Composes d'amides aromatiques
UA80091C2 (en) 2001-04-02 2007-08-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist
WO2003035048A2 (en) * 2001-10-26 2003-05-01 Novartis Ag Methods for the treatment of osteoarthritis and compositions thereof
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
EP1581169A4 (en) * 2002-11-08 2008-09-17 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING DISEASES RELATED TO NATURAL K CELLS
JP4803789B2 (ja) * 2004-02-03 2011-10-26 独立行政法人科学技術振興機構 疼痛を処置するための薬学的組成物
CA2562953A1 (en) * 2004-03-30 2005-10-13 Glaxo Group Limited Humanized and chimeric anti-osm antibodies
TWI307630B (en) 2004-07-01 2009-03-21 Glaxo Group Ltd Immunoglobulins
EP1795204A4 (en) * 2004-09-29 2009-10-21 Asama Kasei Kk FUNCTIONAL COMPOSITION OR FOODS WITH MOLKEPROTEIN, FROM MILK-ORGANIC ANTIBODIES OR ANTIBODIES
US10080779B2 (en) 2004-12-15 2018-09-25 Universite D'angers Method for increasing the expression of anti-microbial peptides by keratinocytes comprising administering a composition comprising IL-17, TNF-alpha and OSM
EP1671642A1 (en) * 2004-12-15 2006-06-21 Universite D'angers Compositions comprising (ant)agonists of oncostatin M (OSM), IL-31 and IFN-gamma for modulating keratinocyte migration and functions via a receptor containing OSMRbeta as a subunit, and applications thereof.
US20060276440A1 (en) * 2005-01-03 2006-12-07 An Wenqian F Treatment of inflammatory disorders
EP1877556B1 (en) * 2005-03-25 2011-09-14 Medtronic, Inc. Use of anti-tnf or anti-il1 rnai to suppress pro- inflammatory cytokine actions locally to treat pain
EP1915436B1 (en) * 2005-08-02 2011-09-28 Trustees Of Tufts College Methods for stepwise deposition of silk fibroin coatings
WO2008134077A1 (en) * 2007-04-30 2008-11-06 Archemix Corp. Metabolic profile directed aptamer medicinal chemistry
JP2010532790A (ja) * 2007-07-06 2010-10-14 グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 抗体処方
US8030290B2 (en) 2007-12-07 2011-10-04 City Of Hope Cell-type specific aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 Therapy
USRE48948E1 (en) 2008-04-18 2022-03-01 Warsaw Orthopedic, Inc. Clonidine compounds in a biodegradable polymer
AR074777A1 (es) 2008-12-19 2011-02-09 Glaxo Group Ltd Proteinas de union a antigeno
US8309688B2 (en) * 2008-12-30 2012-11-13 Centocor Ortho Biotech Inc. Monkey homolog of human oncostatin M and methods of use thereof
EP2401297A1 (en) * 2009-02-24 2012-01-04 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs
US20100239632A1 (en) 2009-03-23 2010-09-23 Warsaw Orthopedic, Inc. Drug depots for treatment of pain and inflammation in sinus and nasal cavities or cardiac tissue
WO2011080050A2 (en) 2009-12-11 2011-07-07 Novartis Ag Binding molecules
WO2011094259A2 (en) 2010-01-28 2011-08-04 Glaxo Group Limited Cd127 binding proteins
UA108227C2 (xx) 2010-03-03 2015-04-10 Антигензв'язуючий білок
AR081556A1 (es) 2010-06-03 2012-10-03 Glaxo Group Ltd Proteinas de union al antigeno humanizadas
ES2717908T3 (es) 2010-06-14 2019-06-26 Lykera Biomed S A Anticuerpos S100A4 y usos terapéuticos de los mismos
EA031044B1 (ru) * 2010-10-13 2018-11-30 Янссен Байотек, Инк. Человеческие антитела к онкостатину м и способы их применения
KR20210021109A (ko) 2010-11-08 2021-02-24 제넨테크, 인크. 피하 투여용 항―ｉｌ―6 수용체 항체
WO2012069433A2 (en) * 2010-11-23 2012-05-31 Glaxo Group Limited Antigen binding proteins
WO2013168829A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Wakayama Medical University Anti oncostatin m receptor beta antibody
US9663571B2 (en) 2013-05-30 2017-05-30 Kiniksa Pharmaceuticals, Ltd. Oncostatin M receptor antigen binding proteins
US10307487B2 (en) * 2013-07-09 2019-06-04 President And Fellows Of Harvard College Microvessel endothelial cell surface markers and uses thereof
US9550828B2 (en) * 2013-09-05 2017-01-24 Boise State University Oncostatin M (OSM) antagonists for preventing cancer metastasis and IL-6 related disorders
JP2014062100A (ja) * 2013-11-05 2014-04-10 Glaxosmithkline Llc 抗体処方
EP3069137A1 (en) 2013-11-05 2016-09-21 Novartis Ag Organic compounds
CN104096219A (zh) * 2014-07-08 2014-10-15 武汉大学 Ⅱ型抑瘤素m受体（osmr）在治疗脂肪肝和ⅱ型糖尿病中的功能和应用
EP2985294A1 (en) 2014-08-14 2016-02-17 Deutsches Krebsforschungszentrum Recombinant antibody molecule and its use for target cell restricted T cell activation
WO2016046738A1 (en) 2014-09-24 2016-03-31 Università Degli Studi Di Padova Composition to induce bone marrow stem cell mobilization
WO2016059602A2 (en) 2014-10-16 2016-04-21 Glaxo Group Limited Methods of treating cancer and related compositions
WO2016120625A1 (en) * 2015-01-29 2016-08-04 Isis Innovation Limited Biomarker
GB201614627D0 (en) * 2016-08-30 2016-10-12 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Antigen binding proteins
US11633457B2 (en) 2019-04-11 2023-04-25 Boise State University Pharmaceutical compositions comprising oncostatin m (OSM) antagonist derivatives and methods of use

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US646727A (en) * 1899-06-20 1900-04-03 Columbia Motor And Mfg Company Steam-generator.
US5618715A (en) * 1985-12-20 1997-04-08 Oncogen Limited Partnership Oncostatin M and novel compositions having anti-neoplastic activity
US5681930A (en) * 1985-12-20 1997-10-28 Bristol-Myers Squibb Company Anti-oncostatin M monoclonal antibodies
JPS6463395A (en) 1987-05-04 1989-03-09 Oncogen Oncostatin m and novel composition having antitumor activity
US5814307A (en) 1989-04-10 1998-09-29 Bristol-Myers Squibb Company Method for regulating cell growth, leukocyte differentiation and tumor cell growth using Oncostatin M to stimulate synthesis of IL-6
DK0422186T3 (da) 1989-04-10 1999-08-16 Oncogen Anvendelse af oncostatin M til suppression af MHC-antigener
AU651330B2 (en) 1989-12-08 1994-07-21 Oncogen Limited Partnership Novel proteins with oncostatin M activity and process for their preparation
NZ237533A (en) * 1990-03-29 1992-12-23 Bristol Myers Squibb Co Monoclonal antibodies which bind to oncostatin m, cell lines producing them
DE4011684A1 (de) 1990-04-06 1991-10-10 Schering Ag Dtpa-monoamide, diese verbindungen enthaltende pharmazeutische mittel, ihre verwendung und verfahren zu deren herstellung
CA2055122A1 (en) 1990-11-13 1992-05-14 Robert I. Grove Methods for stimulating ldl uptake and ldl receptor expression
AU666866B2 (en) 1991-08-30 1996-02-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Hybrid cytokines
US6171824B1 (en) 1991-08-30 2001-01-09 Fred Hutchinson Cancer Research Center Hybrid cytokines
US5262522A (en) * 1991-11-22 1993-11-16 Immunex Corporation Receptor for oncostatin M and leukemia inhibitory factor
JPH05304986A (ja) 1992-04-28 1993-11-19 Tosoh Corp ｇｐ１３０蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体
US5744442A (en) 1992-08-26 1998-04-28 Bristol Meyers Squibb Company Regulation of cellular invasiveness
US5460810A (en) 1992-09-02 1995-10-24 Genetics Institute, Inc. Method for maintaining gut epithelial cells by treatment with a cytokine such as interleukin 11
IT1261787B (it) 1993-06-23 1996-06-03 Angeletti P Ist Richerche Bio Metodologia per la selezione di superagonisti, antagonisti e super- antagonisti di ormoni del cui complesso recettoriale fa parte gp 130.
FR2707882B1 (fr) * 1993-07-23 1997-08-01 Immunotech Sa Nouveaux kits thérapeutiques anti-médiateurs protéiques, procédé de préparation et compositions pharmaceutiques les renfermant.
US5451411A (en) * 1993-10-15 1995-09-19 University Of Washington Methods and compositions for the oral delivery of therapeutic agents
US5783672A (en) 1994-05-26 1998-07-21 Immunex Corporation Receptor for oncostatin M
GB9419021D0 (en) 1994-09-21 1994-11-09 Applied Research Systems Therapeutic protein
US5571513A (en) 1995-05-31 1996-11-05 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Anti-gp130 monoclonal antibodies
JPH09117288A (ja) 1995-06-06 1997-05-06 Bristol Myers Squibb Co オンコスタチンｍ誘導造血
WO1997016202A1 (en) 1995-10-27 1997-05-09 Amrad Operations Pty. Ltd. Cytokines and their use in treatment and/or prophylaxis of breast cancer
WO1998018483A1 (en) 1996-10-25 1998-05-07 Bristol-Myers Squibb Company Oncostatin m for treating inflammation
US5958442A (en) * 1997-10-24 1999-09-28 Bristol-Myers Squibb Company Oncostatin M for treating inflammation
GB9806530D0 (en) * 1998-03-26 1998-05-27 Glaxo Group Ltd Inflammatory mediator

Also Published As

Publication number Publication date
PT1071449E (pt) 2006-12-29
DK1071449T3 (da) 2007-01-02
US8003101B2 (en) 2011-08-23
IL138604A0 (en) 2001-10-31
JP3825255B2 (ja) 2006-09-27
US20040081650A1 (en) 2004-04-29
ZA200005076B (en) 2001-09-21
JP2006290893A (ja) 2006-10-26
BR9909077A (pt) 2000-12-05
JP2002507580A (ja) 2002-03-12
WO1999048523A2 (en) 1999-09-30
US20080044409A1 (en) 2008-02-21
US20060093602A1 (en) 2006-05-04
EP1849478A3 (en) 2013-05-29
GB9806530D0 (en) 1998-05-27
WO1999048523A3 (en) 1999-11-25
DE69933115D1 (de) 2006-10-19
CA2325585A1 (en) 1999-09-30
EP1071449B1 (en) 2006-09-06
AU3046399A (en) 1999-10-18
CY1105722T1 (el) 2010-12-22
US7291332B2 (en) 2007-11-06
PL343431A1 (en) 2001-08-13
ATE338565T1 (de) 2006-09-15
EP1071449A2 (en) 2001-01-31
US20080019967A1 (en) 2008-01-24
CN1295482A (zh) 2001-05-16
DE69933115T2 (de) 2007-04-05
EP1849478A2 (en) 2007-10-31
HUP0101690A2 (hu) 2001-08-28
ES2272058T3 (es) 2007-04-16
US6706266B1 (en) 2004-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20010034672A (ko) 염증성 매개체 길항제
KR101125127B1 (ko) 자가면역 및 염증성 질병과 기관 이식 거부반응의 치료를위해 사용되는 길항제 항-ｃｄ４０ 항체의 사용 방법
JP3577586B2 (ja) Ｉｌ−１７相同的ポリペプチドとその治療用途
JP5351078B2 (ja) 炎症反応を阻害又は増強するための組成物及び方法
JP3323508B2 (ja) Ｃｄ２３に対する結合物質
US20070212362A1 (en) Use of il-17 antibody for the treatment of cartilage damaged by osteoarthritis
CA2646902C (en) Cxcl13 antagonists and their use for the treatment of inflammatory diseases
SK288287B6 (sk) Protilátka proti sekvencii SEQ ID No: 1 alebo polypeptid s jej obsahom a ich použitie
CZ296919B6 (cs) Farmaceutický prípravek pro lécení chronické revmatické artritidy
KR20070107703A (ko) 인터루킨-１７ｆ 항체 및 기타 ｉｌ-１７ｆ 신호전달안타고니스트 및 그의 용도
KR20170121199A (ko) 염증성 질환에서 il-18 결합 단백질(ｉｌ-18ｂｐ) 및 항체
WO2010085643A1 (en) Targeting il-7 signaling as a therapy for multiple sclerosis and other il-7 signaling dependent disorders
US20050238643A1 (en) Modulation of lir function to treat rheumatoid arthritis
AU2002360376A1 (en) Modulation of LIR function to treat rheumatoid arthritis
JP2003525615A (ja) シアロアドへジンファクター−２抗体
KR20010085816A (ko) 면역 관련 질환 치료용 조성물 및 치료 방법
MXPA00009315A (en) Inflammatory mediator antagonists
JP2003514517A (ja) ヒトケモカインβ−１３
KR20100087532A (ko) 항염증성 약학 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid