DE69533435T2

DE69533435T2 - Methode zur identifizierung anti-parasitaerer verbindungen

Info

Publication number: DE69533435T2
Application number: DE69533435T
Authority: DE
Inventors: Clotilde K.S. Carlow; Anthony Page
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1993-10-29
Filing date: 1994-10-18
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2014-10-19
Also published as: US5821107A; US6127148A; JPH09504692A; DE69533435D1; US5482850A; EP0728141B1; EP0728141A4; EP0728141A1; WO1995011916A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren von antiparasitischen Verbindungen. Im Spezielleren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die cyclophilinartige Proteine binden und/oder inhibieren können, sowie Verfahren zur Behandlung parasitischer Infektionen, die für Cyclosporin A nicht empfänglich sind.
Cyclophilin ist ein gewöhnliches Protein, das sich per Definition eifrig an das immunsuppressive Agens Cyclosporin A (CsA) bindet. CsA ist ein fungöses zyklisches Undecapeptid, das momentan häufig als Therapeutikum zur Vermeidung einer Transplantatabstoßung eingesetzt wird. Dieser Wirkstoff wird daher vorzugsweise bei Nieren-, Leber-, Herz- und Knochenmarktransplantationen und zur Behandlung verschiedener Autoimmunkrankheiten verwendet [Kahn, Cyclosporin: Biological Activity And Clinical Applications Grune & Stratton, Orlando, FL (1983)].
Kürzlich wurde gezeigt, dass Cyclophilin Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase-(PPiase)- oder Rotamase-Aktivität besitzt [Fischer, et al., Nature, 337: 476–478 (1989)], und es wurde demonstriert, dass CsA diese enzymatische Aktivität aktiv inhibiert [Takahashi, et al., Nature, 337: 473–475 (1989)]. Dieses Enzym katalysiert die cis-trans-Isomerisierung von Prolin-Imid-Peptidbindungen in Oligopeptiden, und es wurde demonstriert, dass es die Rückfaltung verschiedener Proteine, einschließlich Kollagene, beschleunigt [Bachinger, J. Biol. Chem., 262: 17144–17148 (1987)]. Es wurde demonstriert, dass CsA neben der aktiven Inhibierung der PPiase-Aktivität [Takahashi, et al., Nature, 337: 473–475 (1989)] die In-vitro-Faltung von Kollagen-Tripelhelices verlangsamt [Steinmann, et al., J. Biol. Chem., 266: 1299–1303 (1991)]. Nicht alle Cyclophiline binden CsA in gleichem Maße. In einer Studie mit E. coli und humanen Cyclophilinen wurde deutlich gezeigt, dass die Hauptdeterminante in der Bindung von CsA durch Cyclophilin ein Tryptophanrest in der Wirkstoffbindungsdomäne ist [Lui, et al., Biochemistry, 30: 2306–2310 (1991)]. Es wurde außerdem gezeigt, dass sich Cyclophiline, in denen dieser Tryptophanrest durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, nicht an CsA binden [(Kieffer, et al., J. Biol. Chem. 267: 5503–5507 (1992)].
Forscher konnten erst vor kurzem die Wirkungsweise von CsA und des funktionell, aber nicht chemisch verwandten Immunsuppressors FK-506 auf T-Zellen erklären. Man geht heute davon aus, dass die PPiase-Aktivität von Cyclophilin und des FK-506 Rezeptors FKBP nicht in seiner immunsuppressiven Wirkung eingeschlossen ist. Derzeit wird angenommen, dass sich CsA und FK-506 an endogenes zytosolisches Cyclophilin oder FKBP binden, um einen Komplex zu bilden, der sich anschließend an Calcineurin binden kann, so dass eine Dephosphorylierung inhibiert und Transkriptionsfaktoren wie NF-AT der Zugang in den Kern der T-Zelle verhindert wird [Schreiber & Crabtree, Immunol. Today, 13: 136–142 (1992)].
Es wurde außerdem gezeigt, dass CsA antiparasitische Effekte mit breitem Wirkungsspektrum hat [Chappell & Wastling, Parasitol., 105: 525–540 (1992)]. Zu den beeinflussten parasitischen Protozoen gehören Leishmania major [(Behforouz, et al., J. Immunol., 136: 3067–3075 (1986)] und Plasmodium-Spezies [Nickell, et al., Infect. & Immunol., 37: 1093–1100 (1982); Thommen-Scott, Agents & Actions, 11: 770–773 (1981)]. Zu empfänglichen Helminth-Parasiten gehören die Trematoden-Parasiten Schistosoma mansoni [(Nilsson, et al., Parasitol. Immunol., 7: 19–27 (1985); Pons, et al., Exper. Parasitol., 67: 190–198 (1988); Munro & McLaren, Parasitol., 100: 19–29 (1990a) and Munro & McLaren, Parasitol., 100: 29–34 (1990b)] und Paragonimus miyazakii [Hashiguchi & Okamura, J. Helminthol., 62: 251–256 (1988)] und die Zestoden-Spezies Hymenolepis microstoma [Wastling, et al., Parasitol., 104: 531–538 (1992)]. Nematoden-Spezies, auf die CsA einwirkt, sind unter anderem Acanthocheilonema vitae [Bout, et al., Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg., 78: 670–671 (1984)], Litomosoides carinii [Zahner & Schultheiss, J. Helminthol., 61: 282–290 (1987)] und Trichinella spiralis [Bolas-Fernandez, et al., Parasit. Immunol., 10: 111–116 (1988)]. In einem Beispiel wurde gezeigt, dass bei der Verabreichung von CsA an einen Wirt auf sub-immunsuppressivem Niveau vor S. mansoni-Infektionen starke schistosomentötende Wirkungen erzielt werden, die eine schwerwiegende Hernienbildung des Parasitendarms und Blasenbildung der Tegumentoberfläche zur Folge haben [Munro & McLaren, Parasitol., 100: 19–29 (1990a)]. Diese Effekte wurden auch in vitro mit S. mansoni und Fasciola hepatica demonstriert [Chappel, et al., Parasitology, in press (1993)], so dass die Möglichkeit, dass CsA eine indirekte Wirkung über den Wirt ausübt, ausgeschlossen wurde. Interessanterweise wurde Cyclophilin in S. mansoni identifiziert [Koletsky, J. Immunol., 137: 1054–1059 (1986)] und vor kurzem von der eng verwandten Trematode S. japonicum [Argaet & Mitchell, J. Parasitol., 78: 660–664 (1992)] mit einer Sonde kloniert, die dem Cyclophilin-Gen vom Zestoden-Parasiten Echinococcus granulous [Lightowlers, et al., Mol. Biochem. Parasitol., 36: 287–290 (1989)] entsprach.
Zu den Anti-Nematoden-Effekten von CsA gehören die Verringerung des Mikrofilarien-Niveaus in mit L. carinii infizierten Nagetieren [Zahner, et al., J. Helminthol., 61: 282–290 (1987)] und die Abtötung von A. vitae in Nagetieren [Bout, et al., Trans Roy. Soc. Trop. Med. Hyg., 78: 670–671 (1984)]. In der Adenophorea-Nematode T. spiralis resultierte eine Behandlung infizierter Mäuse mit diesem Wirkstoff in einem bedeutenden Rückgang von Muskelphasen-Larven [Bolas-Fernandez, et al., Parasit. Immunol., 10: 111–116 (1988)]. Allen Anti-Nematoden-Effekten dieses Wirkstoffs gemeinsam sind ihre selektiven Effekte gegen frühe Larvenstadien, mit einer allgemeinen Beständigkeit einer verringerten Empfänglichkeit in späteren Erwachsenenstadien.
Man fand jedoch, dass nicht alle Parasiten für die Wirkungen von CsA empfänglich sind. In Brugia pahangi hatte CsA zum Beispiel keine Wirkung, weder auf adultem noch auf mikrofilarialem Niveau [Lawrence et al., Parasit. Immunol. 14: 371 (1992)]. Es wäre daher eine Verbindung erwünscht, die zur Behandlung von Parasiten verwendet werden könnte, die für die antiparasitischen Wirkungen von CsA nicht empfänglich sind.
Es wäre ein Verfahren erwünscht, mit dem Verbindungen ohne weiteres gescreent und selektiert werden könnten, die in der Lage sind, Cyclophiline von Parasiten, die für die antiparasitischen Wirkungen von CsA nicht empfänglich sind, zu binden und/oder die die PPiase-Aktivität solcher Proteine inhibieren. Im Spezielleren wäre ein Verfahren erwünscht, mit dem CsA-Deriavate gescreent und selektiert werden könnten, die solche Cyclophiline binden und die PPiase-Aktivität inhibieren können, während sie gleichzeitig eine verringerte immunsuppressive Wirkung auf den Wirt haben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde entdeckt, dass Parasiten, die für die antiparasitischen Wirkungen von CsA nicht empfänglich sind, Cyclophiline besitzen, in denen das konservierte Tryptophan an der CsA-Bindungsdomäne durch eine andere Aminosäure, insbesondere durch Histidin, ersetzt ist. Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung dieser Cyclophiline, die im Folgenden als „cyclophilinartige Proteine (CLP)" bezeichnet werden, in einem Verfahren zur Ermittlung von Verbindungen, die sich an diese Proteine binden und/oder ihre enzymatische Aktivität inhibieren können. Solche Verbindungen können ferner im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Inhibierung von Parasiten gescreent werden, die für die antiparasitischen Wirkungen von CsA nicht empfänglich sind.
Im Allgemeinen umfasst dieses Verfahren das Inkontaktbringen eines cyclophilinartigen Proteins mit einer zu testenden Verbindung (Testverbindung) und das Messen von Veränderungen der enzymatischen Aktivität. Vorzugsweise ist die Testverbindung ein CsA-Derivat. Am bevorzugtesten ist das CsA-Derivat ein Bindungsstellenderivat. Insbesondere kann dieses Verfahren zum Screenen nach CsA-Derivaten angewendet werden, die sich an filariale cyclophilinartige Proteine binden können, die PPiase-Aktivität inhibieren und/oder eine geringere oder keine immunosuppressive Wirkung auf den Wirt haben.
In einer bevorzugten Ausgestaltung wird ein Fusionsprotein, das das CLP und ein Protein mit Bindeaffinität zu einem Substrat umfasst, z. B. maIE, in einem Affinitätschromatographiesystem verwendet, um Bindeverbindungen zu screenen und zu selektieren. In diesem Verfahren wird das Fusionsprotein mit einem Substrat in Kontakt gebracht, zu dem das Bindeprotein spezifische Affinität hat, so dass das Fusionsprotein reversibel an der Säule angebracht wird. Anschließend wird eine Testverbindung zur Säule gegeben. Die Verbindung kann markiert werden. Die Säule wird dann gewaschen und analysiert, um die Anwesenheit der Verbindungen zu bestimmen. Verbindungen mit Bindeaffinität zu dem Fusionsprotein können dann im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Inhibierung der PPiase-Aktivität getestet werden.
Ein in dem erfindungsgemäßen Verfahren nützliches cyclophilinartiges Protein stammt von einer parasitischen Nematode, dem humanen filarialen Parasiten B. malayi.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung von DNA, die das cyclophilinartige Protein von B. malayi kodiert, oder eines Fragments davon, zur Identifizierung und Isolierung verwandter Gene von anderen Organismen, einschließlich anderer Spezies parasitischer Nematoden. Unter Verwendung der das B. malayi CLP kodierenden DNA als Nucleotidsonde in einem Southern-Blot haben die Autoren der vorliegenden Erfindung die Anwesenheit verwandter Gene in den Parasiten Brugia pahangi, Dirofilaria immitis, Acanthocheilonema vitae, Litomosoides carinii und Onchocerca gibsoni bestimmt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1A–1C zeigen die Nucleotid- (SEQ ID Nr. 1) und abgeleitete Aminosäuresequenz (Aminosäuren 17–607 (SEQ ID Nr. 21) von B. malayi Cyclophilin. Die Aminosäuren 1–4 und 8–15 sind in der Sequenzauflistung jeweils als SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 20 repräsentiert. Die Cyclophilin-Domäne ist unterstrichen.
Die 2A–2C zeigen die Aminosäureangleichung der Cyclophiline von Eukaryoten. Die Sequenzen wurden mit dem Gap-Programm gegen das Brugia malayi Cyclophilin (Bm (SEQ ID Nr. 3)) angeglichen; Sequenzen wurden von einer HNK – humanen natürlichen Killerzelle – genommen (SEQ ID Nr. 4) [Anderson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 542–546 (1993)], 60% identisch (gp:L04288); H40-Human-Cyclophilin-40 (SEQ ID Nr. 5) [Kieffer, et al., J. Biol. Chem., 268: 12303–12310 (1993)], 56% identisch (gp:L11667); B40-Rinder-Cyclophilin-40 (SEQ ID Nr. 6) [Kieffer, et al., supra (1993)], 57% identisch (gp:L11668); AT-Arabidopsis thaliana (SEQ ID Nr. 7) [Bartling, et al., Plant Mol. Biol., 19: 529–530 (1992)], 61% identisch (gp:X63616); HA-Human-Cyclophilin A (SEQ ID Nr. 8) [Haendler, et al., EMBO J., 6: 947–950 (1987)], 59% identisch (gp:XS2851]; MA-Maus-Cyclophilin A (SEQ ID Nr. 9) [Hasel & Sutcliffe, Nucleic Acids Res., 18: 4019 (1990)], 59% identisch (gp:X52851); Le-Lycopersicon esculentum (SEQ ID Nr. 10) [Gasser, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 9519–9523 (1990)], 65% identisch (pir:A39252); Dm-Drosophila melanogaster Cyclophilin A (SEQ ID Nr. 11) [Stamnes, et al., Cell, 65: 219–227 (1991)], 63% identisch (gp:M62398); Sj-Schistosoma japonicum (SEQ ID Nr. 12) [Argaet & Mitchell, J. Parasitol., 78: 660–664 (1992)], 61% identisch (gp:M93420); Eg-Echinococcus granulosus (SEQ ID Nr. 13) [Lightowlers, et al., Mol. Bio. Chem. Parasitol., 36: 287–290 (1989)], 58% identisch [gp:J04664); Sc-Saccharomyces cerevisae Cyclophilin A (SEQ ID Nr. 14) [Haendler, et al., Gene, 83: 39–46 (1989)], 63% identisch (gp:X17505); und Ce-Caenorhabditis elegans (SEQ ID Nr. 15) [McCombie, et al., Nature Genet., 1: 124–131 (1992)], 60% identisch (gb:CELXT00178). Die in der CsA-Bindung wichtigen Reste [Ke, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 9483–9847 (1993)) werden blockiert und die mit Brugia malayi identischen Reste werden hervorgehoben.
Die 3A bis 3C zeigen die Effekte von Cyclosporin A (CsA) auf die Ultrastruktur der Kutikula von Brugia malayi Parasiten im L4- und adulten Stadium.
3A zeigt B. malayi L4 von einem Wirt, der mit Csa behandelt wurde (14.560fache Vergrößerung);
3B zeigt adulte B. malayi von einem Wirt, der mit CsA behandelt wurde (24.000fache Vergrößerung); und
3C zeigt adulte B. malayi von einem Kontrollwirt (30.000fache Vergrößerung).
Die 4A bis 4D zeigen die Effekte von Cyclosporin A (CsA) auf die Ultrastruktur der Kutikula von Caenorhabditis elegans.
4A zeigt C. elegans ohne CsA (17.600fache Vergrößerung);
4B zeigt C. elegans mit 10 μg CsA (9.120fache Vergrößerung);
4C zeigt C. elegans mit 100 μg CsA (11.360fache Vergrößerung); und
4D zeigt C. elegans mit 500 μg CsA (11.360fache Vergrößerung).
5 zeigt die Expression von Bmcyp-1 im Maltosebindungs-Fusionsproteinsystem. Bahn 1 ist Mbp-Bmcyp-1 Zell-Sonikat. Bahn 2 ist Mbp-Bmcyp-1, eluiert von einer Amylosesäule. Bahn 3 ist Mbp-Bmcyp-1 Eluat, zerschnitten mit 1% Faktor Xa. Bahn 4 ist Mbp-Bmcyp-1, gereinigt auf einer Mono-S-Säule.
6 zeigt die Western-Blot-Analyse von adultem Brugia malayi Extrakt mit Antiserum gegen nichtfusioniertes Bmcyp-1. Bahn A ist Anti-Bmcyp-1 (Fx zerschnitten) und Bahn B ist normales Mausserum.
7 zeigt den Southern-Blot von Helminth-DNA, sondiert mit Bmcyp-1. Bahn 1 ist Brugia malayi; Bahn 2 ist Brugia pahangi; Bahn 3 ist Dirofilaria immitis; Bahn 4 ist Acanthocheilonema vitae; Bahn 5 ist Litomosoides carinii; Bahn 6 ist Onchocerca gibsoni; Bahn 7 ist Toxocara canis; Bahn 8 ist Nippostrongylus brasiliensis; Bahn 9 ist Caenorhabditis elegans und Bahn 10 ist Schistosoma mansoni.
8 zeigt einen Southern-Blot von Helminth-DNA unter Verwendung der Cyclophilin-Domäne von Bmcyp-1 cDNA als Sonde. BM – Brugia malayi; BP – Brugia pahangi; AV – A. vitae; LC – L. carinii; TC – Toxocara canis; Nb – Nippostrongylus brasiliensis; CE – Caenorhabditis elegans; und SM – Schistosoma mansoni.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung cyclophilinartiger Proteine (CLP) in einem Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die sich an Proteine binden und/oder deren enzymatische Aktivität inhibieren können. Wie oben erwähnt, ist CLP ein Cyclophilin, bei dem das konservierte Tryptophan an der CsA Wirkstoffbindungsdomäne durch eine andere Aminosäure wie Histidin ersetzt ist. Verbindungen, die CLP binden, können ferner im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Inhibition von Parasiten gescreent werden, die für die antiparasitischen Wirkungen von CsA, wie oben ausführlicher erörtert, nicht empfänglich sind.
Im Allgemeinen umfasst dieses Verfahren das Inkontaktbringen eines CLP, z. B. das B. malayi CLP, mit einer zu testenden Verbindung (Testverbindung) und das Messen der Bindung und/oder der Veränderung der enzymatischen Aktivität. Das CLP kann an einer Festphase zum Beispiel unter Verwendung eines Affinitätschromatographiesystems angebracht werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann jede beliebige Verbindung getestet werden. Vorzugsweise ist die Testverbindung ein CsA-Derivat (siehe z. B. Borel, Transplantation Proc., 21: 810–815 (1989)). Der Begriff CsA-Derivat bezieht sich auf eine Verbindung mit einer oder mehreren Aminosäuresubstitutionen oder Aminodeletionen von der CsA-Struktur. Sowie modifizierte Aminosäuren. Es wurde über eine Reihe von CsA-Derivaten berichtet (siehe z. B. Merck Index, S. 431, 2759 (11. Auflage, 1989); Nelson, et al., Journal of Immunology, 150: 2139–2147 (1993)). Andere CsA-Derivate können mit bekannten Syntheseverfahren präpariert werden (siehe Nelson, et al, supra).
Es wird besonders bevorzugt, dass das CsA-Derivat ein Bindungsstellenderivat ist. [Ke, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 9483–9487 (1991)]. Es können andere Verbindungen getestet werden, wie insbesondere zyklische Undecapeptide.
Es können auch Verbindungen entworfen werden, die die PPiase-Aktivität von CLPs inhibieren. Die Kristallstruktur von Cyclophilin wurde kürzlich sowohl als freie Form [Ke, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 9483–9487 (1991)] als auch als ein Komplex mit CsA [Kallen, et al., Nature, 353: 276–279 (1991); Kallen & Walkinshaw, FEBS Letters, 300: 286–290 (1992); Pflugl, et al., Nature, 361: 91–94 (1993)] aufgelöst. Diese Studien wurden zur Gestaltung von Analogen von CsA mit weniger toxischen Nebenwirkungen beim Menschen durchgeführt. Eine Wirkstoffgestaltung auf Strukturbasis kann in der gleichen Weise mit dreidimensionalen Strukturinformationen über histidinhaltiges Cyclophilin erfolgen. Mit einer Computeranalyse der CLP-Struktur und dem Einsatz von Programmen können potenzielle Inhibitoren vorhergesagt werden, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren getestet werden können.
Verbindungen mit viel versprechender Aktivität können ferner im Hinblick auf eine In-vitro- und In-vivo-Inhibition von parasitischem Nematodenwachstum zum Beispiel mit den Verfahren von Riberu, et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., 43: 3–5 (1990) und Dedham Animal Models in Parasitology, ed. D. Owen, S. 93, MacMillan, London (1982) gescreent werden. Geeignete Screening-Verfahren sind auch im folgenden Beispiel 2 dargelegt.
In einer Ausgestaltung wird ein Fusionsprotein mit einem CLP und Protein mit Bindeaffinität zu einem Substrat, z. B. maIE, in einem Affinitätschromatographiesystem zum Screenen und Selektieren von Bindeverbindungen verwendet. Techniken zur Bildung von Fusionsproteinen sind der fachkundigen Person allgemein bekannt [siehe EPO 0 286 239 and J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 17.29–17.33 (1989)]. Aus praktischen Gründen können handelsübliche Systeme verwendet werden, wie zum Beispiel das Protein Fusion and Purification System von New England Biolabs, Beverly, Massachusetts. Das Fusionsprotein wird dann mit einem Substrat in Kontakt gebracht, zu dem das Bindeprotein spezifische Affinität hat, so dass das Fusionsprotein reversibel an der Säule angebracht wird. Anschließend wird eine Testverbindung zur Säule gegeben. Die Verbindung kann markiert werden. Die Säule wird dann gewaschen und analysiert, um den Standort der Verbindungen zu bestimmen. Verbindungen mit Bindeaffinität zu dem Fusionsprotein können dann im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Inhibierung der PPiase-Aktivität getestet werden.
Zu Bindeproteinen, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, gehören z. B. Zuckerbindeproteine wie Maltose- oder Arabinosebindeprotein, Rezeptorbindeproteine, Aminosäurebindeproteine und Metallbindeproteine. Andere Bindeproteine sind der fachkundigen Person allgemein bekannt (siehe EPO 0 286 239 and N. M. Sassenfeld, TIBTECH 8: 88–93 (1990)).
In einer bevorzugten Ausgestaltung wird ein Fusionsprotein, das das B. malayi CLP (auch Bmcyp-1 genannt) und Maltosebindeprotein (MBP) umfasst, in einem Affinitätschromatographiesystem verwendet, um Bindeverbindungen zu screenen und selektieren. Unter Verwendung der im folgenden 3. Beispiel ausführlich beschriebenen B. malayi CLP/MBP-Fusion können zum Beispiel Affinitätssäulen präpariert werden, die sich selektiv an Verbindungen binden, die für die histidinhaltige Bindungsdomäne von B. malayi spezifisch sind.
Das Fusionsprotein wird auf eine 2,5 × 10 cm Amylosesäule geladen, die zuvor mit 8 Volumen Säulenpuffer (20 mM TrisCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA und 1 mM Azid) äquilibriert wurde. Die Säule kann dann vor der Zugabe der Testverbindung gewaschen werden. Die Testverbindungen werden vorzugsweise in äquimolaren Verhältnissen (in Säulenpuffer) zum Fusionsprotein gegeben und können mit einem radioaktiven Marker wie Tritium markiert werden. Die Säulen werden dann mit Säulenpuffer gewaschen und durch Szintillationszählung und Bradford-Assay [Bradford, Analytical Biochem., 72: 248 (1976)] geprüft, um jeweils Radioaktivität und Proteinfreisetzung in den Durchflussfraktionen zu bestimmen. Wenn sowohl die Radioaktivität als auch das Proteinniveau ein geringes Niveau oder Hintergrundniveau erreicht hat, werden die Säulen in 10 mM Maltose in Säulenpuffer eluiert und es werden 3-ml-Fraktionen des Säuleneluats aufgefangen. Kleine Proben (μl) der eluierten Fraktionen können durch Szintillation und Bradford-Proteinanalyse analysiert werden und zusammen mit Proben aus dem Säulenwaschschritt weiter durch SDS PAGE Analyse analysiert werden. Die resultierenden SDS-PAGE-Gele werden mit Coomassie gefärbt, um das Proteinprofil dieser Proben zu bestimmen, und ebenfalls durch Szintillationsautoradiographie (Amplify, Amersham) analysiert, um den Standort der radioaktiv markierten Verbindungen zu bestimmen. In dem Fall, dass keine markierten Verbindungen verfügbar sind, können ähnliche Analysen durch Bestimmen des Proteinstandortes in den verschiedenen Säulenfraktionen und durch Analysieren dieser Proben durch SDS PAGE durchgeführt werden, um Migrationsverschiebungen der relativen Molekülmasse infolge der Bindung des Analogs am MBP-Fusionsprotein zu bestimmen.
Dieses Verfahren kann angewendet werden, um zu bestimmen, welche Verbindungen, einschließlich Cyclosporin-A-Derivate, die Fähigkeit haben, sich an das cyclophilinartige Protein von B. malayi und die anderen histidinhaltigen Cyclophiline von anderen Quellen, einschließlich parasitischer Nematoden, zu binden. Eine durch dieses Verfahren selektierte Verbindung kann dann im Hinblick auf eine Rotamasehemmwirkung zum Beispiel mit dem nachfolgend dargelegten Verfahren weiter analysiert werden.
Der Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase-Assay (PPiase) ist ein von Fischer, et al., Nature, 337: 476–478 (1989); Takahashi, et al., Nature, 337: 473–475 (1989) beschriebener gut charakterisierter Assay. Der PPiase-Assay kann wie in diesen Quellenangaben beschrieben, mit den von Kofron, et al., Biochemistry, 30: 6127–6134 (1991) aufgelisteten Modifikationen, durchgeführt werden.
250 mM des Substrats N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Nitroanilin (Sigma) werden zum Beispiel in Trifluorethanol mit 470 mM LiCl aufgelöst und dann zu 5 nM je 1 ml Reaktion verwendet. 865 μl des folgenden Puffers werden je Reaktion von 50 mM HEPES & 100 mM NaCl, pH 8, bei 0°C (43 mM HEPES, 86 mM NaCl) verwendet und das Chymotrypsin (Sigma) wird zu 6 mg/ml aus einem 60 mg/ml Vorrat (in 1 mM HCl) verwendet. Das rekombinante Bmcyp-1 wird zu 2–10 nM je Reaktion verwendet. Zehn μl von rekombinantem Bmcyp-1 werden zum obigen Puffer gegeben und auf Eis äquilibrieren gelassen; kurz vor der Aufnahme des Assays werden dann 100 μl Chymotrypsin zugegeben. Schließlich werden 25 μl des oben genannten Substrats zugegeben, die Lösung wird kräftig vermischt und Messergebnisse werden bei 400 nm über einen Zeitraum von 5 Minuten genommen.
Zum Analysieren der Hemmwirkungen der verschiedenen Verbindungen kann der obige Assay durch Zugabe von 10 μl der in DMSO aufgelösten Testverbindung (Endkonzentrationen liegen zwischen 1 und 500 nm) zur PPiase-Lösung in dem Assay-Puffer angepasst werden. Nach einer Vorinkubation über einen angemessenen Zeitraum (10–150 min) bei 10°C wird der Assay durch Zugabe des Chymotrypsins und des Substrats eingeleitet. Ein direkter Vergleich der Enzymkinetik von Bmcyp-1 PPiase bei An- und Abwesenheit der Testverbindung zeigt, welche Verbindungen histidinbindende PPiase-Hemmwirkungen haben.
In einer anderen Ausgestaltung betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Inhibierung von Wachstum und Entwicklung von Parasiten, die für CsA nicht empfänglich sind. Im Allgemeinen umfasst dieses Verfahren das Inkontaktbringen eines Parasiten mit, oder die Verabreichung an einen mit dem genannten Parasiten infizierten Wirt, einer effektiven Menge einer Verbindung, die sich gemäß der oben beschriebenen Methodik an CLP bindet und seine Aktivität inhibiert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine „effektive Menge" einer Verbindung eine Menge, die ausreicht, um die gewünschte Inhibition von Parasitenwachstum zu erreichen. Es ist zu verstehen, dass die tatsächlich bevorzugten Mengen der verwendeten Verbindungen gemäß der spezifischen verwendeten Verbindung, den speziellen formulierten Zusammensetzungen und der Verabreichungsweise variieren.
Die Verbindungen können durch jedes beliebige bekannte Mittel mit einem Parasiten in Kontakt gebracht oder einem Wirt verabreicht werden. Die Verbindung kann zum Beispiel direkt an einen Parasiten in Kultur verabreicht werden. Zum Verabreichen der Verbindung an einen Wirt kann ein beliebiges einer Auswahl von Mitteln verwendet werden, wie zum Beispiel eine parenterale Injektion (intramuskulär (I. M.), intraperitoneal (I. P.), intravenös (I. V.), intrakranial (I. C.) oder subkutan (S. C.)), oral, eine Inhalation über die Atemwege oder andere bekannte Verabreichungswege.
Die Verbindungen können in jedem beliebigen geeigneten Mittel verabreicht werden und können zum Beispiel mit einem inerten Träger wie Saccharose, Laktose oder Stärke vermischt werden. Sie können die Form von Tabletten, Kapseln und Pillen haben. Zur parenteralen Verabreichung werden sie typischerweise in einer sterilen wässrigen oder nichtwässrigen Lösung, Suspension oder Emulsion in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen parenteralen Träger wie physiologische Kochsalzlösung injiziert. Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen können gemäß bekannten Techniken, wie den zur Formulierung von CsA angewendeten, formuliert werden.
Ein im erfindungsgemäßen Verfahren nützliches CLP ist das CLP einer parasitischen Nematode, dem humanen Filarien-Parasiten B. malayi. Dieses Protein umfasst 589 Aminosäuren und hat eine vorhergesagte relative Molekülmasse von etwa 73 kDa. Die das B. malayi CLP kodierende DNA kann von einer in pMal-C2 inserierten 1823 bp cDNA erhalten werden, was in einem Plasmid mit der Bezeichnung BMCPY-1 resultiert. Eine Probe von mit dem Plasmid BMCPY-1 transformiertem E. coli RR1 wurde am 26. Oktober 1993 bei der Amerikanischen Typus-Kultursammlung (ATCC) mit der ATCC-Beitritts-Nr. 76693 hinterlegt. Die Nucleotidsequenz des 1823 bp cDNA-Inserts ist in der Sequenzauflistung als SEQ ID Nr. 1 dargestellt. Eine Sequenzanalyse demonstriert, dass das B. malayi CLP einen Histidinrest anstelle des konservierten Tryptophans hat, der Feststellungen zufolge für die Bindung an den Wirkstoff CsA in anderen Cyclophilinen wesentlich ist.
Die das B. malayi CLP kodierende DNA (auch als Bmcpy-1 bezeichnet) wurde von einer adulten B. malayi cDNA-Bibliothek isoliert, wobei als Sonde ein Insert von einem Klon verwendet wurde, der zuvor von einer adulten B. malayi Genomexpressionsbibliothek mit einem infektiösen, larvalen, oberflächenspezifischen monoklonalen Antikörper isoliert wurde [Awobuluyi, et al., Mol. Biochem. Parasito., 44: 149–152 (1991)] (siehe 1. Beispiel).
Die DNA, die das cyclophilinartige Protein von B. malayi kodiert, oder ein Fragment davon, erhalten von Bmcpy-1, kann zum Identifizieren und Isolieren verwandter Gene von anderen Organismen, einschließlich anderer parasitischer Nematoden, verwendet werden. Die DNA kann zum Beispiel in einem Southern-Blot verwendet werden, um nach verwandten Genen von anderen Organismen zu screenen. Mit der Bmcyp-1 cDNA als Southern-Blot-Sonde haben die Autoren der vorliegenden Erfindung die Anwesenheit verwandter Gene in den Parasiten Brugia pahangi, Dirofilaria immitis, Acanthocheilonema vitae, Litomosoides carinii und Onchocerca gibsoni ermittelt.
Eine Reihe von Techniken, die der fachkundigen Person vertraut sind, können zur Isolierung von DNA-Sequenzen angewendet werden, die verwandten CLP-Genen entsprechen. Eine cDNA- oder Expressionsbibliothek wird zum Beispiel in konventioneller Weise durch Umkehrtranskription von Messenger-RNA (mRNA) eines Organismus erzeugt, bei dem festgestellt wird, dass er verwandte Sequenzen besitzt, zum Beispiel durch Southern-Blot-Analyse. Zur Selektion von Klonen, die DNA-Sequenzen enthalten, die cyclophilinartige Proteine kodieren, werden Hybridisierungssonden erzeugt, die Abschnitten der Bmcyp-1 cDNA entsprechen, und zum Identifizieren von Klonen verwendet, die solche Sequenzen enthalten. Bevorzugte Sonden enthalten ein Fragment von Nucleotid 326 bis Nucleotid 486 der SEQ ID Nr. 1. Die Expressionsbibliothek kann auch mit gegen das B. malayi cyclophilinartige Protein oder ein Fragment davon erzeugten Antikörpern gescreent werden. Außerdem können Genombibliotheken verwendet werden. Solche Techniken werden zum Beispiel in Sambrook, et al., Molecular Cloning, Second edition, CSH Laboratory Press (1989) gelehrt.
Bei Bedarf kann die so erhaltene DNA dann für weitere Manipulationen mit Techniken subkloniert werden, die der fachkundigen Person vertraut sind. Die DNA kann z. B. in einen Vektor wie pBR322 oder pUC19 subkloniert werden.
Nach der Identifizierung kann die das CLP kodierende DNA-Sequenz in einen angemessenen Expressionsvektor, wie ein Plasmid von E. coli, z. B. pET3A, pBluescript oder pUC19, die vom Bacillus subtilis stammenden Plasmide, z. B. pUB110, pTP5 und pC194, von Hefe stammenden Plasmide, z. B. pSH19 und pSH15, Bakteriophagen wie λ-Phage, Bakterien wie Agrobacterium tumefaciens, Tierviren wie Retroviren und Insektenviren wie Baculovirus, geklont werden.
Eine Überexpression des CLP kann zum Beispiel durch Trennen des CLP von seinen endogenen Kontrollelementen und dann funktionelles Verknüpfen des Polymerasegens mit einem sehr streng kontrollierten Promotor, wie T7 Expressionsvektor, erreicht werden (siehe Rosenberg, et al., Gene, 56: 125–135 (1987), hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen). Die Insertion des starken Promotors kann durch Ermitteln geeigneter Restriktionstargets in der Nähe beider Enden des CLP-Gens und kompatibler Restriktionstargets auf dem Vektor in der Nähe des Promotors und Übertragen des CLP-Gens in den Vektor in einer solchen Ausrichtung erreicht werden, dass es unter der Transkriptions- und Translationskontrolle des starken Promotors ist.
CLP kann auch durch die Verwendung einer starken Ribosomenbindungsstelle stromaufwärts des CLP-Gens überexprimiert werden, um die Expression des Gens zu erhöhen (siehe Shine and Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71: 1342–1346 (1974)).
Der rekombinante Vektor wird mit Standardtechniken zur Transformation und Phageninfektion in einen geeigneten Wirt eingeführt. Das von S. N. Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110 (1972) beschriebene Calciumchlorid-Verfahren, dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist, wird zum Beispiel für E. coli angewendet. Die Transformation von Bazillus wird mit den Verfahren von S. Chang, et al., Molecular and General Genetics, 168: 111 (1979) durchgeführt, deren Offenbarung hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Die Transformation von Hefe wird mit dem Verfahren von Parent, et al., Yeast, 1: 83–138 (1985) durchgeführt, dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Bestimmte Pflanzenzellen können mit Agrobacterium tumefaciens mit dem von C. H. Shaw, et al., Gene, 23: 315 (1983) beschriebenen Verfahren transformiert werden, dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Die Transformation von Tierzellen erfolgt zum Beispiel mit dem in Virology, 52: 456 (1973) beschriebenen Verfahren, dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Die Transformation von Insektenzellen mit Baculovirus wird zum Beispiel mit dem in Biotechnology, 6: 47 (1988) beschriebenen Verfahren durchgeführt, dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Die Transformanten werden je nach der verwendeten Wirtszelle mit Standardtechniken kultiviert, die für solche Zellen geeignet sind. Zum Kultivieren von E. coli werden die Zellen beispielsweise in LB-Medium bei 30°C bis 42°C bis zur mid-log oder stationären Phase wachsen gelassen.
Das CLP kann von einer Kultur transformierter Wirtszellen zum Beispiel durch Extraktion aus kultivierten Zellen oder der Kulturlösung isoliert und gereinigt werden.
Zum Extrahieren des CLP von einer kultivierten Zelle werden die Zellen nach der Kultivierung durch in der Technik bekannte Verfahren, z. B. Zentrifugation, aufgefangen. Anschließend werden die aufgefangenen Zellen in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert und durch Ultraschallbehandlung, Lysozym und/oder Gefrieren-Auftauen aufgebrochen. Ein Rohextrakt mit dem CLP wird durch Zentrifugation und/oder Filtration erhalten.
Wenn das CLP in die Kulturlösung ausgeschieden wird, d. h. alleine oder als ein Fusionsprotein mit einem ausgeschiedenen Protein wie das Maltose-Bindeprotein, dann wird der Überstand von den Zellen mit in der Technik bekannten Verfahren getrennt.
Die Trennung und Reinigung von in dem Kulturüberstand oder dem Zellextrakt enthaltenem CLP kann mit dem oben beschriebenen Verfahren oder durch geeignete Kombinationen bekannter Trenn- und Reinigungsverfahren erfolgen. Zu diesen Verfahren gehören zum Beispiel Verfahren unter Ausnutzung der Löslichkeit, wie Salzfällung und Lösungsmittelfällung, Verfahren unter Ausnutzung der relativen Molekülmassendifferenz, wie Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, Verfahren unter Ausnutzung einer elektrischen Ladungsdifferenz, wie Ionenaustauschsäulenchromatographie, Verfahren unter Ausnutzung spezifischer Affinitätschromatographie, Verfahren unter Ausnutzung der Differenz in der Hydrophobie, wie Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, und Verfahren unter Ausnutzung einer Differenz im isoelektrischen Punkt, wie isoelektrische Fokussierungselektrophorese.
Das gereinigte CLP kann zur Erzeugung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern verwendet werden, die in Diagnose-Assays nützlich sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Verfahren zur Identifizierung histidinhaltiger Cyclophiline von anderen krankheitsverursachenden Parasiten mit veterinärmedizinischer und medizinischer Bedeutung. Dieses Verfahren umfasst die Verwendung von Primern von der konservierten Cyclosporin-A-Bindungsdomäne von Cyclophilin, die Aminosäuresequenz der wirkstoffbindenden Domäne kann in einer Auswahl von Parasiten ermittelt werden, die für bedeutende Krankheiten verantwortlich sind. Krankheiten, die durch Organismen verursacht werden, die Histidin anstelle von Tryptophan in der wirkstoffbindenden Domäne aufweisen, könnten möglicherweise mit den Verbindungen und Analogen behandelt werden, die mit den oben erörterten Verfahren ermittelt werden. Mit diesem Verfahren wurden bereits zwei histidinhaltige Cyclophiline von bedeutenden krankheitsverursachenden Parasiten, nämlich D. immitis (Herzwurm) und O. gibsoni (Rinder-Onchocerciasis) identifiziert.
Die vorliegende Erfindung wird weiter anhand der folgenden Beispiele illustriert. Diese Beispiele sollen zum Verständnis der Erfindung beitragen und sind nicht als Beschränkung anzusehen.
Die oben und im Folgenden genannten Quellenangaben sind hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen.
1. BEISPIEL
ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINER DNA, DIE DAS CYCLOPHILINARTIGE PROTEIN VON BRUGIA MALAYI KODIERT
PRÄPARATION EINER ADULTEN BRUGIA MALAYI cDNA-BIBLIOTHEK
Messenger-RNA von adulten männlichen B. malayi wurde mit dem Guanidinium-Isothiocyanat-Verfahren [Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem., 162: 156–159 (1987)] gereinigt. EcoR1 Linker (NEB 1019) wurden zugegeben und cDNA wurde mit dem Stratagene Giga Pack Gold gemäß Herstelleranweisungen in den EcoR1 Ort des Expressionsvektors λgt11 gepackt.
SCREENEN DER B. MALAYI cDNA-BIBLIOTHEK
Ein Insert vom genomischen Klon P2, der zuvor von einer adulten B. malayi Genomexpressionsbibliothek unter Verwendung eines infektösen, larvalen, oberflächenspezifischen monoklonalen Antikörpers isoliert wurde [Awobuluyi, Mol. Biochem. Parasito., 44: 149–152 (1991)], wurde mit einem DNA-Random-Priming-Kit (New England BioLabs) markiert. Die DNA wurde von dem λgt11 Klon durch Thermocycling unter Verwendung der λgt11 Vorwärts- und Rückwärtsprimer (NEB 1288 & 1222) kloniert. Die Matrize wurde dann durch Phenol/Chloroform-, Chloroform- und Ethanolextraktionen gereinigt. Anschließend wurde sie mit EcoR1 zerschnitten und schließlich auf einem 1% LMP-Agarosegel separiert, von dem sie exzidiert wurde, und mit 2U β-Agarose (NEB) über Nacht verdaut. Die gereinigte Matrize (100 ng) wurde 2 Stunden lang bei 37°C mit 50 μCi [α³³P]dATP (NEN DuPont) markiert. Die resultierende Sonde wurde dann von freien Zahlen auf einer Sephadex G-50 Säule (Pharmacia) weggereinigt.
Nitrocellulosefilter wurden mit dem Benton-Davis-Plaque-Lift-Verfahren [Benton & Davis, Science, 196: 180–182 (1977)] präpariert. Duplikatfilter mit insgesamt 50.000 Plaques wurden über Nacht bei 37°C mit der markierten Matrize in Hybridisierungslösung (50% Formamid, 2% SDS, 10% Dehnhardts und 5 × SSC) hybridisiert. Die Filter wurden anschließend in 0,1% SDS, 0,1 × SSC bei 55°C gründlich gewaschen. Etwa 150.000 Plaques wurden mit der „random primed" markierten Sonde gescreent. Auf den duplizierenden Filtern war ein positiver Plaque vorhanden, der durch 4 Plaque-Reinigungsrunden geführt wurde. Dieser positive Plaque wurde isoliert und Bmcyp-1 genannt.
CsCl ISOLIERUNG VON λgt11 PHAGEN-DNA
DNA vom positiven Plaque wurde durch CsCl-Gradientenzentrifugation gereinigt. Kurz, ER1578 Zellen wurden mit dem Bmcyp-1 Phage infiziert, bis es zur Lyse kam, der Überstand wurde dann in Chloroform extrahiert, anschließend mit DNase und RNase verdaut und über Nacht mit 10% PEG präzipitiert. Das Pellet wurde dann in SM-Puffer mit 50 mM MgCl₂ resuspendiert und mit Chloroform extrahiert. Der resultierende Überstand wurde dann mit 1,5 g/ml CsCl kombiniert und über Nacht bei 35K zentrifugiert. Die Bande des gereinigten Phagen wurde dann gegen SM dialysiert und mit Proteinase K, 0,5 M EDTA und SDS 15 Minuten lang bei 65°C extrahiert. Es folgten eine Phenolextraktion und vier Phenol/Chloroform-Extraktionen, und das gereinigte Phagenpräparat wurde schließlich in Ethanol präzipitiert und in 0,1 M E resuspendiert.
SUBKLONIERUNG IN pUC19
Restriktionsverdaus zeigten, dass der Bmcyp-1 Klon einen internen EcoR1 Ort hat, folglich wurden die beiden EcoR1 Fragmente unabhängig in den EcoR1 Ort des Vektors pUC19 ligiert. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass pUC19 mit EcoR1 zerschnitten und anschließend mit Calf Intestinal Phosphate (NEB) 1 Stunde lang bei 50°C behandelt wurde. Ligationen fanden dann mit einem Vektor/Insert-Verhältnis von 1 : 1 über Nacht bei 16°C mit 1U T4 DNA-Ligase (NEB) statt. Die Ligationen wurden dann in kompetente RR1-Zellen (NEB) transformiert und resultierende Kolonien wurden durch Aufnehmen positiver Kolonien und Ausstreichen auf eine Master-Platte und eine 80 μg/ml X-GAL- und 0,1 M IPTG-Platte zur Selektion weißer Kolonien weiter selektiert. Die Anwesenheit entsprechender Inserts wurde durch Thermocycling mit diesen Klonen unter Verwendung der pUC19 Vorwärts- und Rückwärts-Sequenzierungsprimer (1224 und 1233 NEB) überprüft. Miniprep-DNA wurde von den positiven Plasmiden mit dem Qiagen Kit gemäß Herstelleranweisungen präpariert.
SEQUENZIERUNG
Die pUC19 Subklone wurden sowohl in Vorwärts- als auch in Rückwärtsrichtung mit dem NEB Circumvent Sequencing Kit gemäß Herstellerempfehlungen vollständig sequenziert. Zum Erhalten der Sequenz wurden die Vorwärts- und Rückwärts-pUC19-Primer (1244 und 1233 NEB) und Primer verwendet, die unabhängig synthetisiert wurden und der neu erzeugten internen Sequenz entsprachen.
NUCLEOTID- UND ABGELEITETE AMINOSÄURESEQUENZ VON Bmcyp-1
Die Nucleotidsequenz des Bmcyp-1 cDNA-Klons, subkoniert in pUC19, zeigte ein ORF von bp 57 über ihre gesamte Länge von 1823 bp. Es wurde kein Stoppcodon beobachtet (1 (SEQ ID Nr. 1)). Das resultierende Protein von 589 Aminosäuren hat eine vorhergesagte relative Molekülmasse von 73.626 kDa.
Bei einer Analyse mit dem BLAST-Programm waren die ersten 176 Aminosäuren des Amino-Terminus homolog zum Cyclophilin von einer Vielfalt von Spezies (1 (SEQ ID Nr. 2)), wobei die stärkste Homologie zu den kürzlich beschriebenen cyclophilinartigen Proteinen (CLPs) vom Mensch und von der Maus [Anderson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 542–546 (1993)], Cyclophilin-40-Proteinen vom Rind und menschlicher Herkunft [Kieffer, et al., J. Biol. Chem., 268: 12303–12310 (1993)] und Pflanzencyclophilinen, einschließlich Arabidopsis thaliana [Bartling, Plant Mol. Biol., 19: 529–530 (1992)] vorlag. Wie die CLPs, Cyp-40s und Pflanzencyclophiline hat Bmcyp-1 ein Insert von 8 Aminosäuren (Reste 51–58; 2 (SEQ ID Nr. 2)), das in den gewöhnlicheren Cyclophilinen wie humanes Cyclophilin A nicht zu finden ist. Dieses Insert enthält wenigstens 2 Aminosäuren (GK), die alle diese Spezies gemeinsam haben, und im Falle von humanem Cyp-40, bovinem Cyp-40 und Tomaten-Cyclophilin liegt diese Identität über einem 5- Aminosäure-Stück (GKPLH) vor. Die verbleibende 413 Aminosäure-Carboxyl-terminale Region von Bmcyp-1 wurde in ähnlicher Weise analysiert, woraus sich ebenfalls eine bedeutende Homologie zu den Maus- und Human-CPLs ergab [Anderson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 542–546 (1993)], und wie bei den CLPs ist der Carboxyl-Terminus von Bmcyp-1 äußerst hydrophil und enthält viele Serin- und Argininreste. Bmcyp-1 besitzt daher zwei Hauptdomänen, eine N-terminale Cyclophilinregion und eine hydrophile C-terminale Domäne.
Bmcyp-1 besitzt nicht den konservierten alleinigen Tryptophanrest (Position 121) von Cyp-18 (humanes Cyp-A), der Feststellungen zufolge für die Bindung an den Wirkstoff CsA wesentlich ist [Lui, et al., Biochemistry, 30: 2306–2310 (1991)]. Wie die meisten oben genannten eng verwandten Cyclophiline enthält Brugia-Cyclophilin ein Histidin an seiner Stelle (Position 132) (2 (SEQ ID Nr. 3: angegeben). Die Abwesenheit dieses CsA-bindungsabhängigen Rests führte zu der Annahme, dass das Brugia-Protein eine verringerte oder fehlende Affinität zu diesem Wirkstoff haben würde; diese Beobachtung wurde kürzlich für Maus- und Human-CLPs gemacht, die sich beide nicht an eine CsA-Säule binden und eine CsA-Konzentration von 800 nM voraussetzen, um Rotamaseaktivität zu inhibieren, im Vergleich zu 20 nM bei humanem Cyclophilin C (Stephen Anderson, persönliche Mitteilung). Ebenso benötigen die anderen eng verwandten Cyclophiline, Cyp-40 vom Mensch und Rind, 300 nM CsA zur Inhibition der Rotamaseaktivität [Kieffer, et al., J. Biol. Chem., 268: 12303–12310 (1993)].
2. BEISPIEL
WIRKUNG VON CsA AUF EMPFÄNGLICHE (CAENORHABDITIS ELEGANS) UND RESISTENTE (B. MALAYI) UND NEMATODEN-SPEZIES
Cyclophilin-Gene wurden kürzlich auch von der frei lebenden Nematode Caenorhabditis elegans isoliert, und wie die gewöhnlicheren Cyclophiline besitzen sie ebenfalls das konservierte Tryptophan in ihrer CsA-Bindungsdomäne (Mc-Combie, et al., Nature Genet., 1: 124–131 (1992)]. Es wurden daher Experimente entwickelt, um den Zusammenhang zwischen der An- und Abwesenheit des Tryptophanrests und der Empfänglichkeit von Nematoden für CsA zu untersuchen. Diese Experimente wurden mit Brugia malayi (Histidin) und Caenorhabditis elegans (Tryptophan) durchgeführt. CsA (50 mg/kg) wurde Wüstenspringmäusen am Tag 2, 9, 20 und 46 nach der Infektion mit B. malayi L3s verabreicht. L4s und Adulte wurde aufgefangen und es wurde festgestellt, dass sich die Zahlen zwischen Kontroll- und mit CsA behandelten Wüstenspringmäusen nicht unterschieden. C. elegans wurden 13 Tage lang auf Agar-Platten wachsen gelassen, die mit CsA in einer Verdünnung von 1 μg bis 1 mg/ml in Agar angereichert waren. In diesem Experiment hatte die hohe CsA-Konzentration einen eindeutigen nachteiligen Effekt auf die Zahl lebensfähiger Nematoden, wobei solche getötet wurden, die bei 1 mg/ml kultiviert wurden.
CsA führte zu einem deutlichen Rückgang der Nematodenzahl und wirkte sich stark auf die Motilität jener aus, die bei Konzentrationen von 500 μg/ml und 100 μg/ml übrig blieben. Ein großer Anteil der auf den Platten bei diesen Konzentrationen anwesenden Nematoden war eindeutig beschädigt und wirkte faltig und schlaff.
B. malayi- und C. elegans-Nematoden, die mit CsA behandelt wurden, sowie ihre entsprechenden Kontrollen wurden für eine ultrastrukturelle Analyse auf EM-Ebene bearbeitet, um den Aktionsort des Wirkstoffs mit besonderer Beachtung ihrer Tegumentoberfläche zu bestimmen. In 3 und 4 sind einige der Ergebnisse zusammengefasst, die in dieser Studie erhalten wurden. Auf Ultrastrukturebene gab es keine kutikulären Unterschiede zwischen B. malayi Parasiten, die von einem mit Csa behandelten Wirt oder einem mit einer Kontrolle behandelten Wirt entfernt wurden, weder im L4 noch im adulten Stadium (3: A, B & C). Als jedoch C. elegans untersucht wurde, kam es zu einer drastischen Zunahme der CsA-Konzentrationen an der strukturellen Integrität der Kutikula. In Nematoden, die auf Kontrollplatten und Platten mit geringer CsA-Konzentration (1–20 μg/ml) wuchsen, wurde keine Wirkung bemerkt (4: A & B). Nematoden, die bei 100 μg/ml und insbesondere 500 μg/ml wuchsen, wiesen starke Kutikulaläsionen auf (4: C & D). Hohe CsA-Konzentrationen in den Agarplatten führten zu einer Absonderung der Kutikula an der hypodermen Schicht, was möglicherweise ein Hinweis darauf ist, dass eine alte Kutikula abgestoßen und es versäumt wurde, eine neue Kutikula in der schnellen Art und Weise zu synthetisieren, die für Nematodenhäutungen typisch ist.
3. BEISPIEL
REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON REKOMBINANTEM Bmcyp-1
SUBKLONIERUNG IN pMALc UND EXPRESSION VON MBF FUSIONSPROTEINEN
Ein Thermocycling wurde mit speziell gestalteten Primern durchgeführt, um eine gerichtete Klonierung in den pMAL-c2 Vektor (New England BioLabs) zu ermöglichen. Der 5' Primer entsprach dem ORF von Bmcyp-1 und hatte einen eingefügten stromaufwärts gelegenen BamHI Restriktionsort (Vorwärts 5'-GGGGATCCATGTCAAAAA AAGATCGGCG (SEQ ID Nr. 16)). Der andere Primer, der dem 3' Ende dieses Klons entsprach, hatte ein stromabwärts gelegenes Stoppcodon und einen darin eingebauten HindIII Restriktionsort (rückwärts 5'-CGGAAGCTTCAGAATTCCGGCTCTCTT TCTCT (SEQ ID Nr. 17)). Die Bmcyp-1 λgt11 CsCl-Matrize (250 ng) und die Primer (80 ng) wurden in einer Reaktion mit Vent^exo– (New England BioLabs) verwendet. Es wurden zehn Reaktionen mit jeweils 18 Zyklen bei 94°C (30 sec), 54°C (30 sec) und 72°C (2 min) durchgeführt, und die resultierenden Produkte wurden gepoolt, mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Chloroform extrahiert und in Ethanol präzipitiert in Anwesenheit von 1 M NaCl. Das folgende Pellet wurde dann in 0,1 M TE resuspendiert und mit HindIII und BamHI vollständig zerschnitten. Das zerschnittene Produkt wurde dann auf einem 1% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt laufen gelassen, exzidiert und über Nacht mit 2U β-Agarose (New England BioLabs) verdaut. Der resultierende Überstand wurde dann in Ethanol präzipitiert und in 0,1 M TE resuspendiert.
LIGATION IN pMAL-c2
Ligationen und Transformationen wurden im Wesentlichen wie in der Bedienungsanleitung des New England BioLabs Protein Fusion and Purification System beschrieben durchgeführt. Kurz, der pMAL-c2 Vektor wurde mit BamHI und HindIII zerschnitten und es fanden Ligationen mit einem Vektor/Insert-Verhältnis von 1 : 1 statt. Man ließ die Ligationen 2 Stunden lang bei 16°C mit 1U T4 DNA-Ligase (New England BioLabs) fortfahren. Das Ligationsgemisch wurde 5 Minuten lang bei 65°C inkubiert und es wurden 25 μl kompetente Zellen (ER2252) zugegeben, 5 Minuten lang auf Eis vermischt, 2 Minuten lang auf 42°C erwärmt, 20 Minuten lang mit 100 μl LB bei 37°C vermischt und dann auf LBamp-Platten ausplattiert und über Nacht wachsen gelassen.
Positive Transformanten wurden durch Aufnehmen positiver Kolonien und Ausstreichen auf einer Master-Platte und einer Platte mit 80 pg/ml X-GAL und 0,1 M IPTG zur Selektion weißer Kolonien weiter selektiert. Miniprep-DNA wurde von den positiven Klonen mit dem Qiagen Miniprep-System gemäß Herstellerempfehlungen präpariert.
PRODUKTION UND REINIGUNG VON MBP Bmcyp-1
Eine einzelne MBP-Bmcyp-1 Kolonie wurde aufgenommen und über Nacht bei 37°C in 10 ml LB-Amp wachsen gelassen; anschließend folgte eine Übertragung in 1 l vorgewärmte reichhaltige Nährlösung plus Amp. Die Zellen wurden bei 37°C bis zur log-Phase wachsen gelassen und anschließend 2 Stunden lang mit 0,3 mM IPTG induziert. Nach einer Zentrifugation bei 5000 × g wurden die pelletierten Zellen in 50 ml Säulenpuffer (20 mM TrisCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA und 1 mM Azid) resuspendiert und über Nacht bei –20°C eingefroren. Am nächsten Tag wurde die Suspension in kaltem Wasser aufgetaut und 3 Minuten lang mit 15-Sekunden-Impulsen beschallt. Das Sonikat wurde bei 9000 × g zentrifugiert und der Überstand wurde auf eine 2,5 × 10 cm Amylosesäule geladen, die mit 8 Volumen Säulenpuffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde anschließend mit 10 Säulenvolumen Puffer gewaschen und schließlich mit Säulenpuffer plus 10 mM Maltose eluiert. Dieses Verfahren brachte 5 mg Fusionsprotein/l hervor, das aus vier Hauptbanden auf einem SDS-PAGE-Gel bestand, die bei etwa 68, 80, 100 und 115 kDa migrierten, wobei das dominanteste Produkt das 68 kDa Protein war.
FAKTOR-XA-SCHNITT
Es wurde ermittelt, dass der optimale Zeitpunkt und die optimale Konzentration, bei dem/der Faktor Xa das Zerschneiden der Fusion zulässt, über Nacht bei Raumtemperatur und 1% Faktor Xa ist. Dies ermöglichte eine komplette Exzision der MBP-Fusion, die in Produkten resultierte, die bei etwa 28, 24 und 14 kDa migrierten, wobei die Summe davon dem erwarteten „full-length" Produkt entsprechen würde, was folglich ein Hinweis auf die Anwesenheit von Faktor-Xa-empfänglichen Orten in dem rekombinanten Protein war. Das mit Faktor Xa zerschnittene rekombinante Protein wurde dann vom MBP weggereinigt, indem das Gemisch auf eine Mono-S-(S-Sepharose)-Säule in 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7) aufgetragen wurde, was in einer Konzentration des MBP im Durchfluss und der Elution der gespaltenen rekombinanten Proteine als ein einzelner Peak in 200 mM NaCl (5) resultierte.
ERGEBNISSE
Wie oben ausführlich beschrieben wurde, wurde ein Satz spezifischer Primer erzeugt, um eine gerichtete Subklonierung in den pMAL-c2 Vektor zu ermöglichen. Der 5' Primer entsprach dem ORF von Bmcyp-1 und hatte einen stromaufwärts gelegenen eingefügten BamHI Restriktionsort. Der andere Primer, der dem 3' Ende dieses Klons entsprach, hatte ein stromabwärts gelegenes Stoppcodon und einen darin eingebauten HindIII Restriktionsort. Es fand eine Thermocycle-Sequenzierung mit den obigen Primern und der λgtII CsCl gereinigten Bmcyp-1 DNA als Matrize statt. Das resultierende Produkt wurde anschließend gereinigt und in den pMAL-c2 Vektor ligiert, das Fusionsprotein wurde in kompetente ER2252-Zellen exprimiert, und nach der Induktion folgte eine Analyse durch SDS PAGE.
5 zeigt das Fusionsprotein, seine nachfolgende Amylosesäulenreinigung, den Faktor-X-Schnitt und die weitere Reinigung auf einer Mono-S-Säule. Bahn 1 zeigt das komplexe Profil des beschallten Zellüberstands vor der Amylosereinigung. Bahn 2 zeigt das Profil von Proteinen, die mit 10 mM Maltose von einer Amylosesäule eluierten; mit diesem Verfahren wurden die fusionierten Proteine selektiv gereinigt, so dass vier Hauptkomponenten mit einer hohen relativen Molekülmasse von etwa 115 kDa, 100 kDa, 80 kDa und 68 kDa zum Vorschein kamen. Dies ist ein Hinweis darauf, dass ein Abbau des „full-length" Fusionsproteins vorliegt, wobei das 115 kDa Protein die nicht zerschnittene „full-length" Fusion (Pfeil) ist und die 68 kDa das dominanteste Abbauprodukt sind. Die Proteine in Bahn 3 weisen die gleiche Präparation wie Bahn 2 auf, mit der Ausnahme, dass sie über Nacht mit 1% Faktor 10 gespalten wurden; dieses Verfahren deckt die Anwesenheit von gespaltenem MBP (obere Bande bei 43 kDa, Pfeil), einem 25 kDa Hauptprodukt, das der 68 kDa Fusion minus MBP entspricht, auf; es gibt auch einige unbedeutendere Produkte von 37 kDa und 14 kDa. Schließlich zeigt Bahn 4 das Protein des Materials von Bahn 3, das in 200 mM NaCl von einer Mono-S-Säule eluierte, was ein Hinweis auf eine komplette Trennung des gespaltenen Hauptabbauprodukts von 25 kDa vom MBP ist, sowie geringe Mengen des „full-length" 73 kDa Proteins (Pfeil) und die Abbauprodukte von 37 und 14 kDa.
ROTAMASE-ASSAY
Der Rotamase- oder Peptidyl-Protyl-cis-trans-Isomerase-(PPIase)-Assay wurde im Wesentlichen wie von Fischer, et al., Nature, 337: 476–478 (1989) beschrieben durchgeführt, wobei die von Kofron, et al., Biochem., 30: 6127–6134 (1991) beschriebenen Substrat-Lösungsmittelmodifikationen verwendet wurden. Dieser Assay ermittelt die cis-trans-Umwandlungsrate eines Prolins, das Tetrapeptid enthält, das für eine Chymotrypsin-Proteolyse nur in der trans-Konfiguration empfänglich ist und dessen Spaltung in der Freisetzung eines chromogenen Farbstoffes resultiert. Kurz, 1 nM (10 μl) MBP-Bmcyp-1 Enzym wurde in einer 1 ml Küvette zu 850 μl PPiase-Puffer (50 mM HEPES; 86 mM NaCl; pH 8, bei 0°C) gegeben und auf Eis äquilibrieren gelassen. Kurz vor der Aufnahme des Assays wurden 100 μl (6 mg/ml) Chymotrypsin und anschließend 25 μl 1 nM Ala-Ala-Pro-Phe-P-Nitroanalid (gelöst in Trifluorethanol mit 470 mM LiCl) gegeben. Die Küvette wurde schnell umgedreht und in ein Spektrophotometer gesetzt; Messergebnisse wurden in regelmäßigen Abständen über einen Zeitraum von 5 Minuten bei OD₄₀₀ genommen. Im Rahmen dieses Assays fanden alle Reaktionen bei 4°C statt.
ROTAMASE-AKTIVITÄT VON Bmcyp-1
Erste Ergebnisse zeigen, dass MBP-Bmcyp-1 Fusionsprotein wie alle anderen bisher beschriebenen Cyclophiline PPiase-Aktivität hat. Diese Aktivität ist jedoch bei einem Vergleich mit identischen Molkonzentrationen geringer als die von nativem humanen Cyclophilin A. Man rechnet mit dem Vorhandensein einer geringeren PPiase-Aktivität, da die Fusion weit größer ist (115 kDa im Vergleich zu 18 kDa), und die Expression ist in E. coli und nicht in einer nativen Form.
WESTERN-BLOT VON NATIVEN UND REKOMBINANTEN ANTIGENEN MIT ANTI-Bmcyp-1 ANTISEREN
Eine Western-Blot-Analyse mit Antiseren, die gegenüber nicht zerschnittenem und zerschnittenem Fusionsprotein angehoben wurden, ermittelte eine spezifische Bande, die bei etwa 19,5 kDa in adulten Brugia malayi PBS-Extrakten migrierte (6). Dieses Ergebnis bedeutet möglicherweise, dass das Brugia Cyclophilin posttransnational bearbeitet wird, um den hydrophilen Schwanz zu entfernen, so dass nur die Cyclophilin-Domäne intakt bleibt.
4. BEISPIEL
ANALYSE VON Bmycp-1 EXPRESSION IN VERSCHIEDENEN HELMINTH-SPEZIES
Southern-Blotting wurde durchgeführt, um die Anwesenheit ähnlicher Cyclophilin-Gene in anderen Nematoden- und Trematoden-Spezies zu ermitteln. Southern-Blotting unter Verwendung der gesamten Bmcyp-1 cDNA als Sonde deckte auf, dass ähnliche Gene auch in den filarialen Nematoden B. pahangi, D. immitis, Acanthocheilonema viteae, Litomosoides carinii und Onchocerca gibsoni vorlagen, aber nicht in den nichtfilarialen Nematoden Toxocara canis, Nippostrongylus brasilienis, C. elegans und der parasitischen Trematode Schistosoma mansoni (7). Dieses Ergebnis war gleich bleibend, unabhängig davon, ob die Stringenz hoch (37°C Hybridisierung/55°C Wäsche) oder [sic] (25°C Hybridisierung/25°C Wäsche) war. Bei einer niedrigen Stringenz wurden mehr Fragmente für die Filarienspezies D. immitis, A. viteae, und L. carinii bemerkt, deren Summe in etwa der Größe der B. malayi Gene entsprach, was ein Hinweis darauf war, dass möglicherweise HindIII Orte innerhalb dieser Gene vorlagen. Die oben genannten Southern-Verfahren wurden daher nur mit der Cyclophilindomäne von Bmcyp-1 cDNA als Sonde wiederholt, wobei diese Analyse identische Ergebnisse für die obigen Spezies bei hoher Stringenz aufdeckte, da nur die Filarienspezies ein entsprechendes Gen hatten. Als jedoch die gleiche Sonde bei niedriger Stringenz verwendet wurde, wurde entdeckt, dass alle Nematoden- und die einzelne Trematoden-Spezies ein entsprechendes Cyclophilin-Gen hatten (8).
SOUTHERN-BLOT-BEDINGUNGEN
HYBRIDISIERUNG
Hybridisierungslösung: 10% Hybridisierung-tris-EDTA, 25% 20 × SSC, 50% Formamid, 2% SDS und 10% Denhardts Lösung.
HYBRIDISIERUNGSBEDINGUNGEN

Hohe Stringenz – Hybridisierung über Nacht bei 37°C
Niedrige Stringenz – Hybridisierung über Nacht bei Raumtemperatur von 20°

WASCHBEDINGUNGEN

Hohe Stringenz – 0,1% SSC und 0,1% SDS bei 55°
Niedrige Stringenz – 0,1% SSC und 0,1% SDS bei Raumtemperatur von 20°C.

5. BEISPIEL
THERMOCYCLING-AMPLIFIKATION DER KONSERVIERTEN CYCLOPHILINDOMÄNE VERSCHIEDENER NEMATODEN
Mit Primern, die der hochkonservierten Domäne der Bmcyp-1 Sequenz entsprachen, wurde eine PCR an Genom-DNA verschiedener Nematodenspezies durchgeführt. Diese DNA-Fragmente wurden dann weiter gereinigt und sequenziert, um zu ermitteln, ob diese Spezies den Histidinrest anstelle des konservierten Tryptophans in der CsA-Bindungsdomäne enthielten.
POLYMERASEKETTENREAKTION
Die analysierte Genom-DNA stammte von den filarialen Nematoden Brugia malayi, Achanthechielonema vitae, Dirofilaria immitis, Litomosoides carinii, Onchocerca gibsoni und der Strongyliden-Nematode Nippostrongylus brasiliesis.
1 μg Genom-DNA wurde mit 200 ng Primer C2.7-C10 (vorwärts 5'-GGTGGTATGTTTGACGATGAGC (SEQ ID Nr. 18)) und (Cyp-8 rückwärts 5'-CAACCTTACCAAATACCACATG (SEQ ID Nr. 19)) vermischt. Dntps und BSA wurden zugegeben und das Volumen wurde mit sterilem destilliertem Wasser auf 98 μl gebracht. Schließlich wurden 3 μl Vent exo(–) Polymerase (NEB) zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde mit Öl überzogen. Die Reaktionen wurden 25 Mal bei 92°C (1 min), 53°C (1 min) und 72°C (1 min) zyklisch wiederholt.
Die PCR-Produkte wurden dann durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation gereinigt, in tris-EDTA resuspendiert und dann als Matrizen zur Sequenzierung verwendet.
Die Sequenzierung erfolgte mit dem NEB-Circumvent Sequencing Kit gemäß dem Protokoll für kinasemarkierte Primer.
ERGEBNISSE
Diese Analyse deckte auf, dass die Nematoden DNA-Sequenzen hatten, die dem Bmcyp-1 sehr ähnlich waren; dies traf besonders auf filariale Nematoden zu, bei denen vorhandene Veränderungen gewöhnlich stumme Veränderungen der dritten Base waren. Alle Filarienspezies wiesen Histidin anstelle von Tryptophan auf, wie für Bmcyp-1 aufgedeckt wurde.
Es ist zu verstehen, dass die hierin beschriebenen Beispiele und Ausgestaltungen lediglich illustrativen Zwecken dienen und dass verschiedene Modifikationen oder Änderungen daran der fachkundigen Person offensichtlich sind und im Rahmen der vorliegenden Anmeldung und im Umfang der beiliegenden Ansprüche liegen.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verfahren zum Screenen nach Verbindungen, die in der Lage sind, die PPiase-Aktivität eines cyclophilinartigen Proteins (CLP) zu inhibieren, das von einer parasitischen Nematode erhältlich ist, wobei das CLP eher die Aminosäure Histidin als Tryptophan in der Cyclosporin-A-(CsA)-Bindungsdomäne enthält, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Inkontaktbringen des genannten Nematoden-CLP mit einer Testverbindung; und (b) Messen der Wirkung der Testverbindung auf die PPiase-Aktivität des Nematoden-CLP.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das CLP ein Fusionsprotein ist, das ein Bindeprotein umfasst, und das genannte Fusionsprotein mit einem Substrat in Kontakt gebracht wird, an das sich das Bindeprotein bindet.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Bindeprotein ein Zuckerbindeprotein ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Zuckerbindeprotein Maltosebindeprotein ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Substrat vernetzte Amylose ist.
Im Wesentlichen reines cyclophilinartiges Protein, das B. malayi-eigen ist, mit einer relativen Molekülmasse von etwa 73 kDa und mit der in der Sequenzauflistung als SEQ ID Nr. 21 dargelegten Aminosäuresequenz.
Fusionsprotein, umfassend das Protein aus Anspruch 6 und ein Bindeprotein.
Fusionsprotein nach Anspruch 7, wobei das Bindeprotein ein Zuckerbindeprotein ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 8, wobei das Zuckerbindeprotein Maltosebindeprotein ist.
Isolierte DNA, die das Protein aus Anspruch 6 kodiert.
Isolierte DNA, die ein cyclophilinartiges Protein kodiert, das B. malayi-eigen ist, und die in der Sequenzauflistung als SEQ ID Nr. 1 dargelegte Nucleotidsequenz umfasst.
Isolierte DNA, die ein cyclophilinartiges Protein kodiert, das B. malayi-eigen ist, wobei die DNA von ATCC Nr. 75593 erhältlich ist.
Isolierte DNA, die ein Protein mit der PPiase-Aktivität von cyclophilinartigem Protein (CLP) von Nematoden aufweist, wobei das CLP eher die Aminosäure Histidin als Tryptophan in der Cyclosporin-A-(CsA)-Bindungsdomäne enthält, wobei die isolierte DNA mit einer DNA hybridisiert, gekennzeichnet durch eine Nucleotidsequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (i) der durch SEQ ID Nr. 1 repräsentierten Nucleotidsequenz; und (ii) einem durch SEQ ID Nr. 1 repräsentierten Abschnitt der Nucleotidsequenz, wobei der Abschnitt Nucleotid 326 bis Nucleotid 486 der SEQ ID Nr. 1 ist: wobei die Hybridisierung in einem Southern-Blot unter den folgenden Bedingungen stattfindet: (a) Hybridisierungslösung: 10% Hybridisierung-tris-EDTA, 25% 20 × SSC, 50% Formamid, 2% SDS und 10% Denhardts Lösung; (b) hohe Stringenz – Hybridisierung über Nacht bei 37°C; (c) Waschbedingungen – 0,1% SSC und 0,1% SDS bei 55°C.
Verfahren zum Selektieren einer Verbindung, die in der Lage ist, sich an ein cyclophilinartiges Protein (CLP) zu binden, das von einer parasitischen Nematode erhältlich ist, wobei das CLP eher die Aminosäure Histidin als Tryptophan in der Cyclosporin-A-(CsA)-Bindungsdomäne enthält, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Inkontaktbringen des genannten Nematoden-CLP mit einer Testverbindung; und (b) Messen der Bindung einer Testverbindung an das Nematoden-CLP.