CZ283488B6 - Farmaceutický prostředek obsahující IL-4 a/nebo IL-10 nebo protilátky proti IL-4 a IL-10, způsob jeho výroby a jeho použití - Google Patents

Abstract

Je popsán farmaceutický prostředek obsahující IL-4 a/nebo IL-10 nebo protilátky proti IL-4 a IL-10, způsob výroby tohoto farmaceutického prostředku a použití těchto látek. Tyto prostředky jsou užitečné pro léčení četných onemocnění, jako jsou proliferace neoplastických buněk závislých na interleukinu-2 (IL-2), hypertenzitivní reakce zpožděného typu (DTH), zánětlivá střevní onemocnění a pro zesílení inhibice produkce cytokininu T buňkami nebo zvýšení produkce .gama.-interferonu (IFN-.gama.). V jednom provedení se IL-10 používá k inhibování produkce IL-2 neoplastickými lymfocyty nebo proliferace neoplastických buněk závislých na IL-2. V jiném provedení se IL-10 používá pro léčení zánětlivého střevního onemocnění. V ještě jiném provedení se protilátky proti IL-4 a IL-10 používají ke zvýšení hladin IFN-.gama.. V ještě jiném provedení se kombinace IL-4 a IL-10 používá k zesílení IL-10 zprostředkované inhibice produkce cytokinů T-buňkami. V ještě jiném provedení se IL-10 samotný nebo v kombiŕ

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká použití interleukinu-10 (IL-10) k výrobě léku pro léčení zánětlivého vnitřního onemocnění, jako je Crohnova nemoc a ulcerativní kolitida.

Dosavadní stav techniky

Leukemie jsou heterogenní skupinou novotvarů, pocházejících od maligní transformace hematopoézních (krvetvorných) buněk. Mohou být odvozeny buď od lymfoidních nebo myeloidních typů buněk. Transformované buňky proliferují primárně v kostní dřeni a lymfoidní tkáni, kde interferují s normální hematopoézí a imunitou. Mohou také emigrovat do krve a infiltrovat do jiných tkání, což často vede k abnormální distribuci různých typů buněk. Mezi příklady leukemie patří lymfocytická leukemie (ALL), akutní myeloidní leukemie (AML), chronická myeloidní leukemie (CML), chronická lymfocytická leukemie (CLL), leukemie vlasových buněk a leukemie dospělých T buněk (ATL). Leukemie se typicky charakterizují buď jako akutní nebo jako chronické, podle povahy klinického průběhu.

Lymfomy, na rozdíl od leukémií, jsou neoplastické transformace buněk, které se vyskytují převážně v lymfoidních tkáních. Lymfomy se typicky dělí na Hodgkinovu chorobu a neHodgkinovy lymfomy. Při Hodgkinově chorobě většina buněk jsou malé lymfocyty s T buněčným fenotypem. Více než 90% všech případů ne-Hodgkinových lymfomů jsou deriváty B buněk.

Léčení většiny těchto nemocí není dosud plně úspěšné. Dosud známá technika se primárně soustřeďuje na použití chemoterapie a ozařování. Až do dneška však toto léčení obvykle selhává pro dlouhodobou remisi nebo při dlouhodobé péči. Existuje tedy potřeba bezpečného a spolehlivého způsobu léčení těchto onemocnění, zvláště těch, při nichž proliferace neoplastických buněk závisí na IL-2.

IFN-γ je potenciálním aktivátorem makrofágů, které jsou odpovědné za obranu hostitele proti různým infekčním činidlům a onemocněním. Kvůli důležité roli IFN-γ v obraně proti infekcím existuje potřeba prostředků a způsobů, které mohou zvyšovat produkci IFN-γ.

Imunní systém přináší četné přirozené a adaptivní imunitní reakce, dvě rozsáhlé kategorie, které se nazývají humorální a buněčné imunitní odpovědi. Humorální odpověď se v širokém smyslu týká produkce protilátek a působení B-buněk včetně plazmových buněk. Buněčná imunita je zprostředována buňkami včetně T-buněk, monocytů, makrofágů a histiocytů.

T-buňky mohou být dále rozděleny do kategorií podle různých funkcí nebo znaků. Například Tbuňky lze klasifikovat jako T pomocné buňky nebo T supresorické buňky. T-buňky mohou být také aktivovány, takže se stávají cytotoxickými nebo vytvářejí jiné specializovanější funkce. Normálně mají T-buňky aB-buňky takové interakce, které mohou v jistém rozsahu regulovat vzájemnou aktivitu. Viz např. Paul (red.).: Fundamentals of Immunology, druhé vydání, Raven Press, New York (1989).

U různých antigenů mohou převládat buď buněčné nebo humorální odpovědi, typicky vzájemně výlučným způsobem. Nástup některých onemocnění, např. lepry, leishmaniósy a některých typů autoimunity, může být zapříčiněn nepříslušným převážením jedné třídy odpovědi nad druhou. Mosmann a spol.: Immunol. Today 8, 223 (1987); Mosmann a spol.: Ann. Rev. Immunol. 7, 145

- 1 CZ 283488 B6 (1989); Parish: Transplant Rev. 13, 35 (1972) a Liew: Immunol. Today 10, 40 (1989).

Jeden z mechanismů, kterými je imunitní systém regulován, zahrnuje produkci proteinů, které se nazývají cytokiny. Lymfokiny jsou cytokiny, produkované T-buňkami a některými B-buňkami. Monokiny jsou cytokiny, produkované monocyty. Cytokiny, které mohou být glykosylovány, zprostředkovávají četné imunitní odpovědi.

IL-10 je cytokin, který je schopen zprostředkovat četné činnosti nebo účinky. IL-10 byl izolován jak z myších, tak z lidských buněk. Je obsažen při regulování imunitních odpovědí různých tříd nebo podtříd T pomocných (Th) buněk. Th buňky se mohou dělit na různé podskupiny, které se odlišují profily jejich produkce cytokinů.

Zánětlivé vnitřní onemocnění (IBD) se týká skupiny gastrointestinálních poruch, vyznačujících se chronickým nespecifickým zánětem částí gastrointestinálního traktu. Vředovitá kolitida a Crohnova choroba, nejznámější příklady IBD u lidí, souvisejí s mnoha příznaky a komplikacemi, včetně retardace růstu u dětí, rektálního prolapsu, krve ve stolici (např. melena a/nebo hematochézie), chřadnutí, nedostatku železa a anemie, např. anemie z nedostatku železa a anemie z chronického onemocnění nebo chronického zánětu.

Etiologie IBD není jasná. Viz Wyngaarden a Smith (red.): Cecifs Textbook of Medicine (W. B.Saunders Co., 1985), Berkov (red.): The Měrek Manual of Diagnosis and Therapy (Měrek Sharp and Dohme Research Laboratories, 1982) a Harrison's Principles of Intemal Medicine, 12. vydání, McGraw-Hill, lne. (1991).

Vředovitá kolitida je chronické, nespecifické, zánětlivé a vředovité onemocnění, které se přimámě projevuje v mukóze tlustého střeva. Často se vyznačuje krvácivými průjmy, abdominálními křečemi, krví a hlenem ve stolici, nevolností, horečkou, anemií, anorexií, ztrátou hmotnosti, leukocytózou, hypoalbuminémií a zvýšenou rychlostí sedimentace erytrocytů (ESR). Mezi komplikace patří hemoragie, toxická kolitida, toxický megakolon, příležitostná rektovaginální pištěl a zvýšené riziko rozvinutí rakoviny tračníku.

Vředovitá kolitida souvisí také s komplikacemi, vzdálenějšími od tračníku, jako je artritida, ankylózní spondylitida, sakroileitida, posteriomí uveitida, nodózni erytém, gangrenózní pyodermie a episkleritida. Léčení značně závisí na prudkosti a trvání onemocnění. Například při prudkém nástupu onemocnění je často indikována kapalinová terapie pro zabránění dehydratace a elektrolytové nerovnováhy. Někdy jsou užitečná také speciální dietní opatření. Mezi další léčení patří různé kortikosteroidy, sulfasalazin a některé jeho deriváty a možná imunosupresivní léčiva.

Crohnova choroba má mnoho společných rysů s vředovitou kolitidou. Crohnova choroba je odlišitelná tím, že poranění má tendenci ostře se ohraničovat od přilehlého normálního střeva, na rozdíl od poranění vředovitou kolitidou, které je spíše difuzní. Dále pak Crohnova choroba ovlivňuje převážně ileum (ileitida) a ileum a tračník (ileokolitida). V některých případech je zasažen sám tračník (granulomatózní kolitida) a někdy celé tenké střevo (jejunoileitida). Ve vzácných případech jsou postiženy žaludek, duodenum nebo ezofágus. Mezi poranění patří epiteloidní sarkoidní granulom u zhruba poloviny klinických případů.

Poranění u Crohnovy choroby může být transmurální včetně hlubokého zvředovatění, edému a fíbrózy, které mohou vést k obstrukci a tvorbě pištěle, stejně jako ke vzniku abscesu. To je v kontrastu s vředovitou kolitidou, která obvykle vede k mnohem mělčím poraněním, i když lze u vředovité kolitidy příležitostně potkat také komplikace fíbrózy, obstrukce, tvorby pištěle a abscesů. Běžné léčení je u obou nemocí podobné. Zahrnuje použití steroidů, sulfasalazinu a jeho derivátů a imunosupresivních léčiv, jako je cyklosporin A, merkaptopurin a azathioprin, které všechny mohou mít silné nežádoucí vedlejší účinky.

-2 CZ 283488 B6

Vzhledem k lékařské důležitosti zánětlivého vnutřního onemocnění existuje potřeba léků pro léčení těchto stavů.

Podstata vynálezu

Tento vynález splňuje předcházející potřeby tím, že poskytuje použití IL-10 pro výrobu léku k léčení shora uvedených stavů.

Tento vynález poskytuje tedy použití interleukinu-10 pro výrobu léku k léčení zánětlivého vnitřního onemocnění u savců. Savci, který je zasažen zanětlivým vnitřním onemocněním, se podává efektivní množství IL-10.

Všechny odkazy zde uvedené jsou zde celé zahrnuty jako citace. Všechny sekvence nukleových kyselin zde popsané mají normální 5'-3' konvenci, pokud se čtou zleva doprava. Pro báze nukleotidů v sekvencích jsou použity standardní jednopísmenkové zkratky (37 C. F.R. § 1.822).

V další části tohoto spisu jsou uvedeny zdroje cytokinu a protilátek.

Pojem interleukin 10 nebo IL-10 tak, jak se zde používá, znamená protein, který a) má aminokyselinovou sekvenci maturovaného (například s chybějící sekvencí sekrečního leaderu) IL-10 v podstatě tak, jak je popsán v mezinárodní přihlášce č. WO 91/00349, ab) má biologickou aktivitu, která je obvyklá pro přírodní IL-10. Může se používat jak glykosylovaný (např. produkovaný v eukaryotických buňkách, jako jsou CHO buňky), tak neglykosylovaný (např. chemicky syntetizovaný standardními způsoby nebo produkovaný v E. coli) IL-10. Patří sem také muteiny a další analogy, včetně BCRFI (virový IL-10 viru Epstein Barr, také jednoduše nazývaný virový IL-10) proteinu, který má biologickou aktivitu IL-10. Mezinárodní přihláška č. WO 91/00349 popisuje četné in vitro testy, vhodné pro měření aktivity IL-10. V této přihlášce jsou popsány četné výhodné modifikace IL-10.

IL-10, vhodný pro použití podle vynálezu, se může získat z četných zdrojů. Například se může izolovat z kultivačního média aktivovaných T-buněk, schopných sekretovat tento protein. IL-10 nebo jeho aktivní fragmenty mohou být také chemicky syntetizovány pomocí standardních technik, známých odborníkům. Viz např. Merrifield: Science 233, 341 (1986) a Atherton a spol.: Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach, I.R.L. Press, Oxford 1989.

Rekombinantní lidský IL-10 je také obchodním artiklem, který lze získat od např. PeproTech, lne., Rocky Hill, NJ.

Rekombinantní IL-10 se může vyrábět také s využitím informací o sekvencích známého lidského IL-10 nebo virového IL-10. Způsoby výroby rekombinantního lidského IL-10 jsou popsány např. v mezinárodní patentové přihlášce č. WO 91/00349. Klony, obsahující sekvence, kódující lidský IL-10, byly uloženy v Americké sbírce typů kultur (ATCC), Rockville. Maryland, 20. prosince 1989 a byla jim přiřazena čísla 68191 a 68192. Klonování a exprese virového IL-10 (BCRFI proteinu) z viru Epstein Barr byla popsána Moorem a spol. [Science 248, 1230 (1990)].

Lidský IL-10 se s výhodou používá pro léčení lidí, i když se místo něj může použít také virový IL-10 nebo IL-10 z některého jiného druhu savců. Nejvýhodněji se jako IL-10 používá rekombinantní lidský IL-10.

IL-10 z jakéhokoliv zdroje se může čistit standardními způsoby, včetně (ale bez omezení na tyto) srážení kyselinou nebo solí, chromatografií na ionexu, chromatografií na chelátu kovů, gelovou filtrací, rychlou proteinovou kapalinovou chromatografií (FPLC), vysokoůčinnou kapalinovou

-3 CZ 283488 B6 chromatografií (HPLC), preparativní elektroforézou na diskovém gelu nebo záclonovou elektroforézou, izoelektrickou fokusací, frakcionací z organického rozpouštědla s nízkou teplotou varu, protiproudým roztřepáváním a imunoafinitní chromatografií.

Protilátky proti IL-10 se mohou připravovat standardními způsoby. Slovo protilátka tak, jak je zde používáno, znamená jak polyklonální, tak monoklonální protilátky (McAbs). Zahrnuje také celé imunoglobuliny a jejich fragmenty, vázající antigen.

Polyklonální protilátky se mohou připravovat imunizací hostitelského zvířete, jako je králík, krysa, koza, ovce, myš atd., IL-10. Po původní injekci se s výhodou podají jedna nebo dvě zesilující injekce, aby se zvýšil titr protilátky. Potom se zvířeti odebere krev. Připraví se sérum, které se analyzuje standardním způsoby, jako je ELISA s použitím polypeptidu jako antigenu. Standardními způsoby se pak připraví imunoglobulinové frakce.

Sérum, které se připraví z takto imunizovaných zvířat, se může používat přímo. IgG frakce se může od séra oddělit také standardními způsoby, jako je plazmaforéza nebo adsorpční chromatografie s použitím IgG specifických adsorbentů, jako je imobilizovaný protein A.

Monoklonální protilátky, které jsou výhodné pro použití podle tohoto vynálezu, se mohou připravovat standardními způsoby, např. jak popisují Kohler a spol.: [Nátuře 256, 495 (1975), Eur. J. Immunol. 6, 511 (1976)]. Pro přípravu somatických buněk, sekretujících protilátku, se zvíře imunizuje v podstatě tak, jak je to shora popsáno. Tyto buňky se pak z imunizovaného zvířete odeberou pro fůzi s buňkami myelomu.

Somatické buňky, které mají schopnost produkovat protilátky, zvláště B buňky, jsou vhodné pro fůzi s linií buněk myelomu. Tyto somatické buňky se mohou odvozovat od lymfatických uzlin, sleziny a periferní krve primárně imunizovaných zvířat. Často se používají buňky krysí sleziny, zvláště proto, že tyto buňky produkují relativně vysoké procento stabilních fůzí s myšími myelomovými liniemi. Místo nich by však bylo možné používat lidské, myší, králičí, ovčí, kozí nebo jiné buňky.

Pro použití v postupech, produkujících hybridomové fúze, byly vyvinuty specializované myelomové buněčné linie z lymfatických nádorů [Kohler aMilstein: Eur. J. Immunol. 6, 511 (1976): Shulman a spol.: Nátuře 276, 269 (1978), Volk a spol.: J. Virol. 42, 220 (1982)]. Způsoby generování hybridů buněk sleziny nebo lymfatických žláz, produkujících protilátky, a myelomových buněk, obvykle zahrnují smíchání somatických buněk s myelomovými buňkami v poměru 10:1 (i když se tento poměr může pohybovat od 20:1 do 1:1) v přítomnosti činidla nebo činidel (chemických, virových nebo elektrických), která podporují fúzi buněčných membrán. Způsoby fůze jsou popsány Kohlerem a Milsteinem: viz výše. Gefterem a spol. [Somatic Cell Genet. 3, 231 (1977).] a Volkem a spol. [J. Virol. 42, 220 (1982)]. Činidlem, podporujícím fůzi, které bylo použito autory vynálezu, byl virus Sendai a polyethylenglykol (PEG).

Jelikož postupy fůze produkují živé hybridy ve velmi nízkých frekvencích (např. jestliže se jako zdroj somatických buněk použijí sleziny, získá se jeden hybrid na zhruba každých 1, 10⁵ buněk sleziny), je podstatné mít prostředky pro oddělení fúzovaných buněčných hybridů od zbývajících nefůzovaných buněk, zvláště nefúzovaných myelomových buněk. Jsou nutné také prostředky pro detekování žádaných hybridomů, produkujících protilátky zjiných výsledných fúzovaných buněčných hybridů.

Oddělení fúzovaných buněčných hybridů se obvykle provádí tak, že se buňky kultivují v médiu, které podporuje růst hybridomů, ale brání růstu nefúzovaných myelomových buněk, které by se normálně dělily do nekonečna. Somatické buňky, použité pro fúzi, si neudrží dlouhodobou životaschopnost vin vitro kultuře a nepředstavují tedy žádný problém. Mohou se používat například myelomové buňky, kterým chybí hypoxanthin-fosforibosyl-transferáza (HPRT

-4CZ 283488 B6 negativní). Výběr z těchto buněk se provádí v hypoxanthin/aminopterin/thymidinovém (HAT) médiu, v němž fúzované buněčné hybridy přežívají díky HPRT-pozitivnímu genotypu buněk sleziny. Je možné také použít myelomových buněk s různými genetickými deficity (citlivost na léčiva atd.), které lze vybrat podle média, podporujícího růst genotypicky příslušných hybridů.

Pro selektivní kultivování fúzovaných buněčných hybridů je potřeba několik týdnů. Na počátku této doby je nutné identifikovat ty hybridy, které produkují žádané protilátky, takže se mohou následně klonovat a množit. Obecně produkuje žádanou protilátku kolem 10% získaných hybridů, i když není neobvyklé, že toto množství je od 1 do 30 %.

Detekce hybridů, produkujících protilátky, se může provádět kterýmkoliv z několika standardních způsobů testování, včetně testu ELISA a radioimunoanalytických způsobů, které byly popsány v literatuře [viz např. Kennet a spol. (red.): Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, str. 376 až 384, Plenům Press, New York 1980. ].

Jakmile se jednou žádané fúzované buněčné hybridy vyberou a klonují na jednotlivé buněčné linie, produkující protilátku, každá buněčná linie se může množit jedním ze dvou standardních způsobů. Histokompatibilnímu zvířeti se může injekčně podat suspenze hybridomových buněk. U tohoto zvířete se pak vyvinou nádory, které sekretují specifickou monoklonální protilátku, produkovanou fúzovaným buněčným hybridem. Tělesné kapaliny zvířete, jako je sérum nebo kapalina zascitů, se odeberou dutou jehlou. Získají se tak monoklonální protilátky ve vysoké koncentraci. Jednotlivé buněčné linie se mohou množit také in vitro v laboratorních kultivačních nádobách. Kultivační médium, obsahující vysoké koncentrace jednotlivé specifické monoklonální protilátky, se izoluje dekantací, filtrací nebo odstřeďováním a následně se vyčistí.

Jakmile se jednou získá hybridom, produkující žádanou monoklonální protilátku, mohou se pro přípravu interspecifických monoklonálních protilátek použít způsoby, v nichž se vazebná oblast jednoho druhu kombinuje s nevazebnou oblastí protilátky jiného druhu [Liu a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 3439 (1987).]. Například CDR z monoklonální protilátky hlodavce se naroubuje na kostru lidské protilátky. Tím se protilátka hlodavce polidští [Riechmann a spol.: Nátuře 332, 323 (1988)]. Podrobněji. CDR se mohou naroubovat na proměnnou oblast lidské protilátky s nebo bez lidských stabilních oblastí. Takový způsob byl použit např. pro polidštění myší monoklonální protilátky na p55 (Tac) podjednotku receptorů lidského interleukinu-2 [Queen a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 10029 (1989)].

Lidské monoklonální protilátky se mohou připravovat také s použitím IL-10 a způsobů, popsaných Banchereauem a spol. [Science 251, 70 (1991)].

Tento vynález zahrnuje také fragmenty vázající protilátku, jako je Fab. F(ab')₂, Fv atd. Použití a generace fragmentů protilátek je dobře známa, např. Fab fragmentů [Tijssen: Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier. Amsterodam 1985) ] , Fv fragmentů [Hochman a spol.: Biochemistry 12, 1130 (1973), Sharon a spol.: Biochemistry 15, 1591 (1976), Ehrlich a spol.: USA patent č. 4 355 023.] a poloviny molekuly protilátky (Auditore-Hargreaves. USA patent č. 4 470 925.).

Protilátky a fragmenty protilátek, používané podle tohoto vynálezu, se budou s výhodou vázat na IL-10 a budou neutralizovat biologickou aktivitu IL-10, proti němuž byly připraveny.

V další části popisu bude popsána inhibice proliferace neoplastických buněk, závislých na 1L-2.

Jak je níže uvedeno v příkladech, lidský a virový IL-10 mají přímé vlivy na lidské T buňky. Bylo zjištěno, že všechny proliferační odpovědi lidských ThO-, Thl a Th2-podobných buněk jsou inhibovány IL-10, jestliže se použijí L buňky transfektované FcyRII (CD32) v kombinaci buď

-5CZ 283488 B6 santi-CD3 monoklonálními protilátkami nebo mitogenním párem anti-CD2 monoklonálních protilátek. Antigenově specifické proliferační odpovědi klonů lidských T-buněk byly inhibovány IL-10, jestliže se jako APC použijí myší L buňky, transfektované relevantní třídou II MHC molekul. IL-10 neovlivňuje expresi skupiny II MHC v tomto systému, protože konstitutivní exprese transfektovaných genů třídy II MHC je pod kontrolou promotoru SV40.

Inhibiční účinky IL-10 pocházejí primárně od přímého vlivu IL-10 na klony T buněk inhibicí produkce IL-2 na úrovni mRNA. Inhibiční účinky byly specifické pro IL-2, jelikož IL-10 neovlivňuje produkci IFN-γ. IL-4, IL-5 aGM-CSF. Interakce IL-10 s IL-10 receptorem zřejmě vyvolává signální cestu, která specificky inhibuje syntézu IL-2.

Pro demonstrování účinnosti prostředků podle tohoto vynálezu se mohou použít také jiné testy. Například se mohou použít modely xenoimplantátu nahých myší. Tyto modely byly použity pro testování rozmanitých terapeutických činidel [viz: Howard a spol.: Cancer Res. 51, 3274 (1991) a McLemore a spol.: Cancer Res. 47, 5132 (1987)].

Tato proliferace buněk může souviset s leukémií, jako je B buněčná CLL. Savci, kteří jsou léčeni způsobem podle tohoto vynálezu, jsou s výhodou lidé, kteří jsou postiženi proliferaci neoplastických buněk, závislých na IL-2.

Způsob inhibování proliferace neoplastických buněk, závislých na IL-2, podle tohoto vynálezu se vyznačuje tím, že se savci, s výhodou člověku, který trpí proliferaci neoplastických buněk, podává terapeuticky efektivní dávka IL-10. Může se podávat také terapeuticky efektivní dávka druhého biologicky efektivního činidla.

Farmaceutické prostředky, obsahující IL-10 a fyziologicky přijatelný nosič, se typicky podávají intravenózně. IL-10 může být také obsažen v tobolkách v liposomu.

Pojem proliferace neoplastických buněk, závislých na IL-2 tak, jak se zde používá, znamená jakýkoliv nový nebo abnormální růst tkáně, kdy růst je nekontrolovaný, progresivní, a kontinuální proliferace závisí na IL-2. Růst může být buď benigní nebo maligní. Maligní růst je typicky charakterizován vyšším stupněm anaplazie (dediferenciace) v neoplastických buňkách. Neoplastické buňky, závislé na IL-2, jsou typicky odvozeny od lymfoidních nebo myeloidních linií.

IL-2 je produkován T buňkami. Má více aktivit na různé typy buněk, včetně T buněk. NK buněk a B buněk. Bylo ukázáno, že IL-2 působí jako růstový faktor T buněk a zvyšuje produkci cytokinů T buňkami, jestliže jsou stimulovány v přítomnosti IL-2. IL-2 aktivuje buňky přírodního zabíječe (NK) pro zabíjení cílových buněk MHC ne-specifickým způsobem. IL-2 je také zahrnut při expanzi buněk, omezených ve volbě, čímž zvyšuje produkci protilátek těmito buňkami.

Vzhledem k těmto aktivitám IL-2 by mohla být v některých případech onemocnění důležitá inhibice produkce IL-2, způsobená IL-10. Ta by mohla sloužit například jako prostředek pro snížení IL-2 řízené proliferace T buněk v situacích, kdy proliferace a růst T buněk je nežádoucí, jako je tomu v případě autoimunních onemocnění, jako je autoimunní thyroiditida, diabetes závislý na inzulínu, revmatická artritida, systémová lupus erythematosus a sclerosis mutliplex.

Schopnost IL-10 snižovat IL-2 řízenou expanzi T buněk má také potenciální klinické využití při léčení hostitelské choroby při akutním štěpu versus a chronických zánětlivých onemocněních, jako je zanětlivé vnitřní onemocnění a sarkoidní a pulmonální fibróza. Navíc, inhibováním IL-2 řízené proliferace alergenově specifických T buněk, které jsou silnými producenty IL-4 a IL-5, se IL-10 může použít k léčení alergických onemocnění, jako je astma a atopická dermatitida.

-6CZ 283488 B6

Mezi onemocnění, zahrnující neoplastický růst, která mohou být léčena farmaceutickými prostředky podle tohoto vynálezu, patří leukemie, o nichž je známo, že závisí na IL-2, jako je B buněčná CLL a ATL. Farmaceutické prostředky podle vynálezu jsou vhodné pro použití 5 v různých systémech pro podávání léčiv. Pro stručný přehled těchto způsobů podávání léčiv viz Langer: Science 249, 1527 (1990). Způsoby přípravy sloučenin, schopných podávání, budou známy nebo zřejmý odborníkům a jsou podrobněji popsány například v Remingtonů Pharmaceutical Science, 17. vydání, Mack Publishing Company. Easton, Pa (1985).

io IL-10, používaný podle vynálezu, se může připravovat jako prostředky ve farmaceuticky přijatelném médiu, například solném roztoku, fosforečnanem pufrovaném solném roztoku (PBS), Ringerově roztoku, solném roztoku s dextrózou. Hankově roztoku a glukóze. Prostředky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelná pomocná činidla, jak je to potřebné pro přibližně fyziologické podmínky, jako jsou pufrovací činidla, činidla upravující tonicitu, smáčecí činidla, detergentní činidla a podobná. Mezi přísady patří také další aktivní složky, např. baktericidní činidla nebo stabilizátory. Množství, podávané pacientovi, bude záviset na tom, co se podává, na účelu podávání, jako je profylaxe nebo terapie, na stavu hostitele, na způsobu podávání a na podobných faktorech.

Farmaceutické prostředky jsou typicky určeny pro transdermální nebo parenterální podávání, např. intravenózně, subkutánně nebo intramuskulámě. Žádoucí jsou také formy pro orální podávání. Mohou se získat modifikací prostředku tak, aby prošel prostředím žaludku. Tyto prostředky se mohou používat pro profylaxi a/nebo z důvodů terapeutických. Farmaceutické prostředky se s výhodou podávají intravenózně. Tento vynález poskytuje prostředky, které obsahují IL-10 polypeptid, rozpuštěný nebo suspendovaný v přijatelném nosiči, s výhodou vodném nosiči. Tyto prostředky mohou být sterilovány konvenčními způsoby sterilizace, nebo se mohou sterilně zfiltrovat.

Výsledné vodné roztoky se mohou zabalit pro používání jako takové, nebo v lyofilizované formě.

Lyofilizované přípravky se před podáváním spojí se sterilním vodným nosičem. IL-10 se může podávat také s druhým biologicky aktivním činidlem, jako je standardní chemoterapeutické činidlo. Mezi taková činidla patří, ale nejsou omezena jenom na tato, vincristin, daunorubicin. Lasparaginasa, mitoxantron a amsakrin.

Při terapeutických aplikacích se farmaceutické prostředky podávají pacientovi v množství, které je dostatečné pro inhibování proliferace neoplastických buněk, závislých na IL-2. Množství, kterého je potřeba pro dosažení žádoucího efektu, se definuje jako terapeuticky efektivní množství. Terapeuticky efektivní dávka IL-10 se bude měnit například podle použití, pro které je určeno, podle způsobu podávání, podle zdraví a stavu pacienta a podle posudku ošetřujícího lékaře. Například dávka pro kontinuální infuzi bude typicky v rozmezí od 500 ng do 800 pg za den pro pacienta o hmotnosti 70 kg, s výhodou mezi 10 pg a 300 pg. Typickou dávkou je dávka mezi 700 ng/kg/den a 16 pg/kg/den.

Koncentrace IL-10 ve farmaceutických prostředcích může být různá, tj. od 10 pg do asi 5 mg/ml, s výhodou mezi 100 pg až 2 mg na ml. Koncentrace se obvykle vybere primárně podle objemu kapaliny, viskozity atd., v souladu s příslušným zvoleným způsobem podávání. Typický farmaceutický prostředek pro intravenózní infuzi by se mohl vyrobit tak, aby obsahoval 250 ml solného roztoku s dextrózou a 2,5 mg IL-10.

Pro pevné prostředky se mohou použít konvenční netoxické pevné nosiče, mezi které patří například následující látky o čistotě pro farmaceutické prostředky: manitol, laktóza, škrob, stearát hořečnatý, sodná sůl sacharinu, talek, celulóza, glukóza, sacharóza, uhličitan horečnatý a podobné. Pro orální podávání se vyrobí farmaceuticky přijatelný netoxický prostředek

-7CZ 283488 B6 přidáním normálně používaných ředidel, jako jsou shora uvedené nosiče, a obvykle 10 až 95 % hmot, aktivní složky, tj. polypeptidu IL-10 podle vynálezu, s výhodou 25 až 75 % hmot.

Pro podávání ve formě aerosolu se IL-10 s výhodou dodává v jemně rozemleté formě společně s povrchově aktivním činidlem a hnací látkou. Typický obsah IL-10 je 0,01 až 20 % hmot., s výhodou 1 až 10% hmot.. Povrchově aktivní činidlo musí ovšem být netoxické as výhodou rozpustné v hnací látce. Reprezentativními příklady těchto činidel jsou estery nebo částečné estery mastných kyselin s 6 až 22 atomy uhlíku, jako je ester kyseliny kaprové, oktanové, laurové, palmitové, stearové, linolové, linolenové, olestearové a olejové s alifatickým polyhydroxyalkoholem nebo jeho cyklickým anhydridem, jako je například ethylenglykol, glycerol, erythritol, arbitol, manitol, sorbitol, anhydridy hexitolu, odvozené od sorbitolu, a polyoxyethylenové a polyoxypropylenové deriváty těchto esterů. Mohou se používat smíšené estery, jako jsou směsné nebo přírodní glyceridy.

Povrchově aktivní činidlo může představovat 0,1 až 20 % hmot, z prostředku, s výhodou 0,25 až 5 % hmot. Doplnění prostředku do příslušného množství se obvykle provede hnací látkou. Zkapalněnými hnacími látkami jsou typicky plyny za teplot místnosti, které jsou zkondenzovány pod tlakem. Vhodnými kapalnými hnacími látkami jsou nižší alkany s až 5 atomy uhlíku, jako je butan a propan, výhodné jsou fluorované a fluorchlorované alkany. Mohou se používat také směsi shora uvedených látek. Při výrobě aerosolu se nádoba s vhodným ventilem naplní příslušnou hnací látkou, která obsahuje jemně rozemletý peptid (jemně rozemleté peptidy) a povrchově aktivní činidlo. Tyto složky se pak udržují pod zvýšeným tlakem, dokud se neuvolní ventilem.

Pro zvýšení poločasu séra se IL-10 může uzavřít do tobolek, vložených do lumenu liposomů, připravených jako koloidní látka. Pro prodloužení životnosti peptidů se mohou použít také jiné konvenční způsoby. Tak v některých případech se IL-10 může uzavřít do tobolky v liposomů. Pro přípravu liposomů jsou dostupné různé způsoby, jak je to popsáno např. Szokou a spol.: Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9, 467 (1980) a v USA patentech číslo 4 235 871, 4 501 728 a 4 837 028.

Po přípravě se může upravit velikost liposomů tak, aby se získalo žádané rozmezí velikosti a relativně úzká distribuce velikostí liposomů. Liposomy lze na žádanou velikost upravit několika způsoby. Jeden z nich je popsán v USA patentu číslo 4 737 323.

I při nejůčinnějších způsobech přípravy tobolek může původní suspenze liposomů obsahovat až 50 nebo více % hmot, léčiva ve volné formě (tj. ve formě neuzavřené do tobolky). Odstranění neuzavřené sloučeniny ze suspenze liposomů je možné provést několika způsoby. Podle jednoho způsobu se liposomy v suspenzi peletují odstřeďováním při vysoké rychlosti. V supematantu tak zůstane volná sloučenina a velmi málo liposomů. Podle jiného způsobu se suspenze zkoncentruje ultraflltrací, potom se zkoncentrované liposomy resuspendují v dalším médiu. Pro oddělení velkých liposomových částic od rozpuštěných molekul se může použít také gelová filtrace.

Pro shora uvedené léčení pro použití při intravenózním podání se suspenze liposomů upraví na žádané koncentrace. Tato úprava zahrnuje resuspendování liposomů ve vhodném objemu média pro injekce, liposomy se zkoncentrují, například odstřeďováním nebo ultrafiltrací nebo zahuštěním suspenze, kde stupeň odstranění léčiva zvyšuje celkový objem suspenze. Suspenze se pak steriluje filtrací, jak shora uvedeno. Liposomy, obsahující peptidy podle vynálezu, se mohou podávat parenterálně, jak shora popsáno.

Zvýšená produkce IFN-γ: Způsob podle tohoto vynálezu je zvláště užitečný, jestliže pacient trpí infekční chorobou, při níž pacientův imunitní systém inhibuje produkci IFN-γ díky produkci IL-10. Mezi reprezentativní onemocnění tohoto typu patří viscerální leishmanióza, lepra s infíltráty a plísňové infekce. Mezi reprezentativní plísňové infekce patří rody hub, vybrané ze skupiny, sestávající z: Candida. Paracoccidioidomycosis. Blastomyces a Cryptospiroidium.

-8CZ 283488 B6

Četným infekčním organismům vyhovují, buď přímo nebo nepřímo, nízké hladiny IFN-γ. Tyto infekce jsou často chronické a je pro ně typická nerovnováha Th2 aThl odpovědí na infekční činidlo. Výsledkem této nerovnováhy je inhibice produkce IFN-γ buňkami Thl díky produkci 5 IL-10 buňkami Th2.

Protilátky, použité v tomto vynálezu, jsou pro pacienta s výhodou autologní. Užitečné jsou také nevlastní protilátky, odvozené od buněk stejného druhu. Mohou se používat protilátky z různých druhů, ale musí se používat prostředky pro kontrolu možných nepříznivých imunitních reakcí 10 (HAMA). Např. polidštěné krysí protilátky, stejně jako různé vazebné fragmenty, mohou minimalizovat imunitní odpovědi u lidí. Výhodné budou takové protilátky, jejichž vazebné konstanty jsou přibližně stejné nebo převyšují afinitu IL-10 k jeho přírodním receptorům.

Výhodné jsou takové protilátky, které mají vazebné konstanty na jejich odpovídající receptory 15 více než lOOkrát menší než tento cytokin. Srovnání vazebnosti se provádí standardními rovnovážnými způsoby. Základní technologie je popsána v kapitole 25, díl 1: Immunochemistry, red. D. M.Weir, 4. vydání, 1986, Blackwell Scientific Publ. 25, 1-25, 30. Lze použít také test pro stanovení molámího nadbytku protilátky, která neutralizuje definované množství IL-10 ve standardním in vitro biotestu. Příklady takových testů lze nalézt ve Fiorentinovi a spol.: J. Exp.

Med. 170, 2081 (1989). Rozumnými množstvími protilátek jsou taková množství, která neutralizují dané množství IL-10 v 10- až 1000-násobném nadbytku.

Prostředky podávání jsou typicky parenterální, s výhodou intravenózní. Protilátky se mohou pacientovi podávat infiizí standardními intravenozními způsoby. Protilátky se nejdříve 25 suspendují ve sterilním, fyziologicky slučitelném médiu, jako je fosforečnanový solný pufr. S protilátkami se mohou smíchat farmaceuticky přijatelná ředidla, jako je lecithin, glukóza, dextróza a antibiotika.

Množství protilátky se pohybuje v rozmezí 1 až 10 mg protilátky na kg tělesné hmotnosti. Je 30 žádoucí, aby protilátka byla podávána v takovém množství, které poskytuje cirkulační hladinu 1 až 150 pg/ml, s výhodou 10 až 100 pg/ml séra pro protilátku. Protilátka má typický poločas 2 až 7 dnů. Zopakované podání je potřebné, jestliže hladina protilátky klesne pod žádoucí množství. Množství protilátky ve vzorcích séra se může měřit konvenčními imunotesty, s výhodou testem ELISA.

I když jsou pro ilustraci provedení podle tohoto vynálezu použity monoklonální protilátky proti IL-10, je možné použít také jiné antagonisty. Mohou se použít například protilátky, které se specificky vážou na IL-10 receptory a tím inhibují navázání cytokinu. Podobně se mohou použít rozpustné formy IL-10 receptoru, kterému chybí transmembránové domény. A konečně, mohou 40 se použít antagonisté mutovaných forem IL-10, které se silně vážou na odpovídající receptory, ale kterým v podstatě chybí biologická aktivita.

Antagonisté se s výhodou současně podávají intravenózně jako sterilní vodná směs. Tato směs může obsahovat jakékoliv farmaceuticky přijatelné ředidlo, jako jsou sterilní pufry, solný roztok, 45 antibiotika a podobné.

Léčení se typicky ukončí tehdy, jestliže infekce je pod kontrolou, což lze zjistit podle klinické odpovědi pacienta. Společně s tímto vynálezem lze použít i léčení konvenčními antibiotiky.

Zánětlivé vnitřní onemocnění: Pojem zánětlivé vnitřní onemocnění nebo IBD se zde používá pro vředovitou kolitidu a Crohnovu chorobu. Podávání IL-10 při léčení IBD je s výhodou parenterální, jako například intravaskulámí. Nejvýhodnějším podáváním je intravenózní podávání a léčeným savcem je člověk.

-9CZ 283488 B6

Množství podávaného IL-10 je obvykle v rozmezí od 1 pg do 100 mg na kg tělesné hmotnosti. Toto rozmezí je často od 10 pg do 1000 pg na kilogram tělesné hmotnosti. Nejvýhodnější podávanou dávkou je množství od 50 pg do 100 pg na kilogram tělesné hmotnosti.

IL-10 se může podávat samotný nebo společně s jedním nebo více dalšími terapeutickými činidly. Mezi příklady takových činidel, která jsou užitečná pro regulaci epizodního zánětu vnitřní tkáně, patří kortikosteroidy, sulfasalazin, deriváty sulfasalazinu, imunosupresivní léčiva, jako je cyklosporin A, merkaptopurin a azathioprin, a další cytokiny. Společné podávání může io být postupné nebo souběžné. Společné podávání obvykle znamená, že více (dvě nebo více) léčiv je v příjemci přítomno po jistou specifickou dobu. Typicky platí, že přidá-li se druhé činidlo během poločasu prvního činidla, pak se toto podávání považuje za současné podávání obou činidel.

Podle vynálezu se používá IL-10 k výrobě léku, který obsahuje farmaceutický prostředek s IL-10. Prostředek pro podávání savci, který má IBD, jako je vředovitá kolitida nebo Crohnova choroba, obsahuje takové množství IL-10, které je efektivní pro zlepšení alespoň jednoho příznaku nebo znaku IBD u savce, a shora popsaný farmaceutický nosič.

Pojem příznak (symptom) znamená jakýkoliv subjektivní průkaz nemoci nebo pacientova stavu. Patří sem příznaky vnímané pacientem. Mezi příklady příznaků IBD patří diarea, abdominální bolest, horečka, melena, hematochézie a ztráta hmotnosti. Pojem znak se obecně týká jakéhokoliv objektivního průkazu nemoci nebo stavu, obvykle vnímaného vyšetřujícím lékařem, nebo vlastnosti, které se zjistí laboratorním vyhodnocením nebo jinými testy, jako je ultrazvu25 ková studie nebo radiografický test.

Mezi některé příklady znaků IBD patří abdominální tíže, glositida, aftózní vřed, anální fisura, perianální fisura, anemie, malabsorpce a nedostatek železa. Příležitostně se znaky a příznaky překrývají. Například pacient si stěžuje na krvavou stolici (příznak) a laboratorní test vzorku 30 stolice je pozitivní na krev (znak).

Farmaceutické prostředky tohoto provedení jsou s výhodou ve formě, která je vhodná pro parenterální podávání. Efektivním množstvím je s výhodou jednotková dávka v ampuli. Efektivní množství může být přítomno také v lékovce, obsahující více dávek, nebo by se mohlo nabízet 35 v nějaké formě. Mezi příklady farmaceuticky přijatelných přísad patří ředidla, jako jsou vodná ředidla, pufry, ředidla, protimikrobiální činidla a ochranná činidla.

Pro stanovení IL-10 aktivity se mohou používat biologické testy cytokinů jako takových. Biologický test lidského lymfotoxinu je popsán Aggarwalem: Methods in Enzymology 116, 441 40 (198 5) aMatthewsem aspol. (red. Clemens aspol.): Cytokines and Interferons; A Practical

Approach, str. 221 až 225 (IRL Press, Washington, D. C. 1987). Lidský IL-2 aGM-CSF mohou být testovány na faktoru závislými buněčnými liniemi CTLL-2 aKG-1, které jsou dostupné od ATCC pod označením TIB 214 a CCL 246. Lidský IL-3 lze testovat jeho schopností stimulovat tvorbu různých kolonií hematopoézních buněk v kulturách měkkého agaru, např. jak popisuje 45 Metclaf: The Hemopoietic Colony Stimulating Factors (Elsevier, Amsterodam 1984). INF-γ může být kvantitativně vyhodnocován antivirovými testy, např. Meager v Clemensovi a spol. (red.) na str. 129 až 147. Monitorování těchto cytokinů poskytuje užitečné informace o tom, kdy bylo podáno efektivní množství IL-10. Mohou se používat také imunochemické testy, jako je ELISA.

IL-10 se může podávat ve vodných ředidlech, jako je voda, solný roztok nebo pufrovaná ředidla s přidáním nebo bez přidání různých přísad a/nebo ředidel. Může se také připravit suspenze, například zinková suspenze, která obsahuje IL-10. Tato suspenze je užitečná pro subkutánní (sc)

- 10CZ 283488 B6 nebo intramuskulámi (im) injekce. Množství IL-10 a přísady se může pohybovat v širokém rozmezí, pokud je oboje přítomno v efektivních množstvích. Množství IL-10 by se mělo pohybovat v rozmezí od 1 μg do 100 μg.

Celkovou denní dávkou je typicky množství od 1 μg do 100 mg na kilogram tělesné hmotnosti. Výhodná dávka se vybere z rozmezí od 10 μg do 1000 μg na kilogram tělesné hmotnosti. Výhodnější dávka se vybere z rozmezí od 50 pg do 100 pg na kilogram tělesné hmotnosti. Dávky se podávají podle takového schématu, které poskytuje žádaný terapeutický účinek a které může být periodické nebo nepravidelné po kratší nebo delší dobu podle epizodní povahy takových zánětů.

Prostředky se do těla mohou dostávat orálně nebo injekčně. Mezi prostředky pro orální podávání patří sloučeniny, které chrání polypeptidy před proteinázami, které se vyskytují v gastrointestinálním traktu. Injekce jsou obvykle intramuskulámi, subkutánní, intradermální nebo intravenozní. Za příslušných okolností se mohou používat také intraartikulámí injekce nebo jiné cesty podávání. Prostředky, obsahující IL-10, mohou také být pacientovi implantovány, nebo mohou být podány injekčně systémem pro podávání léčiv. Viz například Urguhart a spol.: Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24, 199 (1984), Lewis (red.): Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals (Plenům Press, New York, 1981) a USA patenty č. 3 773 919 a 3 270 960.

Peptid se s výhodou podává parenterálně, s výhodou v jednotkové dávkové injektovatelné formě. Příklady injektovatelné formy jsou roztoky, suspenze a emulze. Výhodněji se efektivní množství IL-10 podává intravenózně.

Pojem efektivní množství je zde definován tak, že znamená množství, které je dostatečné ke zmírnění příznaku nebo znaku autoimunitního stavu nebo nežádoucí nebo nepatřičné zánětlivé nebo imunitní odpovědi. Mezi typické savčí hostitele patří myši, krysy, kočky, psi a primáti včetně člověka. Efektivní množství pro příslušného pacienta závisí na faktorech, jako je stav léčeného, celkový zdravotní stav pacienta, cesta a dávka podávání a prudkost vedlejších účinků.

Stanovení příslušné dávky provede lékař s použitím parametrů, známých odborníkům. Obvykle dávkování začíná množstvím poněkud menším než je optimální dávka a zvyšuje se po malých přírůstcích, dokud se nedosáhne optimálního účinku. Viz obecně The Měrek Manual § 269 Pharmacokinetics and Drug Administration. Důležitými indikátory dosažení efektivní dávky jsou hladiny TNFa, IFN-γ, IL-1 a IL-6. S výhodou se používá IL-10, odvozený od savčích typů.

Typicky se IL-10 podává injekcí společně s farmaceutickým nosičem, jako je normální solný roztok. Ringerův roztok, roztok dextrózy a další vodné nosiče, známé odborníkům. Mohou se používat také příslušné nevodné nosiče. Příkladem jsou netuhnoucí oleje a ethyloleát. Výhodným nosičem je 5 % (hmot.) roztok dextrózy v solném roztoku. Často je žádoucí, aby v nosiči byla zahrnuta pomocná činidla, jako jsou pufřy a ochranná činidla, nebo jiné látky pro zvýšení isotoničnosti a chemické stability.

Celková denní dávka se může podávat jako jediná injekce nebo jako kontinuální infuze. Může být také rozdělena do několika menších dávek, jako bolus pro intravenózní podání nebo podání nějakou jinou cestou, jako je intramuskulámi injekce. IL-10 se s výhodou podává jako intravenózní bolus.

IL-10 se může podávat samotný nebo v kombinaci s jinými terapeutickými činidly. Mezi příklady takových činidel při indikaci zánětu střev patří kortikosteroidy, sulfasalazin, deriváty sulfasalazinu a vybraná cytotoxická léčiva, jako je cyklosporin A, merkaptopurin a azathioprin. Násobné léčení se typicky provádí tak, že se odděleně podají infuze, nebo se po sobě podají

- 11 CZ 283488 B6 injekce. V některých případech se násobné léčení provádí tak, že se léčiva smíchají a podávají se současně infuzí nebo injekcí, např. IL-10 společně s jinými cytokiny, steroidy nebo terapeutickými reakčními činidly.

Mělo by být uvedeno, že příznaky IBD mohou být epizodní, takže se efektivního léčení může dosáhnout podáním malých dávek ve vhodných momentech. Malá množství kontinuálního podávání mohou poskytovat dlouhá období bezepizodního zdraví pro postižené cílové živočichy.

Příklady provedení vynálezu

Tento vynález může být ilustrován následujícími neomezujícími příklady. Pokud není jinak uvedeno, procenta, uvedená pro pevné látky v pevné směsi, znamenají hmotnostní procenta k hmotnostním dílům, pro kapalin v kapalinách objemová procenta objemovým dílům, a v případě pevných látek v kapalinách hmotnostní procenta k objemovým dílům.

Inhibice proliferace neoplastických buněk, závislých na IL-2

Příklad 1

IL-10 inhibuje proliferaci lidských ThO, Thl aTh2 podobných klonů po aktivaci anti-CD3 monoklonálními protilátkami, zesíťovanými na myších L buňkách transfektovaných CD32

Buňky a buněčné linie

Používají se linie T-buněk CD2⁺, CD3⁺, CD4⁺ a CDB’. Klony HY-06, 827 a 837 byly popsány dříve [Yssel a spol.: Eur. J. Immunol. 16, 1187 (1986) aHaanen a spol.: J. Exp. Med. 174, 583 (1991)]. Klon T buněk 827 rozpoznává toxin tetanu (TT) v kontextu HLA-DR3 a klon T buněk HY-06 rozpoznává peptid 2-12 zheat shock proteinu z Mycobacterium leprae o molekulové hmotnosti 65 000. Antigenová specifičnost klonu T buněk 837 není známa.

Klony T buněk SP-B21 aSP-A3 byly získány z pacienta, trpícího prudkou kombinovanou nedostatečnou imunitou (SCID), kterému byly úspěšně transplantovány fetální thymus a játra [Roncarolo a spol.: J. Exp. Med. 168, 2139 (1988) ] . Klony T buněk NP 12, NP 14 a NP 44 byly získány z PBMC atopického pacienta aproliferují specificky v odpovědi na peptid p89-l 17 molekuly Der p 1, hlavního alergenu roztoče v bytovém prachu [Yssel a spol.: J. Immunol. 148, 738 (1992).] . Klony T buněk CR253, CR378, CR380, AP74 aAP75 byly izolovány z PBMC pacientů, trpících chronickou Lymskou artritidou a reagují na homolog heat shock proteinu Borrelia burgdorferi s mol, hmotností 60 000 (HSP60) [Shanafelt a spol.: J. Immunol. 146, 3985 (1991)].

Tyto klony T buněk byly přiřazeny k T pomocným podřadám na základě jejich profilů produkce lymfokinů (tabulka 1). Klony T buněk (2.10⁵ buněk/ml) byly stimulovány ve dvoutýdenních intervalech směsí krmných buněk, která sestává z 10⁶ ozářených (4 000 rad) alogenních periferních krevních leukocytů (PBL) na mi, 10⁵ ozářených (5 000 rad) buněk na ml B buněčných linií, transformovaných virem Epstein-Bar (EBV-LCL) JY, a 0,1 mg/ml vyčištěných PHA (Welcome Diagnostics, Beckenham, Kent, Anglie) ve 24 jamkách Linbro desek (Flow, Mc Lean, Va.), jak to bylo drive popsáno [Spits a spol.: J. Immunol. 128, 95 (1982)]. Tri až 4 dny po každé restimulaci se kultury rozštěpí a dále se expandují v médiu, obsahujícím 20 jednotek rIL-2 na ml. Všechny klonované linie T buněk a EBV-LCL byly kultivovány v Ysselově médiu (Yssel a spol.: J. Immunol. Methods 72, 219 (1984)), doplněném 1 % lidského AB⁺ séra.

- 12 CZ 283488 B6

Myší L buňky transfektované CD32 (FCyRII) (16.2CG7), byly připraveny podle Peltza: J. Immunol, 141, 1891 (1988). Tato citace je zde zahrnuta jako odkaz. Ve stručnosti - byl použit FcyRII cDNA klon, 16.2, izolovaný z lidské monocytové buněčné linie mutantu U937 (viz Stuart aspol.: J. Exp. Med. 166, 1668 (1987)). Použitím standardních způsobů místně specifické mutageneze se zkonstruuje mutant, kterému chybí cytoplazmová doména, zavedením mutací, které mění dva lysinové kodony po první aminokyselině (argininu) předpovězené cytoplazmové domény na stop kodony. Přechodná transfekce myších L buněk se provádí podle standardních způsobů.

Reakční činidla

Rekombinantní IL-10 se exprimuje v E. coli. Vyčistí se podle způsobů, popsaných ve spisech: de Waal Malefyt a spol.: J. Exp. Med. 174, 915 (1991) a WO 91/00349, viz výše.

Proliferační testy

Klonované T buňky se používají 10 až 12 dnů po stimulaci krmnými buňkami. V tomto stadiu byly klony T buněk malé a v odpočívajícím stavu. Klony T buněk (2.10⁴ buněk na jamku) byly inkubovány L buňkami, transfektovanými CD32 (2.10⁴ buněk na jamku) v přítomnosti anti-CD3 mAbs (SPV-T3b) (1 pg/ml) [Spits aspol.: Hybridoma 2, 423 (1983).] ve 200μ1 miskách s plochým dnem (Falcon, Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ,), L buňky byly předinkubovány s mAbs (1 pg/ml) 1 h v přítomnosti nebo bez přítomnosti IL-10 (100 jednotek na ml) před tím, než se přidají T buňky, a kultivovány 72 hodiny. Na L buňky se nechá působit mitomycin C (50 mg/ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) při 37 °C po dobu 45 minut a následně před použitím byly čtyřikrát promyty. Buňky se inkubují 72 hodiny při 37 °C a 5 % oxidu uhličitého, bylo na ně 4 hodiny působeno [³H]TdR a byly izolovány, jak dříve popsali Yssel a spol.: Eur. J. Immunol. 16, 1187 (1986). Tyto výsledky byly vyjádřeny jako počet impulzů za minutu zahrnutého [³H]TdR a představují střední hodnotu tří kultivací.

Účinky IL-10 na proliferaci klonů T buněk se neliší podle sestavy produkovaných T buněčných lymfokinů. Klony T buněk 837, SP-B21 a 827 po aktivaci produkují IL-2, IL-4 a IFNy a jsou tedy považovány za reprezentanty lidských ThO klonů. HY-06, CR 253, CR 378, CR 380, AP 74 a AP 75 produkují vysoké hladiny IFN-γ a nedetekovatelná nebo malá množství IL-4 a IL-5. Tyto klony jsou považovány za klony, představující lidským Thl podobné klony, zatímco NP 12 aNP 44 představují lidským Th2 podobné klony, jelikož produkují vysoké hladiny IL-4 a IL-5 a nedetekovatelná nebo nízká množství IFN-γ po aktivaci jejich specifickým antigenem. Klon T buněk SP-A3 po aktivaci produkuje IL-2, IL-5, IFN-γ a GM-CSF, ale nikoliv IL-4.

Jak bylo uvedeno v tabulce 1, IL-10 po aktivaci inhibuje proliferaci klonů T buněk 837, SP-B21, SP-A3, 827, HY-06, CR 253, CR 378, CR 380, AP 74, AP 75, NP 12 aNP 44. IL-10 tedy není schopen inhibovat proliferaci klonů T buněk, náležejících ke všem T pomocným podřadám. Obecně IL-10 inhibuje proliferaci klonů T buněk za podmínek tohoto testu z 20 až 50 %. Tato inhibice je závislá na dávce a je specifická, neboť ji lze zvrátit neutralizováním anti-IL-10 mAb 19F1.

- 13 CZ 283488 B6

Tabulka 1

Vliv IL-10 na proliferační odpovědi lidských ThO, Thl a Th2 klonů po aktivaci anti-CD3 mAbs zesíťovaných na CD32 (FcyRII) transfektovaných L buňkách
typ klonů T buněk	inkorporace [3H]TdR (počet impulzů za minutu. 10'3)
klon T buněk	kontrola	+IL-10 (100 j./ml)
T pomocné 0	837	69	51
	SP-B21	88	51
	827	5,5	3,5
	SP-A3	28	12
T pomocné 1	HY-06	11	8
	CR253	12,8	10
	CR378	14,9	4,3
	CR380	19,8	8,5
	AP74	22	9
	AP75	38	33
T pomocné 2	NP12	72	49
	NP44	15,3	7

Myší IL-10, který je specifickou částicí, nemá žádný vliv na proliferaci těchto klonů lidských T buněk. To naznačuje, že IL-10 působí přímo na klony T buněk a nikoliv na CD32 transfektované myší L buňky, použité ke zkříženému navázání anti-CD3 mAbs. Tyto výsledky ukazují, že IL-10 přímo inhibuje proliferaci lidských ThO, Thl aTh2 klonů po aktivaci TCR/CD3 komplexem anti-CD3 mAbs zesíťovaných na L buňkách transfektovaných CD32.

Příklad 2

IL-10 inhibuje proliferaci CD4+ klonů T buněk nezávisle na kostimulačních signálech, poskyto30 váných ICAM-1, LFA-3 nebo B7

Aktivaci klonů lidských T buněk lze upravit interakcí přídatných molekul na T buňkách s jejich opačnými strukturami na antigen prezentujících buňkách (APC). Ukázalo se, že interakce mezi LFA-1 alCAMl, CD2 aLFA3, CD28 aB7 nebo CTLA-4 aB7 poskytují kostimulační signály, 35 zesilující proliferaci a efektorové funkce T buněk. Pro stanovení, jestli IL-10 inhibuje proliferaci

T buněk ovlivněním kostimulační funkce těchto přídatných molekul, byly zkonstruovány L buňky, které exprimují CD32 a ICAM-1, LFA-3 nebo B7.

Konstrukce pCD-SRa-LFA-3 HYG, pCDM8-ICAM-l HYG apBJ-B7 HYG

LFA-3 cDNA byla získána z Ráji cDNA knihovny PCR amplifikací použitím LFA-3 specifických primerů. Ráji cDNA knihovna byla zkonstruována v pCD-SRa vektoru, jak to bylo popsáno dříve [Matsui a spol.: Science 154. 1788 (1991).] . Pro klonování transmembránové formy LFA3 byly použity následující primery:

sense 5'-GGCTGCAGCGACGAGCCATGGTTGCTGGGAGCGACGCG-3' (nt 1 až 30) a antisense 5'-TTCATCTTCTGGTACCAATCAATTGGAGTTGGTTC-3' (nt 780 až 745).

Pro vhodné subklonování amplifikovaných produktů byl LFA-3 sense primer navržen s Pst-I 50 místem a LFA-3 antisense primer s místem Kpn-I. Amplifiklace se provádí za následujících

- 14 CZ 283488 B6 podmínek: 1 pg plazmidové DNA, rozštěpené působením Hind-III z Ráji knihovny, se amplifikuje v 50 ml reakci, obsahující po 25 nmol každého primeru, po 125 mM dGTP, dATP, dCTP adTTP (Pharmacia, Uppsala, Švédsko), 50 nM KC1, 10 nM Tris-Hcl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl₂, 1 mg/ml želatiny a 5 jednotek Tag polymerázy (1B1, New Haven, Kt.).

Směsi se inkubují ve 20 cyklech (denaturace 30 s, 94 °C, anelace 30 s, 55 °C, prodloužení 60 s, 72 °C) přístrojem Perkin-Elmer/Cetus DNA Thermal Cycler. Odebere se 5 μΐ podíl a podrobí se druhému kolu amplifikace za stejných podmínek. Reakce se extrahuje chloroformem a nanese se na 1 % agarózový gel. Amplifikovaný produkt s očekávanou velikostí 785 párů nukleotidů se po rozdělení vyřízne z gelu, izoluje se adsorpcí na silikagelu pomocí sestavy Geneclean kit (Bio 101, La Jolla. Ka.), rozštěpí se působením Pst-1 a Kpn-1 a subklonuje se v Bluescriptu Π KS(+) (Stratagene, La Jolla, Ka.).

Standardními způsoby se izolují četné klony, obsahující LFA-3. Čtyři klony se sekvenují dideoxy-terminační metodou s použitím sestavy pro sekvenování Seguenase DNA seguencing kit (USB, Cleveland, Oh.). Všechny čtyři klony jsou ze 100% identické s publikovanou sekvencí. Izoluje se Pst-l-Kpn-1 fragment jednoho z těchto klonů a subklonuje se do pCD-SRa 296 expresního vektoru Matsui a spol., viz výše.

pCDM8-ICAM-l [Blanchard aspol.: J. Immunol. 138, 2417 (1987).] byl dar Dr. Briana Seeda (Massachusetts Generál Hospital, Boston, Ma.). Aminocyklitol-fosfotransferázový gen, který kóduje rezistenci na hygromycin-B, byl umístěn pod kontrolu promotoru SV-40 a polyadenylačních signálů a standardními způsoby vložen do míst Sfi-I pCD-SRa-LFA-3 a pCDM8-ICAM-l. Získají se tak pCD-SRa-LFA-3 HYG a pCDM8-ICAM-l HYG. pB7-B7-HYG obsahuje lidský B7 pod kontrolou SRa promotoru. Makgoba a spol.: Nátuře 331, 86 (1988). Byl získán darem od Dr. L. Laniera (DNAX Research Intitute).

L buňky, které expresí poskytují HLA-DR3 nebo CD32, byly transfektovány pCD-SRa-LFA-3HYG, pCDM8-ICAM-l-HYG nebo pBJ-B7 HYG lipofekcí (BRL, Gaithersburg, Md.) podle postupu, uvedeného výrobcem. Buňky byly štěpeny 48 h po transfekci. Bylo přidáno médium, které obsahuje 200 pg/ml Hygromycinu-B (Lilly, Indianopolis, In.), a toto médium bylo měněno každé 3 dny.

Po 12 dnech byly viditelné jednotlivé kolonie, rezistentní na hygromycin-B. Tyto buňky byly spojeny, obarveny pro expresi LFA-3, ICAM-1 nebo B7 nepřímou imunofluorescencí a čištěny dvěma po sobě následujícími koly pozitivního sortování na FACS-Star Plus. Kotransfektované buněčné linie byly uchovávány vRPMI-1640, doplněném o 200 pg/ml hygromycinu-b a 10% FCS.

Pro FACS analýzu se buňky inkubují v mikrotitrovacích deskách se dnem ve tvaru V (Flow Laboratories, McLean, Va.) s vyčištěnou mAb (10 pg/ml) 30 min při 4°C. Po dvou promytích PBS, obsahujícím 0,02 mM azidu sodného a 1 % BSA (Sigma, St. Louis, Mo.), byly buňky inkubovány s 1/40 ředění FITC označených fragmentů F(ab')2 kozí protimyší protilátky (TÁGO, lne., Burlingame, Ka.) 30 min při 4 °C. Po třech dalších promytích se vzorky označených buněk analyzují průtokovou mikrofluorimetrií (FMF) na FACScanu (Becton Dickinson, Sunnyvale, Ka.). Používá se anti-LFA-3 mAb TS 2/9, která byla popsána Krenskym a spol.: J. Immunol. 132, 2180 (1984). Byly použity anti-ICAM-1 mAb LB2 a anti-B7 mAb L307, které popsali Azuma a spol.: J. Exp. Med. 175, 353 (1992).

Klony T buněk byly aktivovány působením anti-CD3 nebo anti-CD2 mAbs, zesíťovaných na L buňkách koexprimujících CD32 a ICAM-1, LFA-3 nebo B7 v nepřítomnosti nebo v přítomnosti IL-10. Bylo zjištěno, že proliferace klonů T buněk SP-B21 aNP 12 byla zesílena, když byly klony stimulovány anti-CD3 mAbs, prezentovanými CD32 transfektovanými L buňkami, které

- 15CZ 283488 B6 koexprimovaly ICAM-1 aLFA-3. Koexprese LFA-3 byla účinnější při zvyšování proliferace klonů T buněk ve srovnání s ICAM-1 nebo B7 a vedla stabilně ke 2 až 4násobnému zvýšení proliferace. Při koexpresi ICAM-1 bylo pozorováno pouze mírné zvýšení proliferace. B7 obvykle neovlivňuje proliferaci klonů T buněk.

IL-10 inhiboval proliferační odpovědi klonů T buněk po aktivaci anti-CD3 mAbs, zesíťovaných na L buňkách transfektovaných CD32 i v přítomnosti ICAM-1, LFA-3 a B7. Avšak inhibice působením IL-10 proliferace klonů T buněk aktivovaných CD32 buňkami, exprimujícími LFA-3, byla méně významná.

Proliferace klonů T buněk by mohla být indukována také mitogenní kombinací anti-CD2 mAbs, zesíťovaných na L CD32 buňkách pro klony T buněk SP-B21 aNP-12. Klony T buněk (2.10⁴ buněk na jamku) byly stimulovány anti-CD2 mAbs XI1-1 (0,5 mg/ml) a D66 (0,5 mg/ml) ve 200 μΐ miskách s kulatým dnem (Linbro, Flow Laboratories, Mc. Lean, Va.), jak shora popsáno. Produkce těchto protilátek je popsána Brottierem: J. Immunol. 135. 1624 (1985).

Proliferace T buněk nebyla ovlivněna, jestliže se koexprimuje ICAM-1 nebo LFA-3. Bylo však pozorováno mírné zvýšení proliferace, jestliže se použijí L buňky, koexprimující CD32 a B7. Proliferace klonů T buněk, indukovaná anti-CD2, byla inhibována z 30 až 50 % také v přítomnosti IL-10, jestliže byly použity L buňky, exprimující CD32 a ICAM-1, LFA-3 nebo B7. IL-10 neovlivnil expresi LFA-1, CD2 nebo CD28 klony T buněk. Souhrnně tyto výsledky ukazují na to, že přímé inhibiční vlivy IL-10 na proliferaci T buněk nebyly důsledkem změn kostimulačních signálů, poskytovaných ICAM-1, LFA-3 nebo B7.

Příklad 3

IL-2 může změnit inhibici proliferace T buněk, indukovanou IL-10

Pro stanovení, jestli by IL-2 mohl změnit inhibici proliferace T buněk, indukovanou IL-10, byly klony T buněk aktivovány anti-CD3 nebo anti-CD2 mAbs, zesíťovánými na L buňkách exprimujících CD32 a ICAM-1, LFA-3 nebo B7 v přítomnosti IL-2. IL-2 se přidá v množství 20 j./ml.

Bylo zjištěno, že přidání IL-2 v nízkých koncentracích by mohlo úplně převrátit inhibiční účinky IL-10 na proliferaci klonů T buněk SP-B21 a NP-12. Kultivování klonů T buněk po dobu až 72 h v přítomnosti IL-10 nevede ke snížení regulace exprese IL-2 receptoru a nebo β řetězce. Navíc, aktivace klonů T buněk PHA v přítomnosti IL-10 neměla žádný efekt na indukci exprese IL-2 receptoru a a β řetězce. Byla použita anti-IL-2Ra mAb 810, popsaná Hervem a spol.: Blood 75. 1017 (1990). Byla použita také anti-IL-2RP mAb Tu 27, popsaná Takeshitou: J. Exp. Med. 169, 1323 (1989). Souhrnně tyto výsledky ukazují, že inhibice proliferace T buněk IL-10 by mohla být převrácena účinkem IL-2.

Příklad 4

IL-10 inhibuje produkci IL-2, ale nikoliv IL-4, IL-5, IFN-γ a GM-CSF klony lidských T buněk

Pro stanovení, jestli přímý inhibiční efekt IL-10 na proliferaci klonů T buněk existuje díky inhibici produkce IL-2, byly klony T buněk 837, SP-B21, 827, HY-06, CR 253, NP 12 aNP 44 aktivovány anti-CD3 mAbs, zesíťovanými na L buňkách transfektovaných CD32 a ICAM-1, LFA-3 nebo B7 v nepřítomnosti nebo v přítomnosti IL-10 po dobu 24 hodin. Produkce IL-2, IL4, IL-5, IFN-γ a GM-CSF byla měřena testem ELISA, specifickým pro cytokin. Citlivost těchto

-16CZ 283488 B6 testů ELISA byla: IL-2: 10 pg/ml, IL-4: 50 pg/ml, IL-5: 50 pg/ml, IFN-γ: 300 pg/ml aGM-CSF: 50 pg/ml.

Klony T buněk byly izolovány na testy produkce lymfokinů 10 až 12 dnů po stimulaci krmnými buňkami, jak shora popsáno. Buňky byly inkubovány 24 h při 37 °C ve zvlhčené atmosféře s 5 % oxidu uhličitého, kultivační supematanty byly izolovány, odstřeďovány při 250 x G, rozděleny na jednotlivé podíly a před testováním skladovány při -20 °C.

Aktivace klonů T buněk vedla k produkci IL-2, IL-4, IL-5, GM-CSF a IFN-γ podle jejich odpovídajících profilů produkce Th buněčné podřady cytokinů. Obecně byly naměřeny nejvyšší hodnoty produkce cytokinů tehdy, když klony T buněk byly aktivovány L buňkami, exprimujícími CD32 aLFA-3 nebo B7. Ve skutečnosti byla produkce IL-2 detekována převážně v supematantech klonů T buněk, aktivovaných anti-CD3 na L CD32-LFA-3 a L CD32-B7 transfektantech. IL-10 silně inhibuje produkci IL-2 klony T buněk. Produkce IL-4 nebyla ovlivněna IL-10, zatímco produkce IL-5, GM-CSF a IFN-γ byla IL-10 pouze nepatrně inhibována. IL-10 tedy specificky inhibuje produkci IL-2 aktivovanými klony lidských T buněk.

Příklad 5

IL-10 inhibuje produkci IL-2 klony lidských T buněk po polyklonální aktivaci

Pro zjištění, jestli je IL-10 schopen přímo působit na klony lidských T buněk při inhibici produkce lymfokinů, byly klony T buněk 827, SP-B21 aNP 44 aktivovány acetátem tetradekanoylforbolu (TPA) (Calbiochem), anti-CD3 mAbs a TPA, PHA a TPA, nebo mitogenní kombinací anti-CD2 mAbs v nepřítomnosti přídatných buněk. Klony T buněk byly stimulovány při koncentracích 1.10⁶ buněk/ml, PHA (100 ng/ml), antiCD3 mAb SPV-T3b (1 pg/ml) a TPA (1 ng/ml).

Jak je ukázáno v tabulce 2, polyklonální aktivace klonů T buněk 827, SP-B21 aNP 44 vede k vysokým hladinám produkce lymfokinů podle jejich profilů produkce lymfokinů. IL-10 silně inhibuje produkci IL-2 těmito klony ve všech testovaných způsobech aktivace, zatímco produkce IL-4, IL-5, IFN-γ aGM-CSF není ovlivněna. IL-10 byl schopen inhibovat produkci IL-2 těmito klony T buněk po aktivaci antiCD3 + TPA a následně Ca⁺⁺ ionoforem + TPA, což naznačuje, že mechanismus inhibice nezahrnuje cesty transdukce signálu T buněčný receptor/CD3 a že tento mechanismus působí po směru aktivace proteinové kinázy C.

- 17CZ 283488 B6

Tabulka 2

Vliv IL-10 na produkci lymfokinů klony T buněk 827, HY-06 aNP44 po aktivaci anti-CD3 mAbs a TPA, PHA a TPA nebo ConA

klon T buněk	stimul	produkce lymfokinů (ng/ml)
IL-2	+	IL-4	+	IL-5	+
827	médium	ND	ND	ND	ND	ND	ND
	CD3+TPA	10,6	4J	6,1	6,4	2,4	2,9
	PHA+TPA	17,8	12	5,1	4,0	0,8	0,6
	ConA	3,4	JL4	2,3	2,4	ND	ND
HY-06	médium	ND	ND	ND	ND	ND	ND
	CD3+TPA	1,3	02	ND	ND	ND	ND
	PHA+TPA	5,0	22	ND	ND	ND	ND
	ConA	5,1	02	ND	ND	ND	ND
NP44	médium	ND	ND	ND	ND	ND	ND
	CD3+TPA	0,5	ND	18,6	19,6	6,3	5,9
	PHA+TPA	1,3	OJ	35,4	33,5	8,4	7,9
	ConA	0,3	ND	20,1	18,7	7,8	7,3

Tabulka 2 - pokračování klon

T buněk	stimul	produkce lymfokinů (ng/ml)
+	IFN-γ	GM-CSF	+
827	médium	ND	ND	ND	ND
	CD3+TPA	26,9	21,0	15,4	15,2
	PHA+TPA	32,8	39,3	14,3	15,5
	ConA	32,6	33,7	14,0	15,2
HY-06	médium	ND	ND	ND	ND
	CD3+TPA	23,9	25,5	10,0	13,2
	PHA+TPA	17,6	19,9	16,4	13,1
	ConA	12,8	14,9	14,2	13,3
NP44	médium	ND	ND	ND	ND
	CD3+TPA	1,5	1,1	9,1	8,8
	PHA+TPA	1,4	1,6	13,1	14,6
	ConA	2,6	2,6	18,9	18,9

Klony T buněk (10⁶ buněk/ml) byly aktivovány anti-CD3 mAbs (0,5 pg/ml) a TPA (1 ng/ml), PHA (200 ng/ml) a TPA nebo ConA (10 pg/ml) bez přítomnosti nebo v přítomnosti IL-10 (100j./ml) 24 hodin. Produkce IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ aGM-CSF byla stanovena testy ELISA, specifickými na cytokiny.

ND: znamená nedetekováno (méně než citlivost příslušné ELISy)

- 18CZ 283488 B6

Příklad 6

IL-10 inhibuje IL-2 produkci klony lidských T buněk na úrovni mRNA

Pro stanovení toho, na jaké úrovni IL-10 inhibuje produkci IL-2, byla Northemovými bloty analyzována exprese IL-2, IL-4, IL-5 aIFN-γ mRNA v klonech T buněk NP-12, HY-06, 827, SP-A3, 837 a SP-B21 po aktivaci anti-CD3 mAbs aTPA bez přítomnosti nebo v přítomnosti IL10. Celková RNA byla izolována způsobem podle Chirgwina a spol.: Biochem. 18, 5294 (1979). Northemovy analýzy byly prováděny podle de Waal Malefyta: J. Immunol. 142, 3634 (1989).

Pro Northemovy analýzy byly použity následující sondy: Pstl Xbal fragment (nt 1 až 285) o 285 párech nukleotidů zpCD-hIL-2, který popsali Yokota a spol.: In Lymphokines 13 (1987), NhelEcoRI fragment (nt 106 až 424) o 318 párech nukleotidů zpCD-hIL-4, který popsali Yokota a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83, 5894 (1986), Pstl-HincII fragment (nt 5 až 1106) o 1100 párech nukleotidů, který popsal Yokota: viz výše, a Pstl fragment o 1200 párech nukleotidů z pAl, který popsali de Waal Malefyt a spol: J. Immunol. 145,2297 (1990).

IL-10 silně inhibuje množství IL-2 mRNA, exprimované v těchto klonech, ale neovlivňuje expresi IL-4 aIL-5 ThO- a Th2-podobnými klony nebo expresi IFN-γ ThO- a Thl-podobnými klony. Tyto výsledky ukazují, že IL-10 specificky inhibuje produkci IL-2 klony lidských T buněk na úrovni mRNA.

Příklad 7

IL-10 inhibuje produkci IL-2 T buňkami, izolovanými z periferních krevních buněk

V tomto příkladu bylo určováno, jestli IL-10 může inhibovat proliferaci a produkci IL-2 odpočívajícími T buňkami. T buňky byly izolovány z periferní krve a aktivovány anti-CD3 nebo anti-CD2 mAbs, zesíťovanými na CD32 transfektovaných L buňkách samotných, nebo CD32 L buňkách, které koexprimují ICAM-1, LFA-3 nebo B7. Z potahů sražených leukocytů zdravých dárců se odstřeďováním přes Ficoll-Hypaque (Sigma Diagnostics, St. Louis, Mo,) hustotní gradient podle Boyuma A,: Scan, J, Clin, Lab, Invest, 21 (Suppl, 97), 77 (1968) izoluje PBMNC.

T buňky se vyčistí z PBMNC ulpěním na umělé hmotě, pasážováním kolonou s nylovou vlnou a negativní selekcí magnetickou deplecí. Ve stručnosti - 100.10⁶ PBMNC se kultivuje 30 minut při 37 °C ve 100 mm misce pro tkáňové kultury (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ.) v Ysselově médiu, doplněném 1 % lidského AB séra. Neulpěné buňky se odstraní a pasážují se kolonou s nylovou vlnou (Robbins Scientific, Sunnyvale, Ka.) [Julius a spol.: Eur. J. Immunol. 3, 645 (1973)]. Buňky se pak inkubují s nasycenými koncentracemi anti-CD14 (Leu M3), CD16 (Leu 11a), CD19 (Leu 12) aCD56 (Leu 19) mAbs 30 minut při 4 °C, promyjí a inkubují s magnetickými perličkami, potaženými ovčím protimyším IgG (Dynabeads M450, Dynal A. S., Oslo, Norsko) při poměru perliček k buňkám 40:1.

Tato směs se inkubuje s mírným třepáním 30 minut při 4 °C. Buňky ve tvaru růžice se odstraní magnetickým koncentrátorem částic podle doporučení výrobce. Populace T buněk byly 97 až 99% CD2⁺, CD3Í Anti-CD14 (Leu-M3), CD16 (Leu 11a), CD19 (Leu 12) aCD56 (Leu 19) mAbs a kontrolní mAbs příslušných isotypů byly získány od Becton Dickinson, Mountain View, Ka.

PBMNC T buňky (2.10⁵ buněk/jamku) byly stimulovány anti-CD3 nebo anti-CD2 mAbs, zesíťovanými na LFcyRII buněčných transfektantech, jak shora popsáno. Po 24 h inkubace při 37 °C se izolují kultivační supematanty.

- 19CZ 283488 B6

Bylo zjištěno, že odpočívající T buňky byly úplně závislé na přítomnosti antigenu B7 na CD32 L buňkách pro aktivaci. Jak anti-CD3, tak anti-CD2 mAbs, zesíťované na CD32 L buňkách, byly neúčinné při indukování proliferace T buněk a produkce lymfokinú. Navíc, tyto buňky zůstávaly neúčinné po kotransfekci ICAM-1 nebo LFA-3 do těchto buněk. Avšak anti-CD2 nebo anti-CD3 mAbs, zesíťované do CD32 L buněk, které byly kotransfektovány B7, indukovaly silnou proliferaci T buněk a vysoká množství produkce IL-2, IFN-γ aGM-CSF. IL-10 za těchto podmínek významně neinhiboval proliferaci odpočívajících T buněk. Naproti tomu IL-10 inhiboval produkci IL-2, ale nikoliv produkci IFN-γ a GM-CSF těmito buňkami.

Množství IL-2, produkovaného v přítomnosti IL-10, však bylo ještě dostatečné pro indukování maximální proliferace v okamžiku testu (3. den). Souhrnně tyto výsledky ukazují, že angažování CD28 nebo CTLA-4 na T buňkách interakcí s B7 na přídatné buňce bylo absolutně nutné pro indukci proliferace a produkci lymfokinú odpočívajícími T buňkami, a že IL-10 byl za těchto podmínek stále ještě schopný inhibovat produkci IL-2.

Příklad 8

IL-10 inhibuje antigenově specifickou proliferaci T buněk, jestliže se jako APC použijí myší L buňky, transfektované lidskými HLA molekulami

Byly zkoumány účinky IL-10 na antigenově specifickou proliferaci na toxin tetanu (TT) specifického klonu T buněk 827 aM. Leprae 65 kD hsp pt [2-12] specifického klonu T buněk HY-06, jestliže byly jako buňky, prezentující antigen, použity myší L buňky, transfektované HLA-DR3 nebo HLA-DR3 aICAM-1, LFA-3 nebo B7, jak shora popsáno. FACS profily exprese HLA-DR, ICAM-1, LFA-3 aB7 transfektanty L buněk ukázaly, že IL-10 neměl žádný vliv na konstitutivní expresi skupiny Π MHC těchto buněk.

Toxin tetanu byl poskytnut Dr. B. Bizzinim (Institute Pasteur, Paříž, Francie) a použit v konečné koncentraci 1 gg na ml, Hsp pt [2-12] byl připraven způsobem syntézy peptidů v pevné fázi a zkontrolován analytickou HPLC na obrácených fázích a aminokyselinovou analýzou. Peptidy byly používány v konečné koncentraci 0,5 pg/ml.

Stimulace klonů T buněk 827 a HY-06, analýzy proliferace a měření cytokinů byly prováděny, jak shora popsáno. Bylo zjištěno, že IL-10 inhibuje antigenově specifickou proliferaci HY-06 a 827 L buňkami, transfektovanými HLA-DR3 jako antigen prezentujícími buňkami (APC) v závislosti na dávce. IL-10, přidaný v množství 10 j./ml, měl inhibiční aktivitu a při 100 j./ml a 500 j./ml byla získána až 30 až 50% inhibice proliferace.

Tyto výsledky byly potvrzeny, jestliže byly jako APC použity L buňky, transfektované HLA-DR a ICAM-1, LFA3 nebo B7. Proliferační odpovědi klonů T buněk 827 a HY-06 byly zvýšeny, jestliže se použily L buňky, kotransfektované LFA3, a inhibiční účinek IL-10 byl méně významný. Inhibice proliferačních odpovědí 827 a HY-06 působením IL-10 byly úplně převráceny neutralizováním anti-IL-10 mAb 19F1, což ukazuje na specifičnost inhibice. Tyto výsledky ukázaly, že IL-10 inhiboval antigenově specifické proliferační odpovědi 827 a HY-06, jestliže se jako APC použijí HLA-DR transfektované myší L buňky.

Bylo zjištěno, že inhibice antigenově specifické proliferace působením IL-10 existuje na úrovni T buněk. Aby se toto potvrdilo, byly klony T buněk 827 a HY-06 aktivovány TT a pt [2-12] v přítomnosti lidského nebo myšího IL-10. Tím se zkoumalo, jestli IL-10 působil na antigen prezentující L buňky nebo přímo na klony T buněk. Jak bylo shora diskutováno, lidský IL-10 je účinný na lidské i myší buňky, ale myší IL-10 je účinný pouze na myší buňky.

-20CZ 283488 B6

Bylo zjištěno, že myší IL-10 nebyl schopen inhibovat antigenově specifickou proliferaci 827 a HY-06, jestliže se jako APC použijí L buňky transfektované HLA-DR nebo kotransfektované ICAM-1, LFA3 nebo B7. Tyto výsledky ukazují, že IL-10 měl přímý vliv na proliferaci klonů lidských T buněk.

Klony T buněk 827 a HY-06 byly aktivovány TT nebo pt [2-12] sL buňkami, exprimujícími HLA-DR nebo v kombinaci s ICAM-1, LFA3 nebo B7 v přítomnosti nebo bez přítomnosti IL-10 aIL-2, aby se sledovalo, jestli přidání exogenního IL-2 změní inhibiční účinky IL-10. Nízké koncentrace IL-2 by mohly převrátit inhibiční účinky IL-10 na antigenově specifickou proliferaci klonů T buněk 827 a HY-06.

Klon T buněk HY-06 byl aktivován pt [2-12] s L buňkami, exprimujícími HLA-DR3 samotný nebo v kombinaci s ICAM-1, LFA3 nebo B7 v přítomnosti nebo bez přítomnosti IL-10. Produkce IL-2 a IFN-γ byla stanovena v kultuře supematantů, izolovaných po 24 hodinách. IL-10 inhiboval produkci IL-2, ale nikoliv IFN-γ klonem T buněk HY-06 po antigenově specifické aktivaci. Souhrnně tyto výsledky ukazují, že IL-10 inhiboval antigenově specifickou proliferaci T buněk specifickou inhibici produkce IL-2.

Zánětlivé vnitřní onemocnění

Byl vyvinut myší model IBD. Tento model přispívá k objasnění etiologie nebo mechanismu IBD. Je také experimentálním podkladem pro různá terapeutická činidla. Pro vývoj tohoto modelu se gen IL-10 buď odstraní, nebo se způsobí to, že je v pokusném zvířeti neúčinný nebo neexpresovatelný. O tomto zvířeti se pak jedná jako zvířeti, které má gen IL-10 ochromený, nebo jako o knockoutovaném zvířeti (KO). KO lze dosáhnout několika různými způsoby, známými odborníkům.

Lze například získat transgenního živočicha, jehož gen IL-10 má být inaktivován. Viz Goodnow C.: Transgenic Animals, 1502 až 1504, Encyclopedia of Immunology. Roitt (red.), Academie Press, San Diego (1992). Ve stručnosti - vyčištěná DNA se podá mikroinjekcí do pronuklea oplodněných oocytů. Potom se oocyty chirurgicky implantují do vejcovodu zvířete, použitého jako pěstounka. Pro izolaci homozygotního mutovaného zvířecího kmene lze použít také standardní způsoby genetického křížení.

Také existují způsoby, které inaktivují specifické geny v zárodečné linii myší. V tomto případě se do místa genu přírodního typu homologní rekombinací zavede mutovaný transgen. Linie embryonálních kmenových (ES) buněk se mohou izolovat a kultivovat in vitro z myších blastocystů a později reimplantovat do jiného blastocystu tak, aby částečně kolonizovaly jak somatické tkáně, tak tkáně zárodečné linie výsledné myši (Goodnow na str. 1503).

Do ES buněk v kultuře se zavede DNA. Blastocysty se chirurgicky implantují do pěstounky. Výsledkem je heterozygotní mutantní předek, který se navzájem zkříží, takže nakonec má potomek dvě mutované alely, např. se získá homozygotní mutant. Tito potomci by neměli mít žádné funkční alely genu, o který se jedná, a měly by umožňovat genetické vyříznutí, aby se odstranily specifické geny. Analýza výsledného potomka může poskytnout pohled na roli cílového genu v KO myši při získávání výsledných fenotypů.

Pro další způsoby tvoření experimentálních zvířat s delecemi příslušného genu viz McMahon aspol.: The Midbrain-Hindbrain Phenotype of Wnt-1-/Wnt-1-Mice Results from Stepwise Depletion of engrailed-Expressing Cells by 9.5 Days Postcoitum, Cell 69, 581 (1992), aTravis Scoring a Technical Knockout in Mice, Science 256, 1392 (1992). Další aplikovatelné způsoby v odborné literatuře zahrnují způsoby mutageneze aantisenze technologie. Viz shora Goodnow

-21 CZ 283488 B6

C. (1992).

Příklad 9

Myší model pro zánětlivé vnitřní onemocnění

Byly získány myši, které byly zbaveny genu IL-10. Viz Kuhn a spol.: Science 254, 7097 (1991); Capecchi: Science 244, 1288 (1989); Robertson (red.): Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A Practical Approach. I. R.L. Press. Oxford 1987, aZijestra a spol.: Nátuře 336, 348 (1989) pro popisy obecného způsobu a postupů získání myší, zbavených zvoleného genu. Na myši, kterým chybí gen IL-10, se zde odkazuje jako na IL-10T myši, nebo jako na knockoutované (KO) myši.

První skupina: Čtyři myši byly utraceny kvůli analýze kostní dřeně. Část jejich dřeně byla analyzována, aby se stanovila jejich schopnost produkovat myeloidní a erytroidní předky (viz tabulka 3) a aby byla posouzena produkce kmenových buněk (viz tabulka 4). Zbývající část dřeně byla použita pro dlouhodobou kultivaci kostní dřeně, aby se posoudila schopnost buněk z nejbližšího okolí podporovat normální hematopoézní generaci. Brzlík a slezina obsahovaly normální počty T-buněk a normální počty B-buněk. Analýzy krátkodobého předka a kmenových buněk jsou uvedeny níže v tabulámí formě. Buňky z kontrol a z KO myší byly spojeny odděleně.

Tabulka 3

Počet kolonii tvořících buněk/stehenní kost

celkový počet buněk/ /stehenní kost	GM	BFU-e	CFU-e	Meg	Meg/Mix
kontrola: 9,5.106	18 430	475	42 500	2 470	285
IL-20T: 9,4.106	21 902	940	59 740	2 271	658

GM znamená granulocyty a makrofágy,

BFU znamená krev tvořící jednotky,

CFU znamená jednotky, tvořící kolonii,

-e znamená erytroid,

Meg znamená megakaryocytové kolonie,

Meg/Mix znamená megakaryocyty, smíchané s jinými liniemi.

Faktory stimulující kolonie, použité v testu: IL-3 + IL-6 + erytropoetin (Epo)

Tabulka 4

Počet CFU-S 14. den kontrolní skupina: 1 678 na stehenní kost

IL-10T skupina: 1 517 na stehenní kost

Produkce kmenových buněk znamená počet CFU-S ve stehenní kosti myši. CFU-S je mírou tvorby hemopoézních uzlíků ve slezině smrtelně ozářených myší po transplantaci. Viz Till a spol.: Radiation Research 14, 213 (1961).

-22CZ 283488 B6

IL-10T myši nevykazovaly žádný zřejmý defekt při produkci myeloidních, erytroidních a kmenových buněk. Současně dlouhodobé kultury vytvořily vrstvu podpůrné vazivové tkáně ve všech kulturách včetně kultur zIL-ΙΟΤ myší. Tyto kultury byly uspořádány do dvou stupňů: První stupeň: buňky byly kultivovány tak, aby vytvořily komplexní vrstvy podpůrné vazivové tkáně, potřebné k podpoře kontinuální krvetvorby. Tyto kultury byly pak přeočkovány dalšími buňkami kostní dřeně z ekvivalentních typů donorů, takže poskytly skutečné prekurzory, které asociují s buňkami podpůrné vazivové tkáně. Tento druhý stupeň byl proveden po tom, co byla dostupná druhá a třetí skupina myší.

Druhá a třetí skupina: Buňky kostní dřeně těchto zvířat byly potřeba pro dokončení dlouhodobých pokusů kultivace kostní dřeně. Vedle použití jejich kostní dřeně pro tyto účely byly provedeny další procedury (viz tabulky 5 až 9). IL-10T zvířata byla anemická, ale zdálo se, že mají normální hladiny prekurzorů kostní dřeně. Proto byla vyhodnocena jejich anemie a jejich orgány byly zkoumány histologicky.

Tabulka 5

Počty v periferní krvi

myši		WBC/ml .106	RBC/ml .106	destiček/ml .10*
kontrola	č. 1	7,2	7,3	12,6
	č.2	11,2	5,6	10,7
	č.3	10,0	6,7	8,5
	č. 4	8,2	5,6	9,8
	č. 5	7,7	5,6	8,0
IL-10T	č. 1	4,0	2,4	20,6
	č.2	4,8	7,1	8,0
	č.3	7,5	3,9	27,3
	č. 4	6,5	5,5	23,9

WBC znamená bílé krvinky, RBC znamená červené krvinky.

Tabulka 6

Diferenciály periferní krve

myši	% lymf.	% neut.	% mono.	% eos.	% retik.
kontrola č. 1	87	12	1	0	2,4
č.2	72	26	2	0	1,2
č.3	80	18	1	1	0,6
IL-10T č. 1	36	64	0	1	3,8
č.2	40	57	0	3	5,3
č.3	23	77	0	0	17,1

lymf. znamená lymfocyty, neut. znamená neutrofily, mono, znamená monocyty, eos. znamená eosinofily, retik. znamená retikulocyty.

-23 CZ 283488 B6

RBC morfologie: Všechna kontrolní zvířata měla normální vzhled červených krvinek (RBC). IL-10T myši vykazovaly proměnlivé morfologie. IL-10T č. 1 měly mikrocytické buňky, č. 2 ač. 3 měly mikrocytické buňky plus nějaké makrocytické, polychromní buňky a případně nukleované červené krvinky (NRBC). Nátěry červených krvinek byly obarveny novou methylenovou modří. Byly spočteny buňky, vykazující ribosomové zabarvení. Pozitivní zabarvení se vyskytuje u velmi mladých červených krvinek (retikulocytů) a zahrnuje prematurované uvolnění z hemopoézních orgánů. Tento počet se označuje jako počet retikulocytů.

Histologie orgánů IL-10T myší: Podle prohlídky částí srdce, plic, ledvin a brzlíku se zdá, že vše je normální. Játra se zdají být normální až na nahodilá ložiska jednojademých a neutrofilních granulocytů. Sleziny byly makroskopicky abnormální. Byly přítomny folikuly, ale oblast červené dřeně byla vyplněna hematopoézními buňkami, většinou NRBC ablastocyty (nematurované buňky). Bylo nalezeno několik nebo nebyla nalezena žádná RBC a nebylo zjištěno ukládání železa v makrofágách.

Tabulka 7

Diferenciály buněk sleziny

myši	(% z celkového množství buněk)
buňky/ slezina	lymf.	buňky/ mono.	neu.	eos.	plazma	blast.	nuk. RBC
kontrola
č. 1	1,5.10*	88	2	1	<1	<1	1	6
č. 2	1,5.10*	89	1	<1	<1	<1	2	7
č.3	1,1.10*	79	3	4	1	2	2	8
IL-10T
č. 1	2,1.10*	64	2	7	1	1	2	22
č.2	2,5.10*	54	2	13	3	1	6	21
č.3	1,6.10*	43	2	10	1	1	10	32

lymf. znamená lymfocyty, mono, znamená monocyty, neu. znamená neutrofily, eos. znamená eosinofrly, blast. znamená blastocyt, nuk.RBC znamená nukleované červené krvinky.

Tabulka 8

Diferenciály kostní dřeně

myši	(% z celkového množství)
neu.	neu. MB	eos.	eos. MB	nuk. RBC	plazma buňky	lym.	blast. nedif.
kontrola
č. 1	46	12	10	4	20	<1	4	4
č.2	39	9	5	3	37	<1	5	2
č.3	35	10	12	4	29	<1	6	2
IL-10T
č. 1	46	12	7	2	28	<1	2	2
č.2	56	19	4	1	18	<1	1	1
č.3	53	14	2	1	27	1	1	1

-24CZ 283488 B6 neu. MB znamená neutrofilní myeloblast, eos. MB znamená eosinofilní myeloblast, nuk. RBC znamená nukleovaná RBC, blast nedif. znamená primitivní nediferencovaný blastocyt, lym. znamená lymfocyty.

Následující data jsou výsledky analýz tvorby kolonií. Tyto analýzy byly dělány s buňkami sleziny a také s buňkami kostní dřeně. Pro stimulování buněk, tvořících kolonie, byly použity IL-3 + c-kit ligand místo IL-3 + IL-6. Kombinace IL-3 + c-kit ligand je při stimulování erytroidních prekurzorů účinnější, jak je vidět ze srovnání počtů BFU-e, získaných při první analýze (shora) s počty BFU-e, získanými v následujících analýzách.

Tabulka 9

Testy tvorby kolonií

myš	GM	GEM	GEMM slezina	BFU-e (kolonie/slez	CFU-e ina)	MEG	MEG/MIX
Cl	18 535	618	309	9 268	42 322	618	1 236
C2	7 736	893	595	2 678	44 926	1 488	893
C3	8 670	650	650	7 152	71 741	433	433
K1	55 020	8 400	3 360	51 660	393 120	2 100	6 300
K2	111 060	25 746	10 601	96 925	498 762	14 135	12 116
K3	68 274	20 096	9 890	103 050	1 012 633	14 357	9 252

kostní dřeň (kolonie/stehenní kost)

Cl	37 300	3 632	838	7 963	35 065	978	419
C2	49 159	2 552	510	5 954	81 478	680	1 021
C3	30 343	1 916	639	6 069	24 754	958	958
K1	63 440	1 823	1 641	8 750	58 336	1 276	1 276
K2	37 340	6 570	438	8 870	47 085	986	1 424
K3	35 432	4 006	1 753	14 273	52 208	1 628	4 132

Cl, C2 a C3 se týkají stejných kontrolních myší, také označovaných kontrola č. 1, č. 2 a č. 3

ΚΙ, K2 a K3 se týkají stejných myší, označovaných také IL-10T č. 1, č. 2 a č. 3

GM znamená granulocyt, makrofág,

GEM znamená granulocyt, erytroid, makrofág,

GEMM znamená granulocyt, erytroid, makrofág, megakaryocyt.

Tabulka 10

Testy krve ve výkalech

myš		l.den	2.den
kontrola	č. 1	neg	neg
	č. 2	neg	neg
	č. 3	žádný vzorek	neg
IL-10T	č. 1	neg	neg
	č. 2	poz	poz
	č. 3	poz	poz

-25 CZ 283488 B6

Vyšetření výkalů

Studie výkalů IL-10T myší neodhalily přítomnost vajíček, která by ukazovala na infekci parazity. Neexistuje žádný průkaz přítomnosti maturovaných parazitů v tenkém nebo tlustém střevě.

Zvířata byla mírně až značně anemická. Anemii není možné vysvětlit neschopností generovat erytrocyty. IL-10T myši vykazují znaky snahy vyrovnat se s anemii. Za prvé, produkovaly ve svých slezinách větší než normální počet prekurzorů RBC. U myší se slezina normálně snaží kompenzovat deficity RBC. Myší sleziny byly dvakrát větší než u normálních zvířat a vykazovaly nadměrnou aktivitu při snaze generovat RBC.

Některé z myší byly kompenzovány dobře. Vykazovaly téměř normální počet RBC v krvi a neměly uvolněno mnoho nematurovaných buněk v oběhu, protože počet jejich retikulocytů byl relativně normální. Jiné myši však byly mimo normální hodnoty a do oběhu pouštěly nematurované buňky, což je důvodem pro to, proč měly tak vysoký počet retikulocytů (tj. 17 %). V oběhu cirkulovalo také několik nukleovaných RBC.

Tyto myši měly také vyšší než normální počet destiček a zvýšený počet megakaryocytů ve svých slezinách. To byl znak toho, že mohou krvácet. Ztrátou krve lze vysvětlit chronickou anemii s vyčerpáním zásob železa (tento deficit železa byl zřejmý jak v kompartmentech sleziny, tak v kostní dřeni). Po pitvě bylo jasné, že neměly žádné vnitřní krvácení. Avšak většina z IL-10T myší měla krev ve svých výkalech a vykazovala také prolapsus konečníku. Myši byly podrobně vyšetřeny a bylo zjištěno, že jsou negativní na roup dětský, na tasemnici nebo jiné parazitární infekce. Existovala přímá korelace mezi pozitivním nálezem krve ve výkalech a prudkostí jejich anemie.

Vedle anemie a problému s krvácením měly IL-10T myši v krvi více neutrofilních granulocytů než lymfocytů. To je opak toho, co je u myší normálním stavem. Viz diferenciál periferní krve (tabulka 6). Toto pozorování je v souladu také s obrovským zvýšením myeloidních prekurzorů, zjištěných v testech tvorby kolonií ve slezině (tabulka 9). Myši tedy trpěly příznakem anemie z chronického zánětu.

Při pitvě byly zkoumány sekce tkání, připravené zIL-ΙΟΤ myší a kontrolních myší ze stejného hnízda. Všechny vzorky kontrol se zdály být normální. Pokud jde o IL-10T myši, tkáň brzlíku a páteře byla normální. Slezina vykazovala mírné až značné zvýšení erytroblastů a myeloblastů plus megakaryocytů. Soustava RBC byla malá nebo v podstatě neexistovala. Obarvení pruskou modří ukázalo vyčerpání zásob železa. To byl průkaz zvýšené extramedulámí hematopoézy.

Vyčerpání zásob železa je v souhlasu se ztrátou krve a vede k abnormální erytropoéze. Při makroskopickém zkoumání vykazovaly sleziny 1,5 až 3krát větší velikost než normálně. Mezenterické lymfatické uzliny byly velmi veliké při srovnání s normálními a byly téměř tak veliké jako normální slezina. Podobně byly zvětšeny folikuly B a T-buněk. Tento obraz je v souladu se zánětlivou odpovědí.

Tenké střevo mělo dobře vytvořenou mukózu a submukózu. V některých sekcích byl počet polymorfonukleovaných bílých buněk (PMN) a jednojademých buněk mírně zvýšen. Tlusté střevo a konečník vykazovaly znatelný zánět konečníku od přibližně dolní části tračníku. Je zřejmé značné množství edému a infiltrujících buněk. Převládajícím typem buněk byly PMN, ale byly přítomny eosinofily, lymfocyty, plazmové buňky a epiteloidní buňky (buňky, které připomínají epitel). Zánět zasáhl mukózu, krypty a submukózu. Příležitostně se infíltráty nalézaly ve svalové vrstvě, zvláště ve vnitřní oblasti svěrače. Na mnoha plochách byl ztracen nebo nebyl přítomen epitel. Více poranění vykazoval fibrózní materiál s agregovanými RBC a PMN. Některé krevní cévy byly ucpány RBC. Shluky epitelových buněk předpokládají časnou tvorbu granulomu, ale

-26CZ 283488 B6 nebyly zřejmé dobře vytvořené granulomy. Nebyl zde žádný průkaz parazitů, vajíček nebo intracelulámích bakterií, které by mohly způsobit chronický zánět. Násobná poranění a hemoragie byly v souladu s pozitivním výsledkem testu na skrytou krev ve výkalech. Celkový obraz byl v souladu s IBD, s druhou anemií a chřadnutím.

Příklad 10

IL-10 KO myši odpovídají na léčení exogenním IL-10

Byly zkoumány čtyři myši, které byly zbaveny IL-10 genu (IL-10 ΚΌ), a tři normální kontrolní myši. Vzhled kontrolních myší byl normální. Všechny tři kontrolní myši byly negativní na výskyt skryté krve ve vzorcích výkalů a měly normálně vyhlížející konečník. Některé z IL-10 KO myší byly patrně menší než kontroly a vykazovaly znaky slabšího zdraví. Měly zježené chlupy 15 a malý životní elán při srovnání s normálními kontrolami. Jedna ze čtyř IL-10 KO myší byla nahrbena a procházela se abnormální chůzí. Všechny čtyři IL-10 OK myši měly oteklý konečník a erytematózní rektální tkáň nebo prolapsus konečníku.

Dvě z pokusných KO myší měly pozitivní nález skryté krve ve vzorcích výkalů při dvou různých 20 příležitostech, zatímco třetí myš byla v jednom případě negativní a v druhém případě nejednoznačná. Rektální nátěry byly provedeny u všech čtyř myší. Tři měly hnisavé výpotky s velkým počtem neutrofilních granulocytů. V jednotlivých nátěrech zvířat, které v době odebírání vzorků krvácely z konečníku, byly přítomny také erytrocyty. Protože IL-10 KO myši vykazovaly s časem pokles sil, byla jako část zkoumání zaznamenávána hmotnost IL-10 KO 25 myší a normálních kontrolních myší.

Třem z IL-10 myší bylo injekčně denně dva týdny podáváno 35 pg IL-10. Tyto tři myši stále měly hnisavé výpotky (jenom 2 ze 3 vykazovaly také známky krvácení a 1 ze 3 se hrbila a běhala abnormálně). Jedné IL-10 KO myši (negativní na krvácení a hnisavý výpotek) a normálním 30 kontrolám byly dva týdny denně podávány injekce tromethaminového (TRIS) pufru. Byl sledován obecný zdravotní stav, fyzický zjev, rektální výpotek, výskyt skryté krve a hmotnost.

Po dvou týdnech infuze IL-10 všechny tři IL-10 KO myši vykazovaly zvýšenou životní sílu, hladké chlupy, normální držení těla a normální chůzi. U všech tří došlo ke snížení otoku 35 konečníku, i když byly ještě přítomny znaky zánětu. U všech tří byly negativní výsledky na skrytou krev a v jejich rektálním nátěru nebyly znaky erytrocytů. Množství výpotků bylo sníženo, v jejich rektálních nátěrech však byly ještě pozorovány neutrofilní granulocyty. Nátěr jednoho ze zvířat nyní vykazoval více epitelních a lymfocytových buněk než neutrofilních granulocytů. Jedno zvíře si udržovalo svoji hmotnost přibližně 16 gramů. U dalších dvou se 40 hmotnost zvýšila z 16 na 17,8 g a z 11,4 na 14 gramů.

IL-10 KO myš, které byl podáván TRIS pufr po dobu dvou týdnů, měla negativní výskyt skryté krve ve vzorku stolice. Vykazovala hojný výpotek, který obsahoval velké množství neutrofilních granulocytů. Konečník byl ještě oteklý a citlivý na prolapsus. Zvíře bylo nahrbené a procházelo 45 se abnormálně. Vykazovalo také zřejmé znaky chřadnutí. Jeho hmotnost klesla z 16,6 g na 14 g.

Normální kontroly, kterým byl také injekčně podáván TRIS pufr, si zachovaly svůj normální zdravotní vzhled včetně jejich konečníků. Vzorky stolice byly negativní na skrytou krev a nebyly detekovány žádné výpotky z konečníku. Jejich hmotnost se zvýšila ze 17,1 na 19 g a 17,4 na 18,7 g. Dokonce i několik týdnů později si zvířata stále ještě zvyšovala svoji hmotnost.

-27CZ 283488 B6

Příklad 11

Zlepšování znaků nebo příznaků, příslušejících zánětlivému vnitřnímu onemocnění

Člověk jako pacient s IBD může být léčen IL-10 podle vynálezu následujícím způsobem. Takový pacient má typicky příznaky, mezi které patří diarea, abdominální bolest, horečka, melena, hematochézie a ztráta hmotnosti, a znaky, mezi které patří abdominální hmotnost, glositida, aftózní vřed, anální fisura, perianální fisura, anemie, malabsorpce a deficit železa. Pacient se z počátku léčí 5 gg IL-10 na kg hmotnosti za den. Protože pacient váží 70 kg, počáteční dávka je 350 gg IL-10 za den. Tato dávka se podává jako intravenózní bolus. Tato dávka se zvyšuje o 50 až 150 pg za den podle snášenlivosti a odpovědi pacienta. Optimální dávky 700 pg za den (10 μg na kg za den) se dosáhne během několika dnů.

Před počátkem léčení a potom denně až do několika dnů po ukončení léčení se pacient sleduje klinicky a laboratorními parametry. Mezi laboratorní parametry patří počet krvinek se zvláštní pozorností na celkový počet bílých krvinek a na diferenciál. Zvláště zajímavé je to, jestli počty bílých krvinek zůstávají normální nebo bez významné změny při srovnání s množstvím před léčením pacienta. Vzhledem k diferenciálu bílých krvinek je zvláštní pozornost věnována tomu, jestli se v periferní krvi objevují nematurované formy a jestli zůstává stálý nebo jestli se mění normální poměr různých typů bílých krvinek. Zvláštní pozornost se věnuje poměru lymfocytů a monocytů v periferní krvi.

Mezi další parametry, které mohou být sledovány, patří rychlost sedimentace erytrocytů (ESR), chemické profily a množství IL-6, TNF a IFN-γ v krvi. A konečně, pravidelně, například denně, se hodnotí pacientova stolice na krev a hnisavý výpotek, což může ukazovat na pacientovu odpověď na léčení. Léčení vede ke zlepšení jednoho nebo více příznaků nebo znaků vnitřního zánětu.

Lze udělat mnoho modifikací a variací tohoto vynálezu, aniž by se tyto odchýlily od jeho duchu a rozsahu, jak bude zřejmé odborníkům. Zde popsaná specifická provedení jsou nabídnuta jen jako příklady. Tento vynález je omezen pouze připojenými patentovými nároky.

Seznam sekvencí

Sekvence vzorce I

Ser

Pro

Gly

Gin

Gly

Thr

Gin

Ser

Glu

Asn

Ser

Cys

Thr

His

Phe

1

5

10

15

Pro

Gly

Asn

Leu

Pro

Asn

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Ala

Phe

20

25

30

Ser

Arg

Val

Lys

Thr

Phe

Phe

Gin

Met

Lys

Asp

Gin

Leu

Asp

Asn

35

40

45

Leu

Leu

Leu

Lys

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu

50

55

60

Gly

Cys

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

Glu

65

70

75

Val

Met

Pro

Gin

Ala

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Asp

Ile

Lys

Ala

His

80

85

90

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

95

100

105

Arg

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Ala

110

115

120

Val

Glu

Gin

Val

Lys

Asn

Ala

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

125

130

135

Ile

Tyr

Lys

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

140

145

150

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr

Met

Lys

Ile

Arg

Asn

155

160

-28CZ 283488 B6

Sekvence vzorce II

Thr

Asp

Gin

Cys

Asp

Asn

Phe

Pro

Gin

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

1

5

10

15

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg

Val

Lys

Thr

Phe

Phe

Gin

Thr

Lys

Asp

Glu

20

25

30

Val

Asp

Asn

Leu

Leu

Leu

Lys

Glu

Ser

Leu

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

35

40

45

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

50

55

60

Leu

Glu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

Ala

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Glu

Ala

65

70

75

Lys

Asp

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

80

85

90

Leu

Arg

Leu

Arg

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

95

100

105

Ser

Lys

Ala

Val

Glu

Gin

Ile

Lys

Asn

Ala

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

110

115

120

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

125

130

135

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr

Ile

Lys

Ala

Arg

140

145

147

Sekvence vzorce III:

GGCTGCAGCG ACGAGCCATG GTTGCTGGGA GCGACGCG

Sekvence vzorce IV:

TTCATCTTCT GGTACCAATC AATTGGAGTT GGTTC

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití interleukinu-10 (IL-10) k výrobě léku pro léčení zánětlivého vnitřního onemocnění.
2. 2. Použití IL-10 podle nároku 1, přičemž IL-10 se používá k výrobě léku pro léčení Crohnovy nemoci.
3. 3. Použití IL-10 podle nároku 1, přičemž IL-10 se používá k výrobě léku pro léčení ulcerativní kolitidy.