JPH0698020B2 - ヒト インターロイキン４に対するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ - Google Patents
ヒト インターロイキン４に対するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマInfo
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- JPH0698020B2 JPH0698020B2 JP63509356A JP50935688A JPH0698020B2 JP H0698020 B2 JPH0698020 B2 JP H0698020B2 JP 63509356 A JP63509356 A JP 63509356A JP 50935688 A JP50935688 A JP 50935688A JP H0698020 B2 JPH0698020 B2 JP H0698020B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は一般にモノクローナル抗体およびそれに関連す
るハイブリドーマに関し、さらに詳しくはヒト インタ
ーロイキン４に特異的な抗体に関するものである。
るハイブリドーマに関し、さらに詳しくはヒト インタ
ーロイキン４に特異的な抗体に関するものである。
背景 ヒト インターロイキン−４はヨコタら（YOKOTA）Pro
c.Natl.Acad.Sci.,Vol.83,pgs.5894−5898（1986）によ
ってクローン化され特徴が明らかにされた。IL-4は多機
能性の高いリンホカインであり多くの異なる免疫成分に
影響を与える。これはＴ細胞成長因子活性（TCGF）およ
びＢ細胞成長因子活性を有する。これはインターロイキ
ン２（IL-2）のTCGF活性および顆粒球‐マクロファージ
のコロニー刺激因子（GM-CSF）のコロニー形成活性を強
める。これはIgG1およびIgEを優先的に生産することを
誘導し、またヒト リンパ球クラスII DR抗原の発現を
誘導する。これらの活性はいくつかの可能な治療の用
途、たとえばIL-2抗腫瘍療法のための強化剤として、GM
-CSF-刺激化された骨髄再生のための強化剤として、ま
たはベアリンフォサイト（bare lymphocyte）症候群を
治療するための薬剤としての用途、を堤案する、トウレ
イン（Touraine）,Lancet,pgs.319-321（February 7,19
81）；トウレイン（Touraine）およびベトウエル（Betu
el）Human Immunology,vol.2,pgs.147-153（1981）；お
よびサリバンら（Sullivan）,J.Clin.Invest.,Vol.76,p
gs.75-79（1985）。
c.Natl.Acad.Sci.,Vol.83,pgs.5894−5898（1986）によ
ってクローン化され特徴が明らかにされた。IL-4は多機
能性の高いリンホカインであり多くの異なる免疫成分に
影響を与える。これはＴ細胞成長因子活性（TCGF）およ
びＢ細胞成長因子活性を有する。これはインターロイキ
ン２（IL-2）のTCGF活性および顆粒球‐マクロファージ
のコロニー刺激因子（GM-CSF）のコロニー形成活性を強
める。これはIgG1およびIgEを優先的に生産することを
誘導し、またヒト リンパ球クラスII DR抗原の発現を
誘導する。これらの活性はいくつかの可能な治療の用
途、たとえばIL-2抗腫瘍療法のための強化剤として、GM
-CSF-刺激化された骨髄再生のための強化剤として、ま
たはベアリンフォサイト（bare lymphocyte）症候群を
治療するための薬剤としての用途、を堤案する、トウレ
イン（Touraine）,Lancet,pgs.319-321（February 7,19
81）；トウレイン（Touraine）およびベトウエル（Betu
el）Human Immunology,vol.2,pgs.147-153（1981）；お
よびサリバンら（Sullivan）,J.Clin.Invest.,Vol.76,p
gs.75-79（1985）。
IL-4のIgE誘導活性はアレルギー症を患う人々に重要な
結果をもたらす可能性がある。IL-4に対する拮抗剤が得
られるならば、グルココルチコイドステロイドの使用、
（これは特に長期使用に際して多くの有害な副作用を持
つ；グッドマンおよびギルマン（Goodman and Gillma
n）,The Pharmacological Basis of Therapeutics,6th
Ed.（MacMillan Publishing company,New York,198
0））に代わるひとつの可能性を与える。特に ヒト
インターロイキン４に特異性のあるモノクローナル抗体
の強力なブロッキングは、抗イディオタイプ抗体を生産
することにより拮抗剤を構成する手段を提供する、たと
えば米国特許4,731,237、またはミモトープ（mimotop
e）スクリーニングにより、たとえば、ギーセン等（Gey
sen）,J.Immunol.Meth.,Vol.102,pgs.259-274（198
7）；またはPCT特許出願 WO 86/00991およびWO 86/064
87。
結果をもたらす可能性がある。IL-4に対する拮抗剤が得
られるならば、グルココルチコイドステロイドの使用、
（これは特に長期使用に際して多くの有害な副作用を持
つ；グッドマンおよびギルマン（Goodman and Gillma
n）,The Pharmacological Basis of Therapeutics,6th
Ed.（MacMillan Publishing company,New York,198
0））に代わるひとつの可能性を与える。特に ヒト
インターロイキン４に特異性のあるモノクローナル抗体
の強力なブロッキングは、抗イディオタイプ抗体を生産
することにより拮抗剤を構成する手段を提供する、たと
えば米国特許4,731,237、またはミモトープ（mimotop
e）スクリーニングにより、たとえば、ギーセン等（Gey
sen）,J.Immunol.Meth.,Vol.102,pgs.259-274（198
7）；またはPCT特許出願 WO 86/00991およびWO 86/064
87。
薬剤を用いた治療において重要な観点は、患者の血中ま
たは他の体液中濃度のレベルを予測および／またはモニ
ターすることが可能であることである。モノクローナル
抗体はこの目的に広く用いられる：たとえばスプリンガ
ー（Springer）,ed.,バイオサイエンスおよび医学にお
けるハイブリドーマ技術（Hybridoma Technology in th
e Bioscience and Medicine）（Plenum Press N.Y,198
5）；および米国特許4,562,003,4,486,530および4,255,
329。IL-4のような、遺伝子工学的タンパク質の生産に
おいては、発現したタンパク質を、形質転換した宿主細
胞および／またはそのカルチャー上清から分離すること
が大きな問題である。しばしば分離手順には、組成物を
一回もしくはそれ以上免疫吸体カラムに通さなければな
らない。このようなカラムの最も重要な要素は、精製し
たいタンパク質に特異性のあるモノクローナル抗体であ
る。このようなモノクローナル抗体はまた、特別な手
順、たとえば“ウエスタンブロッティング”で精製の達
成度を測定するにも用いることができる、バーネッテ
（Burnette）,Anal.Biochem.,Vol.112,pgs.195-203（19
81）。
たは他の体液中濃度のレベルを予測および／またはモニ
ターすることが可能であることである。モノクローナル
抗体はこの目的に広く用いられる：たとえばスプリンガ
ー（Springer）,ed.,バイオサイエンスおよび医学にお
けるハイブリドーマ技術（Hybridoma Technology in th
e Bioscience and Medicine）（Plenum Press N.Y,198
5）；および米国特許4,562,003,4,486,530および4,255,
329。IL-4のような、遺伝子工学的タンパク質の生産に
おいては、発現したタンパク質を、形質転換した宿主細
胞および／またはそのカルチャー上清から分離すること
が大きな問題である。しばしば分離手順には、組成物を
一回もしくはそれ以上免疫吸体カラムに通さなければな
らない。このようなカラムの最も重要な要素は、精製し
たいタンパク質に特異性のあるモノクローナル抗体であ
る。このようなモノクローナル抗体はまた、特別な手
順、たとえば“ウエスタンブロッティング”で精製の達
成度を測定するにも用いることができる、バーネッテ
（Burnette）,Anal.Biochem.,Vol.112,pgs.195-203（19
81）。
前述の理由によりIL-4に特異的なモノクローナル抗体お
よび／またはポリクロナール抗体の入手可用性は、現行
の精製法を改良したり、血液、尿などの体液中のIL-4濃
度をモニタリングする手段を供給することにより、医学
的および獣医学的な応用に利用することが明らかであ
る。
よび／またはポリクロナール抗体の入手可用性は、現行
の精製法を改良したり、血液、尿などの体液中のIL-4濃
度をモニタリングする手段を供給することにより、医学
的および獣医学的な応用に利用することが明らかであ
る。
発明の概要 本発明はヒト IL-4の検出、精製、測定および／または
阻害に有用な化合物および組成物を提供する。この化合
物および組成物はヒト IL-4に特異的なハイブリドーマ
産生由来のモノクローナル抗体である。この発明の化合
物および組成物はハイブリドーマそのもの、ハイブリド
ーマ産生モノクローナル抗体を含む。この発明はまた、
上記の化合物及び組成物を用いて、検出、精製、及びヒ
トIL-4の濃度を測定する方法、およびこれらの方法を実
施するためのキットを含む。特に、この発明はハイブリ
ドーマATCC HB9550（以下、IC1.11B4.6という）および
ATCC HB9809（以下、MP4.25D2.11という）およびその
モノクローナル抗体を含む。
阻害に有用な化合物および組成物を提供する。この化合
物および組成物はヒト IL-4に特異的なハイブリドーマ
産生由来のモノクローナル抗体である。この発明の化合
物および組成物はハイブリドーマそのもの、ハイブリド
ーマ産生モノクローナル抗体を含む。この発明はまた、
上記の化合物及び組成物を用いて、検出、精製、及びヒ
トIL-4の濃度を測定する方法、およびこれらの方法を実
施するためのキットを含む。特に、この発明はハイブリ
ドーマATCC HB9550（以下、IC1.11B4.6という）および
ATCC HB9809（以下、MP4.25D2.11という）およびその
モノクローナル抗体を含む。
本発明の組成物はヒトIL-4の作用剤および拮抗剤として
も有用となるであろう。特に抗 IL-4抗体に拮抗的なフ
ラグメント、例えば、MP4.25D2.11のモノクローナル抗
体はアトピー性疾患を治療するための治療剤として有用
である。
も有用となるであろう。特に抗 IL-4抗体に拮抗的なフ
ラグメント、例えば、MP4.25D2.11のモノクローナル抗
体はアトピー性疾患を治療するための治療剤として有用
である。
また、本明細書では、ハイブリドーマIC1.11B4.6および
MP4.25D2.11より抽出したメッセンジャーRNA（mRNA）も
記載する。このようなmRNAは、IC1.11B4.6およびMP4.25
D2.11抗体のフラグメントを，バクテリア、酵母、また
はその他の宿主の中でクローニングおよび発現する際に
有用である。
MP4.25D2.11より抽出したメッセンジャーRNA（mRNA）も
記載する。このようなmRNAは、IC1.11B4.6およびMP4.25
D2.11抗体のフラグメントを，バクテリア、酵母、また
はその他の宿主の中でクローニングおよび発現する際に
有用である。
抗体はジスルフィド結合で一緒に繋がっているポリペプ
チドの集合体より成る。ふたつの主要なポリペプチド鎖
はＬ鎖、Ｈ鎖と呼ばれ、抗体のすべての主要な構造上ク
ラス（isotype）を形成する。Ｈ鎖とＬ鎖は双方とも可
変領域および定常領域と呼ばれるサブ領域に、さらに分
けられる。Ｈ鎖はひとつの可変領域および３つの異なる
定常領域から成り、Ｌ鎖はひとつの可変領域（Ｈ鎖のも
のとは異なる）およびひとつの定常領域（Ｈ鎖のものと
は異なる）より成る。このＨ鎖およびＬ鎖の可変領域
は、抗体の結合特異性を担うものである。
チドの集合体より成る。ふたつの主要なポリペプチド鎖
はＬ鎖、Ｈ鎖と呼ばれ、抗体のすべての主要な構造上ク
ラス（isotype）を形成する。Ｈ鎖とＬ鎖は双方とも可
変領域および定常領域と呼ばれるサブ領域に、さらに分
けられる。Ｈ鎖はひとつの可変領域および３つの異なる
定常領域から成り、Ｌ鎖はひとつの可変領域（Ｈ鎖のも
のとは異なる）およびひとつの定常領域（Ｈ鎖のものと
は異なる）より成る。このＨ鎖およびＬ鎖の可変領域
は、抗体の結合特異性を担うものである。
ここで用いたＨ鎖可変領域はひとつのポリペプチドを意
味し、（１）これは110から125のアミノ酸鎖長であり、
（２）このアミノ酸配列は、本発明のモノクローナル抗
体のＨ鎖に対応し、Ｈ鎖のＮ末端アミノ酸から始まる。
同様にＬ鎖可変領域とはポリペプチドを意味し、（１）
これは95から115のアミノ酸鎖長であり、（２）このア
ミノ酸配列は、本発明のモノクローナル抗体のＨ鎖に対
応し、Ｌ鎖のＮ末端アミノ酸から始まる。
味し、（１）これは110から125のアミノ酸鎖長であり、
（２）このアミノ酸配列は、本発明のモノクローナル抗
体のＨ鎖に対応し、Ｈ鎖のＮ末端アミノ酸から始まる。
同様にＬ鎖可変領域とはポリペプチドを意味し、（１）
これは95から115のアミノ酸鎖長であり、（２）このア
ミノ酸配列は、本発明のモノクローナル抗体のＨ鎖に対
応し、Ｌ鎖のＮ末端アミノ酸から始まる。
Fab,Fc,F（ab）2,およびFvという用語は標準的な免疫学
的意味で使用さｒている：例えば．クレイン（Klein）,
Immunology（John Wiley,New York,1982），またはパー
ム（Parham）,Chapter 14,in Weir,ed.Immunochemistr
y,4th Ed.（Blackwell Scientific Publishers Oxford,
1986）。
的意味で使用さｒている：例えば．クレイン（Klein）,
Immunology（John Wiley,New York,1982），またはパー
ム（Parham）,Chapter 14,in Weir,ed.Immunochemistr
y,4th Ed.（Blackwell Scientific Publishers Oxford,
1986）。
ここで使用している“モノクローナル抗体”という用語
はヒト IL-4に特異的に結合することのできる免疫グロ
ブリの均一な集合体を呼ぶ言葉である。ヒト IL-4は、
（１）ヒト IL-4にあるシングルポリペプチド鎖より成
るペプチド抗原決定基、（２）ヒト IL-4ポリペプチド
配列の中にバラバラに存在しているペプチド鎖のひとつ
以上の特別な接触より成る構造的な抗原決定基（３）翻
訳後に部分的または全体的に炭水化物のような分子構造
の物が、ヒト IL-4に共有結合することよりなる翻訳後
の抗原決定基等より成るひとつ以上の抗原決定基を持つ
可能性があると解釈されている。本発明の抗体はひとつ
もしくはそれ以上のこのような決定基に対応しうる。
はヒト IL-4に特異的に結合することのできる免疫グロ
ブリの均一な集合体を呼ぶ言葉である。ヒト IL-4は、
（１）ヒト IL-4にあるシングルポリペプチド鎖より成
るペプチド抗原決定基、（２）ヒト IL-4ポリペプチド
配列の中にバラバラに存在しているペプチド鎖のひとつ
以上の特別な接触より成る構造的な抗原決定基（３）翻
訳後に部分的または全体的に炭水化物のような分子構造
の物が、ヒト IL-4に共有結合することよりなる翻訳後
の抗原決定基等より成るひとつ以上の抗原決定基を持つ
可能性があると解釈されている。本発明の抗体はひとつ
もしくはそれ以上のこのような決定基に対応しうる。
ここで使用している“結合組成物”とは、ふたつのポリ
ペプチド鎖からなる組成物、即ち、（１）機能的に会合
し、ヒト IL-4に高い親和性のある構造を帯び、且つ
（２）ハイブリドーマが生産する、ヒト IL-4に特異的
なモノクローナル抗体から誘導されたペプチド鎖の組み
合わせを意味する。“機能的に会合する”という言葉の
意味は、さまざまな手段により、例えばFabまたはFvの
ような天然の抗体フラグメントのようなふたつのポリペ
プチド鎖が結合するために互いに位置することなどを含
み、またはカルボキシ末端に遺伝子工学的に作成したシ
ステインを含むペプチドリンカーの方法による。通常こ
のふたつのポリペプチド鎖は、ヒト IL-4に特異的なモ
ノクローナル抗体のＬ鎖可変領域およびＨ鎖可変領域に
相当する。
ペプチド鎖からなる組成物、即ち、（１）機能的に会合
し、ヒト IL-4に高い親和性のある構造を帯び、且つ
（２）ハイブリドーマが生産する、ヒト IL-4に特異的
なモノクローナル抗体から誘導されたペプチド鎖の組み
合わせを意味する。“機能的に会合する”という言葉の
意味は、さまざまな手段により、例えばFabまたはFvの
ような天然の抗体フラグメントのようなふたつのポリペ
プチド鎖が結合するために互いに位置することなどを含
み、またはカルボキシ末端に遺伝子工学的に作成したシ
ステインを含むペプチドリンカーの方法による。通常こ
のふたつのポリペプチド鎖は、ヒト IL-4に特異的なモ
ノクローナル抗体のＬ鎖可変領域およびＨ鎖可変領域に
相当する。
図の簡単な説明 第１図はグリコシル化されていないヒトIL-4をバクテリ
アの宿主中で発現させるために適当な発現ベクターの模
式図であり； 第２図はヒト IL-4の最終精製段階においての、215nm
の吸収パターンを表し； 第３図Ａおよび第３図Ｂはそれぞれ、125I-CHO HulL-4
のDaudi細胞への結合阻害を示す。
アの宿主中で発現させるために適当な発現ベクターの模
式図であり； 第２図はヒト IL-4の最終精製段階においての、215nm
の吸収パターンを表し； 第３図Ａおよび第３図Ｂはそれぞれ、125I-CHO HulL-4
のDaudi細胞への結合阻害を示す。
発明の詳細な説明 本発明のハイブリドーマは周知の技術により生産され
る。通常その過程には、所望の抗体を生産するB-リンパ
球と、不滅化したセルラインとの融合が含まれる。ある
いは、抗体産生不滅化セルラインを作成するために、非
融合法も可能であり、この発明の範囲に含まれる、例え
ば、ウイルスで誘導した形質転換：カサリ質（Casal
i），“Ｂリンパ球の抗原特異性で得られるヒトのモノ
クローン細胞およびEBVによる形質転換（Human Monoclo
nals from Antigen-Specific Selection of B lymphocy
tes and Transformation by EBV"）,Science,Vol.234,p
gs.476-479（1986）．不滅化したセルラインは通常、哺
乳動物、特にげっし動物のミエローマ細胞、ウシ、およ
びヒトを起源とする形質転換された細胞である。最も頻
繁には、便利さと入手のし易さから、ラットまたはマウ
スミエローマ細胞が使用されている。
る。通常その過程には、所望の抗体を生産するB-リンパ
球と、不滅化したセルラインとの融合が含まれる。ある
いは、抗体産生不滅化セルラインを作成するために、非
融合法も可能であり、この発明の範囲に含まれる、例え
ば、ウイルスで誘導した形質転換：カサリ質（Casal
i），“Ｂリンパ球の抗原特異性で得られるヒトのモノ
クローン細胞およびEBVによる形質転換（Human Monoclo
nals from Antigen-Specific Selection of B lymphocy
tes and Transformation by EBV"）,Science,Vol.234,p
gs.476-479（1986）．不滅化したセルラインは通常、哺
乳動物、特にげっし動物のミエローマ細胞、ウシ、およ
びヒトを起源とする形質転換された細胞である。最も頻
繁には、便利さと入手のし易さから、ラットまたはマウ
スミエローマ細胞が使用されている。
目的の抗原を注射した哺乳動物から適切なリンパ球を得
る方法はよく知られている。一般的には、ヒトを起源と
した細胞を所望するのであれば、抹消血リンパ球（PBL
s）が用いられ、ヒトではない哺乳動物種を所望するの
であれば、脾臓細胞またはリンパ節細胞が用いられる。
宿主である哺乳動物は、精製抗原を注射投与され、不滅
化したセルラインに融合させるために収穫される前に、
所望の抗体を生産する細胞を作り出すようにされる。融
合に関する技術についても文献等で広く知られており、
一般的には細胞をポリエチレングリコールなどの融合剤
と一緒に混合する操作を含む。ハイリドーマは、HAT選
択法などの標準的な方法で選択する。これらのハイブリ
ドーマの中から、所望の抗体を分泌するものは、ウエス
タンブロッティング、ELISA,RIAなどの標準的なイムノ
アッセイ法でそれらの培養液をアッセイして選択され
る。抗体は、標準的なタンパク質精製技術、例えば、チ
ジュセン（Tijssen）エンザイムイムノアッセイの実際
と理論（Practice and Theory of Enzyme Immunoassay
s）（Elsevier,Amsterdam、1985）の方法を使用して培
養液より回収される。上記技術を応用するためのガイダ
ンスについては、数多くの文献を入手できる：例えば、
コーラー等（Kohler），ハイブリドー技術（Hybridoma
Techniques）（Cold Spring Harbor Laboratory,New Yo
rk,1980）；チジュセン（Tijssen）エンザイムイムノア
ッセイの実際と理論（Elsevier,Amsterdam,1985）；カ
ンプベル（Campbell），モノクローナル抗体技術（Mono
clonal Antibody Technology）（Elsevier,Amsterdam,1
984）；ファーレル（Hurrell）モノクローナルハイブリ
ドーマの抗体：技術と応用（Monoclonal Hybridoma Ant
ibodies:Technuques and Applications）（CRC Press,B
oca Raton,FL,1982）およびその他。
る方法はよく知られている。一般的には、ヒトを起源と
した細胞を所望するのであれば、抹消血リンパ球（PBL
s）が用いられ、ヒトではない哺乳動物種を所望するの
であれば、脾臓細胞またはリンパ節細胞が用いられる。
宿主である哺乳動物は、精製抗原を注射投与され、不滅
化したセルラインに融合させるために収穫される前に、
所望の抗体を生産する細胞を作り出すようにされる。融
合に関する技術についても文献等で広く知られており、
一般的には細胞をポリエチレングリコールなどの融合剤
と一緒に混合する操作を含む。ハイリドーマは、HAT選
択法などの標準的な方法で選択する。これらのハイブリ
ドーマの中から、所望の抗体を分泌するものは、ウエス
タンブロッティング、ELISA,RIAなどの標準的なイムノ
アッセイ法でそれらの培養液をアッセイして選択され
る。抗体は、標準的なタンパク質精製技術、例えば、チ
ジュセン（Tijssen）エンザイムイムノアッセイの実際
と理論（Practice and Theory of Enzyme Immunoassay
s）（Elsevier,Amsterdam、1985）の方法を使用して培
養液より回収される。上記技術を応用するためのガイダ
ンスについては、数多くの文献を入手できる：例えば、
コーラー等（Kohler），ハイブリドー技術（Hybridoma
Techniques）（Cold Spring Harbor Laboratory,New Yo
rk,1980）；チジュセン（Tijssen）エンザイムイムノア
ッセイの実際と理論（Elsevier,Amsterdam,1985）；カ
ンプベル（Campbell），モノクローナル抗体技術（Mono
clonal Antibody Technology）（Elsevier,Amsterdam,1
984）；ファーレル（Hurrell）モノクローナルハイブリ
ドーマの抗体：技術と応用（Monoclonal Hybridoma Ant
ibodies:Technuques and Applications）（CRC Press,B
oca Raton,FL,1982）およびその他。
抗体フラグメントの使用および作成に関しても周知であ
る；例えば、Fabフラグメントについては：チジュセン
（Tijssen），エンザイムイムノアッセイの実際と理
論）（Elsevier,Amsterdam,1985）；およびFvフラグメ
ントについては：ホフマン等（Hochman）,Biochemistr
y,Vol.12,pgs.1130-1135（1973），シャーロン等（Shar
on）,Biochemistry,Vol.15,pgs 1591-1954（1976）およ
びエーリッヒ等（Ehrlich），米国特許4,355,023;およ
び抗体の半量体については：オーディトレ‐ハーグリベ
ース（Auditore-Hargreaves），米国特許4,470,925。さ
らに本発明の化合物および組成物は、周知の技術により
二重特異抗体を構築するためにも使用できる；たとえば
ハイブリドーマのさらに再度の融合（すなわちクワドロ
ーマ（quadromas）と呼ばれているものを形成する）：
リーディング（Reading），米国特許4,474,493;または
半量体の化学的再会合による：ブレンナン等（Brenna
n）,Science,Vol.229,pgs,81-83（1985）。
る；例えば、Fabフラグメントについては：チジュセン
（Tijssen），エンザイムイムノアッセイの実際と理
論）（Elsevier,Amsterdam,1985）；およびFvフラグメ
ントについては：ホフマン等（Hochman）,Biochemistr
y,Vol.12,pgs.1130-1135（1973），シャーロン等（Shar
on）,Biochemistry,Vol.15,pgs 1591-1954（1976）およ
びエーリッヒ等（Ehrlich），米国特許4,355,023;およ
び抗体の半量体については：オーディトレ‐ハーグリベ
ース（Auditore-Hargreaves），米国特許4,470,925。さ
らに本発明の化合物および組成物は、周知の技術により
二重特異抗体を構築するためにも使用できる；たとえば
ハイブリドーマのさらに再度の融合（すなわちクワドロ
ーマ（quadromas）と呼ばれているものを形成する）：
リーディング（Reading），米国特許4,474,493;または
半量体の化学的再会合による：ブレンナン等（Brenna
n）,Science,Vol.229,pgs,81-83（1985）。
本発明のハイブリドーマおよびモノクローナル抗体は、
遺伝子組み替えで製造した成熟ヒト IL-4のグリコシル
化されたタイプもしくはグリコシル化されていないタイ
プのどちらかに対して生産される。一般的にグリコシル
化されていないタイプのヒト IL-4はE.Coli中で生産さ
れ、グリコシル化されたタイプのものは哺乳動物の宿主
細胞、例えばCV1又はサルのCOS細胞、マウスＬ細胞など
の中で生産される。遺伝子組み換えで生産された成熟ヒ
トIL-4は、標準的な手順を用いて、発現ベクターを宿主
細胞に導入して生産される；例えば、マニアチス等（Ma
niatis），モレキュラークローニング；ラボラトリーマ
ニュアル（Molecular Cloning;A Laboratory Manual）
（Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1982）；
オカヤマおよびバーグ（Okayama and Berg）、Mol.Cel
l.Biol,Vol.2,pgs.161-170（1982）およびVol.3,pgs.28
0-289（1983）；ハーマー（Hamer）,Genetic Engineeri
ng,Vol.2,pgs.83-100（1980）および米国特許4,599,30
8;カウフマン等（Kaufman）,Mol.Cell.Biol.Vol.2,pgs.
1304-1319（1982）；等である。
遺伝子組み替えで製造した成熟ヒト IL-4のグリコシル
化されたタイプもしくはグリコシル化されていないタイ
プのどちらかに対して生産される。一般的にグリコシル
化されていないタイプのヒト IL-4はE.Coli中で生産さ
れ、グリコシル化されたタイプのものは哺乳動物の宿主
細胞、例えばCV1又はサルのCOS細胞、マウスＬ細胞など
の中で生産される。遺伝子組み換えで生産された成熟ヒ
トIL-4は、標準的な手順を用いて、発現ベクターを宿主
細胞に導入して生産される；例えば、マニアチス等（Ma
niatis），モレキュラークローニング；ラボラトリーマ
ニュアル（Molecular Cloning;A Laboratory Manual）
（Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1982）；
オカヤマおよびバーグ（Okayama and Berg）、Mol.Cel
l.Biol,Vol.2,pgs.161-170（1982）およびVol.3,pgs.28
0-289（1983）；ハーマー（Hamer）,Genetic Engineeri
ng,Vol.2,pgs.83-100（1980）および米国特許4,599,30
8;カウフマン等（Kaufman）,Mol.Cell.Biol.Vol.2,pgs.
1304-1319（1982）；等である。
一度所望タンパク質をコードするヌクレオチド配列が知
られるか、またはさもなければ入手できれば、バクテリ
アまたは哺乳動物物の発現ベクターの構築は、文献など
で周知である。例えばデボワー（DeBoer）は米国特許4,
511,433の中でバクテリアの発現ベクターに使用される
プロモーターを開示し；ゲデル等（Goeddel）は米国特
許4,601,980の中で、およびリッグス（Riggs）は米国特
許4,431,739はの中でE.Coliの発現システムによる哺乳
動物のタンパク質の生産を開示し；リッグス（上述）、
フェレティ等（Ferretti）,Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.8
3 pgs.599-603（1986），スプロウト等（Sproat）,Nucl
eic Acid Research,Vol.13,pgs.2959-2977（1985），お
よびムーレンバッハ等（Mullenbach）,J.Biol Chem.,Vo
l.261,pgs.719-722（1986），はバクテリア内での発現
のためにどのように合成遺伝子を構築するかを開示して
いる。それゆえにこれらの文献の内容によって本明細書
に含まれている。成熟ヒト IL-4のアミノ酸配列はヨコ
タ（Yokota）等（上述）によって、開示されておりまた
ヨコタ（Yokota）等（上述）によって記載されたpcDベ
クターが運ぶヒトIL-4をコードしているcDNAはRockvill
e,MD,American Type Culture Collection（ATCC）に寄
託されている：寄託番号67029。多くのバクテリア発現
ベクターおよび宿主は、市販されており、またはATCCを
通じて入手できる。好ましくは、宿手動物を免疫するヒ
トIL-4は、すでに述べたpcDベクターによって暫時にト
ランスフェクションされた、COS,CV1,またはマウスＬ細
胞の培養上清から単離される。本発明のハイブリドーマ
に特徴的な抗体IC1.11B4.6は、メッセンジャーRNAの抽
出、cDNAライブラリーの構築、この抗体分子の部分をコ
ードしているクローンの選択、による遺伝子工学的な手
段を用いて生産することもできる：例えばウォール等
（Wall）,Nucleic Acid Research,Vol.5 pgs.3113-3128
（1978）；ザルスト等（Zalsut）,Nucleic Acid Resear
ch,Vol.8,pgs.3591-3601（1980）；カビリー等（Cabill
y）,Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.81,pgs.3273-3277（198
4）；ボス等（Boss）,Nucleic Acids Research,Vol.12.
pgs.3791-3806（1984）アムスター等（Amster）,Nuclei
c Acids Research,Vol.8,pgs.2055-2065（1980）；およ
びモーア等（Moore），米国特許4,642,234。特にこのよ
うな技術は異種間のモノクローナル抗体、その中には一
種に対する結合領域がもう一種の抗体の非結合領域とつ
ながっているものを生産するのにも利用できる；たとえ
ばリゥー等（Liu）,Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.84,pgs.3
439-3443（1987）。
られるか、またはさもなければ入手できれば、バクテリ
アまたは哺乳動物物の発現ベクターの構築は、文献など
で周知である。例えばデボワー（DeBoer）は米国特許4,
511,433の中でバクテリアの発現ベクターに使用される
プロモーターを開示し；ゲデル等（Goeddel）は米国特
許4,601,980の中で、およびリッグス（Riggs）は米国特
許4,431,739はの中でE.Coliの発現システムによる哺乳
動物のタンパク質の生産を開示し；リッグス（上述）、
フェレティ等（Ferretti）,Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.8
3 pgs.599-603（1986），スプロウト等（Sproat）,Nucl
eic Acid Research,Vol.13,pgs.2959-2977（1985），お
よびムーレンバッハ等（Mullenbach）,J.Biol Chem.,Vo
l.261,pgs.719-722（1986），はバクテリア内での発現
のためにどのように合成遺伝子を構築するかを開示して
いる。それゆえにこれらの文献の内容によって本明細書
に含まれている。成熟ヒト IL-4のアミノ酸配列はヨコ
タ（Yokota）等（上述）によって、開示されておりまた
ヨコタ（Yokota）等（上述）によって記載されたpcDベ
クターが運ぶヒトIL-4をコードしているcDNAはRockvill
e,MD,American Type Culture Collection（ATCC）に寄
託されている：寄託番号67029。多くのバクテリア発現
ベクターおよび宿主は、市販されており、またはATCCを
通じて入手できる。好ましくは、宿手動物を免疫するヒ
トIL-4は、すでに述べたpcDベクターによって暫時にト
ランスフェクションされた、COS,CV1,またはマウスＬ細
胞の培養上清から単離される。本発明のハイブリドーマ
に特徴的な抗体IC1.11B4.6は、メッセンジャーRNAの抽
出、cDNAライブラリーの構築、この抗体分子の部分をコ
ードしているクローンの選択、による遺伝子工学的な手
段を用いて生産することもできる：例えばウォール等
（Wall）,Nucleic Acid Research,Vol.5 pgs.3113-3128
（1978）；ザルスト等（Zalsut）,Nucleic Acid Resear
ch,Vol.8,pgs.3591-3601（1980）；カビリー等（Cabill
y）,Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.81,pgs.3273-3277（198
4）；ボス等（Boss）,Nucleic Acids Research,Vol.12.
pgs.3791-3806（1984）アムスター等（Amster）,Nuclei
c Acids Research,Vol.8,pgs.2055-2065（1980）；およ
びモーア等（Moore），米国特許4,642,234。特にこのよ
うな技術は異種間のモノクローナル抗体、その中には一
種に対する結合領域がもう一種の抗体の非結合領域とつ
ながっているものを生産するのにも利用できる；たとえ
ばリゥー等（Liu）,Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.84,pgs.3
439-3443（1987）。
モノクローナル抗体を精製および測定に利用することは
よく知られている、例えばアフィニティクロマトグラフ
ィーについては、アフィニティークロマトグラフィー：
原理と方法（Affinity Chromatography:Principles and
Methods）（Pharmacia,Orebro,Sweden,1979）；セッチ
ャー等（Secher）,Nature,Vol.285,pgs.446-450（198
0），および米国特許4,423,147;およびヨーロッパ特許
出願0190711（13 August 1986）；およびイムノアッセ
イ技術：チジュセン（Tijssen）（上述）；米国特許4,4
86,530;およびバーネッテ（Burnette）（上述）。アフ
ィニティクロマトグラフィーは、ヒト IL-4発現ベクタ
ーで形質転換またはトランスフェクションした細胞の培
養上澄のようなサンプルからIL-4を抽出しヒトIL-4を精
製するために使用できる。このような精製過程をここで
は免疫精製プロセスと呼んでいる。典型的には、これに
は、ヒト IL-4に特異的なモノクローナル抗体が共有結
合で結合している固相支持体（ここでは“免疫吸着体”
と呼ぶ）が採用され、これはサンプルが通過するカラム
またはチャンバーに置かれる。サンプルからのヒトIL-4
は、この結合したモノクローナル抗体の結合部位に良く
結合し、一方のサンプルの残りの物質はカラムもしくは
チャンバーから洗い出される。ヒト IL-4はその後、標
準的な技術、たとえば低いpH、高濃度の塩、などでこの
免疫吸着体から溶出される。
よく知られている、例えばアフィニティクロマトグラフ
ィーについては、アフィニティークロマトグラフィー：
原理と方法（Affinity Chromatography:Principles and
Methods）（Pharmacia,Orebro,Sweden,1979）；セッチ
ャー等（Secher）,Nature,Vol.285,pgs.446-450（198
0），および米国特許4,423,147;およびヨーロッパ特許
出願0190711（13 August 1986）；およびイムノアッセ
イ技術：チジュセン（Tijssen）（上述）；米国特許4,4
86,530;およびバーネッテ（Burnette）（上述）。アフ
ィニティクロマトグラフィーは、ヒト IL-4発現ベクタ
ーで形質転換またはトランスフェクションした細胞の培
養上澄のようなサンプルからIL-4を抽出しヒトIL-4を精
製するために使用できる。このような精製過程をここで
は免疫精製プロセスと呼んでいる。典型的には、これに
は、ヒト IL-4に特異的なモノクローナル抗体が共有結
合で結合している固相支持体（ここでは“免疫吸着体”
と呼ぶ）が採用され、これはサンプルが通過するカラム
またはチャンバーに置かれる。サンプルからのヒトIL-4
は、この結合したモノクローナル抗体の結合部位に良く
結合し、一方のサンプルの残りの物質はカラムもしくは
チャンバーから洗い出される。ヒト IL-4はその後、標
準的な技術、たとえば低いpH、高濃度の塩、などでこの
免疫吸着体から溶出される。
“ツーサイト”（Tow site）または“サンドイッチ”イ
ムノアッセイは、本発明において好んで用いられるイム
ノアッセイである。例えば、米国特許4,486,530にて開
示されている。ゆえにこの特許は参考により編入され
る。このようなアッセイは、少なくとも一方の抗体がIC
1.11B4.6により生産されるような本発明のモノクローナ
ル抗体より成る抗‐IL-4抗体のふたつの異なる組み合わ
せの使用を要する。このふたつの組み合わせのうちのひ
とつは固相支持体の表面についている。この結合してい
る抗体はその後ヒトIL-4が含まれていると予想されるサ
ンプルにさらされる。IL-4分子はこの固相に固定された
抗体に結合する。第二抗体の組み合わせが、結合してい
るIL-4に添加され、そしてこの第二抗体は第一抗体の組
み合わせが結合した抗原決定基とは別のひとつもしくは
それ以上の抗原決定基と結合する。このIL-4はその後、
第二抗体と関係する間接的または，直接的なシグナル−
形成手段により検出される。例えば、第二抗体は、酵
素、希土類キレーター、または有機色素等のシグナル形
成部分と直接結合させておくことができる。または、第
二抗体はさらに加えた抗体を通してまたはアビジン−ビ
チオン化合物のような親和性の高い複合物を通してひと
つもしくはそれ以上のシグナル形成部分と間接的に結合
させることができる。
ムノアッセイは、本発明において好んで用いられるイム
ノアッセイである。例えば、米国特許4,486,530にて開
示されている。ゆえにこの特許は参考により編入され
る。このようなアッセイは、少なくとも一方の抗体がIC
1.11B4.6により生産されるような本発明のモノクローナ
ル抗体より成る抗‐IL-4抗体のふたつの異なる組み合わ
せの使用を要する。このふたつの組み合わせのうちのひ
とつは固相支持体の表面についている。この結合してい
る抗体はその後ヒトIL-4が含まれていると予想されるサ
ンプルにさらされる。IL-4分子はこの固相に固定された
抗体に結合する。第二抗体の組み合わせが、結合してい
るIL-4に添加され、そしてこの第二抗体は第一抗体の組
み合わせが結合した抗原決定基とは別のひとつもしくは
それ以上の抗原決定基と結合する。このIL-4はその後、
第二抗体と関係する間接的または，直接的なシグナル−
形成手段により検出される。例えば、第二抗体は、酵
素、希土類キレーター、または有機色素等のシグナル形
成部分と直接結合させておくことができる。または、第
二抗体はさらに加えた抗体を通してまたはアビジン−ビ
チオン化合物のような親和性の高い複合物を通してひと
つもしくはそれ以上のシグナル形成部分と間接的に結合
させることができる。
IL-4濃度の定量的な測定は、サンプルが形成したシグナ
ルとヒト IL-4を既知の濃度で含むIL-4スタンダードが
形成するシグナルを比較して行われる。
ルとヒト IL-4を既知の濃度で含むIL-4スタンダードが
形成するシグナルを比較して行われる。
本発明はイムノアッセイ、特にサンドイッチアッセイに
用いる試薬のキットを含む。そのようなキットは（１）
固相支持体（２）モノクローナルであり、ヒトIL-4の第
一の抗原決定基に結合できるATCC HB9550またはATCC
HB9809によって産生された第一抗体（３）ヒトIL-4の第
二の抗原決定基に結合できるモノクローナル抗体である
群から選択される第二抗体、およびヒトIL-4に特異的な
ポリクローナル抗体（ここではポリクローナル抗体組成
物と呼ばれる）かつ（４）この３つの抗体のいずれかひ
とつと結合したシグナル形成手段を含む。個別の実施様
態によって、キットは、３種の抗‐IL-4抗体タイプの使
用について２つの選択枝を有する、すなわち第一抗原決
定基に特異的なモノクローナル抗体および第二抗原決定
基に特異的なモノクール抗体とポリクローナル抗体組成
物との使用、または、第一もしくは第二抗原決定基に特
異的なモノクローナル抗体とポリクローナル抗体組成物
である。この抗体は溶液状でも乾燥状態でもよい。この
抗体の組み合わせの一つは、キットを使用する時に固相
支持体の表面に添加することもできうるし、あらかじめ
固相支持体につけておくことも可能である。シグナル形
成手段は、ふたつの抗体のタイプのどちらかひとつにあ
らかじめ結合させておくか、または使用前にひとつもし
くはそれ以上の成分、例えばバッファー、抗体‐酵素結
合体、酵素基質、と組み合わせることが必要である。多
くのタイプのシグナル形成手段が入手でき、キットのひ
とつもしくはそれ以上の成分を構成できる。さまざまの
シグナル形成手段がチジセン（Tijssen）（上述）によ
って開示されている。本発明のキットは、さらに次のよ
うな試薬、例えば固相表面の非特異的吸着を減らすため
のブロッキング剤、洗浄剤、酵素基質等をも含みうる。
この固相表面は、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン等のタ
ンパク質を固定化するのに適した素材でできたマイクロ
タイタープレート、ミクロスフェア等で形成されうる。
固相表面をもつこのような物質をここでは“支持体手
段”と呼ぶ。好ましくは、蛍光または有色産物の形成を
触媒する酵素がこのシグナル形成手段の成分である。さ
らに好ましくは、この酵素は、パーオキシダーゼ、アル
カリフォスファターゼ、およびベータガラクトシダーゼ
のグループの中から選択される。これらの酵素の基質お
よび反応条件は文献にて明らかである；例えばチジセン
（Tijssen）（上述）。
用いる試薬のキットを含む。そのようなキットは（１）
固相支持体（２）モノクローナルであり、ヒトIL-4の第
一の抗原決定基に結合できるATCC HB9550またはATCC
HB9809によって産生された第一抗体（３）ヒトIL-4の第
二の抗原決定基に結合できるモノクローナル抗体である
群から選択される第二抗体、およびヒトIL-4に特異的な
ポリクローナル抗体（ここではポリクローナル抗体組成
物と呼ばれる）かつ（４）この３つの抗体のいずれかひ
とつと結合したシグナル形成手段を含む。個別の実施様
態によって、キットは、３種の抗‐IL-4抗体タイプの使
用について２つの選択枝を有する、すなわち第一抗原決
定基に特異的なモノクローナル抗体および第二抗原決定
基に特異的なモノクール抗体とポリクローナル抗体組成
物との使用、または、第一もしくは第二抗原決定基に特
異的なモノクローナル抗体とポリクローナル抗体組成物
である。この抗体は溶液状でも乾燥状態でもよい。この
抗体の組み合わせの一つは、キットを使用する時に固相
支持体の表面に添加することもできうるし、あらかじめ
固相支持体につけておくことも可能である。シグナル形
成手段は、ふたつの抗体のタイプのどちらかひとつにあ
らかじめ結合させておくか、または使用前にひとつもし
くはそれ以上の成分、例えばバッファー、抗体‐酵素結
合体、酵素基質、と組み合わせることが必要である。多
くのタイプのシグナル形成手段が入手でき、キットのひ
とつもしくはそれ以上の成分を構成できる。さまざまの
シグナル形成手段がチジセン（Tijssen）（上述）によ
って開示されている。本発明のキットは、さらに次のよ
うな試薬、例えば固相表面の非特異的吸着を減らすため
のブロッキング剤、洗浄剤、酵素基質等をも含みうる。
この固相表面は、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン等のタ
ンパク質を固定化するのに適した素材でできたマイクロ
タイタープレート、ミクロスフェア等で形成されうる。
固相表面をもつこのような物質をここでは“支持体手
段”と呼ぶ。好ましくは、蛍光または有色産物の形成を
触媒する酵素がこのシグナル形成手段の成分である。さ
らに好ましくは、この酵素は、パーオキシダーゼ、アル
カリフォスファターゼ、およびベータガラクトシダーゼ
のグループの中から選択される。これらの酵素の基質お
よび反応条件は文献にて明らかである；例えばチジセン
（Tijssen）（上述）。
本発明で述べる組成物は、直接IL-4関連疾患に対する薬
物組成物としても使用できる。作用薬としての効用を持
つモノクローナル抗体（または、それらの結合フラグメ
ント）より成る薬剤組成物は、IL-4活性を強めるために
使用できる。または、拮抗薬としての効用を持つモノク
ローナル抗体（または、それらの結合フラグメント）
は、IL-4活性を抑制するために使用できる。このような
組成物は、本発明のモノクローナル抗体またはそれらの
結合フラグメントの少なくとも一つを、薬学的に効果的
なキャリアー中に治療に有効な量で含んでいる。薬学的
なキャリアーは、この発明の組成物を患者に与える際に
適当な生体適合性がある非毒性な任意のものである。滅
菌水、アルコール、脂質、ワックスおよび生体に不活性
な固体等がキャリアーに含まれる。薬学的に受け入れら
れる補助薬（バッファー試薬、分散剤）もこの薬剤組成
物に組み込まれうる。一般的に、このような薬剤の非経
口適用として有効な組成物は周知である；例えば、Remi
ngton′s Pharmaceutical Science,15th Ed.（Mack Pub
lishing Company,Easton,PA,1980）。もうひとつの方法
として、本発明の組成は薬剤埋没運搬システムによって
患者の体に導入されうる。；たとえば、ウルクハルト等
（Urquhart）,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.,Vol.24,pg
s.199-236（1984）。
物組成物としても使用できる。作用薬としての効用を持
つモノクローナル抗体（または、それらの結合フラグメ
ント）より成る薬剤組成物は、IL-4活性を強めるために
使用できる。または、拮抗薬としての効用を持つモノク
ローナル抗体（または、それらの結合フラグメント）
は、IL-4活性を抑制するために使用できる。このような
組成物は、本発明のモノクローナル抗体またはそれらの
結合フラグメントの少なくとも一つを、薬学的に効果的
なキャリアー中に治療に有効な量で含んでいる。薬学的
なキャリアーは、この発明の組成物を患者に与える際に
適当な生体適合性がある非毒性な任意のものである。滅
菌水、アルコール、脂質、ワックスおよび生体に不活性
な固体等がキャリアーに含まれる。薬学的に受け入れら
れる補助薬（バッファー試薬、分散剤）もこの薬剤組成
物に組み込まれうる。一般的に、このような薬剤の非経
口適用として有効な組成物は周知である；例えば、Remi
ngton′s Pharmaceutical Science,15th Ed.（Mack Pub
lishing Company,Easton,PA,1980）。もうひとつの方法
として、本発明の組成は薬剤埋没運搬システムによって
患者の体に導入されうる。；たとえば、ウルクハルト等
（Urquhart）,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.,Vol.24,pg
s.199-236（1984）。
実施例 以下の実施例は本発明を説明するために供する。試薬の
濃度、温度、その他の変更可能な値は、ベクターおよび
宿主の選択と同様、本発明の例示のために示しただけで
あり、本発明の制限を考慮したものではない。
濃度、温度、その他の変更可能な値は、ベクターおよび
宿主の選択と同様、本発明の例示のために示しただけで
あり、本発明の制限を考慮したものではない。
実施例I. pcD-ヒト−IL-4にて遺伝子導入したCOS 7サ
ル細胞によるグリコシル化ヒトIL-4の生産 発現ベクターpcD-ヒト−IL-4及び宿主細胞COS 7はそれ
ぞれアメリカン セルカルチャー コレクション（ATC
C）から寄託番号67029およびCRL 1651として入手でき
る。このpcD-ヒト−IL-4クローンは増幅され、プラスミ
ドDNAは精製され、その後にCOS 7に遺伝子導入するため
に標準的な遺伝子導入の手順が用いられた：約１×106
のCOS 7細胞が、ダルベッコの改良イーグル培地DME、10
％胎児子牛血清、および4mM L-グルタミンを含む100mm.
組織培養プレートに接種される。接種約24時間後、この
培地はプレートから吸引除去され、細胞は無血清バッフ
ァー（50mM トリス）DMEで２回洗浄される。各々のプレ
ートに4mlの無血清バッファーDME（4mMのL-グルタミを
含む）、80マイクロリットルのDEAE-Dextran,および５
マイクログラムのpcD-ヒト−IL-4 DNAが加えられる。こ
の細胞はこの混合液の中で４時間、30℃でインキュベー
トされ、この混合液が吸引除去され、細胞は無血清バッ
ファーDMEにて１回洗浄される。洗浄後、各々のプレー
トに4mM L-グルタミンを含む5mlのDME,100μＭクロロキ
ン、および２％胎児子牛血清が加えられ、細胞は３時間
インキュベートされた後、無血清バッファーDMEにて２
回洗浄される。次に4ml L-グルタミンを含むDME5mlおよ
び４％胎児子牛血清を含む5mlのDMEが加えられ、細胞は
37℃で24時間インキュベートされる。その後に、細胞は
DMEまたはPBSで1-3回洗浄され、5mlの無血清 DME（4mM
のL-グルタミンを含む）が加えられて５日後に培養上清
が採り入れられるまで37℃でインキュベートされる。
ル細胞によるグリコシル化ヒトIL-4の生産 発現ベクターpcD-ヒト−IL-4及び宿主細胞COS 7はそれ
ぞれアメリカン セルカルチャー コレクション（ATC
C）から寄託番号67029およびCRL 1651として入手でき
る。このpcD-ヒト−IL-4クローンは増幅され、プラスミ
ドDNAは精製され、その後にCOS 7に遺伝子導入するため
に標準的な遺伝子導入の手順が用いられた：約１×106
のCOS 7細胞が、ダルベッコの改良イーグル培地DME、10
％胎児子牛血清、および4mM L-グルタミンを含む100mm.
組織培養プレートに接種される。接種約24時間後、この
培地はプレートから吸引除去され、細胞は無血清バッフ
ァー（50mM トリス）DMEで２回洗浄される。各々のプレ
ートに4mlの無血清バッファーDME（4mMのL-グルタミを
含む）、80マイクロリットルのDEAE-Dextran,および５
マイクログラムのpcD-ヒト−IL-4 DNAが加えられる。こ
の細胞はこの混合液の中で４時間、30℃でインキュベー
トされ、この混合液が吸引除去され、細胞は無血清バッ
ファーDMEにて１回洗浄される。洗浄後、各々のプレー
トに4mM L-グルタミンを含む5mlのDME,100μＭクロロキ
ン、および２％胎児子牛血清が加えられ、細胞は３時間
インキュベートされた後、無血清バッファーDMEにて２
回洗浄される。次に4ml L-グルタミンを含むDME5mlおよ
び４％胎児子牛血清を含む5mlのDMEが加えられ、細胞は
37℃で24時間インキュベートされる。その後に、細胞は
DMEまたはPBSで1-3回洗浄され、5mlの無血清 DME（4mM
のL-グルタミンを含む）が加えられて５日後に培養上清
が採り入れられるまで37℃でインキュベートされる。
実施例 II. 遺伝子導入COS 7上清からグリコシル化ヒ
ト−IL-4の精製 A.精製のための生物学的活性測定 実施例 I.に従って生産された上清からヒト IL-4を精
製する過程でIL-4活性を測定するためにＴ細胞成長因子
（TCGF）活性が用いられた。TCGF活性のためのいくつか
の標準的な活性測定法が報告されている。：たとえばデ
ボス等（Devos）,Nucleic Acid Research,Vol.11,pgs.4
307-4323（1983）；チーアマン等（Thurman）,J.Biol.R
esponseModifiers,Vol.5,pgs.85-107（1986）；および
ロバートーガロフ等（Robert-Guroff,第９章、ガロフE
d.成長および成熟因子（Growth and Maturation Factor
s）（John Wiley,New York,1984）。一般的にこのTCGF
活性測定は、TCGF因子が末梢Ｔリンパ球またはIL-2依存
性Ｔ細胞ラインの増殖を促進する能力に基ずく；例え
ば、ギリス等（Gillis）J.Immunol.,Vol.120 pgs.2027
（1978）。増殖は標準的な方法、たとえばトリチウム標
識されたチミジンの取り込みまたは比色定量法により測
定できる：モスマン（Mosmann）,J.Immunol.Meth.,Vol.
65,pgs.55−63（1983）。ヒト IL-4 TCGFの活性測定
は、次のように行われた：健康者より得た血液をヘパリ
ン処理した試験管に入れ、フィコールハイパック（Fico
ll-Hypaque）を重層した；例えば、15mlの遠心用試験管
の中に3mlのフィコールハイパックに対して5mlの血液を
入れた。3000×g,20分遠心した後、境界層にある細胞を
吸引採取し、10％胎児子牛血清、50μM2-メルカプトエ
タノール、20μg/mlフィトヘマアグルチニン（PHA）お
よびリコンビナントヒトIL-2を含むRPMI 1640組成の成
長培地で希釈された。37℃で5-10日L-インキュベートし
た後、このPHA-刺激末梢血リンパ球（PBLs）は洗浄さ
れ、２日間の比色定量に使われた（モスマン上述）。IL
-4標準（pcD-ヒト−IL-4を遺伝子導入したCOS 7細胞由
来の上清）または被験用フラクションは、上述の成長培
地をもちいて、連続的に２倍希釈して96-ウエルのトレ
イの中で最終容量が50μl/ウエルとなるようにした。50
μｌのPHA-刺激末梢リンパ球が約4-8×106細胞/mlで各
ウエルに添加され、トレイは、37℃で２日間インキュベ
ートされた。細胞の成長はその後モスマン（上述）の方
法にて測定された。
ト−IL-4の精製 A.精製のための生物学的活性測定 実施例 I.に従って生産された上清からヒト IL-4を精
製する過程でIL-4活性を測定するためにＴ細胞成長因子
（TCGF）活性が用いられた。TCGF活性のためのいくつか
の標準的な活性測定法が報告されている。：たとえばデ
ボス等（Devos）,Nucleic Acid Research,Vol.11,pgs.4
307-4323（1983）；チーアマン等（Thurman）,J.Biol.R
esponseModifiers,Vol.5,pgs.85-107（1986）；および
ロバートーガロフ等（Robert-Guroff,第９章、ガロフE
d.成長および成熟因子（Growth and Maturation Factor
s）（John Wiley,New York,1984）。一般的にこのTCGF
活性測定は、TCGF因子が末梢Ｔリンパ球またはIL-2依存
性Ｔ細胞ラインの増殖を促進する能力に基ずく；例え
ば、ギリス等（Gillis）J.Immunol.,Vol.120 pgs.2027
（1978）。増殖は標準的な方法、たとえばトリチウム標
識されたチミジンの取り込みまたは比色定量法により測
定できる：モスマン（Mosmann）,J.Immunol.Meth.,Vol.
65,pgs.55−63（1983）。ヒト IL-4 TCGFの活性測定
は、次のように行われた：健康者より得た血液をヘパリ
ン処理した試験管に入れ、フィコールハイパック（Fico
ll-Hypaque）を重層した；例えば、15mlの遠心用試験管
の中に3mlのフィコールハイパックに対して5mlの血液を
入れた。3000×g,20分遠心した後、境界層にある細胞を
吸引採取し、10％胎児子牛血清、50μM2-メルカプトエ
タノール、20μg/mlフィトヘマアグルチニン（PHA）お
よびリコンビナントヒトIL-2を含むRPMI 1640組成の成
長培地で希釈された。37℃で5-10日L-インキュベートし
た後、このPHA-刺激末梢血リンパ球（PBLs）は洗浄さ
れ、２日間の比色定量に使われた（モスマン上述）。IL
-4標準（pcD-ヒト−IL-4を遺伝子導入したCOS 7細胞由
来の上清）または被験用フラクションは、上述の成長培
地をもちいて、連続的に２倍希釈して96-ウエルのトレ
イの中で最終容量が50μl/ウエルとなるようにした。50
μｌのPHA-刺激末梢リンパ球が約4-8×106細胞/mlで各
ウエルに添加され、トレイは、37℃で２日間インキュベ
ートされた。細胞の成長はその後モスマン（上述）の方
法にて測定された。
ここで用いている１ユニットとは、１ウエル（0.1ml）
あたり48時間中に２×104のPHA-刺激末梢リンパ球の増
殖を最大50％刺激する因子の量である。
あたり48時間中に２×104のPHA-刺激末梢リンパ球の増
殖を最大50％刺激する因子の量である。
B.精製 精製は陽イオンクロマトグラフィー、ゲル濾過、および
逆相高圧液体クロマトグラフィーを連続的に使用して行
った。すべての操作は４℃で行った。
逆相高圧液体クロマトグラフィーを連続的に使用して行
った。すべての操作は４℃で行った。
COS 7細胞は遠心により除去され、その上清は限外濾過
によって10倍に濃縮され、次の操作まで‐80℃にて保存
された。IL-4の力価は、このタンパク質が、フィトヘマ
アグルチニンで誘導されたヒト末梢血リンパ球の増殖を
刺激する能力として測定して決定した、すなわち上述し
た標準活性測定法をもちいたTCGF活性による。
によって10倍に濃縮され、次の操作まで‐80℃にて保存
された。IL-4の力価は、このタンパク質が、フィトヘマ
アグルチニンで誘導されたヒト末梢血リンパ球の増殖を
刺激する能力として測定して決定した、すなわち上述し
た標準活性測定法をもちいたTCGF活性による。
TCGF活性を約104−106units/ml、タンパク質含量を15-2
0mg/mlで持つ、濃縮したCOS 7上清は、50mM HEPESナト
リウム塩、pH7.0の溶液を24時間中に２度交換して透折
した（各交換液の容量は濃縮液の約10-15倍である）。
0mg/mlで持つ、濃縮したCOS 7上清は、50mM HEPESナト
リウム塩、pH7.0の溶液を24時間中に２度交換して透折
した（各交換液の容量は濃縮液の約10-15倍である）。
透折物は、あらかじめ50mM HEPESナトリウム塩、pH7.0
で平衡化したS-セファロース（流速:0.2ml/min.）のカ
ラム（１×2.5cm）に添加した。このカラムは、15カラ
ム体積の平衡化バッファーで洗浄され、その後50mM HEP
ESナトリウム塩,pH7.0溶液に０から0.5Mの塩化ナトリウ
ムを含む、20カラム体積分の直線NaCl塩濃度勾配で溶出
した。この溶出は50mM HEPESナトリウム塩、0.5M塩化ナ
トリウム、pH7.0の５カラム体積分の溶液をもちいてア
イソクラチックに終了した。二つの別のバッチから、1.
5mlおよび1.8mlの画分が集められた。IL-4の活性は、両
方のクロマトグラフィーにおいて、300mMないし500mMの
NaClで溶出された。
で平衡化したS-セファロース（流速:0.2ml/min.）のカ
ラム（１×2.5cm）に添加した。このカラムは、15カラ
ム体積の平衡化バッファーで洗浄され、その後50mM HEP
ESナトリウム塩,pH7.0溶液に０から0.5Mの塩化ナトリウ
ムを含む、20カラム体積分の直線NaCl塩濃度勾配で溶出
した。この溶出は50mM HEPESナトリウム塩、0.5M塩化ナ
トリウム、pH7.0の５カラム体積分の溶液をもちいてア
イソクラチックに終了した。二つの別のバッチから、1.
5mlおよび1.8mlの画分が集められた。IL-4の活性は、両
方のクロマトグラフィーにおいて、300mMないし500mMの
NaClで溶出された。
IL-4力価を含む２つのS-セファロースからの画分は各々
総量として9.0mlおよび10.8mlに合わせられた。双方の
容量ともアミコンYM5メンブラン（排除分子量;5000）を
使用して限外濾過により1.9mlに濃縮された。この段階
でのタンパク質回収量は、約80％であった。この濃縮し
たIL-4溶液は、あらかじめ50mM HEPES,0.4M塩化ナトリ
ウム、pH7.0で平衡化したセファデックスＧ−100カラム
（1.1×58cm）に添加され、このカラムは、同バッファ
ーで、流速0.15ml/分にて溶出された。全部で50画分
（1.0ml/画分）が集められ、IL-4の力価が分析された。
生物学的活性のあるピークは、見かけ上の分子量22,000
ダルトンと測定された。このセファデックスG-100は、
見かけ上の分子量決定のために、ウシ 血清アルブミン
（65,000ダルトン）、カーボニック アンヒドラーゼ
（30,000ダルトン）、およびチトクロームＣ（11,700ダ
ルトン）を用いて検量線を作成した。
総量として9.0mlおよび10.8mlに合わせられた。双方の
容量ともアミコンYM5メンブラン（排除分子量;5000）を
使用して限外濾過により1.9mlに濃縮された。この段階
でのタンパク質回収量は、約80％であった。この濃縮し
たIL-4溶液は、あらかじめ50mM HEPES,0.4M塩化ナトリ
ウム、pH7.0で平衡化したセファデックスＧ−100カラム
（1.1×58cm）に添加され、このカラムは、同バッファ
ーで、流速0.15ml/分にて溶出された。全部で50画分
（1.0ml/画分）が集められ、IL-4の力価が分析された。
生物学的活性のあるピークは、見かけ上の分子量22,000
ダルトンと測定された。このセファデックスG-100は、
見かけ上の分子量決定のために、ウシ 血清アルブミン
（65,000ダルトン）、カーボニック アンヒドラーゼ
（30,000ダルトン）、およびチトクロームＣ（11,700ダ
ルトン）を用いて検量線を作成した。
IL-4活性を含むセファデックスG-100からの画分は減圧
下で3-4倍に濃縮され、Vydac C-4ガードカラム（4.6×2
0mm）に注入された。0.1％（v/v）トリフルオロ酢酸（T
FA）中で０から72％のアセトニトリルの直線勾配を35
℃、流速1.0ml/分および15分間でカラムに形成した。結
果として保持時間７、8.2、8.7分の３つのピークが214n
mで検出された（それぞれ第２図のピーク1,2,3）。ピー
ク２（溶出時間8.2分）の40μｌを凍結乾燥し、10％の
胎児子牛血清を含む最小必須培地に再溶解した。この溶
液はTCGF陽性反応を示た。ピーク２の300μｌを乾燥す
るため蒸発させ、0.1％（W/V）のドデシル硫酸ナトリウ
ム（SDS）200μｌに再溶解した。２μｌの水溶液を200
μｌの１％（V/V）TFAで希釈し再クロマトグラフィーを
行った。このサンプルはHPLCでは215nmで単一ピークが
示された。ピーク２の物質は約７×108units/mgの活性
を示した。
下で3-4倍に濃縮され、Vydac C-4ガードカラム（4.6×2
0mm）に注入された。0.1％（v/v）トリフルオロ酢酸（T
FA）中で０から72％のアセトニトリルの直線勾配を35
℃、流速1.0ml/分および15分間でカラムに形成した。結
果として保持時間７、8.2、8.7分の３つのピークが214n
mで検出された（それぞれ第２図のピーク1,2,3）。ピー
ク２（溶出時間8.2分）の40μｌを凍結乾燥し、10％の
胎児子牛血清を含む最小必須培地に再溶解した。この溶
液はTCGF陽性反応を示た。ピーク２の300μｌを乾燥す
るため蒸発させ、0.1％（W/V）のドデシル硫酸ナトリウ
ム（SDS）200μｌに再溶解した。２μｌの水溶液を200
μｌの１％（V/V）TFAで希釈し再クロマトグラフィーを
行った。このサンプルはHPLCでは215nmで単一ピークが
示された。ピーク２の物質は約７×108units/mgの活性
を示した。
実施例 III 大腸菌中での非グリコシル化ヒト IL-4
の生産 TRPC11と表されるE.coli発現ベクターは標準的な方法、
例えばマニアチス等（Maniatis）モレキュラークローニ
ング：ラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning:A
Laboratory Manual）（Cold Spring Harbar Laboratry,
New York,1982）で開示、で構築した。
の生産 TRPC11と表されるE.coli発現ベクターは標準的な方法、
例えばマニアチス等（Maniatis）モレキュラークローニ
ング：ラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning:A
Laboratory Manual）（Cold Spring Harbar Laboratry,
New York,1982）で開示、で構築した。
TRPC11ベクターは、合成共通RBSフラグメントをClaIリ
ンカー（ATGCAT）につなぎ、できたフラグメントをClaI
で制限酵素処理したpMT11hc（これはあらかじめClaI部
位を含むように修飾されている）の中にクローニングし
て構築した。pMT11hcは小さくて（2.3キロベース）高コ
ピーであり、πVXプラスミドのEcoRI-HidndIIIポリリン
カー領域をもつpBR322のAMPＲ,TETＳ誘導体である（マ
ニアチス等によって記述されている、上述）。これは、
pMT11hcをEcoRIおよびBamHIで制限処理し、そこで生じ
る粘着末端を埋め、ClaIリンカ‐（CATCGATG）で連結
し、こうして、EcoRIおよびBamHI部位を再び存在させ、
SmaI部位をClaI部位に変更して、ClaI部位をもつように
修飾されている。
ンカー（ATGCAT）につなぎ、できたフラグメントをClaI
で制限酵素処理したpMT11hc（これはあらかじめClaI部
位を含むように修飾されている）の中にクローニングし
て構築した。pMT11hcは小さくて（2.3キロベース）高コ
ピーであり、πVXプラスミドのEcoRI-HidndIIIポリリン
カー領域をもつpBR322のAMPＲ,TETＳ誘導体である（マ
ニアチス等によって記述されている、上述）。これは、
pMT11hcをEcoRIおよびBamHIで制限処理し、そこで生じ
る粘着末端を埋め、ClaIリンカ‐（CATCGATG）で連結
し、こうして、EcoRIおよびBamHI部位を再び存在させ、
SmaI部位をClaI部位に変更して、ClaI部位をもつように
修飾されている。
TRPC11構造物からのひとつの形質転換体は、２つのClaI
部位ではさまれた一列に並んだRBS配列をもっていた。
このプラスミドをPstIで消化し、Bal31ヌクレアーゼ処
理をし、EcoRI制限処理をし、すべての４種類のデオキ
シヌクレオチド３リン酸の存在下でT4ポリメラーゼ処理
をして、ClaI部位のひとつ、およびRBS配列の第２コピ
ーの部分を除去した。この結果できた30-40bpフラグメ
トは、ポリアクリルアミド電気泳動で回収し、Sma1制限
処理したpUC12にクローニングした。次に、pKC101由来
の248bpのE.Coli trpPをもつEcoRIフラグメント（ニコ
ルス等（Nichols）によりMethods in Enzymology,Vol.1
01 pg.155（Academic Press,N.Y.1983）に記載）をEcoR
I部分にクローニングして、TRPC11の構築を完成させ
た。これは第１図に示されている。
部位ではさまれた一列に並んだRBS配列をもっていた。
このプラスミドをPstIで消化し、Bal31ヌクレアーゼ処
理をし、EcoRI制限処理をし、すべての４種類のデオキ
シヌクレオチド３リン酸の存在下でT4ポリメラーゼ処理
をして、ClaI部位のひとつ、およびRBS配列の第２コピ
ーの部分を除去した。この結果できた30-40bpフラグメ
トは、ポリアクリルアミド電気泳動で回収し、Sma1制限
処理したpUC12にクローニングした。次に、pKC101由来
の248bpのE.Coli trpPをもつEcoRIフラグメント（ニコ
ルス等（Nichols）によりMethods in Enzymology,Vol.1
01 pg.155（Academic Press,N.Y.1983）に記載）をEcoR
I部分にクローニングして、TRPC11の構築を完成させ
た。これは第１図に示されている。
TRPC11は、まず始めにClaIおよびBamHIで消化され、精
製されて、その後にpcD-125（ATCC寄託番号67029）のEc
oRV/BamHI処理フラグメントと、0.1マイクロモルの下記
合成リンカー： を含む標準的なライゲーション溶液中で混合し、ヒトIL
-4 cDNAのためのベクターとして採用された。
製されて、その後にpcD-125（ATCC寄託番号67029）のEc
oRV/BamHI処理フラグメントと、0.1マイクロモルの下記
合成リンカー： を含む標準的なライゲーション溶液中で混合し、ヒトIL
-4 cDNAのためのベクターとして採用された。
E.Coli AB1899は標準的な塩化カルシウム法をもちい
て、このライゲーション溶液で直接形質転換され増殖さ
れ、プレートにまかれた。IL-4 cDNAが組み込まれてい
るコロニーは、ラベルしたオリゴヌクレオチドプローブ
を使用し選択した。形質転換体はL-培地中で培養され、
IL-4は構成的に発現された。
て、このライゲーション溶液で直接形質転換され増殖さ
れ、プレートにまかれた。IL-4 cDNAが組み込まれてい
るコロニーは、ラベルしたオリゴヌクレオチドプローブ
を使用し選択した。形質転換体はL-培地中で培養され、
IL-4は構成的に発現された。
実施例IV. 大腸菌により生産された凝集産物からの非
グリコシル化ヒトIL-4の精製 E.Coli.AB1899（lon-）（エール大学E.coli遺伝子セン
ター、New Haven,CTより入手）を11規模で培養し、OD
560＝２（約1.6×109cell/ml）となるまで成長させた。
細胞は、４℃、4500×ｇにて15分間遠心し、収穫した。
沈殿は、50mM NaCl,1mMエチレンジアミン四酢酸（EDT
A）、および0.1mMフェニルメチルスルフェニルフルオラ
イド（PMSF）を含む50mMトリスバッファーpH8.0、30ml
に再懸濁させた。EDATおよびPMSFは、精製前にヒトIL-4
を分解するかもしれないプロテアーゼ活性を阻害するた
めに加えた。次に細胞は、超音波処理（70ワットで50パ
ルス（50％））され、25,000×ｇ、15分間、４℃で遠心
された。この沈殿の主要タンパク質成分は、電気泳動的
に分離した沈殿物（これはドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）に可溶であり、クーマシーブルーにて染色される）
ゲルバンドパターンを陰性のコントロールと比較して、
IL-4であることが示された。
グリコシル化ヒトIL-4の精製 E.Coli.AB1899（lon-）（エール大学E.coli遺伝子セン
ター、New Haven,CTより入手）を11規模で培養し、OD
560＝２（約1.6×109cell/ml）となるまで成長させた。
細胞は、４℃、4500×ｇにて15分間遠心し、収穫した。
沈殿は、50mM NaCl,1mMエチレンジアミン四酢酸（EDT
A）、および0.1mMフェニルメチルスルフェニルフルオラ
イド（PMSF）を含む50mMトリスバッファーpH8.0、30ml
に再懸濁させた。EDATおよびPMSFは、精製前にヒトIL-4
を分解するかもしれないプロテアーゼ活性を阻害するた
めに加えた。次に細胞は、超音波処理（70ワットで50パ
ルス（50％））され、25,000×ｇ、15分間、４℃で遠心
された。この沈殿の主要タンパク質成分は、電気泳動的
に分離した沈殿物（これはドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）に可溶であり、クーマシーブルーにて染色される）
ゲルバンドパターンを陰性のコントロールと比較して、
IL-4であることが示された。
この上清を除去した後、沈殿物は5Mグアニジン塩酸、2m
Mグルタチオン、（還元型）、および0.2mMグルタチオン
（酸化型）を含む、トリスバッファー溶液（50mM Tris,
50mM NaCl,1mM EDTA,0.1mM PMSF,pH8.0;沈殿物１グラム
あたり9ml）に再懸濁した。室温にて１時間後、2mMグル
タチオン（還元型）、0.2mMグルタチオン（酸化型）を
含む、トリスバッファー溶液、pH8.0で1:9に希釈され
た。この希釈、透折、濃縮操作中に生じた沈殿はいつで
も先に進む前に遠心にて除去された。総容積を31のリン
酸バッファー溶液で３回昼夜透折した。この透折物（す
なわち透折バックに残っている物）は、アミコンYM5フ
ィルターで濃縮され（最終濃度8mg/ml）、ゲル濾過クロ
マトグラフィー（カラム:P30（BioRad）,1.5×90cm;PBS
溶出バッファー；流速:8ml/hr）に供された。画分は15
分間隔で回集された。画分23-37がプールされ、さらに
逆相HPLCにて分析された。この分析により、プールした
画分には、95％純度のヒトIL-4が含まれていた。１リッ
トルのカルチャー（ふたつのOD560）からのヒトIL-4の
回収量は2mgであり、比活性で５×107units/mgであっ
た。
Mグルタチオン、（還元型）、および0.2mMグルタチオン
（酸化型）を含む、トリスバッファー溶液（50mM Tris,
50mM NaCl,1mM EDTA,0.1mM PMSF,pH8.0;沈殿物１グラム
あたり9ml）に再懸濁した。室温にて１時間後、2mMグル
タチオン（還元型）、0.2mMグルタチオン（酸化型）を
含む、トリスバッファー溶液、pH8.0で1:9に希釈され
た。この希釈、透折、濃縮操作中に生じた沈殿はいつで
も先に進む前に遠心にて除去された。総容積を31のリン
酸バッファー溶液で３回昼夜透折した。この透折物（す
なわち透折バックに残っている物）は、アミコンYM5フ
ィルターで濃縮され（最終濃度8mg/ml）、ゲル濾過クロ
マトグラフィー（カラム:P30（BioRad）,1.5×90cm;PBS
溶出バッファー；流速:8ml/hr）に供された。画分は15
分間隔で回集された。画分23-37がプールされ、さらに
逆相HPLCにて分析された。この分析により、プールした
画分には、95％純度のヒトIL-4が含まれていた。１リッ
トルのカルチャー（ふたつのOD560）からのヒトIL-4の
回収量は2mgであり、比活性で５×107units/mgであっ
た。
実施例 V. ハイブリドーマIC1.11B4.6の生産 雄のルイスラットは、1mlの完全フロインドアジュバン
ト（CFA）で乳化した1mlのヒトIL-4溶液にて腹腔内に免
疫された。このヒト IL-4溶液は、10mlトリス−塩酸、
0.5M塩化ナトリウム、pH7.4の溶液中に、ヒト IL-4を1
4μg/mlの濃度で含む。このヒトIL-4は、実施例Ｉおよ
びIIに従って生産され、２×107units/mgの比活性をも
っていた。初回免疫から２週間後に、このラットは再び
1mlのCFAで乳化された、ヒトIL-4溶液を腹腔内に注射さ
れた。第２回の注射から３カ月後に、このラットは1ml
のヒトIL-4溶液（15μｇ）を静脈内にブースター投与さ
れた。このブースター投与から４日後に、ラットは殺さ
れ、血液は回収されて、脾臓は融合のために取り出され
た。脾臓細胞は、マウスのミエローマ細胞、P3X63-Ag8.
653（ATCC CRL1580）とポリエチレングリコール（PEG）
を用いて1:1の割合で融合された。この細胞懸濁液（3.5
×105細胞/ml:HAT培地中）は、40枚の96-ウエルプレー
トに分注された。10日後に、ハイブリドーマの上清は、
ヒトIL-4が直接固定化されているマイクロタイタープレ
ート（間接ELISA）、または家兎抗‐ヒトIL-4の固定化
ポリクローナルIgG画分に結合しているヒトIL-4に結合
する能力が試験された。結合した抗体は、標準的方法を
用いて、パーオキシダーゼー結合ヤギ抗ラット免疫グロ
ブリンによって検出された。IL-4と反応する、ハイブリ
ドーマが分泌している抗体は、限定希釈法によってクロ
ーン化された。IC1.11B4.6は、このような手順で選択さ
れた、ひとつの該当するハイブリドーマである。IC1.11
B4.6からの抗体はIgG2aアイソタイプであると判断され
た。このハイブリドーマは、保存でき、（例えば、10％
DMSOを含むカルチャー培地中で‐70℃）、標準的な哺乳
動細培養胞技術（例えば、1mMグルタミンおよび50mM 2-
メルカプトエタノールで補充した10％胎児子牛血清を含
むRPMI 1640）を使って培養できる。
ト（CFA）で乳化した1mlのヒトIL-4溶液にて腹腔内に免
疫された。このヒト IL-4溶液は、10mlトリス−塩酸、
0.5M塩化ナトリウム、pH7.4の溶液中に、ヒト IL-4を1
4μg/mlの濃度で含む。このヒトIL-4は、実施例Ｉおよ
びIIに従って生産され、２×107units/mgの比活性をも
っていた。初回免疫から２週間後に、このラットは再び
1mlのCFAで乳化された、ヒトIL-4溶液を腹腔内に注射さ
れた。第２回の注射から３カ月後に、このラットは1ml
のヒトIL-4溶液（15μｇ）を静脈内にブースター投与さ
れた。このブースター投与から４日後に、ラットは殺さ
れ、血液は回収されて、脾臓は融合のために取り出され
た。脾臓細胞は、マウスのミエローマ細胞、P3X63-Ag8.
653（ATCC CRL1580）とポリエチレングリコール（PEG）
を用いて1:1の割合で融合された。この細胞懸濁液（3.5
×105細胞/ml:HAT培地中）は、40枚の96-ウエルプレー
トに分注された。10日後に、ハイブリドーマの上清は、
ヒトIL-4が直接固定化されているマイクロタイタープレ
ート（間接ELISA）、または家兎抗‐ヒトIL-4の固定化
ポリクローナルIgG画分に結合しているヒトIL-4に結合
する能力が試験された。結合した抗体は、標準的方法を
用いて、パーオキシダーゼー結合ヤギ抗ラット免疫グロ
ブリンによって検出された。IL-4と反応する、ハイブリ
ドーマが分泌している抗体は、限定希釈法によってクロ
ーン化された。IC1.11B4.6は、このような手順で選択さ
れた、ひとつの該当するハイブリドーマである。IC1.11
B4.6からの抗体はIgG2aアイソタイプであると判断され
た。このハイブリドーマは、保存でき、（例えば、10％
DMSOを含むカルチャー培地中で‐70℃）、標準的な哺乳
動細培養胞技術（例えば、1mMグルタミンおよび50mM 2-
メルカプトエタノールで補充した10％胎児子牛血清を含
むRPMI 1640）を使って培養できる。
実施例 VI. ハイブリドーマMP4.25D2.1の生産 ハイブリドーマの収集がおこなわれ、それらの抗体は、
結果的に実施例Ｖと同じ方法でヒトIL-4に対する特異性
がスクリーニングされた。このハイブリドーマの回収物
の中から、それらの抗体がヒトIL-4のTCGF活性をブロッ
クする能力があるかどうか、標準的なin vitroアッセイ
（実施例IIに開示）にてさらにスクリーニングされた。
MP4.25D2.11によって生産された抗体は、ブロッキング
モノクローナルと同定された中で、最も高いブロッキン
グ活性を持つものとして選択された。MP4.25D2.11によ
って生産された抗体は、ラットIgG1と判断された。
結果的に実施例Ｖと同じ方法でヒトIL-4に対する特異性
がスクリーニングされた。このハイブリドーマの回収物
の中から、それらの抗体がヒトIL-4のTCGF活性をブロッ
クする能力があるかどうか、標準的なin vitroアッセイ
（実施例IIに開示）にてさらにスクリーニングされた。
MP4.25D2.11によって生産された抗体は、ブロッキング
モノクローナルと同定された中で、最も高いブロッキン
グ活性を持つものとして選択された。MP4.25D2.11によ
って生産された抗体は、ラットIgG1と判断された。
実施例 VII. ヒトIL−４のサンドイッチアッセイ 100μｌの家兎ポリクローナル 抗‐ヒトIL-4 抗体は
（プロテインＡアフィニティーカラムで精製した、PBS
中10μg/mlの抗体）ポリ塩化ビニル製の96ウエルマイク
ロタイタープレートの各ウエルの表面上に37℃で２時間
吸着される（PBSは、蒸留水１リットル中に8.0gの塩化
ナトリウム、0.2gのKH2PO4,2.9gのNa2HPO4・12H2O,およ
び0.2gの塩化カリウムを含む。このpHは、7.4であ
る）。このプレートは、PBS−Tween 20（Tween 20を１
リットルあたり0.5ml加えるほかは、PBSと全く同じよう
に調製）で未吸着の抗体を除去するために洗い、精製さ
れたE.coli-生産ヒトIL-4の２連の連続希釈溶液（PBS
中）を、IL-4の濃度が1000pg/mlから15pg/mlと減少する
ようにウエルの２つの12ウエル列に置く。次のサンプル
が、残りのウエルにのせられた：（１）ヒトＴ細胞クロ
ーン、例えば、ClLyl+2-/9（ATCC CRL 8179）からの培
養上清（２）pcD-ヒトIL-4で遺伝子導入されたCOS 7細
胞の培養上清、（３）COS 7が生産した精製IL-4を異な
る濃度で含むヒト血清および（４）ヒトIL-1α,IL-2,IL
-3,IFN-γ,IFN-α2b,GM-CSF,BSF-2を含むサンプル。す
べてのサンプルは、室温で２時間インキュベートされ
た。PBS-Tweenで洗浄した後、IC1.11B4.6のカルチャー
由来の1:10希釈上清が各ウエルに加えられ（100μl/wel
l）、室温で１時間インキュベートされた。インキュベ
ーションの後、このプレートは洗浄され、パーオキシダ
ーゼ‐結合ヤギ 抗−ラット 抗体が添加され、室温で
１時間インキュベートされ、その後洗浄された。次にパ
ーオキシダーゼの基質ABTSが添加され、このヒトIL-4の
濃度は、ウエルの中の吸光度を手段として決定した。こ
の結果では、ヒト血清中少なくとも50pg/mlの濃度で、
哺乳細胞‐生産ヒトIL-4が活性測定され、またこの測定
では、先に述べたいかなるリンホカインも検出されな
い。
（プロテインＡアフィニティーカラムで精製した、PBS
中10μg/mlの抗体）ポリ塩化ビニル製の96ウエルマイク
ロタイタープレートの各ウエルの表面上に37℃で２時間
吸着される（PBSは、蒸留水１リットル中に8.0gの塩化
ナトリウム、0.2gのKH2PO4,2.9gのNa2HPO4・12H2O,およ
び0.2gの塩化カリウムを含む。このpHは、7.4であ
る）。このプレートは、PBS−Tween 20（Tween 20を１
リットルあたり0.5ml加えるほかは、PBSと全く同じよう
に調製）で未吸着の抗体を除去するために洗い、精製さ
れたE.coli-生産ヒトIL-4の２連の連続希釈溶液（PBS
中）を、IL-4の濃度が1000pg/mlから15pg/mlと減少する
ようにウエルの２つの12ウエル列に置く。次のサンプル
が、残りのウエルにのせられた：（１）ヒトＴ細胞クロ
ーン、例えば、ClLyl+2-/9（ATCC CRL 8179）からの培
養上清（２）pcD-ヒトIL-4で遺伝子導入されたCOS 7細
胞の培養上清、（３）COS 7が生産した精製IL-4を異な
る濃度で含むヒト血清および（４）ヒトIL-1α,IL-2,IL
-3,IFN-γ,IFN-α2b,GM-CSF,BSF-2を含むサンプル。す
べてのサンプルは、室温で２時間インキュベートされ
た。PBS-Tweenで洗浄した後、IC1.11B4.6のカルチャー
由来の1:10希釈上清が各ウエルに加えられ（100μl/wel
l）、室温で１時間インキュベートされた。インキュベ
ーションの後、このプレートは洗浄され、パーオキシダ
ーゼ‐結合ヤギ 抗−ラット 抗体が添加され、室温で
１時間インキュベートされ、その後洗浄された。次にパ
ーオキシダーゼの基質ABTSが添加され、このヒトIL-4の
濃度は、ウエルの中の吸光度を手段として決定した。こ
の結果では、ヒト血清中少なくとも50pg/mlの濃度で、
哺乳細胞‐生産ヒトIL-4が活性測定され、またこの測定
では、先に述べたいかなるリンホカインも検出されな
い。
下記の表Ａ及び第3A図では、11B4 F（ab）,IgG,および
粗上清（精製していない抗体）は、125I-HuIL-4のDaudi
細胞への結合を阻害する活性を示す。すべての３つの調
製物が結合を最大70％阻害した。コントロールモノクロ
ーナル抗体 GL117 F（ab）,IgG,および粗上清は、結合
には、影響を与えなかった（このコントロール抗体は、
同じイディオタイプの非関連抗原に対する）。50％の結
合阻害を形成するためには、精製 11B4 IgGまたはＦ（a
b）の濃度としては、10-100ng/mlが要求された。
粗上清（精製していない抗体）は、125I-HuIL-4のDaudi
細胞への結合を阻害する活性を示す。すべての３つの調
製物が結合を最大70％阻害した。コントロールモノクロ
ーナル抗体 GL117 F（ab）,IgG,および粗上清は、結合
には、影響を与えなかった（このコントロール抗体は、
同じイディオタイプの非関連抗原に対する）。50％の結
合阻害を形成するためには、精製 11B4 IgGまたはＦ（a
b）の濃度としては、10-100ng/mlが要求された。
下記の表Ｂ及び第3B図では、同アッセイに於いて、25D
2.11 F（ab）の結合阻害能を示している。この調製では
90％の阻害を示し、最大阻害の50％は10-15ng/mlで認め
られた。
2.11 F（ab）の結合阻害能を示している。この調製では
90％の阻害を示し、最大阻害の50％は10-15ng/mlで認め
られた。
第3A図及び第3B図においてX-軸はng/ml（対数値）、Y-
軸は阻害パーセント表す。
軸は阻害パーセント表す。
この実験では、HuIL-4はチャイニーズハムスター卵巣細
胞内で調製され、下記の表においては、CHO-HuIL-4と示
されている。
胞内で調製され、下記の表においては、CHO-HuIL-4と示
されている。
以上の本発明の実施態様の記述は、説明および描写の目
的で提供された。これらは、網羅的記載ではないし、ま
た本発明を開示された態様そのものに限定することを意
図してはおらず、明らかに上述の観点から多くの修飾お
よび変更が可能である。この実施態様は、本発明の原理
および具体的な応用を最も良く説明し、それゆえ他の、
当業者がこの発明を意図する特定の用途に適するよう
に、さまざまな具体例および修飾で最良に利用すること
を可能ならしめるように選ばれ、記述された。この発明
の範囲はこれから述べる請求の範囲によって限定され
る。
的で提供された。これらは、網羅的記載ではないし、ま
た本発明を開示された態様そのものに限定することを意
図してはおらず、明らかに上述の観点から多くの修飾お
よび変更が可能である。この実施態様は、本発明の原理
および具体的な応用を最も良く説明し、それゆえ他の、
当業者がこの発明を意図する特定の用途に適するよう
に、さまざまな具体例および修飾で最良に利用すること
を可能ならしめるように選ばれ、記述された。この発明
の範囲はこれから述べる請求の範囲によって限定され
る。
出願人は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関
するブダペスト条約に基づき、ハイブリドーマIC1.11B
4.6およびMP4.25D2.11をAmerican Type Culture Collec
tion,Rockville,MD,USA（ATCC）に、それぞれ寄託番号H
B9550およびHB9809で寄託した。これらの寄託は、特許
を目的とした、細胞の寄託のためのATCCの合意の下に提
供された条件下で行われこの条件によれば、この寄託が
アメリカの特許庁長官に35 USC 122および37 CFR 1.14
の規定に従って入手できるようにされ、また米国特許の
発行後は公衆に入手できるようにされる。さらに前記条
件は、この寄託が維持されることも必要としている。こ
の寄託した株の利用は、指定国の政府の権威の下に特許
法に従って与えられた権利に反して、本発明を実施する
ための実施権であると解釈されるべきではない。
するブダペスト条約に基づき、ハイブリドーマIC1.11B
4.6およびMP4.25D2.11をAmerican Type Culture Collec
tion,Rockville,MD,USA（ATCC）に、それぞれ寄託番号H
B9550およびHB9809で寄託した。これらの寄託は、特許
を目的とした、細胞の寄託のためのATCCの合意の下に提
供された条件下で行われこの条件によれば、この寄託が
アメリカの特許庁長官に35 USC 122および37 CFR 1.14
の規定に従って入手できるようにされ、また米国特許の
発行後は公衆に入手できるようにされる。さらに前記条
件は、この寄託が維持されることも必要としている。こ
の寄託した株の利用は、指定国の政府の権威の下に特許
法に従って与えられた権利に反して、本発明を実施する
ための実施権であると解釈されるべきではない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＦ Ｕ 9284−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 3/20 Ｃ１２Ｎ 15/08 15/24 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｐ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 8412−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 リー，フランク・ディー アメリカ合衆国カリフォルニア州94301, パロ・アルト，リンコナダ・アベニュー 212 (72)発明者 パース，マイケル・ケイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94306, パロ・アルト，アルマ・ストリート 3375 (56)参考文献 国際公開87／2990（ＷＯ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，315，333−336（1985)
Claims (5)
- 【請求項１】ラット脾臓細胞およびマウスのミエローマ
細胞に由来するハイブリドーマATCC HB9550またはATCC
HB9809によって産生される、ヒト インターロイキン
−４に対して特異的結合特性を有するモノクローナル抗
体。 - 【請求項２】ヒト インターロイキン−４に対して特異
的なモノクローナル抗体を分泌でき、かつラット脾臓細
胞およびマウスのミエローマ細胞に由来するハイブリド
ーマATCC HB9550またはATCC HB9809。 - 【請求項３】ラット脾臓細胞およびマウスのミエローマ
細胞に由来するハイブリドーマATCC HB9550またはATCC
HB9809によって産生されるヒト インターロイキン−
４の第一抗原決定基に対する特異的結合特性を有する第
一モノクローナル抗体を提供し； ヒト インターロイキン−４に特異的なポリクローナル
抗体組成物およびヒト インターロイキン−４の第一抗
原決定基とは異なる第二抗原決定基に特異的な第二モノ
クローナル抗体の群より選択された第二抗体を提供し； それぞれ第一抗体または第二抗体のいずれかの量に単純
に関連する強さのシグナルをつくるために、第一モノク
ローナル抗体または第二抗体のいずれかに機能的に結合
できる酵素を提供し； 抗体−支持体結合体を形成するために、第１モノクロー
ナル抗体または、第二抗体いずれかを支持手段に固定化
し； サンプル中のヒト インターロイキン−４が抗体−支持
体結合体に結合するように、サンプルと支持体結合体を
接触させ； 抗体−支持体結合体が第二抗体を含んでいるときは、機
能的に酵素がついている第一モノクローナル抗体と抗体
−支持体結合体に結合しているヒト インターロイキン
−４を接触させ；または 抗体−支持体結合体が第一モノクローナル抗体を含んで
いるときは、機能的に酵素がついている第二抗体と抗体
−支持体結合体に結合しているヒト インターロイキン
−４を接触させ；そして 酵素により形成されるシグナルの量を測定する； ことからなる、ヒト インターロイキン−４が含まれて
いると思われるサンプルの中のヒト インターロイキン
−４の存在を検出する方法。 - 【請求項４】ヒト インターロイキン−４を含むと思わ
れるサンプル中のヒト インターロイキン−４の存在を
検出するキットであって； ラット脾臓細胞およびマウスのミエローマ細胞に由来す
るハイブリドーマATCC HB9550またはATCC HB9809によ
って産生される、ヒト インターロイキン−４の第一抗
原決定基に対して特異的結合特性を有する第一モノクロ
ーナル抗体； ヒト インターロイキン−４に特異的なポリクローナル
抗体組成物およびヒト インターロイキン−４の第一抗
原決定基とは異なる第二抗原決定基に特異的な第二モノ
クローナル抗体から選択された群より選択された第二抗
体； 第一モノクローナル抗体または第二抗体を固定化し得る
支持体手段；および 第一モノクローナル抗体または第二抗体のうち上記支持
体に固定化するもの以外の抗体に機能的に結合できる酵
素； よりなる上記キット。 - 【請求項５】ヒト インターロイキン−４を含むサンプ
ルからヒト インターロイキン−４を、ラット脾臓細胞
およびマウスのミエローマ細胞に由来するハイブリドー
マATCC HB9550またはATCC HB9809によって産生され
る、ヒト インターロイキン−４に対する特異的結合特
性を有するモノクローナル抗体よりなる免疫吸着体カラ
ムを通して抽出する免疫精製方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US113623 | 1987-10-26 | ||
| US07/113,623 US5041381A (en) | 1986-07-03 | 1987-10-26 | Monoclonal antibodies against human interleukin-4 and hybridomas producing the same |
| PCT/US1988/003631 WO1989003846A2 (en) | 1987-10-26 | 1988-10-21 | Monoclonal antibodies against human interleukin-4 and hybridomas producing the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03503118A JPH03503118A (ja) | 1991-07-18 |
| JPH0698020B2 true JPH0698020B2 (ja) | 1994-12-07 |
Family
ID=22350540
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63509356A Expired - Lifetime JPH0698020B2 (ja) | 1987-10-26 | 1988-10-21 | ヒト インターロイキン４に対するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5041381A (ja) |
| EP (2) | EP0375743B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0698020B2 (ja) |
| KR (1) | KR930008112B1 (ja) |
| CN (2) | CN1032816A (ja) |
| AU (1) | AU611750B2 (ja) |
| CA (1) | CA1335653C (ja) |
| DE (1) | DE3886760T2 (ja) |
| DK (1) | DK169627B1 (ja) |
| ES (1) | ES2061736T3 (ja) |
| HK (1) | HK105996A (ja) |
| IE (1) | IE62491B1 (ja) |
| IL (1) | IL88145A0 (ja) |
| MY (1) | MY108526A (ja) |
| NZ (1) | NZ226692A (ja) |
| PT (1) | PT88847B (ja) |
| WO (1) | WO1989003846A2 (ja) |
| ZA (1) | ZA887987B (ja) |
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| EP0327283B1 (en) * | 1988-02-02 | 1993-08-18 | Schering Biotech Corporation | Method of reducing immunoglobulin e responses |
| WO1991008774A1 (en) * | 1989-12-15 | 1991-06-27 | Cetus Corporation | Cytokine antibody for the treatment of sepsis |
| GB8928501D0 (en) * | 1989-12-18 | 1990-02-21 | Unilever Plc | Reagents |
| CA2071908C (en) * | 1989-12-20 | 2002-04-30 | Lata Ramanathan | Antibody antagonists of human interleukin-4 |
| US5132109A (en) * | 1990-10-05 | 1992-07-21 | Ludwig Institute For Cancer Research | Method for inhibiting production of ige and method for enhancing production of igg using interleukin 9 and inhibitors thereof |
| DE4137333A1 (de) * | 1991-11-13 | 1993-05-19 | W Prof Dr Sebald | Therapeutische mittel, die antagonisten oder partielle agonisten des humanen interleukin 4 sind oder diese enthalten, hil-4-mutantenproteine sowie vefahren zu deren herstellung |
| ES2121078T3 (es) * | 1992-02-19 | 1998-11-16 | Schering Corp | Clonacion y expresion de anticuerpos monoclonales humanizados contra interleuquina-4 humana. |
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| US20020193575A1 (en) * | 1993-09-07 | 2002-12-19 | Smithkline Beecham P.L.C. | Recombinant IL4 antibodies useful in treatment of IL4 mediated disorders |
| US5928904A (en) * | 1993-09-07 | 1999-07-27 | Smithkline Beecham Corporation | DNA encoding recombinant IL4 antibodies useful in treatment of IL4 mediated disorders |
| US5914110A (en) * | 1993-09-07 | 1999-06-22 | Smithkline Beecham Corporation | Recombinant IL4 antibodies useful in treatment of IL4 mediated disorders |
| EP0659766A1 (en) * | 1993-11-23 | 1995-06-28 | Schering-Plough | Human monoclonal antibodies against human cytokines and methods of making and using such antibodies |
| US5959085A (en) * | 1993-11-23 | 1999-09-28 | Schering Corporation | Human monoclonal antibodies against human cytokines and methods of making and using such antibodies |
| WO1995021942A1 (en) * | 1994-02-15 | 1995-08-17 | T Cell Diagnostics, Inc. | Immunoassay kit comprising universal reagents |
| US5597710A (en) * | 1994-03-10 | 1997-01-28 | Schering Corporation | Humanized monoclonal antibodies against human interleukin-4 |
| US5705154A (en) * | 1995-03-08 | 1998-01-06 | Schering Corporation | Humanized monoclonal antibodies against human interleukin-4 |
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| JP2004045384A (ja) * | 2002-05-22 | 2004-02-12 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 免疫学的測定方法、免疫学的測定装置、生体成分測定用トイレ、抗アルブミンモノクローナル抗体、それを産生する細胞株、およびアルブミン検出キット |
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| US20110223168A1 (en) * | 2002-12-27 | 2011-09-15 | Greg Winter | Ligand that has binding specificity for il-4 and/or il-13 |
| AR050044A1 (es) * | 2004-08-03 | 2006-09-20 | Novartis Ag | Anticuerpo especifico de il-4 |
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