EP1084234A2 - Humane deadenylierende nuclease, ihre herstellung und verwendung - Google Patents

Humane deadenylierende nuclease, ihre herstellung und verwendung

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Publication number
EP1084234A2
EP1084234A2 EP99941254A EP99941254A EP1084234A2 EP 1084234 A2 EP1084234 A2 EP 1084234A2 EP 99941254 A EP99941254 A EP 99941254A EP 99941254 A EP99941254 A EP 99941254A EP 1084234 A2 EP1084234 A2 EP 1084234A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
polypeptide
dan
human
allergies
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99941254A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christoph Hüls
Karl-Christian Gallert
Christof Körner
Elmar Wahle
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
Original Assignee
Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG filed Critical Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
Publication of EP1084234A2 publication Critical patent/EP1084234A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a human deadening nuclease (DAN), its coding nucleic acid and its production and use.
  • DAN deadening nuclease
  • mRNAs The intracellular concentration of mRNA appears to be controlled not only by the rate of production but also by the rate of degradation.
  • mRNAs do not seem to be degraded by a random nucleolytic event, but by specific mechanisms and by degradation rates that are specific for the respective RNA.
  • poly (A) tails play a special role.
  • poly (A) tails are attached to mRNAs or mRNA fragments that are generated by the RNAse E.
  • the poly (A) tail appears to function as a relatively unstructured unit that is responsible for the attachment of a complex that, among other proteins, contains a 3 ' exonuclease process, which is a polynucleotide phosphorylase, and an RNA-dependent one Contains ATPase, which helps the exonuclease to bypass inhibitory secondary structures in the mRNA.
  • a similar mechanism appears to work in chloroplasts.
  • the exonucleolytic shortening of the poly (A) tail also initiates the breakdown of many, but not all, mRNAs.
  • the poly (A) degrading exonuclease does not appear to progress into the 3 ' UTR and the coding sequence in its degradation. Instead, the eukaryotic exonuclease appears to continue after the poly (A) tail has been broken down.
  • the second step in mRNA degradation involves removal of the 5 ' cap structure by a specific pyrophosphatase.
  • the CAP is only removed after the poly (A) tail has been shortened to approx. 10- 15 nucleotides instead. The removal of the CAP structure makes the mRNA accessible to 5 ' exonucleases, the most important representative of which is encoded by the XRN1 gene.
  • Deadenylation of certain mRNAs can also lead to inactivation of translation. This can be explained by the importance of the poly (A) tail for the initiation of translation. Deadenylation as a translation control mechanism plays a crucial role in oocyte maturation and early embryogenesis in many animal species. For example, in Drosophila the polarity of the embryo is regulated by the deadenylation of the so-called hunchback mRNA.
  • mRNAs are stored in a translationally inactive form with short poly (A) tails.
  • A short poly
  • An example is the mRNA for tPA (tissue plasminogen activator) in the mouse.
  • tPA tissue plasminogen activator
  • this mRNA receives a long poly (A) tail in the normal polyadenylation reaction, which is then shortened into an oligo (A) tail by deadenylation. This shortening is controlled by sequences in the 3 ' UTR.
  • deadenylation is used to inactivate certain mRNAs that originally had long poly (A) tails and were active in early egg development.
  • Deadenylation is not dependent on specific sequences in the mRNA. All mRNAs are deadenylated unless they are protected by an active adenylation process. 3. During early embryogenesis, certain mRNAs are deadenylated in a specific reaction that also requires specific sequences in the 3 ' UTR.
  • the object of the present invention was to provide a human poly (A) -specific 3'-exoribonuclease.
  • a gene bank has now surprisingly found an unspecified and only sequenced clone which, according to the present invention, codes for a human deadening nuclease (human DAN).
  • the present invention therefore relates to a nucleic acid coding for a human DAN with an amino acid sequence according to SEQ 11 or a functional variant thereof, and parts thereof with at least 8 nucleotides, preferably with at least 15 or 20 nucleotides, in particular with at least 100 nucleotides, especially with at least 300 nucleotides (hereinafter referred to as “nucleic acid according to the invention”).
  • the complete nucleic acid encodes a protein with 639 amino acids and a molecular mass of 73.5 kDa.
  • Expression of the nucleic acid in E. coli resulted in a protein that has similar enzymatic activities to that of Körner, Ch.G. & Wahl, E. (1997, supra) shows DAN.
  • Further experiments according to the present invention confirmed that the nucleic acid is a nucleic acid which codes for a human DAN.
  • the nucleic acid according to the invention was deposited on March 25, 1998 with the DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig under the number DSM 12075.
  • the nucleic acid according to the invention is a DNA or RNA, preferably a double-stranded DNA, and in particular a DNA with a nucleic acid sequence according to SEQ 12 from item 58 to item 1977.
  • the two positions determine the start and the end according to the present invention of the coding area.
  • the term “functional variant” is understood to mean a nucleic acid that is functionally related to the human DAN-coding nucleic acid and in particular of human origin. Examples of related nucleic acids are, for example, nucleic acids from different human cells or tissues or allelic variants
  • the present invention also encompasses variants of nucleic acids that can be derived from different human individuals.
  • variants means nucleic acids which have a homology, in particular a sequence identity of approximately 60%, preferably approximately 75%, in particular approximately 90% and above all approximately Have 95%.
  • the parts of the nucleic acid according to the invention can be used, for example, for producing individual epitopes, as probes for identifying further functional variants or as antisense nucleic acids.
  • a nucleic acid composed of at least approx. 8 nucleotides is suitable as an antisense nucleic acid
  • a nucleic acid composed of at least approx. 15 nucleotides as a primer in the PCR method is suitable as a nucleic acid composed of at least approx. 20 nucleotides for the identification of further variants
  • a nucleic acid at least about 100 nucleotides as a probe is suitable as an antisense nucleic acid
  • a nucleic acid composed of at least approx. 15 nucleotides as a primer in the PCR method
  • a nucleic acid composed of at least approx. 20 nucleotides for the identification of further variants
  • a nucleic acid at least about 100 nucleotides as a probe is suitable as an anti
  • the nucleic acid according to the invention contains one or more non-coding sequences and / or a poly (A) sequence.
  • the non-coding sequences are, for example, intron sequences or regulatory sequences, such as promoter or enhancer sequences, for the controlled expression of the human DAN coding gene.
  • the nucleic acid according to the invention is therefore contained in a vector, preferably in an expression vector or vector which is active in gene therapy.
  • the expression vectors can be, for example, prokaryotic or eukaryotic expression vectors.
  • prokaryotic expression vectors for expression in E. coli are, for example, the T7 expression vector pGM10 (Martin, 1996), which codes for an N-terminal Met-Ala-His6 tag, which advantageously cleans the expressed protein via a Ni 2+ -NTA-Säuie enables.
  • Suitable eukaryotic expression vectors for expression in Saccharomyces cerevisiae are the vectors p426Met25 or p426GAL1 (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767), for expression in insect cells, for example bacuiovirus vectors as in EP-B1 -0127839 or EP-B1 -0549721, and for expression in mammalian cells, for example SV40 vectors, which are generally available.
  • the expression vectors also contain suitable regulatory sequences for the host cell, e.g. the trp promoter for expression in E. coli (see, for example, EP-B1-0154133), the ADH-2 promoter for expression in yeast (Radorel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674) , the baculovirus polyhedrin promoter for expression in insect cells (see, for example, EP-B1-0127839) or the early SV40 promoter or LTR promoters, for example by MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus; Lee et al. (1981) Nature, 214, 228).
  • suitable regulatory sequences for the host cell e.g. the trp promoter for expression in E. coli (see, for example, EP-B1-0154133), the ADH-2 promoter for expression in yeast (Radorel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674) , the baculovirus polyhedrin promoter for
  • virus vectors preferably adenovirus vectors, in particular replication-deficient adenovirus vectors, or adeno-associated virus vectors, e.g. an adeno-associated virus vector consisting exclusively of two inserted terminal repeat sequences (ITR).
  • ITR inserted terminal repeat sequences
  • Suitable adenovirus vectors are described, for example, in McGrory, WJ et al. (1988) Virol. 163, 614; Gluzman, Y. et al. (1982) in "Eukaryotic Viral Vectors” (Gluzman, Y. ed.) 187, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Habor, New York; Chroboczek, J. et al. (1992) Virol. 186, 280; Karlsson, S et al. (1986) EMBO J. 5, 2377 or WO95 / 00655.
  • Suitable adeno-associated virus vectors are described, for example, in Muzyczka, N. (1992) Curr. Top. Microbiol.
  • Vectors with gene therapy effects can also be obtained by complexing the nucleic acid according to the invention with liposomes.
  • Lipid mixtures such as those from Feigner, P.L. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei, USA 84, 7413; Behr, J.P. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Be. USA 86, 6982; Feigner, J.H. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550 or Gao, X. & Huang, L. (1991) Biochim. Biophys. Acta 1189, 195.
  • the DNA is ionically bound to the surface of the liposomes in such a ratio that a positive net charge remains and the DNA is completely complexed by the liposomes.
  • the nucleic acid according to the invention can for example be chemically based on the sequence disclosed in SEQ 12 or on the basis of the peptide sequence disclosed in SEQ 11 using the genetic code e.g. can be synthesized according to the phosphotriester method (see e.g. Uhlman, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543, No. 4).
  • Another way of getting hold of the nucleic acid according to the invention is to isolate it from a suitable gene bank, for example from a human gene bank, using a suitable probe (see, for example, Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning. A laboratory manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor, New York).
  • Suitable as probes are, for example, single-stranded DNA fragments with a length of approximately 100 to 1000 nucleotides, preferably with a length of approximately 200 to 500 nucleotides, in particular with a length of approximately 300 to 400 nucleotides, the sequence of which from the Nucleic acid sequence can be derived according to SEQ 12.
  • Another object of the present invention is also the polypeptide itself with an amino acid sequence according to SEQ 11 or a functional variant thereof, and parts thereof with at least six amino acids, preferably with minor at least 12 amino acids, in particular with at least 65 amino acids and above all with 638 amino acids (hereinafter referred to as "inventive polypeptide").
  • an approximately 6-12, preferably approximately 8 amino acid long polypeptide may contain an epitope which, after coupling to an Carrier for the production of specific poly- or monoclonal antibodies is used (see, for example, US
  • Polypeptides with a length of at least approx. 65 amino acids can also be used directly without a carrier for the production of poly- or monoclonal antibodies.
  • the term “functional variant” in the sense of the present invention means polypeptides which are functionally related to the peptide according to the invention, ie have a poly (A) -specific 3'-exoribonuclease activity and are preferably active under two different reaction conditions. In the first In the absence of salt, the activity is completely dependent on the presence of spermidine. In contrast, in the absence of spermidine, the activity of the enzyme is dependent on the salt concentration. In addition, under certain reaction conditions, gradual degradation of the poly (A) Tail (see also Körner, Chr. G. & Wahl, E. (1997), supra). In particular, the foreseen degradation products differ in length by about 30 nucleotides. Variants are also understood to mean allelic variants or Polypeptides derived from other human cells or tissues. It also means polypeptides that come from different human individuals.
  • this also includes polypeptides which have a sequence homology, in particular a sequence identity of approximately 70%, preferably approximately 80%, in particular approximately 90%, in particular approximately 95%, of the polypeptide with the amino acid sequence Have SEQ 11. Furthermore, this also includes deletion of the polypeptide in the range from about 1-60, preferably from about 1-30, in particular from about 1-15, especially from about 1-5 amino acids. For example, the first amino acid methionine may be absent without significantly changing the function of the polypeptide. In addition, this also includes fusion proteins that contain described polypeptides according to the invention, the fusion proteins themselves already having the function of a human DAN or being able to get the specific function only after the fusion portion has been split off.
  • this includes fusion proteins with a proportion of in particular non-human sequences of approximately 1 to 200, preferably approximately 1 to 150, in particular approximately 1 to 100, especially approximately 1 to 50 amino acids.
  • non-human peptide sequences are prokaryotic peptide sequences, for example from the galactosidase from E. coli, or a so-called histidine tag, for example a Met-Ala-His 6 tag.
  • a fusion protein with a so-called histidine tag is particularly advantageous for purifying the expressed protein via columns containing metal ions, for example via a Ni 2+ - NTA column.
  • NTA stands for the chelator "nitrilot acetic acid” (Qiagen GmbH, Hilden).
  • the parts of the polypeptide according to the invention represent, for example, epitopes that can be specifically recognized by antibodies.
  • the polypeptide according to the invention is a member of the so-called RNaseD family.
  • Figure 4 shows the conserved amino acids of the Exo I, Exo II and Exo III motifs which are characteristic of this class of exonucleases. Other conserved amino acids have a gray background.
  • the three acidic amino acid side chains, two in the Exo I domain and one in the Exo III domain, are directly involved in the binding of the two Mg 2+ ions that are involved in the enzymatic hydrolysis.
  • a third acidic amino acid side chain, located in the Exo II domain binds one of the metal ions via water bridge molecules.
  • polypeptide according to the invention can therefore be referred to as a poly (A) -specific 3'-exoribonuclease of the RNaseD family.
  • the polypeptide according to the invention is produced, for example, by expression of the nucleic acid according to the invention in a suitable expression system, as already described above, using methods which are generally known to the person skilled in the art. poses.
  • Suitable host cells are, for example, the E. coli strains DH5, HB101 or BL21, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae, the insect cell line Lepidopteran, for example from Spodoptera Frugiperda, or animal cells such as COS, Vero, 293 and HeLa, all of which are generally available.
  • the parts of the polypeptide mentioned can also be synthesized with the aid of classic peptide synthesis (Merrifield technique). They are particularly suitable for obtaining antisera, with the aid of which suitable gene expression banks can be searched in order to arrive at further functional variants of the polypeptide according to the invention.
  • Another object of the present invention therefore relates to a method for producing a polypeptide according to the invention, wherein a nucleic acid according to the invention is expressed in a suitable host cell and optionally isolated.
  • Another object of the present invention also relates to antibodies which react specifically with the polypeptide according to the invention, the above-mentioned parts of the polypeptide either being themselves immunogenic or by coupling to suitable carriers, such as e.g. bovine serum albumin, immunogenic or can be increased in their immunogenicity.
  • suitable carriers such as e.g. bovine serum albumin
  • the antibodies are either polyclonal or monoclonal.
  • the preparation which is also an object of the present invention, is carried out, for example, by generally known methods by immunizing a mammal, for example a rabbit, with the polypeptide according to the invention or the parts thereof, optionally in the presence of, for example, Freund's adjuvant and / or aluminum hydroxide gels (see, for example, Diamond, BA et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344).
  • the polyclonal antibodies produced in the animal as a result of an immunological reaction can then be easily isolated from the blood by generally known methods and purified, for example, by column chromatography. Preference is given to affinity purification of the antibodies, in which for example, the C-terminal DAN fragment was coupled to an NHS-activated HiTrap column.
  • Monoclonal antibodies can be produced, for example, by the known method from Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293).
  • Another object of the present invention is also a medicament which contains a nucleic acid or a polypeptide according to the invention and optionally suitable additives or auxiliaries and a method for producing a medicament for the treatment of cancer, autoimmune diseases, in particular multiple sclerosis or rheumatoid arthritis, Alzheimer's Disease, allergies, in particular neurodermatitis, type I allergies or type IV allergies, arthrosis, atherosclerosis, osteoporosis, acute and chronic infectious diseases and / or diabetes and / or for influencing cell metabolism, in particular in immunosuppression, especially in transplants, in one nucleic acid according to the invention, for example a so-called antisense nucleic acid, or a polypeptide according to the invention is formulated with pharmaceutically acceptable additives and / or auxiliaries.
  • autoimmune diseases in particular multiple sclerosis or rheumatoid arthritis
  • Alzheimer's Disease allergies, in particular neurodermatitis, type I allergies or type IV allergies, arthrosis, atherosclerosis, osteo
  • a drug is particularly suitable for gene therapy use in humans which contains the nucleic acid according to the invention in naked form or in the form of one of the above-described gene therapy-effective vectors or in a form complexed with liposomes.
  • Suitable additives and / or auxiliary substances are e.g. a physiological saline, stabilizers, proteinase inhibitors, nuclease inhibitors etc.
  • Another object of the present invention is also a diagnostic agent containing a nucleic acid according to the invention, a polypeptide according to the invention or antibodies according to the invention and optionally suitable additives and / or auxiliary substances and a method for producing a diagnostic agent for the diagnosis of Cancer, autoimmune diseases, in particular multiple sclerosis or rheumatoid arthritis, Alzheimer's disease, allergies, in particular neurodermatitis, type I allergies or type IV allergies, arthrosis, atherosclerosis, osteoporosis, acute and chronic infectious diseases and / or diabetes and / or for analysis of the cell meta- bolism, in particular of the immune status, especially in transplantations in which a nucleic acid according to the invention, a polypeptide according to the invention or antibodies according to the invention are mixed with suitable additives and / or auxiliaries.
  • a diagnostic agent based on the polymerase chain reaction PCR diagnostics, for example in accordance with EP-0200362
  • a Northern blot as described in more detail in Example 5
  • PCR diagnostics for example in accordance with EP-0200362
  • Northern blot as described in more detail in Example 5
  • PCR diagnostics for example in accordance with EP-0200362
  • Northern blot as described in more detail in Example 5
  • the nucleic acid according to the invention can also be modified here, as described, for example, in EP0063879.
  • a DNA fragment according to the invention is preferably labeled using suitable reagents, for example radioactive with ⁇ -P 32 -dATP or non-radioactive with biotin, according to generally known methods and with isolated RNA, which is preferably bound to suitable membranes made of, for example, cellulose or nylon was incubated.
  • suitable reagents for example radioactive with ⁇ -P 32 -dATP or non-radioactive with biotin
  • isolated RNA which is preferably bound to suitable membranes made of, for example, cellulose or nylon was incubated.
  • it is advantageous to separate the isolated RNA prior to hybridization and binding to a membrane for example by means of agarose gel electrophoresis. With the same amount of RNA examined from each tissue sample, the amount of mRNA that was specifically labeled by the probe can thus be determined.
  • Another diagnostic agent contains the polypeptide according to the invention or the immunogenic parts thereof described in more detail above.
  • the polypeptide or parts thereof, which are preferably bound to a solid phase, for example made of nitrocellulose or nylon, can for example be brought into contact with the body fluid to be examined, for example blood, in order to use autoimmune antibodies, for example. to be able to respond via
  • the antibody-peptide complex can then be detected, for example, using labeled anti-human IgG or anti-human IgM antibodies.
  • the label is, for example, an enzyme, such as peroxidase, that catalyzes a color reaction. The presence and the amount of autoimmune antibodies present can thus be easily and quickly detected via the color reaction.
  • Another diagnostic agent contains the antibodies according to the invention themselves. With the aid of these antibodies, for example, a tissue sample from humans can be easily and quickly examined to determine whether the polypeptide in question is present.
  • the antibodies according to the invention are labeled, for example, with an enzyme, as already described above. The specific antibody-peptide complex can thus be detected easily and just as quickly via an enzymatic color reaction.
  • Another object of the present invention also relates to a test for the identification of functional interactors, such as e.g. Inhibitors or stimulators containing a nucleic acid according to the invention, a polypeptide according to the invention or the antibodies according to the invention and, if appropriate, suitable additives and / or auxiliaries.
  • functional interactors such as e.g. Inhibitors or stimulators containing a nucleic acid according to the invention, a polypeptide according to the invention or the antibodies according to the invention and, if appropriate, suitable additives and / or auxiliaries.
  • a suitable test for identifying functional interactors is, for example, the so-called “two-hybrid system” (Fields, S. & Sternglanz, R. (1994) Trends in Ge ⁇ etics, 10, 286).
  • a cell for example a yeast cell, transformed or transfected with one or more expression vectors which express a fusion protein which contains the polypeptide according to the invention and a DNA binding domain of a known protein, for example from Gal4 or LexA from E. coli, and / or express a fusion protein which contains an unknown polypeptide and contains a transcription activation domain, for example from Gal4, Herpesvirus VP16 or B42.
  • the cell also contains a reporter gene, for example the LacZ gene from E.
  • the unknown polypeptide is encoded, for example, by a DNA fragment that is from a gene bank, for example from a human gene bank, Usually, a cDNA library is immediately produced in yeast using the expression vectors described, so that the test can be carried out immediately thereafter.
  • the nucleic acid according to the invention is cloned in a functional unit to the nucleic acid coding for the lexA-DNA binding domain, so that a fusion protein from the polypeptide according to the invention and the LexA-DNA binding domain is expressed in the transformed yeast.
  • cDNA fragments from a cDNA library are cloned in a functional unit to the nucleic acid coding for the Gal4 transcription activation domain, so that a fusion protein from an unknown polypeptide and the Gal4 transcription activation domain in the transformed yeast is expressed.
  • the yeast transformed with both expression vectors which is for example Leu2 " , additionally contains a nucleic acid which codes for Leu2 and is controlled by the LexA promoter / operator.
  • Gal4 binds Transcriptional activation domain via the LexA DNA binding domain to the LexA promoter / operator, thereby activating it and expressing the Leu2 gene, with the result that the Leu2 ' yeast can grow on minimal medium containing no leucine .
  • the activation of the transcription can be demonstrated by the formation of blue or green fluorescent colonies.
  • the blue or fluorescent staining can also be done easily quantify in the spectrophotometer eg at 585 nM in the event of a blue color.
  • Another possible application of the "two-hybrid system” is to influence the interaction between the polypeptide according to the invention and a known or unknown polypeptide by other substances, such as chemical compounds.
  • other substances such as chemical compounds.
  • new valuable chemically synthesizable active substances can also be found easily
  • the present invention is therefore not only intended for a method for finding polypeptide-like interactors, but also extends for a method for finding substances which can interact with the protein-protein complex described above.
  • Such peptide-like as well as chemical interactors are therefore referred to in the sense of the present invention as functional interactors which can have an inhibiting or a stimulating effect.
  • polypeptide according to the invention is the poly (A) -specific degradation of nucleic acids, in particular of mRNA.
  • the poly (A) -specific degradation of nucleic acids can be used in particular in research laboratories.
  • SEQ 11 shows the amino acid sequence of the human DAN with domains for Exo (ADFFAIDGEFSGIS), Exo II LVIGHNMLLDVMHTVH) and Exo III (SEQLHEAGYDAYITGLC).
  • SEQ 12 shows the nucleic acid sequence of the human DAN including start (pos. 58) and stop codon (pos. 1977) with subsequent 3'UTR.
  • Fig. 1 shows the elution profile of the human DAN on MonoQ (Fig. 3A) and SDS-PAGEs (Fig. 1 B and 1 C)
  • FIG. 2 shows a Western blot of recombinant human DAN and native bovine DAN.
  • FIG. 3 shows the deadenylation of mRNA, the accumulation of deadenylated RNA and the influence of PABI.
  • FIG. 4 shows a comparison of known nucleases with the human DAN according to the invention .
  • bovine DAN The purification of bovine DAN was carried out as described in Körner, G. & Wahl, E. (1997), supra, as follows:
  • Fresh calf thymus was obtained from a local slaughterhouse, transported on ice and stored at -80 ° C. One kg was thawed in 2 l of basic buffer with 50 mM KCI and homogenized in a Waring Blendar homogenizer first with a small, then with a medium and finally with the highest speed. The ho mogenisat was centrifuged at 16,000 xg for 1 h and the supernatant decanted through a wide-mesh gauze (Wahl, E., J. Biol. Chem., 266, 1991).
  • This extract from calf thymus was applied to a DEAE-Sepharose FF column (column volume 4 l) and with a salt gradient over 2.5 times the column volume of 50 to 600 mM KCI from the column at a flow rate of 3 l / h elu - iert. Active fractions were eluted from the column at a salt concentration between 75 and 200 mM KCI. The fractions were collected, combined, ammonium sulfate was added to a 30% saturated solution and the mixture was stirred on ice for 1.5 hours.
  • the active fractions of two preparations were combined and precipitated with ammonium sulfate (60% saturation). After centrifugation, the sediment was taken up in 200 ml of base buffer with 50 mM KCI, dialyzed against 3 ⁇ 4 l of the same buffer for 12 h and applied in two portions to a heparin-Sepharose column (2.5 ⁇ 37 cm). The column was washed with 1.5 bed volumes of base buffer with 50 mM KCI and then eluted with 10 bed volumes in a gradient up to 500 mM KCI (flow rate: 145 ml / h). DAN activity eluted between 80 and 150 mM KCI.
  • the active fractions were pooled and dialyzed against base buffer with 30 mM KCI for 4 h.
  • the dialysate was centrifuged off and chromatographed in two portions on a MonoQ FPLC column (bed volume 8 ml).
  • the column was washed with two bed volumes of basic buffer with 50 mM KCI and then with a gradient over 320 ml with an increasing salt concentration (final concentration: 500 mM KCI, Flow rate: 2.5 ml / h) eluted from the column.
  • DAN activity eluted at approximately 160 mM KCI.
  • the active fractions (40 ml) were combined and dialyzed for 4 h against 2 I base buffer with 30 mM KCI, centrifuged and applied to a further MonoQ column (1 ml bed volume, flow rate: 0.9 ml / h).
  • the DAN activity bound to the column was eluted with basic buffer with 500 mM KCI and applied in four portions to a Superdex HR 10/30 FPLC column (equilibrated with basic buffer with 300 mM KCI, flow rate: 0.15 ml / h) (granules , Ch. G. & Wahl, E. (1997), supra)
  • IMAGE consortium clone ID 301901 codes for the 176 C-terminal amino acids of DAN and the entire 3 ' UTR
  • IMAGE consortium clone ID 645295 codes the entire ORF and the 5 ' UTR and part of the 3rd ' -UTR encodes, which corresponds to a protein of 639 amino acids with a molecular mass of 73.5 kDa (SEQ 11).
  • the 57 nucleotides upstream of the first AUG codon do not contain a stop codon in the reading frame.
  • the sequences surrounding this AUG codon correspond to the so-called Kozak rules (Kozak, 1991), which describe preferred start sequences for the translation start.
  • a 3 ' UTR of 0.7 kB is found in cDNA clone 645 295 and a poly (A) tail is found at the end of cDNA clone 301901.
  • the poly (A) tail is preceded by the rare polyadenylation signal AUUAAA upstream. (SEQ 12)
  • the plasmid pGMMCS was constructed in the following way:
  • the T7 expression vector pGM10 (Martin, 1996), which contained the PABII cDNA sequence (Nemeth, 1996) with an N-terminal Met-Ala-His6 tag, was digested with Xho I and BamH I and the fragment which corresponds to the 3rd ' Part of the PAB II was replaced by an Xho I / BamH I fragment from the multiple cloning site from the pBluescript KS (+/-) plasmid.
  • the resulting plasmid contains a sequence controlled by the T7 promoter, which begins with Met-AlaHis 6 and through the 5 ' part of PAB II and a multi cloning site is followed.
  • An Nde I interface lies between the Hise Tag and the PAB II sequence and can be used together with the Multi Cloning Site to replace the remaining PAB II sequence with any coding sequence.
  • the plasmid pGMMCS301901 was prepared in the following way:
  • the resulting cDNA fragments were purified with the Qia-Ex kit (Qiagen GmbH, Hilden) and integrated into the pGMMCS vector digested with Nde I and Xho I. The sequence was confirmed using sequencing.
  • the plasmid pGMMCS645295 was prepared as follows:
  • the coding sequence of the human DAN clone was amplified by means of PCR from clone 645295 under the following conditions:
  • Antibodies against the C-terminal part of human DAN were produced as follows: The plasmid pGMMCS301901 was transformed into BL21 (pLysC). The cells were incubated at 37 ° C. in SOB medium with 200 ⁇ g / ml carbenicellin up to an OD600 of 1.9. Then 200 ⁇ M isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside was added and incubated for a further 5 h. The cells were harvested and taken up in buffer A (100 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM Tris, 8M urea, pH 7.9).
  • buffer A 100 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM Tris, 8M urea, pH 7.9
  • the cells were lysed with ultrasound, the lysate centrifuged and incubated with 3 ml of Ni-NTA column material for 2 h at room temperature.
  • the column material was packed into a column and washed with 70 ml of buffer A, pH 6.3.
  • the mixture was then washed with 15 ml of buffer B (300 mM NaCl, 10% (v / v) Glyce ⁇ n, 50 mM Tris, 0.01% (v / v) Nonidet-P40, 8M urea, pH 7.9).
  • the protein was refolded on the column by reducing the urea content with two gradients (45 ml / h, gradient 1: buffer B from 8 to 4 M urea at room temperature, gradient 2: from 4 to 0 M urea at 4 ° C.) .
  • the protein was eluted from the column with Buffer B containing 500 mM imidazoles, dialyzed against Buffer B without urea and used to immunize rabbits.
  • the affinity purification of anti-DAN antibody was carried out as follows: The C-terminal DAN fragment was coupled to an NHS-activated HiTrap column (1 ml volume, Pharmacia, Freiburg) according to the manufacturer's instructions. 3 ml of serum were applied to the column and eluted according to the manufacturer's instructions. 300 ⁇ g / ml BSA and 0.02% (w / v) NaN 3 were added to the fractions and the buffer was exchanged by dialysis.
  • Human DAN was expressed in E. coli as a fusion protein with an N-terminal His tag (Met-Ala-His 6 tag) as follows:
  • the plasmid pGMMCS645295 was transformed into BL21 (pLysC).
  • the cells were grown in 50 ml LB medium with 100 ⁇ g / ml carbenicellin and 24 ⁇ g / ml chloramphenicol at 37 ° C. and then transferred to a 500 ml culture without chloramphenicol and incubated further at 33 ° C. After an OD600 of 1.3 was reached, 100 ⁇ M isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside was added and the culture was incubated for a further hour.
  • the cells were harvested and in buffer A (50 mM Tris, 300 mM KCI, 0.1 mM MgAc, 1 mM ⁇ -mercaptoethanol, 0.4 ⁇ g / ml leupeptin, 0.7 mg / ml pepstatin, 0.5 mM PMSF , pH 7.9).
  • the cells were lysed with ultrasound, the lysate centrifuged and incubated with 2 ml of Ni 2+ -NTA column material for 2 h at 4 ° C.
  • the column material was packed into a column and with 25 ml of buffer A and then with 20 ml of buffer B (buffer A and 10% (v / v) glycerol, 0.02% (v / v) nonidet-P40, without magnesium, pH 6.3) washed.
  • the protein was then eluted with 5 ml of buffer C (buffer B with 500 mM imidazole). This was followed by dialysis against buffer D (50 mM Tris, 20 mM KCI, 1 mM EDTA, 5 mM PMSF, 10% (v / v) glycerol, 0.02 (v / v) Nonidet-P40, pH 7.9).
  • buffer D 50 mM Tris, 20 mM KCI, 1 mM EDTA, 5 mM PMSF, 10% (v / v) glycerol, 0.02 (v / v) Nonidet-P40, pH 7.9.
  • the preparation was centrifuged and applied to a MonoQ column (1 ml bed volume). The column was then washed with 5 bed volumes of buffer with 50 mM KCI and the column eluted with a gradient over 40 bed volumes with a final concentration of 500 mM KCI. DAN activity eluted in a sharp peak at approximately 190 mM KCI (Fig. 1A).
  • the protein has a poly (A) -specific 3'-exoribonuclease activity (see Example 6). It follows that the cDNA clone found codes for a human DAN.
  • the sequence coding for human DAN was amplified by PCR, labeled with ⁇ - 32 P-dATP by random priming and used as a probe. The hybridization was carried out as described (Ausubel) and the membrane was washed with high stringency. Northern blot analysis with poly (A) + RNA from HeLa cells showed a single 3.1 kB fragment that hybridized with the DAN sample. This size agrees well with the size of the cDNA clone.
  • the DAN activity assay was performed as described (Körner, Chr G. & Wahl, E. (1997), supra). SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was carried out according to Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680.
  • the recombinant DAN is active under two different reaction conditions, depending on the neutralization of phosphate charges. In the absence of salt, activity is completely dependent on the presence of spermidine with an optimum concentration of 1 mM. Under these conditions, the specific activity of the recombinant DAN (79,000 U / mg) is not significantly different from the activity of purified bovine DAN (110,000 U / mg). In the presence of spermidine, the activity of DAN is inhibited by salt. In the absence of spermidine, the activity of the enzyme with an optimum concentration of 150 mM potassium acetate is dependent on salt. Bovine DAN behaves similarly under these conditions.
  • the specific activity of the recombinant protein (960 U / mg) is lower under these conditions than that of the enzyme purified from calf thymus (8070 U / mg). This difference can be explained by a post-translational modification or by contaminating proteins in the preparation of the bovine enzyme.
  • a capped polyadenylated RNA was incubated with the DAN preparations in the presence of salt, the poly (A) tail was degraded and fully deadenylated RNA was temporarily accumulated (Fig. 3). If the assay was carried out in the presence of PABI, the activity was partially inhibited and gradual degradation of the poly (A) tail was observed.
  • the predominant degradation products differed in length by approximately 30 nucleotides, which was apparently caused by the PABI binding. These results are in agreement with the tests for bovine protein (Körner Chr. & Wahl, E. (1997, supra). In summary, the results show that the recombinant protein is a poly (A) -specific 3 ' exoribonuclease.
  • Western blot analyzes were carried out as follows: The proteins were separated by SDS-PAGE and transferred to a nitrocellulose membrane using the Semidry method (Kyse-Andersen, 1984). The blots were incubated with TNT buffer (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% (v / v) Tween 20, pH 7.5) with 5% (w / v) defatted dry milk. The same buffer was used for the antiserum incubation and washing steps. The blots were incubated with the antibodies for 2-3 h at room temperature and then washed. The bound antibodies were detected using a peroxidase-conjugated pig anti-rabbit antibody (DAKO, Glostrup, Denmark) and chemiluminescent staining (SuperSignal-Kit, Pierce).
  • TNT buffer 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% (v / v) Tween 20, pH 7.5) with
  • the analyzes show that rabbit antibodies raised against a C-terminal fragment of DAN can precipitate DAN from partially purified fractions.
  • the antibodies recognize both bovine and human DAN in the Western blot (FIG. 4).
  • the recombinant DAN appears somewhat larger than the enzyme in SDS lysates from HeLa cells, which can be explained by the introduction of the tag (1004 Da) into the sequence. If the first AUG in the cDNA sequence were not the start codon used, the natural DAN from HeLa cells would have been at least 1260 Da larger than the tagged re- combined protein must be.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Nukleinsäure kodierend für eine humane deadenylierende Nuclease (DAN) mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ 11 oder eine funktionelle Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden.

Description

Humane deadenyiierende Nuclease, ihre Herstellung und Verwendung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine humane deadenyiierende Nuclease (DAN), ihre kodierende Nukleinsäure sowie ihre Herstellung und Verwendung.
Die intrazelluläre Konzentration von mRNA scheint nicht nur durch die Produktions- sondern auch durch die Abbaurate kontrolliert zu sein. Dabei scheinen mRNAs nicht durch ein zufälliges nukleolytisches Ereignis, sondern durch spezifische Mechanismen und durch Abbauraten, die spezifisch für die jeweilige RNA sind, abgebaut zu werden. Zur Zeit sind zwei unterschiedliche Abbauwege bekannt, in denen die po- ly(A)-Schwänze eine besondere Rolle spielen. In E. coli werden poly(A)-Schwänze an mRNAs oder mRNA-Fragmente angehängt, die durch die RNAse E generiert werden. Der poly(A)-Schwanz scheint als eine relativ unstrukturierte Einheit zu fungieren, die für die Anlagerung eines Komplexes verantwortlich ist, der neben anderen Proteinen eine prozessive 3'-Exonuclease, die eine Poiynucleotid-Phos- phorylase darstellt, und eine RNA-abhäπgige ATPase enthält, welche der Exo- nuclease hilft, inhibierende Sekundärstrukturen in der mRNA zu umgehen. Ein ähnlicher Mechanismus scheint in Chloroplasteπ zu wirken.
In Eukaryonten leitet die exonukleolytische Verkürzung des poly(A)-Schwanzes ebenfalls den Abbau von vielen, aber nicht allen mRNAs ein. In Gegensatz zu dem Prozeß in Bakterien scheint die poly(A)-abbauende Exonuclease nicht in die 3'-UTR und die kodierende Sequenz in ihrem Abbau fortzuschreiten. Statt dessen scheint die eukaryotische Exonuclease nach Abbau des poly(A)-Schwanzes anzuhalten. Bei S. cerevisiae beinhaltet der zweite Schritt des mRNA-Abbaus die Entfernung der 5'- Cap-Struktur durch eine spezifische Pyrophosphatase. Allerdings findet die Entfer- nung des CAPs erst nach der einer Verkürzung des poly(A)-Schwanzes auf ca. 10- 15 Nukleotide statt. Die Entfernung der CAP-Struktur macht die mRNA für 5'- Exonucleasen, deren wichtigster Vertreter durch das XRN1-Gen codiert wird, zugänglich.
Die Beobachtung des initialen Deadenylierungsprozesses in Säugetierzellen ist relativ einfach, während eine Untersuchung der weiteren Schritte durch die Schnelligkeit der nachfolgenden Abbauprozesse und das Fehlen von analysierbaren Zwischenprodukten erschwert wird. Indirekte Beweise sprechen aber dennoch für eine Entfernung der CAP-Struktur im zweiten Schritt. Ein Homolog aus der Maus ist für das XRN1 -Gen beschrieben worden. Im allgemeinen werden stabile mRNAs langsam und instabile mRNAs schnell deadenyliert. Der schnelle Abbau hängt von dem Vorkommen von bestimmten destabilisierenden Sequenzen in dem 3'-UTR oder in der codierenden Sequenz ab. Mutationen in diesen Sequenzen führen zudem nicht nur zu einer Stabilisierung der mRNA, sondern ebenfalls zu einer verlangsamten Deadenylierung. Im Gegensatz dazu führt eine Inaktivierung eines stabilisierenden Elements der α-Globulin mRNA zu einer Instabilität und zu einer beschleunigten Deadenylierung. Diese Daten sprechen eindeutig für eine Kontrolle des mRNA- Abbaus durch die Deadenylierungsrate.
Die Deadenylierung von bestimmten mRNAs kann ebenfalls zu einer Inaktivierung der Translation führen. Dies ist durch die Bedeutung des poly(A)-Schwaπzes für die Initiation der Translation zu erklären. Die Deadenylierung als Translationskontrollmechanismus spielt bei der Reifung von Oozyten und der frühen Embryogenese in vielen tierischen Spezies eine entscheidende Rolle. Zum Beispiel wird bei Droso- phila die Polarität des Embryos durch die Deadenylierung der sogenannten hunchback mRNA reguliert.
In Vertebraten können grundsätzlich drei Deadenylierungsreaktionen in der Oo- zytenreifung und frühen Embryogenese unterschieden werden: 1. In unreifen Oozyten werden die meisten mRNAs in einer translational inaktiven Form mit kurzen poly(A)-Schwänzen gespeichert. Ein Beispiel ist die mRNA für tPA (tissue plasminogen activator) in der Maus. Zunächst erhält diese mRNA einen langen poly(A)-Schwanz in der normalen Polyadenylierungsreaktion, der dann durch Deadenylierung in einen Oligo(A)-Schwanz verkürzt wird. Diese Verkürzung wird durch Sequenzen im 3'-UTR gesteuert. 2. Bei der Reifung von Oozyten wird die Deadenylierung zur Inaktivierung bestimmter mRNAs verwendet, die ursprünglich lange poly(A)-Schwänze hatten und in der frühen Eientwicklung aktiv waren. Die Deadenylierung ist nicht von spezifischen Sequenzen in der mRNA abhängig. Alle mRNAs werden deadeny- liert, außer sie werden durch einen aktiven Adenylierungsprozess geschützt. 3. Während der frühen Embryogenese werden bestimmte mRNAs in einer spezifischen Reaktion deadenyliert, die ebenfalls spezifische Sequenzen im 3'-UTR benötigt.
Alle drei Deadenylierungsreaktionen finden im Cytoplasma statt. Allerdings bleiben in Gegensatz zu somatischen Zellen die oligoadenylierten oder deadenylierten mRNAs in Oozyten stabil und werden erneut adenyliert oder erst in späteren Entwicklungsstadien abgebaut.
Bisher sind die für diese Reaktionen verantwortlichen Enzyme nicht eindeutig iden- tifiziert worden. In der Hefe konnte gezeigt werden, daß der Abbau von poly(A) direkt oder indirekt vom poly(A) binding protein (PAB1 ) abhängt. Obwohl eine PAB1- abhängige Poly(A)nuclease (PAN) gereinigt worden ist (Sachs, A.B. & Deardorff (1992) Cell, 70, 961 ; Lowell, J.E. et al. (1992) Genes Dev., 6, 2088), konnten bei Mutanten der betreffenden Gene (PAN2 und PAN3) nur geringe Defekte in der Deadenylierung festgestellt werden (Boeck, R. et al. (1996) 271 (1 ), 432; Brown, C. et al. (1996) 16 (10) 5744).
Körner, Ch.G. & Wähle, E. (1997) J. Biol. Chem., 272, 10448, No. 16 beschreiben eine Mg2+-abhängige poly(A)-spezifιsche 3'-Exoribonuclease aus Kalbsthymus mit einem Molekulargewicht von 74 kDa, die auch als deadenyiierende Nuclease (DAN) bezeichnet wurde. Die beschriebene DAN aus Kalbsthymus wird durch das cytoplasmatische poly(A)-bindende Protein I (PAB I) unter bestimmten Reaktions- bedingungen stimuliert (Körner, Chr. & Wähle, E. (1997), supra) und bevorzugt als Substrat Poly(A).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, eine humane Poly(A)-spezifische 3'- Exoribonuclease bereitzustellen.
In einer Genbank wurde nun überraschenderweise ein nicht näher charakterisierter und nur ansequenzierter Klon gefunden, der gemäß der vorliegenden Erfindung für eine humane deadenyiierende Nuclease (humane DAN) kodiert.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Nukleinsäure kodierend für eine humane DAN mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ 11 oder eine funktioneile Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, vorzugsweise mit mindestens 15 oder 20 Nukleotiden, insbesondere mit mindestens 100 Nu- kleotiden, vor allem mit mindestens 300 Nukleotiden (nachfolgend „erfindungsgemäße Nukleinsäure" genannt).
Die vollständige Nukleinsäure kodiert für ein Protein mit 639 Aminosäuren und einer molekularen Masse von 73,5 kDa. Die Expression der Nukleinsäure in E. coli führte zu einem Protein, welches ähnliche enzymatische Aktivitäten wie die von Körner, Ch.G. & Wähle, E. (1997, supra) beschriebene DAN zeigt. Weitere Experimente gemäß der vorliegenden Erfindung bestätigten, daß es sich bei der Nukleinsäure um eine Nukleinsäure handelt, die für eine humane DAN kodiert. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure wurde am 25. März 1998 bei der DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, 38124 Braunschweig unter der Nummer DSM 12075 hinterlegt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine doppelsträngige DNA, und insbesondere eine DNA mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ 12 von Pos. 58 bis Pos. 1977. Die beiden Positionen bestimmen gemäß der vorliegenden Erfindung den Start und das Ende des kodierenden Bereiches. Unter dem Begriff „funktioneile Variante" versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung eine Nukleinsäure, die funktioneil mit der humanen DAN-kodierenden Nukleinsäure verwandt und insbesondere humanen Ursprungs ist. Beispiele verwandter Nukleinsäuren sind bespielsweise Nukleinsäuren aus unterschiedlichen huma- nen Zellen bzw. Geweben oder allelische Varianten. Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls Varianten von Nukleinsäuren, die von verschiedenen menschlichen Individuen stammen können.
Im weiteren Sinne versteht man unter dem Begriff „Varianten" gemäß der vorliegen- den Erfindung Nukleinsäuren, die eine Homologie, insbesondere eine Sequenzidentität von ca. 60%, vorzugsweise von ca. 75%, insbesondere von ca. 90% und vor allem von ca. 95% aufweisen.
Die Teile der erfindungsgemäßen Nukleinsäure können beispielsweise zur Herstel- lung einzelner Epitope, als Sonden zur Identifizierung weiterer funktioneller Varianten oder als Antisense-Nukleinsäuren verwendet werden. Beispielsweise eignet sich eine Nukleinsäure aus mindestens ca. 8 Nukleotiden als Antisense-Nukleinsäure, eine Nukleinsäure aus mindestens ca. 15 Nukleotiden als Primer beim PCR- Verfahren, eine Nukleinsäure aus mindestens ca. 20 Nukleotiden für die Identifizie- rung weiterer Varianten und eine Nukleinsäure aus mindestens ca. 100 Nukleotiden als Sonde.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Nukleinsäure eine oder mehrere nicht-kodierende Sequenzen und/oder eine Poly(A)- Sequenz. Die nicht-kodierenden Sequenzen sind beispielsweise Intronsequenzen oder regulatorische Sequenzen, wie Promotor- oder Enhancer-Sequenzen, zur kontrollierten Expression des humanen DAN kodierenden Gens.
In einer weiteren Ausführungsform ist die erfiπdungsgemäße Nukleinsäure daher in einem Vektor, vorzugsweise in einem Expressionsvektor oder gentherapeutisch wirksamen Vektor enthalten. Die Expressionsvektoren können beispielsweise prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren sein. Beispiele für prokaryotische Expressionsvektoren sind für die Expression in E. coli z.B. der T7 Expressionsvektor pGM10 (Martin, 1996), welcher für einen N-terminalen Met-Ala-His6-Tag kodiert, der eine vorteilhafte Rei- nigung des exprimierten Proteins über eine Ni2+-NTA-Säuie ermöglicht. Als eukaryotische Expressionsvektoren für die Expression in Saccharomyces cerevisiae eignen sich z.B. die Vektoren p426Met25 oder p426GAL1 (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767), für die Expression in Insektenzellen z.B. Bacuiovirus- Vektoren wie in EP-B1 -0127839 oder EP-B1 -0549721 offenbart, und für die Expres- sion in Säugerzellen z.B. SV40-Vektoren, welche allgemein erhältlich sind.
Im allgemeinen enthalten die Expressionsvektoren auch für die Wirtszelle geeignete regulatorische Sequenzen, wie z.B. den trp-Promotor für die Expression in E. coli (s. z.B. EP-B1-0154133), den ADH-2-Promotor für die Expression in Hefen (Rüssel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674), den Baculovirus-Polyhedrin-Promotor für die Expression in Insektenzellen (s. z.B. EP-B1 -0127839) oder den frühen SV40- Promotor oder LTR-Promotoren z.B. von MMTV (Mouse Mammary Tumour Virus; Lee et al. (1981 ) Nature, 214, 228).
Beispiele von gentherapeutisch wirksamen Vektoren sind Virusvektoren, vorzugsweise Adenovirusvektoren, insbesondere replikationsdefiziente Adenovirusvektoren, oder Adenoassoziierte Virusvektoren, z.B. ein Adenoassoziierter Virusvektor, der ausschließlich aus zwei insertierten terminalen Wiederholungssequenzen (ITR) besteht.
Geeignete Adenovirusvektoren sind beispielsweise in McGrory, W.J. et al. (1988) Virol. 163, 614; Gluzman, Y. et al. (1982) in „Eukaryotic Viral Vectors" (Gluzman, Y. ed.) 187, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Habor, New York; Chroboczek, J. et al. (1992) Virol. 186, 280; Karlsson, S. et al. (1986) EMBO J.. 5, 2377 oder WO95/00655 beschrieben. Geeignete Adeno-assoziierte Virusvektoren sind beispielsweise in Muzyczka, N. (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 97; WO95/23867; Samulski, R.J. (1989) J. Virol, 63, 3822; WO95/23867; Chiorini, J.A. et al. (1995) Human Gene Therapy 6, 1531 oder Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5, 793 beschrieben.
Gentherapeutisch wirksame Vektoren lassen sich auch dadurch erhalten, daß man die erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Liposomen komplexiert. Hierzu eignen sich Lipidmischungen wie bei Feigner, P.L. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei, USA 84, 7413; Behr, J.P. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 6982; Feigner, J.H. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550 oder Gao, X. & Huang, L. (1991 ) Biochim. Bio- phys. Acta 1189, 195 beschrieben. Bei der Herstellung der Liposomen wird die DNA ionisch auf der Oberfläche der Liposomen gebunden, und zwar in einem solchen Verhältnis, daß eine positive Nettoladung verbleibt und die DNA vollständig von den Liposomen komplexiert wird.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann beispielsweise chemisch anhand der in SEQ 12 offenbarten Sequenz oder anhand der in SEQ 11 offenbarten Peptidse- quenz unter Heranziehen des genetischen Codes z.B. nach der Phosphotriester- Methode synthetisiert werden (s. z.B. Uhlman, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543, No. 4). Eine weitere Möglichkeit, die erfindungsgemäße Nukleinsäure in die Hand zu bekommen, ist die Isolierung aus einer geeigneten Genbank, beispielsweise aus einer humanen Genbank, anhand einer geeigneten Sonde (s. z.B. Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning. A laboratory manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor, New York). Als Sonde eignen sich beispielsweise einzelsträn- gige DNA-Fragmente mit einer Länge von ca. 100 bis 1000 Nucleotiden, vorzugsweise mit einer Länge von ca. 200 bis 500 Nucleotiden, insbesondere mit einer Länge von ca. 300 bis 400 Nucleotiden, deren Sequenz aus der Nukleinsäurese- quenz gemäß SEQ 12 abgeleitet werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch das Polypeptid selbst mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ 11 oder einer funktionellen Variante davon, und Teile davon mit mindestens sechs Aminosäuren, vorzugsweise mit miπde- stens 12 Aminosäuren, insbesondere mit mindestens 65 Aminosäuren und vor allem mit 638 Aminosäuren (nachfolgend „erfindungsgemäßes Polypeptid" genannt). Beispielsweise kann ein ca. 6-12, vorzugsweise ca. 8 Aminosäuren-langes Polypeptid ein Epitop enthalten, das nach Kopplung an einen Träger zur Herstellung von spe- zifischen poly- oder monoklonalen Antikörper dient (siehe hierzu z. B. US
5,656,435). Polypeptide mit einer Länge von mindestens ca. 65 Aminosäuren können auch direkt ohne Träger zur Herstellung von poly- oder monoklonalen Antikörper dienen.
Unter dem Begriff „funktioneile Variante" im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man Polypeptide, die funktioneil mit dem erfinduπgsgemäßen Peptid verwandt sind, d.h. eine Poly(A)-spezifische 3'-Exoribonucleaseaktivität aufweisen und vorzugsweise unter zwei verschiedenen Reaktionsbedingungen aktiv sind. Bei der ersten Reaktionsbedinguπg ist in Abwesenheit von Salz die Aktivität vollständig von der Anwesenheit von Spermidin abhängig. Im Gegensatz hierzu ist in Abwesenheit von Spermidin die Aktivität des Enzyms von der Salzkonzentration abhängig. Zudem kann in Anwesenheit von PAB1 unter bestimmten Reaktionsbedingungen ein stufenweiser Abbau des Poly(A)-Schwanzes beobachtet werden (siehe auch Körner, Chr. G. & Wähle, E. (1997), supra). Insbesondere unterscheiden sich die vorherr- sehenden Abbauprodukte in ihrer Länge um ca. 30 Nukleotide. Unter Varianten versteht man auch allelische Varianten oder Polypeptide, die von anderen menschlichen Zellen bzw. Gewebe abstammen. Auch versteht man darunter Polypeptide, die von verschiedenen menschlichen Individuen stammen.
Im weiteren Sinne versteht man darunter auch Polypeptide, die eine Sequenzhomologie, insbesondere eine Sequenzidentität von ca. 70%, vorzugsweise von ca. 80%, insbesondere von ca. 90%, vor allem von ca. 95% zu dem Polypeptid mit der Aminosäuresequeπz gemäß SEQ 11 haben. Ferner zählen hierzu auch Deletion des Polypeptids im Bereich von ca. 1 - 60, vorzugsweise von ca. 1 - 30, insbesondere von ca. 1 - 15, vor allem von ca. 1 - 5 Aminosäuren. Beispielsweise kann die erste Aminosäure Methionin fehlen, ohne daß die Funktion des Polypeptids wesentlich verändert wird. Daneben zählen hierzu auch Fusionsproteine, die die oben be- schriebenen erfindungsgemäßen Polypeptide enthalten, wobei die Fusionsproteine selbst bereits die Funktion einer humanen DAN haben oder erst nach Abspaltung des Fusionsanteils die spezifische Funktion bekommen können. Vor allem zählen hierzu Fusionsproteine mit einem Anteil von insbesondere nicht-humanen Sequen- zen von ca. 1 - 200, vorzugsweise ca. 1 - 150, insbesondere ca. 1 - 100, vor allem ca. 1 - 50 Aminosäuren. Beispiele von nicht-humanen Peptidsequenzen sind prokaryotische Peptidsequenzen, z.B. aus der Galactosidase von E. coli oder ein sogenannter Histidin-Tag, z.B. ein Met-Ala-His6-Tag. Ein Fusionsprotein mit einem sogenannten Histidin-Tag eignet sich besonders vorteilhaft zur Reinigung des expri- mierten Proteins über Metallionen-haltige Säulen, beispielsweise über eine Ni2+- NTA-Säule. „NTA" steht für den Chelator „nitrilot acetic acid" (Qiagen GmbH, Hilden).
Die Teile des erfindungsgemäßen Polypeptids repräsentieren beispielsweise Epito- pe, die spezifisch von Antikörpern erkannt werden können.
Durch Vergleich mit bekannten Nucleasen wurde gefunden, daß das erfindungsgemäße Polypeptid ein Mitglied der sogenannten RNaseD-Familie ist. Figur 4 zeigt die konservierten Aminosäuren der Exo I, Exo II und Exo III Motive, die für diese Klasse von Exonucleasen charakteristisch sind. Andere konservierte Aminosäuren sind grau unterlegt. Die drei sauren Aminosäureseitenketten, zwei in der Exo I Domäne und eine in der Exo III Domäne, sind direkt in der Bindung der zwei Mg2+-lonen, die an der enzymatischen Hydrolyse beteiligt sind, involviert. Eine dritte saure Aminosäureseitenkette, die in der Exo II Domäne lokalisiert ist, bindet eines der Metallionen über Wasserbrückenmoleküle. All diese Aminosäurereste sind innerhalb der Familie hoch konserviert und werden auch in der erfindungsgemäßen humanen DAN gefunden. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann daher als eine Po- ly(A)-spezifische 3'-Exoribonuclease der RNaseD Familie bezeichnet werden.
Das erfindungsgemäße Polypeptid wird beispielsweise durch Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einem geeigneten Expressionssystem, wie oben bereits beschrieben, nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden herge- stellt. Als Wirtszellen eignen sich beispielsweise die E. coli Stämme DH5, HB101 oder BL21 , der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae, die Insektenzelllinie Lepi- dopteran, z.B. von Spodoptera Frugiperda, oder tierische Zellen wie COS, Vero, 293 und HeLa, die alle allgemein erhältlich sind.
Insbesondere die genannten Teile des Polypeptids können auch mit Hilfe der klassischen Peptidsynthese (Merrifield-Technik) synthetisiert werden. Sie eignen sich insbesondere zur Gewinnung von Antiseren, mit deren Hilfe geeignete Genexpressionsbanken durchsucht werden können, um so zu weiteren funktionellen Varianten des erfindungsgemäßen Polypeptids zu gelangen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich daher auf ein Verfahren zur Herstellung eines erfiπdungsgemäßen Polypeptids, wobei eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert und gegebenenfalls isoliert wird.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich auch auf Antikörper, die mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid spezifisch reagieren, wobei die oben genannten Teile des Polypeptids entweder selbst immunogen sind oder durch Koppelung an geeignete Träger, wie z.B. bovines Serumalbumin, immunogen gemacht bzw. in ihrer Immunogenität gesteigert werden können.
Die Antikörper sind entweder polyklonal oder monoklonal. Die Herstellung, die auch einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung darstellt, erfolgt beispielsweise nach allgemein bekannten Methoden durch Immunisieren eines Säugetiers, beispielsweise eines Kaninchens, mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid oder den genannten Teilen davon, gegebenenfalls in Anwesenheit von z.B. Freund's Adjuvant und/oder Aluminiumhydroxidgelen (s. z.B. Diamond, B.A. et al. (1981 ) The New England Journal of Medicine, 1344). Die im Tier aufgrund einer immunologischen Reaktion entstandenen polyklonalen Antikörper lassen sich anschließend nach allgemein bekannten Methoden leicht aus dem Blut isolieren und z.B. über Säulenchromatographie reinigen. Bevorzugt wird eine Affinitätsreinigung der Antikörper, bei der bei- spielsweise das C-terminale DAN-Fragment an eine NHS-aktivierte HiTrap-Säule gekoppelt wurde.
Monoklonale Antikörper können beispielsweise nach der bekannten Methode von Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991 ) Nature, 349, 293) hergestellt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Arzneimittel, das eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid und gegebenenfalls geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe enthält und ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs, Autoimmunkrankheiten, insbesondere Multiple Sklerose oder Rheumatoide Arthritis, Alzheimer-Krankheit, Allergien, insbesondere Neurodermitis, Typ I Allergien oder Typ IV Allergien, Arthrose, Atherosklerose, Osteoporose, akute und chronische Infektionskrankheiten und/oder Diabetis und /oder zur Beeinflussung des Zellmetabolismus, insbesondere bei der Immunsuppression, vor allem bei Transplantationen, bei dem eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, beispielsweise eine sogenannten Antisense- Nukleinsäure, oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit pharmazeutisch annehmbaren Zusatz- und/oder Hilfsstoffen formuliert wird.
Für die gentherapeutische Anwendung beim Menschen ist vor allem ein Arzneimittel geeignet, das die erfindungsgemäße Nukleinsäure in nackter Form oder in Form eines der oben beschriebenen gentherapeutisch wirksamen Vektoren oder in mit Liposomen kompiexierter Form enthält.
Als geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe eignen sich z.B. eine physiologische Kochsalzlösung, Stabilisatoren, Proteinaseinhibitoren, Nukleaseinhibitoren etc.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Diagnostikum ent- haltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder erfindungsgemäße Antikörper und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe und ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Krebs, Autoimmunkrankheiten, insbesondere Multiple Sklerose oder Rheumatoide Arthritis, Alzheimer-Krankheit, Allergien, insbesondere Neurodermitis, Typ I Allergien oder Typ IV Allergien, Arthrose, Atherosklerose, Osteoporose, akute und chronische Infektionskrankheiten und /oder Diabetis und/oder zur Analyse des Zellmeta- bolismus, insbesondere des Immunstatus, vor allem bei Transplantationen, bei dem eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder erfindungsgemäße Antikörper mit geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoffen versetzt werden.
Beispielsweise können gemäß der vorliegenden Erfindung anhand der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ein Diagnostikum auf der Basis der Polymerasekettenreak- tion (PCR-Diagnostik, z.B. gemäß EP-0200362) oder eines Northern Blots, wie in Beispiel 5 näher beschrieben, hergestellt werden. Diese Tests beruhen auf der spezifischen Hybridisierung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure mit dem komple- mentären Gegenstrang üblicherweise der entsprechenden mRNA. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann hierbei auch modifiziert sein, wie z.B. in EP0063879 beschrieben. Vorzugsweise wird ein erfindungsgemäßes DNA-Fragment mittels geeigneter Reagenzien, z.B. radioaktiv mit α-P32-dATP oder nicht-radioaktiv mit Biotin, nach allgemein bekannten Methoden markiert und mit isolierter RNA, die vorzugs- weise an geeignete Membranen aus z.B. Zellulose oder Nylon gebunden wurde, inkubiert. Zudem ist es vorteilhaft, die isolierte RNA vor der Hybridisierung und Bindung an eine Membran der Größe nach, z.B. mittels Agarose-Gelelektrophorese, aufzutrennen. Bei gleicher Menge an untersuchter RNA aus jeder Gewebeprobe kann somit die Menge an mRNA bestimmt werden, die spezifisch durch die Sonde markiert wurde.
Ein weiteres Diagnostikum enthält das erfindungsgemäße Polypeptid bzw. die oben näher beschriebenen immunogenen Teile davon. Das Polypeptid bzw. Teile davon, die vorzugsweise an eine Festphase, z.B. aus Nitrocellulose oder Nylon, gebunden sind, können beispielsweise mit der zu untersuchenden Körperflüssigkeit z.B. Blut, in vitro in Berührung gebracht werden, um so beispielsweise mit Autoimmunantikör- per reagieren zu können. Der Antikörper-Peptid-Komplex kann anschließend beispielsweise anhand markierter Antihuman-IgG- oder Antihuman-IgM-Antikörper nachgewiesen werden. Bei der Markierung handelt es sich beispielsweise um ein Enzym, wie Peroxidase, das eine Farbreaktion katalysiert. Die Anwesenheit und die Menge an anwesenden Autoimmunantikörpern kann somit über die Farbreaktion leicht und schnell nachgewiesen werden.
Ein anderes Diagnostikum enthält die erfindungsgemäßen Antikörper selbst. Mit Hilfe dieser Antikörper kann beispielsweise eine Gewebeprobe des Menschen leicht und schnell dahingehend untersucht werden, ob das betreffende Polypeptid vorhanden ist. In diesem Fall sind die erfindungsgemäßen Antikörper beispielsweise mit einem Enzym, wie oben bereits beschrieben, markiert. Der spezifische Antikörper-Peptid-Komplex kann dadurch leicht und ebenso schnell über eine enzymatische Farbreaktion nachgewiesen werden.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft auch einen Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren, wie z.B. Inhibitoren oder Stimulatoren, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder die erfindungsgemäßen Antikörper und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.
Ein geeigneter Test zur Identifizierung funktioneller Interaktoren ist z.B. das sogenannte „Two-Hybrid System" (Fields, S. & Sternglanz, R. (1994) Trends in Geπetics, 10, 286). Bei diesem Test wird eine Zelle, beispielsweise eine Hefezelle, mit einem oder mehreren Expressionsvektoren transformiert oder transfiziert, die ein Fusionsprotein exprimiereπ, das das erfindungsgemäße Polypeptid und eine DNA- Bindedomäne eines bekannten Proteins, beispielsweise von Gal4 oder LexA aus E. coli, enthält und/oder ein Fusionsprotein exprimieren, das ein unbekanntes Polypeptid und eine Transkriptions-Aktivierungsdomäne, beispielsweise von Gal4, Her- pesvirus VP16 oder B42, enthält. Zudem enthält die Zelle ein Reportergen, beispielsweise das LacZ-Gen aus E. coli, „Green Fluorescence Protein" oder die Aminosäure-Biosynthesegene der Hefe His3 oder Leu2, das durch regulatorische Se- quenzen, wie z.B. den lexA-Promotor/Operator oder durch eine sogenannte „Upstream Activation Sequence" (UAS) der Hefe kontrolliert wird. Das unbekannte Polypeptid wird beispielsweise durch ein DNA-Fragment kodiert, das aus einer Genbank, beispielsweise aus einer humanen Genbank, stammt. Üblicherweise wird gleich eine cDNA-Genbank mit Hilfe der beschriebenen Expressionsvektoren in Hefe hergestellt, so daß der Test unmittelbar danach durchgeführt werden kann.
Beispielsweise wird in einem Hefe-Expressionsvektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure in funktioneller Einheit an die Nukleinsäure kodierend für die lexA-DNA- Bindedomäne kloπiert, so daß ein Fusionsprotein aus dem erfindungsgemäßen Polypeptid und der LexA-DNA-Bindedomäne in der transformierten Hefe exprimiert wird. In einem anderen Hefe-Expressionsvektor werden cDNA-Fragmente aus einer cDNA-Genbank in funktioneller Einheit an die Nukleinsäure kodierend für die Gal4- Transkriptions-Aktivierungsdomäne kloniert, so daß ein Fusionsprotein aus einem unbekannten Polypeptid und der Gal4-Transkriptions-Aktivierungsdomäne in der transformierten Hefe exprimiert wird. Die mit beiden Expressionsvektoren transformierte Hefe, die beispielsweise Leu2" ist, enthält zusätzlich eine Nukleinsäure, die für Leu2 kodiert, und durch den LexA-Promotor/Operator kontrolliert wird. Im Falle einer funktionellen Interaktion zwischen dem erfindungsgemäßen Polypeptid und dem unbekannten Polypeptid bindet die Gal4-Transkriptions-Aktivierungsdomäne über die LexA-DNA-Bindedomäne an den LexA-Promotor/Operator, wodurch dieser aktiviert und das Leu2-Gen exprimiert wird. Dies hat zur Folge, daß die Leu2' Hefe auf Minimalmedium, das kein Leucin enthält, wachsen kann.
Bei Verwendung des LacZ- bzw. „Green Fluorescence Protein"-Reportergens anstelle eines Aminosäure-Biosynthesegens kann die Aktivierung der Transkription dadurch nachgewiesen werden, daß sich blau- bzw. grün-fluoreszierende Kolonien bilden. Die Blau- bzw. Fluoreszenzfärbung läßt sich aber auch leicht im Spectro- photometer z.B. bei 585 nM im Falle einer Blaufärbung quantifizieren.
Auf diese Weise können Expressionsgenbanken leicht und schnell auf Polypeptide durchsucht werden, die mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid interagieren. An- schließend können die gefundenen neuen Polypeptide isoliert und weiter charakterisiert werden.
Eine weitere Anwendungsmöglichkeit des „Two-Hybrid-Systems" ist die Beeinflus- sung der Interaktion zwischen dem erfindungsgemäßen Polypeptid und einem bekannten oder unbekannten Polypeptid durch weitere Substanzen, wie z.B. chemische Verbindungen. Auf diese Weise lassen sich auch leicht neue wertvolle chemisch synthetisierbare Wirkstoffe auffinden, die als Therapeutikum eingesetzt werden können. Die vorliegende Erfindung ist daher nicht nur auf ein Verfahren zum Auffinden von polypeptidartigen Interaktoren bestimmt, sondern erstreckt sich auch auf ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die mit dem oben beschriebenen Protein-Protein-Komplex interagieren können. Derartige peptidartige, wie auch chemische Interaktoren werden daher im Sinne der vorliegenden Erfindungs als funktionelle Interaktoren bezeichnet, die eine inhibierende oder eine stimulierende Wirkung haben können.
Eine weitere Anwendungsmöglichkeit des erfindungsgemäßen Polypeptids ist der Poly(A)-spezifische Abbau von Nukleinsäuren, insbesondere von mRNA. Der Po- ly(A)-spezifιsche Abbau von Nukleinsäuren kann insbesondere in Forschungslabors Verwendung finden.
Die nachfolgenden Figuren und Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.
Beschreibung der Figuren und den wichtigsten Sequenzen
SEQ 11 zeigt die Aminosäuresequenz der humanen DAN mit Domänen für Exo (ADFFAIDGEFSGIS), Exo II LVIGHNMLLDVMHTVH) und Exo III (SEQLHEAGYDAYITGLC). SEQ 12 zeigt die Nukleinsäuresequenz der humanen DAN einschließlich Start- (Pos. 58) und Stoppkodon (Pos. 1977) mit anschließender 3'UTR.
Fig. 1 zeigt das Elutionsprofil der humanen DAN an MonoQ (Fig. 3A) und SDS- PAGEs (Fig. 1 B und 1 C)
Fig. 2 zeigt einen Westem-Blot von rekombinanter humaner DAN und nativer boviner DAN Fig. 3 zeigt die Deadenylierung von mRNA, die Akkumulierung von deadenylier- ter RNA und den Einfluß von PABI Fig. 4 zeigt einen Vergleich bekannter Nucleasen mit der erfindungsgemäßen humanen DAN.
Beispiele
1. Identifizierung von humanen DAN cDNA-Klonen
Die Reinigung von boviner DAN wurde, wie bei Körner, G. & Wähle, E. (1997), supra, beschrieben, wie folgt durchgeführt:
Alle Schritte der Reinigung wurden bei 4°C durchgeführt. Zwischen den Reini- gungsschritten wurden die Proben in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C eingefroren. Folgender Basispuffer wurde benutzt: 50 mM Tris/HCI, 1 mM EDTA, 10 % (v/v) Glycerin, 1 mM Dithiothreitol, 0,4 μg/ml Leupeptinhemisulfat, 0,7 μg/ml Pepstatin, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 0,02 % (v/v) Nonidet P-40, pH 7,9. Bei den verschiedenen Reinigungsschritten wurden diesem Basispuffer unter- schiedliche Konzentrationen KCI wie unten beschrieben zugesetzt.
Frischer Kalbsthymus wurde von einem örtlichen Schlachthaus bezogen, auf Eis transportiert und bei -80°C gelagert. Ein kg wurde in 2 I Basispuffer mit 50 mM KCI aufgetaut und in einem Waring Blendar Homogenizator zunächst mit kleiner, dann mit mittlerer und schließlich mit höchster Geschwindigkeit homogenisiert. Das Ho- mogenisat wurde 1 h bei 16000 x g zentrifugiert und der Überstand durch eine weitmaschige Gaze dekantiert (Wähle, E., J. Biol. Chem., 266, 1991 ).
Dieser Extrakt aus Kalbsthymus wurde auf eine DEAE-Sepharose FF Säule (Säu- lenvolumen 4 I) aufgetragen und mit einem Salzgradieπten über das 2,5-fache Säulenvolumen von 50 bis 600 mM KCI von der Säule mit einer Flußrate von 3 l/h elu- iert. Aktive Fraktionen wurden bei einer Salzkonzentration zwischen 75 und 200 mM KCI von der Säule eluiert. Die Fraktionen wurden gesammelt, vereinigt, mit Ammoniumsulfat bis zu einer 30% gesättigten Lösung versetzt und für 1 ,5 h auf Eis ge- rührt. Nach einer Zentrifugation (30 min, 10800 x g, gilt für alle unten erwähnten Zentrifugationsschritte) wurde der Überstand auf 50 %-ige Sättigung mit Ammoniumsulfat eingestellt, erneut auf Eis gerührt und zentrifugiert. Das Sediment wurde in 400 ml Basispuffer mit 50 mM KCI resuspendiert und für 10 h gegen 2 x 4,5 I Basispuffer dialysiert und erneut zentrifugiert. Eine 1 ,4 I Sepharose-Blue Säule (7 x 36 cm) wurde mit Basispuffer mit 50 mM KCI äquilibriert und der dialysierte Extrakt auf die Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit 1 ,5 Bettvolumina von Basispuffer mit 250 mM KCI gewaschen und mit einem Bettvolumen Basispuffer mit 1 M KCI eluiert (Flußgeschwindigkeit 2 l/h).
Die aktiven Fraktionen von zwei Präparationen aus jeweils 1 ,2 kg Kalbsthymus wurden zusammengeführt und mit Ammoniumsulfat (60% Sättigung) gefällt. Nach der Zentrifugation wurde das Sediment in 200 ml Basispuffer mit 50 mM KCI aufgenommen, 12 h gegen 3 x 4 I des selben Puffers dialysiert und in zwei Portionen auf eine Heparin-Sepharose Säule (2,5 x 37 cm) aufgetragen. Die Säule wurden mit 1 ,5 Bettvolumina Basispuffer mit 50 mM KCI gewaschen und anschließend mit 10 Bettvolumina in einem Gradienten bis 500 mM KCI (Flußgeschwindigkeit: 145 ml/h) eluiert. Die DAN Aktivität eluierte zwischen 80 und 150 mM KCI. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und gegen Basispuffer mit 30 mM KCI für 4 h dialysiert. Das Dialysat wurde abzentrifugiert und in zwei Portionen an einer MonoQ FPLC Säule chromatographiert (Bettvolumen 8 ml). Die Säule wurde mit zwei Bettvolumen Basispuffer mit 50 mM KCI gewaschen und anschließend mit einem Gradienten über 320 ml mit einer steigenden Salzkonzentration (Endkonzentration: 500 mM KCI, Flußgeschwindigkeit: 2,5 ml/h) von der Säule eluiert. Die DAN-Aktivität eluierte bei ca. 160 mM KCI. Die aktiven Fraktionen (40 ml) wurden vereinigt und für 4 h gegen 2 I Basispuffer mit 30 mM KCI dialysiert, zentrifugiert und auf eine weitere MonoQ- Säule (1 ml Bettvolumen, Flußgeschwindigkeit: 0,9 ml/h) aufgetragen. Die an die Säule gebundene DAN-Aktivität wurde mit Basispuffer mit 500 mM KCI eluiert und in vier Portionen auf eine Superdex HR 10/30 FPLC Säule (äquilibriert mit Basispuffer mit 300 mM KCI, Flußgeschwindigkeit: 0,15 ml/h) aufgetragen (Körner, Ch. G. & Wähle, E. (1997), supra)
Verschiedene Fraktionen einer Superdex-Säule, die die DAN Aktivität enthielten, wurden gesammelt und über eine Phenyl-Superose-Säule getrennt (Körner, G. & Wähle, E. (1997), supra). Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und gegen Puffer (50 mM Tris HCI, pH 7,9, 1 mM EDTA, 10% (v/v) Glycerin, 1 mM Dithiothreitol, 0,4 μg/ml Leupeptin-Hemisulfat, 0,7 μg/ml Pepstatin, 0,5 mM Phenylmethylsulfonat (PMSF), 0,02 % (v/v) Nonidet p-40, 50 mM KCI) dialysiert. Nach Zentrifugation wurde das Dialysat an einer 100 μl Smart MonoQ (PC 1.6/5) Säule aufgetragen. Anschließend wurde mit 200 μl Puffer gewaschen. Die gebundenen Proteine wurden in einem Gradienten mit einer steigenden Salzkonzentration (Endkonzentration 500 mM KCI) über ein Volumen von 40 Säulenbettvolumina eluiert. Die Fraktionen, die positiv für die DAN-Aktivität waren, eluierten bei einer KCI-Konzentration von ca. 200 mM KCI. Die zwei Fraktionen mit der höchsten DAN-Aktivität wurden mittels einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Anschließend folgte eine in- situ Hydrolyse durch die Protease Lys-C, die Auftrennung über HPLC und Sequenzierung der Peptide. Folgende Sequenzen wurden gefunden: 1. KSFNFYVFPK,
2. KPFNRSSPD(V/K)K,
3. KYAESYWIQTYADYVG sowie
4. eine Mischung aus: KEQEELNDA und KLFLMRVMD.
Die N-terminale Sequenz der gereinigten bovinen DAN konnte nicht bestimmt wer- den. Anschließend wurden EST (expressed sequence tags)-Datenbankrecherchen mit Hilfe des BLAST-Programms (NCBI) durchgeführt. Folgende Klone konnten identifiziert werden:
I.M.A.G.E. -Konsortium Klon ID 645295 durch Peptide 1 und 2 und I.MAG.E.-Konsortium Klon ID 301901 durch Peptid 3.
Das vollständige Sequenzieren der gefundenen Klone wurde auf einem ABI373A- Sequenziergerät mit dem ABI Dye Terminator Cycle SequencingKit durchgeführt.
Hierbei wurde gefunden, daß der I.M.A.G.E. -Konsortium Klon ID 301901 für die 176 C-terminalen Aminosäuren von DAN und den gesamten 3'-UTR kodiert, während I.M.A.G.E. -Konsortium Klon ID 645295 den gesamten ORF und den 5'UTR und einen Teil des 3'-UTR kodiert, was einem Protein von 639 Aminosäuren mit einer molekularen Masse von 73,5 kDa entspricht (SEQ 11 ). Die 57 Nukleotide, die stromaufwärts vom ersten AUG Codon liegen enthalten kein Stop-Codon im Leseraster. Die dieses AUG-Codon umgebenden Sequenzen (AGAAUGG) entsprechen den sogenannten Kozak-Regeln (Kozak, 1991 ), die für den Translationsstart bevorzugte Startsequenzen beschreiben. Ein 3'-UTR von 0,7 kB ist im cDNA-Klon 645 295 und ein poly(A)-Schwanz ist am Ende des cDNA-Klons 301901 zu finden. Dem poly(A)-Schwanz geht stromaufwärts das seltene Polyadenylierungssignal AUUAAA voraus. (SEQ 12)
2. Herstellung von Expressionsvektoren
Das Plasmid pGMMCS wurde auf folgende Weise konstruiert:
Der T7 Expressionsvektor pGM10 (Martin, 1996), welcher die PABII cDNA-Sequenz (Nemeth, 1996) mit einem N-terminalen Met-Ala-His6-Tag enthielt, wurde mit Xho I und BamH I verdaut und das Fragment, das den 3'-Teil des PAB II enthielt, wurde durch ein Xho I/BamH I-Fragmeπt aus der Multiple Cloning Site vom pBluescript KS (+/-) Plasmid ersetzt. Das resultierende Plasmid enthält eine durch den T7-Promotor kontrollierte Sequenz, die mit Met-AlaHis6 beginnt und durch den 5'- Teil vom PAB II und einer Multi Cloning Site gefolgt wird. Eine Nde I Schnittstelle liegt zwischen dem Hise-Tag und der PAB II Sequenz und kann zusammen mit der Multi Cloning Site dafür benutzt werden, um die verbliebene PAB II Sequenz durch jede beliebige kodierende Sequenz zu ersetzen. Das Plasmid pGMMCS301901 wurde auf folgende Weise hergestellt:
Ein Teil der Sequenz des humanen DAN-Klons, der die 176 C-terminalen Aminosäuren enthielt wurde mittels PCR aus dem Klon 301901 mit folgenden Bedingungen amplifiziert: 15 Zyklen: 45 s bei 94°C, 45 s bei 54°C und 3,5 min bei 72°C. Pfu-Polymerase und die Primer Nde 1301901 : CCATATCCATATGCTTTTCAGTGCCTTTCCTAAC und Xho l 301901 : AGTACTCGAGTTACAATGTGTCAGG. Nach Verdau mit Nde I und Xho I wurden die entstandenen cDNA-Fragmente mit dem Qia-Ex-Kit (Qiagen GmbH, Hilden) gereinigt und in den Nde I und Xho I verdauten pGMMCS-Vektor integriert. Die Sequenz wurde mit Hilfe von Sequenzierung bestätigt.
Das Plasmid pGMMCS645295 wurde wie folgt hergestellt:
Die kodierende Sequenz des humanen DAN-Klons wurde mittels PCR aus dem Klon 645295 mit folgenden Bedingungen amplifiziert:
20 Zyklen: 45 s bei 94°C, 45 s bei 54°C und 3,5 min bei 72°C. Pfu-Polymerase und die Primer Nde 1645295: AGTGTCGCATATGGAGATAATCAGGAGCA und Xho I 645295: AGTACTCAGCGGTTTGCTGCCCTCA. Das entstandenen Produkt wurde in den Vektor pCR2.1 mit Hilfe des TA-Klonierungs-Kits (InVitrogen ®) kloniert. Nach Verdau mit Nde I und Xho I wurden die entstandenen cDNA-Fragmente mit dem Qia-Ex-Kit (Qiagen) gereinigt und in den Nde I und Xho I verdauten pGMMCS- Vektor integriert. Anschließend wurde der größte Teil der durch PCR generierten Sequenz mit Hilfe eines Verdaus mit Dra III und BstE II entfernt und durch das entsprechende Fragment des Originalklons ersetzt. Die neue Sequenz wurde mit Hilfe von Sequenzierung bestätigt. 3. Herstellung von Antikörpern
Antikörper gegen den C-terminalen Teil von humanem DAN wurden wie folgt produziert: Das Plasmid pGMMCS301901 wurde in BL21 (pLysC) transformiert. Die Zellen wurden bei 37°C in SOB-Medium mit 200 μg/ml Carbenicellin bis zu einer OD600 von 1 ,9 inkubiert. Anschließend wurde 200 μM Isopropyl-ß-D-Thiogalactosid dazugegeben und für weitere 5 h inkubiert. Die Zellen wurden geerntet und in Puffer A (100 mM NaH2P04, 10 mM Tris, 8M Harnstoff, pH 7,9) aufgenommen. Die Zellen wurden mit Ultraschall lysiert, das Lysat zentrifugiert und mit 3 ml Ni-NTA-Säulenmaterial für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Das Säulenmaterial wurde in eine Säule gepackt und mit 70 ml Puffer A, pH 6,3 gewaschen. Anschließend wurde mit 15 ml Puffer B (300 mM NaCI, 10% (v/v) Glyceπn, 50 mM Tris, 0,01 % (v/v) Nonidet-P40, 8M Harnstoff, pH 7,9) gewaschen. Das Protein wurde auf der Säule zurückgefaltet, indem mit zwei Gradienten der Hamstoffgehalt verringert wurde (45 ml/h, Gradient 1 : Puffer B von 8 auf 4 M Harnstoff bei Raumtemperatur, Gradient 2: von 4 auf 0 M Harnstoff bei 4°C). das Protein wurde mit Puffer B, der 500 mM Imidazole enthielt, von der Säule eluiert, gegen Puffer B ohne Harnstoff dialysiert und für die Immunisierung von Kaninchen verwendet.
Die Affinitätsreinigung von Anti-DAN-Antikörper wurde wie folgt vorgenommen: Das C-terminale DAN-Fragment wurde an eine NHS-aktivierte HiTrap-Säule (1 ml Volumen, Pharmacia, Freiburg) nach Herstelleranweisungeπ gekoppelt. 3 ml Serum wurden auf die Säule aufgetragen und nach Herstellerangaben eluiert. 300 μg/ml BSA und 0,02% (w/v) NaN3 wurden den Fraktionen zugesetzt und der Puffer wurde mittels Dialyse ausgetauscht.
4. Expression und Reinigung von humaner DAN
Humane DAN wurde in E. coli als Fusionsprotein mit N-terminalem His-Tag (Met- Ala-His6-Tag) folgendermaßen exprimiert: Das Plasmid pGMMCS645295 wurde in BL21 (pLysC) transformiert. Die Zellen wurden in 50 ml LB Medium mit 100 μg/ml Carbenicellin und 24 μg/ml Chloramphenicol bei 37°C angezogen und anschließend in eine 500 ml Kultur ohne Chloramphenicol überführt und bei 33°C weiterinkubiert. Nach dem Erreichen einer OD600 von 1 ,3 wurden 100 μM Isopropyl-ß-D-Thiogalactosid hinzugefügt und die Kultur für eine weitere Stunde inkubiert. Die Zellen wurden geerntet und in Puffer A (50 mM Tris, 300 mM KCI, 0,1 mM MgAc, 1 mM ß-Mercaptoethanol, 0,4 μg/ml Leupeptin, 0,7 mg/ml Pepstatin, 0,5 mM PMSF, pH 7,9) aufgenommen. Die Zellen wurden mit Ultraschall lysiert, das Lysat zentrifugiert und mit 2 ml Ni2+-NTA-Säulenmaterial für 2 h bei 4°C inkubiert. Das Säulenmaterial wurde in eine Säule gepackt und mit 25 ml Puffer A und anschließend mit 20 ml Puffer B (Puffer A und 10% (v/v) Glycerin, 0,02 % (v/v) Nonidet-P40, ohne Magnesium, pH 6,3) gewaschen. Anschließend wurde das Protein mit 5 ml Puffer C (Puffer B mit 500 mM Imidazol) eluiert. Darauf folgte eine Dialyse gegen Puffer D (50 mM Tris, 20 mM KCI, 1 mM EDTA, 5 mM PMSF, 10% (v/v) Glycerin, 0,02 (v/v) Nonidet-P40, pH 7,9). Die Präparation wurde zentrifugiert und auf eine MonoQ-Säule (1 ml Bettvolumen) aufgetragen. Anschließend wurde die Säule mit 5 Bettvolumen Puffer mit 50 mM KCI gewaschen und die Säule mit einem Gradienten über 40 Bettvolumen mit einer Endkonzentration von 500 mM KCI eluiert. Die DAN-Aktivität eluierte in einem scharfen Peak bei ca. 190 mM KCI (Fig. 1A).
Die Reinigung führte zu einer nahezu homogenen Präparation eines Proteins mit der erwarteten molekularen Masse (Fig. 1 B und 1 C). Das Protein weist eine poly(A)- spezifische 3'-Exoribonuclease-Aktivität auf (siehe Beispiel 6). Daraus folgt, daß der gefundene cDNA-Klon für eine humane DAN kodiert.
5. Northem-Blot Analyse
RNA wurde aus HeLa-Zellen nach einer Methode von Chomczynski, P. & Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem. 162, 156 isoliert. Poly(A) mRNA wurde mit Hilfe von oli- go(dT)-Zellulose nach einer Methode von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., gereinigt. Die resultierende RNA wurde auf einem 1 %igen Aga- rose-Formaldhyd-Gel aufgetrennt, auf eine Hybond N+ Membran von der Fa. Amer- sham Buchler, Braunschweig durch Kapillar-Blot transferiert und durch Inkubation für 2 h bei 80°C auf der Membran fixiert. Die für die humane DAN kodierende Se- quenz wurde mittels PCR amplifiziert, mit α-32P-dATP durch Random-Priming markiert und als Sonde benutzt. Die Hybridisierung wurde wie beschrieben durchgeführt (Ausubel) und die Membran wurde unter hoher Stringenz gewaschen. Die Northern- Blot-Analyse mit poly(A)+ RNA aus HeLa Zellen zeigte ein einziges 3,1 kB Fragment, das mit der DAN-Probe hybridisierte. Diese Größe stimmt gut mit der Größe des cDNA-Klons überein.
6. DAN-Aktivitätstest
Der Assay für die DAN-Aktivität wurde wie beschrieben durchgeführt (Körner, Chr G. & Wähle, E. (1997), supra). SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde nach Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680 durchgeführt.
Wie das bovine Enzym ist die rekombinante DAN in Abhängigkeit von der Neutralisierung von Phosphatladungen unter zwei verschiedenen Reaktionsbedingungen aktiv. In der Abwesenheit von Salz ist die Aktivität vollständig von der Anwesenheit von Spermidin mit einem Konzentrationsoptimum von 1 mM abhängig. Unter diesen Bedingungen ist die spezifische Aktivität der rekombinanten DAN (79.000 U/mg) nicht signifikant unterschiedlich von der Aktivität gereinigter boviner DAN (110.000 U/mg). In der Anwesenheit von Spermidin wird die Aktivität von DAN durch Salz ge- hemmt. In der Abwesenheit von Spermidin ist die Aktivität des Enzyms mit einem Konzentrationsoptimum von 150 mM Kaliumacetat von Salz abhängig. Bovine DAN verhält sich auch unter diesen Bedingungen ähnlich.. Allerdings ist die spezifische Aktivität des rekombinanten Proteins (960 U/mg) unter diesen Bedingungen geringer, als die des aus Kalbsthymus gereinigten Enzyms (8070 U/mg). Dieser Unter- schied ist durch eine posttranslationale Modifikation oder durch kontaminierende Proteine in der Präparation des bovinen Enzyms erklärbar. Wurde eine mit einem Cap versehene, polyadenylierte RNA mit den DAN- Präparationen in der Anwesenheit von Salz inkubiert, wurde der poly(A)-Schwanz degradiert und vollständig deadenylierte RNA vorübergehend accumuliert (Fig. 3). Wurde der Assay in Anwesenheit von PABI durchgeführt, wurde die Aktivität teilwei- se inhibiert und stufenweiser Abbau des poly(A)-Schwanzes beobachtet. Die vorherrschenden Abbauprodukte differierten in der Länge um ca. 30 Nukleotide, welches offensichtlich durch die PABI-Bindung verursacht wurde. Diese Ergebnisse stimmen mit den Untersuchungen für bovines Protein überein (Körner Chr. & Wähle, E. (1997, supra). Zusammengefaßt zeigen die Ergebnisse, daß das rekombinante Protein eine poly(A)-spezifische 3'-Exoribonuclease ist.
7. Westem-Blot Analysen
Western-Blot Analysen wurden wie folgt durchgeführt: Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrozellulose-Membran mit Hilfe der Semidry- Methode (Kyse-Andersen, 1984) übertragen. Die Blots wurden mit TNT-Puffer (20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 0,05% (v/v) Tween 20, pH 7,5) mit 5% (w/v) entfetteter Trockenmilch inkubiert. Der gleiche Puffer wurde für die Inkubation mit Antiserum und die Waschschritte verwendet. Die Blots wurden mit den Antikörpern für 2-3 h bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend gewaschen. Die gebundenen Antikörper wurden mittels eines Peroxidase-konjugierten Schwein-anti-Kaninchen- Antikörpers (DAKO, Glostrup, Denmark) und Chemiluminiszenz-Färbung (SuperSignal-Kit, Pierce) nachgewiesen.
Die Analysen zeigen, daß Kaninchen-Antikörper, die gegen ein C-terminales Fragment von DAN erzeugt wurden, aus teilgereinigten Fraktionen DAN präzipitieren können. Die Antikörper erkennen im Western-Blot sowohl bovines, als auch humanes DAN (Fig. 4). In diesem Experiment erscheint das rekombinante DAN etwas größer als das Enzym in SDS-Lysaten aus HeLa-Zellen, was durch die Einführung des Tag (1004 Da) in die Sequenz erklärt werden kann. Wenn das erste AUG in der cDNA-Sequenz nicht das benutzte Start-Codon sein sollte, hätte die natürliche DAN aus HeLa-Zellen mindestens 1260 Da größer als das mit einem Tag versehene re- kombinante Protein sein müssen. Auch diese Ergebnisse bestätigen eine Benutzung der ersten AUG-Sequenz im cDNA-Klon als Start-Codon in vivo.

Claims

Patentansprüche
1. Nukleinsäure kodierend für eine humane deadenyiierende Nuclease (DAN) mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ 11 oder eine funktioneile Variante davon, und Teile davon mit mindestens 8 Nukleotiden, wobei SEQ 11 Teil des Anspruchs ist.
2. Nukleinsäure nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine DNA oder RNA, vorzugsweise eine doppelsträngige DNA ist.
3. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine DNA mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ 12 von Position 58 bis 1977 ist, wobei SEQ 12 Teil des Anspruchs ist.
4. Nukleinsäure nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine oder mehrere nicht-kodierende Sequenzen und/oder eine polyA-Sequenz enthält.
5. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure in einem Vektor, vorzugsweise in einem Expressionsvektor oder gentherapeutisch wirksamen Vektor, enthalten ist.
6. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure chemisch synthetisiert oder anhand einer Sonde aus einer Genbank isoliert wird.
7. Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ 11 oder eine funktioneile Variante davon, und Teile davon mit mindestens 6 Aminosäuren.
8. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1-5 in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert wird.
9. Antikörper gegen ein Polypeptid gemäß Anspruch 7.
10. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein Säugetier mit einem Polypeptid gemäß Anspruch 7 immunisiert und gegebenenfalls die entstandenen Antikörper isoliert werden.
11. Arzneimittel enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1-5 oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 7 und gegebenenfalls pharmazeutisch annehmbare Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.
12. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs, Autoimmunkrankheiten, insbesondere Multiple Sklerose oder Rheumatoide Arthritis, Alzheimer-Krankheit, Allergien, insbesondere Neurodermitis, Typ I Allergien oder Typ IV Allergien, Arthrose, Atherosklerose, Osteoporose, akute und chronische Infektionskrankheiten und/oder Diabetis und/oder zur Beeinflussung des Zellmetabolismus, insbesondere bei der Immunsuppression, vor allem bei Transplantationen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1-5 oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 7 oder Antikörper gemäß Anspruch 9 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Zusatz- und/oder Hiifsstoff formuliert wird.
13. Diagnostikum enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1-5 oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 7 oder Antikörper gemäß Anspruch 9 und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.
14. Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Krebs, Autoimmunkrankheiten, insbesondere Multiple Sklerose oder Rheumatoide Arthritis, Alzheimer-Krankheit, Allergien, insbesondere Neurodermitis, Typ I Allergien oder Typ IV Allergien, Arthrose, Atherosklerose, Osteoporose, akute und chronische Infektionskrankheiten und/oder Diabetis und/oder zur Analyse des Zellmetabolismus, ins- besondere des Immunstatus, vor allem bei Transplantationen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1-5 oder ein Poly- peptid gemäß Anspruch 7 oder Antikörper gemäß Anspruch 9 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger versetzt wird.
15. Test zur Identifizierung von funktionellen Interaktoren enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 -5 oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 7 oder Antikörper gemäß Anspruch 9 und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.
16. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1-5 oder eines Poly- peptids gemäß Anspruch 7 zur Identifizierung funktioneller Interaktoren.
17. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 -5 zum Auffinden von Varianten der humanen DAN, dadurch gekennzeichnet, daß eine Genbank mit der genannten Nukleinsäure abgesucht und die gefundene Variante isoliert wird.
18. Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 7 zum poly(A)-spezifischem Abbau von Nukleinsäuren, insbesondere von mRNA.
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