DE69631516T2

DE69631516T2 - Familie von Kaliumkanälen von Säugetieren, deren Klonierung und Anwendung für Drogenscreening

Info

Publication number: DE69631516T2
Application number: DE69631516T
Authority: DE
Inventors: Florian Lesage; Eric Guillemare; Michel Fink; Fabrice Duprat; Michel Lazdunski; Georges Romey; Jacques Barhanin
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1996-02-08
Filing date: 1996-05-24
Publication date: 2004-12-30
Anticipated expiration: 2016-05-25
Also published as: ATE259418T1; FR2744730A1; FR2744730B1; EP0799889A1; US6013470A; EP0799889B1; DE69631516D1

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Familie von Kaliumkanälen. Sie betrifft besonders die Klonierung eines humanen Kaliumkanals, der das erste Glied einer neuen funktionalen und strukturellen Gruppe von Kaliumkanälen darstellt. Das reichliche Vorkommen dieses Kanals und sein Vorhandensein in einer großen Anzahl von Geweben lassen ihm eine grundlegende Rolle im Kaliumtransport bei einer großen Zahl von Zellkulturen zukommen.
Die Kaliumkanäle sind bei den eukaryotischen und prokaryotischen Zellen überall vorhanden. Ihre außergewöhnliche funktionelle Verschiedenheit machen sie zu idealen Kandidaten für eine große Zahl von biologischen Abläufen in den lebenden Zellen (Rudy, B., 1988. Neurosciences, 25, 729–749; Hille, B., 1992, „Ionic Channels of Excitable Membrane", 2nd edn, Sinauer, Sunderland, Massachussetts). Bei den erregbaren Zellen definieren die K⁺-Kanäle die Form der Aktionspotentiale und die Frequenz der elektrischen Aktivität und spielen eine Hauptrolle in der neuronalen Integration, der Muskelkontraktion oder der Hormonsekretion. Bei den nicht erregbaren Zellen scheint ihre Expression mit spezifischen Entwicklungsstadien der Zelle korreliert (Barrres, B. A. et al., 1990, Annu. Rev. Neurosci., 13, 441–474). Bei den meisten Zellen spielen besondere Typen von K⁺-Kanälen eine vitale Rolle zur Bestimmung des elektrischen Potentials der Membran in der Ruhe, indem sie die Durchlässigkeit der Membran für K⁺-Ionen regeln. Diese Kanäle zeigen die Besonderheit, daß sie sofort und in einem großen Bereich von Membranpotentialen offen sind.
Neuere Klonierungsarbeiten haben es ermöglicht, eine große Zahl von Untereinheiten zu identifizieren, welche Kaliumkanäle bilden können (Betz, H., 1990, Biochemistry, 29, 3591–3598; Pongs, O., 1992, Physiol. Rev., 72, S69–88; Salkoff L. et al., 1992, Trends Neurosci., 15, 161–166; Jan, L. Y. and Y. N. Jan, 1994, Nature, 371, 119–122; Doupnik, C. A. et al., 1995, Curr. Opin. Neurobiol., 5, 268–277), welche von anderen Typen von Untereinheiten geregelt werden können (Aldrich, R. W., 1994, Curr. Biol., 4, 839–840; Isom, L. L. et al., 1994, Neuron, 12, 1183–1194; Rettig, J. et al., 1984, Nature, 369, 289–294; Attall, B. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6092–6096.).
Die durch Depolarisierung spannungsabhängig aktivierte Untereinheiten von K⁺-Kanälen (Kv-Familien) und von Kalzium abhängigen K⁺-Kanälen weisen sechs hydrophobe Transmembrandomänen auf, von denen eine (S4) wiederholte positive Ladungen enthält, die diesen Kanälen ihre Empfindlichkeit für Spannung und in der Konsequenz in ihrer funktionellen Ausgangs-Rektifikation verleihen (Logothetis, D. E. et al., 1992, Neuron, 8, 531–540; Bezanilla, F. und Stefani, E., 1994, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 23, 819–846).
Die K⁺-Kanäle mit einer Eingangs-Rektifikation (Kir-Familien) haben nur zwei Transmembrandomänen. Sie besitzen nicht das Segment S4 und die Eingangs-Rektifikation resultiert aus einer spannungsabhängigen Blockierung durch das zytoplasmische Magnesium (Matsuda, H., 1991, Annu. Rev. Physiol., 53, 289–298; Lu, Z. und Mackinnon, R., 1994, Nature, 371, 243–246; Nichols, C. G. et al., 1994, J. Physiol. London, 476, 399–409).
Eine gemeinsame Struktureinheit; die als P-Domäne bezeichnet wird, tritt in den zwei Gruppen auf und bildet ein wesentliches Element der Struktur der für K⁺ durchlässigen Pore. Das Vorhandensein dieses Elements in einem Membranprotein wird als Kennzeichen der Struktur eines K⁺-Kanals angesehen (Pongs, O., 1993, J. Membrane Biol., 136, 1–8; Heginbotham, L. et al., 1994, Biophys. J., 66, 1061–1067; Mackinnon, R., 1995, Neuron, 14, 889–892; Pascual, J. M. et al., 1995, Neuron, 14, 1055–1063).
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Klonierung eines K⁺-Kanals, welcher das erste Glied einer neuen strukturellen und funktionalen Gruppe von Kaliumkanälen ist. Dieser neue K⁺-Kanal hat eine neue molekulare Architektur mit vier Transmembransegmenten und zwei P-Domänen. Aus dem Gesichtspunkt der Funktion ist dieser Kanal bemerkenswert, indem er wenig ausgeprägte Eigenschaften von Eingangsrektifikation aufweist. Dieser neue Kanal wird im folgenden TWIK-1 genannt, was der englischen Terminologie „Tandem of P domains in a Weak Inward rectifying K⁺ channel" entspricht. Seine große Zahl und sein Vorkommen in einer großen Zahl von Geweben verleihen ihm eine grundlegend wichtige Rolle im Kaliumtransport bei einer großen Zahl von Zelltypen.
Der Nachweis dieser neuen Familie von Kaliumkanälen und die Klonierung eines Mitglieds dieser Familie stellen besonders neue Mittel zum Screening von Drogen zur Verfügung, welche die Aktivität dieser neuen Kaliumkanäle modulieren können und damit mit diesen Kanälen zusammenhängende Krankheiten verhindern oder behandeln können.
Die zum Klonieren des Kanals TWIK-1 führende Forschung wurde in der im folgenden beschriebenen Weise durchgeführt, wo auf beigefügte Sequenzen und Zeichnungen Bezug genommen wird, worin:

– SEQ ID No. 1 zeigt die Nukleotidsequenz der DNAc von TWIK-1 und die Aminosäuresequenzen der kodierenden Sequenz.
– SEQ ID No. 2 zeigt die Sequenz von Aminosäuren des Proteins TWIK-1.

1 zeigt die Analyse in Northern Blot, die Nukleotidsequenzen und die abgeleitete Sequenz von Aminosäuren sowie das Profil der Hydrophobizität von TWIK-1 (a): Expression von RNAm von TWIK-1 in menschlichen Geweben; jede Strecke enthält 5 μg Poly(A)⁺; das Autoradiogramm wurde 24 Stunden belichtet. (b): DNAc-Sequenz von TWIK-1 und die Sequenz der Aminosäuren der kodierenden Sequenz. Die als Transmembransegmente angesehenen Segmente sind umrahmt, und die P-Domänen sind unterstrichen; o bedeutet eine potentielle Glycosilierungsstelle und
bedeutet den Threoninrest im genannten Konsensus der Erkennung des Proteins Kinase C. (c): die Analyse der Hydrophobizität und die daraus abgeleitete Topologie von TWIK-1; die Hydrophobizitätswerte wurden nach der Methode von Kyte und Doolittle berechnet (Größe des Fensters von 11 Aminosäuren) und sind aufgetragen gegenüber der Position der Aminosäure; die geschwärzten hydrophoben Spitzen entsprechen den Transmembransegmenten.
2 zeigt die Abgleichungen (alignment) der Sequenzen. (a): Abgleichung der P-Domäne von TWIK-1, TOC/YORK und anderen repräsentativen Familien von K⁺-Kanälen; die identischen und konservierten Reste sind jeweils in Schwarz und in Grau eingerahmt. (b): Abgleichung von TWIK-1 mit potentiellen Homologen von C. elegans; die Sequenzen M110.2 und F17C8.6 wurden abgeleitet von Sequenzen von Genen (jeweilige Zugangsnummern Z49968 und Z35719); die informatisierte Spleißung von anderen Genomsequenzen von C. elegans (Zugangsnummern Z49889, P34411 und Z22180) ist nicht genügend genau, um deren vollkommene Abgleichung zu ermöglichen und daher nicht wiedergegeben.
3 zeigt die biophysischen und pharmakologischen Eigenschaften von K⁺-Strömen, die aufgezeichnet wurden durch die Technik der angelegten Spannung an Oozyten von Xenope, die eine Injektion von RNAc von TWIK-1 erhalten hatten; (a): Der Oozyt wurde bei einem Haltepotential (HP) von –80 mV gehalten und die Ströme wurden nach Spannungssprüngen von 1^–S von –120 bis +60 mV mit 20 mV Inkrementen registriert. (b): Regelmäßige Beziehung Strom-Spannung nach dem gleichen Versuch wie bei (a). (c): Potentialumkehr der Ströme von TWIK-1 (E_rev) in Abhängigkeit von der Außenkonzentration an K⁺. (d): Spuren von Strömen, die mit den Depolarisationen von –30 mV ausgehend von einem Haltepotential (HP) von –80 mV zusammenhängen in Abwesenheit (obere Spur) und in Gegenwart (untere Spur) von 1 mM Ba²⁺. (e): Blockierungseffekt von 100 μM Chinin, gleiches Versuchsprotokoll wie bei (d). (f): Beziehung zwischen Dosis und Abhängigkeit der Blockierung von Strömen von TWIK-1 durch Chinin.
4 zeigt den Einfluß der Expression von TWIK-1 auf das Membranpotential. (a): Beziehungen Dosis-Response von RNAc; obere Reihe = Gleichgewichtszustand von austretenden Strömen gemessen bei +30 mV; untere Reihe = Membranpotentiale beim Ruhezustand. (b): Effekt von 100 μM Chinin auf das Membranpotential eines Oozyten, der keine Injektion erhalten hat (linke Spur), und eines Oozyten, der 20 ng RNAc von TWIK-1 erhalten hat. (c): Statistische Behandlung der dipolarisierenden Effekte von 100 μM Chinin auf Oozyten, die keine Injektion erhalten haben (linke Balken), und auf Oozyten, die eine Injektion von 20 ng RNAc von TWIK-1 erhalten haben (rechte Balken); Kontrolle (leerer Balken), + Chinin (schwarze Balken); jeder Balken stellt den Mittelwert ± SD von 5 Oozyten dar.
5 zeigt die Eigenschaften des einzigen Kanals von TWIK-1. (a): Kurvenzüge von Strömen, die in der Konfiguration Eingang-Ausgang bei den angegebenen Membranpotentialen in Abwesenheit (o) oder in Gegenwart (•) von Mg²⁺ intern (3 mM) und in Symmetrie von 140 mM K⁺ registriert wurden. (b): Mittelwert der Kurven I–V (n = 10). (c und d): Offene Zeiten der Verteilung, die bei +80 mV erhalten wurden (obere Histogramme) und bei –80 mV erhalten wurden (untere Histogramme) in Gegenwart von 3 mM Mg²⁺ (c) oder in Abwesenheit von Mg²⁺ (d).
6 zeigt die Blockierung von TWIK-1-Kanälen durch das innere pH. (a und b): Blockierungswirkung der inneren Ansäuerung auf die TWIK-1-Ströme induziert durch Eindringen von CO_2. (a): Spuren von überlagerten Strömen, hervorgerufen durch eine Phase der Depolarisierung bei –30 mV ausgehend von HP = –80 mV, Kontrolle (obere Spur), Effekt, wenn das Gleichgewicht in Gegenwart von CO₂ erreicht wird (untere Spur); (b): Graph (n = 5), der die praktisch vollständige Blockierung der durch CO₂ induzierten TWIK-1-Ströme zeigt. (c und d): Innere Ansäuerung induziert durch Anwendung von DNP (1 mM). (c): Dasselbe Protokoll wie bei (a), Kontrolle (obere Spur) und nach 5 Minuten Anwendung von DNP (untere Spur). (d): Graph (n = 4), der den Prozentanteil von TWIK-1-Strom anzeigt, der nach Behandlung durch die DNP verbleibt. (e und f): Angelegte Spannung (Modus: angebrachter Patch) unter symmetrischen Bedingungen von K⁺-Konzentration (140 mM), gehalten bei + 80 mV. (e): Zeitliche Entwicklung im Fall der Wirkung von 1 mM DNP (Pfeil) auf die Aktivitäten des einzigen TWIK-1-Kanals. (f): Graph (n = 4), der den Effekt von DNP auf die mittlere Öffnungswahrscheinlichkeit NP_o zeigt, berechnet während 1 Minute Registrierung ausgehend vom Gleichgewichtszustand. (g): Aktivitäten, die in der Konfiguration „Patch-Innen-Außen" bei +80 mV bei verschiedenem Innen-pH gemessen wurden, Graph von Balken (n = 10) von NP_o in Abhängigkeit vom inneren pH.
7 zeigt die Aktivierung der TWIK-1-Kanäle durch die PMA, Aktivator des Kinaseproteins C. (a): Eindringen während 10 Minuten von PMA (30 nM) erhöht den TWIK-1-Strom (obere Spur), hervorgerufen durch eine Phase der Depolarisierung bei +30 mV ausgehend von HP = –80 mV, Kontrollstrom (untere Spur). (b): Graph (n = 5), der den Aktivierungseffekt von PMA auf die TWIK-1-Ströme zeigt. (c und d): Konfiguration „Patch" angebracht unter Bedingungen von bei +60 mV gehaltenen symmetrischen K⁺-Konzentrationen. (c): Zeitliche Entwicklung des Effekts von 30 nM PMA auf die Aktivitäten des einzigen Kanals; die Registrierungen der Aktivität des Kanals werden erhalten mit einem raschen Überstreichen vor und nach der Anwendung des PMA. (d): Graph von Balken (n = 5), welcher den Aktivierungseffekt von PMA auf NP_o zeigt.
Die P-Domänen von K⁺-Kanälen wurden verwendet, um entsprechende Sequenzen in der Datenbank GenBank zu recherchieren, indem das Programm der Sequenzabgleichung BLAST angewandt wurde (Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215, 403–410). Es wurde so eine exprimierte Sequenz Tag human (EST; HSC3AH031) von 298 pb identifiziert, deren abgeleitete Aminosäuresequenz eine Sequenz einer nicht üblichen „P-artigen" Domäne aufweist: GLG anstelle von GYG, wie in 2a gezeigt. Es wurde daher angenommen, daß diese Sequenz EST eine Teilkopie einer RNAm ist, die einen neuen Typ von Untereinheit des K⁺-Kanals kodiert. Eine DNA-Sonde wurde aus dieser Sequenz hergestellt, um eine Hybridisierung mit einem Northern Blot (Clontech) von multiplen humanen Geweben zu realisieren. Ein Transkript von 1,9 kb wurde so, wie in der 1a gezeigt, überreichlich gefunden im Herz und Gehirn und auf einen geringeren Niveau in der Plazenta, der Lunge, der Leber und der Niere. Die DNA-Sonde wurde verwendet, um eine DNAc-Bank der Niere zu screenen, und vier unabhängige Klone wurden erhalten. Die DNAc-Inserts von 1,8 bis 1,9 kb dieser Klone weisen alle den gleichen offenen Leserahmen (ORF) auf, der eine identische Region zur Sequenz von 298 pb von HSC3AH031 enthält, und unterscheiden sich nur durch die Länge ihrer nicht kodierenden Sequenzen 5'.
Primärstruktur von TWIK-1
Die folgenden Charakteristika wurden nachgewiesen:

– Die Sequenzen der DNAc-Klone enthalten einen ORF von 1011 Nukleotiden, der für ein Polypeptid von 336 Aminosäuren kodiert, das in 1b dargestellt ist.
– Dieses Protein weist zwei P-Domänen auf.
– Abgesehen von den P-Domänen wurde keinerlei signifikante Abgleichung zwischen TWIK-1 und einem K⁺-Kanal gefunden, der kürzlich bei der Hefe kloniert wurde und ebenfalls zwei P-Domänen aufweist (Ketchum, K. A. et al., 1995, Nature, 376, 690–695).
– Die Analyse der Hydrophobizität von TWIK-1, die in der 1c dargestellt ist, zeigt die Anwesenheit von vier Transmembrandomänen, die mit T1 bis T4 bezeichnet sind.
– Indem man das NH₂-Ende entsprechend der Abwesenheit des Peptidsignals auf die Zytoplasmaseite bringt, erhält man das in 1c dargestellte Topologiemodell.
– In diesem Modell sind die zwei P-Domänen in die Membran von außen her eingesetzt, entsprechend der bekannten Orientierung dieser Schleifen in den K⁺-Kanälen.
– Außerdem ist die allgemeine Struktureinheit von TWIK-1 ähnlich der Struktureinheit, die man erhält, indem man aus zwei klassischen Untereinheiten, die den Eingang eines Kaliumkanals rektifizieren, ein Tandem macht. Wie ein klassischer Eingangsrektifikator hat TWIK-1 kein stark konserviertes Segment S4, das für die Empfindlichkeit der Eingangsrektifikation der K⁺-Kanäle der Kv-Familie für das Membranpotential verantwortlich ist.
– Eine ungewöhnliche große Schleife von 59 Aminosäuren ist zwischen M1 und P1 vorhanden, wobei sie die Länge des Verbinders (Linkers) M1–P1 auf der extrazellularen Seite der Membran ausdehnt.
– Ein Platz der potentiellen N-Glycosilierung ist in dieser Schleife vorhanden.
– Drei Konsensusplätze der Phosphorylierung sind am N-endständigen Ende (Ser 19 bei der Kalzium-Calmodulin-Kinase II) und C-endständigen Ende (Ser 303 bei der Kasein-Kinase II) der Zytoplasma-Domänen und im Verbinder (Linker) M2–M3 (Thr 161 bei der Proteinkinase II) vorhanden.
– Die Abgleichung der P-Domänen einer wichtigen Gruppe von K⁺-Kanälen ist in 2a angegeben. Sie zeigt, daß die Region, welche die für K⁺ selektive Pore bilden, gut konserviert sind, einschließlich der Reste G in der Position 16 und 18 und drei andere Reste, was praktisch ausschließlich konservierende Veränderungen an den Positionen 7, 14 und 17 anzeigt. Interessant ist, daß ein Leucinrest anstelle eines konservierten Tyrosins in der Position 17 in der Domäne P2 von TWIK-1 oder ein Phenylalanin in der Position 17 in der Domäne P des K⁺-Kanals vom Typ oag vorhanden ist.

Die Homologen von TWIK-1
Der Vergleich der kompletten Sequenz von TWIK-1 mit Sequenzen der Datenbank GenBank ermöglichte die Identifizierung von mindestens fünf Genen von Caenorhabditis elegans, die im Rahmen des Nematoden-Sequenzierungsprojekt charakterisiert wurden und die potentiell für Strukturhomologe von TWIK-1 kodieren. Die Abgleichung von zwei unter ihnen mit TWIK-1 ist in 2b dargestellt. Die Homologien von Gesamtsequenzen zwischen den abgeleiteten Proteinen von C. elegans und TWIK-1 liegen bei etwa 55 bis 60% und 25 bis 28% Identität. Die Homologien zwischen Sequenzen von C. elegans sind nicht stärker.
Funktionelle Expression von TWIK-1
Für die Funktionsuntersuchung wurde die kodierende Sequenz von TWIK-1 zwischen die nicht kodierenden Sequenzen 5' und 3' von Xenopus globin im Vektor pEXO eingesetzt (Lingueglia, E. et al., 1993, J. Biol. Chem., 269, 13736–13739). Eine komplementäre RNA (RNAc) wurde von dieser Konstruktion transkribiert und in Oozyten von X. Laevia injiziert. Ein nicht aktivierender Strom, der bei nicht injizierten Zellen fehlte, wurde durch die Methode der angelegten Spannung gemessen, wie in 3a gezeigt. Die kinetische Aktivierung des Stroms ist meist sofort und kann nicht aufgelöst werden, da sie maskiert ist durch die kapazitive Entladung des zu Beginn des Impulses aufgezeichneten Stroms. Die Strom-Spannungs-Beziehung ist oberhalb von 0 mV linear, dann gesättigt für eine stärkere Depolarisierung der Membran wie 3b zeigt. TWIK-1 ist daher K⁺-selektiv. Im Fall einer Substitution des äußeren K⁺ durch Na⁺ oder durch N-Methyl-D-gluconat folgt die Potentialumkehr der Ströme dem Gleichgewichtspotential K⁺ (E_K) wie in 3c gezeigt. Außerdem führt eine Verände rung der Konzentration [(K)]₀ um 10 zu einer Veränderung der Größe des Umkehrpotentials um 56 ± 2 mV entsprechend der Nernst'schen Gleichung.
Wie 3 zeigt, werden die K⁺-Ströme von TWIK-1 durch Ba²⁺ (3d) mit einem Wert IC₅₀ von 100 μM, durch Chinin (3e und 3f) und durch Chinidin (nicht gezeigt) mit IC₅₀-Werten von jeweils 50 und 95 μM inhibiert. Die TWIK-1-Ströme sind geringfügig empfindlich für TEA und anti-arythmisches Tedisamil der Klasse III (30% Inhibierung in jedem Fall, jeweils bei 10 mM und 100 μM). Weniger als 10% Inhibierung wurden nach Gabe von 4-Aminopyridin (1 mM), Apamin (0,3 μM), Charybdotoxin (3 nM), Dedrotoxin (0,1 μM), Clofilium (30 μM), Amiodaron (100 μM) und Glibenclamid (30 μM) beobachtet. Der TWIK-1-Kanal ist nicht sensibel für K⁺-Kanalöffner, welche Cromakalin (100 μM) und Pinacidil (100 μM) sind.
4 zeigt die Wirkung der Erhöhung von injizierten Dosen von RNAc von TWIK-1 auf die Expression unabhängig von der Zeit der K⁺-Ströme und auf das Membranruhepotential (E_m). Sobald der Strom auftritt, sind die Oozyten polarisiert um einen Wert E_m nah bei E_k zu erreichen. Die Amplitude des Stroms von TWIK-1 erreicht Werte von 0,6 bis 0,8 μA für die Injektion von 20 ng pro Oozyt. Höhere Dosen von RNAc von TWIK-1 sind toxisch und führen zu einem Absinken der Expression. In den Oozyten, die 20 ng RNAc erhalten haben, ist das Chinin der beste TWIK-1-Blockierer und induziert eine starke reversible Depolarisierung (73 ± 6 mV, n = 5) wie in den 4b und 4c gezeigt.
Die Einheitseigenschaften des TWIK-1-Kanals
Die Registrierungen von Strömen des einfachen Kanals, die in 5 dargestellt sind, in einer Patch-Konfiguration vom Typ „inside-out" oder in einer Konfiguration der ganzen Zelle zeigen, daß die TWIK-1-Kanäle für den Durchtritt von austretenden oder eintretenden Strömen in Abhängigkeit jeweils von einer Depolarisierung oder einer Hyperpolarisierung sorgen (5a). Die in 5b dargestellte Beziehung Strom-Spannung des einzigen Kanals zeigt eine kaum akzentuierte Eingangs-Rektifikation in Gegenwart von 3 mM (5) und 10 mM (nicht gezeigt) Mg²⁺ auf der Cytoplasmaseite. Wie 5b zeigt, verschwindet diese Rektifikation bei Abwesenheit von inneren Mg²⁺-Ionen. In 3 mM innerem Mg²⁺ liegt die mittlere Öffnungsdauer bei +80 mV bei 1,9 ms und die Einheitsleitwert bei 19 ± pS (5c). Bei –80 mV schwingen die Kanäle mit einer mittleren Öffnungsdauer von 0,3 ms und einem erhöhten Leitwert bei 34 ± 4 pS. Der Rückzug von inneren Mg²⁺-Ionen beeinflußt die kinetischen Parameter nicht, weder in den polarisierten noch depolarisierten Zuständen, jedoch erreicht der bei –80 mV gemessene Einheitsleitwert +35 ± 4 pS. Diese scheinbare Erhöhung des Leitwerts im Einheitskanal läßt vermuten, daß es die durch Mg²⁺ induzierte außerordentlich rasche Schwingung ist, welche zu einer Unterschätzung der tatsächlichen Größe des Leitwerts führt. Die gleichen Eigenschaften wurden in der Konfiguration mit fixierter Zelle beobachtet, was zeigt, daß das Verhalten des Kanals durch ein Herausschneiden des Patch nicht modifiziert wird. Die TWIK-1-Kanäle in den herausgeschnittenen Patches entladen sich nicht und scheinen keine Notwendigkeit von intrazellularen Bestandteilen zu sein. Im Gegensatz zu zahlreichen Kanäle, welche die Anwesenheit von ATP für ihre Aktivität in der Konfiguration mit herausgeschnittenem Patch erfordern, ist das ATP für die Expression von TWIK-1 nicht erforderlich. Außerdem induziert das Durchspülen des Patch mit einer 10 mM ATP enthaltenden Lösung keinen Effekt bei der Aktivität des TWIK-1-Kanals.
Die Eigenschaften der Regulierung der Aktivität des TWIK-1-Kanals
Der intrazellulare pH (Ph_i) spielt eine Rolle bei der Steuerung zahlreicher Zellprozesse. In Zellen wie den hepatischen Zellen regelt die Veränderung von Ph_i das Membranpotential (Bear, C. E. et al., 1988, Biochim. Biophys. Acta, 944, 113–120).
Die intrazellulare Ansäuerung von Oozyten wurde nach zwei Methoden erhalten:

– Überspülen (Superfusion) mit einer an CO₂ angereicherten Lösung, was eine Ansäuerung durch einen Mechanismus bewirkt, der mit dem Bicarbonat-Transportsystem zusammenhängt (Guillemare, E. et al., 1995, Mol. Pharmacol., 47, 588–594);
– Behandlung mit Dinitrophenol (DNP), das ein metabolischer Inhibitor ist und den H⁺-Gradienten in den Mitochondrien entkoppelt und eine innere Azidität induziert (Pedersen, P. L. und Carafoli, E., 1987, Trends Biol. Sci., 12, 146–189).

Diese zwei Versuchsmaßnahmen führten zu einer signifikanten Verringerung der TWIK-1-Ströme, mehr als 95% im Fall von CO₂ und 80% im Fall von DNP, der Werte der Steuerung der Amplitude, wie in 6a bis 6d gezeigt. Die durch DNP an der Aktivität des Einheitskanals K⁺ indizierte Inhibierung wurde auch noch beobachtet unter Bedingungen von angefügtem Patch, wie in den 6e bis 6f gezeigt. Jedoch wird nach dem Herausschneiden des Patch die Aktivität des Kanals unempfindlich gegenüber der Ansäuerung der inneren Lösung, die entweder durch Modifizierung des Pufferverhältnisses Na₂PO₄/NaH₂PO₄ (6g und 6h) oder durch Entgasen von CO₂ (nicht gezeigt) erhalten wurde. Infolgedessen ist die Wirkung des pH auf die Aktivität des TWIK-1-Kanals wahrscheinlich indirekt.
Die Phosphorylierung oder Dephosphorylierung von spezifischen Aminosäurenresten ist ein wichtiger Regelmechanismus von Ionenkanälen (Lovitan, I. B., 1994, Annu. Rev. Physiol., 56, 193–212). Wie 7 zeigt, erhöht die Aktivierung des Proteins Kinase C durch Phorbol-12-Myristatacetat (PMA, 30 nM) die TWIK-1-Ströme. Der inaktive Phorbolester 4α-Phorbol-12, 13-didecanoat (PDA, 1 μM) hat keinerlei Wirkung. In einem angebrachten Patch, der anfangs nur einen Kanal exprimierte, zeigt die Anwendung von PMA die Gegenwart von mindestens 5 Kanälen (7c und 7d). Dieser Versuch zeigt, daß in diesem Patch mindestens 4 Kanäle vorhanden, jedoch vor Anwendung von PMA schweigend sind. Da die Sequenz des TWIK-1 einen Platz der Konsensus-Phosphorylierung für das Protein Kinase C (PKC) enthält, der auf der Höhe des Threonins in Position 161 (1b) lokalisiert ist, läßt der Effekt des PMA eine Steuerung unter der Kontrolle von PKC vermuten. Jedoch führt die Mutation des Threonins 161 in Alanin zu einem stummen Kanal, der funktionsfähig bleibt und die Fähigkeit behält, daß er durch PMA aktiviert wird.
Die Aktivierung des Proteins Kinase A durch Anwendung von 8-C1-AMPc (300 μM) oder Forskolin (10 μM) beeinflußt nicht die Aktivität von TWIK-1. Die Erhöhung der zytoplasmischen Ca²⁺-Konzentration durch Anwendung von A23187 (1 μM), welche die Ca²⁺-Calmodulin-Kinase II aktivieren und/oder die Anwesenheit eines durch Ca²⁺ aktivierten Kanals aufzeigen konnte, ist auch ohne Wirkung auf die Eigenschaften des Kanals TWIK-1.
Die Erfindung hat daher zum Ziel ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül, das für ein Protein kodiert, das einen TWIK-1-Kaliumkanal darstellt oder Eigenschaften und eine Struktur vom Typ der oben beschriebenen des TWIK-1-Kanals hat.
Insbesondere kodiert dieses Nukleinsäuremolekül für das Protein TWIK-1, dessen Aminosäuresequenz in der beigefügten Sequenzliste SEQ ID No: 2 dargestellt ist, oder ein funktionell äquivalentes Derivat dieser Sequenz. Solche Derivate können erhalten werden, indem man einen oder mehrere Aminosäurereste dieser Sequenz modifiziert und/oder wegläßt, soweit diese Modifikation und/oder Unterdrückung die funktionellen Eigenschaften des TWIK-1-Kaliumkanals des resultierenden Proteins nicht modifiziert.
Die Sequenz eines für dieses Protein kodierenden DNA-Moleküls und besonders die für TWIK-1 kodierende ist in der beigefügten Sequenzliste SEQ ID No: 1 dargestellt.
Die Erfindung betrifft auch einen Vektor mit einem vorangehenden Nukleinsäuremolekül sowie ein Verfahren zur Herstellung oder Expression in einem zellularen Wirt eines Proteins, das einen TWIK-1-Kaliumkanal oder einen Kanal der gleichen Familie wie TWIK-1 darstellt.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das einen TWIK-1-Kaliumkanal bildet oder Eigenschaften und eine Struktur vom Typ derjenigen des TWIK-1-Kanals aufweist, besteht im folgenden:

– es wird ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder ein dieses Molekül enthaltender Vektor in einen zellulären Wirt transferiert;
– dieser im vorangehenden Schritt erhaltene zelluläre Wirt wird unter Bedingungen kultiviert, welche die Produktion von Kaliumkanälen ermöglicht, welche die Eigenschaften von TWIK-1 aufweisen;
– es werden durch jedes geeignete Mittel die Proteine isoliert, welche Kaliumkanäle der Familie TWIK-1 bilden.

Ein Verfahren zur Expression eines Kaliumkanals TWIK-1 oder der gleichen Familie wie TWIK-1 besteht im folgenden:

– es wird ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder ein dieses Molekül enthaltender Vektor in einen zellulären Wirt transferiert;
– der im vorangehenden Schritt erhaltene zelluläre Wirt wird unter Bedingungen kultiviert, welche de Expression von Kaliumkanälen der Familie TWIK-1 ermöglichen.

Der in den vorangehenden Verfahren eingesetzte zelluläre Wirt kann ausgewählt sein unter den Prokaryoten oder Eukaryoten und besonders den Bakterien, Hefen, den Zellen von Säugetieren, Pflanzen oder Insekten.
Der verwendete Vektor wird ausgewählt entsprechend dem Wirt, in den er transferiert werden soll, es kann sich um jeden Vektor wie ein Plasmid handeln.
Die Erfindung betrifft somit auch die transformierten Zellen, welche Kaliumkanäle exprimieren, welche Eigenschaften und eine Struktur vom Typ derer des TWIK-1-Kanals aufweisen, die entsprechend den obigen Verfahren erhalten wurden.
Die Zellen, welche TWIK-1-Kaliumkanäle oder Kanäle mit Eigenschaften und einer Struktur vom Typ derjenigen des TWIK-1-Kanals aufweisen, die gemäß den obigen Verfahren erhalten wurden, werden zum Screening von Substanzen benutzt, welche die Aktivität von TWIK-1-Kaliumkanälen modulieren können. Dieses Screening wird durchgeführt, indem man wechselnde Mengen einer zu testenden Substanz in Berührung bringt mit Zellen, welche den TWIK-1-Kanal oder Kaliumkanäle mit Eigenschaften und einer Struktur vom Typ derjenigen des Kanals TWIK-1 exprimieren und dann auf jede geeignete Weise die eventuellen Wirkungen dieser Substanz auf die Kaliumkanalströme dieser Kanäle mißt.
Dieses Screening-Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Drogen, die nützlich sind in der Behandlung von Herz- oder Nervenkrankheiten. Pathologien, welche mit den Kaliumkanälen zusammenhängen und daher die Kanäle der TWIK-1-Familie betreffen können, sind beispielsweise Epilepsie, die Herzpathologien (Arythmien) und Gefäßpathologien, die neurodegenerativen Pathologien, besonders die mit Ischemien oder Anoxien zusammenhängenden, die endocrinen Pathologien, die mit Anomalien der Hormonsekretion zusammenhängen, die muskulären Pathologien.
Ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül, das für ein Protein kodiert, das einen TWIK-1-Kaliumkanal bildet, oder ein Vektor, der ein solches Nukleinsäuremolekül aufweist oder auch eine Zelle, welche TWIK-1-Kaliumkanäle exprimiert, sind auch nützlich zur Herstellung von nicht humanen transgenen Tieren. Es kann sich um Tiere handeln, welche diese Kanäle überexprimieren, jedoch vor allem sogenannte „knock out"-Tiere, d. h. welche einen Mangel an diesen Kanälen aufweisen; diese nicht humanen transgenischen Tiere werden nach den dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt und man verfügt so über lebende Modelle zur Untersuchung von tierischen Pathologien, die mit TWIK-1-Kanälen zusammenhängen.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder durch diese Moleküle transformierten Zellen können im übrigen verwendet werden in Strategien der Gentherapie, um einen Mangel bei den Kaliumkanälen auf dem Niveau eines oder mehrerer Gewebe eines Patienten zu kompensieren. Die Erfindung betrifft daher auch ein Medikament, das erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle oder durch ein solches Molekül transformierte Zellen aufweist, zur Behandlung von Pathologien, welche mit den Kaliumkanälen zusammenhängen.
Außerdem wurde das Gen des TWIK-1-Kanals auf dem Chromosom 1 in der Position q42–q43 festgelegt. Die Lokalisierung dieses Gens auf dem Chromosom stellt ein entscheidendes Ergebnis für die Identifizierung von genetischen Krankheiten dar, die mit dieser neuen Familie von Kaliumkanälen zusammenhängen. Die Kenntnis der Struktur der Kanäle der TWIK-1-Familie ist von solcher Art, daß sie eine pränatale Diagnostik solcher Krankheiten ermöglicht.
Die Erfindung hat weiter zum Ziel eine neue Familie von K⁺-Kanälen zu den TWIK-1 gehört, die in den meisten menschlichen Zellen und besonders reichlich im Gehirn und Herz vorhanden sind und Eigenschaften und eine Struktur vom Typ derjenigen der oben beschrie benen des TWIK-1-Kanals aufweisen. Sie betrifft daher ein isoliertes und gereinigtes Protein, dessen Aminosäuresequenz in der im Annex unter der Nummer SEQ ID No: 2 dargestellt ist oder ein funktionell äquivalentes Derivat dieser Sequenz.
Solche Derivate können erhalten werden, indem man einen oder mehrere Aminosäurereste dieser Sequenz modifiziert und/oder unterdrückt oder indem man diese Sequenz segmentiert, solange diese Modifizierung und/oder Unterdrückung oder Entfernung eines Fragments die funktionellen Eigenschaften des Kaliumkanals vom Typ TWIK-1 des resultierenden Proteins nicht modifiziert.
Ein Protein, das einen Kaliumkanal vom Typ TWIK-1 darstellt, ist nützlich zur Herstellung von Medikamenten, die zur Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten nützlich sind, welche mit einer Fehlfunktion der Kaliumkanäle einhergehen.
Poly- oder monoklonale Antikörper, die gegen ein Protein gerichtet sind, das ein Kaliumkanal vom Typ TWIK-1 darstellt, können durch in der Literatur beschriebene klassische Methoden hergestellt werden.
Diese Antikörper sind nützlich, um das Vorhandensein von Kaliumkanälen der Familie TWIK-1 in verschiedenen menschlichen oder tierischen Geweben zu untersuchen, sie können aber auch Anwendungen auf dem therapeutischen Gebiet finden, um dank ihrer Spezifizität die Kaliumkanäle vom Typ TWIK-1 in vivo zu inhibieren oder aktivieren.
Andere Vorteile und Merkmale der Erfindung werden erläutert durch die folgenden nicht begrenzenden Beispiele, welche die Klonierung und Expression von TWIK-1 betreffen.
Identifizierung der Sequenz HSC3AH031 EST und Analyse der RNA
Die P-Domänen der klonierten Kanäle wurden verwendet, um Homologe in den Datenbanken der NCBI (National Center of Biotechnology) zu suchen, indem das Programm der Abgleichung von Sequenzen tBLASTn verwendet wurde. Die Übersetzung einer Sequenz EST (HSC3AH031, Genbank-Zugangsnummer: F12504) zeigte eine signifikante Ähnlichkeit der Sequenz (P = 1,2 × 10^–3) mit der zweiten P-Domäne eines K⁺-Kanals der Hefe. Diese Sequenz von 298 pb war ursprünglich erhalten worden von einer DNAc-Bank des menschlichen Gehirns im Rahmen des DNAc Genexpress-Programms (Auffrey, C. et al., 1995, C. R. Acad. Sci. Vie, 318, 263–272). Ein DNA-Fragment von 255 pb entsprechend dem HSC3AH031 wurde durch PCR amplifiziert ausgehend von DNAc-Derivaten von Poly(A)⁺ des menschlichen Gehirns und unterkloniert in pBluescript (Stratagene), um pBS-HSC3A zu liefern.
Für die RNA-Analyse wurde ein Northern Blot von multiplen menschlichen Zellen (Clontech) mit dem Insert von pBS-HSCA markiert mit P³² in 50% Formamid, 5 × SSPE (0,9 M NaCl; 50 mM Natriumphosphat; pH 7,4; 5 mM EDTA), 0,1% SDS, 5 × Denhardts, 20 mM Kaliumphosphat, pH 6,5 und 250 μg DNA von bei 55°C denaturiertem Lachssperma während 18 Stunden gescreent. Die Blots wurden bis zu einer Endstringenz von 0,1 SSC (3 M NaCl; 0,3 M Natriumcitrat; pH 7,0), 0,3% SDS bei 65°C gewaschen.
Isolierung des TWIK-1 kodierenden Klons von DNAc
Eine Bank von DNAc oligo(dT) aus RNA-poly(A)⁺ isoliert aus adulter menschlicher Niere wurde gescreent mit dem mit P³² markierten Insert von pBS-HSCA. Die Filter wurden hybridisiert in 50% Formamid, 5 × SSC, 4 × Denhardt, 0,1% SDS und 100 μg Lachssperma-DNA denaturiert bei 50°C während 18 Stunden. Vier positive Hybridisierungsklone wurden aus etwa 5 × 10⁵ Klonen isoliert. Die die Inserts von DNAc enthaltenden Phagen λ2APII wurden in Plasmide von DNAc (Stratagene) umgewandelt. Die DNAc-Inserts werden analytisch durch Restriktionsenzyme und totale oder partielle Sequenzierung der DNA an den zwei Strängen durch die Dideoxymethode von Nukleotiden charakterisiert unter Anwendung eines automatischen Sequenzers (Applied Biosystems 373A).
Mutationen, Synthese von RNAc und Infektion in Oozyten
Die kodierende Sequenz von TWIK-1 wurde amplifiziert unter Verwendung einer DNA-Polymerase mit geringem Fehlergrad (Pwo DNA pol. Boehringer) und unterkloniert im Plasmid pEXO, um das pEXO-TWIK-1 zu liefern. Die Mutationen wurden hergestellt, indem das Plasmid pEXO-TWIK-1 im ganzen mit einem PCR-Kit für sehr korrekte Extension (Boehringer) und zwei benachbarten Startern amplifiziert wurden. Der eine von diesen führte eine Punktmutation in die kodierende Sequenz des TWIK-1 ein, welche das Codon der Thr 161 in ein Codon für Alanin veränderte. Das Produkt der PCR wurde linearisiert durch das Enzym BamHI und die RNAc wurden synthetisiert unter Verwendung einer T7 RNA-Polymerase (Stratagene). Die Präparation von Oozyten von X. laevis und Injektion von RNAc wurden realisiert wie in der Literatur beschrieben (Guillemare, E. et al., 1992, Biochemistry, 31, 12463–12468).
Elektrophysiologische Messungen
In einer Perfusionskammer von 0,3 ml wurde ein einziger Oozyt gehalten auf zwei Standard-Glasmikroelektroden (0,5 bis 2,0 MW), mit 3 M KCl geladen und unter einer Spannungsklammer mit einem Verstärker Dagan TEV200 gehalten. Die Badlösung enthielt 98 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂ und 5 mM HEPES bei pH 7,4 mit KOH. Die Stimulation des Präparats, die Datenerfassung und die Analysen wurden mit der Software pClamp (Axon Instruments, USA) durchgeführt.
Für die Untersuchung von Patch-Klammer wurden die Oozyten von ihrer Vitellinmembran befreit, wie in der Literatur beschrieben (Duprat, F. et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun., 212, 657–663) und in eine Badlösung gebracht, die 140 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂ und 5 mM HEPES bei pH 7,4 mit KOH enthielt. Die Pipetten wurden mit einer starken Lösung von K⁺ gefüllt (40 mM KCl, 100 mM Kaliummethansulfonat, 1,8 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂ und 5 mM HEPES eingestellt auf pH 7,4 mit KOH). 100 μM GdCl₃ wurden der Pipettenlösung zugesetzt, um die Aktion der aktivierten Kanäle zu inhibieren. Die „inside-out"-Patch wurden mit einer Lösung perfundiert, die 140 mM KCl, 10 mM CaCl₂, 5 mM HEPES eingestellt auf pH 7,2 mit KOH und 5 mM EGTA täglich zugesetzt enthielt. Die Signale des Einkanals wurden bei 3,5 kHz gefiltert und mit dem Programm Biopatch (Bio-Logic, Grenoble, Frankreich) analysiert.
LISTE DER SEQUENZEN

Claims

Isoliertes und gereinigtes codierendes Nukleinsäuremolekül für ein Protein, welches einen Kaliumkanal mit vier transmembranen Segmenten und zwei P-Domainen bildet, und welcher schwach ausgeprägte Eigenschaften für die eintretende Rektifikation aufweist.
Isoliertes und gereinigtes codierendes Nukleinsäuremolekül für ein Protein, welches einen Kaliumkanal bildet, dadurch gekennzeichnet, dass es das Protein, dessen Sequenz an Aminosäuren in der Liste der Sequenzen des Annex unter der Nummer SEQ ID NR. 2 angegeben ist, codiert.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2, dessen Sequenz in der Liste der Sequenzen des Annex unter der Nummer SEQ ID NR. 1 angegeben ist.
Vektor, welcher ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält.
Produktionsverfahren eines Proteins, welches einen Kaliumkanal mit vier transmembranen Segmenten und zwei P-Domainen bildet, und welcher schwach ausgeprägte Eigenschaften für die eintretende Rektifikation aufweist, bestehend aus: – ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einen Vektor nach Anspruch 4 in einen zellulären Wirt zu transferieren, – den zellulären Wirt in vitro zu kultivieren, welcher in der vorhergehenden Etappe, deren Konditionen die Herstellung der Kaliumkanäle mit vier transmembranen Segmenten und zwei P-Domainen, und welche schwach ausgeprägte Eigenschaften für die eintretende Rektifikation aufweisen, ermöglichen, gewonnen wurde, – die Proteine mit allen Mitteln zu isolieren, welche den Proteinen, welche aus Kaliumkanälen mit vier transmembranen Segmenten und zwei P-Domainen bestehen, und welche schwach ausgeprägte Eigenschaften für die eintretende Rektifikation aufweisen, angepasst sind.
Verfahren zur Expression eines Kaliumkanals mit vier transmembranen Segmenten und zwei P-Domainen, und welcher schwach ausgeprägte Eigenschaften für die eintretende Rektifikation aufweist, bestehend aus: – ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einen Vektor nach Anspruch 4 in einen zellulären Wirt zu transferieren, – den zellulären Wirt in vitro zu kultivieren, welcher in der vorhergehenden Etappe, deren Konditionen die Expression der Kaliumkanäle mit vier transmembranen Segmenten und zwei P-Domainen, und welche schwach ausgeprägte Eigenschaften für die eintretende Rektifikation aufweisen, ermöglichen, gewonnen wurde.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass der zelluläre Wirt ausgewählt wurde unter den Prokaryoten oder den Eukaryoten und vor allem unter den Bakterien, den Hefen, den Zellen von Säugetieren, Pflanzen oder Insekten.
Transformierte Zelle, welche die Kaliumkanäle mit vier transmembranen Segmenten und zwei P-Domainen, und welche schwach ausgeprägte Eigenschaften für die eintretende Rektifikation aufweisen, ausdrückt, dadurch gekennzeichnet, dass ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder ein Vektor nach Anspruch 4 in die besagte Zelle transferiert wurde.
Verfahren für das Screening von Substanzen, welche in der Lage sind die Aktivität der Kaliumkanäle mit vier transmembranen Segmenten und zwei P-Domainen, und welche schwach ausgeprägte Eigenschaften für die eintretende Rektifikation aufweisen, zu verändern, dadurch gekennzeichnet, dass: – man variable Quantitäten der zu testenden Substanz mit den Zellen nach Anspruch 8, welche die Kaliumkanäle mit vier transmembranen Segmenten und zwei P-Domainen, und welche schwach ausgeprägte Eigenschaften für die eintretende Rektifikation aufweisen, ausdrücken, in Kontakt bringt, anschließend – man mit allen angepassten Mitteln, die eventuellen Effekte der besagten Substanz auf die Strömung der Kaliumkanäle mit vier transmembranen Segmenten und zwei P-Domainen, und welche schwach ausgeprägte Eigenschaften für die eintretende Rektifikation aufweisen, misst.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Kompen-sierung eines Defizits der Kaliumkanäle auf dem Niveau eines oder mehrerer Gewebe, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Nukleinsäuremoleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder auch die Zellen nach Anspruch 8 beinhaltet.
Isoliertes und gereinigtes Protein, welches einen Kaliumkanal mit vier transmembranen Segmenten und zwei P-Domainen, und welcher schwach ausgeprägte Eigenschaften für die eintretende Rektifikation aufweist, bildet.
Protein nach Anspruch 11, dessen Aminosäuresequenz in der Liste der Sequenzen des Annex unter der Nummer SEQ ID NR. 2 repräsentiert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Kompensierung eines Defizits der Kaliumkanäle auf dem Niveau eines oder mehrerer Gewebe, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Protein nach einem der Ansprüche 11 und 12 beinhaltet.
Monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, welcher gegen ein Protein nach einem der Ansprüche 11 und 12 gerichtet ist.