DE10032630A1 - Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Expansinen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Expansinen in Mikroorganismen, die dafür benötigten Vektoren, Wirtszellen, enthaltend diese Vektoren, sowie die Verwendung von rekombinanten Expansinen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Expansinen in Mikroorganismen, die dafür benötigten Vektoren, Wirtszellen, enthaltend diese Vektoren, sowie die Verwendung von rekombinanten Expansinen.

Expansine sind Proteine, die in pflanzlichen Zellwänden vorkommen und in der Lage sind, die Längenausdehnung unter Zugspannung stehender Zellwände zu katalysie­ ren, ohne dabei die in den Zellwänden enthaltenen Polysaccharide zu hydrolysieren (McQueen-Mason et al., PNAS USA 91, 1994, 6574-6578).

Die besondere Eigenschaft der Expansine, die Struktur und damit die physikalischen Eigenschaften von Polysacchariden, insbesondere von Cellulose und Hemicellulose, zu verändern, macht diese Proteine fvir vielfältige Anwendungen in der faserverarbeitenden Industrie interessant. Um Expansine für solche Anwendungen nutzen zu können, ist es notwendig, sie in hinreichender Menge verfügbar zu haben.

In US-A-5 959 082 wird die Isolierung von Expansinen aus pflanzlichem Rohmaterial beschrieben. Nachteilig an diesem Verfahren ist, dass die Expansine nur in geringen Mengen isoliert werden können. Weiterhin umfasst das Verfahren eine Vielzahl von Arbeits- und Aufreinigungsschritte. Daher ist das Verfahren für eine großtechnische Nutzung unwirtschaftlich.

Die oben genannten Probleme können mit der Herstellung von rekombinanten Expansinen gelöst werden. Bisherige Versuche, aktive Expansine in Mikro­ organismen wie Bakterien oder Pilzen zu exprimieren, schlugen fehl (Cosgrove et al., PNAS USA 94, 1997, 6559-6564; Grobe et al., Eur. J. Biochem. 263, 1999, 33-40).

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, ein Verfahren bereitzustellen, welches die Herstellung aktiver rekombinanter Expansine in Mikroorganismen erlaubt.

Überraschenderweise wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von Expansinen gefunden, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es

• a) das Kultivieren einer Wirtszelle, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für Expansine oder einen Vektor, umfassend eine Nukleinsäure kodierend für Expansine sowie eine damit funktionell verknüpfte Sequenz, welche die Expression der Nukleinsäure in der Wirtszelle gewährleistet, unter Be­ dingungen, die diese Expression gewährleisten und
• b) die Gewinnung der Expansine aus der Zelle oder dem Kulturmedium umfasst.

Unter dem Begriff Expansine sind gemäß der vorliegenden Erfindung alle Proteine zu verstehen, die strukturverändernde Aktivität gegenüber Polysacchariden zeigen ohne diese zu hydrolysieren. Sie bestehen aus einer Polypeptidkette mit einem Molekulargewicht von 25 bis 30 kDa, die mehr als 60% Sequenzähnlichkeit auf Aminosäureebene zum S1-Expansine der Gurke Cucumis sativus (SEQ ID NO: 1) besitzt.

Nukleinsäuren, die für Expansine kodieren sind alle, die für Proteine kodieren, die strukturverändernde Aktivität gegenüber Polysacchariden zeigen ohne diese zu hydrolysieren und aus einer Polypeptidkette mit einem Molekulargewicht von 25 bis 30 kDa bestehen, die mehr als 60% Sequenzähnlichkeit auf Aminosäureebene zum S1-Expansine der Gurke Cucumis sativus (SEQ ID NO: 1) besitzt. Vorzugsweise sind Nukleinsäuren, die für Expansine kodieren, diejenigen, die für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-4 kodieren.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Expansine können in der Form "reifer" Proteine oder als Teile größerer Proteine, z. B. als Fusionsproteine vorliegen. Weiterhin können sie Sezernierungs- oder "Leader"-Sequenzen, Pro- Sequenzen, Sequenzen, die eine einfache Reinigung ermöglichen, wie mehrfache Histidinreste oder zusätzliche stabilisierende Aminosäuren aufweisen, solange sie noch eine strukturverändernde Aktivität gegenüber Polysacchariden zeigen.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Proteine können auch nur Fragmente von Expansinen sein, solange sie eine strutcturverändernde Aktivität gegenüber Polysacchariden aufweisen.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Expansine können im Vergleich zu natürlich vorkommenden Expansinen Deletionen oder Aminosäure­ substitutionen aufweisen, solange sie zumindest eine strukturverändernde Aktivität gegenüber Polysacchariden aufweisen. Konservative Substitutionen sind bevorzugt. Solche konservativen Substitutionen umfassen Variationen, bei denen eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure aus der folgenden Gruppe ersetzt wird:

• 1. kleine aliphatische, nicht-polare oder wenig polare Reste: Ala, Ser, Thr, Pro und Gly;
• 2. polare, negativ geladene Reste und deren Amide: Asp; Asn, Glu und Gln;
• 3. polare, positiv geladene Reste: His, Arg und Lys;
• 4. große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val und Cys; und
• 5. aromatische Reste: Phe, Tyr und Trp.

Die folgende Liste zeigt bevorzugte konservative Substitutionen:

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls Vektoren, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für Expansirie, sowie für Proteine, die eine funktionell mit der Nukleinsäure verknüpfte Sequenz aufweisen, welche die Expression der Nukleinsäure in Mikroorganismen ermöglicht. Vorzugsweise werden Nukleinsäuren, kodierend für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-4 eingesetzt.

Bei den in den erfindungsgemäßen Vektoren enthaltenen Nukleinsäuren kodierend für Expansine (im folgenden Nukleinsäure genannt) handelt es sich insbesondere um einzelsträngige oder doppelsträngige Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Ribonukleinsäuren (RNA). Bevorzugte Ausführungsformen sind Fragmente genomischer DNA, die Introns enthalten können, und cDNAs. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist cDNA.

Bei den funktionell mit der Nukleinsäure verknüpften Sequenzen handelt es sich vorzugsweise regulatorische Sequenzen wie beispielsweise mindestens ein Promotor zur konstitutiven oder induzierbaren Expression oder auch Enhancer.

Bevorzugt sind Vektoren, die eine Expression der Nukleinsäure in Bakterien und Pilzen gewährleisten.

Besonders bevorzugt sind Vektoren, die eine Expression der Nukleinsäure in Bakterien, vorzugsweise Gram-negativen Bakterien ermöglicht.

Ganz besonders bevorzugt sind Vektoren, die eine Expression der Nukleinsäure in E. coli ermöglichen. Passende Promotoren zur Expression der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren Expansine in E. coli umfassen natürliche Hybrid- oder Bakteriophagenpromotoren. Bevorzugt handelt es sich dabei um Promotoren aus der Gruppe der λ-Promotoren, um omp-, lac-, trp- oder synthetische Promotoren (siehe auch WO 98/15625, DE-A-34 30 683, EP-A- 173 149). Geeignete Vektoren sind kommerziell erhältlich, beispielsweise die Vektoren der pET-Serie (beispielsweise pET3a, pET23a, pET28a mit His-Tag oder pET32a mit His-Tag) oder pGEX mit Glutathionsynthetase-Fusion.

Ganz besonders bevorzugt werden die Vektoren pProExHT (Gibco BRL) oder pASK-IBA3 (Institut für Bioanalytik, Göttingen) eingesetzt. Dabei handelt es sich um Vektoren, die eine induzierbare Expression der Expansine in E coli erlauben, wobei durch pProExHT die rekombinanten Expansine am N-Terminus mit einem 6-Histidin-Tag fusioniert werden und durch pASK-IBA3 am C-Terminus mit einem Streptavidin-Tag fusioniert werden.

Die Vektoren, die eine Expression der Nukleinsäure in E. coli ermöglichen, können dann beispielsweise in DE3-lysogene E. coli-Stämme, beispielsweise BL21(DE3), HM S 174(DE3) oder AD494(DE3) transformiert werden. Vorzugsweise werden sie in BL21(DE3) transformiert. Ganz besonders bevorzugt werden die Vektoren pProExHT und pASK-IBA3, die eine Expression der Nuldeinsäure ermöglichen, in BL21 (DE3) transformiert.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Wirtszellen von Mikro­ organismen, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für Expansine. Bevorzugt sind Wirtszellen von Mikroorganismen, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-4.

Die in der Wirtszelle enthaltene Nukleinsäure kodierend für Expansine, vorzugsweise kodierend für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-4 (im folgenden Nukleinsäure genannt) kann in das Genom der Wirtszelle insertiert sein oder in einem Vektor vorliegen. Vorzugsweise liegt die Nukleinsäure in einem Vektor, umfassend diese Nukleinsäure sowie damit funktionell verknüpfte Sequenz, welche die Expression der Nukleinsäure in der Wirtszelle ermöglicht, vor.

Vorzugsweise handelt es sich bei den Wirtszellen um eine Pilz- oder Bakterienzelle, wie beispielsweise Zellen von Gram-negativen Bakterien, Gram-positiven Bakterien, Hefen oder filamentösen Pilzen.

Bevorzugte Beispiele für Bakterien sind Streptomyces sp., Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens oder Pseudomonas Species. Besonders bevorzugt ist E. coli. Ganz besonders bevorzugt sind DE3-lysogene E. coli-Stämme, beispielsweise BL21(DE3), HM S 174(DE3) oder AD494(DE3).

Bevorzugte Beispiele für Hefen sind Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe.

Bevorzugte Beispiele für filamentöse Pilze sind Aspergillus Species.

Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Expansinen kann die Nukleinsäure kodierend für Expansine oder ein Vektor, enthaltend diese Nukleinsäure mit Hilfe von Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, in die geeignete Wirtszelle eingeschleust werden.

Die Kultivierung der transformierten Wirtszellen von Mikroorganismen kann in Komplexen oder mineralischen Medien bei den für den jeweiligen Mikroorganismus geeigneten Temperaturen erfolgen. Dabei werden die jeweiligen Mikroorganismen vorzugsweise zu hohen Zelldichten angezüchtet. Besonders bevorzugt erfolgt die Kultivierung der transformierten Mikroorganismen bis zur späten exponentiellen/ frühen stationären Phase.

Werden im erfindungsgemäßen Verfahren Vektoren verwendet, die eine Induktion der Expansinsynthese erfordern, so erfolgt die Induktion vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 1 und 30°C, besonders bevorzugt zwischen 4 und 28°C, ganz besonders bevorzugt zwischen 10 und 20°C.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Kultivierung der transformierten Mikroorganismen bis zur späten exponentiellen/frühen stationären Phase und die Induktion der Expansinsynthese wird vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 1 und 30°C durchgeführt.

Vorzugsweise erfolgt die Induktion der Expansinsynthese fir einen Zeitraum von 10 Minuten bis 48 Stunden, besonders bevorzugt von 20 Minuten bis 16 Stunden, ganz besonders bevorzugt von 30 Minuten bis 6 Stunden.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens erfolgt die Kultivierung der transformierten Mikroorganismen bis zur späten exponentiellen/frühen stationären Phase und die Induktion der Expansinsynthese vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 1 und 30°C für einen Zeitraum von 10 Minuten bis 48 Stunden.

Der Aufschluss der Wirtszellen findet vorzugsweise bei Temperaturen von 0 bis 30°C, bevorzugt bei 1 bis 25°C, besonders bevorzugt bei 4 bis 20°C statt. Dabei wird zum Schutz der rekombinanten Expansine vor proteolytischer Spaltung vorzugsweise ein Proteaseinhibitor zugesetzt.

Ganz besonders bevorzugt ist ein Verfahren zur Herstellung von Expansinen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass

• a) die Kultivierung von E. coli-Zellen enthaltend einen Vektor umfassend eine Nukleinsäure kodierend für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-4 sowie eine damit funktionell verknüpfte regulatorische Sequenz, welche die Expression der Nukleinsäure in E. coli gewährleistet, bis zur späten exponentiellen/frühen stationären Phase erfolgt,
• b) die Induktion der Expansinsynthese bei Temperaturen von 1 bis 30°C in einem Zeitraum von 10 Minuten bis 48 Stunden erfolgt und
• c) die Gewinnung der Expansine durch Aufschluss der Zellen bei Temperaturen von 0 bis 30°C, vorzugsweise bei 1 bis 25°C, besonders bevorzugt bei 4 bis 20°C erfolgt.

Zum Schutz der rekombinanten Expansine vor proteolytischer Spaltung wird bei der Gewinnung der Expansine durch Aufschluss der Zellen vorzugsweise ein Proteaseinhibitor zugesetzt.

Die Analyse der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Expansine kann beispielsweise durch Westernblot erfolgen. Dabei können die rekombinanten Expansine beispielsweise über fusionierte Tags nachgewiesen werden.

Um die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Expansine auf ihre Löslichkeit zu überprüfen können die Rohextrakte oder Überstände, die durch Zentrifugation der Rohextrakte erhalten werden können, im SDS-PAGE elektrophoretisch aufgetrennt werden.

Handelt es sich bei den im erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Expansine um Fusionsproteine, so können diese beispielsweise affinitätsgereinigt werden.

Bei den im erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Expansine kann ein Nachweis der Aktivität durch alle Methoden und Techniken erfolgen, mit denen man eine strukturverändernde Wirkung an Polysacchariden messen kann. Geeignet sind insbesondere Verfahren zur Bestimmung der Festigkeit von Papieren, Baumwollfäden oder anderen cellulosehaltigen oder hemicellulosehaltigen Materialien, oder Verfahren zur Bestimmung der zum Zerreißen von Papier, Baumwollfäden oder anderen cellulosehaltigen oder hemicellulosehaltigen Materialien nötigen mechanischen Energie. Auch die in McQueen-Mason and Cosgrove, PNAS USA 91, 1994, 6574-6578 und McQueen-Mason et al., Planta 4, 1992, 1425-1433 beschrieben Verfahren eignen sich zum Nachweis der Aktivität.

Zum besseren Verständnis soll die Bedeutung bestimmter Wörter und Begriffe, die in der Beschreibung, den Beispielen und angefügten Ansprüchen verwendet werden, im folgenden näher erläutert werden.

Der Begriff "Fragmente" in Bezug auf Proteine und DNA beschreibt Teile von Expansinen oder Teile der unter der SEQ ID NO. 1-4 beschriebenen Nukleinsäure bzw. Aminosäuresequenz, welche zumindest eine strukturverändernde Aktivität gegenüber Polysacchariden aufweisen.

Der Begriff "Vektor" beschreibt ein DNA-Element, das zum Einbringen exogener Nukleinsäuren in Wirtszellen verwendet wird. Ein Vektor enthält eine Nukleinsäuresequenz, die für ein oder mehrere Polypeptide kodiert. Vektoren, die in der Lage sind, die Expression der Gene zu steuern, die sie enthalten, werden auch als "Expressionsvektoren" bezeichnet.

Der Begriff "Nukleinsäure" bezieht sich auf Polynukleotide wie Desoxyribonuklein­ säuren (DNA) oder, falls angebracht, auf Ribonukleinsäuren (RNA). Der Begriff umfasst auch in äquivalenter Weise Analoga von RNA oder DNA, die aus Nukleotidanaloga hergestellt werden, sowie im zutreffenden Fall einzelsträngige ("Sense" oder "Antisense") und doppelsträngige Polynukleotide.

Der Begriff "Promotor" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, welche die Expression einer bestimmten DNA regulieren, die funktionell mit dem Promotor verknüpft sind. Der Begriff umfasst auch "gewebsspezifische" Promotoren, d. h. Promotoren, die die Expression der spezifischen DNA nur in bestimmten Zellen (beispielsweise Zellen eines bestimmten Gewebes) steuern. Ebenso umfasst sind "gewebsunspezifsche" Promotoren und Promotoren, die zu einer konstitutiven Expression führen oder induzierbar sind.

Ein "Fusionsprotein" ist eine Fusion einer ersten Aminosäuresequenz kodierend für eines der vorstehend beschriebenen Expansine mit einer zweiten Aminosäure­ sequenz, die keine Gemeinsamkeit oder grundlegende Homologie zur Expansin- Sequenzen hat. Die zweite Aminosäuresequenz kann dabei aus demselben Organismus stammen wie die erste, oder alternativ aus einem anderen Organismus stammen (intergenisch). Im allgemeinen kann ein Fusionsprotein anhand der Formel X-Expansin-Y wiedergegeben werden. X und Y stehen für ein Polypeptid, das nicht in Zusammenhang mit einer Expansin-Aminosäuresequenz steht. X oder Y können jeweils unabhängig voneinander abwesend sein.

Die Begriffe "Zelle" oder "Wirtszelle" können im Rahmen der hier vorliegenden Anmeldung im gleichen Sinne verwendet werden. Es versteht sich, dass diese Begriffe sich nicht nur auf eine einzelne Zelle, sondern auch auf die Nachkommen einer solchen Zelle beziehen. Aufgrund bestimmter Modifikationen im Verlauf folgender Generationen (z. B. Mutationen), sind solche Nachkommen möglicherweise nicht mit der Stammzelle identisch, sind allerdings von der vorliegenden Erfindung mit umfasst.

Der Begriff "Intron" beschreibt solche Sequenzen der beschriebenen, vorzugsweise genomischen DNA, die transkribiert, dann aber aus dem Transkript durch soge­ nanntes "Splicing" entfernt werden, wobei die angrenzenden Sequenzen (Exons) verknüpft werden.

Nukleinsäuren

Für Expansine kodierende Nukleinsäuren, wie vorstehend beschrieben, können ausgehend von mRNA gewonnen werden, die in Pflanzenzellen vorliegt. Es ist auch möglich, die erfindungsgemäße DNA ausgehend von genomischer DNA aus den betreffenden Pflanzenzellen zu erhalten. Ein für ein Expansin kodierendes Gen kann beispielsweise aus einer cDNA- oder einer genomischen DNA-Bibliothek gewonnen werden. cDNA kann erhalten werden, indem man die gesamte mRNA einer Zelle isoliert. Ausgehend von der mRNA kann dann doppelsträngige cDNA hergestellt werden und in ein passendes Expressionskonstrukt oder einen passenden Vektor insertiert werden. Die für das erfindungsgemäße Verfahren notwendige DNA kann auch erhalten werden durch Amplifikation mit Hilfe der bekannten Polymerase- Kettenreaktion (PCR) oder auch durch de novo-DNA-Synthese (siehe auch J. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, 2. Auflage, Kap. 14).

Vektoren

Die vorliegende Erfindung umfasst auch Vektoren, die eine Nukleinsäure kodierend für Expansine, vorzugsweise kodierend für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-4, enthalten, die funktionell mit einer regulatorischen Seqzenz verknüpft sind. "Funktionell verknüpft" bedeutet, dass die Nukleinsäuresequenz in einer Weise mit der regulatorischen Sequenz verknüpft ist, dass die Expression des von der Nukleinsäuresequenz kodierten Proteins gesteuert werden kann. "Regulatorische Sequenzen" umfassen beispielsweise Promotoren, Enhancer und andere Kontrollelemente. Die Vektoren enthalten beispielsweise ein Gen kodierend für ein Expansin oder Fragmente davon. Diese Vektoren können verwendet werden, um in Zellen eingebracht zu werden, wo dann die entsprechenden Expansine oder auch Fusionsproteine davon entstehen. Die Transformation kann mit dem Fachmann bekannten Methoden wie Ionen-vermittelte Transformation, Elektrotransformation oder Transfektion durchgeführt werden.

Expression der Expansine

Die vorliegende Erfindung umfasst auch Wirtszellen von Mikroorganismen, die eine Nukleinsäure kodierend für Expansine, vorzugsweise kodierend für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-4, enthalten (z. B. in einem Vektor, einem Expressionskonstrukt oder in das Genom insertiert). Geeignete Mikroorganismen sind beispielsweise Bakterien, Hefen oder filamentöse Pilze.

Die grundlegenden Schritte zur Herstellung rekombinanter Expansine sind:

• 1. Gewinnung einer natürlichen, synthetischen oder semi-synthetischen DNA, die für Expansine im Sinne der Erfindung kodiert.
• 2. Einbringen dieser DNA in ein Expressionskonstrukt oder einen Vektor, der geeignet ist, Expansine zu exprimieren, entweder alleine oder als Fusions­ proteine.
• 3. Transformation einer passenden Wirtszelle eines Mikroorganismus mit diesem Expressionskonstrukt oder Vektor.
• 4. Anzucht dieser transformierten Wirtszelle in einer Weise, die geeignet ist, Expansine zu exprimieren.
• 5. Aufreinigung der aus den Zellen oder aus dem Kulturmedium gewonnenen Expansine durch geeignete, bekannte Methoden.

Zum Beispiel können Vektoren, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für Expansine in λDE3-lysogene E. coli-Stämme, z. B. BL21 (DE3), HM S 174(DE3) oder AD494(DE3) transformiert werden. Nach dem Anwachsen der Zellen wird die Expression mit IPTG induziert. Nach einer Inkubationszeit werden die Zellen aufgeschlossen, das exprimierte Protein über chromatographische Methoden gereinigt, im Fall von mit His-Tag exprimiertem Protein durch FPLC an einer Ni- NTA-Säule, im Fall von mit Streptavidin-Tag exprimiertem Protein an einer Biotin- Säule, sowie durch Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Ultrafiltration, Elektrophorese oder auch Imrnunoaffinitäts-Aufreinigung, die für die Expansine spezifisch sind.

Homologe oder Fragmente der im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Expansine können durch Mutagenese generiert werden, wie beispielsweise durch gerichtete (Punkt-)Mutagenese, oder durch Deletionen.

Bei der Expression der Expansine gemäß der vorliegenden Erfindung kann es von Vorteil sein, bestimmte Kodons zu verändern, um eine optimale Expression zu er­ möglichen. Dies gilt dann, wenn die Verwendung bestimmter Kodons ("Codon usage") im heterologen Expressionssystem anders ist als in Pflanzen. Weiterhin ist die Deletion der 5'- oder 3'-untranslatierten Region möglich, beispielsweise wenn mehrere destabilisierende Sequenzmotive (z. B. ATTTA) in der 3'-Region der cDNA vorliegen.

Fusionsproteine

Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Expansine können auch als Teil eines Fusionsproteins vorliegen. Solche Fusionsproteine werden von der vorliegenden Erfindung voll umfasst. Fusionsproteine erleichtern unter bestimmten Umständen die Expression eines Proteins. Zum Beispiel können die Expansine als Glutathione-S-Transferase (GST-) Fusions-Proteine hergestellt werden. Solche GST- Fusions-Proteine ermöglichen eine leichte Aufreinigung des Proteins (siehe z. B. Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. (John Wiley & Sons, N. Y. 1991). Fusionsproteine können z. B. eine "Leader"-Sequenz enthalten, die der Aufreinigung dient, z. B. erlaubt eine Poly-Histidin-Sequenz am N-Terminus (aber auch am C-Terminus) des Proteins dessen Aufreinigung mittels Chromatographie an einer Ni²⁺-NTA-Säule (siehe z. B. Hachuli et al. (1987) J. Chromatography 411, 177).

Techniken zum Herstellen solcher Fusionsproteine sind dem Fachmann geläufig.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren rekombinanten Expansine können aufgrund ihrer strukturverändernden Aktivität gegenüber Polysacchariden, insbesondere gegenüber Cellulose und Hemicellulose, beim Recyclen von Papier eingesetzt werden. Darüber hinaus können sie zur Herstellung von Pulpe aus pflanzlichem Gewebe eingesetzt werden und so zur Substitution von aggressiven Chemikalien bei der Papierherstellung dienen.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren rekombinanten Expansine können aufgrund ihrer strukturverändernden Aktivität gegenüber Polysacchariden, insbesondere gegenüber Cellulose und Hemicellulose, auch bei der Herstellung, Behandlung und Veredelung von auf Cellulose basierenden Textilien, wie beispielsweise Baumwolle, eingesetzt werden.

Beispiele Beispiel 1 PCR-Klonierung von Expansingenen

Alle Expansingene wurden unter Verwendung der PCR-Methode entweder aus selbst angefertigten oder aus kommerziell erworbenen cDNA-Banken amplifiziert. Die publizierten Originalsequenzen, die zur Amplifikation verwendeten Primer und die amplifizierten Expansingene sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

1.1 Anlegen einer cDNA Bank aus Gurkenkeimlingen

Samen der Gurkensorte Cucumis sativus Sorte euphya (Enza Zaden, Niederlande) wurden in Glasschalen auf befeuchtetem Filterpapier bei 25°C dunkel inkubiert. Nachdem die Wurzelen der Keimlinge eine Länge zwischen 2 bis 6 cm erreicht hatten, wurden sie abgetrennt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert.

Die gesamte RNA wurde nach der Phenol/SDS-Methode zur Isolierung von pflanzlicher RNA (Ausubel et al., 1994) aus 3 g der eingefroren Keimlingswurzeln isoliert.

Aus der Gesamt-RNA wurde die Poly(A)⁺ RNA unter Verwendung des "mRNA direct kit" (Dynal, Hamburg) isoliert. Mithilfe des "superscript preamplification systems" (Gibco BRL Life Technologies, Heidelberg) erfolgte die Erststrang- Synthese der cDNA auf Basis der an magnetischen "Beads" gebundenen Poly(A)⁺ RNA ebenfalls nach Vorschrift der Hersteller.

1.2 Amplifikation der Expansingene

Aus den kommerziell erworbenen cDNA-Banken wurden 10⁶ pfu (plaques forming units) zu 5 µl High-Fidelity-Puffer (Gibco BRL LifeTechnologies, Heidelberg) pipettiert und für 30 min bei 70°C inkubiert, um die in Phagen verpackte c-DNA als Template für die PCR freizusetzen. Im Fall der Gurken-cDNA-Bank wurden 80 µg der an den Beads gebundenen cDNA mit 5 µl High-Fidelity-Puffer (Gibco BRL LifeTechnologies, Heidelberg) vermischt und ohne vorherige Inkubation bei 70°C als Template verwendet.

Den Ansätzen wurden 0,2 mM dNTPs (Clontech Laboratories GmbH, Heidelberg), 1 mM MgSO₄, 0,2 µM Primer forw/rev (Sequenz siehe unten), weitere 0,5 µl High- Fidelity-Polymerase (Gibco BRL LifeTechnologies, Heidelberg) und H₂O ad 50 µl zugesetzt. In einem T3 Thermocycler der Firma Biometra, Göttingen erfolgte die Amplifikation nach folgendem Temperaturprogramm:

Verwendete Primer

No.2: forward primer csexp01
5'-ttcttctttgtcttcaccgaattcgactacggtggctggcag-3'
No.3: reverse primer csexp01
5'-gcagtgtggctgatgcggccgcgaattgagggccttcatagg-3'
No.4: forward primer leexp03
5'-ttactaacactcacactggaattcacattctcactagctcac-3'
No.5. reverse primer leexp03
5'-tcaaggaaggtccagagcggccgccgattcgaactgcttacc-3'
No.6: forward primer ntexp04
5'-gcaatggtctcatcagttgaattctatggtggaggaggttgg-3'
No.7: reverse primer ntexp04
5'-atattaaatgcttgagcaggcggccgcctgcaggtggaattgagctccagtata-3'

Die PCR-Produkte wurden mit Hilfe des "TOPO TA Cloning Kits" (Fa. Invitrogen, Leek, Niederlande) in den pCR2.1-TOPO-Vektor kloniert und in kompetente E. coli DH12S-Zellen (Gibco BRL LifeTechnologies, Heidelberg) elektrotransformiert. Im Anschluß wurden die Hybridplasmide mithilfe des "QIAprep Spin Miniprep Kits" (Qiagen, Hilden) aus den entsprechenden E. coli DH12S-Klonen isoliert.

Die im pCR2.1-TOPO-Vektor inserierten Expansingene wurden unter Verwendung der vom Hersteller empfohlenen Primer sequenziert und mit den Literaturdaten verglichen. Die Sequenz-Analyse ergab für das Tomatenexpansin die identische Sequenz (leexp3, SEQ ID NO: 3) und für das Gurkenexpansin (csexpla, SEQ ID NO: 2) eine Sequenz, die gegenüber der publizierten Sequenz drei stille Mutationen aber keine Änderung der Aminosäuresequenz aufwies. Im Fall des Tabakexpansins (ntexp4a, SEQ ID NO: 4) wurde ein Gen identifiziert, das gegenüber der publizierten Sequenz 14 Mutationen und 2 Aminosäureaustausche besitzt.

Beispiel 2 Klonierung der Expansingene in Expressionsvektoren

Zur Überführung in die Expressionsvektoren wurden die amplifizierten Expansingene durch Restriktionsverdau aus den pCR2.1-TOPO-Vektoren ausgeschnitten, in Agarosegel aufgetrennt und mit Hilfe des "QIAEX II Agarose Gel Extraktion Kits" (Qiagen, Hilden) aus dem Agarosegel isoliert. In einer weiteren Ligationsreaktion wurden sie als EcoRI-NotI-Fragmente in den pProExHTaS-Vektor (Gibco LifeTechnologies, selbst modifiziert) und als EcoRI-XhoI-Fragmente in den pASK-IBA3-Vektor (Institut für Bioanalytik, Göttingen) inseriert. Da der Zielvektor pASK-IBA3 keine NotI-Schnittstelle enthält, wurden die Expansinegene vor ihrer Klonierung in den pASK-IBA3-Vektor als EcoRI-NotI-Fragmente aus dem pProExHTaS-Vektor ausgeschnitten, in den pProEXHtEXb-Vektor (Gibco BRL LifeTechnologies) subkloniert und als EcoRI-XhoI-Fragmente erneut ausgeschnitten. Der pProExHTaS-Vektor unterscheidet sich von pProExHTa-Vektor dadurch, dass von Position 396 bis 401 zwei zusätzliche Stop-Codons eingebaut wurden. Die Originalsequenz-tcgaat- wurde zu -gactga- geändert.

Alle Expressionsvektoren wurden in kompetente E. coli BL21(DE3)-Zellen (Stratagene, La Jolla, CA, USA) transformiert. Durch Klonierung in den pProExHT- Vektor wurden die rekombinanten Proteinen am N-Terminus mit einem 6-Histidin- Tag und durch Klonierung in den pASK-IBA3-Vektor am C-Terminus mit einem Streptavidin-Tag fusioniert (siehe Skripten der Hersteller).

Beispiel 3 Expression der Expansine in E. coli.

Zur Expression der Expansine wurden die rekombinanten E. coli-Stämme in LB- Medium mit 100 µg/ml Ampicillin bei 37°C angezogen. Das Wachstum der Kulturen wurde durch Bestimmung der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD₆₀₀) verfolgt. Nach erreichen einer OD₆₀₀ von 5 erfolgte die Induktion der Expansinsynthese durch Zugabe von 1 mM IPTG (pProExHT-Vektor) bzw. 2 mg/l Anhydrotetracyclin (pASK-IBA3-Vektor). Die Expressionskulturen wurden für 4 h bei 20°C inkubiert und anschließend durch Zentrifugation bei 6000 x g und 4°C für 15 min sedimentiert. Nach Aufnahme des Pellets in 1/100 Volumen Lysispuffer (100 mM TrisHCl pH 8, 1 mM EDTA) erfolgte der Zellaufschluss durch eine Ultraschallbehandlung bei 4°C. Zum Schutz vor proteolytischer Spaltung der rekombinanten Expansine wurde dem Lysispuffer 0,4 mg/ml des Proteaseinhibitors Pefabloc SC (Fa. Boehringer, Mannheim) zugesetzt.

Um die rekombinanten Proteine auf ihre Löslichkeit zu überprüfen wurden die Rohextrakte und ihre klaren Überstände im SDS-PAGE elektrophoretisch aufgetrennt. Die klaren Überstände wurde durch eine Zentrifugation der Rohextrakte für 30 min bei 16.000 x g und 4°C hergestellt.

Im Westerblot wurden die rekombinanten Expansine über ihre Fusionanteile nachgewiesen. Die Detektion der 6-His-Tag-gekoppelten Proteine erfolgte unter Verwendung eines monoklonalen ANTI-polyHISTIDINE Clone His-1 Antikörpers (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) und eines mit einer Alkalischen Phosphatase gekoppelten ANTI-MOUSE IgG Antikörpers (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA). Die Strep-tag-gekoppelten Proteine wurden über ein "streptavidin alkaline phosphatase conjugate" (Institut für Bioanalytik, Göttingen) detektiert. Die Detektion erfolgte nach den Angaben der Hersteller.

Alle drei Gene konnten unter den beschriebene Bedingungen zu löslichen rekombinanten Proteinen exprimiert werden, die sich im Westernblot aufgrund eindeutiger Signale auf Höhe der erwarteten Molekulargewichte identifizieren ließen (Csexp01a: 27,5 kDa; Leexp03 : 30,5 kDA, Ntexo04a: 27,5 kDA).

Beispiel 4 Änderung der Festigkeit von Papier durch rekombinantes Tomatenexpansin

Das in den pASK-IBA 3-Expressionsvektor klonierte Gen des Tomatenexpansins wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, in E. coli BL21(DE3) exprimiert. Die Zellen wurden sedimentiert und im 1/100 Vol. Lysispuffer resuspendiert.

Nach Ultraschall-Lyse wurden die unlöslichen Bestandteile des Rohextraktes durch Zentrifugation (16.000 x g, 30 min. 4°C) abgetrennt und der lösliche Überstand mit einer Celluloseester-Membran (Spectra/Por CE, MWCO: 10.000, Spectrum Medical Industries Inc., Houston, Texas, USA) 4 h bei 4°C gegen 50 mM Natrium-Acetat- Puffer pH 4, 5 dialysiert.

Vier 1,5 × 4 cm messende Papierstreifen (Whatman No. 3, Whatman International Ltd., Maidstone, England) wurden jeweils zwischen zwei Edelstahlklammern gespannt, mit einem 100-g-Gewicht beschwert und in mit 50 mM Natrium-Acetat- Puffer pH 4,5 gefüllte 50-ml-Meßzylindern gehangen. Nachdem die Streifen 2 h gehangen hatten, wurde in zwei Ansätze 5 ml des dialysierten löslichen Rohextraktes zugegeben. Zur Kontrolle wurde den anderen beiden Ansätzen die gleiche Menge Natrium-Acetat-Puffer pH 4,5 zugesetzt. Der Einfluss des Proteinzusatzes auf die Festigkeit der Papierstreifen wurde 3 h lang beobachtet. In den beiden mit dialysiertem löslichen Rohextrakt beschickten Ansätzen rissen die Papierstreifen nach 58 bzw. 65 Minuten ab, während sie in den Kontrollansätzen noch länger als 3 h stabil hängen blieben. Der Einsatz von löslichen Rohextrakten aus Kulturen, in denen für den Vektor pProExHt-CAT (Gibco BRL LifeTechnologies, Heidelberg) eine Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT) exprimiert worden war (Kontroll­ experiment), zeigte ebenfalls keine Veringerung der Papierfestigkeit.

Beispiel 5 Affinitätsreinigung des rekombinanten Tomatenexpansins

Der Stamm E. coli BL21(DE3) mit dem Expressionsvektor pASK-IBA3 : leexp3 wurde bei 37°C in 2,4 Liter LB Medium in Gegenwart von 100 µg/ml Ampicillin angezogen. Nach Erreichen einer OD₆₀₀ von 5 wurde die Inkubationstemperatur auf 20°C gesenkt und die Synthese des rekombinanten Tomatenexpansins durch Zugabe von 2 mg/l Anhydrotetrazyklin (AHT) induziert. Nach weiteren 4 h wurden die Zellen durch Zentrifugation sedimentiert, in 1/100 Volumen Lysispuffer resuspendiert und mittels Ultraschallbehandlung aufgeschlossen.

Nicht lösliche Bestandteile wurden durch Zentrifugation für 30 min bei 4°C und 16.000 x g abgetrennt. Aus dem löslichen Überstand des Rohextrakts wurde das rekombinante Protein mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt. Dazu wurde das "Strep-tag II-System" (Institut für Bioanalytik, Göttingen) verwendet. Die Durchführung erfolgte nach den Protokoll des Herstellers. Der Proteingehalt der einzelnen Fraktionen wurde mit dem BIO-RAD PROTEIN ASSAY, (BIO-RAD Laboratories, München) gemessen.

Nach SDS-PAGE- und Westernblot-Analyse wurden in 4 Fraktionen Signale identifiziert, die dem erwarteten Molekulargewicht des Tomatenexpansins von 30,5 kDa zuzuordnen waren.

Beispiel 6 Einfluß des rekombinanten affinitätsaufgereinigten Tomatenexpansins auf die Festigkeit von Papier

Um den Einfluss des rekombinanten und mittels Affinitätschromatographie gereinigten Tomatenexpansins (siehe Beispiel 5) messen zu können, wurde das Spannungs-Dehnung-Profil von Papier (Whatman No. 3, Whatman International Ltd., Maidstone, England) nach der modifizierten DIN 53455 aufgenommen. Abweichend von der DIN 53455 wurde in Flüssigkeit getränktes Papier verwendet. Das Papier wurde in Streifen des Formats "Probekörper 3" ausgestanzt.

Das Spannungs-Dehnungs-Profil wurde mit einer Universal Prüfmaschine Typ 1455 (Zwick GmbH, Ulm) aufgenommen. Die Papierstreifen wurden mit einer Geschwindigkeit von 0,5 mm/min über eine Stecke von 7,5 cm gedehnt, wobei die angelegte Spannung σ in N/mm² und die Dehnung ε in % der Streifenlänge gemessen wurden. Zur Auswertung wurde die auf die Fläche bezogene mechanische Energie herangezogen (ME [mm*MPa]), die aufgewendet werden musste, um das Papier zu zerreißen. Diese Größe charakterisiert die Festigkeit des Papiers und errechnet sich aus dem Integral der Spannungs-Dehnungs-Funktion.

Vier Ansätze mit je vier Papierstreifen wurden in Glasschalen gelegt. Bezogen auf je einen Streifen wurde das Papier mit den nachfolgend aufgeführten Lösungen befeuchtet, bevor die Ansätze mit 80 ml 50 mM Natrium-Acetat-Puffer pH 4,5 aufgefüllt und 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Im Anschluss daran wurde das Spannungs-Dehnungs-Profils aufgenommen. Neben dem affinitätsgereinigten und in Elutionspuffer (Skript zum Strep-tag II-System, Institut frr Bioanalytik, Göttingen) gelösten Tomatenexpansin wurde als Kontrolle ebenfalls in Elutionspuffer gelöstes Rinderserumalbumin (BSA; Boehringer, Mannheim) sowie reiner Elutionspuffer eingesetzt.

Ansatz 1 (erfindungsgemäß): 650 µl (0,4 ml 500 mM Natriumacetat pH 4, 5 + 1,0 ml Elutionspuffer + rekombinates, affinitätsgereinigtes Tomatenexpansin, Gesamtproteingehalt 1,5 mg)
Ansatz 2 (Kontrolle): 650 µl (0,4 ml 500 mM Natriumacetat pH 4, 5 + 1,0 ml Elutionspuffer)
Ansatz 3 (Kontrolle): 650 µl (0,4 ml 500 mM Natriumacetat pH 4, 5 + 1,0 ml Elutionspuffer + Rinderserumalbumin, Gesamtprotein­ gehalt 2,0 mg))

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt

Tabelle 2

Einfluss von affinitätsgereinigtem rekombinantem Tomatenexpansin auf die Festigkeit von Papier

Die Ergebnisse der beiden Versuche zeigen, dass rekombinantes Tomatenexpansin die Festigkeit des Papier beeinflusst, während BSA selbst in hohen Konzentrationen keine signifikante Wirkung ausübt.

Literatur

Ausubel et al., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, New York
McQueen-Mason and Cosgrove, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol 91, pp. 6574-6578, 1994
McQueen-Mason et al., (1992) Plant Cell Vol. 4, pp. 1425-1433
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Cosgrove et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol 94, pp. 6559-6564 US-Patent, No. 5,959,082
McQueen-Mason and Rochange, (1999) Plant BioL, pp. 19-25
Grobe, et al. (1999) Eur. J. Biochem. Vol. 263, pp. 33-40
Hachuli et al. (1987) J. Chromatography 411, 177

Sequenzprotokoll

Claims (25)

1. Vektoren, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für Expansine sowie eine funktionell damit verknüpfte Sequenz, welche die Expression der Nukleinsäure in Mikroorganismen ermöglicht.

2. Vektoren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-4 kodiert.

3. Vektor gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mit der Nukleinsäure funktionell verknüpfte Sequenz eine regulatorische Sequenz ist.

4. Vektor gemäß einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass er die Expression der Nukleinsäure in Bakterien oder Pilzen ermöglicht.

5. Vektor gemäß einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass er die Expression der Nukleinsäure in E. coli ermöglicht.

6. Vektor gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um pProExHT oder pASK-IBA3 handelt.

7. Wirtszelle eines Mikroorganismus, enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für Expansine oder einen Vektor gemäß Anspruch 1.

8. Wirtszelle gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäure kodierend für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-4 oder einen Vektor gemäß Anspruch 2 enthält.

9. Wirtszelle nach Anspruch 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus um einen Mikroorganismus aus der Reihe Bakterien und Pilze handelt.

10. Wirtszelle nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus um E. coli handelt.

11. Wirtszelle gemäß Anspruch 10 enthaltend einen Vektor aus der Reihe pProExHT und pASK-IBA3, umfassend eine Nukleinsäure kodierend für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-4 sowie eine funktionell damit verknüpfte regulatorische Sequenz, welche die Expression der Nukleinsäure in E coli-Zellen ermöglicht.

12. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Expansinen, dadurch gekennzeichnet, dass es

• a) das Kultivieren einer Wirtszelle enthaltend eine Nukleinsäure kodierend Expansine oder einen Vektor, umfassend eine Nukleinsäure kodierend für Expansine sowie eine damit funktionell verknüpfte Sequenz, welche die Expression der Nukleinsäure in der Wirtszelle gewährleistet, unter Be­ dingungen, die diese Expression gewährleisten und
• b) die Gewinnung des Expansines aus der Zelle oder dem Kulturmedium umfasst.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Nukleinsäure kodierend für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-4 ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass Vektoren gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 eingesetzt werden.

15. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle eine Wirtszelle gemäß den Ansprüchen 7 bis 9 ist.

16. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 12 bis 15. dadurch gekennzeichnet, dass als Wirtszellen E. coli-Zellen eingesetzt werden.

17. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der vorangegangenen Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung der Wirtszellen bis zur späten exponentiellen/frühen stationären Phase erfolgt.

18. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der vorangegangenen Ansprüche 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass ein induzierbarer Vektor eingesetzt wird und die Induktion der Expansinsynthese bei Temperaturen von 1 bis 30°C erfolgt.

19. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung der Wirtszellen bis zur späten exponentiellen/frühen stationären Phase erfolgt.

20. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der vorangegangenen Ansprüche 18 und 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Induktion in einem Zeitraum von 10 Minuten bis 48 Stunden erfolgt.

21. Verfahren gemäß einem oder mehrerer der vorangegangenen Ansprüche 12 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewinnung der rekombinanten Expansine durch Aufschluss der Wirtszellen erfolgt.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Aufschluss der Wirtszellen bei einer Temperatur von 0 bis 30°C erfolgt.

23. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Expansinen, dadurch gekennzeichnet, dass

• a) die Kultivierung von E. coli-Zellen enthaltend einen induzierbaren Vektor umfassend eine Nukleinsäure kodierend für ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1-4 sowie eine damit funktionell verknüpfte regulatorische Sequenz, welche die Expression der Nukleinsäure in E. coli gewährleistet, bis zur späten exponentiellen/frühen stationären Phase erfolgt,
• b) die Induktion der Expansinsynthese bei Temperaturen von 1 bis 30°C in einem Zeitraum von 10 Minuten bis 48 Stunden erfolgt und
• c) die Gewinnung der Expansine durch Aufschluss der Zellen bei Temperaturen von 0 bis 30°C erfolgt.

24. Rekombinante Expansine, herstellbar nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 12 bis 23.

25. Verwendung von rekombinanten Expansinen bei der Herstellung, Behandlung und Veredelung von auf Cellulose basierenden Textilien.