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Technisches
Gebiet
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Diese
Erfindung betrifft eine DNA, die für ein Enzym, beteiligt an der
Biosynthese von Ectoin, codiert, ein Verfahren zum Verleihen von
Ectoin-Synthesevermögen
an eine Wirtszelle, indem die DNA darin eingebracht wird, und eine
transformierte Wirtszelle.
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Stand der
Technik
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Unter
einer Umgebung eines hohen osmotischen Drucks können bestimmte Mikroorganismen
durch Akkumulieren eines sogenannten "kompatiblen gelösten Stoffs" (= osmotische Belastung verträglich machende
Verbindung; "compatible
solute") innerhalb
ihrer Zellen eine Toleranz auf den Umgebungsstress erhalten. Es
ist bekannt, dass der kompatible gelöste Stoff Saccharide, Polyole,
Betaine oder bestimmte Aminosäuren einschließt (vgl.
Truper, H. G. et al., Experientia, Bd. 42, S. 1182–1187, 1986).
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Ectoin
ist eine cyclische Aminosäure,
die 1,4,5,6-Tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidincarbonsäure oder 3,4,5,6-Tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidincarbonsäure ist.
Ectoin ist als ein kompatibler gelöster Stoff gefunden worden,
der von einem halophilen Mikroorganismus, Ectothiorhodospira halochloris,
hergestellt wird, und es ist ferner bekannt, dass es eine Toleranz
gegenüber
einem hohen osmotischen Druck aufweist ("hohe osmotische Toleranz" = "high osmotic tolerance") [vgl. Galinski,
E. A. et al., Eur. J. Biochem., Bd. 149, S. 135–139, 1985; Mitsuo Takano et
al., ein Programm zum Symposium von The Japan Fermentation Engineering
Association, S. 193, 1988]. Es gibt außerdem einige Berichte, was
den Biosynthese-Stoffwechselweg von Ectoin be trifft (vgl. Peters,
P. et al., FEMS Microbiol. Lett., Bd. 71, S. 157–162, 1990) und was die physischen
Eigenschaften davon betrifft (vgl. Khunajakr, N., et al., Annual
Reports of International Center of Cooperative Research in Biotechnology,
Japan, Bd. 12, S. 157–167,
1989).
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Ectoin
wird aus L-Aspartat-β-semialdehyd
biosynthetisiert, bei welchen Schritten L-Diaminobuttersäuretransaminase,
L-Diaminobuttersäureacetyltransferase
und Ectoin-Synthase beteiligt sind. Im Folgenden werden diese Enzyme
im Allgemeinen als "Ectoin-Synthetasen" bezeichnet. Als
ein System, das dazu fähig ist,
die Biosynthese eines Enzyms durch Bakterien zu induzieren, ist
das sogenannte "Operon" bekannt, das ein
regulatorisches System zur Expression eines Gens ist, wobei eine
Reihe von Enzymen synchron von einem einzelnen regulatorischen Gen
induziert werden. Die Ectoin-Synthase ist ein Enzym, das Ectoin
aus α-N-Acetyl-diaminobuttersäure synthetisieren
kann, und es gibt Berichte, die ein Verfahren zum Isolieren und Reinigen
des Enzyms aus einem halophilen Mikroorganismus und die Eigenschaften
davon betreffen (vgl. Mihoko Yamamoto et al., Summary of Symposium
of Japan Biotechnology Society, S. 203, 1992). Die Genstruktur und
Nukleotidsequenz der Ectoin-Synthase und der Ectoin-Synthetasen
sind jedoch nie bekannt gewesen.
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Basierend
auf dem Wissen, dass ein bestimmter Mikroorganismus Ectoin innerhalb
seiner Zellen akkumulieren kann und dadurch sogar unter einer Umgebungsbedingung
von starkem Stress auf lebende Körper (z.
B. hoher osmotischer Druck) wachsen kann, ist ein Verfahren zum
Extrahieren und Isolieren von Ectoin durch das Abzielen auf die
Funktion von Ectoin (vgl. Khunajakr, N. et al., Annual Reports of
International Center of Cooperative Research in Biotechnology, Japan,
Bd. 12, S. 157–167,
1989) und ein Verfahren zur chemischen Synthese von Ectoin (vgl.
JP-A-3-31265) vorgeschlagen worden.
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Offenbarung
der Erfindung
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Abzielend
auf die spezifische Funktion von Ectoin, haben die vorliegenden
Erfinder das Ectoin unter den folgenden Gesichtspunkten intensiv
untersucht. Wo beispielsweise ein Mikroorganismus oder einer Pflanze
eine hohe osmotische Toleranz durch Verleihen einer Befähigung zur
Biosynthese von Ectoin, nicht Ectoin per se, gegeben wird, wird
man ein Verfahren zur effizienten Herstellung eines nützlichen
Produktes durch eine Fermentation bei hoher Konzentration entwickeln
können,
und man wird ferner eine Pflanze mit einer Resistenz gegen Dürre und
mit Toleranz gegen einen durch die Dürreumstände bedingten hohen osmotischen Druck
erzeugen können.
Außerdem
wird es, wo die Mikroorganismen in einem trockenen Boden, wie z.
B. in einer Wüste,
kultiviert werden, auch möglich
sein, auf einen gedüngten
Boden umzustellen und ferner eine Pflanze zu erzeugen, die zum Pflanzen
in einem trockenen Boden und bei hochsalziger Umgebung, wie z. B. an
einer Küste,
geeignet ist.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
eine Restriktionsendonukleasen-Karte einer DNA eines Mikroorganismus
der Gattung Halomonas, Stamm KS-3. Die Zeichen in der Figur bedeuten
die durch die entsprechende Restriktionsendonuklease zu spaltenden
Stellen. Außerdem
bezeichnet der Teil mit einem Kasten eine für Ectoin-Synthase codierende
Region. Ps, PstI; B, BamHI; Pv, PvuII, Sa, SalI; E, EcoRI; Sc, ScaI;
k, KpnI; n, NruI.
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2 zeigt
den Wachstumszustand von E. coli-Transformanten
DH5/pECT101 und DH5/pBR322 in einem Medium, das eine hohe Salzkonzentration
aufweist, wobei die Abszisse die Zeit für die Kultur (h) bedeutet,
die Ordinate die Trübung
des Mediums (Extinktion bei einer Wellenlänge von 610 nm) bedeutet, der
Pfeil den Zeitpunkt, an dem Natriumchlorid in einer Endkonzentration
von 5% zuge geben wurde, bedeutet, und -
-: E.
coli DH5/pECT101 bedeutet und -O- E. coli DH5/pBR322 bedeutet.
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Beste Ausführungsform
der Erfindung
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Abzielend
auf die Existenz von Bakterien, die unter einer hochsalzigen Umgebung
wachsen können und
Ectoin innerhalb ihrer Zellen akkumulieren können und dadurch hohe Toleranz
gegen einen hohen osmotischen Druck aufweisen können, haben die genannten Erfinder
nach einem Bakterium, das derartige Charakteristika aufweist, gesucht,
und haben es aus einem Boden in einer nordöstlichen Gegend in Thailand
eingesammelt und es identifiziert. Das Bakterium mit einer hohen
osmotischen Toleranz wird als ein Gram-negativer, aerober Bacillus
der Gattung Halomonas, klassifiziert, der Katalase-positiv ist,
einen GC-Gehalt in DNA von 65,4 bis 65,7 Mol-% aufweist und in einer
Natriumchloridkonzentration von 0,3% bis 24% wächst (vgl. Mitsuyoshi Okuda
et al., Zusammenfassung beim Symposium of Halophilic Microorganisms
Research Association, Bd. 25, S. 14–17, 1988). Dieses Bakterium
wurde als "Halomonas
sp. KS-3" bezeichnet
und gemäß dem Budapester
Vertrag beim National Institut of Bioscience and Human-Technology,
Agency of Industrial Science and Technology, mit der Eingangsnummer
FERM BP 4841 (angenommen am 20.10.1994), das ursprünglich mit der
Eingangsnummer FERP P-13952 (angenommen am 05.11.1993) hinterlegt
worden war, hinterlegt.
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Von
den Erfindern ist bestätigt
worden, dass der Halomonas sp. KS-3-Stamm Ectoin produzieren kann (gemäß dem Verfahren,
wie in Khunajakr, N. et al., Annual Reports of International Center
of Cooperative Research in Biotechnology, Japan, Bd. 12, S. 157–167, 1989,
beschrieben), und danach ist Ectoin-Synthase aus den Zellen dieser
Kultur isoliert worden. D. h., die Zellen der Kultur werden mit
Lysozym lysiert, und nach Entfernen der Nukleinsäure mit Protaminsulfat wird
die Naturtyp-Ectoin-Synthase isoliert und ge reinigt, indem sie Aussalzen
mit Ammoniumsulfat, einer hydrophoben Säulenchromatographie und einer
Hydroxyapatit-Säulenchromatographie
unterzogen wird. Sie hat ein Molekulargewicht von ungefähr 19 Kilodalton
(kDa), gemessen durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, und ferner
hat sie einen isoelektrischen Punkt von 4,2 bis 4,4. Auch ist bestimmt
worden, dass sie eine Aminosäuresequenz,
mit gemäß einem
Aminosäure-Sequenziergerät (Applied
Biosystems) den 30 N-terminalen Aminosäureresten, wie in SEQ ID NO:
3 gezeigt, aufweist.
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Außerdem ist
es den genannten Erfindern gelungen, Gen-DNA, die für Ectoin-Synthase
codiert, aus der Gen-DNA von Halomonas sp. KS-3, basierend auf der
oben genannten N-terminalen
Aminosäuresequenz, zu
isolieren, und anschließend
haben sie die Nukleotidsequenz bestimmt. Die Nukleotidsequenz der
DNA, die für
die Ectoin-Synthase codiert, ist in SEQ ID NO: 2 gezeigt.
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Die
DNA, die für
die Ectoin-Synthase codiert, kann mit dem folgenden Verfahren isoliert
werden. Und zwar wird das 4,3 kbp-DNA-EcoRI-SalI-Fragment mit den
Restriktionsendonukleasen MboI und NspBII gespalten um ein Fragment,
das 228 Basenpaare mit den Nukleotid-Nrn. von 2 bis 230, und ein
Fragment, das 178 Basenpaare mit den Nukleotid-Nrn. von 231 bis
408 der Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt, aufweist,
zu isolieren, und beide Fragmente werden durch T4-DNA-Ligase ligiert
um ein DNA-Fragment zu ergeben, das 406 Basenpaare mit den Nukleotid-Nrn.
von 3 bis 408 aufweist. Danach werden beide trunkierten Termini
davon durch eine chemisch synthetisierte DNA repariert um die gewünschte DNA,
die für
Ectoin-Synthase codiert, zu ergeben. Alternativ wird das 4,2 kbp-DNA-EcoRI-SalI-Fragment mit den
Restriktionsendonukleasen AspAII (anderer Name: BstEII) und NspBII
gespalten um ein Fragment mit den Nukleotid-Nrn. von 46 bis 408 zu
isolieren, und dann werden beide trunkierten Termini davon durch
eine chemisch synthetisierte DNA repariert um die gewünschte DNA,
die für
Ectoin-Synthase codiert, zu ergeben.
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Die
gesamte Aminosäuresequenz
der Ectoin-Synthase, die wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, ist auf Basis
der Nukleotidsequenz bestimmt. Es wurde bestätigt, dass die Sequenz der
N-terminalen Aminosäuren vollständig mit
der der 30 N-terminalen
Aminosäuren
der Naturtyp-Ectoin-Synthase identisch ist. Die Ectoin-Synthase
ist ein Protein, das aus 137 Aminosäuren zusammengesetzt ist und
ein Molekulargewicht von 15,5 kDa hat. Die Aminosäure-Komponenten
sind außerdem
gut mit den für
die Naturtyp-Ectoin-Synthase bestimmten Daten (vgl. Tabelle 1) identisch.
Die Nukleotidsequenz, die die Ectoin-Synthase codiert, sowie die
korrespondierende Aminosäuresequenz,
sind in SEQ ID NO: 4 gezeigt.
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Tabelle
1 Aminosäure-Komponenten
von Ectoin-Synthase
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Die
Spalten des Naturtyp-Enzyms und der Nukleotidsequenz in der obenstehenden
Tabelle 1 bedeuten die Aminosäure-Komponenten der Naturtyp-Ectoin-Synthase
bzw. die Aminosäure-Komponenten
der Ectoin-Synthase, die basierend auf der Nukleotidsequenz bestimmt
wurden.
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Die
genannten Erfinder haben das ungefähr 4,2 kbp große DNA-Fragment,
erhalten von Halomonas sp. KS-3, durch Spalten mit den Restriktionsendonukleasen
EcoRI und SalI isoliert. Nach Bestätigen, dass die Nukleotidsequenz,
codierend für
die Ectoin-Synthase, wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt, in diesem DNA-Fragment enthalten
ist, wird es in das Plasmid pBR322 eingesetzt und in E. coli eingeführt, und
dann ist gefunden worden, dass das transformierte E. coli die gewünschte hohe
osmotische Toleranz aufweist, so dass es sogar in einem Medium mit
einer hohen Salzkonzentration wachsen kann. Wegen der Transformation
zeigt das Gen des Enzyms, wirksam zur Synthese von Ectoin, seine
Funktion und dadurch wird Ectoin synthetisiert und innerhalb der
Zellen akkumuliert. Als Folge weist E. coli Charakteristika von
hoher osmotischer Toleranz auf.
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Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung, wird in SEQ ID NO: 1 gezeigte
DNA, die für
ein Enzym wirksam zur Synthese von Ectoin codiert, in einen innerhalb
von Wirtszellen replizierbaren Vektor rekombiniert, gefolgt von
Einführen
derselben in einen Wirt. Dadurch wird dem Wirt die Fähigkeit
zum effizienten Synthetisieren von Ectoin verliehen, und dadurch
erwirbt er Charakteristika hoher osmotischer Toleranz. Durch Verwenden
dieses Verfahrens können
Mikroorganismen und Pflanzen hergestellt werden, die hohe osmotische
Toleranz aufweisen, und daher wird das Entwickeln eines effizienten
Fermentationsverfahrens unter Verwendung der Transformanten, das
Erzeugen von Pflanzen, die hohe Resistenz gegen Dürre aufweisen,
und eine Verbesserung von Boden in der wüste möglich sein.
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Die
erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, DNA, die für Ectoin-Synthase
codiert, bereitzustellen. Die Nukleotidsequenz von DNA, die für Ectoin-Synthase
codiert, ist in SEQ ID NO: 2 gezeigt.
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Die
Aminosäuresequenz
der Ectoin-Synthase ist in SEQ ID NO: 1 gezeigt. Die Aminosäuresequenz kann
teilweise durch Modifikationen, Deletionen, Additionen und dergleichen,
gemäß einem
gentechnischen Verfahren, geändert
werden. Ein solches modifiziertes Enzym ist auch in der vorliegenden
Erfindung eingeschlossen, sofern es die essentiellen enzymatischen
Eigenschaften von Ectoin-Synthase aufweist, und daher ist auch die
Nukleotidsequenz, die für
das Enzym co diert, in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Basierend auf der Information der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz,
kann DNA, die für
Ectoin-Synthase codiert, auch durch Auswählen der für eine Wirtszelle geeigneten
Kodons chemisch synthetisiert werden.
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Die
zweite Aufgabe der Erfindung ist ein DNA-Fragment, das ein für Ectoin-Synthase
codierendes Gen enthält,
bereitzustellen. DNA, die ungefähr
4,2 Kilobasenpaare umfasst, und die von Halomonas sp. KS-3 durch
Spalten mit den Resriktionsendonukleasen EcoRI und SalI erhalten
wird, und die die Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt,
aufweist, wird bereitgestellt.
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Die
dritte Aufgabe der Erfindung ist eine rekombinante DNA, die innerhalb
der Wirtszellen selbst replizierbar ist, und die durch Rekombinieren
für Ectoin-Synthase
codierender DNA in eine Vektor-DNA, die innerhalb der Wirtszellen
selbst replizierbar ist, hergestellt wird.
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Die
vierte Aufgabe der Erfindung ist, ein Verfahren zum Bereitstellen
einer Fähigkeit
zur Biosynthese von Ectoin an eine Wirtszelle bereitzustellen, das
Einführen
einer rekombinanten DNA, die für
Ectoin-Synthase codierende DNA enthält, in eine Wirtszelle umfasst.
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Die
fünfte
Aufgabe der Erfindung ist, Mikroorganismen oder Pflanzen, die durch
Einführen
einer rekombinanten DNA, die für
Ectoin-Synthase codierende DNA enthält, transformiert wurden, bereitzustellen.
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Die
erfindungsgemäße, für Ectoin-Synthase
codierende DNA kann durch Feststellen der Nukleotidsequenz des Produkts
und anschließendes
Vergleichen desselben mit der Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 2
gezeigt, oder durch Southern-Blotting-Hybridisierung unter Verwendung
eines Fragments der DNA, die eine wie in SEQ ID NO: 2 gezeigte Nukleotidsequenz
aufweist, als eine Sonde, oder durch Transformieren von E. coli
durch Einführen
des Gens und Bestätigen
des Wachstums davon in einem Medium mit einer hohen Salzkonzentration,
nachgewiesen werden.
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Ectoin-Bestimmung
in Zellen: Sie wird durch die Schritte des Extrahierens der Zellen
mit einem 10fach größeren Volumen
eines 70%igen Ethanols, 10 Minuten lang bei 80°C, des Filtrierens mit einem
Glasfilter um einen Rohextrakt zu ergeben, des Entfernens des Ethanols
aus dem Rohextrakt durch Konzentration unter reduziertem Druck (bei
35°C), des
Zugebens eines äquivalenten
Volumens Chloroform zu der konzentrierten Lösung, des Zentrifugierens (1.500
UpM, 10 Minuten) und des erneuten Konzentrierens des Überstands
unter reduziertem Druck, des Verdünnens der konzentrierten Lösung mit
destilliertem Wasser, des Ladens derselben auf eine Kationenaustauschsäule (DIAION
SK1B, hergestellt von Mitsubishi Chemical), des Waschens derselben
mit Wasser, des Eluierens des Ectoins davon mit 3 N Ammoniumhydroxid,
des Entfernens von Ammoniumhydroxid aus dem Eluat durch Konzentrieren
bei reduziertem Druck, und des Ladens des Resultierenden auf eine
Anionenaustauschersäule
(DIAION SA10A, hergestellt von Mitsubishi Chemical) um das Ectoin
zu isolieren, durchgeführt.
Die Untersuchung von Ectoin kann durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder
eine Dünnschichtchromatographie
gemäß einem
Verfahren von Peters, P. et al. (vgl. FEMS Microbiol. Let., Bd.
71, S. 157–162,
1990) durchgeführt
werden.
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Bestimmung
der Enzymaktivität
von Ectoin-Synthase: Sie wird durchgeführt durch Zugeben eines zu prüfenden Enzyms
zu einem Reaktionsgemisch, bestehend aus 80 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,5),
4,4 mM α-N-Acetyl-diaminobuttersäure, 0,77
M Natriumchlorid (Gesamtvolumen des Reaktionsgemisches: 45 μl), 10-minütiges Reagieren
bei 15°C,
Quenchen der Reaktion durch Zugeben einer äquivalenten Menge 0,6% Trifluoressigsäure, und
Analysieren der Menge des produ zierten Ectoins im Reaktionsgemisch
durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie.
Eine Einheit der Enzymaktivität
von Ectoin-Synthase wird als eine Menge des Enzyms, die 1 μmol Ectoin
pro Minute produzieren kann, definiert.
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In
der vorliegenden Erfindung sind die zur Isolierung der für Ectoin-Synthase
codierenden DNA verwendeten Bakterien Halomonas sp. KS-3. Bekannte
Mikroorganismen, die zum Produzieren von Ectoin fähig sind,
sind beispielsweise Ectothiorhodospira halochloris (American Type
Culture Collection, Eingangsnummer ATCC 35916) (vgl. Galinski, E.
A. et al., Eur. J. Biochem., Bd. 149, S. 135–139, 1985), Halomonas elongata (vgl.
Wohlfarth, A. et al., J. Gen. Microbiol., Bd. 136, S. 705–712, 1990),
Vibrio costicola (vgl. Regev. R. et al., Arch. Biochem. Biophys.,
Bd. 278, S. 106–112,
1990). Die DNA, die für
ein an der Biosynthese von Ectoin beteiligtes Enzym codiert, kann
durch ein Hybridisierungsverfahren unter Verwendung einer DNA, die
die Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt, aufweist, als
eine Sonde, aus einem Bakterium der Gattung Halomonas oder beliebigen
anderen Zellen, die die gleiche oder eine hochhomologe Nukleotidsequenz
haben können,
isoliert werden. Außerdem
kann eine für
Ectoin-Synthase codierende DNA, basierend auf der Information der
Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt, oder der Aminosäuresequenz,
wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt, bei Auswählen der für eine Wirtszelle geeigneten
Kodons auch chemisch synthetisiert werden. Außerdem kann durch partielles
Modifizieren der für
Ectoin-Synthase codierenden DNA gemäß einem ortsgerichteten Mutationsverfahren
(vgl. Kunkel, T. A. et al., Methods in Enzymol., Bd. 154, S. 367–392, 1987),
auch eine für
Ectoin-Synthase codierende DNA, die eine modifizierte Struktur aufweist,
hergestellt werden.
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Die
Expression eines Fremdgens in Wirtszellen kann durch die Verfahren,
wie sie in vielen Lehrbüchern
und Litera turstellen (beispielsweise Molecular Cloning; A Laboratory
Manual, 2. Aufl., Bd. 1–3,
Hrsg. Sambrook, J et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New
York, 1989) beschrieben, durchgeführt werden, und die grundlegende
Theorie davon ist bereits etabliert worden. Eine rekombinante DNA,
die in den Wirtszellen replizierbar ist und funktioniert, kann durch
Anfügen
eines Translations-Startkodons stromaufwärts einer DNA, die für das gewünschte zu
exprimierende Protein codiert, und eines Translations-Stopkodons
stromabwärts
davon, Anfügen
regulatorischer Gene, wie z. B. einer Promotorsequenz, die die Transkription
regulieren kann, z. B. trp, lac, phoS, PL, früher SV40-Promotor), und Einfügen derselben
in einen geeigneten Vektor (z. B. pHY300PLK, pBR322, pUC19, PYAC-neo),
hergestellt werden. Der Expressionsvektor weist vorzugsweise genetische
Information zum Replizieren in Wirtszellen auf und kann darin replizieren
und weist vorzugsweise ein Gen, das als ein nachweisbarer Marker
eingesetzt wird, auf. Der geeignetste Vektor wird, abhängig von den
Arten der Wirte, ausgewählt.
Außerdem
wird auch ein geeigneter Promotor, der in den Wirtszellen funktionsfähig ist,
ausgewählt.
Vom Gesichtspunkt des Zeigens der gewünschten Funktionen, ist ein
aus den Wirtszellen stammendes regulatorisches Gen bevorzugt.
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Das
Einführen
des Gens in Mikroorganismen (z. B. Bakterien, Hefe) und Pflanzen
kann durch ein Calciumchlorid-Verfahren (z. B. Cohen, S. N. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 69, Seiten 2110 bis 2114, 1972),
ein DEAE-Dextran-Verfahren
(z. B. Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1, Kapitel 9.2,
Hrsg. Ausubel, F. M. et al., John Wiley & Sons, 1987), ein Elektroporations-Verfahren,
ein Verfahren unter Verwendung von Protoplasten, ein Verfahren unter
Verwendung des Ti-Plasmids, ein Verfahren unter Verwendung eines
Virusvektors (z. B. Watson J. D. et al., Molecular Biology of Recombinant
DNA, übersetzt
von Michio Matsuhashi et al., herausgegeben von Maruzen, 1993),
erfolgen.
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Die
grundlegenden Verfahren der Gentechnik sollen auf viele Literaturstellen
und technische Texte, z. B. Molecular Cloning; A Laboratory Manual,
2. Aufl., Bd. 1–3,
von Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New
York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1–2, von
Ausubel, F. M. et al., Current Protocols, 1993; und Watson J. D.
et al., Molecular Biology of Recombinant DNA, übersetzt von Michio Matsuhashi
et al., herausgegeben von Maruzen, 1993, bezogen sein. Die verschiedenen,
im technischen Gebiet dieser Erfindung verwendeten Instrumente,
Enzyme und Mittel, werden in Übereinstimmung
mit jeder Anleitung, Verweisanmerkung und jedem Handbuch verwendet.
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Die
folgenden Abkürzungen
werden verwendet um die Beschreibung zu vereinfachen.
| A: | Adenin |
| C: | Cytosin |
| G: | Guanin |
| T: | Thymin |
| Ala: | Alanin |
| Arg: | Arginin |
| Asn: | Asparagin |
| Asp: | Asparaginsäure |
| Cys: | Cystein |
| Gln: | Glutamin |
| Glu: | Glutaminsäure |
| Gly: | Glycin |
| His: | Histidin |
| Ile: | Isoleucin |
| Leu: | Leucin |
| Lys: | Lysin |
| Met: | Methionin |
| Phe: | Phenylalanin |
| Pro: | Prolin |
| Ser: | Serin |
| Thr: | Threonin |
| Trp: | Tryptophan |
| Tyr: | Tyrosin |
| Val: | Valin |
| DNA: | Desoxyribonukleinsäure |
| kDa: | Kilodalton |
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Beispiele
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Die
vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele
detaillierter veranschaulicht, aber sie soll nicht ausgelegt werden,
darauf beschränkt
zu sein, und die vorliegende Erfindung schließt beliebige Modifikation durch
ein konventionelles Verfahren im technischen Gebiet dieser Erfindung ein.
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Beispiel 1
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Isolierung einer Gen-DNA
eines Bakteriums der Gattung Halomonas
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Halomonas
sp. KS-3 wurde in M63-Medium (Bestandteile: 1,4% KH2PO4, 0,4% KOH, 0,2% (NH4)2SO4, 1 mM MgSO4, 3,9 μM
FeSO4, 0,4% Glucose) inokuliert, und dazu
wurden 3% Natriumchlorid und 0,25% Hefeextrakt gegeben, und die
Mischung wurde über
Nacht bei 37°C
aerob vorkultiviert. Diese Vorkulturbrühe wurde in ein frisches M63-Medium
(100 ml), enthaltend 3% Natriumchlorid, in einer Konzentration von
2% inokuliert, und sie wurde aerob bei 37°C unter Schütteln (140 UpMm) kultiviert.
Nach etwa 5-stündigem
Kultivieren wurde, wenn die Kulturbrühe eine Trübheit von ungefähr 2 (Extinktion
bei einer Wellenlänge
von 660 nm) aufwies, Natriumchlorid zugegeben um eine Endkonzentration
von ungefähr
15% zu haben, und die Mischung wurde 5 Stunden lang weiter kultiviert.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation abgetrennt und gewaschen
um Zellen (etwa 0,25 g) zu ergeben.
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Eine
DNA wurde durch ein konventionelles Verfahren (vgl. Current Protocols
in Molecular Genetics, Hrsg. Ausubel F. M. et al., S. 431, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1972) aus den Zellen isoliert.
D. h., die Zellen wurden mit Protease K lysiert, zentrifugiert (8.000
UpM, 10 Minuten lang) um die Rückstände zu entfernen,
und dann mit Ribonuklease behandelt. Danach wurde Protein durch
Extrahieren mit einer Mischung einer äquivalenten Menge an Phenol/Chloroform
entfernt und dann einer Ethanolpräzipitation unterworfen um die
gewünschte
Gen-DNA von Halomonas-Bakterien (etwa 0,8 mg) zu erhalten.
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Beispiel 2
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Isolieren einer für Ectoin-Synthase
codierenden DNA
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Zwei
Arten von DNAs mit 25 Nukleotiden, die für beide Termini der N-terminalen
Aminosäuresequenzen
der Ectoin-Synthase,
wie in SEQ ID NO: 3 gezeigt, entsprechenden Aminosäuresequenzen
codierten, wurden chemisch synthetisiert. Die Nukleotidsequenzen
hatten die folgenden Formeln [I] bzw. [II].
5'-TGATHGTNMGNAAYYTNGARGARGC-3' [I]
5'-GNTYNSWNTYNGMNCANSWYAGGGT-3' [II]
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In
den obigen Formeln [I] und [II] ist M entweder A oder C, ist R entweder
A oder G, ist W entweder A oder T, ist S entweder G oder C, ist
Y entweder C oder T, ist H entweder A oder C oder T, ist N entweder
A oder G oder C oder T.
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Durch
Verwenden der chemisch synthetisierten DNAs mit den obigen Formeln
[I] und [II] als Primer, und außerdem
durch Verwenden der Gen-DNA von Halomonas-Bakterien, die in Beispiel
1 erhalten wurde, als eine Matrize, wurde die gewünschte Gen-DNA
durch Polymerasekettenreaktion mit Ampli Taq Polymerase (hergestellt
von der Firma Perkin-Elmer) in Übereinstimmung
mit der daran angefügten
Beschreibung spezifisch amplifiziert. Die Temperatur für Modifikation,
Anlagern und Polymerasereaktion waren 95°C, 45°C bzw. 72°C.
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Das
Reaktionsprodukt wurde einer Elektrophorese mit einem niedrigschmelzendem
Agarosegel und dann einer Extraktion unterzogen um das gewünschte DNA-Fragment,
das 90 Basenpaare aufweist, zu isolieren. Dieses DNA-Fragment wurde
mit einem Restriktionsenzym SmaI in Plasmid pUC19 bei der Spaltstelle
eingefügt.
Das rekombinante Plasmid wurde in E. coli DH5αF' (hergestellt von Life Technologies,
Inc.) eingebracht um eine Transformante zu erstellen. Ein rekombinantes
Plasmid wurde aus der so erhaltenen Transformante wiedererlangt,
und die Nukleotidsequenz des rekombinierten DNA-Fragments, das 90
Basenpaare aufwies, wurde durch die Didesoxy-DNA-Sequenzierungsmethode
bestimmt. Die durch die Nukleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz
war vollständig
mit der in SEQ ID NO: 3 gezeigten Sequenz identisch, wodurch bestätigt war,
dass es das gewünschte
DNA-Fragment ist.
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Beispiel 3
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Isolierung der Gen-DNA,
die eine für
Ectoin-Synthase codierende DNA enthält
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Die
in Beispiel 1 erhaltene Gen-DNA von Halomonas-Bakterien wurde durch 8 Arten von Restriktionsendonukleasen,
wie unten erwähnt,
gespalten, und die Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese isoliert.
Die verwendeten Restriktionsendonukleasen waren EcoRI, SalI, ScaI,
KpnI, BamHI, PvuII, NruI und PstI. Nach Isolierung durch Agarosegelelektrophorese
wurde jedes DNA-Fragment einem Nachweis durch Southern-Blotting-Hybridisierung
unter Verwendung eines für
Ectoin-Synthase codierenden DNA-Fragments als
eine Sonde unterzogen. Als Ergebnis wurde eine DNA, die vollständig die
für Ectoin-Synthase
codie rende DNA enthält,
d. h. eine DNA von ungefähr
4,2 kbp Größe, die
mit EcoRI und SalI gespalten ist (dieses Fragment wird als "4,2 kbp-DNA-EcoRI-SalI-Fragment" bezeichnet), isoliert.
Das Ergebnis der Analyse der Gen-DNA von Halomonas-Bakterien durch
Restriktionsendonukleasen ist in der begleitenden 1 gezeigt.
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Getrennt
davon wurde ein großes
DNA-Fragment, enthaltend Replikations-Startpunkt, Ampicillin-Resistenzgen,
etc., das durch Spalten des Plasmids pBR322 mit EcoRI und SalI erhalten
wurde (dieses Fragment wurde als "pBR322-EcoRI-SalI-Fragment" bezeichnet), isoliert. Das 4,2 kbp-DNA-EcoRI-SalI-Fragment
und das pBR322-EcoRI-SalI-Fragment wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert
um eine cyclische rekombinante Plasmid-DNA zu erstellen. Diese rekombinante
DNA wurde als "pECT101" bezeichnet.
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Beispiel 4
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Nukleotidsequenz einer
für Ectoin-Synthase
codierenden DNA
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Zum
Zwecke des Bestimmens der Nukleotidsequenz des in Beispiel 3 erstellten
4,2 kbp-DNA-EcoRI-SalI-Fragments wurde sie in die Klonierungsregion
eines pBluescript II SK+-Vektors (hergestellt von Toyobo Co., Ltd.)
eingefügt
(dieser wurde als "pECT201" bezeichnet), und
die Nukleotidsequenz wurde unter Verwendung des pBluescript II Exo/Mung
DNA Sequencing System (hergestellt durch Stratagene Inc.) bestimmt.
Die für
Ectoin-Synthase codierende Nukleotidsequenz und gesamte Aminosäuresequenz
sind in SEQ ID NO: 4 gezeigt.
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Beispiel 5
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Transformation mit der
für Ectoin-Synthase
codierenden DNA
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Die
in Beispiel 3 erhaltene rekombinante DNA (pECT101), die mit dem
4,2 kbp-DNA-EcoRI-SalI-Fragment, das die für Ectoin-Synthase codierende
DNA vollständig
enthält,
rekombiniert worden ist, wurde in E. coli DH5αF' gemäß dem in
Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. Aufl., Bd. 1, 1.77–1,81 (Hrsg.
Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York,
1989), beschriebenen Verfahren eingeführt um eine Transformante mit
Ampicillin-Resistenz (sie wurde als "E. coli DH5/pECT101" bezeichnet) zu ergeben. Außerdem wurde
die Transformante einer Hybridisierung unterzogen, wodurch bestätigt wurde,
dass die Transformante eine für
Ectoin-Synthase codierende DNA enthielt.
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Die
Transformante E. coli DH5/pECT101 wurde in ein M63-Medium, dem 0,02%
Casaminsäure
und 2 μg/ml
Thyamin zugefügt
waren, inokuliert und bei 37°C
kultiviert. Wenn die Trübheit
der Kulturbrühe
(die Extinktion bei einer Wellenlänge von 610 nm) etwa 0,2 wurde,
wurde Natriumchlorid zugegeben um eine Endkonzentration von 5% zu
erreichen, und die Kultur wurde fortgeführt, wobei der Wachstumszustand
der Bakterien mit Bioscanner OT-BS-48 (hergestellt von Ohtake Seisakusho)
beobachtet wurde. Plasmid pBR322 wurde ebenso in E. coli DH5αF' eingeführt um eine
Transformante mit Ampicillin-Resistenz (sie wurde als "E. coli DH5/pBR322" bezeichnet) zu ergeben,
die als eine Referenztransformante verwendet wurde. Als Ergebnis stellte
die Referenztransformante (E. coli DH5/pBR322), wie es in der begleitenden 2 gezeigt
ist, das Wachstum in einem Medium mit einer hohen Salzkonzentration
ein. Im Gegensatz dazu wuchs die Transformante E. coli DH5/pECT101
selbst in einem Medium mit einer hohen Salzkonzentration gut. Das
bedeutet, dass das erfindungsgemäße Produkt
der artige Charakteristika, wie fähig
zu sein, selbst unter der Umgebungsbedingung einer hohen Salzkonzentration
sowie der Umgebung hohen osmotischen Drucks, induziert durch die
hohe Salzkonzentration, aufgrund des Verleihens einer Fähigkeit
zur Synthese von Ectoin durch das Einführen eines für Ectoin-Synthase
codierenden Gens, zu wachsen, erwarb und dadurch hohe Toleranz gegen derartige
Umgebungsbedingungen aufweist.
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Industrielle
Anwendung
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Durch
Gentechnologie kann unter Verwendung der erfindungsgemäßen Gen-DNA
von Ectoin-Synthase Ectoin, das als ein Wasser-zurückbehaltendes
Material verwendbar sein kann, hergestellt werden. Außerdem kann,
wenn die DNA der vorliegenden Erfindung in verschiedene Mikroorganismen
und Pflanzen unter Verwendung eines geeigneten Expressionsvektors
rekombiniert wird, ein Produkt, das Charakteristikum, von selbst
unter Umgebungsbedingungen von hohem osmotischen Druck tolerant
zu sein, aufweist, exprimiert werden, und dadurch kann das Verfahren
zum Kultivieren von Mikroorganismen verbessert werden um fähig zu sein,
selbst in einer hohen Konzentration fortzufahren, und ferner können Pflanzen,
die hohe Resistenz gegen Dürre
und außerdem
Toleranz gegen hohen osmotischen Druck aufweisen, erhalten werden.
Dies wird zum Wiederbeleben von Mikroorganismen in Wüstenboden,
und ferner zum Erzeugen von Pflanzen, die selbst in einem trockenen
Boden oder an einer Küste
wachsen können,
wirksam sein.
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