DE69432427T2

DE69432427T2 - Tomate xyloglukan endotransglykosylase

Info

Publication number: DE69432427T2
Application number: DE69432427T
Authority: DE
Inventors: Jacqueline De Silva; Sally-Anne Whiteman; Susan Amanda Hellyer; David Andrew Arrowsmith
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1993-11-10
Filing date: 1994-11-10
Publication date: 2004-03-18
Anticipated expiration: 2014-11-11
Also published as: HUT74598A; SK57696A3; EP0728208A1; AU698844B2; ES2196048T3; JPH09511121A; HU9601232D0; EP0728208B1; AU8112994A; DE69432427D1; WO1995013384A1; CZ136196A3; GB9323225D0; PT728208E; DK0728208T3; CA2176133A1; ATE236256T1; US6215044B1; PL317046A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Nucleotid-Sequenzen, die ein Pflanzenenzym kodieren, Vektoren, die die Nucleotid-Sequenzen enthalten, Wirtszellen, die die Nucleotid-Sequenzen enthalten, Aminosäure-Sequenzen, die durch die Nucleotid-Sequenzen kodiert werden, rekombinante DNA-Verfahren zum Herstellen von Enzymen und ein Verfahren zur Veränderung der Eigenschaften einer Pflanze.
Hintergrund der Erfindung
Zellwände von Früchten und Gemüsen bestehen hauptsächlich aus Polysaccharid, dessen Hauptkomponenten Pektin, Cellulose und Xyloglucan sind (Selvendran & Robertson, IFR Report 1989). Viele Zellwand-Modelle sind vorgeschlagen worden, die versuchen, die essentiellen Eigenschaften der Stärke und Flexibilität zu berücksichtigen (z. B. Albersheim, 1975, Sci. Am., 232, 81–95; Albersheim, 1976, "The primary cell wall", Plant Biochemistry, 3. Ausgabe, Academic Press; und Hayashi, 1989, Ann. Rev. Plant Physiol. & Plant Mol. Biol. 40, 139–168).
Xyloglucane sind 1,4-β-Glucane, die stark mit α-1,6-Xylosyl-Seitenketten substituiert sind, wobei einige von diesen 1,2 β-galactosyliert sind. Sie werden in großer Anzahl in den primären Zellwänden von Dicotylen aber auch in bestimmten Samen gefunden, wo sie verschiedene Aufgaben erfüllen.
Primäres Zellwand-Xyloglucan ist eng über Wasserstoff-Brückenbindungen an Cellulosemikrofibrilen gebunden und erfordert konzentrierte Alkalien oder stark quellende Mittel, um es freizusetzen. Man glaubt, dass Xyloglucan Brückenbindungen zwischen Cellulosemikrofibrilen bildet, wobei das Cellulose/Xyloglucan-Netzwerk den Hauptteil des belastungsfähigen/elastischen Netzwerks der Wand bildet. DCB-mutierte Suspensionskulturzellen (Zellwände ohne Cellulose) setzen Xyloglucan in ihr Medium frei, was es wahrscheinlich erscheinen lässt, dass Xyloglucan im Normalfall eng an Cellulose gebunden ist.
Die Hydrolyse von primären Zellwand-Xyloglucan ist in Segmenten von im Dunkeln gewachsenen zerquetschten Hypokotylen während des IAA-induzierten Wachstums gezeigt worden (Wakabayashi et al., 1991, Plant Physiol. 95, 1070–1076). Die Endohydrolyse von Wand-Xyloglucan wird so aufgefasst, dass sie zur Wandablösung beiträgt, die mit der Zellexpansion einhergeht (Hayashi, vorhergehend zitiert). Man hat darüber hinaus gezeigt, dass das durchschnittliche Molekulargewicht von Xyloglucan während der Reifung der Tomatenfrucht abnimmt und dies kann zur Gewebeerweichung beitragen, die den Reifungsprozess begleitet (Huber, 1983, J. Amer. Soc. Hort. Sci., 108, 405–409).
Bestimmte Samen, z. B. Nasturtium, enthalten bis zu 30 Gew.-% Xyloglucan, abgelagert in verdickten Keimblattzellwänden, das als Reserve-Polysaccharid dient und während der Keimung schnell depolymerisiert wird.
Eine Endo-1,4 β-D-glucanase, die spezifisch auf Xyloglucan wirkt (d. h. Xyloglucanase), ist aus keimendem Nasturtium(Tropaeolum majus L.)-Samen isoliert und bis zur anschei nenden Homogenität gereinigt worden (Edwards et al., 1986, J. Biol. Chem., 261, 9494).
Die gereinigte Xyloglucanase ergibt eine einzelne Polypeptid-Bande in der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (anscheinendes Molekulargewicht 29–31 kDa) und eine isoelektrische Fokussierung (isoelektrischer Punkt, 5,0). Das Enzym zeigt eine absolute Spezifizität für Xylogluan und eine Wirkung im Endo-Mode, wie bestimmt durch eine End-Produkt-Analyse nach der Hydrolyse von Xyloglucan aus Tamarindensamen (Wakabayashi et al., oben zitiert). Obwohl das natürliche Substrat des Enzyms das Reserve-Xyloglucan aus Naturtium Keimblatt ist, ist gezeigt worden, dass es primäre Zellwand-Xyloglucane in vitro hydrolysiert (Edwards et al., vorhergehend zitiert). In hohen Substrat-Konzentrationen ist eine Xyloglucan-endo-Transglykosylase(XET)-Aktivität demonstriert worden (Fanutti et al., 1993, The Plant Journal 3, 691–700).
Die Nucleotid-Sequenz dieses Nasturtium-Xyloglucanase/XET-Enzyms ist bestimmt worden und in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 93/17101 und von de Silva et al. (1993, The Plant Journal 3, 701–711) offenbart worden.
Eine ähnliche Enzym-Aktivität ist in anderen Pflanzengeweben detektiert worden, und man hat gezeigt, dass diese mit der Wachstumsrate in verschiedenen Zonen des Erbsenstamms positiv korreliert ist (Fry et al., 1992, Biochem. J., 282, 821–829). Es ist vorgeschlagen worden, dass XET für das Schneiden und Wiederverbinden von intramikrofibrilären Xyloglucan-Ketten verantwortlich ist, und dass dies das Ablösen der Wände verursacht, das für die Expansion von Pflanzenzellen verantwortlich ist. Man hat darüber hinaus XET-Aktivität in der Tomtatenfrucht demonstriert (Xyloglucanase, offenbar aktivierbar durch Xyloglucanoligosaccharide), wo sie den Berichten zufolge 2 Tage nach dem "Breaker"-Stadium der Reifung am höchsten ist (Machlachlan & Brady, 1992, Aust. J. Plant Physiol., 19, 137–146) und möglicherweise am Prozess der Erweichung beteiligt ist. EP 0 562 863 A1 offenbart eine Endo-Xyloglucan-Transferase, erhalten von Vigua angularis-Sämlingen und deren kodierende Sequenz.
Diese Anmeldung beschreibt die Isolierung einer Nucleotid-Sequenz, die für eine XET-Aktivität kodiert, aus Tomatenpflanzen.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein Polypeptid mit Xyloglucan-endo-transglykosylase(XET)-Aktivität bereit, umfassend im wesentlichen die Reste 21–289 der Aminosäure-Sequenz aus 1 (Seq ID Nr. 2) oder ein funktionelles Äquivalent davon mit mindestens 80% Aminosäure-Identität mit dieser.
Der Begriff "funktionales Äquivalent", wie hierin verwendet und auf einer Aminosäure-Sequenz angewandt, ist so zu verstehen, dass er auf die Aminosäure-Sequenzen zutrifft, die die gleichen funktionalen Charakterstika aufweisen, wie die erfindungsgemäße Sequenz, aber die leicht unterschiedliche Sequenzen zeigen. Im allgemeinen ist es, z. B., bekannt, dass man eine "konservative" Substitution haben kann, wie das Austauschen von einem Aminosäure-Rest in einer Sequenz gegen einen anderen Rest mit sehr ähnlichen Eigenschaften, ohne dass irgendein signifikanter Effekt bezüglich der Funktion des Polypeptids auftritt.
Ein Beispiel für eine Polypeptid-Sequenz mit funktionaler Äquivalenz ist in 5 gezeigt (Seq ID Nr. 8). Die in den 1 und 5 gezeigten Aminosäure-Sequenzen werden in 6 direkt verglichen.
Darüber hinaus können ein oder mehrere Aminosäuren deletiert oder zugefügt sein, ohne dass signifikante inaktivierende Wirkungen auftreten. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass solche Änderungen insbesondere an solchen Punkten der Sequenz vorgenommen werden können, die nicht evolutionär konserviert sind. Enzym-Vorläufer werden ebenfalls in die Bedeutung des Begriffes "funktionale Äquivalente" einbezogen und darüber hinaus auch reife, prozessierte Enzyme, denen die Signalsequenzen fehlt. Im vorliegenden Fall glaubt man, dass die Aminosäure-Reste 1–20 aus 1 eine solche Signalsequenz darstellen und daher für die Enzym-Aktivität nicht essentiell sind. In ähnlicher Art glaubt man, dass die Aminosäure-Reste 1 bis 18 der in 5 gezeigten Sequenz eine nicht-essentielle Signalsequenz umfassen.
In spezifischen Ausführungsformen kann die Erfindung daher ein Polypeptid mit XET-Aktivität bereitstellen, das die Reste 1–289 der in 1 gezeigten Sequenz umfasst; oder die Reste 19–287 der in 5 gezeigten Aminosäure-Sequenzen; oder die Reste 1–287 der in 5 gezeigten Aminosäure-Sequenz.
Vorzugsweise werden solche Äquivalente mindestens 80% Homologie zeigen und stärker bevorzugt mindestens 85% Homologie und am stärksten bevorzugt mindestens 90% Homologie, in Bezug auf die erfindungsgemäße Aminosäure-Sequenz.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben durch Analyse der Aminosäure-Sequenzdaten eine Anzahl von Peptid-Sequenzen identifiziert, von denen man glaubt, dass sie innerhalb der funktionalen Äquivalente der erfindungsgemäßen Sequenz relativ konserviert sind.
Vorzugsweise umfassen die funktionalen Äquivalente im Wesentlichen ein oder mehrere der folgenden Peptid-Sequenzen (die im allgemeinen perfekt konserviert sind, aber bis zu einer, maximal bis zu zwei Aminosäure-Differenzen aufweisen können): DEIDFEFLGN; SLWNADDWAT; FYSKNEYLFG und GTVTTFYLSS (Seq. ID Nrn. 3 bis 6).
Vorzugsweise liegt das Polypeptid im Wesentlichen von anderen von Pflanzen abgeleiteten Substanzen isoliert vor.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung eine Nucleotid-Sequenz bereit, die für die Aminosäure-Sequenz aus 1 (Seq ID Nr. 1) kodiert, oder funktionelle Äquivalente davon.
Vorzugsweise umfasst die Nucleotid-Sequenz die Nucleotid-Sequenz aus der 1 oder eine andere funktional äquivalente Sequenz, die aus Tomatenpflanzen erhältlich ist. Der Begriff "funktionales Äquivalent", wie hierin verwendet und auf Nucleotid-Sequenzen angewendet, ist so zu verstehen, dass er Nucleotid-Sequenzen bezeichnet, die ein Polypeptid kodieren, das die gleichen funktionalen Charakteristika aufweist wie die Aminosäure-Sequenzen gemäß dem ersten Aspekt und Nucleotid-Sequenzen einschließt, die unter Standardbedingungen hybridisieren (beschrieben von Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual), um die Nucleotid-Sequenz aus 1 zu komplementieren. Vorzugsweise zeigt die funktional äquivalente Nucleotid-Sequenz mindestens 80% Homologie und stärker bevorzugt mindestens 85% Homologie mit der Nucleotid-Sequenz aus 1. Ein spezifisches Beispiel einer funktio nal äquivalenten Nucleotid-Sequenz ist in 5 gezeigt (Seq ID Nr. 7).
Zu Zwecke der vorliegenden Beschreibung betrifft der Begriff "funktionales Äquivalent" auch "antisense"-Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit der Nucleotid-Sequenz aus 1 hybridisieren. Solche Sequenzen sind bei der Herunterregulierung der Expression von erfindungsgemäßen Nucleotid-Sequenzen von Nutzen. Vorzugsweise zeigen solche antisense-funktionalen Äquivalente mindestens 70% Homologie, stärker bevorzugt mindestens 80% Homologie und am stärksten bevorzugt mindestens 90% Homologie mit dem Komplement der Nucleotid-Sequenz aus 1. Im allgemeinen zeigen antisense-funktionale Äquivalente vorzugsweise höhere Prozentsätze an Homologie als sense-Äquivalente. Dies liegt daran, dass Sense-Konstrukte in Polypeptide translatiert werden, die funktional werden und konservative Aminosäure-Substitutionen enthalten können. Im Gegensatz dazu wirken antisense-Konstrukte in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle auf der Ebene der Nucleinsäuren und nicht auf der Ebene der Polypeptide, und daher führt jede Differenz in der Basen-Sequenz tendentiell zu einer Reduktion der Nützlichkeit des Konstruktes.
Der Fachmann versteht, dass es unter Nutzung der hierin gelieferten Offenbarung in Bezug auf die erfindungsgemäßen Nucleotid und Aminosäure Sequenzen leicht sein wird, andere Nucleotid-Sequenzen zu detektieren, isolieren und klonieren (z. B. durch PCR), die mit den erfindungsgemäßen Nucleotid-Sequenz funktional äquivalent sind. Geeignete Verfahren werden z. B. von Sambrook et al. gelehrt. Von besonderer Verwendbarkeit bei solchen Routinearbeiten können die oben offenbarten Polypeptid-Sequenzen sein. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Polypeptid (oder davon abgeleitete Peptide) ver wendet werden, um Antikörper zur Verwendung beim immunologischen Screenen von mutmaßlichen funktional-äquivalenten Sequenzen zu erzeugen.
Es ist bevorzugt, dass die Sequenz gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung darüber hinaus eine 5'-untranslatierte Region umfasst, einschließlich eines geeigneten Promotors, um die Expression in Wirtszellen zu ermöglichen.
Die Erfindung stellt auch einen Vektor bereit, umfassend eine Nucleotid-Sequenz gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung, und eine Wirtszelle, umfassend die erfindungsgemäße Nucleotid-Sequenz.
In einer Ausführungsform ist der Vektor zur Expression der Nucleotid-Sequenz fähig, um das erfindungsgemäße Polypeptid zu produzieren. (Andere Vektoren können eine antisense funktional äquivalente Nucleotid-Sequenz umfassen).
Daher stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit XET-Aktivität bereit, umfassend die Schritte: Einführen eines Vektors in eine geeignete Wirtszelle, der zur Steuerung der Expression eines Polypeptids wie oben definiert fähig ist, Anziehen der Wirtszelle oder deren Nachkommen unter geeigneten Kulturbedingungen, so dass das Polypeptid exprimiert wird, gefolgt von dem Gewinn des Polypeptids, entweder aus dem Kulturmedium und/oder aus den Wirtszellen.
Es ist bevorzugt, aber in keiner Weise essentiell, dass die Wirtszelle eukaryotisch ist, da ein eukaryotischer Wirt das Enzym mit größerer Wahrscheinlichkeit in einer vollständig funktionalen Konformation exprimiert.
Geeignete Vektoren sind solche, die verwendet werden können, um die erfindungsgemäße Sequenz in Pflanzen einzuführen und zu exprimieren.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Transformieren von Wirtszellen bereit, umfassend das Einführen der Nucleotid-Sequenz gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung in die Wirtszelle. Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine Pflanzenzelle. Vorzugsweise umfasst die transformierte Pflanzenzelle einen Teil einer Pflanze.
Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass es zu erwarten ist, dass die Einführung der erfindungsgemäßen Nucleotid-Sequenz in eine Pflanze oder in einen Teil davon die Charakteristika der Pflanze oder des Teils davon verändert.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Veränderung der Charakteristika einer Pflanze oder eines Teils davon bereit, umfassend das Einführen eines wirksamen Teils der erfindungsgemäßen Nucleotid-Sequenz oder eines funktionalen Äquivalents davon in eine Pflanze oder einen Teil davon, so dass der Grad der XET-Aktivität in der Pflanze oder dem Teil davon verändert wird. Vorzugsweise ist das Verfahren so ausgestaltet, dass der Grad der XET-Aktivität in der Pflanze oder dem Teil davon reduziert wird, typischerweise durch Einführung einer antisense-Sequenz. Vorzugsweise umfasst der wirksame Teil mindestens 50%, stärker bevorzugt mindestens 70% und am stärksten bevorzugt mindestens 90% der erfindungsgemäßen Nucleotid-Sequenz.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine durch genetische Technologie veränderte Pflanze bereit, die Charakteri stika aufweist, die durch das oben definierte Verfahren verändert sind, oder die Nachkommen einer solchen Pflanze.
Die veränderte Pflanze ist vorzugsweise irgendeine beliebige, kommerziell wichtige Pflanze (einschließlich Frucht- oder Gemüsepflanzen), über die genügend Wissen vorhanden ist, um das erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen, und in der Xyloglucan eine strukturelle Funktion hat (d. h. Dicotyle und nicht-graminale Monocotyle).
Solche Pflanzen schließen ein: Alfalfa, Apfel, Broccoli, Kohl, Karotten, Blumenkohl, Sellerie, Baumwolle, Preiselbeere, Gurke, Aubergine, Flachs, Traube, Meerrettich, Kiwi, Salat, Mangos, Melone, Ölsamenraps, Papaya, Erbse, Pfirsich, Birnen, Pfeffer, Pflaume, Pappel, Kartoffel, Himbeere, Sojabohne, Fichte, Erdbeere, Zuckerrübe, Süßkartoffel, Tabak, Tomate und Walnuss.
Es braucht nicht weiter erläutert zu werden, dass die Charakteristika der gesamten Pflanzen nicht verändert werden müssen. Es kann wünschenswert sein, die Eigenschaften von Teilen der Pflanze (z. B. der Samen, Früchte) zu verändern. Dies könnte z. B. dadurch erreicht werden, indem gewebespezifische Promotoren verwendet werden, um die Transkription der eingeführten Sequenz zu regulieren.
Man würde erwarten, dass das erfindungsgemäße Verfahren den Grad der XET-Aktivität verändert und daher die Frequenz des Aufbrechens und der Neubildung von Zellwandvernetzungen (bestehend aus Xyloglucanmolekülen), was zur Auflösung der Wand führt, die die Zellexpansion erlauben kann. Darüber hinaus kann man aufgrund der wichtigen strukturellen Rolle des Xyloglucans unter Umständen erwarten, dass die möglicherweise veränderten Charakteristika einschließen: Größe, Wachstumsgeschwindigkeit und Textur, insbesondere während der Reifung.
Die Erfindung wird darüber hinaus durch Verweis auf die folgenden illustrativen Beispiele und Zeichnungen beschrieben, in denen:
1 zeigt eine Aminosäure- und Nucleotid-Sequenz (Klon B1) gemäß der Erfindung;
2 zeigt Teil-Aminosäure-Sequenzen eines erfindungsgemäßen Polypeptids und ein funktionales Äquivalent davon, im Vergleich mit zwei Aminosäure-Sequenzen gemäß dem Stand der Technik;
3 zeigt die Sequenzierungsstrategie, die zum Bestimmen der in 1 gezeigten Sequenz verwendet wurde (E = EcoRI, P = Pst, H = HindIII);
4 zeigt die Sequenzierungsstrategie, die zur Bestimmung der Sequenz eines erfindungsgemäßen Nucleotid-Klons (Klon B2) verwendet wurde (E = EcoRI, P = Pst);
5 zeigt eine erfindungsgemäße Nucleotid-Sequenz (Klon B2) und eine erfindungsgemäße Aminosäure-Sequenz;
6 zeigt einen Vergleich von zwei funktional äquivalenten Aminosäure-Sequenzen (Punkt = identische Aminosäue; Dreieck = vorhergesagte Spaltstelle); und
7 und 8 sind schematische Illustrationen von verschiedenen Plasmid-Konstrukten.
Beispiele
Beispiel 1
Nach der vollständigen Sequenzierung einer cDNA, die für Nasturtium-Samen XET kodiert (beschrieben in der anhängigen internationalen Patentanmeldung Nr. WO 93/17101), wurden Primer entworfen, um den Versuch einer Amplifizierung durch PCR von ähnlichen Gen-Fragmenten aus Tomaten zu unternehmen. Zwei der Primer (NXG2H und NXG2B, wie unten gezeigt) überlappten mit einer Region, die gegenüber einer Bacillus macerans β-1,3-1,4-Glucanase homolog war (die Region hatte die Aminosäure-Sequenz DEIDIEFLG).
Die anderen Primer entsprachen den Regionen, die an Histidin-Resten anlagen oder diese umgaben (diese liegen oft an aktiven Stellen von hydrolytischen Enzymen vor, und aktive Stellen mit ähnlicher Funktion weisen oft primäre Sequenz-Homologie auf). Dies entspricht den Aminosäure-Sequenzen PNHNRVD (Primer NXG1H), HDEIDIE (Primer NXGH2H und NXG2B), HLWFDPT (Primer NXG3H und NXG3B) und TRDHTLT (Primer NXG4B).
Diese Primer sind in Bezug auf die Nasturtium-Sequenz und inkorporierte Restriktionsenzym-Erkennungsstellen an ihren 5'-Enden vollständig konserviert, um das Klonieren der PCR- Produkte zu erleichtern. Alle Versuche, Tomaten-DNA unter Verwendung von Kombinationen jeglicher Art der obigen Primer zu amplifizieren, erwiesen sich jedoch als nicht erfolgreich.
Die abgeleitete Aminosäure von Nasturtium-Samen-XET teilt sich einige Homologie-Regionen (42% Identität in einer überlappenden Region von 151 Aminosäuren) mit einer Sequenz, die aus einem genomischen Klon und cDNA von Arabidopsis thaliana abgeleitet wurde (Medford et al., 1991, The Plant Cell 3, 359-370). Von dem genomischen Klon kodiertes Polypeptid wird meri-5 genannt und seine Funktion ist im Augenblick unbekannt.
Es wurde entschieden, eine PCR-Amplifikation von Tomaten-DNA unter Verwendung einer Mischung von degenerierten Oligonucleotiden (XG 117 und XG 162, unten gezeigt), die mit zwei dieser konservierten Regionen zwischen Naturtium XET und meri-5 korrespondieren, obwohl angesichts der vorhergehenden Fehlschläge und des Mangels an Wissen in Bezug auf die Funktion (falls es eine solche gibt) von meri-5 nur wenig Erfolgsaussichten bestanden.
Überraschenderweise führte die PCR zu einer erfolgreichen Amplifizierung eines 122bp-genomischen DNA-Fragments aus Tomaten mit signifikanter Sequenz-Homologie sowohl zu meri-5 als auch zu Nasturtium XET.
Das Experiment wurde wie unten beschrieben durchgeführt.
Genomische DNA wurde aus jungen Tomatenblattgewebe isoliert (Kultivat VF 143B-7879, erhältlich von Tomato Genetics Stock Centre, Department of Vegetable Crops, University of Califor nia, Davis, CR95616), wie beschrieben von Dellaporta et al. (1983, Plant Mol. Biol. 1, 19–21).
Die degenerierten Oligonucleotid-Mischungen wurden korrespondierend zu den konservierten Regionen DEID(I/F)EFLG (XG 117) und HLWFDPT (XG 162) entworfen, wie unten gezeigt:
Die degenerierten Oligonucleotide wurden dann als Primer in den folgenden Reaktionen verwendet (jede Reaktion hatte ein Gesamtreaktionsvolumen von 100 μl): 1 bis 2 μg genomische DNA; 100 Picomol von jeweils XG 117 und XG 162; dGTP, dATP, dTTP und dCTP, alle mit 0,2 mM; 10 mM Tris-HCl pH 8,3; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl₂; 0,01% (W/V) Gelatine und 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Stratagene).
Das thermische Zyklieren wurde in einem MJ-Researchprogammierbaren thermischen Kontroller mit einem anfänglichen Denaturierungsschritt von 94°C für 2 Minuten, gefolgt von 35 Zyklen bei 94°C für 1 Minute, 40°C für 2 Minuten und 72°C für 2 Minuten ausgeführt. Die Amplifikationsprodukte wurden auf ein 2%-Agarose/TBE-Gel fraktioniert, das 0,5 μg/ml Ethidiumbromid enthielt, und auf einem W-Transilluminator ausgewertet. Die DNA-Fragmente wurden aus den Gelen unter Verwendung von DEAE-Papier gereinigt, wie beschrieben von Sambrook et al. (Molcular Cloning: a laboratory Manual).
Als Haupt-PCR-Produkt wurde ein Produkt von 122bp-Größe gefunden. Dies wurde in pT7Blue (von AMS Biotechnology erhalten) ligiert und einer DNA-Sequenz-Analyse unterzogen. Von den vier sequenzierten Klonen wiesen drei identische DNA-Sequenzen (PX3) auf und eine unterschied sich sowohl in der DNA als auch in der abgeleiteten Aminosäure-Sequenz (PX1), wie in 2 gezeigt. In 2 repräsentieren Tom 3 und Tom 1 die abgeleitete Aminosäure-Sequenz für PX3 bzw. PX1, verglichen mit Meri-5 und Nasturtium XET.
Um ausgedehntere Sequenzinformation zu erhalten, wurde eine Tomaten-cDNA-5'-Stretch-Bank von Clontech Laboratories Inc. erhalten (hergestellt unter Verwendung von mRNA aus dem "Breaker"-Stadium von reifenden Tomatenfrüchten, "Ailsa craig"-Kultivat VFN8); diese wurde mit Oligo-(dT) und Zufallsprimern geprimt, um cDNA zu synthetisieren, die in den Phagen lambda gt11 verpackt wurde.
Etwa 200.000 cDNA-Klone aus dieser Bank wurden unter Verwendung des 122bp-PCR-Fragments als radiomarkierte Sonde gescreent. Kurz gesagt wurden 25–30 ng Gel-gereinigtes 122bp-Amplifikationsprodukt in 9 μl H₂O durch Erhitzen auf 100°C für 5 Minuten denaturiert und dann auf Eis gekühlt. Die Fragmente wurden mit ³²P-dCTP (Amersham International plc) unter Verwendung eines von United States Biochemicals Inc. (Sequenase v2.0) bezogenen Kits radiomarkiert. Nicht eingebaute Nucleotide wurden durch Chromatographie über eine Sephadex-G-50-Säule entfernt.
Unter Verwendung dieser Sonde wurde eine Anzahl an positiv reagierenden Klonen in der cDNA-Bank detektiert. Diese wurden an der oberen Schicht der Agarose in 0,1 bis 1 ml SM (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgSO₄, 100 mM NaCl, 0,01% w/v Gelati ne) eluiert und durch weitere Runden des Screenings gereinigt. Das Insertat wurde aus dem Bakteriophagen entweder durch direkte PCR der Stammsuspension oder durch Verdau von isolierter DNA isoliert.
Für die PCR der Stamm-Suspension wurden gereinigte Bakteriophagen-Stämme (5 μl, 10⁵–10⁶ pfu) für 5 Minuten auf 100°C erhitzt und dann zu einer Lösung zugesetzt, die mit der vorhergehend beschriebenen identisch war, außer dass 20 pmol von jeweils gt11 5'- und 3'-Oligonucleotiden (Clontech) anstelle der degenerierten verwendet wurden. Das thermische Zyklieren lief wie folgt ab: 2 Minuten bei 94°C, 25 Zyklen von 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 55°C und 2 Minuten bei 72°C, gefolgt vom Endschritt von 5 Minuten bei 72°C. Die Amplifikationsprodukte wurden auf 1% Agarose-Gelen wie oben beschrieben Gelgereinigt.
Die Gel-gereinigten PCR-amplifizierten Produkte wurden in pT7-Blue-PCR-Kloningvektor (AMS Biotechnology Limited) ligiert und in kompetente E. coli gemäß den Angaben des Herstellers transformiert.
Kolonien, die rekombinante Plasmide enthielten, wurden verwendet, um 30 ml Lennox-Brühe mit 50 μg/ml Ampicillin und 12,5 μg/ml Tetracyclin zu inokulieren; nach dem Wachstum über Nacht bei 37°C wurde gereinigte Plasmid-DNA aus der Kultur unter Verwendung eines "Plasmid-midi"-Kits erhalten, der von Qiagen Inc. bezogen war. Die Restriktionsanalyse der klonierten Produkte wurde unter Verwendung von Enzymen und Puffern durchgeführt, die von Amersham International plc bezogen wurden, gefolgt von Agarose-Gel-Elektrophorese.
Die DNA wurde unter Verwendung von Kits und Protokollen sequenziert, die von United States Biochemicals Inc. (Sequenase v2.0) bezogen wurden. Rekombinante Plasmide (Quiagenhergestellt) wurden entweder direkt sequenziert oder Restriktionsfragmente wurden in M13 subkloniert, um einzelsträngige Template zu produzieren. Die Reaktionsprodukte wurden unter Verwendung von BRL-6%-Acrylamidlösungen auf 30 cm × 40 cm × 0,4 mm Polyacrylamid-Gelen fraktioniert. Ein IBM-Computer mit DNAstar-Software wurde verwendet, um die resultierenden Sequenzen zu analysieren.
Man fand heraus, dass die Größe der Klone zwischen 500 und 1400 by variierten. Man fand heraus, dass ein Klon, genannt tXET-B1 (oder der Einfachheit halber "B1") interne HindIIIund SacI-Erkennungsstellen aufwies, die eine Subklonierung in M13 erleichterten. Es wurden auch interne Primer verwendet, um den Klon vollständig in beide Richtungen zu sequenzieren (3). Die Sequenzen dieser internen Primer (8-TH-,8-HS-Sense-Primer und 8-TB, 8-HAT-antisense-Primer) sind wie folgt:
Die Sequenzen der anderen Primer waren:
U repräsentiert den M13(-40)-Primer. Anfänglich wurden zwei Sequenzen gefunden, wobei jede eine andere PCR-Amplifikation des lambda-Stammes war. Sie unterschieden sich in zwei Basenpaaren innerhalb der mutmaßlich kodierenden Region. Da diese Unterschiede wahrscheinlich auf der Ungenauigkeit der thermostabilen DNA-Polymerase, die in der PCR verwendet wurde, beruhte, wurde lambda-DNA hergestellt und die cDNA in pBluescript SK+ ligiert, um definitive Sequenzdaten zu erhalten (1). Die definitive Nucleotid-Sequenz von Klon B1 ist in 1 gezeigt, zusammen mit der abgeleiteten Aminosäure-Sequenz.
Das mutmaßliche offene Leseraster des Klons B1 kodiert ein 289-Aminosäure-Polypeptid vom vorhergesagten Molekulargewicht 32,7 kDa. Dies weist 39% Identität in 270 überlappenden Aminosäuren mit Nasturtium XET auf und 59% Identität in 186 überlappenden Aminosäuren mit meri-5.
Ein Signalpeptid wird auf der Basis der Hydrophobizität von Aminosäuren in den Positionen 1–25 vorhergesagt, und die statistische Analyse der Aminosäure-Sequenz sagt voraus, dass der Vorläufer zwischen den Alanin- und Aspartat-Resten bei Positionen 20 und 21 gespalten wird (von Heijne, 1983, Eur. J. Biochem., 113, 17–21).
Die Region des Klons B1, die zu den genomischen PCR-Fragmenten korrespondiert (as 103–129) zeigt, in der abgeleiteten Aminosäure-Sequenz Differenzen im Vergleich zu beiden genomischen Fragment-Sequenzen. Dies legt nahe, dass Klon B1 Teil einer Multigen-Familie in Tomaten ist. Eine mutmaßliche N-Glykosylierungsstelle (Asn-X-Ser/Thr; as 105–107) wurde identifiziert, die auch in meri-5 und in den genomischen Fragmenten vorliegt, aber nicht in Nasturtium XET.
Der zweite erhaltene Klon, genannt Klon tXET-82 (abgekürzt als "B2") war größer als Klon B1, aber hatte keine zweckmäßigen Restriktionsstellen für die Subklonierung, so dass verschiedene interne Primer verwendet wurden, um die DNA-Sequenzierung zu komplettieren. Die zur Bestimmung der Sequenz des Klons B2 angewandte Strategie wird schematisch in 4 gezeigt. In 4, E = EcoRI-Stelle, P = PstI-Stelle; zeigt (a) die Sequenzierung der Verwendung des Vektorprimers, (b) und (c) zeigen Sequenzierung mit internen Primern. Es wurde eine Anzahl an Primern eingesetzt, einschließlich:
Es wurde ein abgeleitetes offenes Leseraster von 287 Aminosäuren identifiziert. Die bestimmte Nucleotid-Sequenz und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz des Klons B2 werden in 5 gezeigt. 6 zeigt die cDNA-Sequenz von Klon B1 und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz davon, im direkten Vergleich mit der abgeleiteten Aminosäure-Sequenz für Klon B2 (in 6 zeigen Punkte identische Aminosäuren und der Pfeil zeigt die vorhergesagten Signal-Peptid-Spaltstellen an). Das vorhergesagte Signal-Peptid für Klon B2 war 2 Aminosäuren kürzer als das von Klon B1, was ein reifes Polypeptid von 269 Aminosäure zurückließ. Eine mutmaßliche N-Glykosylierungsstelle wurde in der gleichen Position gefunden wie für Klon B1. Es wurden sechszehn-Aminosäure-Differenzen zwischen den vorhergesagten reifen Polypeptiden der Klone 8 und 16 identifiziert, von denen 14 konservativ waren.
Es wurde eine hydrophobe Cluster-Analyse (HCA, wie beschrieben von Gaboriaud et al., 1987, FEBS Letters, 224, 149–155, und Henrissat et al., 1988, Biochem. J., 255, 901–905) durchgeführt, um mögliche konformationelle Homologie des von Klon B1 kodierten Polypeptids mit anderen bekannten Proteinen zu untersuchen.
Aus den abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen von Nasturtium XET, meri-5 und Tomaten-Klon B1 wurden unter Verwendung von Word-Perfect^TM 5.1 Makros unter der Verwendung einer modifizierten 2D-Darstellung einer α-Helix (Henrissat et al., oben zitiert) wurden HCA-Plots erstellt. Die hydrophoben Cluster wurden von Hand eingezirkelt, manuell zur Deckung gebracht und die HCA-Homologie-Werte wurden berechnet.
Eine ähnliche Faltung wurde für alle drei Proteine auf Basis des (a) "kontinuierlichen Vorliegen von konservierten Clustern" über einen Großteil der Länge der Sequenzen und (b) über die Gesamt-HCA-Homologie-Werte für alle drei Vergleiche über 75% (meri-5 gegenüber Tomaten-XET-Klon B1, 86%; Nasturtium XET gegenüber Tomaten-XET-Klon B1, 80%; meri-5 gegenüber Nasturtium XET, 78%) vorhergesagt.
Dies unterstützt Daten aus primärer Sequenz-Homologie und sekundären Struktur-Vorhersagen (Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol. Biol, 157, 105–132), die es nahe legen, dass diese drei Proteine wahrscheinlich ein im Wesentlichen ähnliche Faltung aufweisen und daher eine ähnliche Funktion, während sie im Detail Unterschiede aufweisen.
Es wurde entschieden, die Expression des Klon B2 in E. coli zu versuchen. Dies wird unten in Beispiel 2 beschrieben.
Beispiel 2
Manipulierung von Klon B2 zur Expression in E. coli
Die BamHI-Erkennungssequenz wurde nahe an der N-terminalen kodierenden Sequenz des mutmaßlichen reifen Proteins durch PCR eingeführt, unter der Verwendung eines Mutagenese-Primers (16-1 B: CCCTTGGATCGCTATAATT Seq ID Nr. 31) und eines pBluescript-Primers (T3; Stratagene). Die Reaktionsbedingungen waren: 1 ng XET-Klon B2 in pBluescript SK+, 0,4 mM von jeweils dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 25 pmol von jedem Primer, 1 × VENT-Polymerase-Puffer und 0,25 Einheiten VENT-DNA-Polymerase (New England Biolabs Inc.). Das Thermozyklieren wurde für 2 Minuten bei 93°C, 25 Zyklen von 1 Minute bei 93°C, 30 Sekunden bei 55°C und 1 Minute bei 72°C durchgeführt.
Überexpression von rekombinanten Tomaten XET in E. coli
Expression von Tomaten-XET in E. coli wurde unter Verwendung des QIAGEN-QIAexpress^TM-Systems erzielt. Ein BamHI-HindIII-Fragment des mutagenisierten PCR-Produkts wurde in den Expressionsvektor pQE30 ligiert und in E. coli-M15-Zellen transformiert, die das pREP4-Repressionsplasmid enthielten. Der Expressionsvektor erlaubt die Inkorporation eines 6 × Histidin-Markers N-terminal, der eine hohe Affinität für Ni-NTA(Ni-NTA ist Nickelnitrilotriessigsäure)-Harz aufweist, das von QIAGEN bezogen wird. Zellen wurden in Lennox-Brühe angezogen, die geeignete Antibiotika enthielt, und mit 2 mM IPTG induziert, sobald die optische Dichte der Kultur bei 600 nm 0,7 bis 0,8 betrug. Man ließ das Wachstum dann für weitere 3 bis 5 Stunden weitergehen. Zur Analyse wurden Zellen aus 0,5 ml Kultur pelletiert, in Probenpuffer aufgekocht (Laemmli 1970, Nature, 227, 680–685) und es wurden SDS-Polyacrylamidgele (10%) gefahren; die separierten Proteine wurden in Coomassie-Blau gefärbt. Die Lokalisation des markierten Proteins wurde wie in Protokoll 4 von "The QIAexpressionist", 2. Auflage (1992; QIAGEN Inc.), etabliert.
Reinigung und Rückfaltung von rekombinantem Tomaten-XET-Protein
Rekombinantes Tomaten XET wurde unter denaturierenden Bedingungen auf Ni-NTA-Harz gereinigt, wie im "The QIAexpressionist"-Protokoll 7 beschrieben, außer dass nach dem Endwaschen die Säule mit gebundenem Protein in 6 M Harnstoff, 0,5 M NaCl, 20% Glycerin, 40 mM Tris-HCl pH 7,4 equilibriert wurde. Ein FPLC-mediierter 6 M–1 M Harnstoffgradient (24 ml bei einer Geschwindigkeit von 0,25 ml/min) in der obigen Lösung wurde dann verwendet, um das gebundene Protein rückzufalten, das in 10 ml 1 M Harnstoff, 0,5 M NaCl, 20% Glycerin, 40 mM Tris-HCl pH 7,4, 250 mM Imidazol eluiert wurde.
Assays auf XET-Aktivität
³H-markierte XG-Oligosaccharide wurden von S C Fry (University of Edinburgh) erhalten und deren Einbau in polymeres XG wurde wie bei von Fry et al. (1992, Biochem. J., 261, 9489– 9494) beschrieben einem Assay unterzogen. Die Proteinkonzen tration wurde unter Verwendung eines Kits abgeschätzt, der von BioRad bezogen wurde.
N-terminales Aminosäure-Sequenzieren
Gereinigte rekombinante Proteine wurden wie oben beschrieben einer Elektrophorese unterworfen, unter Verwendung von qualitativ hochwertigen Reagenzien. Sie wurden dann auf Problott^TM-Membran (einem derivatisierten PVDF-Material, erhalten von ABI) elektrogeplottet (0,5 A, 2 Stunden) und in 1% Coomassie-Brilliant-Blau, 50% Methanol gefärbt. Das geplottete Protein wurde einem sequentiellen Edman-Abbau auf einem ABI-Gasphasen-Sequenzierer, Modell 740, unterworfen, mit Puls-Liquid-Update, wie von Cottingham et al. beschrieben (1988, Biochim. Biophys. Acta, 956, 201–207).
Expression und Charakterisierung von rekombinanten Tomaten XET
Tomaten XET wurde in E. coli mit N-terminalem 6- × His-Markier exprimiert, um die Reinigung zu erleichtern. Ein markiertes Protein des vorhergesagten Molekulargewichts (32 kDa) wurde in der unlöslichen Fraktion gefunden; eine Phasenkontrast-Mikroskopie der Expressionskultur zeigte stark refraktierende Körper in jeder Zelle, was das Vorliegen von unlöslichen Einschlusskörpern nahe legt (Daten nicht gezeigt). Nach der Aufreinigung in großem Maßstab unter denaturierenden Bedingungen wurde das markierte Protein einer N-terminalen Aminosäure-Sequenzierung unterzogen. Die resultierende Sequenz (MRGSHHHHHHGSADNFYQDA Seq ID Nr. 32) bestätigte sowohl die Identität des Proteins als rekombinantes Tomaten XET als auch das Vorliegen des N-terminalen 6 × His-Markers.
Das rekombinante Tomaten XET wurde rückgefaltet, während es an das Ni-NTA-Agarose-Harz gebunden war, und zwar durch einen reversen Harnstoffgradienten. Nach der Elution von der Säule wurden 15 μl auf Einbau von ³H-XG-Oligosacchariden (XGOs) in polymeres XG einem Assay unterzogen: etwa 400 Bq von ³H-XGOs wurden pro bereitgestelltes kBq, pro Stunde und pro μg Protein eingebaut. Nach der Dialyse gegen 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,2, 20% Glycerin, erhöhte sich die spezifische Aktivität auf etwa 700 Bq/kBq pro Stunde und μg.
Klon B2 wurde so in E. coli über-exprimiert, wobei das mutmaßliche N-terminale Signal-Peptid durch einen 6 × Histidin-Marker ersetzt wurde, was die Aufreinigung erleichterte. Nach der Aufreinigung und dem Rückfalten war das rekombinante Protein fähig, den Einbau von radiomarkierten XG-Oligosacchariden in polymeres XG zu katalysieren, was seine Identität als XET bestätigte. Die spezifische Aktivität des zurückgefalteten XET ist relativ gering; ein roher Stammextrakt aus einer wachsenden Tomatenpflanze hat eine spezifische XET-Aktivität von etwa 100 Bq/kBq pro Stunde pro μg im Vergleich zu 700 Bq/kBq pro μg für rückgefaltetes XET. Da das rückgefaltete Protein mehr als 90% Reinheit aufweist, ist dies vermutlich darauf zurückzuführen, dass der Großteil des Proteins nicht korrekt rückgefaltet ist.
Im Gegensatz zu Nasturtium-Samen XET liegt in den Aminosäure-Sequenzen der beiden Klone eine mutmaßliche N-Glykosylierungs- Stelle vor. Es ist interessant festzustellen, dass rekombinante Expression in E. coli, das keine Glykosylierung von Proteinen vornimmt, zu aktivem XET führt. Dies zeigt, dass die Glykosylierung für die XET-Aktivität in vitro nicht notwendig ist, was zu Fragen über seine Rolle in vivo führt. Der Mangel an Glykosylierung in Nasturtium-Samen-XET könnte auf seine spezialisierte Rolle bei der Mobilisierung von Lagerreserven zurückgehen.
Die Belege für eine Funktion von XET in Pflanzen steigen schnell an. Die Hypothese, dass XET eine Rolle beim Pflanzenwachstum spielt, wird durch seine Korrelation mit dem Wachstum entlang der Länge von Erbsenstämmen unterstützt (Fry et al., 1992, Biochem. J., 282, 821–828) und in Maiswurzeln (Pritchard et al., 1993, J. Exp. Bot., 44, 1281–1289). Man glaubt, dass es bei der Lösung der Zellwände wirksam ist, um die Zellexpansion zu erlauben.
XET ist darüber hinaus wahrscheinlich auch bei dem Reifen der Frucht involviert, wie sich dies durch sich ändernde Gehalte in Früchten wiederspiegelt, die so unterschiedlich sind wie Tomaten, Erbsen (nicht veröffentlichte Beobachtungen der Erfinder) und Kiwi (Fry, 1993, Current Biology, 3 (Nr. 6), 355– 357). Hier könnte XET den Zugang anderer Enzyme zu dem eng gepackten Netzwerken der Zellwand verbessern. Dies würde durch die geringe Größe und die kompakte Form von XET unterstützt (Edwards et al., 1986, J. Biol. Chem., 261, 9489– 9494). Alternativ kann XET (möglicherweise in Zusammenwirken mit anderen Zellwandhydrolasen) bei der Depolymerisation von Xyloglucan involviert sein, die während der Reifung der Früchte auftritt.
Beispiel 3
Zusätzlich zu der Arbeit über rekombinante DNA, wie sie oben beschrieben ist, wurden Versuche unternommen, ein Polypeptid mit XET-Aktivität aus Tomatenpflanzen zu isolieren und zu reinigen.
Schritt 1: Assay auf Aktivität von XET
Die XET-Aktivität in verschiedenen rohen Tomaten-Fruchtextrakten wurde durch Einbau von ³H-markierten Xyloglucanoligosacchariden in Xyloglucanpolymer gemessen. Dieser Assay misst die Transglykosylase-Aktivität. Jeder Assay enthielt die folgenden Komponenten:
10 μl 0,2 M Na-Mes, pH 6,0 (Na-Mes ist Na-2-[N-Morpholino]-ethansulfonsäure, 10 μl 8 mg/ml Xyloglucan und 5 μl [³H] XGO (0,7 KBq).
Die Assays wurden bei 25°C für 1 Stunde inkubiert und durch Zugabe von 100 μl 20% Ameisensäure gestoppt. Die Assaymischung wurde dann auf 5 × 5 cm-Scheiben aus Cellulosefilterpapier (Whatman 3 MM Chromatographiepapier) aufgetropft. Es wurde etabliert, dass Xyloglucanpolymer (sowohl markiert als auch unmarkiert mit [³H]XGO) an den Cellulosefilter bindet, während [³H] XGO-Oligosaccharide dies nicht tun. Man ließ die Filter trocknen und eingebautes [³H]XGO wurde durch Waschen unter laufendem Leitungswasser für 30 Minuten entfernt. Die Filter wurden erneut bei 60°C getrocknet, dann gerollt, mit der Oberfläche nach außen in einen Zylinder gepackt und in ein 22 ml-Szintillationsröhrchen eingebracht. Es wurde Szintillationsflüssigkeit (2 ml von Betamax ES) zugegeben und die Filter wurden auf ³H gezählt. Dieser Assay ist im Wesentli chen wie von Fry et al. (1992), wie oben zitiert, beschrieben.
Schritt 2: Extraktion von XET aus Tomaten-Fruchtwand
Es wurde eine Anzahl von Extraktionspuffern verwendet und man überprüfte deren Wirksamkeit. Man fand, dass XET mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, effizient extrahiert wurde. Man fand darüber hinaus, dass die Retention der XET-Aktivität in hohem Maße von der Ionenstärke abhing, und die Aktivität wurde verloren, wenn die Ionenstärke des Chromatographie-Puffers und der anderen Puffer unter 0,2 M lag.
Schritt 3: Wahl des Startmaterials für die Reinigung
Es wurden rohe Extrakte (0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,2) aus Tomaten-Fruchtwand(Lycopersicum esculentum, var. Moneymaker)-Geweben hergestellt, die aus allen Stadien des Wachstums und der Reifung entnommen waren. Man fand immer wieder (aus mehreren Experimenten), dass kleine grüne Früchte (d. h. weniger als 35 mm im Durchmesser) die höchste XET-Aktivität aufwiesen, unabhängig davon, ob man sie als Gesamtaktivität oder spezifische Aktivität ausdrückte. Daher wurde die Fruchtwand von kleinen grünen Früchten als Startmaterial für die Aufreinigung verwendet.
Schritt 4: Ammoniumsulfatpräzipitation
Es wurden Fruchtwandgewebe (100 g) aus kleinen grünen Früchten von weniger als 35 mm im Durchmesser gewonnen, in flüssigem Stickstoff gefroren und bei –20 oder –70°C gelagert. Das Gewebe wurde in 1 g : 1,5 Vol 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,2, mit 1% (w/v) unlöslichem PVP (Polyvinylpyrrolidon) in einem Mischer homogenisiert. Das Homogenat wurde für 1 Stunde bei 4°C gerührt, um die Diffusion der Zellwandenzyme zu ermöglichen. Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugation bei 20.000 g für 30 Minuten und 4°C im SS34-Rotor der Sorvall RC5B-Zentrifuge entfernt. Der Überstand wurde durch Glaswolle geleitet und durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat (60,3 g/100 ml) auf 90% Ammoniumsulfat Sättigung gebracht. Die Mischung wurde für 40 Minuten bei 4°C gerührt, und die gefällten Proteine durch Zentrifugation (38.000 g, 30 Minuten, 4°C) gesammelt. Die Ammoniumsulfat-präzipitierten Proteine wurden bei –20°C ohne erneutes Suspendieren gelagert.
Schritt 5: S-Sepharose-Kation-Austausch-Chromatographie
0 bis 90% Ammoniumsulfat-präzipitierte Proteine wurden in 10 ml 50 mM Natriumacetat-Puffer, pH 5,3, mit 0,2 M NaCl (Puffer A), entahltend 1 mM EDTA, 20 μg/ml Chymostatin, 1 mM PMSF, resuspendiert. Das resuspendierte Pellet wurde für 2 Stunden gegen 2,5 1 Puffer A unter Verwendung eines 3.500 M^r-Cut-off-Dialyseröhrchens dialysiert. Die Probe wurde mit 50 mM Natriumacetat-Puffer, pH 5,3, 1 mM EDTA, verdünnt, um die Konduktivität auf einen geeigneten Wert für das Aufbringen auf eine s-Sepharose-Säule zu bringen. Die Probe wurde bei 38.000 g für 15 Minuten und 4°C zentrifugiert und dann auf eine 7 ml-S-Sepharose-Fast-Flow-Säule (Pharmacia) aufgebracht, die in Puffer A equilibriert war. Die Säule wurde mit Puffer A gewaschen (Flussrate 1 ml/Minute), bis alles ungebundene Protein entfernt war. Die gebundenen Proteine wurden mit 0 bis 100% Gradienten von Puffer B (wie Puffer A, aber mit 1 M NaCl) über 10 Säulenvolumen eluiert. Die Fraktionen (2 ml) wurden gesammelt und auf XET-Aktivität überprüft.
Schritt 6: Concanavalin A Affinitätschromatographie
Fraktionen von der S-Sepharose-Ionenaustausch-Chromatographie mit hoher XET-Aktivität wurden vereinigt und bei –20°C gelagert. Vor der Concanavalin-Chromatographie wurden die Fraktionen auf 1 mM MgCl₂ und MnCl₂ gebracht. Die vereinigten Fraktionen von S-Sepharose wurden zentrifugiert und der Überstand auf eine Concavalin-A-Säule aufgebracht, die mit 50 mM Natriumacetat-Puffer, pH 5,7, enthaltend 0,2 M NaCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ und 1 mM MnCl₂ (Puffer C), eguilibriert war. Die gebundenen Proteine wurden mit einer Ein-Schritt-Elution mit Puffer D (Puffer C plus 0,5 Methyl-α-D-mannopyranosid) von der Säule eluiert. Die gesammelten Fraktionen wurden auf XET-Aktivität getestet.
Schritt 7: N-terminale Aminosäure-Sequenzierung
Proben von der Concanavalin A-Säule mit hoher XET-Aktivität wurden gemäß dem anscheinenden Molekulargewicht auf einem 15%-SDS-Polyacrylamidgel getrennt. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine auf die Problott^TM-Membran transferiert (Transferpuffer: 10 mM CAPS, pH 11, in 10% Methanol). Die ProblottTM-Membran wurde in 0,1% Coomassie-Brilliant-Blau R250 in 1%iger Essigsäure, 40% Methanol, gefärbt und in 50% Methanol entfärbt. Eine einzelne Bande (d. h., das Protein ist erfolgreich bis zur Homogenität gereinigt worden) von etwa M^r36.000 wurde sichtbar; diese wurde ausgeschnitten und einer N-terminalen Aminosäure-Sequenzierung auf einem ABI-Modell 475-Protein-Sequenzierer unterworfen. Die bestimmte Sequenz (Seq ID Nr. 33) war: GYPRRPVDVPFWKNY. Der Gehalt der Sequenz war konsistent mit der Intensität der gefärbten Proteinbande.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung daher ein im Wesentlichen reines Polypeptid mit Xyloglucan-endo-Transglykosylase(XET)-Aktivität mit einem anscheinenden Molekulargewicht von 36 kDa bereit, wie durch SDS-PAGE abgeschätzt.
Vorzugsweise ist das Enzym aus Tomatenpflanzen erhältlich, am stärksten bevorzugt aus der Fruchtwand von grünen Tomatenfrüchten und vorzugsweise weist es im wesentlichen die N-terminale Aminosäure-Sequenz GYPRRPVDVPFWKNY auf.
Das Enzym wird vorzugsweise durch ein oder mehrere Ammoniumsulfat-Präzipitationen, Ionenaustausch-Chromatographie und/oder Concanavalin-A-Affinitäts-Chromatographie gereinigt.
Beispiel 4
Expression von XET in Tomaten
Der oben beschriebene XET-Assay wurde verwendet, um die XET-Aktivität in der ganzen Tomatenpflanze (var. Moneymaker) zu messen. Extrakte (0,2 M Phosphat) wurden aus Wurzeln, Blätter und Petiol-Segmenten hergestellt, die aus verschiedenen Teilen der wachsenden Pflanze und Frucht in vier Stadien der Entwicklung und in drei Stadien der Reifung isoliert wurden. Die höchste XET-Aktivität wurde in Extrakten gefunden, die aus Petiolen hergestellt waren, die aus der Spitze von wachsenden Pflanzen und sich entwickelnden (kleinen grünen) Früchten isoliert wurden, was in Übereinstimmung steht mit der Involvierung des XET beim Pflanzenwachstum.
Die Gesamt-RNA wurde aus verschiedenen Teilen der Tomatenpflanze unter Verwendung eines Qiagen-Extraktionsverfahrens extrahiert. Die tXET-B1(Tomaten-XET-Klon B1)-Transkriptgehalte wurden durch RNAse-Protektionsanalyse bestimmt. Eine Antisense-tXET-B1-spezifische Sonde wurde durch Inkubieren von HindII-linearisiertem ptXET-B1-Plasmid mit 1 μl T3-RNA-Polymerase in Anwesenheit von 0,5 mM rATP/rGTP/rCTP, 5 nM UTP, 50 μCi³²P-UTP (800 Ci/mMol), 1 μl RNase-Inhibitor und 2 μl Reaktionspuffer (Ambion probe Synthesis kit) in einem End-Reaktionsvolumen von 20 μl für 1 Stunde bei 25°C synthetisiert. Nach DNase-Verdau und Phenol/Chloroform-Extraktion wurde die Sonde durch Ethanolpräzipitation gewonnen. Eine 10⁵cpm-markierte Probe wurde mit 5 μg gesamt-RNA inkubiert und die RNase-Protektionsanalyse wurde unter Verwendung eines RPAII-Kits durchgeführt, der von Ambion bezogen wurde. Die geschützte Sonde wurde durch Denaturieren der Gelelektrophorese quantifiziert, gefolgt von Analyse auf einem Molecular Dynamics PhosphorImager. Die höchsten Grade an tXET-B1-Transkripten wurden in Fruchtwänden gefunden, wobei die Gehalte während der Reifung anstiegen und ihren Höhepunkt bei rosafarbenen Früchten fanden. Maximale Gehalte im Stamm (äquivalent zu den Gehalten, die in reifen grünen Früchten gefunden werden) , wurden etwa 10 cm von der Spitze einer 30 cm-Pflanze entfernt gefunden. Niedrigere Gehalte an tXET-B1-Transkript wurden in Blättern gefunden, wobei in den Wurzeln nur vernachlässigbare Gehalte gefunden wurden. Die Unterschiede in den Aktivitätsmustern und dem Grad der Transkription legen nahe, dass entweder die gesamte XET-Aktivität durch einen Satz differentiell exprimierter Gene kodiert wird, oder dass die selektive Isolation von Isoformen bei 0,2 M Phosphat auftritt. Das Muster der Expression von tXET-B1 legt nahe, dass diese Isoform bei der Reifung von Früchten involviert sein könnte.
Beispiel 5
Reduktion des XET-Enzymgehalts in transgenen Tomatenpflanzen
Ein konstitutiver 2'-Mannopin-Synthase-Promotor wurde aus einem BglII-Fragment aus dem Plasmid pSLJ2'Lnos gewonnen und in das Plasmid ptXET-B1 ligiert. (pSLJ2'Lnos wurde aus pSLJ1006 abgeleitet [Jones et al., 1992, transgenic Research 1, 285– 297], indem die ein β-Glucuronidase-Enzym kodierende DNA-Sequenz durch eine Polylinker-Sequenz ersetzt wurde). Dies platzierte die tXET-B1-kodierende Sequenz in Antisense-Orientierung in Bezug auf den, und stromabwärts von dem 2'-Promotor (7). Ein Xba-Sst-Fragment, enthaltend den Promotor und 798bp (Nucleotide 187 bis 984) der tXET-B1-Sequenz wurde dann in den Pflanzen-Transformationsvektor pGPTV-kann kloniert (Becker D. et al., 1992, Plant Molecular Biology, 20, 1195–1197 und 8). Das resultierende Plasmid pGPTV-kan-2'tXET-B1 wurde verwendet, um Agrobaceterium LBA4404 und den rekombinanten Agrobaceterium-Stamm zu transformieren, der verwendet wurde, um cotyldonarische Segmente von Tomate (Varietät Moneymaker) zu infizieren. Transformierte Pflanzen wurden selektiv in Gegenwart von Kanamycin regeneriert. Das Vorliegen der transferierten DNA wurde durch PCR-Amplifikation einer DNA-Sequenz zwischen den Primern NPTI-Ib(5' ATCGGGAGCGGCGATACCGTA 3', Seq ID Nr. 34) und 8-HS (siehe oben) bestätigt. Die XET-Aktivität wurde in Extrakten bestimmt, die aus rosafarbenen Früchten (15 Pflanzen) nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt waren. Die Gehalte waren um bis zu etwa 80% in Pflanzen reduziert, die mit dem Antisense-tXET-Konstrukt transformiert waren.
SEQUENZLISTE

Claims

Polypeptid mit Xyloglucan-endo-Transglykosylase(XET)-Aktivität, umfassend die Reste 21–289 der in 1 gezeigten (Seq ID Nr. 2) Aminosäure-Sequenz oder ein funktionelles Äquivalent, das mit dieser mindestens 80% Aminosäure-Identität aufweist.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, umfassend die Reste 1–289 der in 1 gezeigten Aminosäure-Sequenz.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, umfassend die Reste 19–287 der in 5 (Seq ID Nr. 8) gezeigten Aminosäure-Sequenz.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, umfassend die Reste 1–287 der in 1 gezeigten Aminosäure-Sequenz.
Polypeptid gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche mit mindestens 85% Aminosäure-Identität mit der Sequenz der Reste 21–289 der in 1 gezeigten Sequenz.
Polypeptid gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche mit mindestens 90% Aminosäure-Identität mit der Sequenz der Reste 21–289 der in 1 gezeigten Sequenz.
Polypeptid gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend ein oder mehrere der folgenden Peptide (mit bis zu einem oder im Höchstfall bis zu zwei Aminosäure-Differenzen in jedem Peptid): DEIDFEFLGN; SLWNADDWAT; FYSKNEYLFG und GTVTTFYLSS.
Polypeptid gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, isoliert von anderen von Pflanzen abgeleiteten Substanzen.
Nucleotid-Sequenz, die die Aminosäure-Sequenz der Reste 21–289 der in 1 gezeigten Aminosäure-Sequenz kodiert oder ein funktionales Äquivalent mit mindestens 70% Homologie mit dem + oder - Strang einer solchen Nucleotid-Sequenz.
Nucleotid-Sequenz gemäß Anspruch 9, umfassend die in 1 gezeigte DNA-Sequenz (Seq ID Nr. 1).
Nucleotid-Sequenz gemäß Anspruch 9, kodierend die Aminosäure-Sequenz der Reste 19–287 der in 5 gezeigten Aminosäure-Sequenz.
Nucleotid-Sequenz gemäß Anspruch 11, umfassend die in 5 gezeigte DNA-Sequenz (Seq ID Nr. 7).
Nucleotid-Sequenz gemäß Anspruch 9 oder 11, die darüber hinaus einen Promotor umfasst, um die Expression in einer Wirtszelle zu ermöglichen.
Sequenz gemäß Anspruch 13, wobei der Promotor nicht ein solcher ist, mit dem die Sequenz natürlicherweise in einer Pflanze assoziiert ist.
Nucleotid-Sequenz gemäß Anspruch 9 mit mindestens 80% Homologie mit dem + oder - Strang der Nucleotid-Sequenz aus 1.
Nucleotid-Sequenz gemäß Anspruch 15 mit mindestens 85% Homologie mit dem + oder - Strang der Nucleotid-Sequenz aus 1.
Nucleotid-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 9 bis 16, kodierend ein Polypeptid gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis B.
DNA-Vektor, umfassend eine Sequenz gemäß mindestens einem der Ansprüche 9 bis 17.
Vektor gemäß Anspruch 18, der, wenn er in eine geeignete Wirtszelle eingefügt wird, fähig ist, die Expression eines Polypeptids gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 zu steuern.
Wirtszelle, in die eine Nucleotid-Sequenz gemäß mindestens einem der Ansprüche 9 bis 17 eingeführt worden ist, oder deren Nachkommen.
Wirtszelle gemäß Anspruch 20, umfassend einen Vektor gemäß den Ansprüchen 18 oder 19.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit Xyloglucan-endo-Transglykosylase(XET)-Aktivität, umfassend die Schritte: Einführen eines Vektors gemäß Anspruch 19 in eine geeignete Wirtszelle; Wachsen lassen der Wirtszelle und/oder deren Nachkommen unter geeigneten Kulturbedingungen, so dass das Polypeptid exprimiert wird; und Gewinnen des Polypeptids aus dem Kulturmedium und/oder den Wirtszellen.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle oder ein Mikroorganismus ist.
Verfahren gemäß Anspruch 22 oder 23, wobei die Wirtszelle eine Hefezelle ist.
Verfahren zum Verändern der Charakteristika einer Pflanze oder eines Teils davon, umfassend das Einführen in die Pflanze oder einen Teil davon eines effektiven Teils einer Nucleotid-Sequenz gemäß mindestens einem der Ansprüche 9 bis 17, um den Grad der XET-Aktivität in der Pflanze oder einem Teil davon zu verändern.
Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei der Grad der XET-Aktivität in der Pflanze oder einem Teil davon reduziert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 25 oder 26, wobei ein oder mehrere der folgenden Charakteristika verändert werden: Größe, Wachstumsgeschwindigkeit, Textur, Reifungseigenschaften.
Genetisch transformierte Pflanze oder deren Nachkommen, umfassend eine Nucleotid-Sequenz gemäß mindestens einem der Ansprüche 9 bis 17, wobei die Pflanze einen veränderten Grad der XET-Aktivität im Vergleich mit einer äquivalenten nicht-transformierten Pflanze aufweist.