SK57696A3 - Polypeptide with xyloglucan endo-transglycosylase activity, method of its manufacture, nucleotide strand, dna vector - Google Patents

Polypeptide with xyloglucan endo-transglycosylase activity, method of its manufacture, nucleotide strand, dna vector Download PDF

Info

Publication number
SK57696A3
SK57696A3 SK576-96A SK57696A SK57696A3 SK 57696 A3 SK57696 A3 SK 57696A3 SK 57696 A SK57696 A SK 57696A SK 57696 A3 SK57696 A3 SK 57696A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
sequence
amino acid
polypeptide
seq
ser
Prior art date
Application number
SK576-96A
Other languages
English (en)
Inventor
David A Arrowsmith
Susan A Hellyer
Silva Jacqueline De
Sally-Anne Whiteman
Original Assignee
Unilever Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Unilever Nv filed Critical Unilever Nv
Publication of SK57696A3 publication Critical patent/SK57696A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01207—Xyloglucan:xyloglucosyl transferase (2.4.1.207)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Polypeptid so xyloglukán endo-transglykozylázovou aktivitou, spôsob jeho výroby, nukleotidový reťazec, DNA vektor
Oblasť vynálezu
Predkladaný vynález sa týka nukleotidových sekvencií kódujúcich rastlinný enzým, vektorov obsahujúcich spomenuté nukleotidové sekvencie, hostiteľov obsahujúcich uvedené nukleotidové sekvencie, aminokyselinových sekvencií kódovaných uvedenými nukleotidmi, spôsobov na produkciu enzýmu pomocou rekombinantnej DNA a spôsobov, ktoré menia vlastnosti rastliny .
Doterajší stav techniky
Bunkové steny ovocia a zeleniny tvoria predovšetkým polysacharidy, hlavnou zložkou je pektín, celulóza a xyloglukán (Selvendran & Robertson, IFR Report 1989). Bolo navrhnutých množstvo modelov bunkovej steny, ktoré sa pokúšali inkorporovať základné vlastnosti pevnosti a pružnosti (napríklad Albersheim, 1975, Sci. Am. 232, 81 až 95; Albersheim, 1976 Primárna bunková stena, Plánt Biochemistry, 3. vyd. , Academic Press; a Hyashi, 1989, Ann. Rev. Plánt. Physiol. & 3 Plánt Mol. Biol., 40, 139 až 168).
Xyloglukány sú 1,4--glukány, ktoré sú značne substituované a-1,6-xylozylovými bočnými reťazcami, niektoré z nich sú 1,2p-galaktozylované. Vo veľkých množstvách ich možno nájsť v primárnych bunkách dvojklíčnych rastlín, ale tiež v určitých semenách, kde zohrávajú rôzne úlohy.
Xyloglukán primárnej bunkovej steny je pevne vodíkom naviazaný na celulózové mikrofibrily a na svoje uvoľňovanie vyžaduje koncentrované alkálie alebo silno nabobtnávacie činidlá. Zdá sa, že xyloglukán tvorí skrížené mosty medzi celulózovými mikrofibrilami, celulózovo/xyloglukánovou sieťou, ktorá vytvára hlavnú sieť bunky z hľadiska unesenia záťaže a elasticity. DCB mutované suspendované kultúry buniek (bunkové steny bez celulózy) uvoľňujú xyloglukán do svojich médií, čo naznačuje, že xyloglukán je za normálnych podmienok pevne viazaný na celulózu.
Hydrolýza xyloglukánu primárnej bunkovej steny bola demonštrovaná v segmentoch roztlačených podklíčnych článkov rastúcich za tmy, počas IAA indukovaného rastu (Vakabayashi et al. , 1991, Plánt Physiol., 95, 1070 až 1076). Uvažuje sa, že endohydrolýza xyloglukánu v stene sa podieľa na rozpade steny, čo je sprevádzané expanziou bunky (Hayashi, citované vyššie). Ukázalo sa tiež, že priemerná molekulová hmotnosť xyloglukánu sa znižuje počas dozrievania rajčinového plodu a toto sa môže podieľať na zmäknutí tkaniva, čo sprevádza proces dozrievania (Huber, 1983, J. Amer. Soc. Hort. Sci., 108 , 405 až 409) .
Určité semená, napríklad žerucha obsahujú až do 30 % hmotnostných xyloglukánu, uloženého v kotyledonárnych stenách buniek, ktorý slúži ako rezerva polysacharidu a je rýchlo depolymerizovaný počas klíčenia.
Endo 1,4p-D-glukanáza, ktorá pôsobí špecificky na xyloglukán (t.j. xyloglukanáza) bola izolovaná a purifikovaná do zjavnej homogenity z klíčiacich semien žeruchy (Tropaeolum majus L.) (Edwards et al., 1986, J. Biol. Chem., 261, 9494).
Purifikovaná xyloglukanáza poskytuje jednoduchý polypeptidový pás pri SDS polyakrylamidovej elektroforéze (zjavná molekulová hmotnosť 29-31 kDa) a pri izolektrickom fokúzovaní (izoelektrický bod 5.0).
Enzým vykazuje absolútnu špecificitu voči xyloglukánu a endo spôsob účinku, ako je určené pomocou analýzy konečného produktu po hydrolýze xyloglukánu strukového semena (Vakabayashi et al., citované vyššie). Hoci prirodzeným substrátom enzýmu je kotyledonárny rezervný xyloglukán žeruchy, ukázalo sa tiež, že hydrolyzuje xyloglukány primárnej bunkovej steny in vitro (Edwards et al., citované vyššie). Pri vysokých koncentráciách substrátu bola demonštrovaná aktivita xyloglukán endo-transglykozylázy (XET) (Fanutti et al., 1993, The Plánt Journal, 3, 691-700). Sekvencia nukleotidov tohto xyloglukanázového/XET enzýmu žeruchy bola Stanovená a objavená v Medzinárodnej patentovej žiadosti č. VO 93/17101 a de Silvom et al., (1993), The Plánt Journal 3, 701 až 711).
Podobná enzymatická aktivita bola zistená i v ďalšom rastlinnom tkanive a ukázalo sa, že je v pozitívnej korelácii s rýchlosťou rastu v rôznych oblastiach stonky hrachu (Fry et al., 1992, Biochem.J., 282, 821-829). Navrhlo sa, že XET je zodpovedná za strihanie a znovuspájanie intermikrofibrilárnych xyloglukánových reťazcov a toto spôsobuje rozpad steny, ktorý je potrebný pre expanziu rastlinnej bunky. XET aktivita bola tiež demonštrovaná v plode rajčiny (xyloglukanáza zjavne aktivovateľná oligosacharidmi xyloglukánu), kde je najvyššia 2 -~dni po breaker štádiu dozrievania (Machlachlan & Brady, 1992, Aust. J. Plánt. Physiol., 19, 137-146) a môže sa podielať na procese mäknutia.
Tento vynález opisuje izoláciu nukleotidovej sekvencie z rajčín, ktorá kóduje XET aktivitu.
Podstata vynálezu
V prvom rade vynález poskytuje polypeptid, ktorý má xyloglukan endo-transglykozylázovú (XET) aktivitu, zahrňujúci predovšetkým zvyšky 21-289 aminokyselinovej sekvencie z obr. 1 (Seq ID No. 2) alebo ich funkčné ekvivalenty.
Termín funkčný ekvivalent, ako je tu použitý a aplikovaný na sekvenciu aminokyselín, je priradený tým aminokyselinovým sekvenciám, ktoré majú rovnaké funkčné charakteristiky ako sekvencia podľa vynálezu, ale majú mierne odlišné sekvencie. Vo všeobecnosti napríklad je dobre známe, že je možné vykonať konzervatívnu substitúciu, výmenou jedného aminokyselinového zvyšku v sekvencii za iný zvyšok s veľmi podobnými vlastnosťami bez toho, aby mal. akýkolvek významný účinok na funkciu polypeptidu.
Príklad funkčne ekvivalentnej polypeptidovej sekvencie je uvedený na obr. 5 (Seq ID No. 8). Sekvencie aminokyselín na obr. 1 a 5 sú priamo porovnané na obr. 6.
Ďalej, jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov môže byť odstránených alebo pridaných bez významného škodlivého účinku. Pre odborníkov v oblasti bude zrejmé, že takéto zmeny možno urobiť zvlášť v takých miestach v sekvencií, ktoré nie sú zachovávané z evolučného hľadiska. Pod termín funkčné ekvivalenty sú tiež zahrnuté prekurzory enzýmov a tiež zrelé, vytvorené enzýmy, ktorým chýbajú signálne sekvencie. Predpokladá sa, že v tomto prípade aminokyselinové zvyšky 1 až 20 z obr. 1 tvoria takéto signálne sekvencie, a preto nie sú podstatné pre enzymatickú aktivitu. Podobne sa o aminokyselinových zvyškoch 1 až 18 zo sekvencie na obr. 5 uvažuje, že sú zahrnuté do nepodstatnej signálnej sekvencie.
V špecifickej podobe preto vynález môže poskytovať polypeptid, ktorý má ΧΕΪ- aktivitu a obsahuje zvyšky 1 až 289 sekvencie zobrazenej na obr. 1; alebo zvyšky 19 až 287 z aminokyselinovej sekvencie na obr. 5; alebo zvyšky 1 až 287 z aminokyselinovej sekvencie zobrazenej na obr. 5.
Výhodne budú takéto funkčné ekvivalenty vykazovať aspoň 80%-nú homológiu a ešte výhodnejšie najmenej 85%-nú homológiu a najvýhodnejšie aspoň 90%-nú homológiu s aminokyselinovou sekvenciou podľa vynálezu.
Predkladatelia tohto vynálezu pomocou analýzy údajov o aminokyselinovej sekvencii identifikovali množstvo peptidových sekvencií, ktoré sú považované za relatívne chránené v rámci funkčných ekvivalentov sekvencie podľa vynálezu.
Výhodne budú funkčné ekvivalenty zahrňovať jednu alebo viac nasledovných peptidových sekvencií (ktoré vo všeobecnosti budú úplne chránené, ale môžu obsahovať jednu, maximálne dva aminokyselinové rozdiely):
DEIDFEFLGN; SLVNADDVAT; FYSKNEYLFG; a GTVTTFZLSS; (Seq ID Nos. 3-6).
Ak je to žiadúce, polypetid je podstatný pri izolácii z iných odvodených substancií rastliny.
Z druhého aspektu vynález poskytuje sekvenciu nukleotidov kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu z obr. 1 (Seq ID No. 1) alebo ich funkčné ekvivalenty.
Výhodne nukleotidová sekvencia zahrňuje nukleotidovú sekvenciu z obr. 1 alebo iné funkčne ekvivalentné sekvencie, ktoré možno z rastliny rajčiny získať.
Termín funkčný ekvivalent, ako je tu použitý a aplikovaný na sekvenciu nukleotidov, je priradený nukleotidovým sekvenciám, ktoré kódujú polypeptid, ktorý má rovnaké funkčné charakteristiky ako sekvencie podľa prvého aspektu a zahrňuje nukleotidové sekvencie, ktoré budú hybridizovať za štandardných podmienok (opísané Sambrookom et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual) ku komplementu nukleotidovej sekvencie z obr. 1. Výhodn bude funkčne ekvivalentná sekvencia nukleotidu vykazovať aspoň 70%-nú homológiu, ešte výhodnejšie 80%-nú homológiu a najvýhodnejšie aspoň 85%-nú homológiu s nukleotidovou sekvenciou z obr. 1. Špecifický príklad funkčne ekvivalentnej nukleotidovej sekvencie je uvedený na obr. 5 (Seq ID No. 7).
Pre potreby tejto špecifikácie patrí termín funkčný ekvivalent tiež anti-sense sekvenciám, ktoré hybridizujú za štandardných podmienok na nukleotidovú sekvenciu z obr. 1. Takéto sekvencie sú prospešné pri nedostatočnej regulácii expresie nukleotidovej sekvencie vynálezu. Výhodne budú takéto anti-sense funkčné ekvivalenty vykazovať aspoň 70%-nú homológiu, výhodnejšie najmenej 80%-nú homológiu a najvýhodnejšie 90%-nú homológiu s komplementom nukleotidovej sekvencie z obr. 1. Vo všeobecnosti budú anti-sense funkčné ekvivalenty vykazovať vyššie percento homológie ako sense ekvivalenty. Toto je spôsobené tým, že sense ekvivalenty budú translatované do polypeptidov, ktoré budú funkčné a ktoré môžu obsahovať zachované aminokyselinové zlúčeniny. Na rozdiel, anti-sense ekvivalenty vo väčšine prípadov, budú fungovať skôr na úrovni nukleovej kyseliny, než na úrovni polypeptidu, a teda akékoľvek zásadné rozdiely v sekvencii budú mať tendenciu znižovať použiteľnosť ekvivalentu.
Odborníkom v oblasti je známe, že výhodou vynálezu súvisiacou so sekvenciami nukleotidov a aminokyselín podľa vynálezu, budú detekcia, izolácia a klonovanie (napríklad pomocou PCR) ďalších nukleotidových sekvencii, ktoré sú funkčne ekvivalentné s nukleotidovou sekvenciou podľa vynálezu, jednoduché. Vhodné spôsoby, napríklad uvádza Sambrook et al.
Zvlášť vhodné pri takejto rutinnej práci môžu byť peptidové sekvencie objavené skôr. Tiež možno použiť polypeptid podľa vynálezu (alebo peptidy od neho odvodené) na vytvorenie protilátok na použitie pri imunologickom skríningu uvažovaných funkčne ekvivalentných sekvencií.
Je výhodné, aby sekvencia z druhého aspektu vynálezu ďalej obsahovala 5 netranslatovanú oblasť vrátane vhodného promotora, aby sa umožnila expresia do buniek hostiteľa.
Vynález tiež poskytuje vektor obsahujúci nukleotidovú sekvenciu z druhého aspektu vynálezu a hostiteľskú bunku obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu podľa vynálezu.
Jednoducho vyjadrené, vektor je schopný expresie nukleotidovej sekvencie, takže produkcie polypeptidu podľa vynálezu. (Ďalšie vektory môžu obsahovať antisense funkčne ekvivalentnú nukleotidovú sekvenciu).
Preto v ďalšom aspekte vynález poskytuje spôsob výroby polypeptidu s XET aktivitou, zahrňujúci kroky zavedenia vektora schopného riadiť expresiu polypeptidu, ako bolo definované vyššie do vhodnej hostiteľskej bunky, rast hostiteľskej bunky a/alebo jej progénov vo vhodných kultivačných podmienkach, takže polypeptid je exprimovaný, s následným získaním polypeptidu alebo z kultivačného média a/alebo z hostiteľských buniek.
Je výhodné, avšak nie je v žiadnom prípade zásadou, aby hositeľská bunka bola eukaryotická, keďže eukaryotický hostiteľ pravdepodobnejšie exprimuje enzým v úplne funkčnej konformácii.
Sú známe vhodné vektory, ktoré možno použiť na zavedenie a na expresiu sekvencie podľa vynálezu v rastlinách.
V ďalšom aspekte vynález poskytuje, spôsob transformácie hostiteľskej bunky, zahrňujúci zavedenie nukleotidovej sekvencie z druhého aspektu vynálezu do hostiteľskej bunky. Výhodne je hostiteľskou bunkou rastlinná bunka. Výhodne transformovaná rastlinná bunka obsahuje časť rastliny.
Ako bude zrejmé oborníkom v oblasti, bude sa očakávať, že zavedenie nukleotidovej sekvencie podľa vynálezu do rastliny alebo jej časti zmení vlastnosti rastliny alebo jej časti .
Ešte v ďalšom aspekte vynález poskytuje spôsob zmeny vlastností rastliny alebo jej časti, zahrňujúci zavedenie účinnej časti nukleotidovej sekvencie podľa vynálezu alebo jej funkčného ekvivalentu do rastliny alebo jej časti, tak aby sa zmenil stupeň XET aktivity v rastline alebo v jej časti. Uprednostňuje sa taký spôsob, ktorý zredukuje stupeň XET aktivity v rastline alebo v jej časti, typicky zavedením antisense sekvencie. Výhodne účinné množstvo bude zahrňoval najmenej 50 %, výhodnejšie najmenej 70 % a najvýhodnejšie 90 % nukleotidovej sekvencie podľa vynálezu.
Z ďalšieho aspektu vynález poskytuje rastlinu získanú pomocou génového inžinierstva, ktorá má vlastnosti zmenené pomocou spôsobu definovaného vyššie, alebo plod takejto rastliny.
Zmenená rastlina je výhodne akákoľvek komerčne dôležitá rastlina (vrátane - ovocia a zeleniny), kde je dostatok poznatkov pre prevedenie spôsobu podľa vynálezu a v ktorej má xyloglukán štrukturálnu funkciu (t. j. dvojklíčne a jednoklíčne netrávnaté rastliny).
Takéto rastliny zahrňujú: lucernu, jablko, brokolicu, kapustu, mrkvu, kaleráb, celer, bavlník, brusnice, uhorku, baklažán, ľan, grep, chren, kiwi, šalát, mango, melón, repku olejnú, papajú, hrášok, broskyňu, hrušku, koreniny, slivku, topoľ, zemiak, malinu, sóju, ihličnany, jahodu, cukrovú repu, batat, tabak, rajčinu a orech.
Bude výhodné, ak vlastnosti celej rastliny nie je potrebné zmenil. Môže byf požadované, aby sa zmenili vlastnosti časti rastliny (napríklad semená, plody). Toto by sa dalo dosiahnu! napríklad použitím tkanivovo špecifických promótorov, aby sa regulovala transkripcia zavedenej sekvencie.
Očakáva sa, že spôsob podľa vynálezu zmení hladiny XET aktivity a teda frekvenciu rozpadu a znovu tvorenia zosielovania bunkovej steny (pozostávajúcej z molekúl xyloglukánu), výsledkom čoho je strata steny, čo môže umožňoval expanziu bunky. Ďalej, z hľadiska dôležitej štrukturálnej úlohy xyloglukánu by sa dalo očakával, že vlastnosti, ktoré by mohli byť zmenené zahrňujú: veľkosť, rýchlosť rastu, a štruktúru, najmä počas dozrievania.
Vynález je ďalej opísaný pomocou nasledovných ilustračných príkladov a obrázkov, v ktorých:
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 predstavuje sekvenciu aminokyselín a nukleotidov (kloň BI) v súlade s vynálezom.
Obr. 2 vyjadruje čiastkové aminokyselinové sekvencie polypeptidu v súlade s vynálezom a ich funkčný ekvivalent, v porovnaní s dvoma pôvodnými aminokyselinovými sekvenciami.
Obr. 3 znázorňuj er-sekvenčnú stratégiu použitú pri určení sekvencie znázornenej na obr. 1 ( E = EcoRI, P = Pst, H = HindlII).
Obr. 4 znázorňuje sekvenčnú stratégiu použitú pri určení sekvencie nukleotidu (kloň B2) v súlade s vynálezom (E = EcoRI, P = Pst).
Obr. 5 znázorňuje nukleotidovú sekvenciu (kloň B2) a aminokyselinovú sekvenciu v súlade s vynálezom.
Obr. 6 znázorňuje porovnanie dvoch funkčne ekvivalentných aminokyselinových sekvencií (bodka = identická aminokyselina; trojuholník = predikované miesto štiepenia).
Obr. 7a 8 predstavujú schematické príklady rôznych plazmidových zostrojení.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Po kompletnom sekventovaní cDNA kódujúcej XET v semene žeruchy (opísané v podanej medzinárodnej patentovej žiadosti č. VO 93/17101) boli navrhnuté priméry, aby sa dosiahla PCR amplifikácia podobných génových fragmentov z rajčiny. Dva z primérov (NXGH a NXGB, znázornené nižšie) boli prekryté oblasťou homologickou s Bacillus macerans β-1,3-1,4-glukanázou (oblasť s aminokyselinovou sekvenciou DEIDIEFLG).
Iné priméry zodpovedali oblastiam priľahlým alebo obklopujúcim histidinové zvyšky; (tieto sú často prítomné v aktívnych miestach hydrolytických enzýmov a aktívnych miestach enzýmov s podobnou funkciou, ktoré majú primárnu sekvenčnú homológiu). Tieto zodpovedali aminokyselinovým sekvenciám PNHNRVD (primér NXG1H), HDEIDIE (priméry NXGH2H a NXG2B), HLVFDPT (priméry NXG3H a NXG3B) a TRDHTLT (primér NXG4B).
NXG1H 5 AAGCTTCCTCAACATCAAAGGGTAGA 3 NXG2H AAGCTTCATGATGAAATCGATATTGA
NXG2B GGATCCTCAATATCGATTTCATCATG
NXG3H AAGCTTCATTTATGGTTGATCCAAC
NXG3B GGATCCGTTGGATCAAACCATAAATG
NXG4B GGATCCGTTAACGTGTGGTCTCGTGT (sense) (sense) (antisense) (sense) (antisense) (antisense) (Seq ID Nos. 9 až 14 vrátane) identita pri 151aa genomického klonu et al., The Plánt
Tieto priméry boli úplne zachované vzhľadom na sekvenciu u žeruchy a inkorporovali rozpoznávacie miesta reštrikčných enzýmov na ich 5 zakončeniach, aby sa uľahčilo klonovanie PCR produktov. Akokoľvek, všetky snahy amplifikovaf DNA rajčín pomocou PCR, za použitia akejkoľvek kombinácie vyššie uvedených primérov sa ukázali ako neúspešné.
Odvodená aminokyselinová sekvencia XET semena žeruchy zdieľa niektoré oblasti homológie (42% preložení) so sekvenciou odvodenou z a cDNA z Arabidopsis thaliana (Medford
Celí 3, 359-370). Polypeptid kódovaný genómovým klonom má zakončenie meri-5 a jeho funkcia je doposiaľ neznáma.
Rozhodlo sa o pokuse PCR amplifikácie rajčinovej DNA za použitia zmesi degenerovaných oligonukleotidov (XG 117 a XG 162, znázornené nižšie) korešpondujúcich s dvoma z týchto oblastí zachovaných u xet žeruchy a meri-5, hoci sa očakával malý úspech vzhladom na predchádzajúce zlyhania a nedostatok poznatkov (ak vôbec) v oblasti funkcie meri-5.
Bolo prekvapujúce, že sa pomocou PCR podarilo amplifikovať fragment genómovej DNA rajčiny, ktorý mal významnú sekvenčnú homológiu voči meri-5 aj voči XET žeruchy.
Experiment bol prevedený, ako je uvedené nižšie.
Genomová DNA bola izolovaná z tkaniva mladého listu rajčiny (kultivar VF 143B-7879, dostupného z Tomato Genetics Stock Centre, Oddelenie zberu rastlín, Univerzita v Kalifornii, Davis, CA95616) , ako bolo opísané Dellaportom et al. (1983, Plánt. Mol. Biol. 1, 19-21).
Zmesi degenerovaných oligonukleotidov boli navrhnuté v súlade so zachovanými oblasťami DEID(I/F)EFLG(XG 117) a HLVFDPT(XG 162), ako je ukázané nižšie:
XG 117 5 GA(C/T) GA(A/G) ATI GA(C/T) (A/T)T(A/C/T) GA(A/G)TT 3 (sense) ~~
XG 162 3 GT(G/A) (G/A)A(G/A/T/C) ACC AA(G/A) CT(G/A) GGITG 5 (antisense) (Seq ID Nos. 15 a 16 vrátane)
Degenerované oligonukleotidy boli potom použité ako priméry v nasledovných reakciách (každá reakcia s celkovým reakčným objemom 100 μΐ): 1 až 2pg genomovej DNA; 100 pikomolov každého z XG 117 a XG 162; dGTP, dATP, dTTP a dCTP všetky 0,2mM; lOmM Tris-HCl pH 8,3; 50 mM KC1; 1,5 mM MgCl2; 0,01% (V/V) želatíny a 2,5 jednotiek Taq DNA polymerázy (Stratagene).
Termálna cyklizácia bola prevedená v MJ programovateľnom tepelnom regulátore s počiatočným denaturačným krokom pri 94 °C po dobu 2 minút, nasledovalo 35 cyklov pri 94 °C 1 minútu, 40°C 2 minúty a 72 °C 2 minúty. Amplifikačné produkty boli frakcionované na 2% agarózo/TBE géli s obsahom 0,5 pg/ml etdíniumbromidu a vizualizované pomocou UV transiluminátora. DNA fragmenty boli purifikované z gélov za použitia DEAE papiera, ako opísali Sambrock et al. (Molecular Cloning: a laboratory Manual).
Hlavný PCR produkt mal veľkosť 122 bp. Tento bol podrobený ligácii do pT7Blue (získanej od AMS Biotechnology) a DNA sekvenčnej analýze. Zo štyroch sekventovaných kmeňov tri mali identické sekvencie DNA (PX3) a jeden sa líšil aj v DNA aj aminokyselinovej sekvencií (PX1), ako je uvedené na obr. 2. Tom 3 a Tom 1 na obr. 2 predstavujú odvodenú sekvenciu aminokyselín pre PX3 a PX1 v porovnaní s Meri-5 a XET žeruchy.
Aby sa získala širšia informácia o sekvencii, cDNA 5 stretch banka rajčiny bola získaná z Clontech Laboratories Inc. (pripravená za použitia mRNA z breaker štádia dozrievajúceho plodu rajčiny, Ailsa craig kultivar VFN8; táto bola naplenená oligo-(dT) a náhodnými primérmi, aby sa zosyntetizovala cDNA, ktorá bola zabalená vo fágu lambda gtll.
Približne 200 000 klonov cDNA z tejto banky sa podrobilo skríningu za použitia 122 bp PCR fragmentu ako rádioznačenej sondy. Stručne,25 až 30 ng gélom purifikovaného 122 bp amplifikačného produktu bolo denaturovaných v 9 μΐ zohriatím pri 100°C po dobu 5 minút a potom sa ochladili ľadom. Fragmenty boli rádioznačené P-dCTP (Amersham International plc) za použitia súpravy dodanej od United States Biochemicals Inc. (Sekvenáza v2.0). Neinkorporované nukleotidy sa odstránili chromatograficky pomocou stĺpca Sephadex G-50.
Za použitia tejto sondy bolo v cDNA banke detegovaných množstvo pozitívne reagujúcich klonov. Tieto eluovali z vrchnej vrstvy agarózy do 0,1 až 1 ml SM (50 mM Tris-HCl pH 7,5, lOmM MgSO^, 100 mM NaCl, 0,01% objemových želatíny) a boli purifikované ďalšími skríningmi. Inzert bol izolovaný z bakteriofága alebo priamou PCR zo zásobnej suspenzie alebo digesciou izolovanej DNA.
Pre PCR zásobnej suspenzie boli purifikované zásoby bakteriofágov (5 μΐ, 10^ až 10^ pfu) zohriate na 100 °C počas 5 minút a boli pridané k roztoku identického s tým, ktorý bol opísaný vyššie, s výnimkou, že 20 pmolov každého z gtll 5 oligonukleotidov (Clontech) bolo použitých namiesto degenerovaných nukleotidov.
Tepelná cyklizácia bola nasledovná: 2 minúty pri 94 °C, 25 cyklov 1 minútu pri 94 “C, 1 minútu pri 55 °C a 2 minúty pri 72 ’C, s následným konečným krokom 5 minút pri 72 ’C. Amplifikačné produkty boli gélovo purifikované na 1% agarózových géloch, ako vyššie.
Gélovo purifikované PCR amplifikované produkty boli ligáciou spojené do pT7 klonujúceho vektora (AMS Biotechnology Limited) a boli transformované do zodpovedajúcej E. coli podľa návodov výrobcu.
Kolónie s obsahom rekombinantných plazmidov boli použité na inokuláciu 30 ml Lennoxovho bujónu obsahujúceho 50 gg/ml ampicilínu a 12,5 gg/ml tetracyklínu; po raste cez noc pri 37 °C, sa z kultúry získala purifikovaná plazmidová DNA za použitia súpravy Plazmid midi dodanej Qiagen Inc. Reštrikčná analýza klonovaných produktov sa prevádzala za použitia enzýmov a pufrov dodaných Amersham International plc, následne sa previedla E'lektrof oréza na agarózových géloch.
DNA bola sekventovaná pomocou súprav a postupov dodaných United States Biochemicals Inc. (Sekventáza v2.0). Rekombinantné plazmidy (Qiagenom pripravené) boli alebo sekventované priamo alebo boli reštrikčné fragmenty subklonované do M13, aby sa získali jednorefazové templáty. Reakčné produkty boli frakcionované na 30 cm x 40 cm x 0,4 mm polyakrylamidových géloch za použitia 6% BRL akrylamidových roztokov. Výsledné sekvencie sa analyzovali na požítači IBM s DNAstar programom.
Zistilo sa, že klony sú v rozmedzí veľkosti 500 až 1400 bp. U jedného klonu, nazvaného tXET-Bl (alebo pre zjednodušenie BI) sa zistilo, že má interné HindlII a Sací rozpoznávacie miesta, ktoré uľahčili subklonovanie do M13. Interné priméry boli tiež použité, aby kloň úplne sekventovali a v oboch smeroch (Obr. 3). Sekvencie týchto interných primérov (8-HT, 8-HS sense priméry a 8-TB, 8-HT antisense priméry) sú nasledovné:
8-TH:
8-TB:
8-HS:
8-HT:
(
CGATGCAGCTGGAATTTCA 3 5 AGTTTGAGCTGCATATCGAA 3 5 TTTGATCCCACCTCGCCGTT 3 5 CAGCTGACCAAACACACGCA 3 Seq ID Nos. 17 až 20 )
Sekvencie ďalších primérov boli:
T3: 5 ATTAACCCTCACTAAAGGGA 3 T7: 5 TAATACGACTCACTATAGGG 3 U19: 5 GTTTTCCCAGTCACGACGT 3 ( Seq. ID Nos. 21 až 23 )
U predstavuje M13 (-40) primér. Na začiatku sa zistili dve sekvencie, každá z rozdielnej PCR amplifikácie lambda zásoby. Odlišujú sa v dvoch základných pároch v údajnej kódujúcej oblasti. Keďže tieto rozdiely boli pravdepodobne zapríčinené chybou termostabilnej DNA polymerázy použitej v reakciách polymerázoyého reťazca, lambda DNA bola pripravená a cDNA bola ligáciou spojená do pBluescript SK+, aby sa získali konečné sekvenčné dáta (obr. 1). Konečná sekvencia nukleotidov klonu BI je znázornená na obr. 1, spolu s odvodenou aminokyselinovou sekvenciou.
Predpokladaná otvorená čítacia mriežka klonu BI kóduje 289 aminokyselinový polypeptid predikovanej molekulovej hmotnosti 32,7 kDa. Tento má 39 % identitu v 270 prekrývajúcich aminokyselinách s XET žeruchy a 59 % identitu v 186 prekrývajúcich aminokyselinách s meri-5.
Signálny peptid je predikovaný na základe hydrofobicity aminokyselín v pozíciách 1 až 25 a štatistická analýza aminokyselinovej sekvencie predikovala, že prekurzor je štiepený medzi alanínovými a aspartátovými zvyškami v pozíciách 20 a 21 (Von Heijne, 1983, Eur. J. Biochem., 113, 17 až 21).
Oblasť klonu BI zodpovedajúca genómovým PCR fragmentom (aa 103 až 129) vykazuje rozdiely v odvodenej sekvencií aminokyselín v porovnaní s obidvoma sekvenciami genómových fragmentov. To naznačuje, že kloň BI je časťou multi-génovej skupiny v rajčinách. Identifikovalo sa predpokladané miesto N-glykozylácie (Asn-X-Ser/Thr; aa 105 až 107), ktoré je tiež prítomné v meri-5 a v genómových fragmentoch, nie však v XET žeruchy.
Získal sa druhý kloň, označený ako tXET-B2 (skrátene B2), bol väčší ako kloň BI, ale nemal žiadne vhodné rest14 rikčné miesta pre subklonovanie, takže na kompletizáciu DNA sekventovania bolo použitých niekoľko interných primérov. Postup použitý pri určovaní sekvencie klonu B2 je schematicky znázornený na obr. 4. Na obr. 4 E = EcoRI miesto, P = PstI miesto; (a) znázorňuje sekventovanie za použitia primérov, (b) a (c) znázorňuje sekventovanie internými primérmi. Bolo použitých množstvo primérov zahrňujúce:
16-1: 5 16-1R: 5 16-2: 5
16-2R: 5 16-3R: 5
16-4: 5 16-4R: 5 (Seq
AATATCAGCGGAAACAGGG 3 CCCTGTTTCCGCTGATAATT 3 CTATTAGCATCTGCACAGTA 3 TACTGTGCAGATGCTAATAG 3 GGAGGACOGGTGAAGACAGA 3 GTGTAAGGTAGTCCTGATGA 3 TCATCAGGACTACCTTACAC 3 ID Nos. 24 až 30)
Bola identifikovaná odvodená otvorená čítacia mriežka 287 aminokyselín. Určená sekvencia nukleotidov a odvodená sekvencia aminokyselín klonu B2 sú znázornené na obr. 5. Obr. 6 znázorňuje cDNA sekvenciu klonu BI a jeho odvodenú sekvenciu aminokyselín, v priamom porovnaní s odvodenou sekvenciou aminokyselín pre kloň B2. (Na obr. 6 bodky predstavujú identické aminokyseliny a šípka naznačuje; predpovedané miesto štiepenia signálneho peptidu). Predikovaný signálny peptid pre kloň B2 bol o 2 aminokyseliny kratší ako signálny peptid klonu BI, uvoľňujúci zrelý polypeptid z 269 aminokyselín. Pravdepodobné miesto N-glykozylácie sa zistilo v tej istej pozícii ako u klonu BI. Identifikovalo sa 16 aminokyselinových rozdielov medzi predikovanými zrelými peptidmi klonov 8 a 16, 14 z nich bolo udržiavajúcich.
Previedla sa hydrofóbna zhluková analýza (HCA, ako popísal Gaboriaud et al., 1987, FEBS Letters, 224, 149 až 155 a Henrissat et al. , 1988, Biochem. J., 255, 901 až 905), aby sa sledovala možná konformačná homológia polypeptidu kódovaná u klonu BI inými známymi proteínmi.
HCA grafy boli vytvorené z odvodených aminokyselinových sekvencií XET žeruchy, meri-5 a raj cínového klonu BI za poTM užitia VordPerfect 5.1 macros, použitím modifikovanej 2D reprezentácie α-helixu (Henrissat et al. , citované vyššie). Hydrofóbne zhluky boli obkreslené ručne, zoradené ručne a bolo vypočítané skóre HCA homológie.
Podobná konformácia bola predpovedaná pre všetky tri proteíny na báze (a) kontinuálna prítomnosť udržujúcich zhlukov predovšetkým z dĺžky sekvencie a (b) zo všetkých skóre HCA homológie pre všetky tri porovnania, ktoré boli viac ako 75% (meri-5 v. rajčinový XET kloň BI rajčiny, 86%; XET žeruchy v. XET kloň BI rajčiny, 80%; meri-5 v. XET žeruchy , 78%).
Toto podporuje údaje z primárnej sekvenčnej homológie a predikcií sekundárnej štruktúry (Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol. Biol., 157, 105 až 132), čo naznačuje, že tieto tri proteíny majú pravdepodobne podobné konformácie, a teda podobnú funkciu, zatiaíčo sú odlišné v detailoch.
Rozhodlo sa o pokuse exprimovaf kloň B2 v E. coli. Toto je opísané nižšie v príklade 2.
Príklad 2
Spracovanie klonu B2 na expresiu v E. coli
BamHI rozpoznávacia sekvencia bola zavedená do N-zakončenia kódujúcej sekvencie predpokladaného zrelého proteínu pomocou PCR, za použitia mutagénneho priméru (16-1 B:CCCTTGGATCCGCTATAATT Seq ID No. 31 a pBluescript priméru ( T3; Stratagene). Reakčné podmienky boli: Ing XET kloň B2 v pBluescript SK+, 0,4 mM každého z dATP, dCTP, dGTP a dTTP, 25 pmolov z každého priméru, 1 x VENT polymerázový pufer a 0,25 jednotiek VENT DNA polymerázy (New England Biolabs Inc). Tepelná cyklizácia trvala 2 minúty pri 93 ’C, 25 cyklov za minútu pri 93 ’C, 30 sekúnd pri 55 °C a 1 minútu pri 72 ’C.
- 16 Over-expresia rekombinantnej raj cínovej XET v E. coli
Expresia raj cínovej XET v E. coli sa dosiahla za použitia QIAGEN QIAexpress™ systému. BamHI-HindIII fragment mutagenizovaného PCR produktu bol pripojený do vektora expresie pQE30 a bol transformovaný do buniek E. coli M15 obsahujúcich REP4 plazmid represie. Vektor expresie dovoluje inkorporáciu 6 x histidínom označeného N-zakončenia, ktoré má vysokú afinitu pre Ni-NTA (Ni-NTA je kyselina nikel-nitril trioctová) živicu poskytnutú QIAGENom. Bunky rástli v Lennoxovom bujóne obsahujúcom primerané antibiotiká a boli indukované 2 mMIPTG, keď optická hustota kultúry pri 600 nm bola 0,7 až 0,8. Rast sa nechal pokračovať 3 až 5 hodín. Na analýzu boli bunky zozbierané z 0,5 ml kultúry, zovreté vo vzorke pufra (Laemli, 1970, Náture, 227, 680 až 685) a prebehnuté na SDS polyakrylamidových géloch (10%); separované proteíny boli farbené v Coomassieovej modrej. Lokalizácia označených proteínov sa stanovila ako v protokole 4 QLAexpressionist 2. vyd. (1992; QIAGEN Inc).
Purifikácia a rekonformácia rekombinantného rajčinového XET proteínu
Rekombinantná rajčinová XET bola purifikovaná za denaturujúcich podmienok na Ni-NTA živici, ako je opísané v The QIA expressionist protokole 7, s výnimkou toho, že po konečnom premytí bol stĺpec s naviazaným proteínom uvedený do rovnováhy v 6 M močovine, 0,5 M NaCl, 20% glycerole, 40 mM Tris-HCl pH 7,4. FPLC sprostredkovaný 6M-1M močovinový gradient (24 ml pri rýchlosti 0,25 ml/minútu) vo vyššie spomenutom roztoku bol potom použitý na rekonformáciu naviazaného proteínu, ktorý bol eluovaný v 10 ml IM močoviny, 0,5 M NaCl, 20% glycerole, 40 mM Tris-HCl pH 7,4, 250 mM imidazole.
Testy pre XET aktivitu 3H-značené XG oligosacharidy sa získali od S C Fry (Univerzita v Edinburgu) a ich inkorporácia do polymerického XG bola stanovená, ako to opísal Fry et al. (1992, Biochem.
J . , 261, 9489 až 9494). Koncentrácia proteínu sa stanovila za použitia súpravy dodanej firmou BioRad..
Sekventovanie aminokyselín s N-zakončením
Purifikované rekombinantné proteíny boli podrobené elektroforéze, ako je uvedené vyššie, za použitia vysoko kvalitných reagensovr Tie boli potom elektroprenesené (0,5A, 2 hodiny) na Problott™ membránu (odvodený PVDF materiál, získaný od ABI) a boli farbené v 1% Coomassieovej brilantnej modrej, 50% metanole. Prenesený proteín bol podrobený sekvenčnej Edmanovej degradácii na ABI sekvenčnom modeli 740 v plynnej fáze, s pulzným tekutým doplňovačom, ako je opísané Cottinghamom et al. (1988 Biochim. Biophys. Acta,
956, 201 až 207).
Expresia a charakteristika rekombinantnej rajčinovej XET
Rajčinová XET bola exprimovaná v E. coli s N-zakončením 6 x His tágom kvôli uľahčeniu purifikácie. Označený proteín predpovedanej molekulovej hmotnosti (32 kDa) bol zistený v nerozpustnej frakcii; fázovou kontrastnou mikroskopiou exprimujúcej kultúry sa ukázali silno refraktujúce telieska v každej bunke, žo naznačuje prítomnosť nesolubilných inklúzií (údaje nepreukázané). Po purifikácii za denaturačných podmienok bol označený proteín podrobený sekventovaniu aminokyselín s N-zakončením. Výsledná sekvencia (MRGSHHHHHHGSADNFYQGDA Seq ID No. 32) potvrdila tak identitu proteínu ako aj rekombinantnej rajčinovej XET a prítomnosť N-zakončenia 6 x His tágu.
Rekombinantná rajčinová XET bola rekonformovaná, kým sa naviazala na Ni-NTA agarózovú živicu pomocou reverzného močovinového gradientu. Po elúcii zo stĺpca sa 15 μΐ testovalo na inkorporáciu H-XG oligosacharidov (XGO) do polyméQ rového XG: približne 400 Bq H-XGO bolo inkorporovaných/ kBq.hodinu.gg proteínu. Po dialýze proti 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,2, 20% glycerolu, sa špecifická aktivita zvýšila na približne 700 Bq/kBq.hod.gg.
Kloň B2 bol preto pre-exprimovaný v E. coli so zjavným N-terminálnym signálnym peptidom nahradeným 6 x histidínovým tágom, ktorý uľahčil purifikáciu. Po purifikácii a rekonformácii bol rekombinantný proteín schopný katalyzovať inkorporáciu rádioznačených XG oligosacharidov do polymérového XG, potvrdzujúc, že je to XET. Špecifická aktivita rekonformovanej XET je relatívne π-ízka; surový extrakt zo stonky rastúcej rajčiny má XET špecifickú aktivitu asi 100 Bq/kBq.hod.gg, v porovnaní so 700 Bq/kBq.gg pre rekonforraovanú XET. Keďže rekombinantný proteín má čistotu vyššiu ako 90%, možno predpokladať, že je to preto, že väčšina proteínu nebola správne rekonformovaná.
XET semena žeruchy je predpokladaným glykozylačným miestom prítomným v obidvoch klonoch aminokyselinových sekvencií. Je zaujímavé poznamenať, že rekominantná expresia v E. Coli, ktorá neglykozyluje proteíny, rezultovala do aktívnej XET. Toto naznačuje, že glykozylácia nie je nevyhnutná pre XET aktivitu in vitro, jej úloha in vivo nastoľuje otázku. Chýbanie glykozylácie v XET u semien žeruchy môže odrážať jej špeciálnu úlohu v mobilizácii uchovaných rezerv.
Zmienky o funkcii XET v rastlinách sa rýchlo zhromažďujú. Hypotéza, že XET zohráva úlohu pri raste rastliny je podporená jej koreláciou s rastom do dĺžky u stoniek hrachu (Fry et al., 1992, Biochem. J., 282, 821 až 828) a v koreňoch kukurice (Pritchard et al., 1993, J. Exp. Bot., 44, 1281 až 1289). Predpokladá sa, že pôsobí stratou bunkovej steny, aby sa umožnila expanzia bunky.
XET sa teda podieľa na dozrievaní plodu, ako naznačili zmeny jej hladín v ovocí, tak rozdielnom ako je rajčina, hruška (nepublikované údaje vynálezcov) a kiwi (Fry, 1993, Current Biology, 3, (č. 6), 355 až 357). Tu môže XET zvyšo19 vať prístup ďalších enzýmov do pevne viazaných sietí bunkovej steny. Toto by mohlo byť podporené malou, kompaktnou podobou XET (Edwards et al., 1986, J. Biol. Chem, 261, 9489 až 9494). Alternatívne sa môže XET podieľať (možno v spojení s inými hydrolázami bunkovej steny) na depolymerizácii xyloglukánu, ktorý sa vyskytuje počas dozrievania plodu.
Príklad 3
Na doplnenie práce s rekombinantnou DNA popísanou vyššie, boli urobené pokusy izolovať a purifikovať polypeptid s XET aktivitou z rajčiny.
Krok 1: testovanie aktivity XET
XET aktivita v rôznych surových extraktoch plodov raj činy bola meraná pomocou inkorporácie H značených xyloglukánových oligosacharidov do xyloglukánového polyméru. Tento test meria aktivitu transglykozylázy. Každý test obsahoval nasledovné zložky:
μΐ 0,2 M Na-Mes, pH 6,0 (Na-Mes je sodná soľ kyseliny 2-[N-morfolino]etánsulfónovej), 10 μΐ 8 mg/ml xyloglukánu a 5 μΐ [3H]XG0 (0,7 KBq).
Zložky boli inkubované 1 hodinu pri 25 °C a boli zastavené pridaním 100 μΐ 20% kyseliny mravčej. Testovaná zmes bola potom nakvapkaná na 5 x 5 cm disk celulózového filtračného papiera (Vhatman 3MM chromatografický papier). Stanovilo sa, že xyloglukánový polymér (značený alebo neznačený [3H]XGO) sa naviaže na celulózový filter, zatiaľ čo [3H]XGO oligosacharidy sa nenaviažu. Filtre sa nechali vysušiť a neO zakorporovaný [^H]XG0 sa odstránil premytím tečúcou vodou počas 30 minút. Filtre sa opäť vysušili pri 60 °C, potom boli zvinuté, uložené z vonkajšej strany do valca a boli umiestnené do 22 ml scintilačnej tuby. Bol pridaný scintilant (2 ml Betamaxu ES) a filtre sa odčítali na 3H. Tento test v základe zodpovedá opisu Frya et al. (1992), citované vyššie.
Krok 2: extrakcia XET z oplodia rajčiny
Použila sa škála extrakčných pufrov a stanovila sa ich účinnosť. Zistilo sa, že XET bola účinne extrahovaná 0,1 M pufrom fosfátu sodného, pH 7,2. Tiež sa zistilo, že retencia XET aktivity bola vysoko závislá na iónovej sile a aktivita sa stratila, ak iónová sila chromatografického pufra atď. bola menej ako 0,2 M.
Krok 3: Výber východzieho materiálu pre purifikáciu
Boli vyrobené surové extrakty (v pufri 0,1 M fosfátu sodného, pH 7,2) z ,-tkanív oplodia rajčiny (Lycopersicum esculentum, var. Moneymaker) odobraných vo všetkých štádiách rastu a dozrievania. Zhodne sa zistilo (z niekoľkých experimentov) , že malý zelený plod (t.j. menšieho priemeru ako 35 mm) mal najvyššiu XET aktivitu, exprimovanú ako celková alebo špecifická aktivita. Preto bolo oplodie malého zeleného plodu použité ako východzí materiál na purifikáciu.
Krok 4: Precipitácia síranu amónneho
Tkanivo oplodia (100 g) z malého zeleného plodu alebo plodu menšieho priemeru ako 35 mm bolo zozbierané, zmrazené v tekutom dusíku a uchovávané pri -20 °C alebo -70 °C. Tkanivo bolo homogenizované v 1 g: 1,5 objemu 0,1 M fosfátu sodného, pH 7,2 s 1,0% (objemové) nerozpustným PVP (polyvinylpyrolidon) v miešači. Homogenát bol 1 hodinu miešaný pri 4 ’C, aby sa umožnila difúzia enzýmov bunkovej steny. Nerozpustný materiál bol odstránený centrifugáciou pri 20 000 g, 30 minút, 4 “C v SS34 rotore Sorvall. RC5B centrifúgy. Supernatant pasážoval cez sklenenú vatu a dosiahol až 90% nasýtenie sulfátu amónneho pridaním tuhého sulfátu amónneho (60,3 g/100 ml). Zmes bola miešaná 40 minút pri 4 °C a precipitované proteíny sa zozbierali centrifugáciou (38 000 g, 30 minút, 4 °C). Proteíny precipitované sulfátom amónnym sa uchovávali pri -20 °C bez resuspendovania.
Krok 5: S-sefarózová katexová chromatografia
Proteíny precipitované 0 až 90% sulfátom amónnym resuspendovali v 10 ml pufra 50 mM octanu sodného, pH 5,2 0,2 M NaCI (pufer A) obsahujúceho lmM EDTA, 20 gg/ml chymostatínu, 1 mM PMSF. Resuspendované peleta bola dialyzovaná 2 hodiny proti 2,5 1 pufra A za použitia 3 500 Mt-prerušovacej dialyzačnej rúrky. Vzorka bola zriedená 50 mM pufra acetátu sodného pH 5,3, 1 mM EDTA, aby znížila konduktivita na vhodnú hodnotu pre nanesenie na stĺpec S-sefarózy. Vzorka bola centrifugovaná pri 38 000 g 15 minút, 4 °C, potom bola nanesená na 7 ml S-Sefarózového stĺpca s rýchlym prietokom (Pharmacia) a ekvilib-T'ovaná v pufri A. Stĺpec bol premytý pufrom A (prietoková rýchlosť 1 ml/minútu), až kým sa neodstránili nenaviazané proteíny. Naviazané proteíny boli eluované 0 až 100% gradientom pufra B (rovnaký ako pufer A, ale s IM NaCI) cez 10 stĺpcových objemov. Frakcie (2 ml) boli zozbierané a testované na XET aktivitu.
s vysokou XET -20 ’C. Pred vložili do 1 centrifugovaná
Krok 6: Konkanavalín A-afinitná chromatografia
Frakcie z S-sefarózovej ionomeničovej chromatografie aktivitou boli zozbierané a uchovávané pri konkanavalínovou chromatografiou sa frakcie Mm MgCl2 a MnC^· Časť z S-sefarózy bola a supernatant bol nanesený na stĺpec konkanavalínu-A ekvilibrovaný v 50 mM pufra octanu sodného pH 5,7 s obsahom 0,2 M NaCI, 1 mM MgC^, 1 mM CaCl2 a 1 mM MnCl2· Naviazané proteíny boli eluované zo stĺpca jednostupňovou elúciou pufrom D (ako pufer C plus 0,5 metyl α-D-manopyranozid). Zozbierané frakcie boli testované na XET aktivitu.
Krok 7: Sekventovanie aminokyselín s N-zakončením
Vzorky zo stĺpca konkanavalínu A s vysokou XET aktivitou boli separované podľa predpokladanej molekulovej hmôt22 nosti na 15% SDS polyakrylamidovom géli. Po elektroforéze boli proteíny prenesené na Problott™ membránu (transferový pufer: 10 mM CAPS pH 11 v 10% metanole). Problott™ membrána bola farbená v 0,1% Coomassieovej brilantnej modrej R250 v 1% kyseline octovej, 40% metanole a odfarbená v 50% metanole . Jednoduchý pás (t.j. proteín bol úspešnej purifikovaný po homogenitu) asi M^ó 000 bol viditeľný, vybraný a podrobený sekventovaniu aminokyselín s N-zakončením na ABI modeli 475 proteínového sekventera. Určená sekvencia bola (Seq ID No. 33) : GYPRRPVDVPFVKNY. Hladina sekvencie bola konzistentná s intenzitou sfarbeného pásu proteínu.
V ďalšom aspekte preto vynález poskytuje v podstate čistý polypeptid s xýloglukánendotransglykozylázovou (XET) aktivitou so zjavnou molekulovou hmotnosťou 36 kDa, ako bolo stanovené pomocou SDS-PAGE.
Výhodne možno enzým získať z rastlín rajčiny, najvýhodnejšie z oplodia zeleného plodu rajčiny a výhodne má sekvenciu aminokyselín s N-zakončením GYPRRPVDVPFVKNY.
Enzým je výhodne purifikovaný jednou alebo viacerými precipitáciami sulfátom amónnym, ionomeničovou chromatografiou a/alebo konkanavalín A afinitnou chromatografiou.
Príklad 4
Expresia XET v rajčinách
XET test popísaný vyššie bol použitý na monitorovanie XET aktivity v rastline rajčiny (var. Moneymaker) . Extrakty 0,2 M fosfát) boli pripravené z koreňa, listu a segmentov petioly izolovaných z rôznych častí rastúcej rastliny a plodu v 4 štádiách vývoja a 3 štádiách dozrievania. Najvyššia XET aktivita sa zaznamenala v extraktoch pripravených z petiol izolovaných z vrchola rastúcej rastliny a vyvíjajúceho sa (malého zeleného) plodu, v súlade s tvorbou XET pri rastlinnom raste.
Celková RNK bola extrahovaná z rozdielnych častí rastliny rajčiny za použitia Qiagen extrakčného postupu.
tXET-Bl (kloň BI rajčinovej XET) traskripčné hladiny boli stanovené pomocou analýzy ochrany RNA-ázy. Anti sense tXET-Bl špecifická sonda bola zosyntetizovaná pomocou inkubácie HindlII linearizovaného ρΐΧΕΤ-Bl plazmidu s 1 μΐ T3 RNK polymerázy v prítomnosti 0,5 mM rATP/rGTP/rCTP, 5 nM UTP, 50gCi32P/UTP (800 Ci/mmol), 1 μΐ inhibítora RNA-ázy a 2 μΐ reakčného pufra (Ambion sondová súprava pre syntézu) v konečnom reakčnom objeme 20 μΐ 1 hodinu pri 25 °C. Po digescii DNA-ázy a fenol/chloroform extrakcii bola sonda znovu získaná etanolovou precipitáciou. 10^ cpm značená sonda bola inkubovaná s 5 gg celkovej RNA a analýza ochrany RNA-ázy bola prevedená za použitia RPAII súpravy dodanej firmou Ambion. Ochránená sonda bola kvántifikovaná denaturujúcou gélovou elektroforézou s následnou analýzou na fosforovom zobrazovači molekulovej dynamiky. Najvyššie hladiny tXET-Bl transkriptov boli detegované v oplodí plodu, s hladinami zvyšujúcimi sa počas dozrievania a tvorenia ružového plodu. Maximálne hladiny v stonke (ekvivalentné hladinám zisteným v zrelom plode) boli približne 10 cm od vrcholu 30 cm rastliny. Nižšie hladiny tXET-Bl traskriptu boli detegované v liste, s hladinami nevýznamnými v koreni. Rozdiely v známkach aktivity a hladina transkriptu naznačujú, že alebo celková XET aktivita je kódovaná súpravou rozdielne exprimovaných génov alebo selektívna izolácia izoforiem sa vyskytuje pri 0,2 M fosfátu. Známka expresie tXET-Bl naznačuje, že táto izoforma môže byť zainteresovaná pri dozrievaní plodu.
Príklad 5
Redukcia XET enzymatických hladín v transgenických rajčinových rastlinách
Konštitutívny 2 promoter manopín syntázy bol obnovený na BglII fragmente z plazmidu pSLJ2’Lnos a bol pripojený do plazmidu ptXET-Bl. (pSLJ2’Lnos bol odvodený z pSLJlOOó [Jones et al., 1992, Transgenic Research, 1, 285 až 297] výmenou DNA sekvencie kódujúcej enzým β-glukuronidázu s poly24 väzbovou sekvenciou). Tento umiestnil ΐΧΕΤ-Bl kódujúcu sekvenciu v antisense orientácii po smere 2 promótora (obr. 7) . Xba - Sst fragment obsahujúci promótor a 798 bp (nukleotidy 187 až 984) tXET-Bl sekvencie bol potom klonovaný do rastlinného transformačného vektora, pGPTV-kan (Becker, D. et al., 1992, Plánt Molecular Biology, 20, 1195 až 1197 a obr. 8). Výsledný plazmid, pGPTV-kan-2 ΐΧΕΤ-Bl bol použitý na transformovanie Agrobacterium LBA4404 a rekombinantný kmeň Agrobacterium bol použitý na infikovanie kotyledonárnych segmentov rajčiny (varieta Moneymaker). Transformované rastliny boli selektívne regenerované v prítomnosti kanamycínu. Prítomnosť prenesenej DNA bola potvrdená PCR amplifikáciou DNA segmentu medzi primérmi NPTIIb (5 ATCGGGAGCGGCGATACCGTA 3 , Seq. ID No. 34) a 8-HS (viď. vyššie) . XET aktivita bola monitorovaná v extraktoch pripravených z ružového plodu (15 rastlín) spôsobom opísaným vyššie. Hladiny boli redukované až do približne 80 % v rastlinách transformovaných antisense tXET zostrojenia.
ZOZNAM SEKVENCIÍ (1) všeobecné informácie (i) žiadateľ:
(A) meno: Unilever PLC (B) ulica: Unilever House, Blackfriars (C) mesto: Londýn (E) krajina: Veľká Británia (F) poštový kód (ZIP): EC4P 4BQ (G) telefón: (0234) 222268 (B) telefax: (0234) 222633 (A) meno: Unilever NV (B) ulica: Veena 455 (C) mesto: Roterdam (E) krajina: Holandsko (F) poštový kód (ZIP): 3013 AL (ii) názov vynálezu: Nový rastlinný enzým (iii) počet sekvencií: 34 (iv) počítačovo čitateľná forma:
(A) typ média: Floppy disk (B) počítač: IBM kompatibilný (C) operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) programové vybavenie: Patentln Release # 1.0 Verzia #1.25 (EPO) (2) Informácia pre SEQ ID N0:l:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 994 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) anti sense: žiadny (ix) znaky:
(A) meno/kľúč: CDS (B) lokalizácia: 79..945 (xi) opis sekvencie: SEQ ID N0:l
GA ^AGTAGAC·
CTG □Ό r-.* ! t r-A.·
AC ATACATTCCC AAAAA.CA.AC'
AACTACATA'
TCCHAAGAT TTCCTATA ATG HG CTG CAG CAG CTA TCT GH CTT GCT CTA
Met Leu Leu Gin Gin Leu Ser Val Leu Ala Leu
. 1 5 10
CH CTC HG CTA TGT CCT GH TGG GCT GAC AAT HC TAC CM GAT GCA
Leu Leu Leu Leu Cys Pro Val Trp Ala Asp Asn Phe Tyr Gin Asp Ala
15 20 25
ACG GH ACC TH GGT GAT CAG CGA GCT CAG ATA CAA GAT GGT GGG CGC
Thr Val Thr Phe Gly Asp Gin Arg Ala Gin íle Gin Asp Gly Gly Arg
30 35 40
CH CTC GCC HG TCC CH GAC AAA AH TCA GGT TCA GGA TH CAG TCT
Leu Leu Ala Leu Ser Leu Asp Lys íle Ser Gly Ser Gly Phe Gin Ser
45 50 55
AAG AAT GAA TAT HA TH GGA AGG HC GAT ATG CAG CTC AAA CTA GTA
Lys Asn Glu Tyr Leu Phe Gly Arg Phe Asp Met Gin Leu Lys Leu Val
60 65 70 75
CCT GGA AAT TCT GCT GGC ACT GTC ACT ACC HC TAT HG TCT TCT CAA
Pro Gly Asn Ser Ala Gly Thr Val Thr i hr Phe Tyr Leu Ser Ser Gin
85 90
GGA GCA GGG CAC GAC GAA AH GAT TTT GAG HT CTG GGA AAT TCA TCA
Gly Ala Gly His Asp Glu íle Asp Phe Glu Phe Leu Gly Asn Ser Ser
95 100 105
GGC CAA CCG TAC ACG GH CAT ACT MT GTC TAC TCT CM GGA AM GGC
Gly Gin Pro Tyr Thr Val His Thr Asn Val Tyr Ser Gin Gly Lys Gly
110 115 120
AAC AAA GM CM CAG TH CGC CTA TGG TH GAT CCC ACC TCG CCG HC
Asn Lys Glu Gin Gin Phe Arg Leu Trp Phe Asp Pro Thr Ser Pro Phe
125 130 135
CAC ACC TAC TCT AH GH TGG MC TCT CM CGC ATC ATA TH HG GTG
His Thr Tyr Ser íle Val Trp Asn Ser Gin Arg íle íle Phe Leu Val
140 145 150 155
GAT AAT ATC CCA ATA AGA GTA HC MC MC CAC GM MG CH GGT. GH
Asp Asn íle Pro íle Arg Val Phe Asn Asn His Glu Lys Leu Gly Val
160 165 170
GCA HC CCA MG MC CM GCA ATG AGA GH TAT GCC AGT HA TGG MT
Ala Phe Pro Lys Asn Gin Ala Met Arg Val Tyr Ala Ser Leu i rp Asn
175 180 185
GCT GAT GAC TGG GCA ACA CM GGA GGG CGA GTG MG ACG GAT TGG TCA
Ala Asp Asd i rp Ala T'nr Gin G1 v Gly Arg Val Lys Thr Asp i rp Ser
190 195 200
ATG GCT CCG TH ACA GC l TCT TAC AGG AAT HC AAC ACA AAT GCT TGT
Met Ala Pro Phe i nr Al a Ser lyr Arg Asn Phe Asn ľnr Asn Ala Cys
205 210 215
111
159
207
255
303
351
399
447
495
543
591
639
687
735
GH TGG TCA GCT GCA TCG TCT ACT TCG TCC TGT GGA GGC TCT AAG ACT 783
Val i rp Ser Ala Ala Ser Ser i hr Ser Ser Cys Gly Gly Ser Lys i hr
220 225 230 235
GAT TCA GTA AAC AAT GAT CAG GCA TGG CAA ACT CAA GAA C l G AAC GGT 831
Asp Ser Val Asn Asn Asp Gin Ala Trp Gin ihr Gin Glu Leu Asn Gly
240 245 250
AAT GAC AGA AAT AGG cn CGA TGG GTT CAG CAG AAA TAC ATG ATC TAC 879
Asn Asp Arg Asn Arg Leu Arg Trp Val Gin Gin Lys lyr Met íle lyr
255 260 265
AAT TAC TGT GCA GAT GCT AAA AGG TTC TCT CAA GGC cn TCT CCT GAA 927
Asn lyr Cys Al a Asp Ala Lys Arg Phe Ser Gin Gly Leu Ser Pro Glu
270 275 280
TGC AAA CGT TCA AGG TTC TAAÄGGATCA AATCTACGAA TGTTGTCTG' Γ 975
Cys Lys Arg Ser Arg Phe
285
994 (2) Informácia pre SEQ ID NO:2:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 289 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: lineárna
( ii) moleku lárny t yp: pro teín
( xi) popis sekvene ie: SEQ ID NO: 2:
Met Leu Leu Gin Gin Leu Ser Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Cys
1 5 10 15
Pro Val Trp Al a Asp Asn Phe Tyr Gin Asp Ala Thr Val Thr Phe Gly
20 25 30
Asp Gin Arg Al a Gin íle Gin Asp Gly Gly Arg Leu Leu Al a Leu Ser
35 40 45
Leu Asd Lys íle Ser Gly Ser Gly Phe Gin Ser Lys Asn Glu Tyr Leu
50 55 60
Phe Gly Arg Phe Asp Met Gin Leu Lvs Leu Val Pro Gly Asn Ser Ala
65 70 75 80
Gly Thr Val Thr Thr Phe Tyr Leu Ser Ser Gin Gly Al a Gly His Asp
85 90 95
Glu íle Asd Phe G1 u Phe Leu Gly Asn Ser Ser Gly G1 n Pro Tyr Tnr
100 105 110
Val His Thr Asn Val lyr Ser Gin Gly Lys Gly Asn Lys Glu Gin Gin
115 120 125
Phe Arg Leu Trp Phe Asp Pro Thr Ser Pro Phe His Thr Tyr Ser íle
130 135 140
Val Trp Asn Ser Gin Arg íle íle Phe Leu Val Asp Asn íle Pro íle
145 150 155 160
Arg Val Phe Asn Asn His Glu Lys Leu Gly Val Ala Phe Pro Lys Asn
165 170 175
Gin Ala Met Arg Val Tyr Ala Ser Leu Trp Asn Ala Asp Asp Trp Ala
180 185 190
Thr Gin Gly Gly Arg Val Lys Thr Asp Trp Ser Met Ala Pro Phe Thr
195 ST- 200 205
Ala Ser Tyr Arg Asn Phe Asn Thr Asn Ala Cys Val Trp Ser Ala Ala
210 215 220
Ser Ser Thr Ser Ser Cvs Gly Gly Ser Lys Thr Asp Ser Val Asn Asn
225 230 235 240
Asp Gin Ala Trp Gin Thr Gin Glu Leu Asn Gly Asn Asp Arg Asn Arg
245 250 255
Leu Arg Trp Val Gin Gin Lys Tyr Met íle Tyr Asn Tyr Cys Ala Asp
260 265 270
Ala Lys Arg Phe Ser Gin Gly Leu Ser Pro Glu Cys Lys Arg Ser Arg
275 280 285
Phe (2) Informácia pre SEQ ID NO:3:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 10 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: neznáma (ii) molekulárny typ: peptid (iii) hypotetický: áno (iii) antisense: žiadny (v) fragmentový typ: interný (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:3:
Asc g i u I'1 e Asd Phe Giu Phe Leu Gly Asn i 5 -0 (2) Informácia pre SEQ ID NO:4;
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 10 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: neznáma (ii) molekulárny typ: peptid (iii) hypotetický: áno (iii) antisense: žiadny (v) fragmentový typ: interný (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:4:
Ser Leu Trp Asn Ala Asp Asp Trp Ala Thr 1 5 10 (2) Informácia pre SEQ ID NO:5:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 10 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: neznáma (ii) molekulárny typ: peptid (iii) hypotetický: áno (iii) antisense: žiadny (v) fragmentový typ: interný (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:5:
Phe Tyr Ser Lys Asn Glu Tyr Leu Phe Gly 1 5 10 (2) Informácia pre SEQ ID NO:6:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 10 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: neznáma (ii) molekulárny typ: peptid (iii) hypotetický: áno (iii) antisense: žiadny (v) fragmentový typ: interný (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:6:
Gly Thr Val Thr Tnr Phe Tyr Leu Ser Ser 1 5 10 (2) Informácia pre SEQ ID NO:7:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 1289 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (ix) znaky:
(A) meno/kľúč: CDS (B) lokalizácia: 232..1092 (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:7:
GAATTCTGGG TAGGCTHGG HGCMTMG CGTCTGHCT TCGCHACTA CTHGGAAM 60
ATTGACTTTA GGCCTGCGGT CCCTAGCAH AMHCATCG ACCGCTGTGT CATATAGACG 120
CCGCTTTGCA AGATCGHGA CCMGGTAH GHACCTCGG ACGGTCTCAA GCAAAGCGGA 180
CGATGTGGGT GTHGTGTGT ATGCCAHGT AGHGTAGM TGTAAAATAT A ATG HG 237
Met Leu
CTG CAG CH TCT CH CH ACA CTA GTC HA CTA TCC CCT GH TCC GCT 285
• Leu Gin Leu Ser Leu Leu Thr Leu Val Leu Leu Ser Pro Val Ser Ala
5 10 15
« GAT AAT HC TAC CAA GAC GCG GCG GTC ACG j | i GGT GAC CAG CGC GCT 333
Asp Asn Phe tyr Gin Asp Ala Ala Val Thr Phe Gly Asp Gin Arg Ala
20 25 30
CAG ATA CAA GAT GGA GGG CGC CH CTC ACA HG TCA CH GAT AM AH 381
Gin íle Gin Asp Gly Gly Arg Leu Leu i'nr Leu Ser Leu Asp Lys íle
35 40 45 50
TCA GGT TCC GGA TH CAG TCT MG MT GAG TAT HA HG GGA AGG HC 429
Gly Ser Gly Phe Gin Ser Lys Asn Glu i vr 4 Leu Phe Gly Arg Phe
55 60 65
GAT ATG CAG CH AAA CTC GTA CCT GGA MT TCT GCT GGC ACT GTC ACC 477
Asp Met Gin Leu Lys Leu Val Pro Gly 75 Asn Ser Ala Gly i'nr Val i hr
70 80
ACA HC TAT HG TCT TCT CM GGA GCA r* Gub CAT GAT GAA AH GAT TH 525
i hr Phe lyr Leu Ser Ser Gin Gly Al a Gly His Asp Glu íle Asp Phe
85 90 95
GAG TH CTA GGA AAT TCA TCA GGA CTA CCT TAC ACG GH CAT ACC MT 573
Glu Phe Leu Gly Asn Ser Ser Gly Leu Pro Tyr i hr Val His Thr Asn
100 105 110
GTT TAC TCT CAA GGA AAA GGC AAT AAA GAA CAA CAA πτ CGT CTC TGG 621
Val Tyr Ser Gin Gly Lys Gly Asn Lys Glu Gin Gin Phe Arg Leu Trp
115 120 125 130
τπ GAT CCA ACT TCG TCG nc CAC ACT TAC TCT ΑΠ 6π TGG MC TCT 669
Phe Asp Pro Thr Ser Ser Phe His Thr Tvr Ser Ile Val i rp Asn Ser
135 140 145
CAA CGG ATC ATA τπ KG GTG GAT AAT ATC CCA ΑΠ AGA gtg πc AAC 717
Gin Arg Ile íle Phe Leu Val Asp Asn Ile Pro Ile Arg Val Phe Asn
150 155 160
AAC CAC GAA GCA cn GGT GH GCA TAC CCA AAG AAT CM GCA AlG AGA 765
Asn His Glu Ala Leu Gly Val Ala Tyr Pro Lys Asn Gin Ala Met Arg
165 170 175
GTT TAC GCG AGT CTA TGG AAÍ- GCT GAT GAT TGG GCT ACA CAA GGA GGA 813
Val iyr Ala Ser Leu i rp Asn Ala .Asp Asp i rp Ala Thr Gin Gly Gly
180 185 190
CGG GTG AAG ACA GAT TGG TCT ATG GCT CCG πτ ACA GCT TCT TAC AGG 861
Arg Val Lys Thr Asp Trp Ser Met Ala Pro Phe i hr Ala Ser Tyr Ara
195 200 205 210
AAT TTC AAT ACA AAT GCT TGT GH TGG TCA GCT GCT ACG TCT ACT TCG 909
Asn Phe Asn Thr Asn Ala Cys Val Trp Ser Ala Ala i hr Ser Thr Ser
215 220 225
TCT TGT GGA GGT TCT AAG ACT GAG TCA GTA MC AAT GAT GAG ACA TGG 957
Ser Cys Gly Gly Ser Lys Thr Glu Ser Val Asn Asn Asp Glu Thr Trp
230 235 240
CAA ACG CAA CAA CTG AA.C GCT AAT GGA AGA AAT AGA ATA CGA TGG οπ 1005
Gin i hr Gin Gin Leu Asn Ala Asn Gly Arg Asn Arg íle Arg irp Val
245 250 255
CAG CAG AAG TAC ATG ATC TAC MT TAC TGT GCA GAT GCT AAT AGG πτ 1053
Gin Gin Lys Tyr Met Ile iv r Asn Tyr Cys Ala Asd Ala Asn Arg Phe
260 265 270
TCT CAA GGC TTT TCT CCT GAA TGC AAG CGT TCA AGG πτ TAAGGCG GAT 1102
5$r Gin Gly Phe Ser Pro Glu Cys Lys Arg Ser Ar q Pne
275 280 285
ATATATAGTA TATGMTGTA AAAHATGH TGTTTCACTT TTCTATTCn nAATTTTGA 1162
TCAGGTAAAA AAAAAAAAGA ACATAGTGTA AKAITTGTG TATGCAATAT AKCKTATT 1222 CTTTTľGTAA TCATGAAATA GAAATMTAA TGAATTGTTT TCCTGAAAAA AAAAAAACCG 1282 GAATTCC 1289 (2) Informácia pre SEQ ID NO:8:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 287 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: proteín
( xi) ΡθΡ ds : sekv enc: íe: SEQ ID NO: 8:
Met Leu Leu Gin Leu Ser Leu Leu Thr Leu Val Leu Leu Ser Pro Val
1 5 10 15
Ser Al a Asp Asn Phe Tyr Gin Asp Ala Ala Val Thr Phe Gly Asp Gin
20 25 30
Λ m / u y Ala C-ln íle Gin Asp i £ly Gly Arg Leu Leu Thr Leu Ser Leu Asp
35 40 45
Lys íle Ser Gly Ser Gly Phe Gin Ser Lys Asn Glu Tyr Leu Phe Gly
50 55 60
Ara Phe Asp Met Gin Leu Lys Leu Val Pro Gly Asn Ser Ala Gly Thr
65 70 75 80
Val Thr Thr Phe Tyr Leu Ser Ser Gin Gly Ala Gly His Asp Glu íle
85 90 95
Asp Phe Glu. Phe Leu Gly Asn Ser Ser Gly Leu Pro Tyr Thr Val His
100 105 110
Thr Asn Val Tyr Ser Gin Gly Lys Gly Asn Lys Glu Gin Gin Phe Arg
115 120 125
Leu Trp Phe Asp Pro Thr Ser Ser Phe Hi s Thr Tyr Ser íle Val Trp
130 135 140
Asn Ser Gin Arg íle íle Phe Leu Val Asp Asn íle Pro íle Arg Val
145 150 155 160
Phe Asn Asn Hi s Glu Ala Leu Gly Val Ala Tyr Pro Lys Asn Gin Al a
165 170 175
Met Arg Val Tyr Al a Ser Leu Trp Asn Al a Asp Asp Trp Ala Thr Gin
180 185 190
Gly Gly ' Ara Val Lys Thr Asp Trp Ser Met Ala Pro Phe Thr Ala Ser
195 200 205
Tyr Ara Asn Phe Asn Thr Asn Ala Cys Val trp Ser Ala Ala Thr Ser
21Ó 215 220
Thr Ser Ser Cys Gly Gly Ser Lys T'nr Glu Ser Val Asn Asn Asp Glu
225 230 235 240
T'nr Trp Gin Thr Gin Gin Leu Asn Ala Asn Gly Arg Asn Arg íle Arg
245 250 255
Trp Val Gin Gin Lys Tyr Met íle Tyr Asn Tyr Cys Ala Asd Ala Asn
260 265 270
Arg Phe Ser Gin Gly Phe Ser Pro Glu Cys Lys Arg Ser Arg Phe
275 280 285 (2) Informácia pre SEQ ID NO:9:
(i) charakteristiky-sekvencie:
(A) dĺžka: 26 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:9:
AAGCTTCCTC AACATCAAAG GGTAGA (2) Informácia pre SEQ ID NO:10:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 26 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:10:
AAGCi iCAíú A iuA-A ΐCGA i.-.i íuA (2) Informácia pre SEQ ID NO:11:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 26 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:11:
GGATCCTCAA TATCGATTTC ATCATG 26 (2) Informácia pre SEQ ID NO:12:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 26 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:12:
AAGCTTCATT TATGGTTTGA TCCMC 26 (2) Informácia pre SEQ ID NO:13:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 26 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID N0:13:
ουΑ i cCuíTo uAlCaAACCA TAAA l c (2) Informácia pre SEQ ID NO:14:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 26 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:14:
GGATCCGTTA ACGTGTGGTC TCGTGT 26 (2) Informácia pre SEQ ID NO:15:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 20 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:15
GAYGARATNG AYWTHGARTT (2) Informácia pre SEQ ID NO:16:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 20 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:16
GiNGGRTCRA ACCANARRTG (2) Informácia pre SEQ ID NO:17:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 19 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:17:
CGATGCAGCT GGAATTTCA (2) Informácia pre SEQ ID NO:18:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 20 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:18:
AGTTTGAGCT GCATATCGAA (2) Informácia pre SEQ ID NO:19:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 20 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:19:
TTTGATCCCA CCTCGCCGTT (2) Informácia pre SEQ ID NO:20:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 20 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:20:
CAGCTGACCA AACACAAGCA 20 (2) Informácia pre SEQ ID NO:21:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 20 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: ŠEQ ID NO:21:
AnAACCCTC ACTAAAGGGA 20 (2) Informácia pre SEQ ID NO:22:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 20 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:22:
TMTACGACT CACTATAGGG (2) Informácia pre SEQ ID NO:23:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 19 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:23: GTTTTCCCAG TCACGACGT (2) Informácia pre SEQ ID NO:24:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 19 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:24 AATATCAGCG GAAACAGGG (2) Informácia pre SEQ ID NO:25:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 20 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:25
CCCTGTTTCC 6CTGATAATT (2) Informácia pre SEQ ID NO:26:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 20 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:26:
(2) Informácia pre SEQ ID NO:27:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 20 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:27:
TACTGTGCAG ATGCTAATAG (2) Informácia pre SEQ ID NO:28:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 20 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:28:
GGAGGACGGG TGAA.GACAGA (2) Informácia pre SEQ ID NO:29:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 20 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:29:
GTGTAAGGTA GTCCTGATGA 20 (2) Informácia pre SEQ ID NO:30:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 20 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:30:
TCATCAGGAC TACCTTACAC 20 (2) Informácia pre SEQ ID NO:31:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 20 základných párov
(B) typ: nukleová kyselina
(C) vláknitosť: jednoduchá
(D) topológia: lineárna
(ii) molekulárny typ: cDNA
(iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:31:
CCCTTGGATC CGCTATAATT (2) Informácia pre SEQ ID NO:32:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 20 aminokyselín (B) typ: aminokyselina j (D) topológia: neznáma (ii) molekulárny typ: peptid (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (v) fragmentový typ: N-zakončenie (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:32:
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ala Asp Asn Phe 15 10 15
Tyr Gin Asp Ala 20 (2) Informácia pre SEQ ID NO:33:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 15 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (D) topológia: neznáma (ii) molekulárny typ: peptid (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (v) fragmentový typ: N-zakončenie (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:33:
Gly Tyr Pro Arg Arg Pro Val Asp Val Pro Phe Trp Lys Asn Tyr 1 5 10 15 (2) Informácia pre SEQ ID NO:34:
(i) charakteristiky sekvencie:
(A) dĺžka: 21 základných párov (B) typ: nukleová kyselina (C) vláknitosť: jednoduchá (D) topológia: lineárna (ii) molekulárny typ: cDNA (iii) hypotetický: žiadny (iii) antisense: žiadny (xi) popis sekvencie: SEQ ID NO:34:
ATCGGGAGCG GCGATACCGT A 21
TV 5-y-G'Cié

Claims (27)

1. Polypeptid s xyloglukán (XET) aktivitou, zahrňujúci zvyšky vej sekvencie znázornenej na obr funkčný ekvivalent, ktorý má s ňou identitu.
endo-transglykozylázovou 21 až 289 aminokyselino1 (Seq ID No. 2) alebo aspoň 80% aminokyselinovú
2. Polypeptid podľa nároku 1, obsahujúci hlavne zvyšky 1 až 189 aminokyselinovej sekvencie znázornenej na obr. 1.
3. Polypeptid podlá nároku 1, obsahujúci hlavne zvyšky 19 až 287 aminokyselinovej sekvencie znázornenej na obr. 5 (Seq ID No. 8).
4. Polypeptid podľa nároku 1, obsahujúci hlavne zvyšky 1 až 287 aminokyselinovej sekvencie znázornenej na obr. 1.
5. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorý má aspoň 85% aminokyselinovej identity so sekvenciou zvyškov 21 až 289 sekvencie znázornenej na obr. 1.
6. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorý má aspoň 90% aminokyselinovej identity so sekvenciou zvyškov 21 až 289 sekvencie znázornenej na obr. 1.
7. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, obsahujúci jeden alebo viac nasledovných peptidov (s možnosťou jedného, najviac dvoch rozdielov v aminokyselinách v každom peptide): DEIDFEFLGN; SLVNADDVAT; FYSKNEYLFG; a GTVTTFZLSS.
8. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, najmä jeho izolácia z látok odvodených od iných rastlín.
9. Sekvencia nukleotidov kódujúca hlavne aminokyselinovú sekvenciu zvyškov 21 až 289 aminokyselinovej sekvencie znázornenej na obr. 1 alebo funkčný ekvivalent s najmenej 70%-nou homológiou s + alebo - reťazcom takejto nukleotidovej sekvencie.
10. Sekvencia nukleotidov podľa nároku 9, obsahujúca najmä DNA sekvenciu znázornenú na obr. 1 (Seq ID No. 1).
11. Sekvencia nukleotidov podľa nároku 9, kódujúca najmä DNA sekvenciu znázornenú na obr. 5.
12. Sekvencia nykleotidov podľa nároku 11, kódujúca najmä DNA sekvenciu znázornenú na obr. 5 (Seq ID No. 7).
13. Sekvencia nukleotidov podľa nároku 9 alebo 11, ďalej obsahujúca promótor kvôli umožneniu expresie v hostiteľskej bunke.
1. Sekvencia nukleotidov podľa nároku 13, kde promótor nie je rovnaký ako promótor, s ktorým sekvencia v rastline prirodzene súvisí.
15. Sekvencia nukleotidov podľa nároku 9, ktorá má aspoň 80%-nú homológiu s + alebo - reťazcom nukleotidovej sekvencie z obr. 1.
16. Sekvencia nukleotidov podľa nároku aspoň 85%-nú homológiu s + alebo - reťazcom sekvencie z obr. 1.
15, ktorá má nukleotidovej
17. Sekvencia nukleotidov podľa ktoréhokolvek z nárokov 9 až 16, kódujúca polypeptid v súlade s ktorýmkoľvek z nárokov 1 až 8 .
18. DNA vektor obsahujúci sekvenciu v súlade s ktorýmkoľvek z nárokov 9 až 17.
19. Vektor podľa nároku 18 schopný priamej expresie polypeptidu v súlade s ktorýmkoľvek z nárokov 1 až 8, ak je zavedený do vhodného hoastiteľa.
20. Hostiteľská bunka, do ktorej bola zavedená nukleotidová sekvencia v súlade s ktorýmkoľvek z nárokov 9 až 17 alebo jej progény.
21. Hostiteľská bunka podľa nároku 20, obsahujúca vektor v súlade s nárokom 18 alebo 19.
22. Spôsob prípravy polypeptidu, ktorý má xyloglukán endo-transglykozylázovú. (XET) aktivitu, vyznačuj ú ci sa tým, že zahrňuje kroky: zavedenia vektora v súlade s nárokom 19 do vhodnej hostiteľskej bunky; rast hostitelskej bunky a/alebo jej progénov za vhodných pestovacích podmienok tak, že je exprimovaný polypeptid; a získanie polypeptidu z média kultúry a/alebo hostiteľských buniek.
23. Spôsob podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že hostiteľskou bunkou je rastlinná bunka alebo mikroorganizmus .
24. Spôsob podľa nároku 22 alebo 23, vyznačujúci sa tým, že hostiteľskou bunkou je kvasinková bunka.
25. Spôsob meniaci vlasnosti rasliny alebo jej časti, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje zavedenie účinnej časti nukleotidovej sekvencie v súlade s ktorýmkoľvek z nárokov 9 až 17 do rastliny alebo jej časti, takže dôjde k zmene stupňa XET aktivity v rastline alebo v jej časti.
26. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že stupeň aktivity XET je v rastline alebo jej časti znížený.
27. Spôsob podľa nároku 25 alebo 26, vyznačuj úci sa t ý m, že je zmenená jedna alebo viac nasledovných vlastností: veľkosť, rýchlosť rastu, textúra, dozrievanie.
28. Rastlina vyrobená génovým inžinierstvom spôsobom podľa nároku 25, 26 alebo 27, alebo progény takejto rastliny.
SK576-96A 1993-11-10 1994-11-10 Polypeptide with xyloglucan endo-transglycosylase activity, method of its manufacture, nucleotide strand, dna vector SK57696A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB939323225A GB9323225D0 (en) 1993-11-10 1993-11-10 Novel plant enzyme
PCT/GB1994/002467 WO1995013384A1 (en) 1993-11-10 1994-11-10 Tomato xyloglucan endo-transglycosylase

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK57696A3 true SK57696A3 (en) 1996-10-02

Family

ID=10744976

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK576-96A SK57696A3 (en) 1993-11-10 1994-11-10 Polypeptide with xyloglucan endo-transglycosylase activity, method of its manufacture, nucleotide strand, dna vector

Country Status (16)

Country Link
US (1) US6215044B1 (sk)
EP (1) EP0728208B1 (sk)
JP (1) JPH09511121A (sk)
AT (1) ATE236256T1 (sk)
AU (1) AU698844B2 (sk)
CA (1) CA2176133A1 (sk)
CZ (1) CZ136196A3 (sk)
DE (1) DE69432427T2 (sk)
DK (1) DK0728208T3 (sk)
ES (1) ES2196048T3 (sk)
GB (1) GB9323225D0 (sk)
HU (1) HUT74598A (sk)
PL (1) PL317046A1 (sk)
PT (1) PT728208E (sk)
SK (1) SK57696A3 (sk)
WO (1) WO1995013384A1 (sk)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3289832B2 (ja) * 1995-12-21 2002-06-10 ノボザイムス アクティーゼルスカブ キシログルカンエンドトランスグリコシラーゼ（ｘｅｔ）の利用
CN1156570C (zh) * 1997-02-26 2004-07-07 诺沃奇梅兹有限公司 微生物木糖葡聚糖内切转糖基酶、其生产方法及用途
CA2298068C (en) * 1997-07-27 2015-11-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University In Jerusalem Plants transgenic for a cellulose binding domain with altered morphology
GB9720038D0 (en) * 1997-09-19 1997-11-19 Nickerson Biocem Ltd Control
AU4029999A (en) 1998-05-29 1999-12-20 Novozymes A/S Methods for using xyloglucan endotransglycosylase in baking
GB0307294D0 (en) * 2003-03-29 2003-05-07 Univ Southampton A novel genetic approach to improve the processability of fresh produce
MX2007011801A (es) * 2005-03-24 2008-02-19 Neose Technologies Inc Expresion de glicosiltransferasas eucarioticas activas, solubles en organismos procarioticos.
CN106068077B (zh) 2014-03-05 2019-06-07 诺维信公司 用于改进农作物的收获后特性的组合物和方法
US20170073890A1 (en) 2014-03-05 2017-03-16 Novozymes A/S Compositions and Methods for Functionalizing and Linking Materials
US20160333292A1 (en) 2014-03-05 2016-11-17 Novozymes A/S Compositions and Methods for Improving Properties of Cellulosic Textile Materials with Xyloglucan Endotransglycosylase
US20170027167A1 (en) 2014-03-05 2017-02-02 Novozymes Bioag A/S Formulations comprising polymeric xyloglucan as a carrier for agriculturally beneficial agents
WO2015134729A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Novozymes A/S Compositions and methods for improving properties of non-cellulosic textile materials with xyloglucan endotransglycosylase

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA931333B (en) * 1992-02-28 1994-08-25 Unilever Plc Recombinant plant enzyme.
JP2898499B2 (ja) 1992-03-26 1999-06-02 寳酒造株式会社 エンド型キシログルカン転移酵素遺伝子

Also Published As

Publication number Publication date
GB9323225D0 (en) 1994-01-05
PT728208E (pt) 2003-08-29
CZ136196A3 (en) 1996-12-11
WO1995013384A1 (en) 1995-05-18
AU698844B2 (en) 1998-11-12
DE69432427D1 (de) 2003-05-08
DK0728208T3 (da) 2003-07-21
EP0728208B1 (en) 2003-04-02
US6215044B1 (en) 2001-04-10
HU9601232D0 (en) 1996-06-28
JPH09511121A (ja) 1997-11-11
CA2176133A1 (en) 1995-05-18
ATE236256T1 (de) 2003-04-15
HUT74598A (en) 1997-01-28
PL317046A1 (en) 1997-03-03
EP0728208A1 (en) 1996-08-28
ES2196048T3 (es) 2003-12-16
AU8112994A (en) 1995-05-29
DE69432427T2 (de) 2004-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Arrowsmith et al. Characterisation of two tomato fruit-expressed cDNAs encoding xyloglucan endo-transglycosylase
Schröder et al. Biochemical and molecular characterisation of xyloglucan endotransglycosylase from ripe kiwifruit
US6693227B1 (en) Inducibile plant promoters
De Silva et al. Xyloglucan endotransglycosylase and plant growth
SK57696A3 (en) Polypeptide with xyloglucan endo-transglycosylase activity, method of its manufacture, nucleotide strand, dna vector
EP0629243A1 (en) Recombinant plant enzyme
US5767364A (en) Endo-1,4-beta-D-glucanase
AU707797B2 (en) Novel (exo)-(1-4)-beta-D galactanase
Aubert et al. A new cDNA encoding a xyloglucan endo-transglycosylase-related polypeptide (AtXTR8) preferentially expressed in seedling, root and stem of Arabidopsis thaliana
US5859344A (en) Modified fruit containing galactanase transgene
AU778691B2 (en) Genes coding for tomato beta-galactosidase polypeptides
JP3495749B2 (ja) 可溶性のイネ澱粉合成酵素遺伝子及びその使用法
WO1996007743A1 (en) Xyloglucan-specific beta-galactosidase
JP3349440B2 (ja) 植物の制御方法
RO118451B1 (ro) Polipeptidă cu activitate piruvat ortofosfat dikinazică, adn care o codifică, vector recombinant cu acest adn şi procedeu de transformare a unei plante prin intermediul acestui vector
AU3225099A (en) Novel exo-(1-ge4)-beta-D galactanase