DE69431922T2

DE69431922T2 - Glycosilierte und nichtglycolisierte bakterizide/die permeabilität erhoehende proteine und methoden zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE69431922T2
Application number: DE69431922T
Authority: DE
Inventors: C. Lane; N. Marra; W. Scott; L. Snable
Original assignee: Incyte Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Incyte Corp
Priority date: 1993-07-02
Filing date: 1994-07-01
Publication date: 2003-11-13
Anticipated expiration: 2014-07-02
Also published as: CA2166488A1; EP0726944A1; DE69431922D1; EP0726944B1; JPH09500269A; EP0726944A4; WO1995001428A1; AU7217094A; ATE229980T1

Description

Hintergrund der Erfindung

Gram-negative Infektionen sind eine hauptsächliche Ursache von Morbidität und Mortalität, insbesondere bei hospitalisierten und immunkompromittierten Patienten. [Duma, R. J., Am. J. of Med., 78 (Suppl. 6A): 154-164 (1985); and Kreger B. E., D. E. Craven and W. R. McCabe, Am. J. Med., 68: 344-355 (1980)]. Obwohl erhältliche Antibiotika bei der Eindämmung von Gram-negativen Infektionen effektiv sind, tun sie nichts, um die mit Lipopolysaccharid (LPS) zusammenhängenden pathophysiologischen Effekte zu neutralisieren. LPS, hier auch als Endotoxin bezeichnet, ist eine hauptsächliche Komponente der äußeren Membran von Gram- negativen Bakterien und wird freigesetzt, wenn die Organismen lysiert werden. [Ahenep, J. L. and K. A. Morgan, J. Infect. Dis., 150 (3): 380-388 (1984)].
Während der Antibiotikatherapie freigesetztes LPS ist ein potenter Stimulator der Entzündungsantwort. Viele schädliche Effekte von LPS in vivo resultieren aus löslichen Mediatoren, die durch inflammatorische Zellen Freigesetzt werden. [Morrison D. C. and R. J. Ulevich, Am. J. Pathol., 93 (2): 527-617 (1978)]. LPS induziert die Freisetzung von Mediatoren durch Wirts-inflammatorische Zellen, die letztendlich zu disseminierter intravaskulärer Koagulation (DIC), adultem respiratorischen Streßsyndrom (ARDS), Nierenversagen und irreversiblem Schock führen können.
Monozyten und neutrophile Granulozyten spielen eine Schlüsselrolle bei der Wirtsverteidigung gegen bakterielle Infektionen und nehmen auch an der Pathologie von Endotoxämie teil. Diese Zellen nehmen Mikroorganismen intrazellulär auf und töten diese ab und antworten auf LPS in vivo und in vitro durch die Freisetzung von löslichen Proteinen mit mikrobioziden, proteolytischen, opsonischen, pyrogenischen, Komplement-aktivierenden und Gewebebeschädigenden Effekten. Tumor-Necrosefaktor (TNF), ein Cytokin, das durch LPS- stimulierte Monozyten freigesetzt wird, ahmt einige der toxischen Effekte von LPS in vivo nach. Die Injektion von Tieren mit TNF verursacht Fieber, Schock und Veränderungen im Glucosestoffwechsel. TNF ist auch ein potenter Stimulator von Neutrophilen. Andere Cytokine, wie z. B. IL-1, IL-6 und IL-8 werden auch freigesetzt und können eine Rolle in der inflammatorischen Antwort auf LPS spielen.
Lösliches LPS verursacht verringerte Neutrophilen Chemotaxis, erhöhte Adhäsivität, erhöhte Hexosemonophosphat-Shunt-Aktivität und OZ-Radikalherstellung, Hochregulierung von Oberflächenrezeptoren für Komplement und Freisetzung von Granula-Proteinen in das umgebende Medium. [Morrison and Ulevich (1978)].
Sowohl spezifische und azurophile Kompartimente degranulieren in Antwort auf LPS. [Bannatyne, R. M., N. M. Harnett, K. Y. Lee and W. D. Rigger, J. Infect. Dis., 156 (4): 469-474 (1977)]. Azurophile Proteine, die in Antwort auf LPS freigesetzt werden, können sowohl schädlich als auch vorteilhaft für den Wirt sein. Neutrophilen Elastase verursacht den Äbbau von Proteaseinhibitoren, die für die Unterdrückung der Koagulationskaskade verantwortlich sind. Dies führt zu Koagulopathien, wie z. B. disseminierter intravaskulärer Koagulation, einer möglicherweise lethalen Konsequenz von Endotoxämie. Azurophile Granulae enthalten auch bakterizide Moleküle, wie z. B. Myeloperoxidase und bakteriziden/permeabilitätserhöhenden Faktor, hier im folgenden als BPI-Protein bezeichnet.
Kaninchen-BPI wurde zuerst in 1975 entdeckt. [Weiss, J., R. C. Franson, S. Becherdite, K: Schmeidler, and P. Elsbach, J. Clin. Invest., 55: 33 (1975)]. BPI-Protein wurde 1978 aus menschlichen Neutrophilen isoliert. [Weiss, J., P. Eisbach, I. Olson and H. Odeberg, J. Biol. Chem. 153 (8): 2664-2672 (1978)].
1984 wurde ein 57 kD-Protein mit ähnlichen Eigenschaften aus menschlichen Neutrophilen isoliert [Shafer, W. M., C. E. Martin and J. K. Spitznagel, Infect. Immun., 45: 29 (1984)]. Dieses Protein ist identisch zu BPI-Protein, wie durch die N-terminale Sequenz, Aminosäurezusammensetzung, Molekulargewicht und Quelle des 57 kDa-Proteins bestimmt. Jedoch waren die Autoren nicht in der Lage, das chromatographische Isolierungsverfahren zu reproduzieren, das von Elsbach, et al. und Weiss, et al. verwendet wurde.
Menschliches BPI-Protein ist ein 57 kD-Protein, das an die äußere Membran von sensitiven Gram-negativen Bakterien bindet [Weiss, et al. (1978)]. Die Tatsache, daß BPI-Protein ein Lipid-A-bindendes Protein ist, wird dadurch gestützt, daß: (1) Rough-Stämme von Bakterien sensitiver gegenüber sowohl bakteriziden und permeabilitätserhöhenden Aktivitäten von BPI- Protein sind [(Weiss, J., M. Hutzler and L. Kao, Infect. Immun., 51: 594 (1986)]; (2) Mutationen in Lipid-A eine verringerte Bindung und eine erhöhte Resistenz gegenüber der bakteriziden Aktivität von sowohl Polymyxin-B und BPI-Protein verursacht [(Farley, M. M., W. M. Shafer and J. K. Spitznagel, Infect. Immun., 56: 1589 (1988)]; (3) BPI-Protein mit Polymyxin- B (PMB) um die Bindung an S. typhimurium kompetitiv ist [Farley 1988]; und (4) der BPI- Protein-Sequenzhomologie und Immunkreuzreaktivität mit einem LPS-bindenden Protein, Lipopolysaccharid-bindendes Protein (LBP). Von LBP-LPS-Komplexen wurde gezeigt, daß diese den oxidativen Burst auf Neutrophile in Antwort von formulierten Peptiden stimulieren. Zusätzlich binden LBP-LPS-Komplexe zurück an einen Zelloberflächenrezeptor auf Monozyten (CD 14), was zu der Induktion von Tumor-Necrosefaktor (TNF)-Produktion führt. Daher vermittelt LBP die immunstimulatorische Aktivität von LPS und stimuliert daher die toxische Antwort auf Endotoxin. Lipoprotein (HDL) hoher Dichte, ein anderes LPS-bindendes Protein, das in menschlichen Serum in Komplex mit LPS gefunden wird, zeigt nicht die stimulierenden Effekte auf Neutrophile.
Die BPI-Proteinbindung an Gram-negative Bakterien unterbricht die LPS-Struktur, verändert die mikrobielle Permeabilität gegenüber kleinen hydrophoben Molekülen und verursacht Zelltod. [Weiss, et al. (1978)]. BPI-Protein tötet Bakterien unter physiologischen Bedingungen von pH und Ionenstärke in vitro, was darauf hindeutet, daß es in vivo außerhalb der niedrigen pH-Umgebung des Phagolysosoms aktiv sein kann. Alle der bakteriziden und permeabilitäts-erhöhenden Aktivitäten von BPI-Protein sind in dem N-terminalen 25 kD-Fragement des Proteins vorhanden [Ooi, C. E., J. Weiss, P. Elsbach, B. Frangione, and B. Marrion, J. Biol. Chem. 262: 14891 (1987)]. Es wurde bisher geglaubt, daß die vorteilhaften Effekte von BPI-Protein auf seine bakteriziden Effekte beschränkt sind. Jedoch wurde später gezeigt, daß BPI-Protein auch an Endotoxin bindet, jedoch daß BPI-Protein, anders als LBP, die immunstimulatorischen Aktivitäten von LPS eher inhibiert, als diese zu unterstützen.
Mannion, et al. [Preferential Binding of the Neutrophil Cytoplasmic Granule-Derived Bactericidal/Permeability Inereasing Protein to Target Bacteria, J. Immunol. 142: 2807 (1989)] zeigten, daß BPI-Protein aus Neutrophilen Granulae-Extraken durch Bindung an Gram- negative Bakterien gereinigt werden konnte. Achtzig Prozent des gebundenen BPI-Proteins konnten dann mit 200 mM MgCl&sub2;, in 10 mM Natriumacetat pH 4,0 bei 37ºC eluiert werden und die Bakterien durch Zentrifugation entfernt werden.
Die Expression von vielen Proteinen in Bakterien, wie z. B. E. coli, hat sich als schwierig erwiesen. Welche Proteine in E coli exprimiert werden und ob oder ob nicht das Protein in Form eines denaturierten unlöslichen Einschlußkörperchen exprimiert werden wird oder in die aktive Form gefaltet werden wird, kann nicht vorher bestimmt werden. Eine Vielzahl von Bedingungen können untersucht werden, um die Menge von unlöslichem gegenüber löslichem Material zu verändern, einschließlich Fermentationsbedingungen, wie z. B. Medienzusammensetzung, pH, Ionenstärke und Temperatur [A. Mitraki and J. King Bio/Technology 7: 690-697, 1989, or C. H. Schein Biol. Technology 7: 1141-1149 (1989)].
Weiterhin können für Proteine in unlöslicher Einschlußkörperchenform eine Vielzahl von Techniken untersucht werden, um renaturiertes aktives Protein zu erhalten [BioTechniques 3: 298-306 (1985)], wobei jedoch der Erfolg sehr stark von dem Charakter des fraglichen Proteins abhängig ist.
U.S. Patent Nr. 5,171,739 (Scott and Marra) beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines BPI-Proteins oder einer Proteinvariante davon aus einer Gram-negativen bakteriellen Zelle, das umfaßt, (a) Konstruieren eines Vektors, der DNA umfaßt, die für BPI kodiert, an die keine Leader-Peptidsequenz angebracht ist; (b) Transfizieren der Zelle mit dem Vektor; und (c) Kultivieren der so transfizierten Zelle in Kulturmedium unter Bedingungen, daß das BPI- Protein oder die Proteinvariante hergestellt wird.
Die vorliegende Erfindung stellt unter anderem ein Verfahren zur Herstellung von bakterizidem/permeabilitäts-erhöhendem Protein zur Verfügung, welches BPI-Protein einschließt, unter der Verwendung von Gram-negativen Bakterien. BPI-Protein ist ein Protein, das antibiotische Funktionen besitzt, d. h. eine potente antibakterielle Aktivität gegen Gram-negative Bakterien. Demzufolge würde ein Fachmann nicht erwarten, daß es möglich wäre, ein Protein in aktiver löslicher Form in einer Wirtszelle zu exprimieren, wobei das Protein als ein bekanntes Zytotoxin gegen die Wirtszelle fungiert. In der Tat hat die Tatsache, daß BPI-Protein Gram-negative Bakterien abtötet, Andere in dem Bereich davon abgehalten, ein bakterielles Expressionssystem für BPI-Protein zu entwickeln. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt einen wesentlichen Fortschritt über den Stand der Technik dar, weil die Produktion von rekombinantem Protein in Gram-negativen Bakterien, wie z. B. E. coli, bis zu 100-fach kosteneffektiver sein kann, als andere Produktionsverfahren, wie z. B. Säugetierzell- Expressionssysteme.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegend Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von nicht-glycosyliertem bakterizidem/permeabilitäts-erhöhendem Protein unter der Verwendung einer Gram-negativen bakteriellen Zelle zur Verfügung, das ein Transformieren oder Transfizieren der Zelle mit einem Vektor umfaßt, der für bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein kodiert, wobei das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein kein daran angebrachtes Leader-Peptid aufweist, wenn es exprimiert wird; Aktivieren der so transformierten oder transfizierten Zelle, um so nicht-glycosyliertes bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein in der Zelle herzustellen; und Aufreinigen des so hergestellten nicht-glycosylierten bakteriziden/permeabilitätserhöhenden Proteins aus der Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle bei einer Temperatur von unterhalb von 37ºC kultiviert wird.
In der bevorzugten Ausführungsform wird die Zelle bei einer Temperatur von zwischen 25- 36ºC kultiviert, weiter bevorzugt bei einer Temperatur von 26ºC.
In einer Ausführungsform umfaßt das Aufreinigen die Schritte von (a) Lysieren der Zelle unter Bedingungen, welche die Bildung von einem Komplex zwischen dem bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Protein und LPS verhindern, um so daß bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein aus der Zelle freizusetzen; und (b) Isolieren des so freigesetzten bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Proteins.
In einer anderen Ausführungsform umfaßt das Aufreinigen die Schritte von (a) Lysieren der Zelle unter Bedingungen, die die Bildung eines Komplexes zwischen dem bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Protein und LPS ermöglichen; (b) Isolieren des sich ergebenden bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Protein-LPS-Komplexes; (c) Dissoziieren des bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Protein-LPS-Komplexes, der so isoliert wurde, um das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein von dem bakteriziden/permeabilitätserhöhenden Protein-LPS-Komplex freizusetzen; und (d) Isolieren des so freigesetzten bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Proteins.
Gemäß eines anderen Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Aufreinigung von nicht-glycosyliertem bakterizidem/permeabilitäts-erhöhendem Protein aus einer Gram-negativen bakteriellen Zelle zur Verfügung gestellt, die mit einem Vektor, der für bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein kodiert, transformiert oder transfiziert ist, das kein Vorläufer-Peptid aufweist, wenn es exprimiert wird, und kultiviert, um so nicht-glycosyliertes bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein in der Zelle zu produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle bei einer Temperatur von unterhalb von 37ºC kultiviert wurde, wird das Verfahren die Schritte umfaßt von:
(a) Lysieren der Zelle unter Bedingungen, die die Bildung eines Komplexes zwischen dem bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Protein und LPS verhindern, um so daß bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein aus der Zelle freizusetzen; und
(b) Isolieren des so freigesetzten bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Proteins.
Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung, wird ein Verfahren zur Aufreinigung von nicht-glycosyliertem bakterizidem/permeabilitäts-erhöhendem Protein aus einer Gram-negativen bakteriellen Zelle zur Verfügung gestellt, die mit einem Vektor transformiert oder transfiziert ist, der für ein bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein kodiert das kein daran angebrachtes Vorläufer-Peptid aufweist wenn exprimiert, und kultiviert, um so nicht-glycosyliertes bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein in der Zelle zu produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle bei einer Temperatur von unterhalb 37ºC kultiviert ist, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
(a) Lysieren der Zelle unter Bedingungen, die die Bildung eines Komplexes zwischen den bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Proteins und LPS ermöglichen;
(b) Isolieren des sich ergebenden bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Protein-LPS- Komplexes;
(c) Dissoziieren des bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Protein-LPS-Komplexes, der so isoliert wurde, um so das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein von dem bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Protein-LPS-Komplex freizusetzen; und
(b) Isolieren des bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Proteins, das so freigesetzt wurde.
Zuletzt beschreibt die vorliegende Erfindung das nicht-glycosylierte bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein, das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1

Schematische Zeichnung von cDNA, die für BPI-Protein kodiert.

Fig. 2

Nukleotid- und Aminosäuresequenz von BPI-Protein Mutagenese-Primer 25 kDa Pro 212 TGA, der eine C-terminale Verkürzung von BPI-Protein ist.

Fig. 3

Nukleotid- und Aminosäuresequenz von BPI-Protein Mutagenese-Primer 35 kDa Pro 337 TGA, der eine C-terminale Verkürzung von BPI-Protein ist.

Fig. 4

Nukleotid- und Aminosäuresequenz von BPI-Protein Mutagenese-Primer: bevorzugt ATG 5' Hindill, der eine C-terminale Verkürzung von BPI-Protein ist.

Fig. 5

Schematische Zeichnung von pSVBPIMDH.

Fig. 6-1 und 6-2

Schematische Zeichnungen von pAc373.

Fig. 7

SDS-PAGE-Analyse von (1) nBPI-Protein (#148104), (2) rBPI-Protein (#148159) und (3) rBPI-Protein (# 148179).

Fig. 8A-1 und 8A-2

Aminosäuresequenz von BPI-Protein.

Fig. 8B-1 und 8B-2

cDNA-Sequenz von BPI-Protein.

Fig. 9

Proteinsequenz für p337.

Fig. 10

Proteinsequenz für p212.

Fig. 11

SDS-PAGE-Analyse von BPI-Protein, das in Säugerzellen und E. coli hergestellt wurde und von BPI-Protein, das durch nicht-rekombinante Verfahren erhalten wurde. Spuren 1 und 10 sind Molekulargewichtsmarker; Spur 3 ist BPI-Protein, hergestellt in CHO-Zellen; Spur 5 ist natürlich abgeleitetes BPI-Protein; Spur 7 ist in E coli hergestelltes BPI-Protein und teilweise gereinigt.

Fig. 12

Test, der die TNF-Freisetzung im Gesamtblut für in CHO-Zellen und E coli produzierten BPI-Protein vergleicht. Für den TNF-Test wird Blut mit Citrat-Antikoagulans von gesunden Spendern abgenommen. BPI-Protein wird hinzugefügt und dann wird LPS hinzugefügt. Die Inkubation wird für 4 Stunden bei 37ºC mit 5% CO&sub2; durchgeführt. Die Proben werden zentrifugiert und Plasma gesammelt. TNF wird unter Verwendung eines Sandwich-Assays getestet.

Fig. 13

Aktivität von BPI-Protein, hergestellt in E coli, im LAL-Assay.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Genau gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von nichtglycosyliertem bakterizidem/permeabilitäts-erhöhendem Protein unter der Verwendung einer Gram-negativen bakteriellen Zelle, das Transfizieren der Zelle mit einem Vektor umfaßt, der für bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein kodiert; Kultivieren der so transfizierten Zelle unter Bedingungen, die die Produktion von nicht-glycosyliertem bakterizidem/permeabilitäts-erhöhendem Protein in der Zelle ermöglicht, und Aufreinigen aus der Zelle des nicht-glycosylierten, bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Proteins, das so hergestellt wurde.
Wie hier verwendet, bedeutet bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein BPI-Protein und BPI-Varianten. Wie hier verwendet, bedeutet BPI-Protein das native 55 kD menschliche Protein, das die Aminosäuresequenz aufweist, die für humanes BPI-Protein in Fig. 8A-1 und 8A-2 gezeigt wird, und wird durch die cDNA-Sequenz kodiert, die in Fig. 8B-1 und 8B-2 gezeigt wird. Wie hier verwendet, bedeutet eine BPI-Variante ein Protein, die einen Teil von BPI-Protein umfaßt, wobei das Protein in der Lage ist, (a) an LPS zu binden, (b) mit BPI- Protein oder LBP um die Bindung von LPS kompetetiv zu sein, und (c) die LPS-vermittelte Produktion von TNFα durch menschliche Monozyten zu inhibieren. BPI-Varianten schließen ein, sind jedoch keinesfalls begrenzt auf, ein Fragment von BPI-Protein, eine Punktmutante von BPI-Protein, eine Deletionsmutante von BPI-Protein oder eine Punkt- und Deletionsmutante von BPI-Protein. Spezifische BPI-Varianten schließen ein, sind jedoch keinesfalls begrenzt auf, B(5351> A) (Glycosylierungstelle deletiert); B(D200-> DP) (Säurespaltungsstelle eingeführt); B&sub1;&submin;&sub1;&sub9;&sub9; (N-terminale Domaine von BPI-Protein); B200456 (C-terminales Fragment von BPI-Protein); B(F61-> c) (Cystein-Insertion); B(c132-> A) (Cystein-Deletion); B(c132-> s) (Cystein- Deletion); B(C 135-> S) (Cystein-Deletion); B(c175> 5) (Cystein-Deletion); B(132> A)(C135-> s)(C175-> S) (multiple Cystein-Deletionen); B(cq32-> S)(C135-> S)(C175-> S) (multiple Cystein-Deletionen).
In den BPI-Variantenbezeichnungen supra, wird der Teil von BPI-Protein in Varianten durch den Buchstaben B bezeichnet, gefolgt von einer Aminosäuresequenz-Nummerierungs- Zuordnung, die der in den Fig. 8A-1, 8A-2, 8B-1 und 8B-2 für menschliches BPI-Protein entspricht, wobei der reife N-Terminus als Rest 1 bezeichnet wird. Einzelne Aminosäure- Restsubstitutiorlen sind in Klammern angegeben, wobei der Ausgangs-Aminosäurerest angegeben ist (unter der Verwendung des Standard ein Buchstabencode für Aminosäuren), gefolgt vom substituierten Aminosäurerest. Zum Beispiel wird die BPI-Variante, worin der Original- Serinrest an Position 351 mit einem Alaninrest substituiert ist (wobei die Substitution ein Glycosylierungssignal entfernt) als BS351-> A) bezeichnet. Die Aminosäuresubstitutionen können eine Substitution sein, bei der ein Ausgangs-Aminosäurerest an einer bestimmten Position mit einem Rest an der entsprechenden Position in einem verschiedenen Protein substituiert ist. B(Xn> Y) ist ein Beispiel von solch einer Substitution, wobei der Aminosäurerest X an Position n in BPI-Protein mit einem Rest Y substituiert ist, der an Position n in LBP (oder Kaninchen- oder Rinder-LBP) gefunden wird. Aminosäurerest-Insertionsveränderungen sind in Klammern angegeben, durch Angeben des Aminosäurerests nach dem die Insertion auftritt, gefolgt von dem Aminosäurerest, nach dem die Insertion auftritt, zusammen mit dem eingefügten Rest oder den Resten. Zum Beispiel wird in B(D199-> DP) ein Prolinrest nach dem Aspartatrest an Position 199 eingeführt.
BPI-Varianten, die einen oder mehrere der Cysteinreste deletiert und substituiert durch Serin- oder andere Aminosäurereste aufweisen, wären zur Vorbeugung der Aggregation von BPI- Varianten während ihrer Produktion oder Verwendung brauchbar sein.
Die BPI-Varianten können eine oder mehrere die nicht-konservierte Glycosylierungsstellen deletiert haben. Alternativ können die BPI-Varianten eine oder mehrere nicht-konservierte Glycosylierungsstellen inseriert haben.
Die BPI-Varianten können eine oder mehrere die Sekundärstruktur verändernde Aminosäurereste deletiert oder hinzugefügt haben. Zum Beispiel können eine oder mehrere der nichtkonservierten Prolinreste in BPI-Protein mit einem nicht-Prolinrest substituiert sein.
Wie hier verwendet, bedeutet LPS Lipopolysaccharid. Wie hier verwendet, bedeutet TNFα Tumor-Necrosefaktor-α.
In einer Ausführungsform ist die Gram-negative bakterielle Zelle E. coli.
Verfahren zur Transfektion von Gram-negativen Zellen, für die Transfektion von Gram- negativen Zellen geeignete Vektoren, und Verfahren zur Kultivierung von Gram-negativen Zellen sind dem Fachmann gut bekannt. Beispiele von solchen Verfahren und Vektoren werden infra zur Verfügung gestellt.
Gemäß der Erfindung weist das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein kein darin angebrachtes Vorläufer-Peptid auf, wenn es exprimiert wird. Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "wenn exprimiert", wenn zuerst von der mRNA translatiert.
In der bevorzugten Ausführungsform umfassen die Bedingungen, welche die Produktion von nicht-glycosyliertem bakterizidem/permeabilitäts-erhöhendem Protein in der Zelle ermöglichen, niedrige Temperatur. Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "niedrige Temperatur", eine Temperatur von zwischen 25-36ºC. In der bevorzugten Ausführungsform bedeutet niedrige Temperatur eine Temperatur von ungefähr 26ºC.
Das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein kann in aktiver löslicher Form hergestellt werden. Zwei Ausführungsformen werden infra zur Aufreinigung von bakterizidem/permeabilitäts-erhöhendem Protein, hergestellt in aktiver löslicher Form, zur Verfügung gestellt.
In einer Ausführungsform umfaßt die Aufreinigung die Schritte von (a) Lysieren der Zelle unter Bedingungen, welche die Bildung von einem Komplex zwischen dem bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Protein und LPS verhindern, um so das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein aus der Zelle freizusetzen; und (b) Isolieren des bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Proteins, das so freigesetzt wurde.
In einer anderen Ausführungsform umfaßt die Aufreinigung die Schritte von (a) Lysieren der Zelle unter Bedingungen, die die Bildung eines Komplexes zwischen dem bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Protein und LPS ermöglichen; (b) Isolieren des so erhaltenen bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Protein-LPS-Komplexes; (c) Dissoziieren des bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Protein-LPS-Komplexes, der so isoliert wurde, um so daß bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein von dem bakteriziden/permeabilitäts- erhöhenden Protein-LPS-Komplex freizusetzen; und (d) Isolieren des so freigesetzten bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Proteins.
In einer Ausführungsform umfaßt das Lysieren der Zelle das Entfernen der äußeren Membran der Zelle und anschließend das Aufbrechen der sich ergebende Zelle.
In einer Ausführungsform umfaßt das Dessoziieren des bakteriziden/permeabilitäts- erhöhenden Protein-LPS-Komplexes in Kontakt bringen des Komplexes mit divalenten Kationen. In Kontakt bringen des Komplexes mit divalenten Kationen kann in Kontakt bringen des Komplexes mit 0,05 M-1,0 MgCl&sub2; umfassen. In der bevorzugten Ausführungsform umfaßt das in Kontakt bringen des Komplexes mit divalenten Kationen das in Kontakt bringen des Komplexes mit 0,5 M MgCl&sub2;.
Alternativ kann das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein in inaktiver unlöslicher Form hergestellt werden und in Einschlußkörperchen gelagert werden. Infra beschrieben ist ein Verfahren zur Aufreinigung von bakterizidem/permeabilitäts-erhöhendem Protein, hergestellt in inaktiver unlöslicher Form.
In diesem Verfahren umfaßt die Aufreinigung die Schritte von (a) Extrahieren aus den Einschlußkörperchen das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein in seiner inaktiven unlöslichen Form und (b) Neufalten des inaktiven unlöslichen Proteins, um so aktives lösliches bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein zu erzeugen. Beispiele dieser Ausführungsform sind infra zur Verfügung gestellt.
Auch wird ein Verfahren zur Herstellung von nicht-glycosyliertem bakteriziden/permeabilitäts-erhöhendem Protein unter der Verwendung einer prokaryontischen Zelle offenbart, welches ein Transfizieren der Zelle mit einem Vektor, der für bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein kodiert; Kultivieren der so transfizierten Zelle unter Bedingungen, die die Produktion von nicht-glycosyliertem bakteriziden/permeabilitätserhöhenden Protein in der Zelle ermöglichen; und Aufreinigen aus der Zelle des nicht- glycosylierten bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Proteins, das so hergestellt wurde, umfaßt. In einem Beispiel ist die prokaryontische Zelle eine Gram-positive Zelle.
Zuletzt offenbart die vorliegende Erfindung das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte nicht-glycosylierte bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein.
Die vorliegende Erfindung wird in dem folgenden Teil der Experimentellen Einzelheiten verdeutlicht. Dieser Abschnitt ist angegeben, um bei dem Verständnis der vorliegenden Erfindung zu helfen, ist jedoch nicht dem gedacht, und sollte deshalb nicht so ausgelegt werden, die Erfindung, wie in den folgenden Ansprüchen angegeben, auf irgendeine Weise zu begrenzen.

Experimentelle Einzelheiten

Beispiel 1

Reinigung und Charakterisierung von Neutrophil-BPI-Protein

A. Materialien und Methoden

1. Reagenzien

Lipopolysaccharid aus E. coli 0111:B4, S. typhimurium Wildtyp, Glycolipid aus S. typhimurium RE Mutante und Lipid-A aus S. typhimurium RE Mutante und LPS aus P. aeruginosa wurden von RIBI Immunochem Research, Inc. (Hamilton, MT) erworben; FMet-Leu-Phe (FMLP) und Polymyxin-B-Sulfat wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erworben; Hanks balancierte Salzlösung ohne Calzium, Magnesium und Phenolrot (HBSS) wurden von Hazelton Research Products (Denver, PA) erworben; Ficoll-Paque, Percoll und Macrodex wurden von Pharmacia, Inc. (Piscataway, NJ) erworben; TNF und anti-TNF wurden von Endogen (Boston, MA) erworben; Fluoreszein-konjugiertes Ziege-anti-Maus-IgG wurde von TAGO, Inc. (Burlingame, CA) erworben; IgG1 Kontrollantikörper wurde von Coulter Immunology (Hialeah, FL) erworben; Phycoerythrin (PE), konjugierter anti-CR3 (Leu-15) und IgG2a Kontrolle wurden von Becton Dickinson (Mountain View, CA) erworben; und anti- CR1 monoklonale Antikörper können käuflich oder gemäß Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, erhalten werden.

2. Azurophile Granula-Isolierung und Extraktion

Granulozyten wurden aus Buffy-Coats isoliert, die aus lokalen Blutbänken erhalten wurden. Die Buffy-Coats wurden 3-4X in HBSS verdünnt, und die Granulozyten wurden aus mononuklearen Zellen durch Zentrifugation durch 64% Percoll abgetrennt. Das Pellet wurde Diisopropylfluorphosphat (DFP) unterzogen, gewaschen und in eiskaltem Lysepuffer (10 mM PIPES, pH 6,8, 100 mM KCl, 3 mM NaCl, 3,5 mM MgCl&sub2;) resuspendiert und durch Stickstoffkavitation (Parr Instrument Co., Moline, IL) aufgebrochen. Die azurophilen Granulae wurden auf diskontinuierlichen Percoll Gradienten, wie durch Borregaard beschrieben, isoliert [Borregaard, N., J. M. Heiple, E. R. Simons, and R. A. Clark, J. Cell.Biol., 97: 52-61 (1983)]. Die azurophilen Granulae wurden gesammelt und das Percoll wurde durch Zentrifugation bei 180.000 · g für 2 Stunden entfernt. Die Granulae wurden für 4 Zyklen von Einfrieren-Auftauen, gefolgt von 1 Minute Beschallung lysiert. Die lysierten Granulae wurden in einem gleichen Volumen von 100 mM Glycin, pH 2,0 durch regelmäßiges Vortexen für 1 Stunde bei Raumtemperatur extrahiert. Der Säureextrakt wurde durch Zentrifugation bei 30.000 X g für 20 Minuten und bei 200.000 · g für 30 Minuten geklärt.

3. Neutrophilen-Isolation

Venöses Blut wurde von gesunden freiwilligen Spendern in Säurecitratdextrose- Antikoagulans abgenommen und unmittelbar auf Eis gelagert. Fünf Teile Blut wurden mit einem Teil kaltem Marcrodex gemischt und sich für 1,5-2 Stunden bei 4ºC Absetzen gelassen. Leukozyten-reiches Plasma wurde einmal in kaltem HBSS gewaschen, dann in HBSS resuspendiert und über Ficol1-Paque geschichtet. Falls signifikante Erythrozyten-Kontamination vorhanden war, wurde das Granulozyten-Pellet hypotonischer Lyse unterzogen. Die Zellen wurden 2X in HBSS gewaschen und in HBSS + 2% autologem Plasma resuspendiert, um eine finale Granulozytenkonzentration von 1 · 10&sup6;/ml im Inkubationsgemisch zu ergeben.

4. BPI-Protein-Reinigung

Ungefähr 2 mg von ungereinigten azurophilen Granulaextrakt wurde der Größe nach auf einer Biosil (TSK-250) (7,8 mm · 600 mm) High-Performance Größenausschlußsäule unter der Verwendung von 50 mM Glycin und 100 mM NaCl Puffer, pH 2,0 unter isokratischen Bedingungen bei einer Flußrate von 1 ml/min abgetrennt. Die Säulenfraktionen mit der höchsten LPS inhibitorischen Aktivität enthielten einen großen Teil der 54 kD Spezies, wie durch SDS PAGE gezeigt wurde. Diese TSK- Fraktionen wurden vereinigt und über eine Aquapore schwache Kationenaustausch- (WCX) Säule (2,1 mm · 30 mm), unter der Verwendung von 50 mM Citrat, pH 5, 5 laufen gelassen, und in einem Gradienten von 0-75% von 50 mM Citrat und 1 M NaCl (Puffer B) in 25 Minuten eluiert, dann 25-100% Puffer B für 5 Minuten mit einer Flußrate von 200 ml/min. Material von 55 kD wurde aus dem Kationenaustausch erhalten und er schien als eine einzelne Bande auf SDS PAGE. In einigen Experimenten wurde BPI-Protein weiter durch reverse Phase HPLC auf einer Vydac C4 Säule, geladen für 12 Minuten, in 0,1% CH&sub3;CN plus 0,1% TFA in 3 0 Minuten mit einer Flußrate von 200 ml/min (Rainin Instruments, Emeryville, CA) gereinigt.

5. Neutronhilen-Stimulation

Isolierte Neutrophile wurden auf Eis gehalten, bis sie mit und ohne Stimuli bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert wurden. Im Anschluß an die Inkubation wurden die Zellen in einem großen Volumen von kaltem PBS + 0,05% Natriumazid + 2% autologes Plasma gewaschen. Die Pellets wurden in zwei Hälften aufgeteilt, eine mit 50 ul Kontroll- IgG1 Antikörper (20 ug/l · 106 Zellen) gefärbt, die andere mit 50 ul von 20 ug/l · 10&sup6; Zellen anti-CR1 für 30 Minuten bei 0ºC. Im Anschluß an diese Inkubation wurden die Zellen 2X mit PBS + autologem Plasma gewaschen, dann mit Ziege-anti-Mäus- IgG-FITC gefärbt, und in einigen Experimenten, 20 ul von IgG2a-Phycoerythrin (PE) in Kontrollnäpfen, und 20 ul Leu-15 PE in Testnäpfen. Im Anschluß an eine 30- minütige Inkubation bei 0ºC und 2 weiteren Waschschritten wurden die Zellen durch Flußcytometrie auf einem Becton Dickinson FACStar-Flow-Cytometer (Becton Dikkinson, Mountain View, CA) analysiert. Die Neutrophilen-Stimulation wurde durch Vergleichen der mittleren Fluoreszenzintensität von Proben, die allein in HBSS + 2% autologem Plasma inkubiert wurden (Kontrolle), mit denjenigen, die mit LPS oder LPS inkubiert wurden, das vorher für 30 Minuten bei 37ºC mit BPI-Protein oder Polymyxin-B inkubiert wurde, gemessen. Die Daten sind als %-Stimulation oder %- Inhibition ausgedrückt und wurden unter der Verwendung der mittleren Fluoreszenzintensität (F 1) auf einer Log-Skala, nach:
%-Stimulation = [(Experimentell-Kontrolle)/(Maximum-Kontrolle)] · 100
und
%-Inhibition = 1-[+Inhibitor)-(Kontrolle)]/[(Inhibitor)-(Kontrolle)] · 100
berechnet.

6. Aminosäureanalyse

Die Gasphasenhydrolyse von BPI-Protein und Aminosäurederivatisierung wurde unter Verwendung einer Pico-tag-Workstation (Waters, Milford MA) durchgeführt, und die chromatographische Analyse der Phenylthiocarbamylaminosäuren wurde auf einem Applied Biosystems 130 A MPLC unter der Verwendung von durch den Hersteller zur Verfügung gestellten Anweisungen durchgeführt.

7. Sequenzanalyse

Die BPI-Protein N-terminale Sequenz wurde durch automatisierten Edman-Abbau unter der Verwendung eines Applied Biosystems 477A Puls-Flüssigphasesequenators (Applied Biosystems, Foster City, CA) analysiert. Die Phenylthiohydantoin- Aminosäureanalyse wurde Online unter der Verwendung eines Applied Biosystems- Modell 120A Flüssigkeitschromatographen durchgeführt.

B. Ergebnisse

Menschliche Neutrophile können sowohl in vivo und in vitro durch Lipopolysaccharid stimuliert werden. Nach der Aktivierung nimmt die Oberflächenexpression der Rezeptoren für C3b und C3bi (jeweils CR1 und CR3) zu. Unter der Verwendung des Fluoreszenz-aktivierten Cell-Sorters (FACS) wurde die Fluoreszenzintensität von frisch isolierten menschlichen Neutrophilen im Anschluß an die Stimulation mit zunehmenden Dosen von 0111:B4 LPS gemessen (Daten nicht gezeigt). Da die normalerweise beobachtete maximale Stimulation bei oder oberhalb von 10 ng/ml war, wurden bei Experimenten, die auf die Inhibierung von 0111:B4 LPS testeten, 10 ng/ml als stimulatorische Dosis verwendet. Alle Experimente wurden in zweifachen Ansätzen durchgeführt. In den meisten Experimenten sind die Daten nur für CR1 gezeigt, da keine Bedingungen beobachtet wurden, bei denen die Neutrophilen-Stimulation eine Hochregulation von CR1 oder CR3 allein verursachte [M. Marra et al., J. Immunol. 144(2): 662-666 (1990)].
Um zu bestimmen, ob Proteine, die in Neutrophil azurophilen Granulae gefunden wurden, mit der neutrophilen Antwort auf LPS interferieren könnten, wurden ungereinigte Säureextrakte von azurophilen Granulae mit LPS für 30 Minuten bei 37ºC präinkubiert. Das Gemisch wurde dann auf seine Fähigkeit hin getestet, Neutrophile zu stimulieren. Azurophiles Protein (I ug/ml) konnte effektiv die Stimulierung von 1 · 10&sup6; polymorphonuklearen Leukozyten (PMN) /ml durch 10 ng/ml LPS (Daten nicht gezeigt) blockieren. Dieser Effekt wurde bei der Verwendung von Glycinextraktionspuffer nicht beobachtet, der mit LPS präinkubiert wurde, auch konnte keine Stimulation von Neutrophilen unter der Verwendung von ungereinigten Extrakt oder Glycinpufferkontrolle gefunden werden (Daten nicht gezeigt).
Um weiter zu ermitteln, welches der Proteine in dem Extrakt für den inhibitorischen Effekt verantwortlich war (waren), wurden ungereinigte Säureextrakte durch reverse Phase HPLC aufgetrennt, und jeder Peak wurde getrennt auf LPS inhibitorische Aktivität getestet. Die Identität jedes dieser Peaks wurde vorher unter der Verwendung eines zweidimensionalen Reinigungsansatzes, der Microbore reverse Phase HPLC in der ersten Dimension beinhaltete, gefolgt von SDS PAGE, Elektroblotting und Mikrosequenzierung bestimmt. Die azurophilen Proteine können in 10 diskrete Peaks aufgelöst werden, deren Identitäten in Tabelle 1 gezeigt sind. Die gezeigten Aminosäuresequenzen sind für die ersten 15 Aminosäuren des N-Terminus.
Die LPS inhibitorische Aktivität von 1 ug jedes Peaks wurde getestet. Peak 9 wies die höchste LPS neutralisierende Aktivität auf. Die hauptsächliche Proteinspezies in diesem Peak weist eine N-terminale Identität mit BPI-Protein, das vorher beschrieben wurde, auf [Weiss, J., P. Elsbach, I. Olsson and H. Odeberg, J. Biol. Chem, 253 (8): 2664-2672 (1978)]. Von BPI-Protein wurde gezeigt, das es den hauptsächlichen Anteil der Gram-negativen bakteriziden Aktivität in azurophilen Granulaextraken enthält. Cathepsin G zeigte einige Inhibierung von LPS, jedoch waren die Daten zwischen den Experiment nicht so reproduzierbar, wie für Peak 9. Von Cathepsin G wurde gezeigt, daß es an LPS in vitro bindet und Gram-negative Organismen abtötet, obwohl zu einem geringeren Ausmaß, als BPI-Protein. Andere Proteine, die mikrobizide Aktivität gegen Gram-negative Organismen gezeigt hatten, sind Elastase und die Defensine. Jedoch inhibierten diese Proteine (1 ug/ml) die stimulatorische Aktivität von LPS auf Neutrophile nicht.
Die LPS inhibitorische Aktivität von ungereinigten azurophilen Extrakten wurde weiter charakterisiert und gereinigt unter der Verwendung von Größenausschluß und Ionenaustausch, gefolgt von reverser Phase-Chromatographie. Die LPS inhibitorische Aktivität komigriert mit einer reinen 55 kD Bande, die auf SDS PAGE gesehen wurde (Daten nicht gezeigt).
Weil der in RPLC Auftrennungen verwendete Puffer (CH&sub3;CN und 0,1% Trifluoressigsäure (TFA)) die LPS inhibitorische Aktivität von BPI Protein signifikant verringert (Daten nicht gezeigt) und weil das gereinigte Material aus der Ionenaustauschchromatographie, wie durch SDS PAGE abgeschätzt, von hoher Reinheit war, wurde Größenausschluß/Ionenaustauschmaterial verwendet, um eine Dosis-Antwortkurve zu erzeugen. Tabelle 1 Azurophil-Granulae-abgeleitete Proteine
Dieses Größenausschluß/Ionenaustausch-gereinigte Material wurde durch N-terminale Sequenzanalyse als BPI-Protein bestätigt. Die Proteinkonzentration wurde durch Aminosäureanalyse gemessen. Ungefähr 90 ng/ml an BPI-Protein wird für die maximale Inhibierung der Neutrophilen-Antwort auf 10 ng/ml 0111:B4 LPS benötigt. Die Neutrophilen-Antwort auf formuliertes Peptid (10&supmin;&sup7; M FMLP) wurde durch BPI-Protein nicht inhibiert (Daten nicht gezeigt).
Eine ähnliche Dosis-Antwortkurve wurde für das Polypeptid-Antibiotikum Polymyxin-B (PMB) gefunden. Polymyxin-B bindet an die Lipid A-Gruppe von LPS und neutralisiert einige ihrer toxischen Effekte sowohl in vivo und in vitro. Polymyxin-B bindet stöchiometrisch an LPS [Morrison, D. C. and D. M. Jacobs, Immunochem. 13: 813-818 (1976)]. Die berechnete Menge von PMB, die benötigt wird, um 10 ng/ml von glattem LPS zu inhibieren, ist ungefähr 0,67 nM. In den vorliegenden Experimenten wurden 0,4 ng/ml oder 0,36 nM Polymyxin-B benötigt, um die Neutrophilen-Stimulation unter der Verwendung von 10 ng/ml LPS vollständig zu inhibieren. 90 ng/ml oder 1,58 nM BPI-Protein waren zur 100% Inhibierung von 10 ng/ml LPS erforderlich.
Daher war auf einer molaren Basis die Menge von BPI-Protein, die erforderlich war, um die LPS-Stimulierung von Neutrophilen in vitro zu inhibieren, ungefähr 4X die Menge, die für Polymyxin-B benötigt wurde.
Um zu testen, ob BPI-Protein aus anderen Gram-negativen Organismen LPS inhibieren kann, wurden LPS Moleküle mit variierenden Polysaccharid-Kettenlängen und Lipid A in dem vorliegenden System (CRI Stimulation in Neutrophilen) gegen 90 ng/ml von 2X gereinigtem BPI-Protein getestet. Die in Tabelle 2 gezeigten Daten zeigen, daß die stimulatorische Dosis zwischen diesen Molekülen variieren kann und das LPS von sowohl Smooth- und Rough- Chemotypen, sowie Lipid A, alle durch BPI-Protein inhibiert werden. Tabelle 2 Effekt von BPI-Protein auf Neutrophilen-Stimulation durch verschiedene Agentien Inhibierung von CR-Hochregulation auf Neutrophilen
* Geringe bis keine Stimulation bei dieser Endotoxin-Konzentration

Beispiel 2

Vorläufige Untersuchungen an Neutrophil-BPI-Protein

In Antwort auf LPS regulieren menschliche Neutrophile die Zelloberflächenexpression von Komplement-Rezeptoren CR1 und CR3 (Daten nicht gezeigt) hoch. Um diese Neutrophilen- Antwort auf LPS zu messen, wurden frisch isolierte menschliche Neutrophile mit E. coli 0111:B4 LPS inkubiert (Daten nicht gezeigt), und gezeigt, daß die maximale CR1 Hochregulation unter der Verwendung von 10 ng/ml LPS beobachtet wird (Daten nicht gezeigt). Die Neutrophilen-Stimulation mit LPS wurde nicht durch exogene anti-TNF-Antikörper inhibiert, was vermuten läßt, daß LPS direkt auf Neutrophile in diesem System wirkte.
BPI-Protein inhibiert die Neutrophilen-Antwort auf LPS (Daten nicht gezeigt). Die Inhibierung der CR-Hochregulation war bei einer Dosis von ungefähr 1,8-3,6 nM (100-200 ng/ml) BPI-Protein vollständig, verglichen mit 0,4 nM Polymyxin-B, das benötigt wurde, um 10 nM/ml Smooth-LPS (ungefähres Molekulargewicht 15.000) zu inhibieren, was ungefähr 0,7 nM ist, was gut mit dem beobachteten Wert von 0,4 nM übereinstimmt. Auf einer molaren Basis war die Menge von BPI-Protein, die dazu benötigt wurde um LPS zu inhibieren, ungefähr 5-fach höher, als die für Polymyxin-B erforderliche Menge.
BPI-Protein inhibierte LPS-vermittelte Neutrophilen-Stimulation, jedoch nicht die Stimulation durch entweder FMLP oder TNF (Tabelle 3). Diese Daten zeigen, daß BPI-Protein LPS direkt inhibiert und nicht die Neutrophilen-Mechanismen unterbricht, die bei der CR- Hochregulation beteiligt sind. Tabelle 3 Effekt von BPI-Protein auf Neutrophilen-Stimulation durch verschiedene Agentien Inhibierung von CR-Hochregulation bei Neutrophilen
Die Neutrophilen wurden mit E. coli 0111:B4 LPS, FMLP oder TNF präinkubiert, in Anwesenheit oder Abwesenheit von 2,7 nM BPI-Protein. Die Daten sind als Prozent Inhibierung von CR-Expression in Antwort auf jeden Stimulus, präinkubiert und Puffer alleine, dargestellt. Die Neutralisierung von LPS durch BPI-Protein trat schnell auf. Sogar ohne Präinkubation inhibierten sowohl BPI-Protein (und Polymyxin-B) mehr als 70% der Neutrophilen- Antwort auf LPS (Daten nicht gezeigt). Die maximale Inhibierung wurde im Anschluß von an 5 Minuten Präinkubation gesehen.
BPI-Protein inhibiert CR-Hochregulation, wie stimuliert durch LPS von Smooth- und Roughbakteriellen Stämmen, sowie Lipid A (Tabelle 4). Aufgrund des breiten Bereichs von BPI- Proteinaktivität gegen diese verschiedenen Formen von LPS, unter denen nur Lipid A und 2- Keto-3-desoxy-octonat übereinstimmende Determinanten sind, ist es wahrscheinlich, daß die LPS-Inhibierung durch BPI-Protein durch Lipid A beeinflußt wird. Tabelle 4 Inhibierung von LPS und Lipid A-induzierter Neutrophilen-Stimulation durch BPI-Protein Inhibierung von CR-Hochregulation bei Neutrophilen
Die Neutrophilen wurden mit LPS und Lipid A, präinkubiert mit und ohne 2,7 nM gereinigtem BPI-Protein, stimuliert. Die Ergebnisse sind als Prozent Inhibierung von Fluoreszenzintensität, die mit jedem Typ von LPS allein beobachtet wurde, angegeben.
BPI-Protein inhibiert andere LPS-vermittelte Aktivitäten. Bei einer Konzentration von ungefähr 9 nM, oder 500 ng/ml, inhibierte BPI-Protein signifikant die LPS-Aktivität im LAL- Assay (Daten nicht gezeigt). Wenn LPS und BPI-Protein ohne Präinkubation zusammengegeben wurden, wurde keine Inhibierung beobachtet (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, daß BPI-Protein auf LPS wirkte und keinen Effekt auf das LAL-Assaysystem hatte. BPI- Protein inhibiert auch die LPS-vermittelte TNF-Produktion durch menschliche adhärente mononukleare Zellen (Tabelle 5). Tabelle 5 BPI-Protein inhibiert LPS-induzierte TNF-Produktion durch menschliche Monozyten TNF (pg/ml), produziert in Antwort auf LPS, präinkubiert mit*:
* E. coli 0111:B4 LPS wurde mit BPI-Protein oder Polymyxin B (PMB) präinkubiert, dann zu adhärenten peripheren Blut-mononuklearen Zellen hinzugefügt. Die TNF-Produktion wurde durch ELISA gemessen.
BPI-Protein wurde zuerst durch Eisbach und Weiss 1978 gereinigt. In den anfänglichen Untersuchungen wurde BPI-Protein aus azurophilen Granulaextrakten in einem einzigen Schritt durch reverse Phase HPLC isoliert. Die Ausbeute von BPI-Protein-Aktivität aus der reversen Phase war schlecht, möglicherweise aufgrund der denaturierenden Bedingungen. Hier ist die Reinigung von LPS inhibitorischer Aktivität unter der Verwendung von nichtdenaturierenden Schritten gezeigt, und es wird gezeigt, daß die meiste Aktivität aus Neutrophilen mit BPI komigriert. Die Verbesserungen in der Reinigung haben auch zu Material mit sehr hoher spezifischer Aktivität geführt, wie im folgenden Teil gezeigt werden wird.

Beispiel 3

Reinigung von Neutrophilen BPI-Protein unter streng-Pyrogen-freien Bedingungen

A. Materialien und Methoden

1. Reagenzien

USP-Grad steriles Spülungswasser wurde von Travensol Laboratories Inc. (Deerfield, IL) erhalten; Pyrosart-Filter wurden von Sartorius GmbH (Deutschland) erhalten; CM Sepharose FF wurde von Pharmacia (Upsala, Schweden) erhalten; Polyaspartartamid schwache Kationenaustausch HPLC-Säule (100 · 4,6 mm) wurde von der Nest Group (Southborough, MA) erhalten; Glycin und Bio-Sil G250 Größenausschluß HPLC- Säule (600 · 7,5 mm) wurden von Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA) erhalten; Polyacrylamid-Gelelektrophoresegele wurden von Novex (Encitas, CA) erhalten; Sequenzierungs- und Aminosäureanalysereagentien und Puver wurden von Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) erhalten; Trifluoressigsäure, konstant siedendes HCL, Hydrolysat-Aminosäurestandard und BCA-Protein-Testreagenzien wurden von Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) erhalten; Limulus-Amöbozytenlysat wurde von Whittaker Bioproducts Inc. (Walkersville, MD) erhalten; Lipopolysaccharid wurde von RIBI Immunochem Research, Inc. (Hamilton, MT) erhalten; HPLC-Grad Acetonitril wurde von J. T. Baker (Phillipsburg, NJ) erhalten; alle anderen Puffer und Salze, die verwendet wurden, waren von Reagenzgrad. 18 Megohm reines Wasser wurde durch das Lab- Five-Ultrapure Wassersystem von Technic (Seattle, WA) hergestellt. 0,5 M NaOH zur Reinigung wurde aus Reagenzgrad-NaOH-Pellets und USP-Wasser hergestellt.

2. Granulaextrake aus Neutrophilen

Diese wurden hergestellt wie beschrieben (U.S. Anmelde-Nr. 07/199,206, angemeldet 26. Mai 1988), mit der Ausnahme, daß die Percoll-Abtrennung der azurophilen Granulae ausgelassen wurde. Anstelle wurden Gesamtgranulafraktionen durch Zentrifugieren des post nuklearen Überstands bei 17.000 · g für 20 Minuten erhalten. Das Granulapellet wurde dann in einem Volumen von 1 ml von 50 mM Glycin, pH 2 für jede 4 · 10&sup8; Zellen, die lysiert wurden, suspendiert. Resuspendierte Granulae wurden durch 5 Einfrier/Auftauzyklen auf Trockeneis Ethanol, gefolgt von starkem Schütteln für eine Stunde bei 4ºC, lysiert. Der lösliche Extrakt wurde durch Zentrifugation bei 30.000 · g für 30 Minuten erhalten.

3. Limulus-Amöbozytenlysatassay

Dieser Test wurde wie durch den Hersteller angewiesen durchgeführt. Wo erforderlich, wurde der pH von Proben auf Neutralität durch die Hinzugabe von Pyrogenfreiem 0,5 M Phosphatpuffer, pH 7,4 eingestellt, und die Salinität wurde durch Verdünnung mit USP-Wasser auf < 150 mM verringert [Desch, C. E., et al. (1989) Infection and Immunity, 57: 1612-1614; Friberger, P. (1985)]. The design of a reliable endotoxin test. P. 139-149. In J. W. Cape (ed.). Bacterial endotoxins: structure, biomedical significance and direction with the Limulus amebocyte lysate test. Alan R. Liss, Inc., New York; Galanos, C., et al. (1979) Chemical, physiochemical and biologic properties of bacterial lipolysaccharides, p. 321-332. In E. Cohen (ed.) Biomedical application of the horseshoe crab (Limulidae). Alan R. Liss, Inc., New York; Byaston, K. F. and J. Cohen (1990) J. Med. Microbiol., 31: 73-83; Tahaka, D., et al. (1982) Biochem. Biophys. Res. Comm., 105: 717-723; Morita, T., et al. (1985) J. Biochem., 97: 1611-1620].

4. LPS-Neutralisierungstest

Dieser Test wurde wie vorher beschrieben durchgeführt [M. Marra et al. (1990) J. Immunol. 144 (2): 662-666)].

5. Hochsalzfraktionierung von Granulaextrakten

200 mg von extrahierten Proteinen wurde aus verschiedenen Präparationen vereinigt und auf Eis gehalten. Ein Volumen von sterilem 5 M NaCl wurde für jede 4 Volumen von Extrakt hinzugefügt. Das erhaltene Präzipitat wurde durch Zentrifugation bei 20.000 · g für 20 Minuten bei 4ºC pelletiert. Dieser Überstand wurde für die CM Sepharose Chromatographie durch Verdünnen mit 4 Volumen von USP-Spülwasser vorbereitet und der pH mit ausreichend 1 M Tris pH 7,4 eingestellt, um eine finale Konzentration von 50 mM zu ergeben. Nur frische, sterile Pyrogen-freie Vorratssalze- und puffer wurden verwendet.

6. CM Sepharose Chromatographie

Eine XK-16-Säule (Pharmacia) wurde mit ausreichend Harz gepackt, um ein Bettvolumen von 5 ml zu ergeben. Diese Säule wurde auf einer Gradienten FPLC installiert, die mit einer Pl-Pumpe zur Probenladung ausgerüstet war. Vor der Verwendung wurden alle Oberflächen in Kontakt mit der mobilen Phase ausführlich mit 0,1 M NaOH gewaschen. Die Säule wurde gespült durch Waschen bei 0,2 ml/min mit 0,5 M NaOH für 4 Stunden. Die Säule wurde dann re-equilibriert und ein Leerlauf wurde durchgeführt. Fraktionen von dem Leerlauf und die Eluenten wurden durch LAL-Test auf Pyrogenizität hin getestet. Vorbereiteter Extrakt wurde bei einer Flußrate von 400 ml/Stunde geladen. Sobald geladen, wurde die Säule mit 2 bis 3 Säulenvolumen von Startpuffer gewaschen. Der Granulaextrakt wurde auf Eis während der Beladung gehalten. Die Säule wurde bei Raumtemperatur laufen gelassen.

7. Schwache Kationenaustausch-HPLC

Die schwache Kationenaustausch-HPLC wurde unter der Verwendung einer Eldex ternären Gradientenpumpe, ausgerüstet mit einem Rheodyne-Injektor und einem Gilson-Modell 111B U.V. Detektor durchgeführt. Benäßbare Oberflächen wurden mit 0,5 M NaOH gewaschen, gefolgt von ausführlichem Spülen mit USP-Wasser, um alle Spuren von Base vor der Installation der Säule zu entfernen. Leerfraktionen und Eluenten wurden wie oben auf Pyrogenizität hin getestet.

8. Gelpermeations-HPLC

Gelpermeations-HPLC wurde unter denselben Vorsichtsmaßnahmen und der Ausrüstung durchgeführt, die für die schwache Kationenaustausch HPLC angegeben sind, mit der Ausnahme, daß die TDK-Säule nicht mit NaOH behandelt wurde.

9. Polyacrylamid-Gelelektrophorese

8 bis 16% Acrylamid-Gradientengele wurden von Novex gekauft und gemäß den Anweisungen des Herstellers laufen gelassen.

10. Proteinsequenz-Bestimmun

Ein Applied Biosystems 477A gepulster Flüssigphasensequenator, der mit einem 120A PTH Aminosäureanalyzer ausgerüstet war, wurde für den automatisierten Edman-Abbau verwendet.

11. Microbore-Umkehrphasen-HPLC

Das Material für die Proteinsequenzierung wurde durch Entsalzen auf einer 30 · 2,1 mm Aquapore-Butylsäule präpariert. Lösung A war 0,1% TFA in Wasser und Lösung B war 70% Acetonitril in Wasser mit 0,1% TFA. Der verwendete Gradient war 30 bis 100% B in 30 Minuten bei einer Flußrate von 200 ul/min. Die Detektoreinstellungen waren 214 nm Wellenlänge bei 2,0 Absorptionseinheiten volle Skala. Ein HP 3396A wurde verwendet, um die Daten zu integrieren und darzustellen.

12. Aminosäureanalyse

Die Aminosäureanalyse wurde auf dem oben beschriebenen System unter der Verwendung der PTC-Säule, Puffern und Trennbedingungen die von ABI zur Verfügung gestellt wurden, durchgeführt. Die Probenhydrolyse und PTC-Derivate wurden unter der Verwendung einer Pico-Tag Workstation der Waters-Chromatographie-Abteilung von Millipore unter der Verwendung der Protokolle des Herstelles präpariert.

13. Proteintests

Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung der BCA-Verfahrensanweisungen 23230, 23225 von Pierce Chemical Co. bestimmt. Um die Pufferinterferenz zu minimieren, wurden die Proben zehnfach verdünnt und das Microreagenzprotokoll wurde verwendet.

B. Ergebnisse

Von aus azurophilen Granulae gereinigtem BPI-Protein wurde früher gezeigt, daß es die Neutrophilen-Aktivierung durch LPS inhibiert und das es LPS in dem LAL-Assay direkt inhibiert. Um die Rolle von BPI-Protein weiter zu untersuchen und die Anwesenheit von anderen ähnlichen Molekülen in sowohl azurophilen und spezifischen Granulae zu untersuchen, wurde die Reinigung von LPS inhibitorischer Aktivität aus bei einem sauren pH extrahierten Gesamtgranulae unternommen. Vorläufige Untersuchungen verfizierten die Anwesenheit einer LPS inhibitorischen Aktivität in dem Rohextrakt.
Um die Endotoxin-neutralisierende Aktivität zu identifizieren, wurde dessen Reinigung aus Gesamtgranulaextrakten versucht. Die Reinigung von LPS neutralisierender Aktivität wurde durch die Beobachtung sehr erleichtert, daß hohe Konzentrationen von NaCl (1 M) die reversible Ausfällung von ungefähr 90% von in dem Granulaextrakt vorhandenen Protein verursachten. Im wesentlichen alles der LPS inhibitorischen Aktivität verblieb in dem löslichen Überstand. Die lösliche Fraktion wurde dann verdünnt, um die Ionenstärke zu verringern und weiter durch CM Sepharose Kationenaustausch-Chromatographie gereinigt und konzentriert. Ein breiter Aktivitäts-Peak eluierte, der anschließend weiter unter der Verwendung einer Polyaspartamid High- Performance Kationenaustauschsäule gereinigt wurde. Ein leicht schärferer Peak der Aktivität wurde aufgereinigt, der mit einem hauptsächlichen Protein von ungefähr 55.000 Molekulargewicht durch SDS-PAGE komigrierte, gemeinsam mit verschiedenen anderen Proteinen niedrigeren Molekulargewichts. Als finaler Reinigungsschritt wurde Gelpermeations-HPLC verwendet und identifizierte einen Aktivitäts-Peak der mit einem einzelnen scharfen Protein-Peak eluierte. Das gereinigte Protein migrierte als zwei dicht beabstandete Banden auf SDS-PAGE bei 55.000 Molekulargewicht, was ein Gemisch von glycosylierter und nicht-glycosylierter Spezies darstellte. 25% der gesamten Endotoxin-neutralisierenden Aktivität wurde mit einer 250-fachen Reinigung aufgereinigt.
Das gereinigte Endotoxin-neutralisierende Protein wurde einer Umkehrphasen HPLC unterzogen, gefolgt von N-terminaler Sequenzanalyse durch automatisierten Edman- Abbau. Die Sequenz wurde mittels vollständiger Homologie innerhalb von 39 Resten als bakterielles permeabilitäts-erhöhendes Protein identifiziert. Zusätzlich war die Aminosäurezusammensetzung des gereinigten Moleküls im wesentlich identisch zu dem von BPI-Protein (Daten nicht gezeigt).
Um zu untersuchen, ob die beiden dicht beabstandeten Banden BPI-Protein darstellten, wurden die gereinigten Proteine einer Western-Blot-Analyse unter der Verwendung von BPI-Protein-spezifischen Kaninchen-polyklonalem Antiserum unterzogen, das gegen ein synthetisches Peptid erzeugt wurde, das Aminosäuren 1-20 von BPI-Protein umfaßte. Beide Banden waren immunreaktiv. Die Unterschiede entstehen möglicherweise aufgrund von Glycosylierung.

Beispiel 4

LPS inhibitorische Aktivitäten von BPI-Protein in vitro

Die Reinigung von BPI-Protein unter streng Pyrogen-freien Bedingungen, wie supra beschrieben, führten zu einer potenteren BPI-Präparation. Die Inhibierung von LPS-vermittelter CR-Hochregulierung war bei 25 ng/ml BPI-Protein vollständig, was eine 4-fache Zunahme in der Aktivität im Vergleich zu dem in Teil I verwendeten Material darstellte. Auf einer molaren Basis inhibierte diese BPI-Proteinpräparation LPS bei ungefähr stöchiometrischen Anteilen, äquivalent zu molaren inhibitorischen Konzentrationen von Polymyxin B. BPI-Protein inhibierte auch die LPS-vermittelte TNF-Produktion durch menschliche adhärente mononukleare Zellen bei einer geringeren Konzentration, im Anschluß an die Reinigung unter Pyrogen-freien Bedingungen (Tabellen 7 und 8).
BPI-Protein bindet an LPS (Daten nicht gezeigt). In diesen Experimenten wurden 4 ug von LPS/Napfauf 96-Napf Plastikplatten immobilisiert, dann mit verschiedenen Konzentrationen von BPI-Protein inkubiert und anti-BPI-Protein polyklonalen Antiseren entwickelt. Die BPI- Proteinbindung an LPS wurde durch Polymyxin B inhibiert (Daten nicht gezeigt), was die Spezifität der BPI-Proteinbindung zeigte. BPI-Protein bindet an LPS in Anwesenheit von sowohl Plasma (Daten nicht gezeigt) und Serum (Daten nicht gezeigt), was die potentielle in vivo Effizienz von BPI-Protein zeigt. Tabelle 7 BPI-Protein inhibiert LPS-induzierte TNF-Produktion durch menschliche Monozyten TNF (pg/ml), produziert in Antwort auf LPS präinkubiert mit*:
* E. coli 0111:B4 LPS wurde mit BPI-Protein oder Polymyxin B (PMB) präinkubiert, dann zu adhärenten peripheren Blut-mononuklearen Zellen hinzugefügt. TNF-Produktion wurde durch ELISA getestet. Tabelle 8 Inhibierung von LPS-induzierter TNF-Produktion durch menschliche Monozyten TNF (pg/ml). produziert in Antwort auf LPS präinkubiert mit*:
* BPI-Protein oder Polymyxin B Sulfat wurden mit 0-10 ng/ml E. coli 0111:B4 LPS oder 0,1% w/v abgetöteter S. aureus präinkubiert, und dann adhärente periphere Blutmononukleare Zellen hinzugefügt. Die TNF-Produktion wurde durch ELISA getestet und ist als ng/ml angegeben.

Beispiel 5

Inhibierung von LPS-induzierter TNF-Produktion durch Neutrophile und rekombinantes CHO Zell-abgeleitetes BPI-Protein

Menschliche periphere Blut-mononukleare Zellen wurden auf Ficoll-Paque (Pharmacia) Gradienten isoliert, 2x in Pyrogenfreiem HBSS (Hazelton) gewaschen und bei 5 · 10&sup6;/ml in RPMI (Gibco) Medium ohne Serum resuspendiert. 200 ul dieser Zellsuspension wurden in jedem Napf von Flach-Boden 96-Napf Gewebekulturschalen (Costar) für 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Nicht adhärente Zellen wurden durch 2X Waschen mit RPMI + 10% autologem Hitze inaktiviertem Serum entfernt. Adhärente mononukleare Zellen wurden mit E. coli 0111:B4 LPS stimuliert, das für 30 Minuten bei 37ºC mit Puffer, BPI-Protein oder Polymyxin B (Gibco; 7900 U/ml) präinkubiert wurde. Die Überstände wurden 4 Stunden nach dem das LPS-Gemisch hinzugefügt wurde, geerntet. Die Sekretion von TNFα wurde durch ELISA (Endogen) quantifiziert (Ergebnisse in Tabelle 9). Tabelle 9 Inhibierung von LPS-induzierter TNF-Produktion durch menschlichem Monozyten
n = natürlich
r = rekombinant
Normal betäubte Mäuse wurden durch die intranasale Route mit 10 ng/ml E. coli 0111:B4 LPS konfrontiert (Ergebnisse in Tabelle 10). 20 Minuten vor der Konfrontation wurden die betäubten Mäuse über die intranasale Route mit 50 ul Saline, BPI-Protein oder Polymyxin B Lösung behandelt. Eine Stunde nach der LPS Konfrontation wurden die Mäuse wieder betäubt und 0,7 ml Kochsalzlösung, die 1% menschliches Serumalbumin enthielt, wurde über die Luftröhre zu den Lungen hinzugefügt. Die Lungen wurden sanft massiert. Ein 0,5 ml Volumen Broncheo-Alveolarer Lavage (BAL) Flüssigkeit wurde aspiriert, die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und die BAL-Probe wurde bei -70ºC gelagert. Der TNFα- Spiegel in der BAL-Flüssigkeit wurde durch Messen der Cytotoxizität gegen WEHI Klon 13 Mausfibrosarcomzellen bestimmt und ist in Tabelle 10 zusammengefaßt. Menschlicher rTNFα (Chiron) wurde als Standard verwendet. Tabelle 10 Inhibierung von TNFα-Produktion, wie in Broncheo-Alveolarer Lavage-Flüssigkeit gemessen

Beispiel 6

Expression von rekombinantem CHO Zell-abgeleitetem BPI-Protein

Rekombinantes CHO Zell-abgeleitetes BPI-Protein wurde wie in dem folgenden Beispiel beschrieben erhalten. Um BPI-Protein und/oder BPI-Proteinvarianten in Säugetierzellen zu erhalten, müssen die cDNA-Sequenzen in einen geeigneten Plasmidvektor eingeführt werden. Eine schematische Zeichnung der cDNA, die für BPI-Protein kodiert, ist in Fig. 1 gezeigt. Ein für eine solche Anwendung geeigneter Vektor ist pSV-1, der den Origin-of-Replication und die frühen und späten Promotoren von SV40 enthält, gefolgt durch multiple Einfügungsklonierungsstellen, gefolgt durch die Terminationssequenzen des Hepatitis B-Oberflächen- Antigens (Fig. 5). Auch enthalten innerhalb des Plasmids sind ein Origin der bakteriellen DNA-Replikation und die Gene, die für Ampicillin-Resistenz und Dihydrofolat-Reduktase kodieren. Ähnliche Vektoren wurden verwendet, um andere Fremdgene zu exprimieren (McGrogan, et al., Biotechnology 6, 172-177). Die Vektor-DNA wurde zur Aufnahme der BPI-Protein cDNA-Sequenzen durch Verdau mit HindIII and BamHI und Dephosphorylierung mit alkalischer Phosphatase präpariert.
Mehrere BPI-Proteine und BPI-Varianten cDNA-enthaltende Inserts wurden zur Insertion in pSV-1 hergestellt. Zuerst wurde ein Insert, das für BPI-Protein kodierte, durch Verdau des Ausgangsplasmids mit geeigneten Restruktionsenzymen, z. B. EcoRI und BgIII hergestellt, was zwei DNA-Fragmente ergab, die Teile der für BPI-Protein kodierenden Sequenz enthielten. Diese zwei Fragmente wurden in vorbereiteten SV-1 zusammen ligiert und die erhaltenen rekombinanten Klone wurden durch Restriktionsenzymverdau auf die Anwesenheit der zwei Inserts in der richtigen Orientierung hin gescrennt. Zwei cDNAs, die für verkürzte Formen von BPI-Protein kodierten, wurden unter der Verwendung von Oligonukleotid-gesteuerter DNA Amplifikation der Ausgangs-BPI-Insert-DNA erzeugt. Die amplifizierenden Oügos waren so aufgebaut, um die Codons 212 (Oligo 459) (Fig. 2) und 337 (Oligo 460) (Fig. 3) durch Stoppcodons zu ersetzen, zusätzlich zu einer BamHI Klonierungsstelle. An dem 5'- Ende von beiden Konstrukten wurde Oligo 458 in den Amplifikationen verwendet, um eine HindIII-Stelle unmittelbar stromaufwärts des Translations-Startcodons ATG (Fig. 4) zu erzeugen. Daher wurden drei BPI-Varianten kodierende Inserts erzeugt, die jeweils für 55 kDa, 38 kDa und 25-kDa Teile von BPI-Protein kodierten, und jedes wurde getrennt in vorbereitete Vektor-DNA ligiert. Fig. 9 und 10 zeigen die Aminosäuresequenz jeweils der 38 kDa- und 25 kDa-Teile.
Jedes der drei Konstrukte wurde durch Restriktionsverdauanalyse verifiziert und dann in Mengen hergestellt, die zur Transfektion in CHO-Zellinien DUXB11-Zellen ausreichend waren. Die Transfektion wurde unter der Verwendung von Lipofectin durchgeführt, und die erhaltenen transformierten Zellen wurden in der Anwesenheit von zunehmenden Mengen von Methotrexat unter Verwendung von Protokollen, die Standard im Stand der Technik sind, selektiert. Die transformierten Zellen wurden unter Standardbedingungen im Stand der Technik kultiviert, und Überstände von entweder transfizierten Pools oder Klonen, die aus den Pools erhalten wurden, wurden auf BPI-Protein oder BPI-Variante durch das infra diskutierte BPI-Protein ELISA-Verfahren getestet.
Fig. 7 zeigt die SDS-PAGE Analyse von nativem BPI-Protein und Chargen von CHO- abgeleitetem rekombinantem BPI-Protein. Rekombinantes BPI-Protein läuft als eine einzelne Bande auf einem SDS-PAGE Gel bei ungefähr 55 kDa. Rekombinante BPI-Proteine, wie in CHO-Zellen produziert wurden, zeigen ein leicht verändertes Laufmuster auf SDS-PAGE im Vergleich zu nativen Proteinen, was anzeigt, daß das Molekül auch unterschiedlich in CHO- Zellen prozessiert wird, anders als in Neutrophilen oder HL60-Zellen. Solches Prozessieren kann entweder verantwortlich sein für oder ein Ergebnis davon sein, daß das Molekül sekretiert wird, und nicht in Granula-Membranen verpackt wird. Die Aminosäureanalysen von rekombinantem BPI und nativem BPI sind in Tabelle 11 gezeigt, die zeigt, daß die beiden im wesentlichen dieselben sind. Tabelle 11 Aminosäurezusammensetzung von rekombinantem BPI 148179
(C, W nicht quantifiziert)

Beispiel 7

Expression von rekombinantem BPI-Protein in Insektenzellen

1. Konstruktion von Plasmidexpressionsvektor

Um BPI-Protein und/oder BPI-Proteinvarianten in Insektenzellen herzustellen, muß die cDNA-Sequenz zuerst in einen geeigneten Plasmidexpressionsvektor, wie zum Beispiel pAC373 (siehe Fig. 6-1 und 6-2), eingefügt werden. Geeignete Restriktionsstellen für diese Einfügung wurden durch Standard-Stellen-gerichtete Mutageneseverfahren hergestellt. Die wesentlichen Eigenschaften eines geeigneten Expressiosvektors schließen einen Transkriptionspromotor, wie zum Beispiel den Polyhedron- Genpromotor von pAC373 ein, und flankierende homologe Sequenzen, um die Rekombination in das Baculovirus-Genom zu vermitteln. Ein Polyadenylierungssignal, wie das in diesem Plasmidvektor vorhandene Polyhedron-Gen kann oder kann nicht für die Expression des rekombinanten Gens erforderlich sein. Ein Markergen, wie zum Beispiel das beta-Galactosidasegen von E. coli, direkt im Anschluß an regulatorische Sequenzen, die ein Transkriptionspromotor und möglicherweise ein Polyadenylierungssignal einschließen, können in dem Vektor enthalten sein, jedoch ist dies nicht für die Expression des bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Proteins essentiell. Ein typischer Vektor für solche Zwecke, pAC373, ist in Fig. 6-1 und 6-2 gezeigt.

2. Herstellung von rekombinantem Baculovirus

Ein chimärer Baculovirus wurde durch homologe Rekombination zwischen dem Expressionsplasmid, daß das BPI-Protein-Zielgen (oder Verkürzungen davon, die wie supra beschrieben davon abgeleitet sind) enthielt und Wildtyp Baculovirus DNA erzeugt. Plasmid- und Wildtyp-Baculovirus DNA wurden durch die Calziumphosphattechnik co-präzipitiert und zu nicht infizierten Spodoptera frugiperda (Sf9) Insektenzellen hinzugefügt. Vier bis sieben Tage im Anschluß an die Transfektion zeigten die Zellen eine cytopathologische Morphologie und enthielten die Kernausschlußkörperchen, die typischerweise durch virale Infektion produziert werden. Das Zell-freie Kulturmedium, enthaltend sowohl Wildtyp und rekombinanten Virus, wurde geerntet und auf BPI-Protein Inaktivität hin getestet.

3. Identifizierung und Isolierung von chimärem Baculovirus

Klonale Isolate von Virus wurden aus diesem co-transfizierten Vorrat durch Plaque- Reinigung auf Sf9-Zellmonolagen, überschichtet mit Agarose, erhalten. Kandidaten- Plaques für die Analyse werden durch eine für Ausschlußkörperchen negative Plaque- Morphologie identifiziert. Falls das Expressionsplasmid ein Markergen, wie zum Beispiel beta-Galactosidase enthält, werden rekombinante Plaques durch die blaue Farbe angezeigt werden, die von einem chromogenen Substrat, wie zum Beispiel 5-Brom-4- chloryl-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal) in dem Agarose-Plattierungsmedium produziert wird. Ausgestochene Plaques werden zur Beimpfung von Zellen in multi- Napf-Schälchen verwendet werden. Die so erhaltenen Zelllysate und infizierten Zellüberstände können auf die Expression von rekombinanten BPI-Protein unter der Verwendung von Standard-Aktivitäts- oder immunologischen Tests hin evaluiert werden. Positive Näpfe können zusätzliche Runden von Plaque-Reinigung erfordern, um reine rekombinante Virusvorräte, frei von Wildtypkontamination, zu erhalten.

4. Chargenproduktion von BPI-Protein

sf9-Zellen wurden an Wachstum in Serumfreiem, Niedrigproteinmedium, wie zum Beispiel ExCell (J. R. Scientific) adaptiert. Die Zellen wurden aus Suspensionskultur durch sanfte Zentrifugation gesammelt und in frischem Medium resuspendiert, daß das virale Inoculum bei einer Konzentration von 10 Millionen Zellen pro ml enthielt, unter der Verwendung eines Vielfachen von Infektion einer Virus-Plaque bildenden Einheit pro Zelle. Nach einer Zeitdauer von 2 Stunden wurde die Kultur 5-fach mit frischem Medium verdünnt und für 2 bis 3 Tage inkubiert. Am Ende dieser Zeit wurden die Zellen durch Zentrifugation pelletiert und das konditionierte Medium wurde geerntet. BPI-Protein wurde aus dem Zell-freiem Überstand durch Standardmittel gereinigt.

5. Charakterisierung von Insektenzellen abgeleitetem BPI-Protein

Unter der Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystems ist in Insektenzellen produziertes BPI-Protein ein glycosyliertes Protein von ungefährem Molekulargewicht von 55.000 kD. Die N-terminale Aminosäuresequenz ist identisch zu der von reifen Säugetier Zell-produzierten BPI-Protein, was eine korrekte Prozessierung der Signalsequenz anzeigt. Die spezifische Aktivität von Endotoxinbindung von rekombinanten Protein war nicht aus natürlichen Quellen erhaltenem BPI-Protein unterscheidbar.

Beispiel 8

Expression von rekombinanten BPI-Protein mit Signalsequenz in E coli

A. Konstruktion von pT7BPI-Proteinplasmiden

Oligonukleotide wurden auf einem Applied Biosystems 380B DNA-Synthesizer zur Verwendung bei der Oligonukleotid-gerichteten DNA-Amplifikation hergestellt. Die Oligonukleotide wurden mit NdeII und BamHI Restriktionsstellen an den jeweiligen 5'- und 3'-Enden der BPI-Protein DNA erzeugt. Zusätzlich wurde ein anderes Oligonukleotid, das eine BamHI-Restriktionsstelle enthielt dazu verwendet, um die verkürzte Prolin-212-Version der BPI-Protein DNA zu erzeugen.
Im Anschluß an die Amplifikationsreaktionen wurden die Fragmente gereinigt und mit NdeI und BamHI verdaut. Das Plasmid pGEMEX-I (erhältlich von Promega) wurde als der Vektor für die Konstruktion ausgewählt. PGEMEX-1 enthält einen T7- Promotor, der für die Expression von stromabwärts liegenden Sequenzen verwendet werden kann, wenn in dem geeigneten Wirt plaziert. Der Vektor wurde mit BamHI gespalten und nach der Reinigung partiell mit NdeI verdaut, um einen Vektor mit einer einzelnen NdeI-Stelle und einer einzelnen BamHI-Stelle zu erzeugen. Die Fragmente wurden ligiert und in den E. coli JM101 unter der Verwendung des Hanahan- Transformationsprotokoll transformiert. Die transformierten Bakterien wurden auf LB-Platten plattiert die Carbamicillin enthielten und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Resistente Kolonien wurden ausgewählt und durch Präparieren von Mini- Plasmidpräparationen und Verdauen mit den geeigneten Restriktionsenzymen analysiert. Die Verdaue wurden auf sowohl 1% Agarosegele und 5% Polyacrylamidgelen analysiert.
Der Expressionswirt, E. coli-Stamm JM109 (DE3) wird unter der Verwendung von 1 ul der Mini-Plasmidpräparation und dem Hanahan-Transformationsprotokoll transformiert (DNA Cloning: A Practical Approach, Vol I, D. M. Glover Ed., IRC Pr. Ltd., Chapter 6, pp. 109-135 (1985). JM109 (DE3) enthält eine chromosomale Kopie des Gens für T7-RNA-Polymerase, die mit IPTG induziert werden kann. Die transformierten Bakterien wurden auf LB-Platten plattiert, die Carbamicillin enthielten und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Ergebnisse sind nicht gezeigt.

B. Ergebnisse

Wenn eine Signalsequenz an die reife BPI-Protein cDNA-Sequenz in dem Expressionsplasmid operativ angebracht wird, wie in einem Vollängenklon zur Verfügung gestellt und durch Gray, et al. berichtet [Journ. of Biol. Chem., 264: 9505 (1989)] werden keine bakteriellen Kolonien erhalten, wohingegen zahlreiche Kolonien erhalten werden können, wenn die Signalsequenz deletiert wird. Weil die Voll-Längen- und Prolin- 212-verkürzten Formen von BPI-Protein, die das Signalpeptid enthielten, keine Kolonien ergeben, wohingegen diejenigen Formen, die nicht das Signalpeptid enthalten, Kolonien ergeben, wurde das BPI-Protein in einer aktiven Form exprimiert und wird korrekt prozessiert, wobei das Protein in den periplasmatischen Raum des Bakteriums (den Ort in Bakterien, in dem Proteine geschickt werden, die ein Signalpeptid besitzen), wo die bakterizide Aktivität die Zellen abtötet. Dies impliziert auch, daß sowohl die Vollängen-Form und die Prolin-212 verkürzte Form aktiv sind und zu einer bakteriziden Aktivität in der Lage sind.

Beispiel 9

Expression von rekombinantem E. coli-abgeleiteten BPI-Protein

1. Erzeugung eines BPI-Proteinexpressionsvektors

Um ein Konstrukt zur E. coli Expression zu erzeugen, wurde die für BPI-Protein kodierende Sequenz aus dem CHO-Zellexpressionsvektor durch PCR, unter der Verwendung der Oligonukleotide:
BPI.forward 5'C.ACC.GCC.GTG.ACA.CAT.ATG.GTC.AAC.CCT.GGC.GTC
BPI.reverse 5'GAC.GTT.CTC.TAT.AAA.TGA.AGG.ATC.CTA.GCT.C,
subkloniert, wobei jeweils eine NdeI und BamHI-Stelle erzeugt wurde. Das sich ergebende Fragment wurde mit NdeI und BamHI geschnitten und in pGEMEX-1 Vektor (Promega) subkloniert.
Der pGEMEX E coli Expressionsvektor enthält drei RNA-Polymerasefrägmente. Stromabwärts von Gen 10 befindet sich eine Multiple-Cloning-Sequenz. Im Leseraster Subklonierung kann durchgeführt werden, um Fusionsproteine zu erzeugen, falls das Protein von Interesse die geeigneten Restriktionsstellen im Leseraster aufweist.
Um die mit Fusionsproteinproduktion assoziierten Probleme zu vermeiden, wurde die Gen 10 Region aus pGEMEX entfernt, jedoch wurden die T7 RNA- Polymerasebindungsstelle und die NdeI- und BamHI-Klonierungsstellen beibehalten: Um dies zu erreichen, wurde die NdeI-Stelle bei 3251 durch partiellen Verdau, gefolgt von Klenow Auffüllen und Re-Ligation entfernt. Dies Plasmid wird als pT7BPI bezeichnet. Die korrekte Sequenz wurde durch Sequenzierung der gesamten kodierenden Region für BPI-Protein, jedoch mit der Vorläufersequenz deletiert, bestätigt, so daß die erste Aminosäure, für die das Plasmid kodiert, Methionin ist.

2. Mutagenese für Konstruktion von BPI-Varianten

Das Plasmid pT7BPI weist einen f1 ori zur Herstellung von einzelsträngiger DNA auf. Dieses pT7BPI wurde in den E. coli Stamm CJ236 zur Herstellung von ssDNA transformiert, die als ein Templat für Stellen-gerichtete Mutagenese gemäß dem Verfahren von Kunkel [(Kunkel, T. A. (1988) in Nucleic Acids and Molecular Biology (Eckstein, F., Lilley, D. M. J. Eds.) Vol. 2, p. 124, Springer-Verlag, Berlin und Heidelberg] verwendet wurde. Mutagene Oligonukleotide wurden mit Homologie an der 5'-Seite und 12 Nukleotiden exakter Homologie auf der 3'-Seite des fehlpaarenden Kodons oder der Kodone, die der Stelle der Mutation entsprechen, erzeugt. Das mutagene Oligonukleotid wurde unter der Verwendung von OPC-Säulen, wie durch ABI beschrieben, gereinigt, durch Standard enzymatische Techniken phosphoryliert, an in CJ236 Zellen erzeugte ss-pT7BPI anhybridisiert, bei 37ºC mit T7 DNA Polymerase verlängert und mit T4-Ligase ligiert. Die sich ergebende geschlossene zirkuläre ds-DNA wurde gemäß Standardprotokollen (siehe, z. B. Sambrook, et al.) in RecA+ Ei coli, wie zum Beispiel JM101 transformiert und plattiert. Einzelne Kolonien wurden zur Produktion von ds-DNA zur doppelsträngigen Sequenzierung durch Standardtechniken angezogen. Klone mit der korrekten Mutation wurden in JM109 (DE3) zur Expression transformiert.

3. Expression von BPI-Protein

JM109 (DE3) enthält eine chromosomale Kopie des Gens, das für T7 RNA- Polymerase kodiert, unter der Kontrolle des induzierbaren lac-Promotors. JM109 (DE3) die pTBPI (oder eine Variante von BPI) enthalten, wird über Nacht in 2xYT- Medium (Bio101, La Jolla, CA) + 0,2% Glucose + 100 mg/ml Carbenicillin bei 26- 37ºC angezogen. Geringe Temperatur und hohe Nährstoff-enthaltende Lösung ist bei der Erzeugung von produktiven Beimpfungen hilfreich. Das Inoculum wird 1 : 250 bis 1 : 500 verdünnt und auf OD600nm &sim; 1 in einer Schüttelflasche oder OD600nm &sim; 50 in einem Fermenter bei 26-37ºC angezogen und mit IPTG bei 0,1-1,0 mM für 4-24 Stunden induziert. Die Bakterien werden durch Zentrifugation gesammelt, in 10 mM TRIS, pH 8,1 mM EDTA resuspendiert und durch Hochdruckhomogenisierung aufgebrochen. Wenn Bakterien bei 37ºC angezogen wurden, wie es Standard im Stand der Technik ist, wurde im wesentlichen alles des BPI-Proteins unlöslich in Einschlußkörperchen produziert. Jedoch, wenn die Temperatur unterhalb von 37ºC verringert wurde, wurden ansteigende Mengen von BPI-Protein in löslicher, aktiver Form aufgereinigt.

Ergebnisse

1. Expression von unlöslichem BPI-Protein in E. coli

Die Expression bei 37ºC führte vorherrschend zur Produktion von BPI-Protein in unlöslichen Einschlußkörperchen, wie durch Lichtmikroskopie identifiziert. E. coli Zellen wurden in Tris pH 6,0 mit einem Ultra-Turrax Homogenizer lysiert. Die Einschlußkörperchen wurden durch Zentrifugation gesammelt, mit 1 M NaCl, 0,05% Triethylamin gewaschen und das Protein durch schnelle Verdünnung von einer 6 M Guanidinlösung in verschiedene Puffer hinein neu gefaltet. BPI-Protein wurde durch einen Fanglauf von Fast S Sepharose gereinigt und mit 0,6 M NaCl eluiert, auf 0,25 M NaCl verdünnt und über eine Fast Q Sepharose passiert, um Endotoxin zu entfernen und auf Fast 5 Sepharose zurückgefangen und mit 0,6 M NaCl oder einem Gradienten von 0,25 bis 1 M NaCl eluiert. Die Neufaltung führte unter einer Vielzahl von Bedingungen zu aktivem BPI-Protein mit ungefähr 0,1% Ausbeute aus dem gesamten BPI (d. h. 1 mg/g gesamtes BPI).

2. Expression von löslichem aktivem BPI-Protein in E. coli

Alternativ wurde gefunden, daß BPI-Protein in einer löslichen Form innerhalb von E. coli, durch Einstellen der Fermentationsbedingungen erzeugt werden konnte. Eine größere Ausbeute von löslichem BPI-Protein wurde gefunden, als die Fermentationstemperatur von 37ºC auf 26ºC verringert wurde, mit einem einhergehenden Verlust im Einschlußkörperchenmaterial. Dies wurde in Schüttelflaschenkulturen, angezogen in 2xYT-Medium (Bio101, La Jolla, CA) + 0,2% Glucose + 100 mg/ml Carbenicillin gezeigt. Die Fähigkeit, BPI-Protein herzustellen, ist relativ unerwartet, da BPI-Protein für E. coli bakterizid ist und BPI-Proteinkonstrukte mit einer Vorläufersequenz, die dazu aufgebaut ist, um BPI-Protein in den periplasmatischen Raum zu sekretieren, zu Zelltod führt. Jedoch wird hier gezeigt, daß BPI-Protein, das nicht sekretiert wurde, sondern im Zytoplasma zurückgehalten wurde, in hohen Konzentrationen ohne Zelltod beibehalten werden kann. Um lösliches BPI-Protein zu reinigen, wurde das Zellysat aus dem Aufbrechnungsschritt (Aufbrechen durch Mikrofluidizer) durch Zentrifugation und Filtration, gefolgt von Zentrifugation und Filtration geklärt und das lösliche Protein, wie unten beschrieben, gereinigt. Alternativ können Zellysate durch Behandlung mit Polykationen, wie zum Beispiel Polyethylenimin oder Biocryl (Toso Haas) geklärt werden. Die Erzeugung von löslichen Material weist viele Vorteile auf, d. h. es gibt keine Neufaltungsschritte und es gibt eine größere Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge.
BPI-Protein wurde mit Ausbeuten hergestellt, die ungefähr 1 mg pro Liter an Produktion entsprachen, bei einer Zelldichte von 1 OD600nm. Durch Verwendung von Standardchargen-Zuführungsfermentationstechniken kann die Gesamtproduktion signifikant verbessert werden, um Zelldichten von höher als 50 OD600nm zu erreichen. Ein Beispiel würde es sein, die Bakterien in ein Medium an zuimpfen, das aus 8 g prö Liter Trypton, 5 g pro Liter Hefeextrakt, 2,5 g pro Liter NaCl, 2 g pro Liter Glucose und 50 ug pro ml Carbenicillin besteht, mit einer Zuführung von 100 g pro Liter Trypton, 60 g pro Liter Hefeextrakt, 200 g pro Liter Glucose und 0,1 g pro Liter Carbenicillin und einem gehaltenen pH von 7,1 und gelösten Sauerstoff bei 50%. Diese E. coli Synthese eines für E. coli toxischen Proteins stellt einen wesentlichen Fortschritt im Stand der Technik der BPI-Proteinproduktion dar.
Die Fermentationsbedingungen können durch den Fachmann variiert werden, um die Produktion zu maximieren. Weitere Fortschritte zur Erhöhung der Menge an löslichem BPI-Protein schließen Überexpression von zellulären Cofaktoren oder Chaperon- Proteinen ein, die nötig oder vorteilhaft für die BPI-Proteinfaltung in der Zelle sind. Auch könnte man die Aminosäurestruktur von BPI-Protein optimieren, während dessen biologische Aktivität beibehalten wird, um so eine aktive BPI-Proteinvariante zu produzieren, die bei einem hohen Spiegel in Bakterien exprimiert wird.
In Chinese-Hamster-Ovary-Cells produziertes BPI-Protein wandert mit einer höheren molekularen Masse auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS- PAGE), als in E. coli produziertes BPI-Protein, was anzeigt, daß diese Moleküle in Säugetierzellen, anders als in E. coli, unterschiedlich prozessiert werden (Fig. 11).

3. Reinigung von E. coli-abgeleitetem BPI-Protein

Die Reinigung von BPI-Protein aus E. coli-Lysaten stellt verschiedene zu überwindende Hindernisse dar. BPI-Protein ist ein potentes Endotoxin-bindendes Molekül und experimentelle Hinweise haben gezeigt, daß mehr als 100 Millionen Endotoxineinheiten pro ml in dem E. coli-Zellysat vorhanden sind (basierend auf dem Limulus- Amöbozyten-Lysattest). Daher ist das in E. coli produzierte BPI-Protein an Endotoxin komplexiert und mit Zellwandfragmenten assoziiert. Um gereinigtes lösliches aktives BPI-Protein aus E. coli zu erhalten, muß das BPI-Protein von seinem Endotoxin abgereinigt werden, während es seine Aktivität beibehält. Diese Schwierigkeiten wurden nun mit einer Kombination von Schritten überwunden, die so aufgebaut sind, um hochgereinigtes, lösliches, aktives Endotoxin-freies BPI-Protein aus E. coli herzustellen.

4. Reinigungsverfahren A

E. coli-Bakterien, die BPI-Protein exprimieren, wurden durch Hochdruckhomogenisierung (Microfluidics, Newton, MA) in 10 mM Tris 1 mM EDTA, pH 8, lysiert. Zentrifugation und Filtration wurden verwendet, um verbleibende Gesamtzellen und Zellrückstände zu entfernen. MgCl&sub2; wurde auf 500 mM hinzugefügt und für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Essigsäure wurde hinzugefügt, um den pH auf 4,0 zu verringern. Zusätzliche Inkubation, 30 Minuten bei 37ºC, verursachte die Ausfällung Vieles der kontaminierenden Proteine, Lipide und DNA. Nach Zentrifugation und Filtration blieb. BPI-Protein löslich im Überstand zurück. Es wurde 3x verdünnt und an einen Kationenaustauscher, z. B. Poros HS (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA), Fast 5 Sepharose, oder CM Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) gebunden. Eine Serie von. Waschschritten folgte: pH 6,5, 8,5 und 10,0. Der pH wurde unter der Verwendung eines geeigneten Puffers auf 6 zurückgebracht, und die Elution wurde mit einem 0-2 M NaCl Gradienten oder Schrittelution erreicht. Der pH des Eluenten wurde auf 8,5 angehoben und die Lösung wurde durch einen geeigneten Anionenaustauscher, z. B. Poros HQ, Fast Q Sepharose oder DEAE Sepharose passiert, um jegliches Verbleiben des Endotoxin und DNA, sowie kontaminierende anionische Verbindungen zu entfernen. BPI-Protein bindet nicht unter diesen Bedingungen. BPI-Protein wurde dann an eine andere Kationenaustauschsäule gebunden und mit entweder einem Gradienten oder einem Schritt von NaCl eluiert. Die N-terminale Sequenz von BPI-Protein wurde durch automatisierten Edman-Abbau bestätigt und die Aktivität durch Inhibierung im Limulus-Amöbozyten-Lysattest verifiziert (Fig. 13).

5. Reinigungsverfahren B

Mit Endotoxin komplexiertes BPI-Protein, wie es in dem Zellysat vorhanden ist, wird nicht an Kationenaustausch binden. Daher kann als ein alternatives Reinigungsschema das Zellysat über eine Kationenaustauschsäule, wie z. B. Poros HS (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA), Fast S Sepharose oder CM Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) bei dem niedrigsten möglichen pH, bei dem der BPI-Protein- Endotoxinkomplex nicht binden wird, passiert werden. Dies entfernt viele der kontaminierenden kationischen Gruppen, die sonst mit BPI-Protein in einem anschließenden Kationenaustauschschritt co-eluieren würden. Der Säulendurchfluß wird dann auf 500 mM MgCl&sub2; gebracht, 30 Minuten bei 37ºC inkubiert und der pH mit Essigsäure auf 4,0 eingestellt. Nach Zentrifugation und Filtration ist BPI-Protein im Überstand löslich. Das BPI-Protein wird dann 3x verdünnt und an einen Kationenaustauscher, z. B. Poros HS (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA), Fast 5 Sepharose oder CM Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) gebunden. Eine Serie von Waschschritten würde folgen: pH 6,5, 8,2 und 10,0. Der pH wird dann in einem geeigneten Puffer auf 6 zurückgebracht und die Elution mit einem 0-2 M NaCL-Gradienten oder Schrittelution erreicht. Der pH des Eluenten wird dann auf 8,5 angehoben und die Lösung durch einen geeigneten Anionenaustauscher, z. B. Poros HQ, Fast Q Seqharose oder DEAE- Sepharose passiert, umd jegliches verbleibendes Endotoxin und DNA, sowie kontaminierende ionische Verbindungen zu entfernen. PBI bindet nicht unter diesen Bedingungen. BPI-Protein wird dann an eine andere Kationenaustauschsäule gebunden und mit entweder einem Gradienten oder einem Schritt von NaCl eluiert. BPI-Protein wird dann in 10 mM Natriumsuccinat, 110 mM NaCl, pH 6,0 durch Größenausschlußchromatographie unter der Verwendung von Sepharose CL-6B formuliert.

6. Reinigungsverfahren C

Ein alternatives Lyseprotokoll würde die Verwendung von Additiven einschließen, die die Bildung von BPI-Protein-Endotoxinkomplexen verhindern würden. Magnesiumchlorid würde mit pH bei entweder 8 oder 4 zu der Zellsuspension vor der Lyse hinzugefügt. Die Lyse würde durch Hochdruckhomogenisierung erreicht werden. Nach Zentrifugation und Filtration wäre BPI-Protein im Überstand löslich. BPI-Protein würde 3x verdünnt und an einen Kationaustauscher, z. B. Poros HS (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA), Fast-S-Sepharose oder CM-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) gebunden werden. Eine Serie von Waschschritten würde folgen: pH 6,5, 8,5, 10,0. Der pH würde in einem geeigneten Puffer zurück auf 6 gebracht werden und die Elution mit einem 0-2 M NaCl-Gradienten oder Schrittelution erreicht werden. Der pH des Eluenten würde auf 8,5 angehoben werden und die Lösung durch einen geeigneten Anionenaustauscher, z.b. Poros HQ, Fast Q-Sepharose oder DEAE-Sepharose passiert werden, um jegliches verbleibendes Endotoxin und DNA sowie Kontaminieren anionischer Verbindungen zu entfernen. BPI-Protein bindet nicht unter diesen Bedingungen. BPI-Protein würde dann an eine andere Kationenaustauschsäule gebunden und mit entweder einem Gradienten oder einem Schritt von NaCl eluiert werden. BPI- Protein würde dann in 10 mM Natriumsuccinat, 110 mM NaCl, pH 6,0 durch Größenausschlußchromatographie unter der Verwendung von Sepharose CL-6B formuliert werden.

7. Verwendung von Endotoxin-entfernenden Mitteln

Endotoxin-entfernende Polykationen, wie z. B. Polyethylimin oder BioCryl (Toso Haas) können zu Zellen hinzugefügt werden, die als nächstes durch Hochdruckhomogenisierung lysiert werden. Nach Zentrifugation und Filtration wäre BPI-Protein im Überstand löslich. BPI-Protein würde an einen Kationenaustauscher, z. B. Poros HS (Perceptive Biosystems, Cambridge, MA), Fast-S-Sepharose oder CM-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) gebunden werden. Eine Serie von Waschschritten würde folgen: pH 6,5, 8,2 und 10,0. Der pH würde in einem geeigneten Puffer auf 6 zurückgebracht werden und die Elution mit einem 0-2 M NaCL-Gradienten oder Schrittelution erreicht werden. Der pH des Eluenten würde auf 8,5 angehoben werden und die Lösung durch einen geeigneten Anionenaustauscher, z. B. Poros HQ, Fast-Q- Sepharose oder DEAE-Sepharose passiert werden, um jegliches verbleibendes Endotoxin und DNA sowie kontaminierende anionische Verbindungen zu entfernen. BPI- Protein bindet nicht unter diesen Bedingungen. BPI-Protein würde dann durch eine andere Kationenaustauschsäule gebunden werden und mit entweder einem Gradienten oder einem Schritt von NaCl eluiert werden. BPI-Protein würde dann in 10 mM Natriumsuccinat, 110 mM NaCL, pH 6,0 durch Größenausschlußchromatographie unter Verwendung von Spharose CL-6B formuliert werden.

8. Entfernung von Endotoxin aus der äußeren Membran vor der Zellyse

Alternativ könnte die äußere Membran von den Bakterien vor der Lyse entfernt werden, wodurch das Endotoxin und der Bedarf für anschließende Endotoxinentfernung bei der Reinigung entfernt würde. Ein Beispiel wäre es, bivalente Chelat-bildende Reagenzien, wie z. B. EDTA oder EGTA hinzuzufügen oder durch Hinzugabe eines Detergens, wie z. B. Triton X-100 [S. T. L. Harrison, Biotech. Adv. 9: 217-240 (1991)].

9. Entfernung von Endotoxin aus BPI-Protein durch chromatographische Verfahren

Endotoxin kann von BPI-Protein durch Passieren von BPI-Protein durch einen Anionaustauscher, z. B., Poros HQ, Fast-Q-Sepharose oder DEAE-Sepharose bei einem hohen pH (8,5 oder darüber) entfernt werden oder durch Binden von BPI- Proteinen an einen kationischen Austauscher, z. B. Poros HS (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA), Fast-S-Sepharose oder CM-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) und ausführlichem Waschen bei hohem pH vor der Elution mit NaCl. Die BPI- Protein-exprimierenden E. coli könnten dann in einem niedrigen pH-Puffer, z. B. 20 mM Natriumacetat pH 4,0 vor der Lyse durch Hochdruckhomogenisierung suspendiert werden. Alternativ könnte der pH nach der Lyse verringert werden. Nach Zentrifugation und Filtration wäre BPI-Protein löslich im Überstand. BPI-Protein würde an einen Kationenaustauscher, z. B. Poros HS (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA), Fast- S-Sepharose oder CM-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) gebunden werden. Eine Serie von Waschschritten würde folgen: pH 6,5, 8,5 und 10,0. Der pH würde in einem geeigneten Puffer zurück auf 6 gebracht und die Elution mit einem 0-2 NaCl- Gradienten oder Schrittelution erreicht werden. Der pH des Eluenten würde auf 8,5 angehoben werden und die Lösung durch einen geeigneten Antionenaustauscher, z. B. Poros HQ, Fast-Q-Sepharose oder DEAE-Sepharose passiert werden, um jegliches verbleibendes Endotoxin und DNA sowie kontaminierende anionische Verbindungen zu entfernen. BPI-Protein bindet nicht unter diesen Bedingungen. BPI-Protein würde dann an eine andere Kationenaustauschsäule gebunden werden und mit entweder einem Gradienten oder Schritt von NaCl eluiert werden. BPI-Protein würde dann in 10 mM Natriumsuccinat, 110 mM NaCl, pH 6,0 durch Größenaustauschchromatographie unter der Verwendung von Sepharose CL-6B formuliert werden.

10. Aktivitätstest von BPI-Protein

BPI-Protein, produziert in löslicher Form bei niedrigen Temperaturen in E. coli und, wie oben in Reinigungsverfahren A beschrieben, gereinigt, wurde in dem Limulus- Amöbozytenlysat-(LAL)-Test auf seine Fähigkeit hin getestet, Endotoxin zu neutralisieren. Dieser Test basiert auf der Fähigkeit von Gram-negativem bakteriellem Endotoxin, die Aktivierung eines Pro-Enzyms in dem LAL zu katalysieren. Die anfängliche Aktivierungsrate wird durch die Rate der Farbbildung unter der Verwendung des Substrats Ac-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA und photometrischer Aufzeichnung der Absorption bei 405 nm, nach dem die Reaktion gestoppt wird, bestimmt. Es besteht eine lineare Korrelation zwischen der Absorption bei 405 nm und der Endotoxinkonzentration zwischen 0,1 und 1 EU/ml.
Demzufolge wurde 1 EU Endotoxin mit einer Verdünnungsreihe von E. coli BPI- protein in einer Mikrotiterplatte bei 37ºC gemischt, gefolgt von Substratzugabe. Die Absorption in jedem Napfder Platte wurde unter Verwendung eines Molecular Devices-Plattenlesegeräts gemessen. Fig. 13 zeigt die Inhibierung der LAL-Aktivierung durch E. coli BPI-Protein, mit einer IC&sub5;&sub0; = 0,45 mg/ml. Daher ist E. coli-abgeleitetes BPI-Protein in der Lage, an Endotoxin zu binden und es zu neutralisieren.
In löslicher Form bei niedriger Temperatur in E. coli produziertes BPI-Protein, und in Reinigungsverfahren A wie oben beschrieben gereinigt, wurde auf die Inhibierung von Endotoxin-vermittelter TNF-Induktion durch menschliche adhärente mononukleare Zellen getestet. Blut, das in saure Citrat-Dextrose enthaltenen Vacutainer-Röhrchen (Becton Dickinson, Rutherford, NJ) gesammelt wurde, wurde in Hanks balancierter Salzlösung (HBSS) minus Ca&spplus;² und Mg&spplus;² verdünnt. Mononukleare Zellen wurde unter der Verwendung von Ficol-Paque (Pharmacia Inc., Piscataway, N. J.) abgetrennt; gesammelt und dreimal in HBSS gewaschen und der Anteil von Monozyten wurde durch mikroskopische Untersuchung abgeschätzt. Die Zellen wurden in ein geeignetes Volumen von RPMI 1640 mit Glutamin und Antibiotika und ohne Serum eingebracht; um ungefähr 1 · 10&sup6; Monozyten/ml zu ergeben. Die Zellen wurde in 96 Napf- Flachbodengewebekulturplatten (Costar, Cambridge, MA) plattiert, 200 ul/Napf und für zwei Stunden bei 37ºC in einem befeuchteten Inkubator mit 7% O&sub2; inkubiert. Die Zellen wurden dann dreimal in warmem RPMI 1640 ohne Serum gewaschen. Nachdem der letzte Waschschritt ausgeblasen war, wurden 200 ul/Napf RPMI 1640 mit 10% autologem Hitze-inaktiviertem Serum hinzugefügt. Zu jedem Napf wurden dann die 22 ul der 10x-Lösung von E. coli-Endotoxin, präinkubiert in Puffer, Polymyxin B oder BPI-Protein hinzugefügt. Die Zellen wurden für vier Stunden bei 37ºC mit dem Endotoxingemisch inkubiert, dann wurden die Überstände gesammelt und durch ELISA (Endogen, Inc., Boston, MA) auf TNFα-Antigen getestet (Fig. 12).

11. BPI-Protein ELISA

A. Materialien

Immulon-4 96 Napfplatten (Dynatech Labs, 011-010-3750); 12-Kanal 50-200 ul Pipette; P20, P200, P1000 Pipetten; Mikropipetten und Multikanal-Pipettenspitzen; Reagenzreservoirs (Costar); 1 ml-Röhrechen im Ständer (BioRad); und Polypropylen 15 ml konische Röhrchen.

B. Reagenzien

Beschichtungspuffer: 25 mM Natriumborat, pH 9,5. Blocking-Puffer: 5% BSA (Sigma A-7030) in PBS. ELISA-Puffer: 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mg/ml BSA (Sigma A-7030); 0,05% Tween 20 (Sigma, P-1379), 1 ug/ml Polymyxin-B-Sulfat (Gibco/BRL, 7900 U/mg).
Standard- und Probenverdünnungsgsmittel = Wasch/Probenpuffer mit 60 mM MgCl&sub2; oder geeignete Lösung für Unbekannte (z. B. bei der Untersuchung von Gewebekulturüberständen, verwende REM + dFBS).
Substratpuffer: 24,5 mg MgCl&sub2; (auf 500 ml auffüllen), 48 ml Diethanolamin, bis auf 400 ml mit Lab V H&sub2;O auffüllen, auf pH 9,8 einstellen, bis auf 500 ml mit Lab V H&sub2;O auffüllen.
Antikörper: INV 1-2 IgG (Protein A gereinigter Rb Anti-BPI-Antikörper, 5 mg/ml); und Biotinylierter Anti-BPI-Antikörper. Auch kann der monoklonale Antikörper HA- 1A verwendet werden. Anti-BPI-Antikörper können z.b. durch Immunisieren eines Kaninchens mit BPI und Aufreinigen der dadurch produzierten Anti-BPI-Antikörper unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden.
Andere Reagenzien: BPI-Standard (Charge 149713 = 1,0 mg/ml Aliquots, gelagert bei -70ºC); PNPP-Substrattabletten (5 mg/Tablette: Sigma 104-105); Streptavidinalkalische Phosphatase (BioRad, 170-3554, Charge 72439). BPI kann z. B. gemäß dem Verfahren, beschrieben in Spalte 11, Zeile 62 bis Spalte 12, Zeile 13 von US-Patent Nr. 5,089,274, erhalten werden.

C. Verfahren

Beschichtungsplatten: Anmerkung: Beschichte Platten bis zu 1 Monat im voraus. Lagere Platten bei 4ºC bis benötigt. Verdünne anti-BPI IgG-Antikörper (Protein A- gereinigt) auf 5 ug/ml in 25 mM Na-Bora, pH 9,5 (10 ml/Platte). Füge 100 ul zu jedem Napfzu 96-Napfplatten (Immulon-4) hinzu. Inkubiere über Nacht bei 37ºC. Bis zur Verwendung kühlen.
Blocken von Platten: Kippe Beschichtungsantikörper aus den Platten und drücke Platte auf Papiertücher. Füge 200 ul 5% BSA in PBS zu jedem Napf hinzu. Inkubiere 1-4 Stunden bei 37ºC oder über Nacht bei 4ºC. Kippe die Blocklösung aus, wasche 3x mit ELISA-Puffer und presse Platte auf Papiertücher.
BPI-Standards und Unbekannte: Hinweis - BPI-Standards und Proben sollen mit ELISA-Puffer/60 mM MgCl&sub2; und nur in Propylenröhrchen verdünnt werden! Taue neuen Stadard-Aliquot (0,5 ml bei 1 mg/ml) alle 2 Monate auf. Stelle Vorratslösung von gereinigtem BPI bei 100 ng/ml her, durch: a) Verdünnen von 149713 PBI 5 ul + 495 ul Verdünnungsmittel (= 1 : 100; 10 ug/ml), dann noch einmal 1 : 100 für eine finale Konzentration von 100 ng/ml in 1 ml (dies ist ausreichend 100 ng/ml Vorratslösung für 2 Standardkurven in dreifachen Ansätzen); und b) Herstellen von 1000 ul von jeder der folgenden Standardkonzentrationen wie folgt:
Füge 100 ul/Napf Standards und Unbekannte hinzu und Inkubiere bei 37ºC für 2 Stunden. Wasche 4 · mit Probe/Waschpuffer und presse stark auf Papiertücher.
Zweiter Antikörper (Koniugat): Nach dem finalen Waschen, presse Platte stark, füge 100 ul biotinyliertes Anti-BPI Ab bei 1 : 2000 ( = 5 ul in 10 ml von Wasch/Probepuffer) zu jedem Napf hinzu. Inkubiere bei 37ºC für 1 Stunde oder über Nacht bei 4ºC. Wasche 4 · und drücke trocken.
Streptavidin alkalische Phosphatase: Nach dem finalen Waschen, presse Platte stark, für 100 ul 1 : 1000 ( = 10 ul in 10 ml) Streptavidinalkalische Phosphatasekonjugat zu jedem Napf hinzu. Inkubiere bei 37ºC für 45 Minuten oder über Nacht bei 4ºC. Wasche 4x und presse trocken.
Substrat: Nach dem finalen Waschen, presse Platte stark und füge 100 ul Substratlösung (2 · 5 mg PNPP-Substrat Tablette/10 ml Substratpuffer) hinzu. Anmerkung: Stelle frisches Substrat unmittelbar vor der Verwendung durch Lösung von zwei Tabletten/10 ml Substratpuffer her.
Lese Platte bei 405 nm nach der Entwicklung für 25-35 Minuten. Halte die Platte zwischen den Ablesungen im Dunkeln.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines nicht glycosilierten bakteriziden/permeabilitäts- erhöhenden Proteines unter Verwendung einer Gram-negativen Bakterienzelle, wobei das Verfahren umfaßt:

Transformieren oder Transfizieren der Zelle mit einem Vektor, der für das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein kodiert, wobei das bakterizide/permeabilitäts- erhöhende Protein kein Vorläufer-Peptid mit sich verbunden hat, wenn es exprimiert wird,

Kultivieren der Zelle, die so transformiert oder transfiziert ist, um das nicht glycosilierte bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein in der Zelle herzustellen und Gewinnen des nicht glycosilierten bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Proteines aus der Zelle, das so produziert wurde,

dadurch gekennzeichnet, daß

die Zelle bei einer Temperatur von unterhalb 37ºC kultiviert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Zelle bei einer Temperatur zwischen 25- 36ºC kultiviert wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem die Zelle bei einer Temperatur von 26ºC kultiviert wird.

4. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem die Gewinnung umfaßt:

(a) Lysieren der Zelle unter Bedingungen, die die Bildung eines Komplexes zwischen dem bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Protein und LPS verhütet, um so das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein aus der Zelle freizusetzen und

(b) Isolieren des so freigesetzten bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Proteins.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Gewinnen umfaßt:

(a) Lysieren der Zelle unter Bedingungen, die die Bildung eines Komplexes zwischen dem bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Protein und LPS zulassen,

(b) Isolieren des sich ergebenden Komplexes bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein - LPS,

(c) Dissoziieren des Komplexes bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein- LPS, der so isoliert wurde, um das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein aus dem Komplex bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein - LPS freizusetzen und

(d) Isolieren des so freigesetzten bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Proteins.

6. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein das native menschliche Protein von 55 kDa ist, das die Aminosäuresequenz aufweist, die für das menschliche BPI-Protein in den Fig. 8A-1 und 8A-2 gezeigt ist und durch die cDNA-Sequenz kodiert wird, die in den Fig. 8B-1 und 8B-2 gezeigt ist oder eine BPI-Variante, die einen Abschnitt des BPI-Proteines umfaßt, wobei die Variante in der Lage ist, (a) an LPS zu binden, (b) mit dem BPI-Protein oder LBP um die Bindung an LPS in Wettbewerb zu treten und

(c) die LPS-vermittelte Produktion von TNFα durch menschliche Monozyten zu inhibieren.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem die BPI-Variante B(S351-> A), B(D200> DP), B(1-199), B&sub2;&sub0;&sub0;&submin;&sub4;&sub5;&sub6; B(F61-> C), B(C132-> A), B(C132-> S), B(C135-> S), B(C-175-> S), B(C132-> A) (C135-> S) (C175-> S) oder B(C-132-> S) (C135-> S) (C175-> S) ist, wobei der Abschnitt des BPI-Proteines in der Variante durch den Buchstaben B bezeichnet ist, gefolgt von einer Zuweisung der Numerierung der Aminosäuresequenz, die derjenigen entspricht, die in den Fig. 8A-1, 8A-2, 8B-1 und 8B-2 für das menschliche BPI-Protein gezeigt ist, bei dem der reife N- Terminus als Rest 1 bezeichnet ist.

8. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem die Gram-negative bakterielle Zelle E. coli ist.

9. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein in aktiver löslicher Form produziert wird.

10. Verfahren zum Gewinnen nicht glycosilierten bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Proteines aus einer Gram-negativen bakteriellen Zelle, die mit einem Vector transformiert oder transfiziert ist, der für bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein kodiert, das kein Vorläufer-Peptid an sich gebunden aufweist, wenn es exprimiert wird und so kultiviert wird, um nicht glycosiliertes bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein in der Zelle zu produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle bei einer Temperatur von unterhalb 37ºC kultiviert worden ist, welches Verfahren die Schritte umfaßt von:

(a) Lysieren der Zelle unter Bedingungen, die die Bildung eines Komplexes zwischen dem bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Protein und LPS verhüten, um so das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein aus der Zelle freizusetzen und

(b) Isolieren des bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Proteins, das so freigesetzt ist.

11. Verfahren zum Gewinnen nicht glycosilierten bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Proteines aus einer Gram-negativen bakteriellen Zelle, die mit einem Vector transformiert oder transfiziert ist, der für ein bakterizides /permeabilitäts-erhöhendes Protein kodiert, das kein Vorläufer-Peptid an sich gebunden aufweist, wenn es exprimiert wird und so kultiviert wird, um nicht glycosiliertes bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein in der Zelle zu produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle bei einer Temperatur von unterhalb 37ºC kultiviert worden ist, welches Verfahren die Schritte umfaßt von:

(c) Dissoziieren des Komplexes bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein - LPS, der so isoliert wurde, um das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein aus dem Komplex bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein - LPS freizusetzen und

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4, 5, 10 oder 11, bei dem der Schritt des Lysierens der Zelle das Entfernen der äußeren Membran der Zelle und nachfolgendes Aufbrechen der erhaltenen Zelle umfaßt.

13. Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 11, bei dem der Schritt des Dissoziierens des Komplexes bakterizides/permeabilitäts-erhöhendes Protein - LPS das Kontaktieren des Komplexes mit divalenten Kationen umfaßt.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, bei dem der Komplex mit 0,05 M-1,0 M MgCl&sub2; in Kontakt gebracht wird.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, bei dem der Komplex mit 0,5 M MgCl&sub2; in Kontakt gebracht wird.