EP1309694A2 - Verfahren zur verbesserten herstellung von cyanophycin und dessen folgeprodukte - Google Patents
Verfahren zur verbesserten herstellung von cyanophycin und dessen folgeprodukteInfo
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- EP1309694A2 EP1309694A2 EP01955376A EP01955376A EP1309694A2 EP 1309694 A2 EP1309694 A2 EP 1309694A2 EP 01955376 A EP01955376 A EP 01955376A EP 01955376 A EP01955376 A EP 01955376A EP 1309694 A2 EP1309694 A2 EP 1309694A2
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Classifications
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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-
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-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Definitions
- the present invention relates to a thermostable cyanophycin synthase, transformed organisms containing such an enzyme, and a method for the improved production of cyanophycin and / or its secondary products, for example polyaspartic acid or arginine.
- Multi-L-Arginyl-Poly-L-aspartate is a branched polypeptide that contains aspartic acid and arginine in a ratio of 1: 1.
- Structure corresponds to a poly- ⁇ -aspartate backbone with arginine side residues, which are linked to almost all ⁇ -carboxyl groups of the backbone via peptide bonds.
- DE-A 197 09 024 discloses the extraction and purification of cyanophycin from Aphanocapsa PCC 6308, the synthesis being carried out at 20 ° C.
- FEMS Microbiology Letters 181 (1999) 229-236 describes the production of cyanophycin from Synechococcus sp. MA 19 known.
- a disadvantage of the large-scale production of cyanophycin according to the known processes is that a relatively narrow temperature range, generally below 35 ° C., must not be exceeded for optimum product yield.
- the present invention relates to a cyanophycin synthetase which is characterized in that it codes a temperature optimum in the range of> 35 ° C. and an amino acid sequence according to SEQUENCE PROTOCOL 1 by an isolated nucleotide sequence according to SEQUENCE PROTOCOL 2, an allele, homologue or derivative of this nucleotide sequence or with this has a hybridizing nucleotide sequence.
- the cyanophycin synthetase according to the invention has an optimum temperature in the range from 35 ° C. to 55 ° C., preferably in the range from 35 to 50 ° C.
- the cyanophycin synthetase according to the invention is distinguished by the fact that it originates from Synechococcus elongatus.
- the cyanophycin syn- thetase is a thermostable enzyme.
- the present invention also relates to isoenzymes of the cyanophycin synthetase according to the invention.
- This includes enzymes with the same or comparable substrate and activity specificity, but which have a different primary structure.
- the present invention also includes modified forms of cyanophycin synthetase. According to the invention, this includes enzymes in which there are changes in the sequence, for example at the N- and / or C-terminus of the polypeptide or in the region of conserved amino acids, but without impairing the function of the enzyme. These changes can be made by exchanging one or more amino acids according to known methods.
- a special embodiment variant of the present invention comprises variants of the cyanophycin synthetase according to the invention, the substrate specificity of which has been changed, for example, by amino acid exchange compared with the respective starting protein, for example with regard to the production of polyaspartic acid.
- the present invention furthermore relates to polypeptides with the function of a cyanophycin synthetase, the amino acid sequence of which is changed in such a way that they are desensitive to regulatory compounds, for example the end products of metabolism regulating their activity (feedback-desensitive).
- an isolated nucleotide sequence or an isolated nucleic acid fragment is to be understood as a polymer made from RNA or DNA, which can be single or double-stranded and optionally contain natural, chemically synthesized, modified or artificial nucleotides.
- DNA polymer also includes genomic DNA, cDNA or mixtures thereof.
- alleles are to be understood as functionally equivalent, ie essentially equivalent nucleotide sequences. Functionally equivalent sequences are those sequences which, despite a different nucleotide sequence, for example due to the degeneracy of the genetic code, still have the desired functions.
- Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described here as well as artificial nucleotide sequences, for example those obtained by chemical synthesis and possibly adapted to the codon use of the host organism.
- functionally equivalent sequences include those which have an altered nucleotide sequence which corresponds to the
- Enzyme for example, gives a desensitivity or resistance to inhibitors.
- a functional equivalent is also understood to mean, in particular, natural or artificial mutations in an originally isolated sequence which continues to show the desired function. Mutations include substitutions, additions,
- nucleotide residues Deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues. Also included here are so-called sense mutations, which can lead to the exchange of conserved amino acids at the protein level, but which do not lead to a fundamental change in the activity of the protein and are therefore function-neutral. This also includes changes in the nucleotide sequence that affect the N- or C-terminus of a protein at the protein level, but without significantly impairing the function of the protein. These changes can even have a stabilizing influence on the protein structure.
- the present invention also encompasses, for example, those nucleotide sequences which are obtained by modifying the nucleotide sequence, resulting in corresponding derivatives.
- the aim of such a modification can, for example, be to further narrow down the coding sequence contained therein or, for example, also to insert further recognition sites for restriction enzymes.
- Functional equivalents are also those variants whose function is weakened or enhanced compared to the original gene or gene fragment.
- artificial DNA sequences are the subject of the present invention as long as they impart the desired properties as described above and can be incorporated or appended into the gene of the cyanophycin synthetase according to the invention.
- Such artificial DNA sequences can be determined, for example, by back-translating proteins created using computer-aided programs (molecular modeling) or by in-vitro selection. Coding DNA sequences which are obtained by back-translating a polypeptide sequence according to the codon usage specific for the host organism are particularly suitable. The specific codon usage can easily be determined by a person familiar with molecular genetic methods by computer evaluations of other, already known genes of the organism to be transformed.
- homologous sequences are to be understood as those which are complementary to and / or hybridize with the nucleotide sequences according to the invention.
- hybridizing sequences includes substantially similar nucleotide sequences from the group of DNA or RNA which, under known stringent conditions, enter into a specific interaction (binding) with the aforementioned nucleotide sequences. This also includes short nucleotide sequences with a length of, for example, 10 to 30, preferably
- nucleotide primers or probes 12 to 15 nucleotides. According to the invention, this includes also so-called nucleotide primers or probes.
- the preceding (5'- or upstream) and / or subsequent (3'- or downstream) coding regions are also also present.
- regulatory sequences include promoters, enhancers, operators, terminators or translation enhancers.
- An operative link is understood to mean the sequential arrangement of, for example, the promoter, coding sequence, terminator and, if appropriate, further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function as intended when expressing the coding sequence.
- These regulatory nucleotide sequences can be of natural origin or can be obtained by chemical synthesis. In principle, any promoter which can control gene expression in the corresponding host organism is suitable as the promoter.
- this can also be a chemically inducible promoter by means of which the expression of the genes underlying it in the host cell can be controlled at a specific point in time.
- a promoter that can be induced by IPTG (isopropyl- ⁇ -thiogalactoside) is mentioned here as an example.
- a gene structure is produced by fusing a suitable promoter with the nucleotide sequence according to the invention using common recombination and cloning techniques as are known from the literature.
- DNA fragments with one another can be attached to the fragments adapters or linkers.
- the present invention relates to a vector comprising at least one nucleotide sequence of the type described above coding for a cyanophycin synthetase specific for the production of cyanophycin, to regulative nucleotide sequences operatively linked thereto and to additional nucleotide sequences for selecting transformed host cells, for replication within the host cell or for Integration into the corresponding host cell genome.
- the vector according to the invention can contain a gene structure of the aforementioned type.
- Suitable vectors are those which are replicated in microorganisms, such as bacteria, fungi and / or plants.
- Known vectors are, for example, pBluescript (Stratagene, 11099 North Torney Pines Rd., La Jolla, CA 92 037, USA) or pET (Novagen, 601 Science Drive, Madison, WJ 53 711, USA).
- pBluescript Stratagene, 11099 North Torney Pines Rd., La Jolla, CA 92 037, USA
- pET Novagen, 601 Science Drive, Madison, WJ 53 711, USA.
- this list is not limiting for the present invention.
- corresponding probes or nucleotide primers can be synthesized and used to amplify and isolate analog genes from other single or multicellular organisms, preferably bacteria, fungi, algae or plants, for example with the aid of PCR technology.
- the present invention thus also relates to a probe for identifying and / or isolating genes coding for proteins involved in the biosynthesis of cyanophycin, preferably further thermostable cyanophycin synthetases, this probe being produced on the basis of the nucleic acid sequences of the type described above and one for detection contains suitable marking.
- the probe can be a partial section of the sequence according to the invention, for example from a conserved area, which e.g. has a length of 10 to 30 or preferably 12 to 15 nucleotides and can hybridize specifically with homologous nucleotide sequences under stringent conditions. Suitable markings are well known from the literature.
- the present invention further relates to the transfer of the nucleic acid sequence according to the invention or a part thereof coding for a cyanophycin synthetase, an allele, homolog or derivative thereof or a nucleotide sequence hybridizing with these sequences into a heterologous host system.
- This also includes the transfer of a gene construct or vector according to the invention into a heterologous host system.
- a heterologous host system is understood to mean a single-cell or multi-cell organism. Examples of these are microorganisms, fungi, lower or higher plants, tissues or cells thereof. Bacteria are preferred according to the invention, particularly preferred the genus of enterobacteria and in particular the type Escherichia coli. Furthermore, useful plants, such as potatoes or
- the nucleotide sequence coding for a thermostable cyanophycin synthetase according to the invention is transferred into one of the host systems mentioned above by known methods. Examples of methods for DNA transfer into suitable host systems are transformation, electroporation, conjugation and agrobacterium-mediated DNA transfer or “particle bombardment”. These lists are only used to explain the present invention and are not limiting.
- a transformed single or multicellular organism resulting from a successfully carried out nuclear acid transfer thus differs from the correspondingly not transformed organism in that it contains additional nucleic acids of the type according to the invention and can accordingly express them.
- the present invention thus also relates to a transformed single or multicellular organism containing a cyanophycin synthetase according to the invention and / or a vector containing a cyanophycin synthetase of the type described above.
- the present invention relates to a method for providing a cyanophycin synthetase according to the invention of the type described above, wherein the nucleotide sequence coding for the enzyme is isolated from a thermophilic single or multicellular organism, if necessary operatively linked to regulatory structures and / or into one suitable for heterologous expression Vector is cloned, optionally transferred to a heterologous host system, expressed there and then isolated from this host system and optionally purified and / or enriched.
- cyanophycin synthetase it is also conceivable to directly isolate an amount of cyanophycin synthetase sufficient for the synthesis of cyanophycm from a thermophilic organism. mus, without the previous enrichment in a heterologous system. Furthermore, the enzyme cyanophycin synthetase according to the invention can then be used, for example, in an in vitro system for the synthesis of cyanophycin and / or its secondary products.
- the present invention also relates to a process for the preparation of cyanophycin and / or its secondary products, a cyanophycin synthetase and / or a vector and / or a transformed single or multicellular organism of the type described above being used.
- the present invention comprises not only the production of cyanophycin and / or its secondary products in a living host system, but also the in vitro synthesis of cyanophycin with the aid of an isolated cyanophycin synthetase of the type described above.
- the process according to the invention for the production of cyanophycin is characterized in that the enzyme-catalyzed synthesis takes place in a temperature range from 35 ° C. to 55 ° C., preferably in a range from 35 ° C. to 50 ° C.
- the process according to the invention is advantageously characterized in that the process is less susceptible to faults due to the wide temperature range, in particular above 28 ° C., allows greater variability in the process control and thus delivers an improved product yield.
- the production of cyanophycin and / or its secondary products according to the invention is thus substantially more reproducible and more economical than the previously known processes.
- the cyanophycin synthetase according to the invention catalyzes an ATP-dependent chain extension reaction (elongation). Surprisingly, the enzyme has two active (catalytic) centers.
- the cyanophycin synthetase according to the invention gradually and alternately (sequentially) incorporates a molecule of aspartic acid and then a molecule of arginine into a cyanophyne precursor (peptide primer). Without a primer, the enzyme-catalyzed
- the present invention further relates to the use of a vector containing a cyanophycin synthetase according to the invention of the aforementioned type for position of a transformed single or multicellular organism as described above.
- a transformed single or multi-cell organism for the production of a cyanophycin synthetase according to the invention and / or for the production of cyanophycin and / or its secondary products is also included in the present invention.
- a cyanophycin synthetase isolated according to the invention can also be used for the in vitro production of cyanophycin and / or its secondary products.
- the use of cyanophycin and / or its derivatives for the production of food supplements and / or agents in the field of agriculture and / or crop protection is covered in the present invention.
- cyanophycin and / or its secondary products can be seen in the paper, textile, pigment, lacquer, ceramic, building material or detergent industries as well as in the areas of water and waste water treatment.
- SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
- the peptide primers are linked by the following reaction: (i) coupling of Fmoc-Asp-OtBu and subsequently (ii) twice attaching the building block Fmoc-Asp- [Arg- (Pmc) -OtBu] -OH. Furthermore, the N-terminally blocked peptide primer ⁇ -Ahx 2 - (b-Asp-Arg) 3 was produced by attaching Fmoc- ⁇ -aminohexanoic acid (Novabiochem) twice to the peptide primer bound to the resin described above. The finished peptides were made by
- the peptide primer ( ⁇ -Asp-Arg) 3 -Asp was synthesized on a TentaGel-S-PHB resin (Rapp polymers) loaded with Fmoc-Asp (OtBu) by attaching the corresponding building block three times.
- the peptide was also cleaved from the resin and deprotected as previously described. Here, the peptide was obtained as a free acid.
- All peptide primers were purified on a C-18 column (Vydac 201SP54) and analyzed using RP-HPLC and MALDI-MS.
- the dipeptide ⁇ -Asp-Arg was also produced on a TentaGel-S-PHB phase, which had previously been loaded with Fmoc-Arg (Pmc).
- Fmoc-Arg Pmc
- the resin was treated with 4 eq (equivalents) of Boc-Asp-OtBu (Bachern Chemicals), 4 eq O- (benzotriazol-l-yl) - N , N, N ', N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate and 8 eq diisopropyl-emylamine treated in DMF.
- the peptide was cleaved from the resin with trifluoroacetic acid containing 1% phenol, 2% water and 3% triisobutylsilane, then precipitated with cold t-butylmethyl and finally purified on a C-18 column (Vydac 201SP54) and with RP-HPLC and MALDI-MS analyzed.
- the reaction batches for product analysis by mass spectrometry contain the following components in a volume of 125 ⁇ l: 100 mM NEUHCO; ⁇ (pH 8.0), 4 mM ATP disodium salt, 20 mM MgCl 2 , 8 mM KC1, 2 mM DTT, 0.2 mM L-aspartic acid, 0.2 mM L-arginine, ⁇ 10 ⁇ M synthetic primers and 3 ⁇ g cyanophycin synthetase.
- the reaction mixture of 125 ⁇ l contains the following: 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 4 mM ATP disodium salt, 20 mM MgCl 2 , 20 mM KC1, 1 mM DTT, 0.8 mM L Aspartic acid, 0.4 mM L-arginine,> 10 ⁇ M synthetic primer and 3 ⁇ g cyanophycin synthetase.
- Various primers (Fig. 1) are added to the reaction mixture. After incubation of the reaction batches for 24 hours at room temperature
- Lane 5 like lane 4 but with about 160 ⁇ M primer. " The diffuse bands below 29 kDa in lanes 1, 2 and 3 represent cyanophycin-like material.
Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft eine thermostabile Cyanophycinsynthetase aus Synechococcus elongatus sowie ein Verfahren zur verbesserten Herstellung von Cyanophycin und oder dessen Folgeprodukte.
Description
Verfahren zur verbesserten Herstellung von Cyanophycin und dessen Folgeprodukte
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine thermostabile Cyanophycinsynthe- tase, transformierte Organismen enthaltend eine solches Enzym, sowie ein Verfahren zur verbesserten Herstellung von Cyanophycin und/oder dessen Folgeprodukten, beispielsweise Polyasparaginsäure oder Arginin.
Multi-L-Arginyl-Poly-L-Aspartat (Cyanophycin) ist ein verzweigtes Polypeptid, wel- ches Asparaginsäure und Arginin im Verhältnis von 1:1 enthält. Die chemische
Struktur entspricht einem Poly-α-Aspartat-Grundgerüst mit Arginin-Seitenresten, welche über Peptidbindungen an nahezu alle ß-Carboxylgruppen des Grundgerüstes angeknüpft sind.
In der DE-A 198 25 509 ist die Identifizierung, Klonierung und heterologe Expression des Gens für die Cyanophycinsynthetase aus Synechocystis PCC 6803 beschrieben. Die Bestimmung der Enzymaktivität erfolgt hier mittels eines radioaktiven Tests bei dem L-[U-14C]-Argimn in als "Primer" (Vorstufe) vorgelegtes Cyanophycin aus Aphanocapsa PCC 6308 eingebaut wird. Die Enzymreaktion selber erfolgt hier bei 28°C.
Aus der DE-A 197 09 024 ist die Extraktion und Reinigung von Cyanophycin aus Aphanocapsa PCC 6308 bekannt, wobei die Synthese bei 20°C durchgeführt wird.
Die DE-A 198 13 692 offenbart lediglich die Isolierung des Cyanophycinsynthetase- gens aus Synechocystis PCC 6803 oder Anabaena variabilis ATCC 29 413. Verfahrenstechnische Merkmale zur Herstellung von Cyanophycm sind hier jedoch nicht beschrieben.
Aus FEMS Microbiology Letters 181 (1999) 229-236 ist die Herstellung von Cyanophycin aus Synechococcus sp. MA 19 bekannt.
Nachteilig für eine großtechnische Herstellung von Cyanophycin gemäß den bekannten Verfahren ist, dass für eine optimale Produktausbeute ein relativ enger Temperaturbereich, in der Regel unterhalb von 35°C, nicht überschritten werden darf.
Dies stellt eine erhebliche Einschränkung der Freiheitsgrade für großtechnische Produktionen innerhalb der Prozessführung zur Herstellung von Cyanophycin dar, da höhere Temperaturen von vorne herein Kontamination durch Fremdkulturen verhindern.
Daher ist eine Herstellung von Cyanophycin auch bei wesentlich höheren Temperaturen als bislang beschrieben, verbunden mit einer höheren Flexibilität bei der Prozesssteuerung und erheblich verbesserten Produktausbeuten wünschenswert, um daraus in großtechnischem Maßstab Folgeprodukte wie Polyasparaginsäure oder Argi- nin zu isolieren.
Diese Aufgabe wird durch die vorhegende Erfindung gelöst.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Cyanophycinsynthetase, die sich dadurch auszeichnet, dass sie ein Temperaturoptimum im Bereich von >35°C und eine Aminosäuresequenz gemäß SEQUENZPROTOKOLL 1 kodiert durch eine isolierte Nukleotidsequenz gemäß SEQUENZPROTOKOLL 2, ein Allel, Homolog oder Derivat dieser Nukleotidsequenz oder eine mit dieser hybridisierende Nukleotidsequenz aufweist.
In einer bevorzugten Variante der vorliegenden Erfindung weist die erfindungsgemäße Cyanophycinsynthetase ein Temperaturoptimum im Bereich von 35°C bis 55°C, bevorzugt im Bereich von 35 bis 50°C auf.
Ferner zeichnet sich die erfindungsgemäße Cyanophycinsynthetase dadurch aus, dass sie aus Synechococcus elongatus stammt. Die erfindungsgemäße Cyanophycinsyn-
thetase stellt ein thermostabiles Enzym dar.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Isoenzyme der erfindungsgemäßen Cyanophycinsynthetase. Hierunter sind Enzyme mit gleicher oder vergleichbarer Substrat- und Wirkungsspezifität zu verstehen, die jedoch eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen. Darüber hinaus umfasst die vorhegende Erfindung auch modifizierte Formen der Cyanophycinsynthetase. Hierunter sind erfindungsgemäß Enzyme zu verstehen, bei denen Änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N- und/oder C-Terminus des Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne jedoch die Funktion des Enzyms zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können durch den Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren nach bekannten Methoden vorgenommen werden.
Eine besondere Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung umfasst Varianten der erfindungsgemäßen Cyanophycinsynthetase, deren Substratsspezifität bspw. durch Arninosäureaustausch, verglichen mit dem jeweiligen Ausgangsprotein verändert wurde, bspw. im Hinblick auf die Produktion von Polyasparaginsäure. Gleiches gilt für die Stabilität der erfindungsgemäßen Enzyme in den Zellen, die bspw. gegenüber dem Abbau durch Proteasen verstärkt oder vermindert anfällig sind.
Ferner sind Polypeptide mit der Funktion einer Cyanophycinsynthetase Gegenstand der vorliegenden Erfindung, die in ihrer Aminosäuresequenz derart verändert sind, dass sie gegenüber regulatorisch wirkenden Verbindungen, bspw. die sie in ihrer Aktivität regulierenden Stoffwechsel-Endprodukte, desensitiv sind (feedback-desen- sitiv).
Unter einer isolierten Nukleotidsequenz oder einem isolierten Nukleinsäurefragment ist erfindungsgemäß ein Polymer aus RNA oder DNA zu verstehen, das einzel- oder doppelsträngig sein kann und optional natürliche, chemisch synthetisierte, modifi- zierte oder artifizielle Nukleotide enthalten kann. Der Begriff DNA-Polymer schließt hierbei auch genomische DNA, cDNA oder Mischungen davon ein.
Unter Allelen sind erfindungsgemäß funktioneil äquivalente, d.h. im wesentlichen gleichwirkende Nukleotidsequenzen zu verstehen. Funktioneil äquivalente Sequenzen sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz, bspw. durch die Degeneriertheit des genetischen Codes noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene und gegebenenfalls an den Kodon-Gebrauch des Wirtsorganismus angepasste Nukleotidsequenzen. Darüber hinaus umfassen funktionell äquivalente Sequenzen solche, die eine veränderte Nukleotidsequenz aufweisen, welche dem
Enzym bspw. eine Desensitivität oder Resistenz gegenüber Inhibitoren verleiht.
Unter einem funktioneilen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigt. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen,
Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Inbegriffen sind hier auch sogenannte Sinnmutationen (sense mutations), die auf Proteinebene bspw. zum Austausch konservierter Aminosäuren führen können, welche aber zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen und so- mit funktionsneutral sind. Dies beinhaltet auch Veränderungen der Nukleotidsequenz, die auf Proteinebene den N- oder C-Terminus eines Proteins betreffen, ohne jedoch die Funktion des Proteins wesentlich zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können sogar stabilisierenden Einfluss auf die Protemstruktur ausüben.
Ferner werden bspw. auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation der Nukleotidsequenz, resultierend in entsprechenden Derivaten, erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodierenden Sequenz oder z.B. auch die Einfügung weiterer Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme sein. Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt oder verstärkt ist.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen Gegenstand der vorliegenden Erfindung, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschten Eigenschaften vermitteln und in das Gen der erfindungsgemäßen Cyanophycinsynthetase eingebaut oder angehängt werden können. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können bspw. durch Rückübersetzung von mittels computergestützten Programmen (molecular modelling) erstellten Proteinen oder durch in-vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung eine Polypeptidsequenz gemäß der für den Wirtsorganismus spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit molekulargenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bereits bekannter Gene des zu transformierenden Organismus leicht ermitteln.
Unter homologen Sequenzen sind erfindungsgemäß solche zu verstehen, die zu den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen komplementär sind und/oder mit diesen hybridisieren. Der Begriff hybridisierende Sequenzen schließt erfindungsgemäß süb- stanziell ähnliche Nukleotidsequenzen aus der Gruppe von DNA oder RNA ein, die unter bekannten stringenten Bedingungen eine spezifische Wechselwirkung (Bindung) mit den zuvor genannten Nukleotidsequenzen eingehen. Hierzu zählen auch kurze Nukleotidsequenzen mit einer Länge von beispielsweise 10 bis 30, bevorzugt
12 bis 15 Nukleotiden. Dies umfasst erfindungsgemäß u.a. auch sogenannte Nukleo- tid-Primer oder Sonden.
Erfϊndungsgemäß sind auch die den kodierenden Bereichen (Strukturgenen) voraus- gehenden (5'- oder upstream) und/oder nachfolgenden (3'- oder downstream)
Sequenzbereiche eingeschlossen. Insbesondere sind hierin Sequenzbereiche mit regulatorischer Funktion inbegriffen. Sie können die Transkription, die RNA-Stabilität oder das RNA processing sowie die Translation beeinflussen. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind u.a. Promotoren, Enhancer, Operatoren, Terminatoren oder Translationsverstärker.
Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulatorischer Elemente derart, dass jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Diese regulatorischen Nukleotidsequenzen können natürlichen Ursprungs sein oder durch chemische Synthese erhalten werden. Als Promotor ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Genexpression in dem entsprechenden Wirtsorganismus steuern kann. Hierbei kann es sich erfindungsgemäß auch um einen chemisch induzierbaren Promotor handeln, durch den die Expression der ihm unterliegenden Gene in der Wirtszelle zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Beispielhaft sei hier ein durch IPTG (Isopropyl-ß-thiogalactosid) induzierbarer Promotor genannt.
Die Herstellung einer Genstruktur erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie literaturbekannt sind. Für die Verbindung der
DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor enthaltend wenigs- tens eine Nukleotidsequenz der zuvor beschriebenen Art kodierend für eine zu Herstellung von Cyanophycin spezifische Cyanophycinsynthetase, mit diesen operativ verknüpfte regulative Nukleotidsequenzen sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion transformierter Wirtszellen, für die Replikation innerhalb der Wirtszelle oder zur Integration in das entsprechende Wirtszell-Genom. Ferner kann der erfm- dungsgemäßen Vektor eine Genstruktur der vorgenannten Art enthalten.
Als Vektoren eignen sich solche, die in Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien, Pilzen und/oder Pflanzen repliziert werden. Bekannte Vektoren sind beispielsweise pBlueskript (Stratagene, 11099 North Torney Pines Rd., La Jolla, CA 92 037, USA) oder pET (Novagen, 601 Science Drive, Madison, WJ 53 711, USA). Diese Aufzählung ist für die vorliegende Erfindung jedoch nicht limitierend.
Unter Ausnutzung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können entsprechende Sonden oder auch Nukleotid-Primer synthetisiert und dazu verwendet werden, beispielsweise mit Hilfe der PCR-Techmk analoge Gene aus anderen ein oder mehrzelligen Organismen, bevorzugt Bakterien, Pilzen, Algen oder Pflanzen zu amplifizieren und isolieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch eine Sonde zur Identifizierung und/oder Isolierung von Genen kodierend für an der Biosynthese von Cyanophycin beteiligten Proteinen, bevorzugt weiteren thermostabilen Cyanophycinsynthetasen, wobei diese Sonde ausgehend von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen der zuvor beschriebenen Art hergestellt wird und eine zur Detektion geeignete Markierung enthält. Bei der Sonde kann es sich um einen Teilausschnitt der erfindungsgemäßen Sequenz, beispielsweise aus einem konservierten Bereich handeln, der z.B. eine Länge von 10 bis 30 oder bevorzugt 12 bis 15 Nukleotiden aufweist und unter stringenten Bedingungen spezifisch mit homologen Nukleotidsequenzen hybridisieren kann. Geeignete Markierungen sind aus der Literatur zahlreich bekannt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Übertragung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines Teils davon kodierend für eine Cyanophycinsynthetase, ein Allel, Homolog oder Derivat davon oder eine mit diesen Sequenzen hybridisierende Nukleotidsequenz in ein heterologes Wirtssystem. Dies schließt auch die Übertragung eines erfϊndungsgemäßen Genkonstrukts oder Vektors in ein heterologes Wirtssystem ein.
Unter einem heterologen Wirtssystem ist erfindungsgemäß ein ein- oder mehrzelliger Organismus zu verstehen. Beispiele hiefür sind Mikroorganismen, Pilze, niedere oder höhere Pflanzen, Gewebe oder Zellen davon. Erfindungsgemäß bevorzugt sind Bakterien, besonders bevorzugt der Gattung der Enterobakterien und insbesondere der Art Escherichia coli. Ferner sind Nutzpflanzen, wie beispielsweise Kartoffeln oder
Tabak besonders bevorzugt.
Die Übertragung der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz kodierend für eine erfindungsgemäß thermostabile Cyanophycinsynthetase in eine der zuvor genannten Wirtssysteme erfolgt nach bekannten Methoden. Als Beispiele für Verfahren zur DNA-Übertragung in geeignete Wirtssysteme sind die Transformation, Elektropora- tion, Konjugation sowie eine Agrobakterien-vermittelte DNA-Übertragung oder „particle bombardment" zu nennen. Diese Aufzählungen dienen nur der Erläuterung der vorliegenden Erfindung und sind nicht limitierend.
Ein aus einer erfolgreich durchgeführten Nuklemsäureübertragung resultierender transformierter ein- oder mehrzelliger Organismus unterscheidet sich somit von dem entsprechend nicht transformierten Organismus dadurch, daß er zusätzliche Nukleinsäuren der erfindungsgemäßen Art enthält und entsprechend zur Ausprägung bringen kann.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch ein transformierter ein- oder mehrzelliger Organismus enthaltend eine erfindungsgemäße Cyanophycinsynthetase und/oder einen Vektor enthaltend eine Cyanophycinsynthetase der zuvor beschriebenen Art.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bereitstellung einer erfindungsgemäßen Cyanophycinsynthetase der zuvor beschriebenen Art, wobei die für das Enzym kodierende Nukleotidsequenz aus einem thermophilen ein- oder mehrzelligen Organismus isoliert wird, ggf mit regulatorischen Strukturen operativ verknüpft und/oder in einen zur heterologen Expression geeigneten Vektor kloniert wird, gegebenenfalls in ein heterologes Wirtssystem übertragen, dort exprimiert und anschließend aus diesem Wirtssystem isoliert und gegebenenfalls aufgereinigt und/oder angereichert wird.
Denkbar ist auch die direkte Isolierung einer für die Synthese von Cyanophycm ausreichenden Menge an Cyanophycinsynthetase aus einem thermophilen Organis-
mus, ohne die vorhergehende Anreicherung in einem heterologen System. Im weiteren kann dann das erfindungsgemäße Enzym Cyanophycinsynthetase beispielsweise in einem in-vitro System zur Synthese von Cyanophycin und/oder dessen Folgeprodukte eingesetzt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung von Cyanophycin und/oder dessen Folgeprodukte, wobei eine Cyanophycinsynthetase und/oder ein Vektor und/oder ein transformierten ein- oder mehrzelliger Organismus der zuvor beschriebenen Art eingesetzt wird. Die vorliegende Erfindung umfasst jedoch nicht nur die Herstellung von Cyanophycin und/oder dessen Folgeprodukte in einem lebenden Wirtssystem, sondern auch die in-vitro Synthese von Cyanophycin mit Hilfe einer isolierten Cyanophycinsynthetase der zuvor beschriebenen Art.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Cyanophycin zeichnet sich dabei dadurch aus, dass die Enzym-katalysierte Synthese in einem Temperaturbereich von 35°C bis 55°C, bevorzugt in einem Bereich von 35°C bis 50°C erfolgt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich in vorteilhafter Weise dadurch aus, dass der Prozess aufgrund des weiten Temperaturbereichs, insbesondere oberhalb von 28°C weniger störanfällig ist, größere Variabilität bei der Prozessführung erlaubt und so eine verbesserte Produktausbeute liefert. Somit ist die erfindungsgemäße Herstellung von Cyanophycin und/oder dessen Folgeprodukte wesentlich reproduzierbarer und wirtschaftlicher als die bisher bekannten Verfahren.
Auf molekularer Ebene katalysiert die erfindungsgemäße Cyanophycinsynthetase eine ATP-abhängige Kettenverlängerungsreaktion (Elongation). Überraschender Weise weist das Enzym zwei aktive (katalytische) Zentren auf. Die erfindungsgemäße Cyanophycinsynthetase baut schrittweise und abwechselnd(sequentiell) ein Molekül Asparaginsäure und anschließend ein Molekül Arginin in eine Cyanophy- ein- Vorstufe (Peptid-Primer) ein. Ohne einen Primer kann die enzymkatalysierte
Kettenverlängerung nicht gestartet werden. Untersuchungen dazu sind in Fig. 2 dar-
gestellt. Die chemische Struktur verschiedener zur Synthese von Cyanophycin eingesetzter Primer ist in Fig. 1 dargestellt. Hierbei wird deutlich, dass der Einbau ausschließlich am C-terminalen Ende der Vorstufe erfolgt und auch nur, wenn beide Aminosäuren, also Asparaginsäure und Arginin bzw. eine andere basische Aminosäure, gemeinsam vorliegen. Eine Zusammenfassung dieser Untersuchungen ist in Fig. 3 und Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Nr. Primer Substrat(e) Produkt
C-terminal blockierter Primer:
(1) (ß-Asp-Arg)3-ε-Ahx2 Asp + Arg keines
(2) (ß-Asp-Arg)3-ε-Ahx2 Asp oder Arg keines
N-terminal blockierter Primer:
(3) ε-Ahx2-(ß-Asp-Arg)3 Asp + Arg Cyanophycin
(4) ε-Ahx2-(ß-Asp-Arg)3 Asp ε-Ahx2-(ß-Asp-Arg)3-Asp
(5) ε-Ahx2-(ß-Asp-Arg)3 Arg keines
Unblockierte Primer:
(6) (ß-Asp-Arg)3 Asp + Arg Cyanophycin
(7) (ß-Asp-Arg)3 Asp (ß-Asp-Arg)3-Aspa)
(8) (ß-Asp-Arg)3 Arg keines
(9) (ß-Asp-Arg)3 ß-Asp-Arg keines
(10) (ß-Asp-Arg)3-Asp Asp + Arg Cyanophycin
(11) (ß-Asp-Arg)3-Asp Asp keines
(12) (ß-Asp-Arg)3-Asp Arg (ß-Asp-Arg)4 a) Das Reaktionsprodukt könnte grundsätzlich auch Asp-(ß-Asp-Arg)3 sein. Diese
Möglichkeit wird jedoch wegen der Resultate mit den N-terminal bzw. C-terminal blockierten Primern ausgeschlossen (Reaktionen 2 und 4 dieser Tabelle).
Die vorliegende Erfindung betrifft femer die Verwendung eine Vektors enthaltend eine erfindungsgemäße Cyanophycinsynthetase der zuvor genannten Art zur Her-
stellung eines transformierten ein- oder mehrzelligen Organismus wie zuvor beschrieben. Ebenso ist die Verwendung eines solchen transformierten ein- oder mehrzelligen Organismus zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Cyanophycinsynthetase und/oder zur Herstellung von Cyanophycin und/oder dessen Folgepro- dukte in der vorliegenden Erfindung umfaßt. Darüber hinaus kann auch eine erfindungsgemäß isolierte Cyanophycinsynthetase zur in-vitro-Herstellung von Cyanophycin und/oder dessen Folgeprodukten Verwendung finden. Außerdem ist die Verwendung von Cyanophycin und/oder dessen Folgeprodukte zur Herstellung von Nahrungsergänzungsmitteln und/oder Mitteln im Bereich der Agrarwirtschaft und/oder des Pflanzenschutzes in der vorhegenden Erfindung erfaßt. Weitere
Anwendungsbereiche des Cyanophycins und/oder dessen Folgeprodukte sind in der Papier-, Textil-, Pigment-, Lack-, Keramik-, Baustoff- oder Waschrnittelindustrie zu sehen sowie in den Bereichen Wasser- und Abwasserbehandlung.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher charakterisiert, die jedoch nicht limitierend für die Erfindung sind:
Allgemeine genetische Methoden:
Die DNA-Isolierung, Plaquehybridisierung, Polymerasekettenreaktion (PCR), Erstellung einer genomischen DNA-Genbank sowie die Vorgehensweisen zur Analyse von Proteinen mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) einschließlich der Proteinaufreinigung, ebenso wie die Kultivierung von Mikroorganismen, wie z.B: Escherichia coli erfolgen nach Standardmethoden beschrieben in Sambrook, J. et al. (1998, Molecular Cloning: A laboratory Manual; 2nd Edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, NY.) oder gemäß den Herstellerangaben. Die
Kultivierung von Blaualgen, wie z. B. Synechococcus elongatus erfolgte nach Beschreibungen in Yamaoka, T., et al. (1978, Plant Cell Physiol., 19: 943-954).
Synthese der Peptid-Primer: Die verzweigten Peptid Primer (ß-Asp-Arg)3, (ß-Asp-Arg)3-Asp, ε-Ahx2-(b-Asp-
Arg)3 und (ß-Asp-Arg)3-ε-Ahx2 (siehe Fig. 1; Ahx = ε-Aminohexansäure) wurden an
einer Festphase in Anlehnung an die Fmoc/tbu Chemie über O-(Benzotriazol-l-yl)- N,N,N',N'-tetramethyluronium-tetrafluoroborat Aktivierung mit dem building block Fmoc-Asp-[Arg(Pmc)-OtBu]-OH synthetisiert. Der building block wurde durch folgende Reaktionsfolge in Lösung hergestellt: (i) Acylierung von H-Arg(Pmc)-OtBu (Bachern Biochemicals) mit Fmoc-Asp-All (All = Allylester) ( ovabiochem) unter
Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid/N-Hydroxybenzotriazol (Novabiochem) als Aktivierungs Agenzien und anschließend (ii) Öffnung des Allylesters mit Hilfe von N-Methylanilin und Tetrakis-(triphenylphospin)-palladium(0) als Katalysator. Die Synthese wird an einem mit Fmoc-Arg(Pmc)-TentaGel-S-PHB beladenen Harz (Rapp Polymere) gestartet. Die Peptid Primer werden durch folgende Reaktion verknüpft: (i) Kupplung von Fmoc-Asp-OtBu und nachfolgend (ii) zweimaliges Anhängen des building blocks Fmoc-Asp-[Arg-(Pmc)-OtBu]-OH. Weiterhin wurde der N-terminal blockierte Peptid Primer ε-Ahx2-(b-Asp-Arg)3 durch zweimaliges Anhängen von Fmoc-ε-Aminohexansäure (Novabiochem) an den oben beschrie- benen Harz gebundenen Peptid Primer hergestellt. Die fertigen Peptide wurden durch
Behandlung mit 94% Trifluoressigsäure, 1% Phenol, 2% Wasser, 3% Triisobutyl- silan entschützt und vom Harz abgespalten, wobei die Peptide und die N-terminal blockierten Peptid Primer als freie Säuren erhalten werden. Der C-terminal blockierte Peptid Primer (ß-Asp-Arg)3-ε-Ahx wurde an einem TentaGel-SRAM Harz (Rapp- Polymere) nach folgendem Procedere hergestellt: (i) zweimalige Kupplung von
Fmoc-ε-Aminohexansäure und nachfolgend dreimalige Kupplung des building blocks Fmoc-L-Asp-[L-Arg(Pmc)-OtBu).Die Abspaltung des fertigen Primers wurde wie oben beschrieben durchgeführt und lieferte das Peptid als Carboxamid.
Der Peptid Primer (ß-Asp-Arg)3-Asp wurde an einem mit Fmoc-Asp(OtBu) beladenen TentaGel-S-PHB Harz (Rapp Polymere) durch dreimaliges Anhängen des entsprechenden building blocks synthetisiert. Das Peptid wurde ebenfalls wie vorher beschrieben vom Harz abgespalten und entschützt. Hierbei wurde das Peptid als freie Säure erhalten. Alle Peptid Primer wurden auf einer C-18 Säule (Vydac 201SP54) gereinigt und mit Hilfe der RP-HPLC und MALDI-MS analysiert.
Das Dipeptid ß-Asp-Arg wurde ebenfalls an einer TentaGel-S-PHB Phase, die vorher mit Fmoc-Arg(Pmc) beladen wurde, hergestellt. Nachdem die Fmoc Schutzgruppe mit 20%iger Piperidin-DMF-Lösung abgespalten wurde, wurde das Harz mit 4 eq (Äquivalenten) Boc-Asp-OtBu (Bachern Chemicals), 4 eq O-(Benzo-triazol-l-yl)- N,N,N',N'-Tetramethyluroniumtetrafluoroborat und 8 eq Diisopropyl-emylamin in DMF behandelt. Das Peptid wurde mit Trifluoressigsäure, die 1% Phenol, 2% Wasser und 3% Triisobutylsilan enthält, vom Harz abgespalten, anschließend mit kaltem t-Butylmethyl ausgefallt und schließlich auf einer C-18 Säule (Vydac 201SP54) aufgereinigt und mit RP-HPLC und MALDI-MS analysiert.
Reaktionsansätze und Produktanalyse:
Die Reaktionsansätze zur Produktanalyse mittels Massenspektrometrie enthalten in einem Volumen von 125 μl folgende Komponenten: 100 mM NEUHCO;} (pH 8,0), 4 mM ATP-Dinatriumsalz, 20 mM MgCl2, 8 mM KC1, 2 mM DTT, 0,2 mM L-Aspa- raginsäure, 0,2 mM L- Arginin, ≥ 10 μM synthetische Primer und 3 μg Cyanophycinsynthetase.
Zur Produktanalyse mittels SDS-PAGE enthält der Reaktionsansatz von 125 μl folgendes: 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 4 mM ATP-Dinatriumsalz, 20 mM MgCl2, 20 mM KC1, 1 mM DTT, 0,8 mM L-Asparaginsäure, 0,4 mM L-Arginin, > 10 μM synthetische Primer und 3 μg Cyanophycinsynthetase.
Die Proben werden für 10-14 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend entweder mit Probenpuffer gemischt (SDS-PAGE) oder eingefroren (Massenspektrometrie). Die Produktanalyse mittels Massenspektrometrie (MALDI-
MS) erfolgt gemäß den Angaben im Benutzerhandbuch des Geräteherstellers (PerSeptive Biosystems).
Legende zu den Figuren, Tabellen und Zusatzseiten:
Zusatzseiten 1 bis 3
SEQUENZPROTOKOLL 1 der Airiinosäuresequenz der erfindungsgemäßen thermostabilen Cyanophycinsynthetase abgeleitet von dem entsprechenden
Cyanophycinsynthetase-Gen.
Zusatzseiten 4 bis 7:
SEQUENZPROTOKOLL 2 der Nukleotidsequenz des erfindungsgemäßen Cyanophycinsynthetase-Gens kodierend für die erfindungsgemäße Cyanophycinsynthetase.
Fig. 1: Chemische Struktur der verwendeten synthetischen Peptid-Primer zur Synthese einer Cyanophycin mittels Cyanophycinsynthetase.
Fig. 2: Darstellung der Ergebnisse einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS- PAGE) zur in-vitro Synthese von Cyanophycin-ähnlichem Material mittels gereinigter Cyanophycmsynthetase. Der Reaktionsansatz enthält u.a. etwa 10 μM Primer (ß-Asp-Arg)3. Nach einer Inkubation von 24 Stunden bei Raumtemperatur werden Aliquots des
Reaktionsansates mittels SDS-PAGE analysiert und Proteine nach Standardmethoden sichtbargemacht. Spur 1: vollständiger Reaktionsansatz; Spur 2: Reaktionsansatz ohne Asparaginsäure; Spur 3: Reaktionsansatz ohne Arginin; Spur 4: Reaktionsansatz ohne ATP; Spur 5: Reaktionsansatz ohne Primer (ß- Asp-Arg)3; Spur 6: Reaktionsansatz mit hitzeinaktiviertem Enzym (5 min,
100 °C). Die Proteinbande über dem 97,4 kDa Standard repräsentiert die Cyanophycinsynthetease. Die diffusen Banden unterhalb von 29 kDa in Spur 1, 2 und 3 stellen Cyanophycin-ähnliches Material dar.
Fig. 3: Darstellung der Ergebnisse einer SDS-PAGE zur Kettenverlängerung eines Primers mittels Cyanophycinsynthetase am C-terminalen Ende des Peptid- Primers.
Verschiedene Primer (Fig. 1) werden dem Reaktionsansatz zugesetzt. Nach Inkubation der Reaktionsansätze für 24 Stunden bei Raumtemperatur werden
Aliquots des Reaktionsansates mittels SDS-PAGE analysiert und Proteine nach Standardmethoden sichtbargemacht. Spur 1: Ansatz ohne Primer; Spur 2: Ansatz mit etwa 8 μM ungeschütztem Primer (ß-Asp-Arg)3; Spur 3: Ansatz mit etwa 8 μM N-terminal geschütztem Primer (ε-Ahx2-(ß-Asp-Arg)3); Spur 4: Ansatz mit etwa 8 μM C-terminal geschütztem Primer ((ß-Asp-Arg)3-ε-
Ahx ); Spur 5: wie Spur 4 aber mit etwa 160 μM Primer." Die diffusen Banden unterhalb von 29 kDa in Spur 1, 2 und 3 stellen Cyanophycin-ä nliches Material dar.
Tab. 1: Cyanophycinsynthetase katalysierter Einbau von L-Asparaginsäure (Asp) und L- Arginin (Arg) in synthetische Peptid-Primer.
Claims
1. Cyanophycinsynthetase, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Temperaturoptimum im Bereich von 35°C bis 55°C und eine Aminosäuresequenz gemäß SEQUENZPROTOKOLL 1 kodiert durch eine Nukleotidsequenz gemäß
SEQUENZPROTOKOLL 2, ein Allel, Homolog oder Derivat dieser Nukleotidsequenz oder eine mit dieser hybridisierende Nukleotidsequenz aufweist und aus Synechococcus elongatus stammt.
2. Vektor enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz kodierend für eine zur
Herstellung von Cyanophycin spezifische Cyanophycinsynthetase gemäß Anspruch 1.
3. Transformierter ein- oder mehrzelliger Organismus enthaltend eine Cya- nophycinsynthetase gemäß Anspruch 1 und/oder einen Vektor gemäß
Anspruch 2.
4. Transformierter ein- oder mehrzelliger Organismus gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Mikroorganismus, ein Pilz, eine niedere oder höhere Pflanze, Gewebe oder eine Zelle davon ist.
5. Verfahren zur Bereitstellung einer Cyanophycinsynthetase gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die für das Enzym kodierende Nukleotidsequenz mit regulatorischen Strukturen operativ verknüpft und/oder in einem zur heterologen Expression geeigneten Vektor kloniert wird, in ein heterologes Wirtssystem übertragen, exprimiert und aus diesem Wirtssystem isoliert und aufgereinigt und/oder angereichert wird.
6. Verfahren zur Herstellung von Cyanophycin und den daraus herzustellenden Folgeprodukten, dadurch gekennzeichnet, dass eine Cyanophycinsynthetase gemäß Anspruch 1 und/oder ein Vektor gemäß Anspruch 2 und/oder ein transformierter ein- oder mehrzelliger Organismus gemäß einem der Ansprüche 3 oder 4 eingesetzt wird.
7. Verwendung eines Vektors gemäß Anspruch 2 zur Herstellung eines trans- formierten ein- oder mehrzelligen Organismus gemäß einem der Ansprüche 3 oder 4.
8. Verwendung eines transformierten ein- oder mehrzelligen Organismus gemäß einem der Ansprüche 3 oder 4 zur Herstellung einer Cyanophycinsynthetase gemäß Anspruch 1 und/oder zur Herstellung von Cyanophycin.
9. Verwendung einer Cyanophycinsynthetase gemäß Anspmch 1 zur Herstellung von Cyanophycin.
10. Isoenzyme und modifizierte Formen der Cyanophycinsynthetase, dadurch gekennzeichnet, dass diese durch Modifikation der Cyanophycinsynthetase von Synechococcus elongatus erhalten werden.
11. Isoenzyme und modifizierte Formen der Cyanophycinsynthetase gemäß Anspmch 10, dadurch gekennzeichnet, dass diese durch Aminosäureaustausch erhalten werden.
12. Isoenzyme und modifizierte Formen der Cyanophycinsynthetase gemäß Anspmch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Aminosäureaustausch durch Modifikation der Nukleotidsequenz des zugrundeliegenden Gens erfolgt.
13. Artifizielle DNA-Sequenzen, dadurch gekennzeichnet, dass diese in das Gen der Cyanophycinsynthetase gemäß Anspmch 1 eingebaut oder angehängt werden.
14. Sonde zur Identifizierung und/oder Isolierung von Genen kodierend für an der Biosynthese von Cyanophycin beteiligten Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass diese eine zur Detektion von der Cyanophycinsynthetase und deren Modifikation gemäß der Ansprüche 1 und 10 geeignete Markierung enthält.
15. Heterologe Wirtssysteme enthaltend eine Nukleinsäuresequenz oder einen Teil davon kodierend für eine Cyanophycinsynthetase, ein Isoenzym oder eine modifizierte Form davon gemäß der Ansprüche 1 und 10.
16. Verwendung von Cyanophycin hergestellt nach Anspmch 9 zur Synthese von
Polyasparaginsäure oder Arginin.
17. Natürliche oder artifizielle DNA-Sequenzen in 5' oder upstream und/oder 3' oder downstream Position der Cyanophycinsynthetase gemäß Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, dass diese die Transkription, die RNA Stabilität oder das RNA processing sowie die Translation beeinflussen.
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