RU2196605C2 - Способ получения растворимых конъюгатов биологически активных веществ - Google Patents

Способ получения растворимых конъюгатов биологически активных веществ Download PDF

Info

Publication number
RU2196605C2
RU2196605C2 RU2000131517/14A RU2000131517A RU2196605C2 RU 2196605 C2 RU2196605 C2 RU 2196605C2 RU 2000131517/14 A RU2000131517/14 A RU 2000131517/14A RU 2000131517 A RU2000131517 A RU 2000131517A RU 2196605 C2 RU2196605 C2 RU 2196605C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
protein
dextran
peroxidase
proteins
detector
Prior art date
Application number
RU2000131517/14A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2000131517A (ru
Inventor
А.Б. Жебрун
Original Assignee
Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера filed Critical Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера
Priority to RU2000131517/14A priority Critical patent/RU2196605C2/ru
Publication of RU2000131517A publication Critical patent/RU2000131517A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2196605C2 publication Critical patent/RU2196605C2/ru

Links

Images

Landscapes

  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, биохимии и медицины, а именно к способам синтеза веществ с бифункциональной и мультифункциональной биологической активностью. Сущностью изобретения является способ получения растворимых конъюгатов биологически активных веществ, предусматривающий соединение белка с полисахаридом - декстраном. В способе декстран использован в качестве носителя. К нему присоединяют белки с различной функциональной активностью. К декстрану можно присоединить фермент пероксидазу и детекторные белки для определения иммуноглобулинов, а в качестве детекторных белков для определения иммуноглобулинов IgG-фракции, или белок А золотистого стафилококка, или белок G стрептококка. Наилучшие результаты получают при молярном соотношении соединяемых компонентов декстран: детекторный белок: пероксидаза 1:5:5 - 1:5:10. Технический результат - расширение арсенала технологии иммунокомпетентных средств. 1 з.п. ф-лы, 7 табл.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, биохимии и медицины, а именно к способам синтеза веществ с бифункциональной и мультифункциональной биологической активностью, и может найти применение в конструировании иммуноферментных, иммуногенных, гормонбелковых и других подобных конъюгатов для биологии и медицины.
Известны способы конъюгации белков химической связью с помощью бифункциональных соединений, а также способы конъюгации белков с предварительно активированными полисахаридами [1].
Наибольшее распространение получили два способа активации (создания реакционных групп белка): посредством обработки полисахарида цианогенбромидом и посредством периодатного окисления [2, 3].
Наиболее близким по сущности к предлагаемому способу является способ получения декстран-белковых конъюгатов, при котором декстран активируют цианогенбромидом и используют в качестве гаптена для присоединения к белку-носителю [4]. Однако данный способ не позволяет получать конъюгаты с бифункциональной и полифункциональной активностью.
Изобретение направлено на создание способа синтеза конъюгатов, который предусматривает использование растворимого активированного полисахарида в качестве носителя или мостика для совместного присоединения к нему конъюгируемых белков. Способ позволяет свободно комбинировать состав конъюгата, независимо от наличия или отсутствия углеводных остатков в структуре конъюгируемых белков. Предлагаемым способом могут быть получены не только би-, но также три- и мультимолекулярные конъюгаты, так как к полисахариду-носителю совместно могут быть присоединены белковые вещества любого заданного состава.
Сущность изобретения сводится к следующему.
Способ получения растворимых конъюгатов биологически активных веществ предусматривает соединение белка с полисахаридом - декстраном. В отличие от прототипа декстран использован в качестве носителя. К нему присоединяют белки с различной функциональной активностью. К декстрану можно присоединить фермент пероксидазу и детекторные белки для определения иммуноглобулинов, а в качестве детекторных белков для определения иммуноглобулинов - IgG-фракции, или белок А золотистого стафилококка, или белок G стрептококка. Наилучшие результаты получают при молярном соотношении соединяемых компонентов декстран:детекторный белок: пероксидаза 1:5:5-1:5:10.
Способ реализуется следующим образом.
Пример 1.
Получают конъюгат для иммуноферментного анализа (ИФА) IgG человека. В качестве детектора IgG используют белок А золотистого стафилококка, селективно реагирующий с Fc фрагментом IgG [7]. В качестве фермента используют пероксидазу хрена. Декстран с молекулярной массой 4400 D в количестве 4,4 мг растворяют в 10,0 мл Н2О и при постоянном перемешивании добавляют одной порцией 2 мг сухого CNBr: немедленно вслед за этим добавляют 2 М раствор NaOH - по каплям, под контролем рН-метра, поддерживая рН среды на уровне 10,5±0,1 в течение 15 минут при температуре 20±5oС.
Затем в реагентную смесь добавляют одной порцией при постоянном перемешивании свежеприготовленный раствор белков: очищенного белка А (200 мг) и пероксидазы хрена (200 мг) в 20 мл 0,2 М карбонат-бикарбонатного буферного раствора рН 9,2±0,1. Смесь оставляют при перемешивании на роторной мешалке при 20±5oС на 18-20 часов, после чего ее нейтрализуют 0,1 н. раствором НСl и наносят на колонку с сефадексом G-200 диаметром 35 мм и высотой слоя геля 500 мм, уравновешанную 0,1 М фосфатным буферным раствором рН 7,2±0,1. Гельфильтрацию ведут со скоростью 2 мл/час/см2 под контролем ультрафиолетового абсорбциометра при длине волны 280 нм. Блок-содержащую фракцию (50 мл) собирают в составе свободного объема. Остальные фракции гель-фильтрата удаляют.
Целевую фракцию гель-фильтрата - очищенный конъюгат - разводят до концентрации пероксидазы 100нг/мл 0,15 М фосфатным буферным раствором (ФБР) рН 7,2±0, l с твином в концентрации 0,025% и используют в ИФА как рабочее разведение конъюгата. В лунках полистирольного планшета для ИФА сорбируют IgG человека, для чего в лунки вносят 0,1 мл раствора IgG в концентрации 10 нг/мл в 0,1 М глициновом буферном растворе рН 8,2±0,1 и выдерживают при 37±0,1oС в течение 1 часа. После удаления раствора IgG и 4-х кратного промывания лунок ФБР с твином в них вносят конъюгат, полученный указанным выше способом в рабочем разведении. Для сравнения в другие лунки с сорбированным IgG вносят конъюгат белка А с пероксидазой, полученный известным способом (ФС 42-3428-97) в рабочем разведении - с концентрацией пероксидазы 100 нг/мл. Планшеты выдерживают 40 минут при 37±0,5oС, после чего раствор конъюгата удаляют и в лунки вносят по 0,1 мл субстратной смеси с ортофенилендиамином (6 мг ортофенилендиамина растворяют в 10 мл цитратно-фосфатного буферного раствора 0,1 М рН 5,0±0,1 и добавляют 10 мкл 33% раствора пергидроля) выдерживают 30 минут в темноте и останавливают реакцию добавлением 2Н H2SO4 по 0,1 мл в каждую лунку. Оптическую плотность продукта реакции измеряют при длине волны 492 нм (ОД492).
Получают следующие результаты (табл.1). Активность конъюгата, полученного предлагаемым способом, более чем в 2 раза выше активности конъюгата, приготовленного известным способом. Конъюгат высокоспецифичен - ОД492 в контроле с альбумином и ФБР находится на уровне сотых долей и ею можно пренебречь.
Пример 2.
Получают конъюгат для ИФА IgG человека, используя следующие реагенты: декстран 4,4 мг, IgG-фракцию антисыворотки козы к IgG человека 800 мг и пероксидазу хрена 200 мг. Остальные условия выполнения способа аналогичны примеру 1. Получают 50 мл очищенного гельфильтрацией конъюгата IgG-декстран-пероксидаза. Его разводят до рабочей концентрации 100 нг пероксидазы в 1 мл и используют в опыте определения антител к дифтерийному токсину.
Дифтерийный анатоксин в концентрации 0,5 мкг/мл на глициновом буферном растворе рН 8,2±0,1 сорбируют в лунках полистирольного планшета для иммунологических реакций 16 часов +4oС. Лунки промывают 0,15 М раствором NaCl в 0,15 М фосфатном буферном растворе, содержащем твин-20 в концентрации 0,025% и инкубируют в них исследуемые сыворотки человека в разведении 1:400: а) сыворотку, содержащую антитоксические антитела в количестве 0,5 АЕ/мл по данным титрацитарной биопробы в коже кролика; б) сыворотку, содержащую антитела в концентрации 0,001 АЕ/мл и в) сыворотку, не содержащую антитоксических противодифтерийных антител по данным биопробы. Планшеты с сывороткой инкубируют 2 часа при 37±0,5oС, после чего сыворотку удаляют, лунки 4-х кратно промывают и производят детекцию IgG человека (антител, сорбировавшихся на антигене), как описано в примере 1, но в качестве детектора используют рабочее разведение конъюгата IgG козы декстран-пероксидаза.
Получают следующие результаты (табл. 2). Конъюгат, приготовленный по предлагаемому способу, имеет преимущества, особенно при анализе низкоактивной сыворотки, содержащей 0: 01 АЕ/мл противодифтерийного антитоксина. Конъюгат, полученный известным способом, не позволяет достоверно определить наличие или отсутствие антител в низкоактивной сыворотке, хотя это важно, так как концентрация антитоксина 0,02 АЕ/мл считается минимальным защитным уровнем гуморального иммунитета против дифтерии и служит критерием для определения тактики вакцинации населения.
Пример 3.
Выполняют в точном соответствии с примером 1 с тем отличием, что вместо белка А золотистого стафилококка используют белок G рекомбинантный с молекулярной массой 42 KD, в количестве 200 мл. По биологической активности белок G стрептококка также реагирует с Fc-фрагментом IgG человека и млекопитающих других видов и используется в качестве заменителя анти-IgG антител [8] . Остальные операции по приготовлению конъюгата и его испытанию проводят аналогично примеру 1.
Получают данные оптической плотности продукта реакции (табл.3), которые демонстрируют преимущества предлагаемого способа конструирования конъюгата: существенно более высокую активность активность при тестировании IgG при низких значениях неспецифических реакций.
Пример 4.
В целях определения зоны концентраций реагентов, дающей воспроизводимые результаты, используют следующие соотношения основных компонентов (табл.4). Конъюгаты белок А-декстран-пероксидаза получают при указанных соотношениях реагентов в соответствии с условиями примера 1. Конъюгаты испытывают, как указано в примере 3, при тестировании антитоксических противодифтерийных антител в сыворотке человека с низким содержанием антител (0,01 АЕ/мл).
Результаты представляют в табл.5. Полученные данные показывают, что наибольшие преимущества перед известным конъюгатом имеют предлагаемые конъюгаты, полученные при молярных соотношениях декстран:детекторный белок:пероксидаза, равных 1:5:5-1:5:10.
Пример 5.
Получают конъюгат: овальбумин декстран - белок А золотистого стафилококка. Конъюгацию осуществляют с соблюдением условий примера 1 с тем отличием, что вместо пероксидазы используют овальбумин (ОР). Конечный продукт конъюгации используют для иммунизации 2-х кроликов по схеме: 2 внутримышечные инъекции (с интервалом 14 дней) по 1 мл раствора, содержащего 2 мг конъюгата по содержанию белка. Для сравнения кроликов иммунизируют конъюгатом декстран-овальбумин, полученным по методу (4). Через три недели после второй иммунизации у кроликов определяют антитела к овальбумину в реакции иммунодиффузии. Получают результаты (табл. 6), из которых следует, что предлагаемый способ существенно повышает иммуногенность овальбумина по сравнению с известным способом конъюгации. Этот факт подтверждают путем выделения анти-ОА-антител из объединенного образца сыворотки от кролика 1 и 2 аффинной хромотографией на CNBr сефарозе с иммобилизованным овальбумином. Из 1 мл сыворотки выделяют 583 мкг аффинно-очищенных антител к ОА, тогда как из объединенного образца сыворотки 3 и 4 выделяют 167 мкг антител к ОА. Приведенный пример демонстрирует преимущества предлагаемого способа при создании иммуногенных конъюгатов.
Пример 6.
Получают конъюгат белок А - декстран-пероксидаза, причем декстран активируют периодатным окислением. 4,4 мг декстрана (молекулярная масса 4400 KD) растворяют в 10 мл Н2О и добавляют 2 мг NalO4, смесь выдерживают на роторной мешалке (1 об/мин) 20 минут при 20±5oС, после чего диализуют 1 сутки против 200 объемов 0,001 М ацетатного буферного раствора рН 4,0±0,1. К диализованному раствору добавляют 20 мл 0,01 М корбанат-бикарбонатного буферного раствора рН 9,5±0,1, содержащего 200 мг белка А и 200 мг пероксидазы хрена. Смесь выдерживают на роторной мешалке при 20±5oС 2 часа. Затем добавляют 20 мг NaBH4 в 0,5 мл Н2О и выдерживают на роторной мешалке при 4±1oС 2 часа. Продукт реакции диализуют против 300 объемов ЗФР рН 7,2±0,1 в течение 20 часов и очищают на колонке с сефадексом G-200,как указано в примере 1. Получают 50 мл раствора конъюгата, который используют в ИФА в рабочей концентрации - 100 нг/мл по содержанию пероксидазы. Конъюгат испытывают, как указано в примере, при детекции сорбированных в лунках планшета IgG человека и альбумина человека. Получают результаты, представленные в табл.7. Из них следует, что способ воспроизводим в варианте конъюгации белков с периодатно-окисленным декстраном, т.е. при ином способе активации полисахарида, чем описано в примерах 1-5.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Руослахти Е. (ред.) Иммуносорбенты в очистке белков. М., Медицина, 1979.
2. Туркова Я. Аффинная хроматография. М., Мир, 1980, 472 с.
3. Nacane Р. К., Kawaoi A. Peroxidase - labeled antibody a new methods of conjugation. J. Histochem. Cytochem., 1974, 22, 1084 -1091.
4. Richter W. , Kagedal L. Preparation of Dextran - Protein Conjugates and Studies of their Immunogenicity. Int. Arch. Allergy 1972, 42, 885 - 902.
5. Farr A.G., Nacane P.K., J.Immunol Meth, 1981, 47, р.129-144.
6. Стендифер Д. К. В кн.: Иммуноферментный анализ. М., Мир, 1988, стр. 172-192.
7. Фармакопейная статья ФС 42-3402-97.
8. Временная фармакопейная статья ВФС 42-34-80-99.

Claims (2)

1. Способ получения растворимых конъюгатов биологически активных веществ путем соединения белка с декстраном, отличающийся тем, что декстран использован в качестве носителя, к которому присоединяют фермент пероксидазу и детекторные белки для определения иммуноглобулинов, причем молярное соотношение соединяемых компонентов декстран : детекторный белок : пероксидаза составляет 1: 5: 5 - 1: 5: 10.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве детекторных белков для определения иммуноглобулинов используют Ig G-фракции или белок А золотистого стафилококка или белок G стрептококка.
RU2000131517/14A 2000-12-07 2000-12-07 Способ получения растворимых конъюгатов биологически активных веществ RU2196605C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2000131517/14A RU2196605C2 (ru) 2000-12-07 2000-12-07 Способ получения растворимых конъюгатов биологически активных веществ

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2000131517/14A RU2196605C2 (ru) 2000-12-07 2000-12-07 Способ получения растворимых конъюгатов биологически активных веществ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2000131517A RU2000131517A (ru) 2002-11-10
RU2196605C2 true RU2196605C2 (ru) 2003-01-20

Family

ID=20243483

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2000131517/14A RU2196605C2 (ru) 2000-12-07 2000-12-07 Способ получения растворимых конъюгатов биологически активных веществ

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2196605C2 (ru)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RICHTER W., RAGEDAL L. Preparation of Dextran-Protein Conjugates..., Jnt. Arh. Allergy, 1972, 42, 885-902. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cho et al. Site-directed biotinylation of antibodies for controlled immobilization on solid surfaces
US4371515A (en) Method for forming an isolated lectin-immunological conjugate
US5086002A (en) Erythrocyte agglutination assay
US4493793A (en) Soluble immunoassay reagent comprising lectin covalently bonded to reactive component
US4683295A (en) Method for the preparation of anti-receptor antibodies
US20160047807A1 (en) Method for Detection of Legionella Bacteria Employing Purified Antigen-Specific Antibodies
EP0005271A2 (en) Method and kit for enzyme immunoassay of biological substances
JPH0721500B2 (ja) 抗原または抗体の濃度を測定する方法
JPH0576960B2 (ru)
JPH0566547B2 (ru)
EP0185722A1 (en) Polyclonal antibodies, preparation and use
CA1197777A (en) Coated cells and their use
JP2988635B2 (ja) ヒトIgEに対するモノクローナル抗体
US4454226A (en) Enzymatic immunoassay
RU2196605C2 (ru) Способ получения растворимых конъюгатов биологически активных веществ
JP3969878B2 (ja) 50(v/v)%有機溶媒水溶液においてもその抗原認識特性が実質的に低下しないコプラナーPCBに特異的に反応するモノクローナル抗体及びその測定方法
KR100215552B1 (ko) 즉석 마약검출지 및 그것의 제조 방법
Aithal et al. An alternate method utilizing small quantities of ligand for affinity purification of monospecific antibodies
EP0308242B1 (en) Agglutination assay
WO1997016727A1 (en) Assay background reduction using glycoproteins with oxidized carbohydrates
JP2968910B2 (ja) 1α,25(OH)2ビタミンD3に対する抗体及びその用途
Bankert et al. Synthesis of a lipopolysaccharide designed to conjugate haptens and proteins to erythrocytes for use as target cells in passive hemagglutination and hemolytic assays
JP2000214165A (ja) 均一系酵素免疫分析方法
EP0206779A1 (en) Detecting antinuclear antibody
Kuffner et al. Two-site monoclonal antibody quantitative ELISA for toxic shock syndrome toxin-1

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20041208