HUT74598A

HUT74598A - Tomato xyloglucan endo-transglicosylase

Info

Publication number: HUT74598A
Application number: HU9601232A
Authority: HU
Inventors: David Andrew Arrowsmith; Silva Jacqueline De; Susan Amanda Hellyer; Sally-Anne Whiteman
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 1993-11-10
Filing date: 1994-11-10
Publication date: 1997-01-28
Also published as: PL317046A1; SK57696A3; GB9323225D0; JPH09511121A; PT728208E; AU8112994A; ES2196048T3; ATE236256T1; CA2176133A1; DK0728208T3; US6215044B1; DE69432427D1; AU698844B2; EP0728208B1; DE69432427T2; CZ136196A3; HU9601232D0; WO1995013384A1; EP0728208A1

Description

A találmány tárgya növényi enzimet kódoló nukleotid-szekvencia, az ezt a nukleotid-szekvenciát tartalmazó vektorok és gazdaszervezetek, valamint a szóbanforgó nukleotid-szekvenciák által kódolt aminosav-szekvenciák. Tárgyát képezik továbbá a találmánynak az adott enzim előállítására szolgáló rekombináns DNS módszerek, illetve egy, a növényi tulajdonságok megváltoztatására alkalmas módszer.

A gyümölcs- és zöldségfélék sejtfala zömmel poliszacharidokból áll, melyek fő komponense pektin, cellulóz, valamint xiloglükán [Selvendran & Robertson, IFR Report 1989]. Sokfajta sejtfal-modell ismeretes, melyek segítségével megkísérelték magyarázni az ellenállóságot és a flexibilitást [pl. Albersheim, Sci. Am., 232, 81-95 (1975); Albersheim, The primary cell wall, Plánt Biochemistry, 3rd Edition, Academic Press (1976); Hayashi, Ann. Rév. Plánt Physiol. & Plánt Mól. Bioi. 40, 139-168 (1989)].

A xiloglükánok olyan 1,4-0-glükánok, melyekben sűrűn fordulnak elő a-l,6-xilóz oldalláncok, és ezek némelyike 1,2-β-galaktozilált. A xiloglükánok nagy mennyiségben megtalálhatók a kétszikű növények elsődleges sejtfalában, valamint bizonyos magvakban, ahol különféle szerepet töltenek be.

Az elsődleges sejtfalban lévő xiloglükán hidrogén kötésekkel szorosan kapcsolódik cellulóz mikrofibrillumokhoz, és tömény lúg vagy erős duzzasztószer szükséges ennek megbontásához. A feltételezések szerint a xiloglükán kereszt• · kötéseket képez a cellulóz mikrofibrillumok között, és az Így kialakuló cellulóz/xiloglükán hálózat alkotja a sejtfal legfontosabb terherviselő/rugalmas vázát. A DCB mutagén kezelésen átesett sejtek (cellulózhiányos sejtfal) szuszpenziós tenyészetében xiloglükán választódik ki a tápközegbe, ami arra utal, hogy normális esetben a xiloglükán a cellulózhoz kötődik.

Az elsődleges sejtfalban lévő xiloglükán hidrolízisét sikerült kimutatni sötétben növesztett tök sziklevélben, IAA indukált növesztés során [Wakabayashi et al., Plánt Physiol. 95, 1070-1076 (1991)]. Azt valószínűsítik, hogy a sejtfal xiloglükán endohidrolízise hozzájárul a sejtfal fellazulásához, ami a sejtnövekedést kíséri [Hayashi, ibid.]. Kimutatták, hogy a xiloglükán átlagos molekulatömege csökken a paradicsom érése során, és ez elősegítheti az érést kísérő puhulást [Huber, J. Amer. Soc. Hort. Sci., 108, 405-409 (1983)].

Bizonyos magvak, pl. a sarkantyúvirágé, tömegükre számolva akár 30 % xiloglükánt is tartalmazhatnak, mely a megvastagodott sziklevél sejtfalban van jelen, és poliszacharid tartalékként szolgál, midőn a csírázáskor gyorsan depóiimerizálódik.

Sikerült a xiloglükánra specifikus 1,4-p-D-glükanáz enzimet (vagyis xiloglükanázt) izolálni, és gyakorlatilag tiszta formában előállítani csírázó sarkantyúvirág (Tropaeolum május L.) magvakból [Edwards et al., J. Bioi.

·· ·· · · · · · · · • ·· · ·· · · • ··· · ····· • ·· ····· ······ · · ·

Chem., 261, 9494 (1986)].

A tisztított xiloglükanáz SDS poliakrilamid gélelektroforézissel (29-31 kDa látszólagos molekulatömeg), valamint izoelektromos fókuszálással (5,0 izoelektromos pont) vizsgálva egyetlen polipeptid sávot ad. Az enzim kizárólagosan specifikus xiloglükánra és endo-működésű, amint azt a tamarindmag xiloglükánja hidrolízisének végtermék analízise mutatja [Wakabayashi, ibid.]. Bár az enzimnek természetes szubsztrátuma a sarkantyúvirág sziklevél tartalék xiloglükánja, kimutatható volt, hogy az elsődleges sejtfal xiloglükánokat in vitro hidrolizálja [Edwards, ibid.]. Magas szubsztrátum koncentrációknál megfigyelhető volt a xiloglükán endo-transzglikoziláz (XET) aktivitás is [Fanutti et al., The Plánt Journal 3, 691-700 (1993)].

A sarkantyúvirág xiloglükanáz/XET enzimjének nukleotid-szekvenciáját meghatározták és közölték [a WO 93/17101 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentésben, valamint de Silva et al., The Plánt Journal 3, 701-711 (1993) irodalmi helyen].

Sikerült kimutatni hasonló enzimaktivitást más növényi szövetekben is, és megállapították, hogy ez egyértelmű összefüggésben van például a borsó hajtásának különböző rétegeiben észlelhető növekedési sebességgel [Fry et al., Biochem. J., 282, 821-829 (1992)]. Azt valószínűsítik, hogy a XET felelős a mikrofibrillumok közötti xiloglükán láncok hasításáért és összekapcsolásáért, valamint azt is, hogy ez okozza a sejtfal • · • ·· · ·· ·· • ··· · «*··· • ·· ····· ······ · · · 5 fellazulását, ami a sejtek növekedéséhez elengedhetetlen. A

XET aktivitást kimutatták a paradicsom termésében is (a xilo glükanáz xiloglükán oligoszacharidokkal aktiválható) , ahol a legmagasabb aktivitás az érési folyamat során a szedés utáni

második napon	mérhető	[Machlachlan	& Brady, Aust.	, Plánt
Physiol., 19,	137-146 (1992)] és ez	részes lehet a	puhulás
folyamatában.
A jelen	találmány	ismerteti a	XET aktivitást	kódoló

nukleotid-szekvencia izolálását paradicsom növényből.

A találmány tárgya elsősorban xiloglükanáz (XET) aktivitással rendelkező polipeptid, amely tartalmazza az 1. ábra szerinti (2. szekvencia) aminosav-szekvencia 21 - 289 közötti szakaszát, vagy ennek funkcionális ekvivalenseit.

A funkcionális ekvivalens kifejezés jelen értelmezésben mindazon aminosav-szekvenciákra vonatkozik, melyek rendelkeznek a találmány szerinti szekvencia funkcionális tulajdonságaival, ám ettől némiképp eltérő aminosav-szekvenciájúak. Általánosságban szólva közismert módon létrehozható például ún. konzervatív szubsztitúció, melynek során valamely aminosav maradékot egy nagyon hasonló tulajdonságokkal rendelkező másikra cserélünk, anélkül, hogy ez számottevő hatást gyakorolna az adott polipeptid funkciójára.

Az ilyen, funkcionálisan ekvivalens polipeptidre példa az 5. ábrán (8. szekvencia) szereplő aminosav-szekvencia. Az 1. és 5. ábrán szereplő aminosav-szekvenciákat a 6. ábrán hasonlítjuk közvetlenül össze.

• · · · · · • · · · • · · · · · • · · · · · • · ·

Lehetséges egy vagy több aminosav maradék elhagyása vagy hozzáadása is, minden különösebb, az aktivitásra gyakorolt hatás nélkül. A szakmában jártasak számára nyilvánvaló, hogy az ilyen változtatások elsősorban a szekvencia azon pontjain eszközölhetők, melyek nem konzerválódtak az evolúció során. Az aminosav-szekvenciákra vonatkozó funkcionális ekvivalens kifejezés kiterjed az enzim prekurzorokra, valamint a szignálszekvenciákkal nem rendelkező érett, poszttranszlációs módosításon keresztülment enzimmolekulákra is. Jelen esetben például az 1. ábrán szereplő 1-20 közötti aminosavak minden valószínűség szerint olyan szignálszekvenciát alkotnak, mely nem esszenciális az enzimaktivitáshoz. Hasonlóképpen az 5. ábrán szereplő szekvencia 1-18 közötti aminosavai minden bizonnyal szintén nem esszenciális szignálszekvenciát képeznek.

A találmány a fentiek szerint közelebbről olyan polipeptidre vonatkozik, amely XET aktivitással rendelkezik, és az 1. ábrán szereplő aminosav-szekvencia 1 - 289 közötti; vagy az 5. ábrán szereplő aminosav-szekvencia 19 - 287 közötti; vagy pedig az 5. ábrán szereplő aminosav-szekvencia 1 - 287 közötti részletét tartalmazza.

Az ilyen funkcionális ekvivalensek előnyösen 80 %-os homológiát, még előnyösebben 85 %-os homológiát, legelőnyösebben pedig 90 %-os homológiát mutatnak a találmány szerinti aminosav-szekvenciával.

Az aminosav-szekvenciák analízise alapján a jelen • · ···· ·· · • · · · · « • 9· * ····· • « · · · · · • · * · · találmány szerzői azonosítottak egy sor olyan peptidszekvenciát, melyek minden valószínűség szerint viszonylag konzerváltak és így a találmány szerinti szekvencia funkcionális ekvivalenseinek tekinthetők.

A funkcionális ekvivalensek előnyösen tartalmaznak egy vagy több peptidszekvenciát a következők közül (melyek általában tökéletesen konzerváltak, de egyszersmind tartalmazhatnak egy, vagy többnyire két aminosav eltérést) : DEIDFEFLGN; SLWNADDWAT; FYSKNEYLFG; illetve GTVTTFYLSS; (rendre a 3 - 6. szekvenciák).

Kívánt esetben a polipeptid más, növényi eredetű anyagból is kinyerhető.

A találmány tárgya továbbá az 1. ábrán (1. szekvencia) szereplő aminosav-szekvenciát kódoló nukleotid-szekvencia, valamint ennek funkcionális ekvivalensei.

A szóbanforgó nukleotid szekvencia előnyösen olyan, az 1. ábrának megfelelő nukleotid-szekvencia vagy ennek fukcionális ekvivalense, mely paradicsom növényből nyerhető. A nukleotid-szekvenciákra vonatkozó funkcionális ekvivalens kifejezés jelen összefüggésben olyan nukleotid-szekvenciát jelent, amely a találmány szerinti aminosav-szekvenciák funkcionális jellemzőivel megegyező tulajdonságú polipeptidet kódol, és olyan nukleotid-szekvenciát tartalmaz, mely a szokásos körülmények között [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989)] hibridizál az 1. ábra szerinti nukleotid-szekvencia komplementerével. A funkcioná···· • ·· ♦···· ·«···· · · · lisan ekvivalens nukleotid-szekvencia előnyösen 70 %-os homológiát, még előnyösebben 80 %-os homológiát, legelőnyösebben pedig 85 %-os homológiát mutat az 1. ábra szerinti nukleotid-szekvenciával. A funkcionálisan ekvivalens nukleotid-szekvencia egy konkrét példája az 5. ábrán (7. szekvencia) látható.

A jelen találmányban a funkcionális ekvivalens kifejezés azokra az anti-sense (ellentétes sorrendű) szekvenciákra is vonatkozik, amelyek a szokásos körülmények között hibridizálnak az 1. ábra szerinti nukleotid-szekvenciával. Ezek a szekvenciák a találmány szerinti nukleotid-szekvenciák expressziójának szabályozására használhatók fel. Az anti-sense funkcionális ekvivalensek előnyösen legalább 70 %-os homológiát, még előnyösebben legalább 80 %-os homológiát, legelőnyösebben pedig legalább 90 %-os homológiát mutatnak az 1. ábra szerinti nukleotid-szekvencia komplementerével. Általánosságban az ilyen anti-sense funkcionális ekvivalensek előnyösen nagyobb fokú homológiát mutatnak, mint a megfelelő sense ekvivalensek. Ennek a jelenségnek az az oka, hogy a sense nukleotidok olyan polipeptidekké íródnak át, amelyek funkcionálisak, és konzervatív aminosav szubsztituenseket tartalmazhatnak, míg ezzel szemben az anti-sense konstrukciók az esetek túlnyomó többségében inkább nukleinsav szinten funkcionálisak semmint polipeptid szinten, és így bármely eltérés a bázissorrendben csökkenti a konstrukció alkalmasságát.

···

A szakmában jártasak számára nyilvánvaló módon a leírásban közölt, a jelen találmány szerinti nukleotid- és aminosav-szekvenciák ismeretében meglehetősen egyszerűen kimutathatók, izolálhatók és klónozhatók (pl. PCR technika alkalmazásával) más nukleotid-szekvenciák is, melyek a találmány szerintinek funkcionális ekvivalensei. Az erre alkalmas módszereket például Sambrook és munkatársai közölték. Ilyen rutinjellegű munka során megkaphatók a fentiekben ismertetett peptidszekvenciák. A találmány szerinti polipeptid (valamint az ebből készíthető származékok) használata révén antitestek készíthetők a feltételezetten funkcionális ekvivalens szekvenciák immunológiai szkríneléséhez.

A találmány szerinti nukleotid-szekvencia előnyösen tartalmazza az 5’ végen lévő nem transzlálódó régiót is, mely magában foglalja az alkalmas promotert, lehetővé téve így a gazdasejtben való expressziót.

Tárgya a találmánynak a szóbanforgó nukleotid-szekvenciát tartalmazó vektor, valamint gazdasejt is.

Konkrét példa erre az olyan vektor, amely alkalmas a nukleotid-szekvencia expressziójára, és ilyen módon a találmány szerinti polipeptid előállítására. (Más vektorok antisense funkcionális ekvivalens szekvenciát tartalmazhatnak) .

Mindezek alapján a találmány tárgyát képezi a XET aktivitással rendelkező polipeptid előállítására szolgáló módszer is, melynek lépései a következők: a) a fentiek szerinti polipeptid expresszióját irányítani képes vektor • ♦ · · · · · ··· · ····· « « · · · · · • · · · · bejuttatása alkalmas gazdasejtbe; b) a gazdasejt elszaporltása megfelelő körülmények között, oly módon, hogy a polipeptid expresszálódjon; és c) a polipeptid kinyerése a tápközegből és/vagy a gazdasejtekből.

A szóbanforgó gazdasejt előnyösen - de semmi esetre sem kizárólagosan - eukarióta sejt, mivel az enzim teljesen funkcionális konformációban történő expressziója eukarióta sejtben nagyobb valószínűséggel mehet végbe.

A találmány szerinti szekvencia növényi sejtekbe való bevitelére és expressziójára alkalmas vektorok közismertek.

Tárgya még a találmánynak a gazdasejt transzformálására szolgáló módszer is, mely abban áll, hogy a találmány szerinti nukleotidot a gazdasejtbe juttatjuk. A gazdasejt előnyösen növényi sejt. A transzformált növényi sejt előnyösen valamely növény része.

Amint az a szakmában jártasak előtt nyilvánvaló, a találmány szerinti nukleotid-szekvencia bevitele valamely növénybe vagy annak részébe, várhatóan megváltoztatja az adott növény vagy növényi rész tulajdonságait.

További tárgya a találmánynak a növények vagy növényi részek tulajdonságainak megváltoztatására alkalmas módszer, mely abban áll, hogy a találmány szerinti nukleotid-szekvenciának, illetve funkcionális ekvivalensének a hatás kiváltásához elegendő részét az adott növénybe vagy növényi részbe juttatjuk, oly módon, hogy ezáltal az illető növény vagy növényi rész XET aktivitásának szintjét megváltoztatjuk. Ez a *·· beavatkozás előnyösen azzal az eredménnyel jár, hogy a szóbanforgó növény vagy növényi rész XET aktivitása csökken, ami jellemzően anti-sense szekvencia bejuttatásával idézhető elő. A hatás kiváltásához elegendő rész a találmány szerinti nukleotid-szekvenciának előnyösen legalább 50 %-át, még előnyösebben 70 %-át, legelőnyösebben pedig 90 %-át tartalmazza.

A találmány tárgya a fentiekben ismertetett módszerrel megváltoztatott tulajdonságú, genetikailag manipulált növény, valamint annak leszármazottai.

A megváltoztatott tulajdonságú növény előnyösen bármely olyan gazdasági jelentőségű növény (ideértve a gyümölcs- és zöldségféléket), melyek esetében rendelkezésre áll a szükséges szaktudás, hogy a találmány szerinti módszert kivitelezzük, és amelyekben a xiloglükánnak szerkezeti szerepe van (kétszikűek és nem pázsitfűféle egyszikűek).

A szóbanforgó növények közé tartozik például a lucerna, az alma, a brokkoli, a káposzta, a sárgarépa, a karfiol, a zeller, a gyapot, a vörös áfonya, az uborka, a padlizsán, a len, a szőlő, a torma, a kiwi, a saláta, a mangó, a dinnye, az olajrepce, a papaja, a borsó, az őszibarack, a körte, a paprika, a szilva, a nyárfa, a burgonya, a málna, a szójabab, a lucfenyő, a szamóca, a cukorrépa, az édesburgonya, a dohány, a paradicsom és a dió.

Nyilvánvaló, hogy a teljes növény sajátosságait nem szükséges megváltoztatni. Kívánatos lehet azonban a növény • · · · ·*·· · · · • ·· · ·· · · • ··· · ··· · · • ·· ····· ······ · · · bizonyos részeinek (pl. mag, gyümölcs) tulajdonságait befolyásolni. Ez megvalósítható például szövetspecifikus promoterek alkalmazásával, melyek szabályozzák a bejuttatott nukleotid-szekvencia transzkripcióját.

A találmány szerinti módszer alkalmazása elvárásainknak megfelelően megváltoztatja a XET aktivitás szintjét, és ezáltal a sejtfalban lévő keresztkötések (melyek xiloglükán molekulákból állnak) felszakadásának és újraképződésének gyakoriságát, ami végülis a sejtfal fellazulását eredményezi, lehetővé téve a sejt növekedését. A xiloglükán szerkezeti szerepének jelentőségét figyelembe véve elvárható továbbá az olyan tulajdonságok megváltozása is, mint a méret, a növekedési sebesség, a textúra, különösképpen az érési folyamat során.

A következő példák és ábrák a találmány jobb megértését szolgálják.

— 1. ábra: a találmány szerinti (B1 klón) aminosav és nukleotid-szekvencia;

— 2. ábra: a találmány szerinti polipeptid részleges aminosav-szekvenciája, valamint annak funkcionális ekvivalense, összehasonlítva két korábbi aminosav-szekvenciával;

— 3. ábra: az 1. ábrán látható szekvencia meghatározása során követett stratégia szemléltetése (E=EcoRI, P=Pst, H=HindIlI) ;

— 4. ábra: a találmány szerinti (B2 klón) nukleotid-szekvencia meghatározása során követett stratégia szemlél13 tetése (E=EcoRI, P=Pst);

— 5. ábra: a találmány szerinti (B2 klón) nukleotid- és aminosav-szekvencia;

— 6. ábra: két funkcionálisan ekvivalens aminosav-szekvencia (a pont az azonos aminosavakat, a háromszög pedig az előrejelzett hasítási helyeket jelöli);

— 7. és 8. ábra: különböző plazmid konstrukciók sémája.

1. példa

A sarkantyúvirág XET aktivitását kódoló cDNS teljes szekvenálása alapján (WO 93/17101 számú szabadalmi bejelentés) printereket terveztünk annak érdekében, hogy PCR amplifikálással megkíséreljünk hasonló génfragmenst izolálni paradicsomból. A primerek közül kettő (az alább ismertetett NXG2H és NXG2B) átfedést mutatott egy, a Bacillus macerans b-1,31,4-glükanáz enzimmel homológ régióval, melynek aminosav-szekvenciája DEIDIEFLG. A többi primer a hisztidin maradékokkal (ezek gyakoriak a hidrolitikus enzimek aktív centrumában, és a hasonló funkciójú enzimek aktív centruma gyakran mutat elsődleges szekvencia homológiát) szomszédos, illetve azokat körülvevő régióknak felelt meg. Az ezeknek megfelelő aminosav-szekvenciák rendre PNHNRVD (NXG1H primer), HDEIDIE (NXGH2H és NXG2B primer), HLWFDPT (NXG3H és NXG3B primer), valamint TRDHTLT (NXG4B primer).

·· ···· ·· · • · · · · · ··· · ··♦ · · • · · · · · ·

NXG1H	5'	AAGCTTCCTCAACATCAAAGGGTAGA	3'	(sense)
NXG2H		AAGCTTCATGATGAAATCGATATTGA		(sense)
NXG2B		GGATCCTCAATATCGATTTCATCATG		(antisense)
NXG3H		AAGCTTCATTTATGGTTTGATCCAAC		(sense)
NXG3B		GGATCCGTTGGATCAAACCATAAATG		(antisense)
NXG4B		GGATCCGTTAACGTGTGGTCTCGTGT		(antisense)
		(9 - 14. szekvenciák)
	Ezek	a primerek a sarkatyúvirágban	levő	szekvenciára

nézve teljesen konzervatívak, és 5’ végükön restrikciós enzim felismerési helyeket tartalmaznak a PCR termékek klónozásának megkönnyítése érdekében. Mindazonáltal a fenti primerek használatával, és PCR technika alkalmazásával végzett, paradicsom DNS amplifikálását célzó kísérleteink egyike sem vezetett sikerre.

A sarkantyúvirág magjából származó XET levezetett aminosav-szekvenciája bizonyos mértékű homológiát (151 aminosav maradékból álló átfedő szakaszon 42 %-os egyezés) mutat az Arabidopsis thaliana genom kiónjából, és cDNS-éből levezetett szekvenciával [Medford et al., The Plánt Cell, 3, 359-370 (1991)]. A genom kiónban kódolt polipeptid a meri-5 nevet viseli, és funkciója jelenleg még ismeretlen.

Elhatároztuk, hogy a paradicsom DNS PCR amplifikálását megkíséreljük degenerált oligonukleotidok ( a következő ábrán látható XG117 és XG162) keverékének felhasználásával. Ezek az oligonukleotidok két olyan régiót is tartalmaznak, amelyek konzervatívak a meri-5 és a sarkantyúvirág XET esetében ·· ·* ··«· V* · • · · · · · · · • ««· · ··♦ · · « · · · ··»» ······ · « · egyaránt. Mégsem igen számítottunk sikerre, egyrészt a korábbi kudarcok, másrészt pedig a meri-5 funkciójának (ha van ilyen egyáltalán) ismeretlensége miatt.

Meglepő módon sikerült PCR technikával amplifikálni a paradicsom genom 122 bp méretű fragmensét, mely jelentős mértékű homológiát mutat a meri-5 és a sarkantyúvirág XET szekvenciákkal.

A kísérlet kivitelezése az alábbiak szerint történt.

Genom DNS-t izoláltunk fiatal paradicsom levélszövet tenyészetből (VF 143B-7879 sejtvonal, Tomato Genetics Stock Centre, Department of Vegetable Crops, University of California, Davis, CA 95616 USA) az irodalomban ismert módon [Dellaporta et al., Plánt Mól. Bioi., 1, 19-21 (1983)].

A degenerált oligonukleotid keverékeket a konzervált DEID(I/F)EFLG(XG117) és HLWFDPT(XG162) régióknak megfelelően terveztük meg, a következőképp:

XG117 5' GA(C/T) GA(A/G) ATIGA(C/T) (A/T) T (A/C/T) GA(A/G) TT 3' (sense)

XG162 3' GT(G/A) (G/A) A (G/A/T/C) ACCAA (G/A) CT (G/A) GGI TG 5’ (antisense) (15. és 16. szekvencia)

A degenerált oligonukleotidokat ezután printerként használtuk fel a következő reakciókban (valamennyi esetben a teljes reakciótérfogat 100 μΐ volt): 1-2 μς genom DNS, • 4 »· ·«·· 4*· » · · b · ·· · • ··· · ··· · · • · · · <···· ····«· · *r

100-100 pM XG117 és XG162, 0,2-0,2 mM dGTP, dATP, dTTP és dCTP, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl₂, 0,01 % (t/tf) zselatin, valamint 2,5 egység Taq DNS polimeráz (Stratagene).

A ciklikus melegítéssel járó reakciót MJ Research programozható hőfokszabályzóval hajtottuk végre, a kezdeti denaturálási lépést 2 percen át 94 ’C-on végeztük, melyet 35 olyan ciklus követett, amely 1 percen át 94 °C-on, 2 percen át 40 °C-on és 2 percen át 72 °C-on történő hőkezelésből állt. Az amplifikációs termékeket 0,5 jimg/ml etídium-bromidot tartalmazó 2 %-os agaróz/TBE gélen frakcionáltuk, és UV átvilágítással vizualizáltunk. A gélből a DNS fragmenseket DEAE papír segítségével nyertük ki tiszta formában a Sambrook és munkatársai által leírtak szerint (Molecular Cloning: A Laboratory Manual).

A fő PCR termék 122 bp méretű volt, ezt pT7Blue DNS-sel (AMS Biotechnology) ligáltuk és DNS szekvencia analízisnek vetettük alá. Az általunk szekvenált négy kiónból háromnak teljesen azonos volt a DNS szekvenciája (PX3), egy pedig mind a DNS, mind pedig a levezetett aminosav-szekvenciában (PX1) eltérést mutatott, amint az a 2. ábrán látható. A 2. ábrán a Tom3 és a Tomi a PX3, illetve a PX1 esetében levezethető aminosav-szekvenciákat mutatják, a meri-5 és a sarkantyúvirág XET szekvenciákkal összehasonlítva.

Annak érdekében, hogy alaposabb szekvencia információ birtokába jussunk, paradicsom cDNS könyvtárat szereztünk be a • · < · ·

Clontech Laboratories Inc. cégtől (melyet mRNS felhasználásával az érési folyamat breaker fázisában lévő Ailsa craig VFN8 paradicsomfajtából készítettek). Ennek felhasználásával, oligo-(dT), valamint random primerek alkalmazásával cDNS-eket szintetizáltunk, és ezeket lambda gll fágba pakoltuk.

Ebből a könyvtárból mintegy 200 ezer cDNS kiónt vizsgáltunk át, a 122 bp méretű PCR fragmenst radioaktívan jelölt DNS próbaként használva. Az utóbbi előállítására a gélen tisztított 122 bp méretű amplifikációs termék 25-30 ng mennyiségét 9 μΐ vízben 5 percen át 100 ’C-on melegítve denaturáltuk, majd jegeltük. A fragmens radioaktív jelölését ³²P-dCTP (Amersham International plc) felhasználásával, Sequenase v2.0 (United States Biochemicals Inc.) készlet alkalmazásával végeztük. A jelöletlenül maradt nukleotidot Sephadex G-50 géloszlopon való kromatografálással távolítottuk el.

Az így előállított próba használata révén egy sor pozitív reakciót mutató kiónt sikerült kimutatni a cDNS könyvtárban. Ezeket az agaróz fedőrétegből 0,1 ml SM oldattal [50 ml Tris-HCl pH=7,5, 10 mM MgSO₄, 100 mM NaCl, 0,01 % (t/tf) zselatin] eluáltuk és a teljes eljárást ismételve tovább tisztítottuk. A bakteriofágból az inszertet vagy direkt PCR technikával, vagy pedig az izolált DNS emésztésével nyertük ki.

A direkt PCR technika alkalmazásához a bakteriofág • ·· · ·· ·· • ··· · ····· • ·· ····· ······ · · * törzsoldat 5 μΐ térfogatú (10⁵-10^e pfu) alikvotjait 5 percen át 100 ’C-on hőkezeltük, majd a korábban leírt összetételű oldathoz adtuk, azzal az eltéréssel, hogy a degenerált oligonukleotidok helyett ezúttal 20-20 pM 5', illetve 3' gtll oligonukleotidot (Clontech) használtunk. A ciklikus hőkezelést az alábbiak szerint végeztük: 2 percen át 94 °C-on tartás, 25 ciklusban 1 perc 94 ’C-on, 1 percen át 55 °C-on és 2 percen át 72 ’C-on tartás, majd végül 5 percen át 72 ’C-on tartás. Az amplifikációs termékeket a fentiekben ismertetett módon, 1 %-os agaróz gélen tisztítottuk.

A PCR amplifikálással kapott, tisztított termékeket pT7Blue PCR klónozó vektorba (AMS Biotechnology Ltd.) ligáltuk, és ezzel - a gyártó előírásának megfelelően eljárva kompetens Escherichia coli sejteket transzformáltunk.

A rekombináns plazmidot tartalmazó telepekről 30 ml térfogatú, 50 μg/ml ampicillint és 12,5 μg/ml tetraciklint tartalmazó Lennox tápközeget oltottunk, melyet egy éjszakán át 37 ’C-on inkubáltunk. A tenyészetből a tisztított plazmid DNS-t Plasmid midi készlet (Qiagen Inc.) alkalmazásával nyertük ki. A klónozott termékek restrikciós analízisét az Amersham International plc. enzimjeinek és puffereinek felhasználásával, majd agaróz gélelektroforézissel végeztük.

A DNS szekvenálását a United States Biochemicals készletének és protokoljának (Sequenase v2.0) használatával hajtottuk végre. A Qiagen készlettel kapott rekombináns plazmidok szekvenálása vagy közvetlenül történt, vagy pedig azt ·· ·· ···· ·· · • ·· · ·· · · • ··· · ····· • ·· ····· ······ · · · követően, hogy a restrikciós fragmenseket M13 fágban szubklónoztuk egyszálú templátok előállítása céljából. A reakciótermékeket 30 x 40 x 0,4 mm méretű poli(akril-amid) gélen frakcionáltuk 6 %-os akril-amid oldatot (BRL) használva. Az analízis során nyert adatokból IBM számítógép és DNAstar szoftver segítségével határoztuk meg a szekvenciákat.

A kiónok mérete 500 és 1400 bp tartományban ingadozott.

A kiónok egyike (tXET-Bl vagy egyszerűbben Bl) Hindii! és SacI felismerő helyeket tartalmazott, melyek megkönnyítették az M13 fágban való szubklónozást. Annak érdekében, hogy a klón szekvenciáját teljesen, és mindkét irányban meghatározzuk (3. ábra), belső primereket is felhasználtunk. Ezeknek a belső printereknek (8-TH és 8-HS sense, valamint 8-TB és 8-HT antisense primer) a szekvenciája a következő:

8-TH	5'	CGATGCAGCTGGAATTTCA	3'
8-TB	5'	AGTTTGAGCTGCATATCGAA	3'
8-HS	5'	TTTGATCCCACCTCGCCGTT	3'
8-HT	5'	CAGCTGACCAAACACAAGCA	3’

(17 - 20. szekvenciák)

A többi primer szekvenciája az alábbi:

T3 5’	ATTAACCCTCACTAAAGGGA	3’
T7 5'	TAATACGACTCACTATAGGG	3'
U195'	GTTTTCCCAGTCACGACGT	3'

(21 - 23. szekvenciák) • · • ··· · ··· · · • ·· ····· ······ · · ·

Az U az M13 (-40) prímért jelöli. Kezdetben két szekvenciát találtunk, a lambda törzsoldat különböző PCR amplifikálása eredményeképp. Az eltérés közöttük a valószínű kódoló régióban 2 bázispár volt. Mivel ez az eltérés minden valószínűség szerint a PCR technika során felhasznált hőstabil DNS polimeráz pontatlanságának tudható be, lambda DNS-t preparáltunk, és a cDNS-t pBluescript SK+ vektorba ligáltuk annak érdekében, hogy definitiv szekvencia adatokhoz jussunk (1. ábra). A B1 klón definitiv nukleotid-szekvenciája az 1. ábrán látható, a belőle levezethető aminosav-szekvenciával együtt.

A B1 klón valószínű open reading frame szakasza 289 aminosav maradékból álló polipeptidet kódol, melynek számított molekulatömege 32,7 kDa. Ez a polipeptid 270 aminosav maradékból álló, a sarkantyúvirág XET polipeptiddel átfedést adó szakaszán 39 %-os azonosságot mutat, a meri-5 polipeptiddel átfedő 186 aminosav maradékból álló szakaszon pedig 59 %-os egyezés állapítható meg. Az 1 - 25 pozíció aminosavjainak hidrofobicitása alapján szignálpeptid jelenléte valószínűsíthető, az aminosav-szekvencia statisztikai elemzéséből pedig arra következtethetünk, hogy a prekurzor hasítási helye a 20 és 21 helyen lévő alanin, illetve aszparaginsav maradékok között van [Von Heijne, Eur. J. Biochem., 113, 17-21 (1983).

A B1 klón azon szakasza, amely a genomból származó PCR fragmensnek felel meg (103 - 129 közötti aminosavak) , élté21 rést mutat mindkét genom fragmensből levezethető aminosav-szekvenciától. Ez a jelenség arra utal, hogy a B1 klón a paradicsomban levő multigén család egyik tagjának tekinthető. Azonosítottuk a valószínű N-glikozilálási helyet (Asn-XSer/Thr, 105 - 107 közötti aminosavak), amely szintén megtalálható a meri-5 és a genom fragmens esetében, de nincs meg a sarkantyúvirág XET polipeptidben.

A másik kinyert klón (tXET-B2, rövidebben B2) nagyobb, mint a B1 klón, de nem tartalmaz a szubklónozást megkönnyítő restrikciós felismerő helyeket, így több belső prímért is fel kellett használnunk a teljes DNS szekvenálás során. A B2 klón szekvenciájának meghatározása során követett stratégia sémája a 4. ábrán szerepel. A 4. ábrán E=EcoRI hasítási hely, P=PstI hasítási hely, (a) a vektor primerekkel kapott szekvenálást, (b) és (c) a belső primerekkel végzett szekvenálást mutatja. Egy sor prímért használtunk, egyebek között az alábbi szekvenciákat:

16-1	5'	AATATCAGCGGAAACAGGG	3'
16-1R	5'	CCCTGTTTCCGCTGATAATT	3 '
16-2	5'	CTATTAGCATCTGCACAGTA	3 '
16-2R	5'	TACTGTGCAGATGCTAATAG	3 ’
16-3R	5'	GGAGGACGGGTGAAGACAGA	3'
16-4	5'	GTGTAAGGTAGTCCTGATGA	3'
16-4R	5'	TCATCAGGACTACCTTACAC	3'

(24 - 30. szekvencia)

A 287 aminosav levezetésére lehetőséget adó open • · · · · reading frame szakaszt sikerült azonosítanunk. A B2 klón meghatározott aminosav-szekvenciája, és a belőle levezethető aminosav-szekvencia az 5. ábrán látható. A 6. ábra a B1 klón cDNS szekvenciáját, valamint a belőle levezethető aminosav-szekvenciát mutatja, közvetlenül összehasonlítva a B2 kiónból levezetett aminosav-szekvenciával. (A 6. ábrán a pontok az azonos aminosavakat, a nyilak pedig a valószínűsített szignálpeptid hasítási helyet jelölik.) A B2 klón esetében valószínűsített szignálpeptid 2 aminosavval rövidebb, mint a B1 kiónban szereplő, így az érett polipeptid 269 aminosav maradékból áll. A valószínűsíthető N-glikozilálási hely ugyanott található, ahol a B1 klón esetében. Nyolc, illetve tizenhat klón összehasonlítását elvégezve, a valószínűsíthető érett polipeptidekben 16 aminosav eltérés mutatkozott, melyek közül 14 volt konzervatív.

Hydrophobic Cluster Analysis (HCA) alkalmazásával [Gaboriaud et al., FEBS Letters, 224, 149-155 (1987) és Henrissat et al., Biochem. J., 255, 901-905 (1988)] megvizsgáltuk, hogy a B1 klón által kódolt polipeptid mutat-e konformációs homológiát más ismert fehérjékkel.

A sarkantyúvirág XET, a meri-5, illetve a B1 paradicsomklónból levezethető aminosav-szekvenciákból WordPerfect™ 5.1 makró használatával, az α-hélix módosított kétdimenziós ábrázolása [Henrissat et al., ibid.] alapján megszerkesztettük a HCA ábrákat. A hidrofób csoportokat kézzel körülhatárolva és manuálisan egymáshoz igazítva a HCA homo• · • · · · · · · · • ··· · ····· • · « ····· «····· · · · 23 lógia értékét kiszámítottuk.

Mindhárom proteinnél hasonló folding prognosztizálható (a) a szekvencia legnagyobb részén fellelhető konzervált szakaszok folyamatos jelenléte alapján, valamint (b) mivel a HCA homológra összértékek mindhárom összehasonlításban meghaladják a 75 %-ot (meri-5/Bl paradicsom XET klón esetében 86 %; sarkantyúvirág XET/B1 paradicsom XET klón esetében %; meri-5/sarkantyúvirág XET esetében 78 %).

Mindez alátámasztja az elsődleges szekvencia homológiából nyert adatokat, valamint a másodlagos szerkezetre vonatkozó előrejelzéseket [Kyte & Doolittle, J. Mól. Bioi., 157, 105-132 (1982)], amelyek arra mutatnak, hogy ez a három fehérje valószínűleg nagyjából hasonló folding tulajdonságokkal és így hasonló funkcióval is rendelkezik, jóllehet a részleteket illetően különbözhetnek egymástól.

Megkíséreltük a B2 kiónt Escherichia coli gazdaszervezetben expresszálni. Ezt a munkát ismertetjük a következő 2. példában.

2. példa

A B2 klón manipulációja E. coli sejtekben való expresszióhoz

A valószínűsíthető érett fehérje N-terminális végét kódoló szekvencia közelébe BamHI felismerő helyet építettünk be PCR technikával, mutagén primer (16-1 B: CCCTTGGATCCGCTATAATT; 31. szekvencia) és Bluescript primer (T3, Stratagene) felhasználásával. A reakciót a következő ·· ·· · · · · · · · • ·· · · · · · • ··· · ····· » · · · · · · ·····* · · · körülmények között hajtottuk végre: 1 ng XET klón Bluescript SK+ vektorban, 0,4-0,4 mM dATP, dCTP, dGTP és dTTP, 25 pM primer 1 x VÉNT polimeráz puffer, valamint 0,25 egység VÉNT DNS polimeráz (New England Biolabs Inc.). A ciklikus hőkezelést az alábbiak szerint végeztük: 2 percen át 93 ’C-on tartás, 25 ciklus 1 percen át 93 ^eC-on, 30 másodpercen át 55 °C-on, és 1 percen át 72°C-on tartás.

Rekombináns paradicsom XET túltermeltetése E. coli sejtekben

A paradicsom XET E. coli sejtekben való expresszióját QIAGEN QIAexpress™ rendszer alkalmazásával valósítottuk meg. A mutagenizált PCR termék BamHI - Hindii! fragmensét pQE30 expressziós vektorba ligáltuk, és ezzel olyan E. coli M15 sejteket transzformáltunk, amelyek tartalmazták a pREP4 repressziós plazmidot. Ez az expressziós vektor lehetővé teszi az N-terminális vég 6 hisztidin maradékkal való jelölését, ami nagy affinitást biztosít a QIAGEN Ni-NTA (nikkel nitrilo-triecetsav) típusú gyantájához. A sejteket Lennox tápközegben, a megfelelő antibiotikumok jelenlétében elszaporítottuk, és 2 mM IPTG hozzáadásával indukáltuk, midőn a tenyészet 600 nm hullámhosszon mért optikai denzitása elérte a 0,7 - 0,8 értéket. Ezután a tenyésztést további 3-5 órán át folytattuk. A folyamat nyomonkövetésére 0,5 ml térfogatú alikvot mintákból a sejteket centrifugálással elkülönítettük, és pufferben felvéve forraltuk [Laemmli, Natúré, 227, 680-685 (1970)], majd SDS poli(akril-amid) (10 %) gélelektro• ·· · ·· • ··· · ··· · · • · · ····· ······ · · · forézist végeztünk. Az elválasztott fehérjéket Coomassie blue színezékkel vizualizáltuk. Az affin jelöléssel ellátott fehérjék lokalizálása az előírásnak [4. protokoll, The QIAexpressionist 2nd edition, QIAGEN Inc. (1992)] megfelelően történt.

Rekombináns paradicsom XET protein tisztítása és refoldingj a

A rekombináns paradicsom XET fehérje tisztítását Ni-NTA gyantán, denaturáló körülmények között végeztük a The QIAexpressionist 7. protokollja szerint, azzal az eltéréssel, hogy az utolsó mosást követően a megkötött fehérjét tartalmazó oszlopot 0,5 M NaCl, 20 % glicerin és 40 mM TrisHC1 (pH=7,4) tartalmú 6 M koncentrációjú karbamid oldattal ekvilibráltuk. A protein refoldingját FPLC-vel vezérelt, a korábbi komponenseket tartalmazó 6 Μ - 1 M karbamid gradienssel (0,25 ml/perc áramlási sebesség, 24 ml térfogat) hajtottuk végre, majd az elúciót 0,5 M NaCl, 20 % glicerin, 40 mM Tris-HCl (pH=7,4) és 250 mM imidazol tartalmú, 10 ml térfogatú, 1 M koncentrációjú karbamid oldattal végeztük.

A XET aktivitás meghatározása

S. C. Fry (University of Edinburgh) által rendelkezésünkre bocsátott ³H jelöléssel ellátott XG oligoszacharidok polimer XG-be való beépülését mértük a Fry és munkatársai által leírt módon [Biochem. J., 261, 9489-9494 (1992)]. A fehérjekoncentrációt a BioRad cégtől származó készlet felhasználásával becsültük.

N-terminál is aminosav-szekvenálás

A tisztított rekombináns fehérjét a korábban ismertetett módon elektroforézisnek vetettük alá, nagytisztaságú reagenseket használva. A fehérjéket ezután Problott™ membránon (PVDF-származék anyagú membrán az ABI cégtől) rögzítettük elektroblott technika (0,5 A, 2 óra) alkalmazásával. A vizualizálást 1 % Coomassie Brilliant Blue színezéket tartalmazó 50 %-os metanollal végeztük. A megkötött fehérjét szekvenciális Edman lebontásnak vetettük alá, ABI model 740 típusú gázfázisú szekvenátoron, folyadékpulzálásos üzemmódban [Cottingham et al., Biochim. Biophys. Acta, 956, 201-207 (1988)].

A rekombináns paradicsom XET protein expressziója és jellemzése

A rekombináns paradicsom XET fehérjét E. coli sejtekben oly módon expresszáltuk, hogy N-terminális végén tartalmazza a tisztítást elősegítő, 6 hisztidin aminosav maradékból álló jelzést. Az előre jelzett molekulatömegű (32 kDa), jelöléssel ellátott fehérje a nem oldott frakcióban volt jelen. Fáziskontraszt mikroszkóppal vizsgálva az expresszáló tenyészetet, a sejtek mindegyikében erősen fénytörő objektumok voltak láthatók, ami arra utal, hogy bennük oldhatatlan, ún. inclusion bodies formájában van jelen a rekombináns fehérje (nem közölt adat) . A denaturáló körülmények között kivitelezett nagyléptékű tisztítást követően a jelöléssel ellátott fehérje N-terminális aminosav-szekvenálásának eredménye ·· ·· ···· · · · • ·· · · · ·· • · · ♦ « · · · · · • ·· ····· ······ · · · (MRGSHHHHHHGSADNFYQDA Seq ID No. 32) bizonyította mind a protein rekombináns paradicsom XET fehérjével való azonosságát, mind pedig a 6 hisztidin aminosav maradékból álló jelölés jelenlétét az N-terminális végen.

A rekombináns paradicsom XET fehérje refoldingjára Ni-NTA agaróz gyantához kötött állapotban, fordított karbamid gradiens alkalmazásával került sor. Az oszlopról való leoldást követően 15 ml térfogatú minta felhasználásával vizsgáltuk a ³H-XG oligoszacharidok (XGOs) beépülését XG polimerbe. Minden ezer Bq aktivitásra 400 Bq aktivitású ³H-XGO beépülés jutott óránként, mg fehérjére vonatkoztatva. 0, 5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH=7,2) és 20 % glicerin tartalmú oldattal szemben végzett dialízist követően a fajlagos aktivitás mintegy 700 Bq/kBq/óra/pg értékre növekedett.

A B2 kiónt a fentiek szerint oly módon expresszáltuk E. coli sejtekben, hogy a szignálpeptidnek tűnő N-terminális szekvenciát a tisztítást elősegítő 6 hisztidin aminosav maradékból álló jelölésre cseréltük. A tisztítás és a refolding után a rekombináns fehérje képesnek mutatkozott katalizálni a radioaktív jelzéssel ellátott XG oligoszacharidok beépülését XG polimerbe, ami igazolta a XET aktivitást. Az így kapott XET fehérje fajlagos aktivitása (700 Bq/kBq/óra/pg) viszonylag alacsony, hiszen a növésben lévő paradicsomnövény szárából készített nyers extraktum is rendelkezik 100 Bq/kBq/óra/pg fajlagos XET aktivitással. Mivel a rekombináns fehérje 90 %-nál tisztább, a jelenségért • · · a nem tökéletesen helyes refolding lehet a felelős.

A sarkantyúvirág XET fehérjétől eltérően, mindkét klón aminosav-szekvenciájában valószínűsíthető N-glikozilálási hely. Érdekes ezzel kapcsolatban megjegyezni, hogy a proteineket nem glikoziláló E. coli sejtben történő expresszió aktív XET fehérjét eredményezett. Ez azt mutatja, hogy a glikozilálás nem okvetlenül szükséges az in vitro XET aktivitáshoz, ami kérdéseket vet fel in vivő szerepét illetően. A sarkantyúvirág magjában lévő XET fehérje esetében a glikozilálás hiánya esetleg éppen a tartalék tápanyagok mobilizálásában játszott különleges szerepet tükrözi.

A XET fehérje növényekben betöltött funkciójára vonatkozó információ gyorsan gyarapszik. Azt a hipotézist, hogy a XET a növények növekedésében játszik szerepet, támogatja az a felismerés, hogy előfordulása korrelál a növekedéssel a borsószár hossza mentén [Fry et al., Biochem. J., 282, 821-828 (1992)], valamint a kukorica gyökerén [Pritchard et al., J. Exp. Bot., 44, 1281-1289 (1993)]. Úgy tartják, hogy a XET fehérje a sejtfal fellazításával lehetővé teszi a sejtek méretének növekedését.

Az is valószínű, hogy a XET a gyümölcsérés folyamatában is részes, minthogy erre mutat változó szintje az olyan különböző növényekben, mint a paradicsom, a körte (a feltalálók nem közölt megfigyelése) és a kiwi [Fry, Current Biology, 3(6), 355-357 (1993)]. Ebben az esetben a XET javíthatja más emzimek hozzáférését a sejtfal szoros illeszkedésű • ··· · ··· · · • ·· · · · · · ······ · · · hálózatához. Ezt az elképzelést támogatja a XET kis mérete és kompakt természete [Edwards et al., J. Bioi. Chem., 261, 9489-9494 (1986)]. Másrészről a XET részese lehet (esetleg más sejtfal hidrolázokkal együtt) a xiloglükán depolimerizációjának, mely az érési folyamat során következik be.

3. példa

A fentiekben ismertetett rekombináns DNS munka mellett arra is kísérletet tettünk, hogy XET aktivitással rendelkező polipeptidet nyerjünk ki és állítsunk elő tiszta formában a paradicsom növényből.

1. lépés: A XET aktivitás meghatározása

A különböző pradicsom termés extraktumok XET aktivitásának mérése a 3H-jelzett xiloglükán oligoszacharidok xiloglükán polimerbe való beépülése alapján történt. Ez a meghatározási módszer a transzglikoziláz aktivitást méri. A meghatározáshoz a következő komponenseket használtuk fel: 10 μΐ Na-Mes pH 6,0 (Na-Mes = nátrium 2-[N-morfolino]-etánszulfonát) , 10 μΐ 8 mg/ml xiloglükán, és 5 μΐ [³H]XGO (0, 7 kBq) .

A reakcióelegyet 25 °C-on egy órán át inkubáltuk, majd a reakciót 100 μΐ 20 %-os hangyasav hozzáadásával leállítottuk, és a reakcióelegyet 5x5 méretű cellulóz szűrőpapír korongra (Whatman 3MM Chromatography paper) vittük fel. Korábbról ismeretes, hogy a xiloglükán polimer (akár [³H]XGO jelölt, akár jelöletlen) hozzákötődik a cellulóz szűrőhöz, a ·· · ♦ · (’HJXGO oligoszacharidok viszont nem. A szűrőpapír korongokat száradni hagytuk, majd a be nem épült [³H]XGO-t 30 perces folyóvizes mosással eltávolítottuk. A szűrőpapír korongokat 60 ’C-on ismét megszárítottuk, majd átitatott felükkel kifelé felcsavartuk, és 22 ml térfogatú szcintillációs edénybe helyeztük. A mintákhoz szcintillációs folyadékot (2 ml Betamax ES) adtunk és ³H tartalmukat szcintillációs számlálóval megmértük. A meghatározás lényegében megegyezik a Fry és munkatársai által leírttal (korábban idézett irodalmi hely).

2. lépés: XET fehérje extrakciója paradicsom magházból

Különféle extrakciós puffereket próbáltunk ki és hatásosságukat értékeltük. Azt tapasztaltuk, hogy a XET aktivitás eredményesen extrahálható 0,1 M nátrium-foszfát pufferrel (pH=7,2). Megfigyeltük azt is, hogy a XET aktivitás visszatartása jelentős mértékben függ az ionerősségtől. Teljesen elvesztettük az aktivitást abban az esetben, ha a kromatográfiás és egyéb pufferek ionerőssége kevesebb volt, mint 0,2 M.

3. lépés: A kiindulási anyag kiválasztása

Nyers extraktumot készítettünk (0,1 M nátrium-foszfát puffer, pH=7,2) paradicsom (Lycopersicum esculentum var. Moneymaker) magház szövetből, a növekedési és érési folyamat különböző stádiumában. Több kísérlet során következetesen azt tapasztaltuk, hogy a kis zöld bogyó (átmérő <35 mm) ren31 ·· ·· ···· ·· · « ·· · · · · · • ··· * ··· · · • ·· itat ······ · · · delkezett a legnagyobb XET aktivitással, mind az összes, mind pedig a fajlagos aktivitást tekintve. Ezért a tisztítási kísérletekhez kiindulási anyagul a kis zöld bogyó magházát választottuk.

4. lépés: Ammőnium-szulfátos kicsapás

A 35 mm alatti átmérőjű kis zöld bogyóból származó magház szövetet (100 g) a szedés után folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, és a felhasználásig -20 vagy -70 °C hőmérsékleten tároltuk. A szövet homogenizálását lg: 1,5 tf arányú, 1,0 % (t/tf) oldhatatlan polivinil-pirrolidont (PVP) tartalmazó 0,1 M nátrium-foszfát pufferrel (pH=7,2) turmixolva végeztük. A homogenizátumot 1 órán át 4 °C-on kevertük, hogy lehetővé tegyük a sejtfal enzimek diffúzióját, majd a szilárd részeket centrifugálással (20000 g, 30 perc, 4 ’C, SS34 rotor, Sorwall RC5B centrifuga) eltávolítottuk. A felülúszót üveggyapoton szűrtük, és szilárd ammónium-szulfát hozzáadásával (60,3 g/100 ml) 90 %-os telítettségre állítottuk be a koncentrációt. Az elegyet 40 percen át 4 ’C-on kevertük, majd a kicsapódó fehérjéket centrifugálással (38000 g, 30 perc, 4 °C) kinyertük. Az ammónium-szulfáttal kicsapott fehérjéket reszuszpendálás nélkül -20 ’C-on tároltuk a további felhasználásig.

5. lépés: S-Sepharose kationcserélő kromatográfia

Az ammónium-szulfáttal kicsapott fehérjéket 10 ml térfogatú, ImM EDTA, 20 gg/ml kimosztatin és 1 mM PMSF tar• ·· · · · ·· ··· · >·«·· • · * ····· ······ · · · talmú A-pufferben (0,2 M nátrium-kloridot tartalmazó 50 mM nátrium-acetát puffer, pH=5,3) felszuszpendáltuk. Az így kapott szuszpenziót 2 órán át dializáltuk 2,5 1 A-pufferrel szemben, 3500 cut-off értékű dialízis cső alkalmazásával. A mintát 1 mM EDTA tartalmú 50 mM nátrium-acetát pufferrel (pH=5,3) hígítottuk, hogy a vezetőképességet az S-Sepharose oszlopra vitelhez megfelelő értékre csökkentsük. A mintát ezután centrifugáltuk (38000 g, 15 perc, 4 °C), majd a felülúszót A-pufferrel ekvilibrált 7 ml térfogatú S-Sepharose Fást Flow oszlopra (Pharmacia) vittük. Az oszlopot A-pufferrel mostuk (1 ml/perc áramlási sebesség), a meg nem kötött fehérjék eltávolítására. A megkötött fehérjéket 10 oszloptérfogatnyi mennyiségű 0 - 100 % B-puffer (1 M NaCl tartalmú A-puffer) gradienssel eluáltuk. 2 ml térfogatú frakciókat szedtünk, és ezek XET aktivitását meghatároztuk.

6. lépés: Konkanavalin A affinkromatográfia

Az S-Sepharose ioncserélő kromatografálással kapott magas XET aktivitást mutató frakciókat egyesítettük, és -20 ’C-on tároltuk. A konkanavalin kromatografálás előtt az elegyhez 1 mM végkoncentrációra számított mennyiségű magnézium-kloridot, valamint mangán(II)-kloridot adtunk. Az eluátumot ezután centrifugáltuk, és a felülúszót C-pufferrel (0,2 M NaCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ és 1 mM MnCl₂ tartalmú 50 mM nátrium-acetát puffer pH=5,7) ekvilibrált konkanavalin A oszlopra vittük. A megkötött fehérjéket az oszlopról D-pufferrel (0,5 mM metil-a-D-mannopiranozid tartalmú

9999 99

		33		• 9 9 9 9 9 9 9 9 999 9 999 9 9 9 9 9 9 9999 999999 9 · ·
C-puf fer)	történő	egylépéses	elúcióval	oldottuk le.

Frakciókat gyűjtöttünk, melyek XET aktivitását meghatároztuk.

7. lépés: N-terminális aminosav-szekvenálás

A konkanavalin A oszlopról lejövő, magas XET aktivitású frakciók fehérjéit látszólagos molekulatömegüknek megfelelően 15 %-os poli(akril-amid) gélen elválasztottuk. Az elektroforézis után a fehérjéket Problott™ membránra vittük (transzfer puffer: 10 mM CAPS pH=ll tartalmú 10 %-os metanol). A Problott™ membránt 0,1 % Coomassie Brilliant Blue R250 színezéket és 1 % ecetsavat tartalmazó 40 %-os metanollal festettük, a színezék fölöslegét 50 %-os metanollal távolítottuk el. A membránon egyetlen sáv volt látható kb. 36000 látszólagos molekulatömegnél, azaz sikerült a fehérjét egységessé tisztítani. A sávot a gélből kivágtuk és N-terminális aminosav-szekvenálásnak vetettük alá ABI modell 475 fehérje szekvenátoron. A meghatározott szekvencia GYPRRPVDVPFWKNY (Seq ID No. 33) volt. A szekvencia szintje megfelelt a festett proteinsáv színintenzitásának.

Mindezek alapján a találmány egy további tárgya xiloglükanáz aktivitással rendelkező, lényegében tiszta polipeptid, melynek SDS-PAGE alapján meghatározott molekulatömege 36 kDa.

Az enzim előnyösen paradicsom növényből, legelőnyösebben pedig a paradicsom zöld termésének magházából nyerhető ki, és N-terminális aminosav-szekvenciája előnyösen

GYPRRPVDVPFWKNY.

«· ·»· · V · · • ·· « ·· * · • ««· « *·· · · • · « ♦ ···♦ ··· ς · · · *

Az enzim tisztítását előnyösen egy vagy több ammónium-szulfátos kicsapással, ioncserélő kromatografálással és/vagy konkanavalin A affinkromatografálással végezzük.

4. példa

XET fehérje expressziója paradicsomban

A korábban ismertetett XET meghatározás alkalmazásával nyomon követtük a XET aktivitás eloszlását a teljes paradicsom (var. Moneymaker) növényben. Extraktumot (0,2 M foszfát-pufferrel) készítettünk gyökérből, levélből és a növekedésben lévő növény különböző részéről származó kocsányból, valamint a termésből, a fejlődés négy, illetve az érés három fázisában. A legmagasabb XET aktivitást a növény csúcsáról származó kocsányban és a fejlődő (kis zöld) termésben sikerült kimutatni, ami igazolja a XET részvételét a növényi növekedésben.

Teljes RNS-t nyertünk ki paradicsom növényből a Qiagen extrakciós eljárás alkalmazásával. A tXET-Bl (B1 paradicsom XET klón) transzkripciós szintjét ribonukleáz protekciós analízissel határoztuk meg. Antisense tXET-Bl specifikus próbát készítettünk oly módon, hogy a Hindin emésztéssel linearizált ptXET-Bl plazmidot 1 μΐ T3 RNS polimerázzal inkubáltuk 0,5 mM rATP/rGTP/rCTP, 5 nM UTP, 50 μΟί³²Ρ-υΤΡ (800 Ci/mmól), 1 μΐ ribonukleáz inhibitor és 2 μΐ reakciópuffer (Ambion próba szintézis készlet) jelenlétében, 20 μΐ végtérfogatban, 25 ’C-on, egy órán át. Dezoxiribonukleázos ···· • · · · ··· · · • · ···· • · · • 4 · · • ··· • · ···· *· emésztés és fenol/kloroformos extrakció után a próbát etanolos kicsapással nyertük ki. 10⁵ cpm jelzett próbát 5 pg teljes RNS-sel inkubáltunk, és ribonukleáz protekciós analízist végeztünk az Ambion cégtől származó RPAII készlet alkalmazásával. A védett próba mennyiségi meghatározása denaturáló körülmények között végrehajtott elektroforézis után Phosphorlmager (Molecular Dynamics) készülékkel történt. A tXET-Bl transzkript legmagasabb szintjét a termés magházában sikerült kimutatni, mely az érés folyamán egyre emelkedő tendenciát mutatva maximális értékét a rózsaszínű termésben érte el. A szárban a legmagasabb értéket 30 cm magas növény esetében a csúcstól 10 cm-re mértük, ez nagyjából megegyezett a kifejlett zöld termésben mérhetővel. Jóval alacsonyabb tXET-Bl transzkript szintek voltak kimutathatók a levélben, és elhanyagolhatóan alacsonyak a gyökérben. Az aktivitásban, illetve a transzkript szintekben mutatkozó eltérés arra utal, hogy vagy a XET összaktivitást különbözőképp expresszálódó gének kódolják, vagy pedig arra, hogy a 0,2 M foszfátpufferrel izoformok szelektíven nyerhetők ki. A tXET-Bl expressziójának vizsgálatából kapott adatok azt valószínűsítik, hogy az érési folyamatban ez az izoform játszik szerepet.

5. példa

A XET enzimszint csökkentése transzgén paradicsom növényben

Konstitutív 2’-mannopin szintáz promotert hasítottunk ·· ·· ···· ·· · • ·· · ·· · · • ··· · ··· · · • ·· ····· ······ · ♦ · ki BglII emésztéssel a pSLJ2'Lnos plazmidból, és ezt a ptXETB1 plazmidba ligáltuk. (A pSLJ2'Lnos a pSLJ1006 plazmidból származik [Jones et al., Transgenic Research 1_, 285-297 (1992)], oly módon, hogy a β-glükuronidáz enzimet kódoló DNS szekvenciát polilinker szekvenciára cserélték). Ezzel a tXETB1 kódszekvencia a 2' promoter mögé, ahhoz képest antisense orientációba került (7. ábra). Ezután a promotert és a tXETB1 szekvencia 798 bp méretű (187 - 984 nukleotidok) Xba - Sst fragmensét a pGPTV-kan növényi transzformációs vektorba [Becker D. et al., Plánt Molecular Biology, 20, 1195-1197 (1992)] (8. ábra) klónoztuk. Az így előállított pGPTV-kan2’tXET-Bl plazmiddal Agrobacterium LBA4404 sejteket transzformáltunk, és a transzformáns Agrobacterium törzsekkel paradicsom (var. Moneymaker) sziklevél darabokat fertőztünk. A transzformált növényeket kanamycin jelenlétében szelektíven regeneráltuk. Az átvitt DNS jelenlétét a NPTIIb (5’ ATCGGGAGCGGCGATACCGTA 3’, 34. szekvencia) és a 8-HS (lásd fentebb) primerek közötti DNS szegmens PCR amplifikálásával bizonyítottuk. A rózsaszínű termésekből (15 növény) készített extraktumok XET aktivitását a korábban ismertetett módszerrel követtük nyomon. Az antisense tXET konstrukcióval transzformált növényekben a XET aktivitás akár 80 %-os csökkenése is megfigyelhető volt.

• ·

SZEKVENCIALISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:

(i) BEJELENTŐ: UNILEVER PLC (ii) A TALÁLMÁNY CÍME: Új növényi enzim (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 34 (2) INFORMÁCIÓK AZ 1. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 994 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 79..945 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 1. szekvencia

GAAGiaGACG

A7GCAGCTGG AAi : iC.AAAC AlACATTCCC AAA.AACAACT

AACTACATAT • · • · ·· • · · · • · · • · ··· · · • · · · · • ·

TCCT

7AAG

iAT T

TCCT

ATA

A i G

kg

CTG

CAG

CTA

TCT

gk c í i

GC i

CTA

111

Met

Leu

Gin

Leu

Ser

Val Leu

Alá

Leu

1

5

10

ck

CTG

KG

CTA

TGT

CC i

gk

TGG

GCT

GAC

AAT

KC

TAC C.AA

GAT

GCA

159

Leu

Cys

Pro

Val

Trp

Alá

Asp

Asn

Phe

Tyr Gin

Asp

Alá

15

20

25

ACG

GK

ACC

τπ

GGT

GAT

CAG

CGA

GCT

CAG

ATA

CAA

GAT GGT

GGG

CGC

207

Thr

Val

Thr

Phe

Gly

Asp

Gin

Arg

Alá

Gin

Ile

Gin

Asp Gly

Gly

Arg

30

35

40

οπ

CTC

GCC

KG

TCC

CK

GAC

AAA

Απ

TCA

GGT

TCA

gga τπ

CAG

TCT

255

Leu

Alá

Leu

Ser

Leu

Asp

Lys

Ile

Ser

Gly

Ser

Gly Phe

Gin

Ser

45

50

55

AAG

AAT

GAA

TAT

KA

τπ

GGA

AGG

πο

GAT

ATG

CAG

CTC AAA

CTA

GTA

303

Lys

Asn

Glu

Tyr

Leu

Phe

Gly

Arg

Phe

Asp

Met

Gin

Leu Lys

Leu

Val

60

65

70

75

CCT

GGA

AAT

TCT

GCT

GGC

ACT

GTC

ACT

ACC

πο

TAT

KG i C i

TCT

CAA

351

Pro

Gly

Asn

Ser

Alá

Gly

Thr

Val

Thr

Phe

Tyr

Leu Ser

Ser

Gin

80

85

90

GGA

GCA

GGG

CAC

GAC

GAA

AK

GAT

πτ

GAG

τπ

CTG

GGA AAT

TCA

399

Gly

Alá

Gly

Hl S

Asp

Glu

Ile

Asp

Phe

Glu

Phe

Leu

Gly Asn

Ser

95

100

105

GGC

CAA

CCG

TAC

ACG

gk

CAT

ACT

AAT

GTC

TAC

TCT

CAA GGA

AAA

GGC

447

Gly

Gin

Pro

Tyr

Thr

Val

His

Thr

Asn

Val

Tyr

Ser

Gin Gly

Lys

Gly

110

115

120

AAC

AAA

GAA

CAA

CAG

[ í

CGC

CTA

TGG

τπ

GAT

CCC

ACC TCG

CCG

KC

495

Asn

Lys

Glu

Gin

Phe

Arg

Leu

Trp

Phe

Asp

Pro

ihr Ser

Pro

Phe

125

130

135

CAC

ACC

TAC

TCT

AK

GK

TGG

AAC

TCT

CAA

CGC

ATC

ΑΤΑ TK

KG

GTG

543

Hl s

Thr

Tyr

Ser

Ile

Val

Trp

Asn

Ser

Gin

Arg

Ile

Ile Phe

Leu

Val

140

145

150

155

GAT

AAT

ATC

CCA

A-KA r\: a*.

AGA

GTA

πο

AAC

CAC

GAA

AAG CK

GGT

GK

591

Asp

Asn

Ile

Pro

i le

Arg

Val

Phe

Asn

His

Glu

Lys Leu

Gly

Val

160

165

170

GCA

πο

CCA

AAG

AAC

CAA

GCA

ATG

AGA

gk

TAT

GCC

AGi ί i A

TGG

AAT

639

A1 c

Phe

Pro

Lys

Asn

Gin

A1 a

Met

Ara

Val

Tyr

Alá

Ser Leu

ί rp

Asn

175

180

135

GOT

GAT

GAC

TGG

GCA

AGA

CAA

GGA

OUU

CGA

GTG

AAG

ACG GAT

TGG

TCA

687

Alá

Asp

Aso

irp

/. * ! C

: nr

G1 n

Glv

Gly

Arg

Val

Lys

ihr Aso

Trp

Ser

190

19’5

200

ATG

GOT

CCG

τπ

GCT

TCT

TAC

A hU U

AA í

' πο

Λ ΑΓ

ACA -AT

' GCT

i G i

735

Met

Alá

Pro

Phe

π h

Alá

Ser

Tyr

Arg

Asn

Phe

Asn

Thr Asn

Alá

Cys

205

210

215

GTT

i 'JIJ

TCA

GCT

GCA

TCG

TCT

AC i TCG

TCC

TGT

GGA

GGC

TCT

AAG

ACT

783

Val

Trp

Ser

Al a

Alá

Ser

Thr Ser

Ser

Cys

Gly

Ser

Lys

Thr

220

225

230

235

GAT

TCA GTA

AAC

AAT

GAT

CAG

GCA

TGG

CAA

ACT

CAA

GAA

CTG

AAC

GGT

831

Asp

Ser Val

Asn

Asp

Gin

Alá

Trp

Gin

ihr

Gin

Glu

Leu

Asn

Gly

240

245

250

AAT

GAC AGA

AAT

AGG

CTT

CGA

TGG

GTT

CAG

AAA

TAC

ATG

ATC

TAC

879

Asn

Asp Arg

Asn

Arg

Len

Arg

Trp

Val

Gin

Lys

Tyr

Met

Ile

Tyr

255

260

265

AAT

TAC TGT

GCA

GAT

GCT

AAA

AGG

ne

TCT

CAA

GGC

CTT

TCT

CCT

GAA

927

Asn

Tyr Cys

Alá

Asp

Alá

Lys

Arg

Phe

Ser

Gin

Gly

Leu

Ser

Pro

Glu

270

275

280

TGC

AAA CGT

TCA

AGG

TTC

TAAAGGA'

ICA ,

AATC‘

7ACG.

AA TI

□TTG'

rCTG

T

975

Cys

Lys Arg

Ser

Arg

Phe

285

AATATTATCC CGGAATTCC 994 (2) INFORMÁCIÓK A 2. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 289 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 2. szekvencia

Met

Leu

Gin

Leu

Ser

Val

Leu

Alá

Leu

Cys

1

5

10

15

Pro

Val

Trp

Alá

Asp

Asn

Phe

Tyr

Gin

Asp

Alá

Thr

Val

Thr

Phe

Gly

20

25

30

Asp

Gin

Arg

Alá

Gin

Ile

Gin

Aso

Gly

Arg

Leu

Alá

Leu

Ser

35

£0

45

Leu

ASP 50

Lys

He

Ser

Gly

Ser 55

Gly

Phe

Gin

Ser

Lys 60

Asn

Glu

Tyr

Leu

Phe

Gly

Ara

Phe

Asp

Met

Gin

Leu

Lys

Leu

Val

Pro

Gly

Asn

Ser

Alá

r-

70

75

80

Gly

Thr

Ve 1

Thr

Phe

Tyr

Leu

Ser

Gin

Gly

Alá

Gly

His

Asp

85

90

95

Glu

Ile

Asp

Phe

Glu

Phe

Leu

Gly

Asn

Ser

Gly

Gin

Pro

Tyr

Thr

100

105

110

• ·

Va 1

Hl s

Thr

Asn

Val

Tyr

Ser

Gin

Gly

Lys

Gly

Asn

Lys

Glu

Gin

115

120

125

Phe

Arg

Leu

Trp

Phe

Asp

Pro

Thr

Ser

Pro

Phe

His

Thr

Tyr

Ser

Ile

130

135

140

Val

Trp

Asn

Ser

Gin

Arg

Ile

Phe

Leu

Val

Asp

Asn

Ile

Pro

Ile

145

150

155

160

Arg

Val

Phe

Asn

HiS

Glu

Lys

Leu

Gly

Val

Alá

Phe

Pro

Lys

Asn

165

170

175

Gin

Alá

Met

Arg

Val

Tyr

Alá

Ser

Leu

Trp

Asn

Alá

Asp

Ásd

Trp

Alá

180

185

190

Thr

Gin

Gly

Arg

Val

Lys

Thr

Asp

Trp

Ser

Met

Alá

Pro

Phe

Thr

195

200

205

Alá

Ser

Tyr

Arg

Asn

Phe

Asn

Thr

Asn

Alá

Cys

Val

Trp

Ser

Alá

210

215

220

Ser

Thr

Ser

Cvs

Gly

Ser

Lys

Thr

Asp

Ser

Val

Asn

225

230

235

240

Asp

Gin

Alá

Trp

Gin

Thr

Gin

Glu

Leu

Asn

Gly

Asn

Asp

Arg

Asn

Arg

245

250

255

Leu

Arg

Trp

Val

Gin

Lys

Tyr

Met

Ile

Tyr

Asn

Tyr

Cys

Alá

Asp

260

265

270

Alá

Lys

Arg

Phe

Ser

Gin

Gly

Leu

Ser

Pro

Glu

Cys

Lys

Arg

Ser

Arg

275

280

285

Phe (2) INFORMÁCIÓK A 3. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 10 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: igen (iii) ANTI-SENSE: nem (v) FRAGMENS TÍPUSA: belső (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 3. szekvencia

Asp Glu He Asp Phe Glu Phe Leu Gly Asn

5 10 • · (2) INFORMÁCIÓK A 4. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 10 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: igen (iii) ANTI-SENSE: nem (v) FRAGMENS TÍPUSA: belső (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 4. szekvencia

Ser Leu Trp Asn Alá Asp Asp Trp Alá Thr 1 5 10 (2) INFORMÁCIÓK AZ 5. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 10 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: igen (iii) ANTI-SENSE: nem (v) FRAGMENS TÍPUSA: belső (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 5. szekvencia

Phe Tyr Ser Lys Asn Glu Tyr Leu Phe Gly

5 10 (2) INFORMÁCIÓK A 6. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 10 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: igen (iii) ANTI-SENSE: nem (v) FRAGMENS TÍPUSA: belső (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 6. szekvencia

Gly Thr Val Thr Thr Phe Tyr Leu Ser Ser 15 10 (2) INFORMÁCIÓK A 7. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 1289 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENS: nem (ix) TULAJDONSÁG:

• · • · · · ·· · • · · • · • · · · · • · · · ·

A« (A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 232..1092 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 7. szekvencia

GAAKCTGGG TAGGCKTGG KGCAATAAG CGTCTGKCT TCGCKACTA CKTGGAAAA60

AKGACKTA GGCCTGCGGT CCCTAGCAK AAAKCATCG ACCGCTGTGT CATATAGACG120

CCGCTTTGCA AGATCGKGA CCAAGGTAK GTTACCTCGG ACGGTCTCAA GCAAAGCGGA180

CGATGTGGCT GTTTGTGTGT ATGCCAKGT AGTTGTAGAA TGTAAAATAT A ATG KG237

Met Leu

CTG CAG CK TCT CK CK

ACA CTA GTC

KA CTA TCC CCT

GK TCC

GCT Alá

285

Leu Gin Leu

Ser

Leu

Thr

Leu 10

Val

Leu Leu

Ser

Pro 15

Val

Ser

5

GAT

AAT

KC

TAC

CAA GAC

GCG

GTC

ACG

TK

GGT GAC

CAG

CGC

GCT

333

Asp

Asn

Phe

Tyr

Gin

Asp

Alá

Val

Thr

Phe

Gly

ÁSD

Gin

Arg

Alá

20

25

30

CAG

ATA

CAA

GAT

GGA

buu

CGC

CK

CTC

ACA

KG

TCA

CK

GAT

AAA

AK

381

Gin

11 e

Gin

Ásd

Gly

Glv

Ang

Leu

i hr

Leu

Ser

Leu

Asp

Lys

Ile

35

40

45

50

TCA

GGT

TCC

GGA

TK

CAG

TCT

AAG

AAT

GAG

TAT

KA

KC

GGA AGG

KC

429

S°r

Gly

Ser

Gly

Phe

Gin

Ser

Lys

Asn

Glu

i y r

Leu

Phe

Gly

Arg

Phe

55

60

65

• · * · ·

U A 1 A 1 L3

CAG

CTT

AAA

CTC

GTA

Cli GGA

AAT

TCT

GCT

GGC

ACT

GTC

ACC

477

Ásd Met

Gin

Leu

Lys

Leu

Vő 1

Pro Gly

Asn

Ser

A i a

Gly

Thr

Val

Thr

70

75

80

ACA iiC

TAT

TTG

TCT

CAA

GGA GCA

Guu

CAT

GAT

GAA

Απ

GAT

τπ

525

Thr Phe

Tyr

Leu

Ser

Gin

Gly Alá

Gly

His

Asp

Glu

Ile

Asp

Phe

85

90

95

GAG i 1i

CTA

GGA

AAT

TCA

GGA CTA

CCT

TAC

ACG

ΰπ

CAT

ACC

AAT

573

Glu Phe

Leu

Gly

Asn

Ser

Gly Leu

Pro

lyr

Thr

Val

His

Thr

Asn

100

105

110

G ι i iAC

TCT

CAA

GGA

AAA

GGC

AAT AAA

GAA

CAA

τπ

CGT

CTC

TGG

621

Val Tyr

Ser

Gin

Gly

Lys

Gly

Asn Lys

Glu

Gin

Phe

Arg

Leu

Trp

115

120

125

130

τπ GAT

CCA

ACT

TCG

ne

CAC ACT

TAC

TCT

Απ

οπ

TGG

AAC

TCT

669

Phe Asp

Pro

ihr

Ser

Phe

His Thr

Tvr

Ser

Ile

Val

Trp

Asn

Ser

135

140

145

C.AA CGG

ATC

ATA

τπ

HG

GTG

GAT AAT

ATC

CCA

Απ

AGA

GTG

πο

AAC

717

Gin Arg

Ile

Phe

Leu

Val

Asp Asn

Ile

Pro

Ile

Arg

Val

Phe

Asn

150

155

160

AAC CAC

GAA

GCA

CK

GGT

GH

GCA TAC

CCA

AAG

AAT

CAA

GCA

ATG

AGA

765

Asn His

Glu

Alá

Leu

Gly

Val

Alá Tyr

Pro

Lys

Asn

Gin

Alá

Met

Arg

165

170

175

GTT TAC

GCG

AGT

CTA

TGG

AAT

GCT GAT

GAT

TGG

GCT

ACA

CAA

GGA

813

Vei lyr

Alá

Ser

Leu

Trp

Asn

Alá Asp

Asp

i rp

Alá

Thr

Gin

Gly

180

185

190

CGG GTG

AAG

ACA

GAT

TGG

TCT

ATG GCT

CCG

τπ

ACA

GCT

TCT

TAC

AGG

861

Ara Vei

Lys

Thr

Asp

Trp

Ser

Met Alá

Pro

Phe

i hr

Alá

Ser

Tyr

Ara

195

200

205

21Ö

AAT TTC

AAT

ACA

AAT

GCT

TGT

G i i TGG

TCA

GCT

ACG

TCT

ACT

TCG

909

Asn Phe

Asn

Thr

Asn

Alá

Cys

Val Trp

Ser

Alá

Thr

Ser

ihr

Ser

215

220

225

TCT TGT

GGA

GGT

TCT

AAG

ACT

GAG TCA

GTA

AAC

AAT

GAT

GAG

ACA

TGG

957

Ser Cys

Gly

Ser

Lys

Thr

Glu Ser

Val

Asn

Asp

Glu

inr

Trp

230

235

240

CAA ACG

CAA

CTG

AAC

GCT

AAT GGA

AGA

AAT

AGA

ATA

CGA

TGG

6π

1005

Gin Thr

Gin

Leu

Asn

A1 a

Asn Gly

Arc

Asn

Arc

Ile

Arg

i rp

Va i

245

250

255

CAG CAG

AAG

TAC

ATG

ATC

TAC

AAT TAC

T>*-T

GCA

GA i

GCT

AAT

a Acj

ί 1 v

1053

G i n Gin

Lys

Tyr

Met

Ile

lyr

Asn lyr

Cys

Alá

Ásd

Alá

Asn

Arg

Phe

263

265

270

TCT CA.A

. GGC

TTT

TCT

CCT

' GAA

i ül. AAG

CGT

' TCA

, AG’j

πο

TAA

iGAT

1102

Ser Gin

Gly

Phe

Ser

Pro

• Glu

Cys Lys

Arg

Ser

Arg

Pne

275

280

225

• · ·

ATATATAGTA TATGAATGTA AAATTATGTT TGTTTCACTT TTCTATTCTT TTAATTTTGA TCAGGTAAAA AAAAAAAAGA ACATAGTGTA ΑιιAιIIGTG TAiGCAAí A ι A11CIi TATT CTTTTTGTAA TCATGAAATA GAAATAATAA TGAATTGTTT TCCTGAAAAA AAAAAAACCG GAATTCC

1162

1222

1282

1289 (2) INFORMÁCIÓK A 8. SZEKVENCIÁHOZ (í) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 287 aminosav (B) TÍPUS:aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 8. szekvencia

Met 1

Leu

Leu Gin Leu 5

Ser Leu Leu Tnr

Leu Val 10

Leu Leu

Ser

Pro 15

Val

Ser

Al a

Asp

Asn

Phe

Tyr

Gin

Asp Alá

Alá

Val

Tnr

Phe

Gly Asp

Gin

20

25

30

Arg

Alá

Gin

Ile

Gin

Asp

Gly Gly Arg

Leu

Thr

Leu

ζαρ

Leu

Asp

35

40

45

Lys

Ile

Ser

Gly

Ser

Gly

Phe

Gin

Ser

Lys

Asn

Glu

Tyr

Leu

Phe

Gly

50

55

60

Arg

Phe

Asp

Met

Gin

Leu

Lys

Leu

Val

Pro

Gly

Asn

Ser

Alá

Gly

Thr

65

70

75

80

Val

Thr

Phe

Tyr

Leu

Ser

Gin

Gly Alá

Gly

Hl s

Asp

Glu

Ile

85

90

. 95

Asp

Phe

Glu

Phe

Leu

Gly

Asn

Ser

Gly

Leu

Pro

Tyr

Thr

Val

His

100

105

110

Thr

Asn

Val

Tyr

Ser

Gin

Gly

Lys

Gly

Asn

Lys

Glu

Gin

Phe

Arg

115

120

125

Leu

Trp

Phe

Asp

Pro

Thr

Ser

Ph°

Hí S

Thr

Tvr

Ser

Ile

Val

Trp

130

135

140

Asn

Ser

Gin

Arg

He

Ile

Phe

Leu

Vei

Asp

Asn

Ile

Pro

11^a

Arg

Val

145

150

155

160

Phe

Asn

Hí s

Glu

Alá

Leu

Gly

Vei

Alá

Tyr

Pro

Lys

.-sn

Gin

Alá

165

170

175

Met

Arg

Val

Tyr

Alá

Ser

Leu

Trp

Asn

Al c

Asp Ásd

Trp

Alá

Thr

Gin

180

155

190

Gly

Ara

Val

Lys

Thr

Asp

Tro

Ser

Met

Alá

Pro

Phe

Thr

Alá

Ser

195

200

205

Tyr

Ara

Asn

Phe

Asn

Thr

Asn

Alá

Cys

Val

Trp

Ser

Alá

Thr

Ser

21Ö

215

220

T’nr

Ser

Cys

Gly

Ser

Lys

Thr

Glu

Ser

Val

Asn

Asp

Glu

225

230

235

240

Thr

Trp

Gin

Thr

Gin

Leu

Asn

Alá

Asn

Gly

Arg

Asn

Arg

Ile

Arg

245

250

255

Trp

Val

Gin

Lys

Tyr

Met

Ile

Tyr

Asn

Tyr

Cys

Alá

Asp

Alá

Asn

260

265

270

Arg

Phe

Ser

Gin

Gly

Phe

Ser

Pro

Glu

Cys

Lys

Arg

Ser

Arg

Phe

275 280 285 • * (2) INFORMÁCIÓK A 9. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 26 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 9. szekvencia

AAGCTTCCTC AACATCAAAG GGTAGA 2 6 (2) INFORMÁCIÓK A 10. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 26 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 10. szekvencia

AAGCTTCATG ATGAAATCGA TATTGA 26 (2) INFORMÁCIÓK A 11. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 26 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 11. szekvencia

GGATCCTCAA TATCGATTTC ATCATG 2 6 (2) INFORMÁCIÓK A 12. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 26 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 12. szekvencia • · · ·

AAGCTTCATT TATGGTTTGA TCCAAC (2) INFORMÁCIÓK A 13. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A)	HOSSZ:	26 bázispár
(B)	TÍPUS:	nukleinsav
(C)	SZÁLSZÁM: egyszeres
(D)	TOPOLÓGIA: lineáris
ii) A MOLEKULA	TÍPUSA: cDNs

(iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 13. szekvencia

GGATCCGTTG GATCAAACCA TAAATG (2) INFORMÁCIÓK A 14. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 26 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 14. szekvencia

GGATCCGTTA ACGTGTGGTC TCGTGT (2) INFORMÁCIÓK A 15. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 15. szekvencia

GAYGARATNG AYWTHGARTT (2) INFORMÁCIÓK A 16. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem « · • ··· * ··· · · • · · · · ·«· ···«· · · · (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 16. szekvencia

GTNGGRTCRA ACCANARRTG (2) INFORMÁCIÓK A 17. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 19 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 17. szekvencia

CGATGCAGCT GGAATTTCA (2) INFORMÁCIÓK A 18. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 18. szekvencia

AGTTTGAGCT GCATATCGAA (2) INFORMÁCIÓK A 19. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 19. szekvencia

TTTGATCCCA CCTCGCCGTT (2) INFORMÁCIÓK A 20. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs (iii) HIPOTETIKUS: nem • · (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 20. szekvencia

CAGCTGACCA AACACAAGCA (2) INFORMÁCIÓK A 21. SZEKVENCIÁHOZ (í) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A)	HOSSZ:	20 bázispár
(B)	TÍPUS:	nukleinsav
(C)	SZÁLSZÁM: egyszeres
(D)	TOPOLÓGIA: lineáris
(ii) A MOLEKULA	TÍPUSA: cDNs

(iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 21. szekvencia

ATTAACCCTC ACTAAAGGGA (2) INFORMÁCIÓK A 22. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 22. szekvencia

TAATACGAC TCAC TATAGGG (2) INFORMÁCIÓK A 23. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 19 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 23. szekvencia

GTTTTCCCAG TCACGACGT (2) INFORMÁCIÓK A 24. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 19 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs • · • · · · (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 24. szekvencia

AATATCAGCG GAAACAGGG (2) INFORMÁCIÓK A 25. SZEKVENCIÁHOZ

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A)	HOSSZ: 20 bázispár
(B)	TÍPUS: nukleinsav
(C)	SZÁLSZÁM: egyszeres
(D)	TOPOLÓGIA: lineáris

(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 25. szekvencia

CCCTGTTTCC GCTGATAATT (2) INFORMÁCIÓK A 26. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 26. szekvencia

CTATTAGCAT CTGCACAGTA (2) INFORMÁCIÓK A 27. SZEKVENCIÁHOZ

(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 27. szekvencia

TACTGTGCAG ATGCTAATAG (2) INFORMÁCIÓK A 28. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris • · (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 28. szekvencia

GGAGGACGGG TGAAGACAGA (2) INFORMÁCIÓK A 29. SZEKVENCIÁHOZ

(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 29. szekvencia

GTGTAAGGTA GTCCTGATGA (2) INFORMÁCIÓK A 30. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 30. szekvencia

TCATCAGGAC TACCTTACAC (2) INFORMÁCIÓK A 31. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 31. szekvencia

CCCTTGGATC CGCTATAATT (2) INFORMÁCIÓK A 32. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 20 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen «· ·» ···· ς>« · • · · · ·« · · • <··· · ··· · · · · · ·«·· ···» ·· · · · (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (v) FRAGMENS TÍPUSA:N-terminál is (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 32. szekvencia

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Alá Asp Asn 15 10 15

Phe Tyr Gin Asp Alá (2) INFORMÁCIÓK A 33. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 15 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (v) FRAGMENS TÍPUSA: N-terminális (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 33. szekvencia

Gly Tyr Pro Arg Arg Pro Val Asp Val 1 5

Pro Phe Trp Lys Asn Tyr

15 (2) INFORMÁCIÓK A 34. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLSZÁM: egyszeres (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNs (iii) HIPOTETIKUS: nem (iii) ANTI-SENSE: nem (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 34. szekvencia

ATCGGGAGCG GCGATACCGT A

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Xiloglükán endo-transzglikoziláz (XET) aktivitással rendelkező polipeptid, amely az 1. ábra szerinti aminosav-szekvencia (Seq ID No. 2) 21 - 289 aminosav maradék közötti részét, vagy ennek funkcionális ekvivalensét tartalmazza.
2. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az 1. ábra szerinti aminosav-szekvencia 1 - 289 aminosav maradék közötti részét.
3. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az 5. ábra szerinti aminosav-szekvencia (8. szekvencia) 19 - 287 aminosav maradék közötti részét.
4. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az 1. ábra szerinti aminosav-szekvencia 1 - 287 aminosav maradék közötti részét.
5. Az 1 - 4. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy legalább 80 %-os homológiát mutat az 1. ábra szerinti aminosav-szekvencia 21 - 289 aminosav maradék közötti részével.
6. Az 1 - 5. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy legalább 85 %-os homológiát mutat az 1. ábra szerinti aminosav-szekvencia 21 - 289 aminosav maradék közötti részével.
7. Az 1 - 6. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy legalább 90 %-os homológiát • · • ·· · ·· ·· .· ··: .· ··: :.:.

54 .........

• mutat az 1. ábra szerinti aminosav-szekvencia 21 - 289 aminosav maradék közötti részével.
8. Az 1 - 7. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egyet vagy többet a következő peptidek közül (egy vagy inkább két aminosav eltérés lehetséges valamennyi peptid esetében): DEIDFEFLGN; SLWNADDWAT; FYSKNEYLFG; és GTVTTFYLSS.
9. Az 1 - 8. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy növényi eredetű anyagból nyerhető ki.
10. Nukleinsav-szekvencia, amely az 1. ábra szerinti aminosav-szekvencia 21 - 289 aminosav maradék közötti részének, vagy funkcionális ekvivalensének genetikai kódját tartalmazza .
11. A 10. igénypont szerinti nukleotid-szekvencia, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az 1. ábra szerinti DNS szekvenciát (1. szekvencia).
12. A 10. igénypont szerinti nukleotid-szekvencia, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az 5. ábra szerinti aminosav-szekvencia 19 - 287 aminosav maradék közötti részének genetikai kódját.
13. A 12. igénypont szerinti nukleotid-szekvencia, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az 5. ábra szerinti DNS szekvenciát (7. szekvencia).
14. A 10. vagy 12. igénypont szerinti nukleotid-szekvencia, azzal jellemezve, hogy gazdasejtben való • ··· · ··· ♦ · · - * ···· ·· · · expressziót lehetővé tevő promotert is tartalmaz.
15. A 14. igénypont szerinti szekvencia, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó promoter az adott szekvencia növényben előforduló természetes promoterétől eltérő.
16. A 10. igénypont szerinti nukleotid-szekvencia, azzal jellemezve, hogy legalább 70 %-os homológiát mutat az 1. ábra szerinti nukleotid-szekvenciával.
17. A 16. igénypont szerinti nukleotid-szekvencia, azzal jellemezve, hogy legalább 80 %-os homológiát mutat az 1. ábra szerinti nukleotid-szekvenciával.
18. A 16. igénypont szerinti nukleotid-szekvencia, azzal jellemezve, hogy legalább 85 %-os homológiát mutat az 1. ábra szerinti nukleotid-szekvenciával.
19. A 10 - 18. igénypontok bármelyike szerinti nukleotid-szekvencia, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az 1 - 9. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid genetikai kódját.
20. A 10. igénypont szerinti nukleotid-szekvencia, azzal jellemezve, hogy antisense funkcionális ekvivalensként legalább 70 %-os homológiát mutat az 1. ábra szerinti nukleotid-szekvencia komplementerével.
21. A 20. igénypont szerinti nukleotid-szekvencia, azzal jellemezve, hogy legalább 80 %-os homológiát mutat az 1. ábra szerinti nukleotid-szekvencia komplementerével.
22. A 20. igénypont szerinti nukleotid-szekvencia, azzal jellemezve, hogy legalább 90 %-os homológiát mutat az 1. ábra szerinti nukleotid-szekvencia komplementerével.

• · · ···· «· · • · · · · · · • ··· · ··· · · • · · ··· ·· ·· · · ·
23.

DNS vektor, amely a 10 - 22. igénypontok bármelyike szerinti szekvenciát tartalmazza.
24 .

A 23. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy alkalmas gazdaszervezetbe juttatva képes az 1

9.

igénypont bármelyike szerinti polipeptid expressziójának irányítására.
25. Transzformált gazdaszervezet vagy annak leszármazottja, amely a 10

22. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav-szekvenciát tartalmazza.
26. A 25. igénypont szerinti transzformált gazdaszervezet, azzal jellemezve, hogy tartalmazza a 23. vagy 24.

igénypont szerinti vektort.
27. Eljárás xiloglükán endo-transzglikoziláz (XET) azzal jellemezve, hogy

a) a

24. igénypont szerinti vektort alkalmas gazdaszervezetbe juttatjuk;

b) a transzformált gazdaszervezetet vagy annak leszármázottját alkalmas tenyésztési körülmények között elszaporítjuk, oly módon, hogy a polipeptid expressziója bekövetkézzen; és

c) a polipeptidet a tenyészetből és/vagy a gazdaszervezet sejtjeiből kinyerjük.
28.

A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként növényi sejtet vagy mikroorganizmust alkalmazunk.

• · • · · · • · · ·
29. A 27. vagy 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként élesztősejtet alkalmazunk .
30. Eljárás növény vagy növényi rész tulajdonságainak megváltoztatására, azzal jellemezve, hogy egy növénybe vagy növényi részbe a 10 - 22. igénypontok bármelyike szerinti nukleotid-szekvencia hatásos részét bejuttatjuk, és ezáltal a növény vagy növényi rész XET aktivitásának szintjét módosítjuk.
31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növény vagy növényi rész XET aktivitásának szintjét csökkentjük.
32. A 30. vagy 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi jellemzők közül egyet vagy többet megváltoztatunk: méret, növekedési sebesség, textúra, érés.
33. Genetikailag manipulált növény vagy annak leszármazottja, azzal jellemezve, hogy előállítása a 30., 31. vagy 32. igénypont szerinti eljárással történt.