JPH0648982B2 - アミラーゼの分離精製方法およびそれに用いる吸着剤およびその分離精製装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アミラーゼの分離精製方法それに用いる吸着
剤及びその分離精製装置に係り、特にグルコアミラーゼ
とβ−アミラーゼを高選択的に吸着するのに好適な架橋
化ポリグルカンあるいは架橋ホモオリゴマ、それらを用
いたアミラーゼの分離精製方法及びその装置に関する。

〔従来の技術〕

現在、ぶどう糖，異性化糖，麦芽糖は殿粉をα−アミラ
ーゼ，グルコアミラーゼあるいはβ−アミラーゼを用い
て加水分解して工業生産されている。

このように、グルコアミラーゼやβ−アミラーゼは殿粉
から有用な低分子性の甘味料を工業生産するのに極めて
有用である。

一般に、酵素は、酵素を生成する微生物、すなわち酵素
生産菌を液体培養して製造される。研究用試薬としての
酵素は、塩析やイオン交換クロマト，電気泳動法等を組
み合せた、複雑な分離精製プロセスによつて、部分精製
もしくは高度精製して用いられている。

これに対し、工業用酵素製剤は、培養濾液をそのまま濃
縮した濃縮液か、乾燥した粉末、あるいは分離精製して
得られる濃縮液もしくはその乾燥粉末として得られる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかし、培養濾液の濃縮液や粗乾燥品には、培養液中に
含まれる不快臭成分及び着色成分が多量に含まれるた
め、目的とする反応生成物を分離精製する際、これらの
成分を最終的に除去することが必要となつてくる。ま
た、培養濾液中に蛋白分解酵素類（プロテアーゼ）をも
含まれることが多い。アミラーゼ以外に蛋白分解酵素類
を含む培養濾液等の粗酵素溶液では、精製途中や目的反
応の進行に際して蛋白分解酵素の作用によりアミラーゼ
が分離され失活することが多い。このため、アミラーゼ
などの酵素反応を利用して有用物質を生産する際には、
これら不利益となる不純物を除去することが必要となつ
てくる。

このため、後続の反応生成物の分離精製工程に著く負担
をかける。

一方、一般的な精製方法として知られる塩析法や液体ク
ロマト法では、部分的な濃縮が限界であり、分離精度を
高める際には、これらの操作条件、例えば沈殿剤の種
類，濃度，ｐＨ，充填剤の種類，吸脱着剤の種類等、を
変え、これらを組み合せた複雑なプロセスを経ることが
必要となる。

その公知例としてはグルコアミラーゼの調製方法、ジヤ
ーナル・フアーメンテーシヨン・テクノロジー５６巻，
No.４ｐ２９６−３０２（１９７８年）、グルコアミラ
ーゼに関する研究、ジヤーナル・フアーメンテーシヨン
・テクノロジー５４巻，No.１２ｐ８３１−８３７（１
９７６年）、グルコアミラーゼの生産に関する研究、ジ
ヤーナル・フアーメンテーシヨン・テクノロジー，５３
巻，No.１０ｐ６９３−６９７（１９７５年）、グルコ
アミラーゼの特性に関する研究、ジヤーナリ・フード・
サイエンス４９巻ｐ１２１０〜１２１１（１９８４）年
に示されている。

それだけでなく、操作には沈殿剤としてあるいは溶出剤
として多量の塩を添加することになり、次工程へ移る際
の脱塩操作も必要となる。さらに、これらの精製過程で
発生する数１０％の高い塩濃度のＢＯＤ廃液は、その廃
液処理も簡単ではない。

以上のことから、これら複雑な工程からなる公知の精製
方法は、専ら、研究用試薬等におのずと限定されてい
る。

なかでも、精製が困難とされているグルコアミラーゼと
β−アミラーゼを、酵素の起源によつて異なる酵素分子
の構造の差異によらず、選択的に効率よく吸着できる吸
着剤が開発されれば、培養濾液から両酵素を一段階で純
度高く濃縮分離できる。

本発明者らは、α−アミラーゼの精製方法として古くか
ら知られているアミロース（グルコースの直鎖状ポリマ
（分子量１０〜４０万，グルコースの重合数５×１０^２
〜２×１０^３）を吸着剤とする吸着法に着目した。これ
らの公知例の１例としてHasegawa等のジヤーナル・バイ
オケミストリー９巻，ｐ３５〜４２（１９７６年）に示
されている。これをグルコアミラーゼ及びβ−アミラー
ゼに適用してみた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかし、吸着容量はα−アミラーゼの場合に比べ、１０
^３分の１以下と極めて低く、殿粉を吸着剤とする公知の
方法はグルコアミラーゼ及びβ−アミラーゼの精製に対
し実用的でないことが判明した。

本発明の目的は、クルコアミラーゼ及びβ−アミラーゼ
以外に多種多様の不純物を含む酵素含有液から、目的と
するアミラーゼを高選択的に効率よく吸着することので
きる吸着剤を提供することにある。

本発明の他の目的は、グリコアミラーゼあるいはβ−ア
ミラーゼの水溶液と接触した時に、これらのアミラーゼ
と複合体を形成し水に不溶なゲルとなり、従つて極めて
容易にグルコアミラーゼあるいはβ−アミラーゼを分離
精製することのできる吸着剤を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、グルコアミラーゼあるいは槽
と、分岐鎖を有するポリグルカンを分子間及び／又は分
子内で架橋化して得られる架橋化ポリグルカン、あるい
はグルコースのα−１，４結合ホモオリゴマを分子間架
橋化物して得られる架橋化ホモオリゴマーと粗酵素水溶
液とを接触させるためのアミラーゼ吸着槽とを連結して
成ることを特徴とするアミラーゼの分離精製装置であ
る。β−アミラーゼを高選択的に効率よく吸着分離する
ことのできる新規架橋化ポリグルカン及び新規架橋化ホ
モオリゴマを提供することにある。

本発明の更に他の目的は、架橋化ポリグルカン及び架橋
化ホモオリゴマの製造法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、グルコアミラーゼ及びβ−ア
ミラーゼ以外に多種多様の不純物を含む酵素含有液か
ら、目的アミラーゼを高選択的に効率よく吸着分離する
架橋化ポリグルカンあるいは架橋化ホモオリゴマを用い
たアミラーゼの分離精製方法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、グルコアミラーゼ，β−アミ
ラーゼの各々もしくは両者を選択的に吸着する新規な吸
着剤と酵素含有液とを接触させ、目的に応じて両酵素の
一方もしくは両方を吸着分離する、アミラーゼの分離精
製方法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、吸着剤に吸着したグルコアミ
ラーゼの及びβ−アミラーゼを容易に脱着する方法を提
供することにある。

本発明の更に他の目的は、グルコアミラーゼ及びβ−ア
ミラーゼを高選択的に効率よく吸着分離することのでき
る、アミラーゼの分離精製装置を提供することにある。

本発明の更に他の目的及び利点は、以下の記述から明ら
かとなろう。

本発明の第１の特徴は、グリコーゲンを分子間架橋化物
或いはグリコーゲンを予めアミラーゼで処理して分岐鎖
を短縮したグリコーゲンを分子間架橋化して得られる三
次元架橋化高分子物質（架橋化ポリグルカン）よりなる
吸着剤である。

本発明の第２の特徴はグルコースのα−１，４結合ホモ
オリゴマを分子間架橋化して得られる三次元架橋化高分
子物質（架橋化ホモオリゴマ）よりなる吸着剤である。

本発明の第３の特徴は、グルコアミラーゼ及びβ−アミ
ラーゼの一方もしくは両方を含有する粗酵素水溶液を、
グリコーゲンを分子間架橋化或いはグリコーゲンを予め
アミラーゼで処理して分岐鎖を短縮したグリコーゲンを
分子間架橋化或いはグルコースのα−１，４結合ホモオ
リゴマを分子間架橋化して得られる三次元架橋化高分子
物質よりなる吸着剤の少なくとも１つと接触させ、グル
コアミラーゼ及びβ−アミラーゼの一方もしくは両方を
吸着させる工程； 酵素を吸着した三次元架橋化高分子物質の水和ゲルと液
とを分離する工程；及び 該水和ゲルを弱アルカリ性水溶液、0.5Ｍ以上の濃度の
塩水溶液及び弱アルカリ性でかつ塩を含有した水溶液の
いずれかの水溶液と接触させて、吸着した酵素を脱着さ
せる工程、を含むことを特徴とするアミラーゼの分離精
製方法である。

本発明の第４の特徴は、グルコアミラーゼ及びβ−アミ
ラーゼの一方もしくは両方を含有する粗酵素水溶液を入
れるための菌体除去培養液貯槽と、グリコーゲンの分子
間架橋化物或いはグリコーゲンを予めアミラーゼで処理
して分岐鎖を短縮したグリコーゲンの分子間架橋化物或
いはグルコースのα−１，４結合ホモオリゴマの分子間
架橋化物よりなる吸着剤の少なくとも１つを前記粗酵素
水溶液と接触させるためのアミラーゼ吸着槽とを具備し
たことを特徴とするアミラーゼの分離精製装置である。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明で用いる好ましい吸着剤を以下に示す。

(a)グルコースがβ−１，４結合により重合した主鎖
に、非還元性グルコース残基を開放末端としかつグルコ
ースα−１，４結合により重合した分岐差を有する分岐
ポリグルカンであつて、分岐点に相当する主鎖中のグル
コース残基が分子中全グルコース残基数の５％以上を占
める分岐度でα−１，６結合により分岐せる分岐ポリグ
ルカンを、分子間及び／又は分子内で架橋化して得られ
る三次元架橋化高分子物質（架橋化ポリグルカン）。

分岐鎖の平均重合度は２〜５０好ましくは２〜２０であ
る。

架橋剤としてエピハロゲンヒドリンを用いた該物質の代
表的な構造単位の例を第１図に示す。

(b)架橋化前の(a)記載の分岐ポリグルカンにアミラーゼ
類、特にグルコアミラーゼ，β−アミラーゼ，α−アミ
ラーゼを作用させることにより分岐鎖のグルコースの平
均重合度を２以上６以下に短鎖化した分岐ポリグルカン
を用いて、これを架橋化して得られる三次元架橋化高分
子物質（架橋化ポリグルカン）。

かかる架橋化ポリグルカンは第１図において、ｅ及びｆ
が０〜４である場合に相当する。

(c)グルコース分子が２〜５０分子、α−１，４結合に
より直線状に重合したホモオリゴマを分子間架橋化して
得られる三次元架橋化高分子物質（架橋化ホモオリゴ
マ）。

架橋剤としてエピハロゲンヒドリンを用いた該物質の代
表的な構造単位の例を第２図及び第３図に示す。

本発明に用いる吸着剤は、実質上α−アミラーゼを吸着
しないため、グルコアミラーゼ及び又はβ−アミラーゼ
と、α−アミラーゼとを実質的に分離できる。

本発明に用いる吸着剤である架橋化ポリグルカンの分岐
鎖もしくは架橋化ホモオリゴマの製造に用いるホモオリ
ゴマの鎖長を調節することにより、グルコアミラーゼと
β−アミラーゼとを相互に分割できる。すなわち、分岐
鎖もしくはホモオリゴマの鎖長を短くすることにより、
即ち、架橋化ポリグルカンの分岐鎖のグルコースの重合
度を２〜６好ましくは２〜３、とすることにより、ある
いは架橋化ホモオリゴマの製造に用いるホモオリゴマの
グルコースの重合度を２〜６好ましくは２〜３とするこ
とにより、β−アミラーゼにくらべグルコアミラーゼを
選択的に吸着させることができる。また、分岐鎖もしく
は鎖長を長くすれば、即ち、分岐鎖の平均重合度は４〜
５０好ましくは４〜２０である架橋化ポリグルカンある
いは重合度好ましくは４〜２０のホモオリゴマから得ら
れる架橋化ホモオリゴマを用いれば、グルコアミラーゼ
とβ−アミラーゼの両者を吸着できる。

吸着剤に吸着したグルコアミラーゼ及びβ−アミラーゼ
は、弱アルカリ性水溶液もしくは0.5Ｍ以上の濃度の塩
水溶液によりもしくは弱アルカリ性でかつ塩を含有した
水溶液より容易に吸着できる。

グルコアミラーゼ及びβ−アミラーゼの吸着及び脱着に
際しての、操作温度は氷点以上で実質的に加水分解反応
がおこらない温度の範囲内で実施するのが好ましい。

その理由は、本発明に用いる吸着剤には、グルコアミラ
ーゼ，β−アミラーゼもしくは粗酵素液中に含まれる他
のグルカナーゼの加水分解作用を受ける構造を有するも
のも含まれることと、粗酵素液中に含まれる恐れのある
プロテアーゼによるグルコアミラーゼ，β−アミラーゼ
の目的酵素の分解及び目的酵素の熱安定性を考慮する必
要があるためである。

アミラーゼ類を含有する粗酵素液を種類の異なる吸着剤
で行う吸脱着操作の連結により、各アミラーゼを個別に
分離することができる。

例えば、α−アミラーゼ，β−アミラーゼ，グルコアミ
ラーゼを含有する粗酵素液を試料液とし、まず重合度２
〜６好ましくは２〜３の分岐鎖を有する架橋化ポリグル
カンあるいは重合度２〜６好ましくは２〜３のホモオリ
ゴマから得られる架橋化ホモオリゴマを吸着剤としてグ
ルコアミラーゼを選択的に吸着させ、非吸着成分を有す
る残液を重合度４〜５０好ましくは４〜２０の分岐鎖を
有する架橋化ホモオリゴマあるいは重合度４〜５０好ま
しくは４〜２０のホモオリゴマから得られる架橋化ホモ
オリゴマと接触させることによりβ−アミラーゼを吸着
させ、最後の残液をα−アミラーゼ含有液として分離す
るかもしくは従来公知の殿粉吸着法により殿粉とを接触
させてさらにα−アミラーゼを吸着分離することもでき
る。各カラムを弱アルカリ水溶液等で吸着している酵素
を脱着させれば、３種の酵素をそれぞれ分離精製でき
る。

あるいはまた、α−アミラーゼ，β−アミラーゼ，グル
コアミラーゼを含有する粗酵素液を試料液とし、重合度
２以上の分岐鎖を有する架橋化ポリグルカンあるいは平
均重合度４〜５０、好ましくは４〜２０のホモオリゴマ
から得られる架橋化ホモオリゴマを吸着剤としてグルコ
アミラーゼ及びβ−アミラーゼを選択的に吸着させ、得
られるグルコアミラーゼ及びβ−アミラーゼを更に、前
記したグルコアミラーゼのみを選択的に吸着する吸着剤
を吸着させて、グルコアミラーゼとβ−アミラーゼを分
離することもできる。

あるいはまた、グルコアミラーゼ及び他のアミラーゼを
含む試料液を、前記したグルコアミラーゼのみを吸着す
る吸着剤で処理して、試料液からグルコアミラーゼのみ
を分離することもできる。

あるいはまた、グルコアミラーゼ及びβ−アミラーゼ、
並びに他のアミラーゼを含む試料液を、前記したグルコ
アミラーゼ及びβ−アミラーゼを吸着する吸着剤で処理
して試料液から、グルコアミラーゼ及びβ−アミラーゼ
を分離することができる。

吸着剤と粗酵素液との接触は回分式混合床，流動層，充
填層を形成するいずれの形態を用いる方法及び装置でも
使用できる。

本発明の対象となる酵素は、グルコアミラーゼ及びβ−
アミラーゼであり、本酵素の分類の範囲内にあれば、そ
の起源生物は特に限定されるものではない。

例えば、アスペルギルス層，リゾープス属等の糸状菌や
サツカロミセス属等の酵母，バシルス属等の細菌を起源
とするβ−アミラーゼであつても適用できる。また、ア
スペルギルス属，リゾープス属等の糸状菌やサツカロミ
セス属等の酵母，バシルス属，クロスツリジウム属等の
細菌を起源とするグルコアミラーゼであつても適用でき
る。

本発明の吸着剤を製造するための原料のポリグルカン
（α−グルカン）としては、高度に分岐したグルカンが
用いられる。分岐の程度は、分岐点に相当するグルコー
ス残基が、分子中のグルコース残基総数の５％以上あれ
ば好ましく用いることができる。更に好ましくは分岐度
は５〜３５％である。１５％以上の分岐点を含むα−グ
ルカンならなお好適である。したがつて、天然のα−グ
ルカンの例としてはグルコーゲンや高度分岐型のアミロ
ペクチンがあげられる。これらグルコーゲンや高度分岐
型アミロペクチンも起源生物には特に限定されない。例
えば、グリコーゲンは動物起源のものであつても微生物
起源のものでも使用できる。

また、これらのα−グルカンとしては、上述した天然原
料から分離したα−グルカンだけでなく、これらの分岐
鎖を酵素処理で短鎖化した加工α−グルカンを用いても
よい。α−グルカンの短鎖化処理には、前述したように
グルコアミラーゼもしくはβ−アミラーゼもしくはα−
アミラーゼが好ましい。これらの酵素の種類は特に限定
されない。処理時の反応条件は基質のα−グルカンの種
類，濃度等により適宜選択されるが、分岐鎖のグルコー
ス重合数２以上，６以上にとどめる様、適宜調節され
る。

α−グルカンの分岐等が５％未満になると、グルコアミ
ラーゼの吸着容量が低下し、実用的でない。

本発明の吸着剤である架橋化ホモオリゴマを製造するた
めの原料のホモオリゴマ（オリゴ糖）としては、グルコ
ース分子がα−１，４結合で直線状に重合した重合数２
〜６のオリゴ糖が好ましく用いられる。これらのオリゴ
糖は単成分であつても混合物であつてもよい。しかし、
β−アミラーゼとグルコアミラーゼのどちらか一方を相
対的に選択吸着したい場合には重合度の異なるオリゴ糖
を適宜、選択する。

これらのオリゴ糖としては、例えばマルトース，マルト
トリオース，マルトテトラオース，マルトヘキサオース
などが挙げられる。

上述したホモオリゴマ（オリゴ糖）あるいはポリグルカ
ン（α−グルカン）の架橋方法は、特に限定されない
が、その架橋の程度は、β−アミラーゼもしくはグルコ
アミラーゼを吸着する際に使用される温度である氷点以
上で６０℃以下において、好ましくは６０℃において１
００ｇの水に対し、本発明になる吸着剤の溶解度が0.01
ｇ以下になる様に、分子間及び／又は分子内架橋を行え
ばよい。

したがつて、架橋処理により調製された本発明なる吸着
剤は水和性のゲル又は固体である。

また、架橋化処理して得られる吸着剤を６０℃の水に１
日間浸漬した後に形成される水和ゲルにおいて、その水
和ゲルの吸着剤に対する重量比がゲルの機械強度及び吸
着部位の密度の点から３〜５０であるのが好ましい。

架橋反応及びその条件は、α−グルカンあるいはオリゴ
糖の種類，濃度，酵素吸着時の使用条件により適宜選択
される。反応として、例えば、エピクロルヒドリンなど
のエピハロゲンによりグルコース残基のＯＨ基間の架橋
等があげられる。エピハロゲンとしてはエピクロルヒド
リンが最も実用的である。エピハロゲンの場合、その添
加量は原料α−グルカンあるいはオリゴ糖の溶液の0.5
〜３倍が好適である。原料液中のα−グルカンあるいは
オリゴ糖の濃度は少なくとも１％以上が好ましい。架橋
化反応はアルカリの存在下に行なわれ、アルカリは苛性
ソーダ，苛性カリ等の強アルカリが好ましく用いられる
が、その濃度は１Ｎ以上のエピハロゲンのハロゲンに対
し、等当量以上のアルカリを含むことが好ましい。温度
は３０℃以上で行われる。時間は温度、アルカリ濃度に
より適宜選択されるが、６０℃の際、３０分間以上を要
する。反応中のエピハロゲン層と水層との接触と、ゲル
生成に伴う液の粘性上昇のため撹拌を有効である。

アミラーゼの吸着剤への吸着及び脱着時の液性条件は、
目的とする酵素，粗酵素液中の不純物組成及び吸着剤の
特性並びに目的により適宜選択されるが、一般に以下の
条件で実施可能である。

吸着時のｐＨは3.0〜7.5の範囲で行われる。脱着剤溶液
のｐＨは7.6以上が好ましいが、酵素の安定性の面から
一般に9.0以下の弱アルカリ性で行う。また脱着に用い
る塩溶液の塩の種類も特に限定されない。中性塩，弱酸
性塩，弱塩基性塩の中から適宜選択して用いられる。最
も使用しやすい塩としては塩化ナトリウム，塩化カリウ
ムがあげられる。

脱着時に用いる塩溶液は弱アルカリ性溶液と併用しても
よい。塩溶液の塩濃度は分離精製しようとする酵素の特
性，塩の種類，液のｐＨ等により異なるが、一般に0.5
Ｍ以上で操作される。３Ｍ以上の塩濃度は、後の脱塩操
作や酵素の失活或いは塩析がおこりやすくなることから
実用的でない。

次に、本発明の方法及び分離精製装置の構成例を第４〜
第６図のフローを用いて説明する。

第４図の装置においては、グルコアミラーゼ，β−アミ
ラーゼの一方もしくは両者を生成する酵素生産菌を培養
槽２で培養し、培養液１を得る。培養の条件は、菌の特
性，酵素生成の目的により適宜選択して行われる。培養
終了後、アミラーゼ類を含む培養液１は移送配管３を経
て貯槽４に貯留される。次いで、遠心分離等の固液分離
装置により、菌体スラリ１０と菌体除去培養液１２とに
分離される。アミラーゼを含む菌体除去培養液１２はさ
らに移送配管８を経て貯槽１３に貯留される。菌体除去
培養液１２はアミラーゼ吸着槽１６に導入され、アミラ
ーゼのうち分離の対象となるアミラーゼを選択的に吸着
する本発明の吸着剤１８を貯槽１９の配管１７を経て吸
着槽１６に添加し、所定の条件下で混合して固液接触さ
せる。接触時の液性、例えば、ｐＨ，温度，塩濃度は前
述した範囲になるように、吸着するアミラーゼの種類に
合せて適宜選択される。接触は、本図の場合、従来公知
の撹拌下、例えば撹拌翼を用いる機械撹拌により行われ
る。槽内温度は実質上、グルコースα−１，４結合及び
α−１，６結合の酵素的加水分解反応がおこらない低温
域で行われる。吸着時間も前述した様に、適宜選択され
る。吸着の終了したアミラーゼ用吸着剤・菌体除去培養
液混合物１５は固液分離装置２１に導入される。ここで
アミラーゼを吸着した吸着剤は液と分離され、次いで洗
滌水２２で付着している液を洗滌除去される。得られた
アミラーゼ吸着・洗滌処理吸着剤２５は脱着槽３０に移
送される。一方、アミラーゼ除去培養液及び洗滌廃液４
６は配管２４を経て貯槽４５に貯留される。アミラーゼ
吸着・洗滌処理吸着剤は脱着剤溶液２６と接触させ、吸
着しているアミラーゼを脱着させる。脱着した吸着剤・
脱着剤溶液混合物２９は再度固液分離装置３２で固液分
離される。分離したアミラーゼ脱着ずみ吸着剤３６はア
ミラーゼ脱着液３５と分離される。アミラーゼ脱着液は
貯槽３８に貯留し、必要に応じ、脱着剤溶液中の塩類及
びアルカリ成分を脱塩するため、脱塩装置４０に導入さ
れる。脱塩処理したアミラーゼを含む溶液は濃縮乾燥装
置４３により、適宜・濃縮液としてあるいは乾槽粉末と
して分離される。

尚、図中、５は培養液貯槽、６は培養液移送配管、７は
固液分離装置、９は菌体スラリ移送配管、１１は菌体ス
ラリ貯槽、１４は菌体除去培養液移送配管、２０はアミ
ラーゼ用吸着剤・菌体除去培養液混合物移送配管、２３
は洗滌水、２７は吸着剤溶液貯槽、２８は脱着剤溶液移
送配管、３１は吸着剤・脱着剤溶液混合物移送配管、３
３はアミラーゼ脱着ずみ吸着剤移送配管、３４はアミラ
ーゼ脱着液移送配管、３７はアミラーゼ脱着ずみ吸着剤
貯槽、３９はアミラーゼ脱着液移送配管、４１は脱塩用
イオン交換本体、４２は脱塩処理アミラーゼ溶液、４４
は濃縮乾燥アミラーゼを示す。

あるいは、第５図のフローに示すように、第４図の吸着
剤と菌体除去培養液との接触を懸濁混合による方法を、
吸着剤１１５を充填した充填カラムで行うこともでき
る。まず、菌体除去培養液１１２が移送配管１１４を経
てアミラーゼ吸着塔１１６に送られ、塔内に充填した吸
着剤１１５でアミラーゼを吸着させる。次いで、洗滌水
１１９を配管１１７を経て吸着塔１１６に通じて洗滌
し、洗滌廃液１２６を貯槽１２７に貯留する。次に、脱
着剤溶液１２２を配管１２３を経て吸着塔１１６に導入
しアミラーゼを脱着させる。アミラーゼを含むアミラー
ゼ脱着液１３０は、第４図の場合と同様、必要に応じ、
脱塩，濃縮，乾燥を行う。

尚、図中、１１８は洗滌水貯槽、１２０はアミラーゼ除
去培養液移送配管、１２１は脱着剤溶液貯槽、１２４は
洗滌廃液移送配管、１２５はアミラーゼ脱着液移送配
管、１２８はアミラーゼ除去培養液、１２９はアミラー
ゼ除去培養液貯槽、１３１はアミラーゼ脱着液貯槽、１
３２はアミラーゼ脱着液移送配管、１３３は脱塩用イオ
ン交換体、１３４は脱塩装置、１３５は脱塩処理アミラ
ーゼ溶液移送配管、１３６は濃縮乾燥装置、１３７は濃
縮乾燥アミラーゼを示す。

第６図は、第４図の懸濁混合の別法として、流動層で吸
着を行うものである。菌体除去培養液１２を流動層型ア
ミラーゼ吸着槽２１７に導入し、空気圧縮機２２１から
供給される加圧空気により流動化させながら吸着剤２１
４と接触させる、接触後のフローは第４図と同様であ
る。

尚、図中、２１５はアミラーゼ用吸着剤貯槽、２１６は
アミラーゼ用吸着剤移送配管、２１８はアミラーゼ用吸
着剤・菌体除去培養液混合物、２１９は菌体除去培養液
移送配管、２２０は空気移送配管、２２２は洗滌水貯
槽、２２３は洗滌水、２２４は洗滌移送配管、２２５は
アミラーゼ用吸着剤・菌体除去培養混合物移送配管、２
２６は固液分離装置、２２７はアミラーゼ除去培養液及
び洗滌廃液用移送配管、２２８はアミラーゼ吸着・洗滌
処理吸着剤移送配管、２２９はアミラーゼ除去培養液及
び洗滌廃液貯槽、２３０はアミラーゼ除去培養液及び洗
滌液、２３１は吸着剤溶液、２３２は脱着剤溶液貯槽、
２３３は吸着剤・脱着剤溶液混合物、２３４は脱着槽、
２３５は吸着剤・脱着剤溶液混合物移送配管、２３６は
アミラーゼ脱着液移送配管、２３７はアミラーゼ脱着
液、２３８はアミラーゼ脱着液貯槽、２３９はアミラー
ゼ脱着液移送配管、２４０は脱塩装置、２４１は脱塩用
イオン交換体、２４２は脱塩処理アミラーゼ移送配管、
２４３は濃縮乾燥装置、２４４は濃縮乾槽アミラーゼで
ある。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を用いて、さらに詳しく紹介す
る。

実施例１ グルコーゲン架橋化物を用いた、β−アミラーゼ及びグ
ルコアミラーゼの分離精製 大腸菌のグリコーゲン（推定分子量４×１０^５，推定分
岐度２５％）の乾燥粉末１０ｇに水９０mlを添加し、撹
拌しながら７０℃に加熱して溶解して粘性の液体とし
た。これに６Ｎの苛性ソーダ３３mlを添加し、これを撹
拌機と還流冷却器を付した５００mlの反応フラスコを入
れた。次いで、１４０mlのエピクロルヒドリンを加え、
２０rpmで撹拌しつつ、５０℃で５時間加熱した。

反応終了後、内容物を室温に冷却し、下部の水層中のゲ
ル化物を濾別した。このゲル状物にエタノール５０mlを
添加し、撹拌後に濾過してゲル状物を回収した。回収ゲ
ルを再度エタノール５０mlに再び懸濁し、濾過してゲル
状物を回収した。本操作をさらに３回繰り返した。次に
蒸溜水５０mlに懸濁し、濾別した。本操作を３回繰り返
した後、再度エタノール５０mlに分散した。これを濾過
し、ゲル状物を乾燥後、粉砕し、白色粉末9.2ｇを得
た。

本粉末の６０℃における水への溶解度は水１００ｇに対
し0.002ｇ以下であつた。さらに本粉末を６０℃水に１
日間浸漬した後の水和ゲルの本粉末に対する重量比は1
1.5であつた。

一方、アスペルギルス・オリゼＩＦＯ−4176の培養濾液
４０ml（α−アミラーゼ0.50単位／ml，β−アミラーゼ
0.98単位／ml，グルコアミラーゼ1.30単位／mlを含む）
を６℃に冷却し、上記の吸着粉末0.2ｇを添加し、５rpm
で２分間混合して接触させた。これを濾過し、濾過中の
α−アミラーゼ活性，β−アミラーゼ活性，グルコアミ
ラーゼ活性を測定した。

上澄液中のα−アミラーゼは0.50単位／ml，β−アミラ
ーゼは0.02単位／ml，グルコアミラーゼは0.01単位／ml
であつた。

上記吸着剤に吸着した酵素量を、吸着剤との接触前の酵
素濃度から接触後の酵素濃度を減じた値として計算し
た。その結果、培養濾液中に存在したα−アミラーゼは
実質上吸着されず、β−アミラーゼの９８％（38.4単
位），グリコアミラーゼの９９％（51.6単位）が吸着さ
れた。

次に、上記酵素を吸着している吸着剤を２０mlの容器に
入れ、苛性ソーダでｐＨ８に調節した液４mlを添加して
５rpmで撹拌して２分間接触させた。これを３０００rp
m、５分間で遠心分離して、吸着剤と上澄液に分離し
た。さらに吸着剤に水２mlを加え懸濁し、再度、３００
０rpm、５分間遠心分離して洗滌液と吸着剤とに固液分
離した。上記で得られた上澄液と洗滌液とを合せ酵素脱
着液６mlを得た。

上記の酵素脱離液の酵素濃度を測定した結果、α−アミ
ラーゼは検出させず、β−アミラーゼは6.40単位／ml、
グルコアミラーゼは8.60単位／mlとなり、それぞれの回
収量は各酵素の脱離液中濃度に液量６mlを乗じることに
より、α−アミラーゼ０単位，α−アミラーゼは38.4単
位，グルコアミラーゼは51.6単位となる。したがつて、
原液中に存在した酵素は本実施例の吸脱着により、α−
アミラーゼは０％，β−アミラーゼは９８％，グルコア
ミラーゼの９９％回収できた。また、本液中にはプロテ
アーゼ活性は検出されず、着色，着臭も認められなかつ
た。かつ本液中の有機物量無機物量は、原液中の含有量
に対しそれぞれ1.1％，1.0％に減少した。

上記により、原液中のβ−アミラーゼとグルコアミラー
ゼを約５倍に濃縮しかつ精製できた。

実施例２ グルコーゲン架橋化物を用いたβ−アミラーゼ及びグル
コアミラーゼの分離精製 実施例１で調製したグルコーゲン架橋化物を0.5ｇを取
り、１０φ×７０mmのカラムに充填した。

このカラムに、実施例１で用いたものと同一ロツトのア
スペルギスオリゼＩＦＯ−４１７６の培養濾液８０ml
を、温度６℃で流速３ml／minで通じた。カラム濾液を
集め、液中の酵素濃度を測定した。

その結果、α−アミラーゼは0.5単位／ml，β−アミラ
ーゼは0.03単位／ml，グルコアミラーゼは0.01単位であ
つた。

上記吸着剤に吸着した酵素量は、吸着剤との接触前の酵
素濃度から接触後の酵素濃度を減じた値として計算し
た。その結果、α−アミラーゼは、０単位，β−アミラ
ーゼ７６単位，グルコアミラーゼは103.2単位だけ吸着
されたことになる。したがつて、培養濾過液中に存在し
たα−アミラーゼは吸着されず、β−アミラーゼの９７
％，グルコアミラーゼの９９％が吸着された。

次に、上記カラムに水４mlを通じ洗浄した。洗浄したカ
ラムに、苛性ソーダでｐＨを8.0に調整した液１５mlを
６℃にて、流速0.5ml／minで通過した。次いで、５mlを
水を通じ洗浄液を回収した。上記の流下液と洗浄液とを
合せ酵素脱離液２０mlを得た。

本液中の酵素濃度を測定した結果、α−アミラーゼは検
出されず、β−アミラーゼは12.5単位／ml，グルコアミ
ラーゼは16.9単位／mlであつた。それぞれの回収量は、
各酵素の脱離液中濃度に液量の２０mlを乗じることによ
り算出される。したがつて、各回収量はα−アミラーゼ
は０単位，β−アミラーゼは７６単位，グルコアミラー
ゼは１０単位となる。すなわち、原液中に存在した酵素
のうち、α−アミラーゼは０％，β−アミラーゼは９７
％，グルコアミラーゼは９６％を回収できた。

また、本液中にはプロテアーゼ活性は検出されず、着
色，着臭も認められなかつた。かつ、本液中の有機物量
及び無機物量は、原液中の含有量に対し、それぞれ1.1
％，1.0％に減少した。

上記により、原液中のβ−アミラーゼとグルコアミラー
ゼを約４倍に濃縮し、かつ精製できた。

実施例３ グリコーゲン架橋化物を用いたβ−アミラーゼ及びグル
コアミラーゼの分離精製 牛肝臓のグリコーゲン（推定分子量４×１０^５，推定分
岐度２７％）の乾燥粉末１０ｇに水９０mlを添加し、撹
拌しながら７０℃に加熱して溶解して粘性の液体を得
た。これに４Ｎの苛性カリ３３mlを添加し、これを撹拌
機と還流冷却器を付した５００mlの反応フラスコに入れ
た。次いで、１４０mlのエピクロルヒドリンを加え、２
０rpmで撹拌しつつ、５０℃で５時間加熱した。

反応終了後、内容槽を室温に冷却し、下部の水層中のゲ
ル化物を濾別した。このゲル状物にエタノール５０mlを
添加し、撹拌後濾過してゲル状物を回収した。回収ゲル
を再度エタノール５０mlに再懸濁し、濾過してゲル状物
を回収した。本操作をさらに３回繰り返した。次に蒸溜
水５０mlに懸濁し、濾別した。本操作を３回繰り返した
後、再度エタノール５０mlに分散した。これを濾過し、
ゲル状物を乾燥後、粉砕し、白色粉末9.3ｇを得た。

本粉末の６０℃における水への溶解度は水１００ｇに対
し0.003ｇ以下であつた。さらに本粉末を６０℃水に１
日間浸漬した後の水和ゲルの本粉末に対する重量比は1
2.3であつた。

次に、本粉末へのグルコアミラーゼの吸着性を見るた
め、以下の実験を行つた。

アスペルギルス・オリゼＩＦＯ−４１７６の培養濾液４
０ml（α−アミラーゼ0.50単位／ml，β−アミラーゼ0.
98単位／ml，グルコアミラーゼ1.30単位／mlを含む）を
６℃に冷却し、上記の吸着剤粉末0.2ｇを添加し、５rpm
で２分間混合して接触させた。フイルタを底部に付した
カラム（１０φ×５０mm）に通して濾過し、濾過中のα
−アミラーゼ活性，グルコアミラーゼ活性を測定した。

上澄液中のα−アミラーゼは0.50単位／ml，β−アミラ
ーゼは0.03単位／ml，グルコアミラーゼは0.02単位／ml
であつた。

上記吸着剤に吸着した酵素量を、吸着剤との接触前の酵
素濃度から接触後の酵素濃度を減じた値として計算し
た。その結果、培養濾液中に存在してα−アミラーゼは
実質上吸着されず、β−アミラーゼの９７％（0.95単位
／ml），グルコアミラーゼの９８％（1.28単位／ml）が
吸着された。

次に、上記の酵素を吸着している吸着剤のカラムに0.5
Ｍの塩化ナトリム水溶液（ｐＨ７．０）を流し、溶出液
を回収した。そのあと、水２mlを流し、カラムを洗滌し
て洗滌液と前記溶出液とを合せて酵素脱着液６mlを得
た。

上記の酵素脱離液の酵素濃度を測定した結果、α−アミ
ラーゼは検出させず、β−アミラーゼは6.2単位／ml，
グルコアミラーゼは8.6単位／mlであつた。それぞれの
回収量は各酵素の脱離液中濃度に回収液量６mlを乗じる
ことにより、α−アミラーゼ０単位，α−アミラーゼは
37.2単位，グルコアミラーゼは51.2単位となる。したが
つて、原液中に存在した酵素は本実施例の吸脱着によ
り、α−アミラーゼは０％，β−アミラーゼは９５％，
グルコアミラーゼの９６％を回収できた。また、本液中
にはプロテアーゼ活性は検出されず、着色，着臭も認め
られなかつた。かつ、本液中の有機物量，無機物量は、
原液中の含有量に対し、それぞれ1.0％，1.1％に減じ
た。

上記により、原液中のβ−アミラーゼとグルコアミラー
ゼを約５倍に濃縮しかつ精製できた。

実施例４ グリコーゲン架橋化物を用いたβ−アミラーゼ及びグル
コアミラーゼの分離精製 かき貝のグリコーゲン（推定分子量４×１０^５，推定分
岐度２５％）の乾燥粉末１０ｇに水９０mlを添加し、撹
拌しながら７０℃に加熱して溶解して粘性の液体とし
た。

これに６Ｎの苛性カリ３３mlを添加し、これを撹拌機と
還流冷却器を付した５００mlの反応フラスコを入れた。
次いで、１４０mlのエピクロルヒドリンを加え、２５rp
mで撹拌しつつ、５０℃で５時間加熱した。

反応終了後、内容物を室温に冷却し、下部の水層中のゲ
ル化物を濾別した。このゲル状物にエタノール５０mlを
添加し、撹拌後濾過してゲル状物を回収した。回収ゲル
を再度エタノール５０mlに再懸濁し、濾過してゲル状物
を回収した。

本操作をさらに３回繰り返した。次に蒸溜水５０mlに懸
濁し、濾別した。本操作をさらに３回繰り返した。次
に、蒸溜水５０mlに懸濁し、濾別した。、本操作を３回
繰り返した後、再度、エタノール５０mlに分散した。

これを濾過し、ゲル状物を乾燥後、粉砕し、白色粉末9.
1ｇを得た。

本粉末の６０℃における水への溶解度は水１００ｇに対
し0.001ｇ以下であつた。さらに、本粉末を６０℃水に
１日間浸漬した後の水和ゲルの本粉末に対する重量比は
10.8であつた。

次に、本粉末へのグルコアミラーゼの吸着性を見るた
め、以下の実験を行つた。

アスペルギルス・オリゼＩＦＯ−４１７６の培養濾液４
０ml（α−アミラーゼ0.50単位／ml，β−アミラーゼ0.
98単位／ml，グルコアミラーゼ1.30単位／mlを含む）を
６℃に冷却し、流動層型吸着槽に入れた、本槽は、外筒
（φ２８mm×１００mm）中にドラフトチユーブ（φ１５
mm×７０mm）を液流動化用空気ふき込み単孔ノズル（内
径１mm）を内蔵させる構造を有する。次いで上記の吸着
剤粉末0.2ｇを添加し、空気を0.5cm／secの空塔速度で
注入し槽内液を２分間流動させて接触させた。内容物を
フイルタの底部に付したカラム（１０φ×５０mm）で濾
過し、濾液中のα−アミラーゼ活性，グルコアミラーゼ
活性を測定した。

上澄液中のα−アミラーゼは0.50単位／ml，β−アミラ
ーゼは0.04単位／ml，グルコアミラーゼは0.03単位／ml
であつた。

上記吸着剤に吸着した酵素量を、吸着剤との接触前の酵
素濃度から接触後の酵素濃度を減じた値として計算し
た。その結果、培養濾液中に存在してα−アミラーゼは
実質上吸着されず、β−アミラーゼの９６％（0.94単位
／ml），グルコアミラーゼの９８％（1.27単位／ml）が
吸着された。

次に、上記の酵素を吸着している吸着剤のカラムに0.5
Ｍの塩化ナトリム水溶液（ｐＨ7.0）を流し、溶出液を
回収した。そのあと、水２mlを流し、カラムを洗滌して
洗滌液と前記溶出液とを合せて酵素脱着液６mlを得た。

上記の酵素脱離液の酵素濃度を測定した結果、α−アミ
ラーゼは検出させず、β−アミラーゼは6.2単位／ml，
グルコアミラーゼは8.4単位／mlであつた。それぞれの
回収量は各酵素の脱離液中濃度に回収液量６mlを乗じる
ことにより、α−アミラーゼ０単位，α−アミラーゼは
37.4単位，グルコアミラーゼは50.1単位となる。したが
つて、原液中に存在した酵素は本実施例の吸脱着によ
り、α−アミラーゼは０％，β−アミラーゼは９５％，
グルコアミラーゼは９６％を回収できた。また、本液中
にはプロテアーゼ活性は検出されず、着色，着臭も認め
られなかつた。かつ、本液中の有機物量，無機物量は、
原液中の含有量に対し、それぞれ1.2％，1.1％に減じ
た。

上記により、原液中のβ−アミラーゼとグルコアミラー
ゼを約５倍に濃縮しかつ精製できた。

実施例５ グルコアミラーゼ処理したグリコーゲン架橋化物を用い
たβ−アミラーゼ及びグルコアミラーゼの分離精製 大腸菌のグリコーゲン（推定分子量４×１０^５，推定分
岐度２５％）の乾燥粉末５ｇに0.05Ｍ酢酸ソーダ緩衝液
（ｐＨ5.0）を９５mlを添加し、撹拌しながら７０℃に
加熱して溶解した。これを５０℃まで冷却し、そのうち
３０mlを取りアスペルギルス属（Aspergillus orizea
ＩＦＯ−４１７６）起源のグルコアミラーゼ１０単位を
溶解したグルコアミラーゼ溶液２mlを添加し、４０℃に
保持した。

２時間後のグルコース生成量を測定した結果、供試グリ
コーゲン分子のグルコース残基数に対し約３０％に達し
た。その時点の分子量は６×１０^４であつた。

本液を透析用セロフアンチユーブに充填し、１０℃の水
５に対し１０時間透析した。内容液を凍結乾燥し、白
色粉末0.9ｇを得た。

これに水１０mlを添加し、撹拌しながら７０℃に加熱し
て溶解して粘性の液体とした。次に、６Ｎの苛性ソーダ
３３mlを添加し、これを撹拌機と還流冷却器を付した２
００mlの反応フラスコを入れた。次いで、１００mlのエ
ピクロルヒドリンを加え、２０rpmで撹拌しつつ、７０
℃で５時間加熱した。

反応終了後、内容物を室温に冷却し、下部の水層中のゲ
ル化物を濾別した。このゲル状物にエタノール５０mlを
添加し、撹拌後濾過してゲル状物を回収した。回収ゲル
を再度エタノール５０mlに再懸濁し、濾過してゲル状物
を回収した。本操作をさらに３回繰り返した。次に蒸留
水５０mlに懸濁し、濾別した。本操作を３回繰り返した
後、再度、エタノール５０mlに分散した。これを濾過
し、ゲル状物を乾燥後、粉砕し、白色粉末0.7ｇを得
た。

本粉末の６０℃における水への溶解度は水１００ｇに対
し0.001ｇ以下であつた。さらに本粉末を６０℃水に１
日間浸漬した後の水和ゲルの本粉末に対する重量比は1
3.2であつた。本粉末の非還元末端基の測定により分岐
鎖の平均量合度は4.2であつた。次に、本粉末へのグル
コアミラーゼの吸着性を見るため、以下の実験を行つ
た。

アスペルギルス・オリゼＩＦＯ−４１７６の培養濾液４
０ml（α−アミラーゼ0.50単位／ml，β−アミラーゼ0.
98単位／ml，グルコアミラーゼ1.30単位／mlを含む）を
６℃に冷却し、上記の吸着剤粉末0.2ｇを添加し、５rpm
で２分間混合して接触させた。内容液をフイルタを底部
に付したカラム（１０φ×５０mm）で濾過し、濾液中の
α−アミラーゼ活性，グルコアミラーゼ活性を測定し
た。

上澄液中のα−アミラーゼは0.50単位／ml，β−アミラ
ーゼは0.50単位／ml，グルコアミラーゼは0.01単位／ml
であつた。

上記吸着剤に吸着した酵素量を、吸着剤との接触前の酵
素濃度から接触後の酵素濃度を減じた値として計算し
た。その結果、培養濾液中に存在したα−アミラーゼは
実質上吸着されず、β−アミラーゼの５１％（0.48単位
／ml），グルコアミラーゼの９９％（1.29単位／ml）が
吸着された。

次に、上記の酵素を吸着している吸着剤のカラムに苛性
ソーダ溶液でｐＨ7.5に調整した0.5Ｍの塩化ナトリム水
溶液（ｐＨ7.0）を流し、溶出液を回収した。そのあ
と、水２mlを流し、カラムを洗滌して洗滌液と前記溶出
液とを合せて酵素脱着液６mlを得た。

上記の酵素脱離液の酵素濃度を測定した結果、α−アミ
ラーゼは検出させず、β−アミラーゼは3.1単位／ml，
グルコアミラーゼは8.5単位／mlであつた。それぞれの
回収量は各酵素の脱離液中濃度に回収液量６mlを乗じる
ことにより、α−アミラーゼ０単位，α−アミラーゼは
２０単位，グルコアミラーゼは51.0単位となる。したが
つて、原液中に存在した酵素は本実施例の吸脱着によ
り、α−アミラーゼは０％，β−アミラーゼは51.0％，
グルコアミラーゼは９８％回収できた。また、本液中に
はプロテアーゼ活性は検出されず、着色，着臭も認めら
れなかつた。かつ本液中の有機物量，無機物量は、原液
中の含有量に対し、それぞれ0.9％，1.1％に減じた。

上記により、原液中のβ−アミラーゼを3.4倍と、グル
コアミラーゼを約５倍に濃縮しかつ精製できた。

実施例６ マルトース架橋化物を用いたグルコアミラーゼの分離精
製 マルトース１０ｇに水９０mlを添加し、５０℃に加熱し
て溶解した。これに３Ｎの苛性ソーダ３３mlを添加し、
これを撹拌機と還流冷却器を付した５００mlの反応フラ
スコに入れた。次いで、１４０mlのエピクロルヒドリン
を加え、２０rpmで撹拌しつつ、７０℃で１５時間加熱
した。

反応終了後、内容物を室温に冷却し、下部の水層中のゲ
ル化物を濾別した。このゲル状物にエタノール５０mlを
添加し、撹拌後濾過してゲル状物を回収した。回収ゲル
を再度エタノール５０mlに再び懸濁し、濾過してゲル状
物を回収した。本操作をさらに３回繰り返した。次に、
蒸留水５０mlに懸濁し、濾別した。本操作をさらに３回
繰り返した後、再度エタノール５０mlに分散した。これ
を濾過し、ゲル状物を乾燥後、粉砕し、白色粉末9.4ｇ
を得た。

本粉末の６０℃における水への溶解度は水１００ｇに対
し0.002ｇ以下であつた。さらに、本粉末を６０℃水に
１日間浸漬した後の水和ゲルの本粉末に対する重量比は
14.0であつた。

一方、アスペルギルス・オリゼＩＦＯ−4176の培養濾液
２０ml（α−アミラーゼ0.50単位，β−アミラーゼ0.98
単位，グルコアミラーゼ1.30単位／mlを含む）を６℃に
冷却し、上記の吸着剤粉末0.2ｇを添加し、５rpmで２分
間撹拌した。これを濾過し濾液２０mlを得た。濾液中の
α−アミラーゼ活性，β−アミラーゼ活性，グルコアミ
ラーゼ活性を測定した。

上澄液中のα−アミラーゼは0.50単位／ml，β−アミラ
ーゼは0.97単位／ml，グルコアミラーゼは0.01単位／ml
であつた。

上記吸着剤に吸着した酵素量を、吸着剤との接触前の酵
素濃度から接触後の酵素濃度を減じた値として計算し
た。その結果、α−アミラーゼは０単位／ml，β−アミ
ラーゼは0.015単位／ml，γ−アミラーゼは1.29単位／m
l培養濾液だけ吸着剤に吸着されたことになる。したが
つて、培養濾液中に存在したα−アミラーゼの０％，β
−アミラーゼの１％，グルコアミラーゼの９９％が吸着
された。

次に、上記の酵素を吸着した吸着剤を２０mlの容器に入
れ、苛性ソーダでｐＨ８に調節した液４mlを添加し、５
rpmで撹拌して２分間接触させた。これを３０００rpm，
５分間遠心分離して、吸着剤と上澄液とに分離した。さ
らに吸着剤に水２mlを加え懸濁し、再度、３０００rp
m，５分間遠心分離して、洗滌液と吸着剤とに固液分離
した。上記で得られた上澄液と洗滌液とを合せ、酵素脱
着液６mlを得た。

上記の酵素脱離液の酵素濃度を測定した結果、α−アミ
ラーゼ０単位／ml，β−アミラーゼは0.65単位／ml，グ
ルコアミラーゼは4.25単位／mlであつた。従つて、α−
アミラーゼ０単位（回収率０％），β−アミラーゼは3.
9単位（２％），グルコアミラーゼは25.5単位（９８
％）回収できた。

また、本液中にはプロテアーゼ活性は検出されず、着
色，着臭も認められなかつた。かつ、本液中の有機物量
及び無機物量は、原液中の含有量に対し、それぞれ1.5
％，1.4％に減じた。上記により、原液中のグルコアミ
ラーゼを選択的に約３倍に濃縮し、かつ精製できた。

実施例７ マルトース架橋化物を用いたグルコアミラーゼの分離精
製 マルトース１０ｇに水８０mlを添加し、５０℃に加熱し
て溶解した。これに４Ｎの苛性カリ３３mlを添加し、こ
れを撹拌機と還流冷却器を付した５００mlの反応フラス
コに入れた。

次いで、１４０mlのエピクロルヒドリンを加え、２０rp
mで撹拌しつつ、８０℃で６時間加熱した。

反応終了後、内容物を室温に冷却し、下部の水層中のゲ
ル化物を濾別した。このゲル状物にエタノール５０mlを
添加し、撹拌後濾過してゲル状物を回収した。

回収ゲルを再度エタノール５０mlに再び懸濁し、濾過し
てゲル状物を回収した。本操作をさらに３回繰り返し
た。次に、蒸留水５０mlに懸濁し、濾別した。

本操作を３回繰り返した後、再度、エタノール５０mlに
分散した。これを濾過し、ゲル状物を乾燥後、粉砕し、
白色粉末18.1ｇを得た。

本粉末の６０℃における水への溶解度は水１００ｇに対
し0.003ｇ以下であつた。さらに、本粉末を６０℃水に
１日間浸漬した後の水和ゲルの本粉末に対する重量比は
15.2であつた。

一方、アスペルギルス・オリゼＩＦＯ−4176の培養濾液
２０ml（α−アミラーゼ0.50単位，β−アミラーゼ0.98
単位，グルコアミラーゼ1.30単位／mlを含む）を６℃に
冷却し、上記の吸着剤粉末0.2ｇを添加し、５rpmで２分
間撹拌した。これを濾過し、濾液中のα−アミラーゼ活
性，β−アミラーゼ活性，グルコアミラーゼ活性を測定
した。

上澄液中の各酵素活性を測定した。上澄液中のα−アミ
ラーゼは0.50単位／ml，β−アミラーゼは0.88単位／m
l，グルコアミラーゼは0.01単位／mlであつた。

上記吸着剤に吸着した酵素量を、吸着剤との接触前の酵
素濃度から接触後の酵素濃度を減じた値として計算し
た。その結果、α−アミラーゼは０単位／ml，β−アミ
ラーゼは0.12単位／ml，グルコアミラーゼは1.29単位／
ml培養濾液、だけ吸着剤に吸着されたことになる。

したがつて、培養濾液中に存在したα−アミラーゼは全
く吸着されず、β−アミラーゼの12.0％，グルコアミラ
ーゼの９９％が吸着された。

次に、上記の酵素を吸着している吸着剤を２０mlの容器
に入れ、苛性ソーダでｐＨ８に調節した液４mlを添加
し、５rpmで撹拌して２分間接触させた。これを３００
０rpm，５分間遠心分離して、吸着剤と上澄液とに分離
した。さらに吸着剤に水２mlを加え懸濁し、再度、３０
００rpm，５分間遠心分離して、洗滌液と吸着剤とに固
液分離した。上記で得られた上澄液と洗滌液とを合せ、
酵素脱着液６mlを得た。

上記の酵素脱離液の酵素濃度を測定した結果、α−アミ
ラーゼ０単位／ml，β−アミラーゼは0.35単位／ml，グ
ルコアミラーゼは4.14単位／mlであつた。従つて、α−
アミラーゼ０単位（回収率０％），β−アミラーゼは2.
1単位（１０．７％），グルコアミラーゼは24.8単位
（９５％）を回収できた。

また、本液中にはプロテアーゼ活性は検出されず、着
色，着臭も認められなかつた。かつ、本液中の有機物量
及び無機物量は、原液中の含有量に対し、それぞれ1.4
％，1.2％に減じた。

上記により、原液中のグルコアミラーゼを選択的に約3.
2倍に濃縮し、かつ精製できた。

実施例８ マルトトリオース架橋化物を用いたβ−アミラーゼ及び
グルコアミラーゼの分離精製 マルトトリオース１０ｇに水８０mlを添加し、５０℃に
加熱して溶解した。これに４Ｎの苛性ソーダ３３mlを添
加し、これを撹拌機と還流冷却器を付した５００mlの反
応フラスコに入れた。

次いで、１４０mlのエピクロルヒドリンを加え、２０rp
mで撹拌しつつ、８０℃で６時間加熱した。

反応終了後、内容物を室温に冷却し、下部の水層中のゲ
ル化物を濾別した。このゲル状物にエタノール５０mlを
添加し、撹拌後濾過してゲル状物を回収した。

回収ゲルを再度エタノール５０mlに再び懸濁し、濾過し
てゲル状物を回収した。本操作をさらに３回繰り返し
た。次に、蒸留水５０mlに懸濁し、濾別した。

本操作を３回繰り返した後、再度エタノール５０mlに分
散した。これを濾過し、ゲル状物を乾燥後、粉砕し、白
色粉末9.7ｇを得た。

本粉末の６０℃における水への溶解度は水１００ｇに対
し0.002ｇ以下であつた。さらに、本粉末を６０℃水に
１日間浸漬した後の水和ゲルの本粉末に対する重量比は
14.8であつた。

一方、アスペルギルス・オリゼＩＦＯ−4176の培養濾液
２０ml（α−アミラーゼ0.50単位，β−アミラーゼ0.98
単位，グルコアミラーゼ1.30単位／mlを含む）を６℃に
冷却し、上記の吸着粉末0.2ｇを添加し、５rpmで２分間
撹拌した。これを濾過し、濾液中のα−アミラーゼ活
性，β−アミラーゼ活性，グルコアミラーゼ活性を測定
した。

上澄液中の各酵素活性を測定した。上澄液中のα−アミ
ラーゼは0.50単位／ml，β−アミラーゼは0.64単位／m
l，グルコアミラーゼは0.03単位／mlであつた。

上記の吸着剤に吸着した酵素量を、吸着剤との接触前の
酵素濃度から接触後の酵素濃度を減じた値として計算し
た。

その結果、α−アミラーゼは０単位／ml，β−アミラー
ゼは0.34単位／ml，グルコアミラーゼは1.27単位／ml−
培養濾液、だけ吸着剤に吸着されたことになる。

したがつて、培養濾液中に存在したα−アミラーゼは全
く吸着されず、β−アミラーゼの３５％，グルコアミラ
ーゼの９８％が吸着された。

次に、上記の酵素を吸着している吸着剤を２０mlの容器
に入れ、苛性ソーダでｐＨ8.2に調節した液４mlを添加
し、５rpmで撹拌して２分間接触させた。これを３００
０rpm，５分間遠心分離して、吸着剤と上澄液とに分離
した。さらに吸着剤に水２mlを加え懸濁し、再度、３０
００rpm，５分間遠心分離して、洗滌液と吸着剤とに固
液分離した。上記で得られた上澄液と洗滌液とを合せ、
酵素脱着液６mlを得た。

上記の酵素脱離液の酵素濃度を測定した結果、α−アミ
ラーゼ０単位／ml，β−アミラーゼは1.05単位／ml，グ
ルコアミラーゼは4.16単位／mlであつた。従つて、α−
アミラーゼ０単位（回収率０％），β−アミラーゼは6.
27単位（３２％），グルコアミラーゼ25.0単位（９６
％）を回収できた。

また、本液中にはプロテアーゼ活性は検出されず、着
色，着臭も認められなかつた。かつ、本液中の有機物量
及び無機物量は、原液中の含有量に対し、それぞれ1.7
％，1.2％に減少した。

上記により、原液中のグルコアミラーゼを選択的に約3.
2倍に濃縮し、かつ精製できた。

実施例９ マルトテトラオース架橋化物を用いたβ−アミラーゼ及
びグルコアミラーゼの分離精製 マルトテトラオース１ｇに水８０mlを添加し、５０℃に
加熱して溶解した。これに４Ｎの苛性ソーダ３３mlを添
加し、これを撹拌機と還流冷却器を付した２００mlの反
応フラスコに入れた。

次いで、１５mlのエピクロルヒドリンを加え、２０rpm
で撹拌しつつ、８０℃で６時間加熱した。

反応終了後、内容物を室温に冷却し、下部の水層中のゲ
ル化物を濾別した。このゲル状物にエタノール５０mlを
添加し、撹拌後濾過してゲル状物を回収した。

回収ゲルを再度エタノール５０mlに懸濁し、濾過してゲ
ル状物を回収した。本操作をさらに３回繰り返した。次
に蒸留水５０mlに懸濁し、濾別した。

本操作を３回繰り返した後、再度、エタノール５０mlに
分散した。これを濾過し、ゲル状物を乾燥後、粉砕し、
白色粉末0.90ｇを得た。

本粉末の６０℃における水への溶解度は水１００ｇに対
し0.001ｇ以下であつた。さらに、本粉末を６０℃水に
１日間浸漬した後の水和ゲルの本粉末に対する重量比は
13.4であつた。

一方、アスペルギルス・オリゼＩＭＦ−4076の培養濾液
２０ml（α−アミラーゼ0.50単位，β−アミラーゼ0.98
単位，グルコアミラーゼ1.30単位／mlを含む）を６℃に
冷却し、上記の吸着粉末0.2ｇを添加し、５rpmで２分間
撹拌した。

これを濾過し、濾液中のα−アミラーゼ活性，β−アミ
ラーゼ活性，グルコアミラーゼ活性を測定した。

上澄液中のα−アミラーゼは0.50単位／ml，β−アミラ
ーゼは0.29単位／ml，グルコアミラーゼは0.03単位／ml
であつた。

上記の吸着剤に吸着した酵素量を、吸着剤との接触前の
酵素濃度から接触後の酵素濃度を減じた値として計算し
た。

その結果、α−アミラーゼは０単位／ml，β−アミラー
ゼは0.69単位／ml，グルコアミラーゼは1.27単位／ml−
培養濾液だけ吸着剤に吸着されたことになる。

したがつて、培養濾液中に存在したα−アミラーゼは全
く吸着されず、β−アミラーゼは７０％，グルコアミラ
ーゼは９８％吸着された。

次に、上記の酵素を吸着した吸着剤を２０mlの容器に入
れ、苛性ソーダでｐＨ8.2に調節した液４mlを添加し、
５rpmで撹拌して２分間接触させた。これを３０００rp
m，５分間遠心分離して、吸着剤と上澄液とに分離し
た。さらに吸着剤に水２mlを加え懸濁し、再度、３００
０rpm，５分間遠心分離して、洗滌液と吸着剤とに固液
分離した。上記で得られた上澄液と洗滌液とを合せ、酵
素脱着液６mlを得た。

上記の酵素脱離液の酵素濃度を測定した結果、α−アミ
ラーゼ０単位／ml，β−アミラーゼは1.31単位／ml，グ
ルコアミラーゼ2.06単位／mlであつた。従つて、α−ア
ミラーゼ０単位（回収率０％），β−アミラーゼ7.84単
位（４０．０％），グルコアミラーゼは12.35単位（９
５％）を回収できた。

また、本液中にはプロテアーゼ活性は検出されず、着
色，着臭も認められなかつた。かつ、本液中の有機物量
及び無機物量は、原液中の含有量に対し、それぞれ1.7
％，1.3％に減少した。

上記により、原液中のグルコアミラーゼを選択的に約9.
5倍に濃縮し、かつ精製した。

実施例１０ マルトヘキサオース架橋化物によるβ−グルコアミラー
ゼ及びグルコアミラーゼの分離精製 マルトヘキサオース１０ｇに水９０mlを添加し、５０℃
に加熱して溶解した。これに４Ｎの苛性ソーダ３３mlを
添加し、これを撹拌機と還流冷却器を付した２００mlの
反応フラスコに入れた。

次いで、１５０mlのエピクロルヒドリンを加え、２０rp
mで撹拌しつつ、８０℃で６時間加熱した。

反応終了後、内容物を室温に冷却し、下部の水層中のゲ
ル化物を濾別した。このゲル状物にエタノール５０mlを
添加し、撹拌後濾過してゲル状物を回収した。

回収ゲルを再度エタノール５０mlに懸濁し、濾過してゲ
ル状物を回収した。本操作をさらに３回繰り返した。次
に蒸留水５０mlに懸濁し、濾別した。

本操作をさらに３回繰り返した後、再度、エタノール５
０mlに分散した。これを濾過し、ゲル状物を乾燥後、粉
砕し、白色粉末9.7ｇを得た。

本粉末の６０℃における水への溶解度は水１００ｇに対
し0.001ｇ以下であつた。さらに、本粉末を６０℃水に
１日間浸漬した後の水和ゲルの本粉末に対する重量比は
13.5であつた。

一方、アスペルギルス・オリゼＩＭＦ−4076の培養濾液
２０ml（α−アミラーゼ0.50単位，β−アミラーゼ0.98
単位，グルコアミラーゼ1.30単位／mlを含む）を６℃に
冷却し、５rpmで２分間撹拌した。

これを濾過し、濾液中のα−アミラーゼ活性，β−アミ
ラーゼ活性，グルコアミラーゼ活性を測定した。

上澄液中のα−アミラーゼは0.50単位／ml，β−アミラ
ーゼは0.20単位／ml，グルコアミラーゼは0.03単位／ml
であつた。

上記の吸着剤に吸着した酵素量を、吸着剤との接触前の
酵素濃度から接触後の酵素濃度を減じた値として計算し
た。その結果、α−アミラーゼは０単位／ml，β−アミ
ラーゼは0.88単位／ml，グルコアミラーゼは1.27単位／
ml−培養濾液だけ吸着剤に吸着されたことになる。

したがつて、培養濾液中に存在したα−アミラーゼは全
く吸着されず、β−アミラーゼは９０％，グルコアミラ
ーゼは９８％吸着された。

次に、上記の酵素を吸着した吸着剤を２０mlの容器に入
れ、苛性ソーダでｐＨ8.2に調節した液４mlを添加し、
５rpmで撹拌して２分間接触させた。これを３０００rp
m，５分間遠心分離して、吸着剤と上澄液とに分離し
た。さらに吸着剤に水２mlを加え懸濁し、再度、３００
０rpm，５分間遠心分離して、洗滌液と吸着剤とに固液
分離した。上記で得られた上澄液と洗滌液とを合せ、酵
素脱着液６mlを得た。

上記の酵素脱離液の酵素濃度を測定した結果、α−アミ
ラーゼ０単位／ml，β−アミラーゼは25.5単位／ml，グ
ルコアミラーゼ41.7単位／mlであつた。従つて、α−ア
ミラーゼ０単位（回収率０％），β−アミラーゼ15.3単
位（78.0％），グルコアミラーゼは25.0単位（96.0％）
を回収できた。

また、本液中にはプロテアーゼ活性は検出されず、着
色，着臭も認められなかつた。かつ、本液中の有機物量
及び無機物量は、原液中の含有量に対し、それぞれ1.8
％，1.9％に減少した。

上記により、原液中のグルコアミラーゼを選択的に約1
9.2倍に濃縮し、かつ精製した。

次に、本発明吸着剤の代りにα−アミラーゼ吸着剤とし
て公知のアミロース（馬鈴薯起源）を用いてα−アミラ
ーゼ及びグルコアミラーゼの吸着実験を比較例として実
施した。

比較例１ アミロースを用いたグルコアミラーゼ及びβ−アミラー
ゼの分離精製 実施例と同一ロツトのアスペルギルス，オリゼＩＦＯ−
４１７６の培養液４０ｍｌ（α−アミラーゼ０．５０単
位／ml，β−アミラーゼ0.98単位／ml，グルコアミラー
ゼ1.30単位／mlを含む）を６℃に冷却し、アミロース粉
末0.2ｇを添加し、５rpmで２分間混合して接触させた。
これを濾過し、濾液中のα−アミラーゼ活性及びグルコ
アミラーゼを測定した。

上澄液中のα−アミラーゼは0.02単位／ml，β−アミラ
ーゼは0.96単位／ml，グルコアミラーゼは1.29単位／ml
であつた。上記アミロース粉末に吸着した酵素量を、ア
ミロースとの接触前の酵素濃度から接触後の酵素濃度を
減じた値として計算した。その結果、培養濾液中に存在
したα−アミラーゼはその９６％（0.48単位／ml），β
−アミラーゼはその２％（0.02単位／ml）、が吸着さ
れ、グルコアミラーゼは１％（0.01単位／ml）と事質上
α−アミラーゼ以外は吸着されなかつた。

比較例２ 塩析及びクロマトを用いたβ−アミラーゼ及びグルコア
ミラーゼの分離精製 アスペルギス，オリゼＩＦＯ−４１７６の培養液４０ml
（α−アミラーゼ２０単位，0.5単位／ml，β−アミラ
ーゼ３９単位，0.98単位／ml，グルコアミラーゼ５２単
位，1.3単位／mlを含む）に、６℃下で硫酸アンモニウ
ムを撹拌下で少量ずつ添加し、終濃度を１２％（Ｗ／
Ｗ）とし、３０分間撹拌した。本液を3000rpm，５分間
遠心分離して、アミラーゼ活性のない不純物の沈殿を沈
降除去し、上清液を酵素フラクシヨンとして回収した。
この上清液にさらに３５％（Ｗ／Ｗ）になる様に硫酸ア
ンモニウムを添加し、上記３種の酵素を沈殿させた。沈
殿を遠心分離して回収した。沈殿中の活性はα−アミラ
ーゼが7.5単位，β−アミラーゼは、7.2単位，グルコア
ミラーゼは１７単位であつた。遠心した上清液にさらに
硫酸アンモニウムを添加し硫酸アンモニウムの溶解度に
近い４０％液としたが、生成する沈殿中にはアミラーゼ
活性は認められず、溶解したままであり塩析による沈殿
としては回収不能であつた。

次に、上記沈殿を水５mlに溶解した。これをジエチルア
ミノエチルセルロースカラム（φ１０×７０mm）に吸着
させ、0.05Ｍトリスアミノメタン塩酸塩緩衝液ｐＨ6.0
中の食塩濃度を０〜１Ｍまで直線勾配で上昇しつつ、本
緩衝液で酵素を溶出した。三酵素のいずれかを含む溶出
液フラクシヨン１５０mlを分取し、液中の酵素活性を測
定した。α−アミラーゼは4.8単位，β−アミラーゼは
9.8単位，グルコアミラーゼは11.3単位であつた。した
がつて、原液中に存在した酵素は、本比較例の精製操作
により、α−アミラーゼは２４％，β−アミラーゼは２
５％，グルコアミラーゼは１９％の活性量を回収するこ
とができた。着色，着臭は認められなかつた。液中の高
分子有機物量はそれぞれ原液中の含有量に対し、3.5％
に減少した。塩濃度は7.2倍に増加した。原液中の各酵
素に対し、精製酵素液の各酵素濃度はα−アミラーゼは
1/16倍，β−アミラーゼは1/15倍，1/20倍になつた。

実施例１１ 大腸菌のグリコーゲン（推定分子量４×１０^５，推定分
岐度２５％）の乾燥粉末５ｇに0.05Ｍ酢酸ソーダ緩衝液
（ｐＨ5.0）を９５ml添加し、撹拌しながら７０℃に加
熱して溶解した。これを５０℃まで冷却し、そのうち３
０mlを取り、アスペルギルス属（Aspergillus orizea I
FO-4176）起源のα−アミラーゼ５０単位とグルコアミ
ラーゼ２００単位を溶解したα−アミラーゼとグルコア
ミラーゼの混合溶液２mlを添加して５０℃に保持した。

２時間後のグルコース生成量を測定した結果、供試グリ
コーゲン分子のグルコース残基数に対し約７０％に達し
た。その時の分子量は１×１０^２であつた。

本液を透析用セロフアンチユーブに充填し、８℃の水５
に対し１７時間透析した。透析処理したチユーブの内
容液を凍結乾燥し、白色粉末0.85ｇを得た。

これに水１０mlを添加し、撹拌しながら７０℃に加熱し
て溶解し、粘性のある液体とした。次に、６Ｎの苛性ソ
ーダ３５mlを添加し、これを撹拌機と還流冷却器を付し
た２００mlの反応フラスコに入れた。次いで、１５０ml
のエピクロルヒドリンを加え、２０rpmで撹拌しつつ、
７０℃で5.2時間加熱した。

反応終了後、内容物を室温に冷却し、下部の水層中のゲ
ル化物を濾別した。

このゲル状物にエタノール５０mlを添加し、撹拌後に濾
過してゲル状物を回収した。回収ゲルを再度エタノール
５０mlに再懸濁し、濾過してゲル状物を回収した。本操
作をさらに３回繰り返した。次に蒸留水５０mlに懸濁
し、濾別した。本操作を３回繰り返した後、再度、エタ
ノール６０mlに分散した。これを濾過し、ゲル状物を乾
燥後、粉砕し、白色粉末0.7ｇを得た。

本粉末の６０℃における水への溶解度は水１００ｇに対
し0.001ｇ以下であつた。さらに、本粉末を６０℃水に
１日間浸漬した後の水和ゲルの本粉末に対する重量比は
14.1であつた。本粉末の非還元末端基の測定により分岐
鎖の平均重合度は2.9であつた。次に、本粉末へのグル
コアミラーゼの吸着性を見るため、以下の実験を行つ
た。

アスペルギルス・オリゼＩＦＯ−４１７６の培養濾液４
０ml（α−アミラーゼ0.50単位／ml，β−アミラーゼ0.
98単位／ml，グルコアミラーゼ1.30単位／mlを含む）を
６℃に冷却し、上記の吸着材粉末0.2ｇを添加し、５rpm
で２分間混合して接触させた。内溶液を、フイルタを底
部に付したカラム（１０φ×５０mm）で濾過して濾液中
のα−アミラーゼ活性，β−アミラーゼ活性，グルコア
ミラーゼ活性を測定した。

濾液中のα−アミラーゼ，β−アミラーゼ，グルコアミ
ラーゼの各活性はそれぞれ0.50単位／ml，0.06単位／m
l，0.013単位／mlであつた。上記吸着剤に吸着した酵素
量を、吸着剤との接触前の酵素濃度から接触後の酵素濃
度を減じた値として計算した。その結果、培養濾液中に
存在したα−アミラーゼは実質上吸着されず、β−アミ
ラーゼの3.1％（0.95単位／ml），グルコアミラーゼの
９８％（0.013単位／ml）吸着された。次に、上記の酵
素を吸着している吸着剤のカラムに苛性ソーダ溶液でｐ
Ｈ7.5に調整した0.5Ｍ塩化ナトリウム水溶液を流し、流
出液を回収した。そのあと、水２mlを流し、カラムを洗
浄して洗浄液と前記溶出液とを合せて酵素脱着液６mlを
得た。

上記の酵素脱離液の酵素濃度を測定した結果、α−アミ
ラーゼは検出されず、β−アミラーゼは1.41単位／ml，
グルコアミラーゼは8.42単位／mlであつた。それぞれの
回収量は各酵素の脱離液中濃度に回収液量６mlを乗じる
ことにより、α−アミラーゼ０単位，β−アミラーゼは
8.5単位，グルコアミラーゼは50.5単位となる。従つ
て、原液中に存在した酵素は本実施例の吸脱着により、
α−アミラーゼは０％，β−アミラーゼは3.6％，グル
コアミラーゼは91.0％回収できた。また、本液中にはプ
ロテアーゼ活性は検出されず、着色，着臭も認められな
かつた。かつ、本液中の有機物量，無機物量は、原液中
の含有量に対し、それぞれ0.86％，1.1％に減少した。

本吸着材の使用により、β−アミラーゼとα−アミラー
ゼとを濾液中に、グルコアミラーゼを吸着材からの溶出
液中へと選択的に分離できる。

尚、溶出液に関しては、グルコアミラーゼが原液に対し
６．５倍に濃縮されたのに対し、β−アミラーゼは2.5
倍に稀釈されたことになる。

〔発明の効果〕

本発明のアミラーゼの分離精製方法及び装置では、吸着
剤として分岐鎖の長さが調節可能な架橋化ポリグルカン
あるいは、主鎖の長さが調節可能な架橋化ホモオリゴ
マ、すなわち、吸着剤の分岐鎖あるいは主鎖の長さが分
離精製しようとするアミラーゼにより調節され、分子間
およびまたは分子内三次元架橋されて水に不溶となつた
吸着剤を用いる。このため、培養濾液などの多種多様の
有機性，無機性不純物及び他種の酵素を含む液中から、
単にアミラーゼを吸着・脱着させることにより、容易に
目的のアミラーゼを濃縮，精製できる。したがつてアミ
ラーゼ精製プロセスも大幅に簡略化可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、架橋剤としてエピハロゲンヒドリンを用いて
得られる架橋化ポリグルカンの代表的な構造単位の例を
示す。 第２図及び第３図は、架橋剤としてエピハロゲンヒドリ
ンを用いて得られる架橋化ホモオリゴマの代表的な構造
単位の例を示す。 第４図は、グルコアミラーゼあるいはβ−アミラーゼの
分離精製に使用する装置であつて、吸着剤と菌体除去培
養液との接触を懸濁混合による方法で行なう装置、第５
図は、吸着剤と菌体除去培養液との接触を、充填カラム
を用いて行なうアミラーゼの分離精製装置、第６図は吸
着剤と菌体除去培養液との接触を、流動層を用いて行な
うアミラーゼの分離精製装置を示す。 ５：培溶液貯槽，６：培溶液移送配管、７：固液分離装
置、９：菌体スラリ移送配管、１１：菌体スラリ貯槽、
１４：菌体除去培養液移送配管、２０：アミラーゼ用吸
着剤・菌体除去培養液混合物移送配管、２３：洗滌水、
２７：吸着剤溶液単槽、２８：脱着剤溶液移送配管、３
１：吸着剤・脱着剤溶液混合物移送配管、３３：アミラ
ーゼ脱着ず吸着剤移送配管、３４：アミラーゼ脱着液移
送配管、３７：アミラーゼ脱着ずみ吸着剤貯槽、３９：
アミラーゼ脱着液移送配管、４１：脱塩用イオン交換本
体、４２：脱塩処理アミラーゼ溶液、４４：濃縮乾燥ア
ミラーゼ、１１８：洗滌水貯槽、１２０：アミラーゼ除
去培養液移送配管、１２１：脱着剤溶液貯槽、１２４：
洗滌廃液移送配管、１２５：アミラーゼ脱着液移送配
管、２１５：アミラーゼ用吸着剤単槽、２１６：アミラ
ーゼ用吸着剤移送配管、２１８：アミラーゼ用吸着剤・
菌体除去培養液混合物、２１９：菌体除去培養液移送配
管、２２０：空気移送配管、２２２：洗滌水貯槽、２２
３：洗滌水、２２４：洗滌水移送配管、２２５：アミラ
ーゼ用吸着剤・菌体除去培養混合物移送配管、２２６：
固液分離装置、２２７：アミラーゼ除去培養液及び洗滌
廃液用移送配管、２２８：アミラーゼ吸着・洗滌処理吸
着剤移送配管、２２９：アミラーゼ除去培養液及び洗滌
廃液貯槽、２３０：アミラーゼ除去培養液及び洗滌液、
２３１：吸着剤溶液、２３２：吸着剤溶液貯槽、２３
３：吸着剤・脱着剤溶液混合物、２３４：脱着槽、２３
５：吸着剤・脱着剤溶液混合物移送配管、２３６：アミ
ラーゼ脱着液移送配管、２３７：アミラーゼ脱着液、２
３８：アミラーゼ脱着液貯槽、２３９：アミラーゼ脱着
液移送配管、２４０：脱塩装置、２４１：脱塩用イオン
交換体、２４２：脱塩処理アミラーゼ移送配管、２４
３：濃縮乾燥装置、２４４：濃縮乾燥アミラーゼ。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】グルコアミラーゼ及びβ−アミラーゼの一
   方もしくは両方を含有する粗酵素水溶液を、グリコーゲ
   ンの分子間架橋化物、グリコーゲンを予めアミラーゼで
   処理して分岐鎖を短縮したグリコーゲンの分子間架橋化
   物及びグルコースのα−１，４結合ホモオリゴマの分子
   間架橋化物よりなる吸着剤の少なくとも１つと接触さ
   せ、グルコアミラーゼ及びβ−アミラーゼの一方もしく
   は両方を吸着させる工程； 酵素を吸着した該吸着剤の水和ゲルと液とを分離する工
   程；及び 該水和ゲルを弱アルカリ性水溶液、０．５Ｍ以上の濃度
   の塩水溶液及び弱アルカリ性でかつ塩を含有した水溶液
   のいずれかの水溶液と接触させて、吸着した酵素を脱着
   させる工程；を含むことを特徴とするアミラーゼの分離
   精製方法。
2. 【請求項２】グリコーゲンを予めアミラーゼで処理して
   分岐鎖を短縮したグリコーゲンの分子間架橋化物よりな
   ることを特徴とするアミラーゼの分離精製に使用される
   吸着剤。
3. 【請求項３】グルコアミラーゼ及びβ−アミラーゼの一
   方もしくは両方を含有する粗酵素水溶液を入れるための
   菌体除去培養液貯槽と、 グリコーゲンの分子間架橋化物、グリコーゲンを予めア
   ミラーゼで処理して分岐鎖を短縮したグリコーゲンの分
   子間架橋化物及びグルコースのα−１，４結合ホモオリ
   ゴマの分子間架橋化物よりなる吸着剤の少なくとも１つ
   を前記粗酵素水溶液と接触させるためのアミラーゼ吸着
   槽 とを具備したことを特徴とするアミラーゼの分離精製装
   置。