KR100215552B1 - 즉석 마약검출지 및 그것의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 검출하고자 하는 시료가 가해지는, 덱스트란으로 처리된 시료 멤브레인:상기 시료 멤브레인과 길이방향으로 겹치도록 연결되며, 검출하고자 하는 마약의 항체와 착색미립자를 결합시킨 마약항체-착색미립자가 일시적으로 고정되어있는 유리섬유 멤브레인;상기 유리섬유 멤브레인과 길이방향으로 겹치도록 연걸되며, 검출하고자 하는 마약에 단백질을 접합시킨 마약-단백질 접합체와 상기 마약의 제2항체가 서로 다른 위치에 영구적으로 고정되어 있는 폴리에스테르 지지 나이트로셀룰로오스 멤브레인; 및·상기 폴리에스테르 지지 나이트르셀룰로오스 멤브레인에 길이방향으로 겹치도록 연결되는 반응액 흡수 멤브례인으로 이루어지는, 측석마약 검출지 및 그것을 제조하는 방법에 관한 발명이다. 본 발명에 의해 보다 짧은 시간에 마약 검출 결과를 얻을 수 있고, 검출 결과 판정이 용이하며, 마약에 대한 민갇성이 향상된 마약검출지가 제공된다.

Description

즉석 마약검출지 및 그것의 제조 방법

본 발명은 마약 항체의 반응 특이성을 이용하여 마약을 단시간 내에 민감하게 검출할 수 있는 검식검출지 및 그것의 제조방법에 관한 발명이다.

일반적으로 마약을 복용하거나 주사한 사람의 뇨중에는 마약이 원형 그대로 또는 일부 대사산물로 배출되며, 복용시간과 뇨중에서 검출되는 양과는 관계가 있다. 따라서 마약 투약 여부를 검사하는 스크리닝 테스트는 뇨를 채취한 시점에서 곧 시솰하는 것이 가장 바람직한 방법이다. 또한 세관 통관시 의문시 되는 유사 마약을 현장에서 직접 테스트하여 일차적으로 마약 여부를 감지할 수 있는 간이검출지도 마약거래 현장수사에 가장 필요한 도구이다.

이러한 사회적 요구에 따라 수사현장에서 사용할 수 있는 마약 스크리닝법에 대한 연구가 다각적으로 행해지고 있다, 지금까지 개발된 대부분의 마약 검출 방법은 실험실에서 수행하는 방법들로서, 면역분석법, 가스크로마토그래피와 질량분석기기를 이용한 기기분석법이 이용되고 있다. 그러나 이러한 실험적 방법은 고가의 장비와 훈련된 특수인원이 필요하며, 검사할 때까지 일정한 시간이 소요될 뿐 아니라, 검사후 졀과통보까지도 많은 시간이 걸린다는 단점이 있다. 현재까지 화학정색반응을 이용한 스크리닝법은 수사현장에서 사용할 수 있으나, 반응 특이성이 낮아, 마약 특이 항체의 면역반응성을 이용한 면역검출지로 대체되고 있다. 이러한 면역검출지는 마약에 특이성이 높아 일반 의약품과의 교차반응성이 거의 없이 마약 및 그 대사산물만을 검출할 수 있는 정확한 방법이다.

크로마토그래피 면역검출지의 원리는 처음으로 영국의 유니패스사에 의해 청색 라텍스미립자와 샌드위치 면역검출법을 멤브레인에 적용하여 임신진단시약을 제조하였다(K. May 등, 영국특허공개 2 204 3998 A(l988)). 그후 쿨로이달골드나 클로이달세레니움을 이용한 제품이 출현하였다(G.Osiko∫vicz 등, Clin. Chem.36(9), 1586-1587 (1990). 또, 청색라텍스 미립자나 적색콜로이달골드 미립자와의 경쟁면역검출을 이용한 마약검출지가 제시되었다(상표명 Abusign MET, 미국 PrinstonBiomeditech Corp.).

이와 같은 검출지를 사용하여 마약을 검출하는 방법은, 검사 대상인 시료가 모세관 현상에 의해 멤브레인을 따라 이동하여 감에 따라, 시료속에 검출하고자 하.

마약이 있으면 이 마약은 착색미립자-마약항체와 반응하여 복합체를 형성하여 이동하게 되고, 이 복합체가 멤브레인의 마약접합체가 영구적으로 결합된 부위에 도달하면, 마약접합체와 경쟁반응을 나타낸다. 그 결과 마약접합제 부위에서 색깔이 나타나게 되며, 이 색깔의 결과로서 약물의 유무를 판정할 수 있는 방법이다.

이러한 방법으로 약물의 유무를 판정하는 경우, 약물을 미량의 농도까지 검출할 수 있는 검출 민감도와, 결과판정을 용이하게 할 수 있는 색깔의 강도에 따라 제품으로서의 가치가 달라지고 있다.

본 발명은 보다 짧은 시간에 결과를 얻을 수 있고, 마약에 대한 민감성이 향상된 마약 검출지 및 그것의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 검출지에 사용되는 마약검출 멤브레인으로 폴리에스테르 지지나이트로셀룰로오스 멤브레인을 사용함으로써 검출시간을 단축시킬 수 있을 뿐 아니라 반응민감성을 향상시킬 수 있다.

또, 시료 멤브레인을 덱스트란으로 처리함으로써, 항원-항체 반응성을 향상시켜 뚜렷한 색깔이 나타나도록 할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 마약 검출지의 조립 측면도이다.

도 2는 본 발명에 따른 마약 검출지의 평면도이다.

도 3은 마약검출지의 조립 모형도이다.

도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

1 : 시료 멤브레인 2 : 유리섬유 멤브레인

3 : 폴리에스테르 지지 나이트로셀룰로오스 멤브레인

4 : 흡수 멤브레인 5 : 결과선

6 : 실험관리선

본 발명에 따른 검출지는 도 1과 도 2에 예시되는 것과 같이, 검출하고자 하시료가 가해지는, 덱스트란으로 처리된 시료 멤브레인(1);상기 시료 멤브레인(1)과 길이방향으로 겹치도록 연결되며, 검출하고자 하는 마약의 항체와 착색미립자를 결합시킨 마약항체-착색미립자가 일시적으로 고정되어 있는 유리섬유 멤브레인(2);상기 유리섬유 멤브레인(2)과 길이방향으로 겹치도록 연결되며. 검출하고자하는 마약에 단백질을 접합시킨 마약-단백질 접합체와 상기 마약의 제2항체가 서로 다른 위치에 영구적으로 고정되어 있는 폴리에스테르 지지 나이트로셀룰로오스 멤브레인(3);및 상기 폴리에수테르 지지 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 길이방향으로 겹치도록 연결되는 반응액 흡수 멤브레인(4)으로 이루어진다.

본 발명의 검출지를 사용하여 마약의 존재 여부를 곁정하는 방법은 다음과 같다.

유리 멤브레인의 끝 부분인 시료 멤브레인에 시료를 가하면, 시료가 어과 흡수되어 모세관 현상에 의해 유리섬유 멤브레인과 폴리에스테르 지지 나이트로셀룰로오스 멤브레인을 따라 이동하게 되는데, ㅇl때, 시료속에 검출하고자 하는 마약이나 그 대사산물이 검출 민감도 이상으로 존재하는 경우, 이 약물은 마약항체-착색미립자와 반응하여 복합체를 형성하여 이동하게 되며, 이 복합체가 폴리에스테르지지 나이트로셀룰로오스 멤브레인의 마약-단백질 접합체가 영구적으로 결합된 부위에 도달하면, 마약-착색미립자 접합체의 마약과 마약-단백질 접합체의 마약이 착색미립자와 결합되어 있는 항체에 경쟁반응을 나타낸다. 그 결과 마약-단백질이 고정된 부위에서는 착색미립자에 의한 색깔이 나타나지 않고, 제2항체가 고정되어 있는 부위에서만 착색미립자에 의한 색깔이 나타나게 된다.

한편, 시료속에 검출하고자 하는 약물이나 고 대사산물이 없는 경우에는 마약항체-착색미립자가 멤브레인을 따라 이동하면서 일부는 마약-단백질 접합체와 결합하고, 일부는 제2항체와 결합하게 되어, 마약-단백질 접합체가 고정된 부위와 제2항체가 고정된 부위 모두에서 착색미립자에 의한 색깔이 나타나게 된다.

본 발명의 검출지에서, 시료 멤브레인으로는 덱스트란을 함유하는 용액으로 처리된 셀룰로오스 멤브레인을 사용할 수 있다. 덱스트란을 함유하는 용액으로 처리된 시료 멤브레인을 사용하면 결과선의 색깔이 뚜렷해져 검출 결과를 판정하기가 수월해진다.

본 발명의 검출지에서 착색미립자로는 이 분야에서 사용되는 다양한 착색미립자를 사용할 수 있는데, 이중 클로이달 골드가 바람직하며, 직경 30-50 nm인 것이 특히 바람직하다. 콜로이달 골드는 HAuCl4를 트리소디움시트레이트로 환원시켜 제조할 수 있으며, 시판 제픔을 구입하여 사용할 수도 있다. 클로이달 골드는 다른 착색미립자, 예를 들어 착색라텍스미립자들보다 크기가 작아 멤브레인에서의 이동성이 향상될 뿐 아니라 결과선이 잘 형성되어 마약 검출이 용이하다.

본 발명의 검출지에서, 마약 검출 판정 멤브레인으로, 폴리에스테르 지지 나이트로셀룰로오스 멤브레인을 사용하며, 포어 크기가 8-12긔n인 폴리에스테르 지지나이트로셀룰로오스 멤브레인이 바람직하다. 폴리에스테르 지지 나이트로셀룰로오 멤브레인을 사용함으로써 시료의 이동속도를 빠르게 할 수 있어 보다 빠른 시간내에 검사 결과를 얻을 수 있을 뿐 아니라, 마약에 대한 민감성을 향상시킬 수 있다.

마약-단백질 접합체의 단백질로 오브알부민을 사용하는 경우, 다른 단백질, 예를 들어 키흘림펫헤모시아닌이나 소혈청알부민을 사용할 때와 비교하어 민감도를 10배 이상 향상시킬 수 있으므로 바람직하다.

제2항원은, 마약항체-착색미립자에 사용되는 마약항체를 얻은 동물과 다른 동물로 부터 얻은 마약항체 자체에 대한 항체를 의며한다.

본 발명의 마약 검출지는, 몰핀, 대마초, 필로폰 등 다양한 종류의 마약 점출에 응용될 수 있다.

본 발명에 따른 마약 검출지의 제조방법은 다음과 같다.

덱스트란을 함유하는 용액으로 패드를 처리하여 시료 멤브레인을 제조하고; 검출하고자 하는 마약의 항체와 착색미립자를 결합시킨 마약항체-착색미립자를 유리섬유 멤브레인에 일시적으로 고정되도록 처리하고; 검출하고자 하는 마약에 단백질을 접합시킨 마약-단백질 접합체와 상기 마약의 제2항원을 폴리에스테르 지지 나이트로셀룰로오스 멤브레인의 다른 위치에 영구 고정되도록 처리하고; 상기 시료멤브레인, 상기 유리섬유 멤브레인, 상기 폴리에스테르 지지 나이트로셀룰로오스멤브레인과 반응액 흡수 멤브레인을 순서대로 서로 길이방향으로 겹치도록 조립하는 것으로 이루어진다.

본 발명의 마약 검출지 제조방법에서, 항원-항체 반응성을 향상시키 위하여시료 멤브레인을 텍스트란을 함유한 용액으로 처리한다. 이와 같이 처리함으로써, 결과선의 색깔이 뚜렷해져 검출 결과를 인식하기 수월해진다.

본 발명에 따른 제조방법에서, 마약항체-착색미립자가 일시적으로 고정되어 있는 유리섬유 멤브레인의 제조방법은 다음과 같다.

먼저, 반응 특이성과 반응성이 우수한 마약항체를 얻기 위하여, 에를 들어J. Choi, Arch. Pharm. Res.,2어1),46-52 (1997)에 기재된 방법에 따라, 마약-단백질 접합체를 리간드로 사용한 면역친화성 크로마토고래피를 수행하여 마약항체를얻는다.

이 때 면역친화성 크로마토그래피의 리간드로, 마약 면역원을 위해 사용된단백질과는 다른 종류의 단백질을 사용함으로써, 특이성이 높은 마약항체를 얻을수 있다.

얻어진 마약항체를 적정량의 착색 미립자와 혼합하여 반응시커 마약항체-착색미립자를 제조한다. 제조된 마약항체-착색머립자를 유리섬유 멤브레인의 일정한위치에 처리한다.

본 발명을 실시에에 따라 상세히 기술하면 다음과 같으며. 이 예로서 발명의 범위를 제한하지는 않는다.

[실시예 1. 필로폰항체의 분리정제]

한국특허출원 93-20973에 기재된 방법에 따라 면역원을 준비하였다.

즉, 필로폰에 소혈청알부민을 결합시기기 위해, 필로폰을 N-4-(브로모부틸)프탈이미드로 활성화시킨 후 하이드라진 수화물과 반응시켜 활성화된 N-4-아미노부털 필로폰(필로폰-NH2)을 합성하였다. 활성화된 필로폰-NH2 12 mg에 소혈청알부민 4.8mg과, 증류수 0.68 mg에 녹인 양쪽기능성 커플링 시약인 EDAC 72.9 mg을 가한 후, 상온에서 3시간 교반하여 필로폰-소혈청알부민을 제조하였다. 이것을 0.0lM 인산완층액(PBS, pH 7.4)에서 4시간 투석한 후, Sephacryl S-200 크로마토그래피(용출용매:10mM PBS, pH7.4)를 통해 중합된 접합물을 제거하였다.

필로폰-키흘림펫헤모시아닌을 얻기 위해, 소혈청알부민 대신 키흘림펫헤모시아닌을 사용하여 동일한 과정을 수행하였다.

면역원 1OO Llg을 Freund's 완전 보조액 1 m1과 잘 유화시켜 토끼 (AlbinoRabit, 암컷,3-5k9)의 등피 4곳에 1차 피하 주사하였다.3주 후에 20 Ug의 면역원을 Freund's 불완전 보조액 1 m1과 잘 유화시켜 2차 피하 주사한 후 2주 간격으로 같은 용량의 면역원을 2회 더 주사하였다. 표지항원 필로폰-흘스래디쉬퍼옥시데이즈(HRP)를 사용하여 ELISA에 의한 항체 희석곡선으로 측정한 항체 역가 희석 배수가 5,000-10,000 정도일 때 체헐하였다.

면역원이 필로폰-소혈청알부민 접합체인 경우는 필로폰-기홀림펫헤모시아닌 접합체나 필로폰-오브알부민을 리간드로 사용하여 면역친화성 크로마토 그래피를 수행하여 면역항체를 분리하였다.

면역원이 필로폰-키흘림펫헤모시아닌 접합체인 경우는 필로폰-소혈청알부민접합체나 필로폰-오브알부민을 리간드를 사용하여 면역친화성 크로마토그래피를 수행하여 면역항체를 분리하였다.

필로폰 항혈청을 3종류의 리 간드(필로폰-키 홀림 펫헤모시 아닌, 필로폰-오브알부민, 필로폰-소형청알부민)을 사용하여 시아노겐브로마이드 세파로스 레진과 반응시켜 면역친화성 크로마토그래피를 수행하였다. 면역친화성컬럼을 1M Tris-C1, pH8.0 완충액으로 세척한 후 여기에 펼로폰 항혈청을 가해 4∵에서 18시간 반응시킨후 0.5M NaC1을 함유한 0.1M tris-C1, pH 8.3 완충액으로 세척했다. 그후 0.1M 트리에틸아민, pH 11.5로 면역항체를 정제해 내고, 이것을 1M phosphate 완충액, 마6.8로 중화시켰다. 이를 PBS로 투석하고 농축시켰다.

[실시예 2. 필로폰항체-콜로이달골드가 고정된 유리섬유 벰브레인의 제조]

1lnㅛ의 콜로이달골드(미립자 크기:30-50 nm)를 pH 9.⒥인로 맞추고, 여기에실시예 1에서 얻은 필로폰 항체를 항체 농도가 8μg항체/1I1꼬. 클로이달골드가 되도록조금씩 가했다. 실온에서 30분간 흔들며 반응시킨 후,10% 소혈청알부민을 1% 농도가 되도록 가한 후, 다시 또 30분 반응시켰다.12,000rpl뻬서 10분간 원심분리하여상등액을 버리고, 다시 2岾 붕산 완충액을 가하여 콜로이달 골드를 세척하고, 마지막 세척 후 2耐 붕산완충액 (pH 7.2)에 현탁시킨 후 소혈청알부민을 1%가 되도록가했다. 쿨로이달골드-항체의 농도를 530nm에서 흡광도가 1.0이 되도록 희석한 후유리 섬유 멤브레인에 5⒩를 처리하고 동결건조시켰다.

[실시예 3. 필로폰-단백질 접합체가 고정된 폴리에스테르 지지 나이트로셀룰]

로오스 멤브레인의 제조

4-아미노부칠유도체화한 필로폰 20 I띵에, 증류수에 녹인 오브알부민 20 mg과 1-에틸-3-(3-메틸아미노프로필)카르보디이미드 148 1띵을 가하고 4 。C에서 하룻밤 반응시킨 후 투석하여 필로폰-오브알부민 접합체를 얻었다.

단백질로 오브알부민 대신 소혈청알부민과 키흘림펫헤모시아닌을 각각 사용하여 필로폰-소혈청알부민 접합체와 필로폰-키흘림펫헤모시아닌 접합체를 얻었다.

폴리에스테르 지지 나이트로셀룰로스 멤브레인(포어 크기:8-12삐)에 필로폰-단백질 접합체(300μg/l11ㅛ)를 처리하여 졀과선을 만들고(12μg/20Cm), 제2항체(토끼면역글로브린 항혈청. 그러나 마약항체의 동물원에 따라 달라질 수 있음)로 실험관리선을처리하여 건조시켰다.

[실시예 4. 시료 멤브레인 제조]

3皿 셀룰로오스 멤브레인을 3-10% 덱스트란,1% 소혈청알부민, 서당을 함유하는 50mM 붕산완층액(pH 7.2)로 처리하고 건조시켰다.

[실시예 5. 반응액 흡수 멤브레인]

반응액 흡수 멤브레인으로는 17 Chro 셀루로오스 멤브레인을 사용하였다.

[실시예 6. 점출지 제조]

도 1과 도 3에 예시된 바와 같이, 두꺼운 플라스틱 접착패드 위에 셀룰로오스시료 멤브레인, 유리섬유 멤브레인, 폴리에스테르 지지 나이트로셀룰로오수 멤브레인, 셀룰로오스 반응액 흡수 멥브레인을 그 순서로 길이방향으로 서로 겹치도록 조립하여 검출지를 만든 후 이것을 5刪 간격으로 세로로 절단하여 도 2와 같은 스트림을 제조하였다.

[실시예 7. 마약 검출실험 (마약 양성시료)]

실시예 6에서 제조된 마약 걷출지의 시료 멤브레인에 필로폰 양성시료 5방울(약 150⒪)를 떨어뜨리고 5분이내 결과를 관찰하였다. 필로폰-게2항체가 영구 고정된 위치('실험관리선'이라 함)에 적색이 나타났으며, 필로폰-단백질 접합체가 영구구정된 위치 ('결과선'이라 함)에는 적색이 나타나지 않았다. 이때 마약의 검출감도는 마약-오브알부민 접합체를 사용한 경우 1ppm이었으며 마약-기홀림펫헤모시아닌 또는 마약-소형청알부민 접합체를 사용한 경우 1Oppm이었다.

나. 마약 음성 뇨 경우

마약 음성시료를 사용하여 앞의 실험을 수행한 결과 적색선이 결과선과 실험관리선에 모두 나타났다. 이때 시료 멤브레인에 덱스트란을 처리한 경우 결과선의색깔이 강해져서 판정이 용이해진다.

본 발명에 의해 보다 짧은 시간에 마약 검출 결과를 얻을 수 있고, 검출 결과 판정이 용이하며, 마약에 대한 민감성이 향상된 마약 검출지가 제공된다.

Claims (8)

1. 검출하고자 하는 시료가 가해지는, 덱스트란으로 처리된 시료 멤브레인; 상기 시료 멤브레인과 길이방향으로 겹치도록 연결되며, 검출하고자 하는 마약의 항체와 착색미립자를 결합시킨 마약항체-착색미립자가 일시적으로 고정되어 있는 유리섬유 멤브레인;상기 유리섬유 멤브레인과 길이방향으로 겹치도록 연결되며, 검출하고자 하는 마약에 단백질을 접합시킨 마약-단백질·접합차와 상기 마약의 제2항체가 서로 다른 위치에 영구적으로 고정되어 있는 폴리에스테르 지지 나이트로셀룰로오스 벰브레인; 및 상기.폴리에스테르 지지 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 길이방향으로 겹치도록 연결되는 반응액 흡수 멤브레인으로 이루어지는, 즉석 마약 검출지.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 마약항체-착색미립자가 마약항체-콜로이달골드 미립자인 마약 검출지.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 콜로이달골드 미립자의 그기가 30-50nm인 마약 검출지.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리에스테르 지지 나이크로셀룰로오스 멤브레인의 포어 크기가 8-12μm인 마약 검출지.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 마약이 필로폰인 마약 검출지.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 마약-단백질 접합체가 마약-오브알부민인 마약 검출지.
7. 덱스트란을 함유하는 용액으로 패드를 처리하여 시료 멤브레인을 제조하고; 검출하고자 하는 마약의 항체와 착색미립자를 결합시긴 마약항체-착색미립자를 유리섬유 벰브레인에 일시적으로 고정되도록 처리하고; 검출하고자 하는 마약에 단백질을 접합시킨 마약-단백질·접합체와 상기 마약의 제2항원을 폴리에스테르 지지 나이트로셀룰로오스 멤브레인의 다른 위치에 영구 고정되도록 처리하고: 상기 시료멤브레인, 상기 유리섬유 멤브레인, 상기 폴리에스테르 지지 나이트로셀룰로오스멤브레인과 반응액 흡수 멤브레인을 순서대로 서로 길이방향으로 겹치도록 조립하는 것으로 이루어지는, 마약 검출지 제조방법.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 덱스트란의 분자턍이 80,000-200,000 달톤 범위어고,상기 덱스트란을 함유하는 용액이 텍스트란을 3-10% 함유하는 제조방법.

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