DE69115843T3

DE69115843T3 - Protease aus Bacillus licheniformis

Info

Publication number: DE69115843T3
Application number: DE1991615843
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Sakai-shi Teraoka; Mikio Nara-shi Tamaki; Etsuo Kobe-shi Nakamura; Masaru Kobe-shi Shin; Nobuo Nishinomiya-shi Yoshida; Hiroshige Tsuzuki-gun Tsuzuki; Takashi Nara-shi Fujiwara; Koichi Toyonaka-shi Matsumoto
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1990-10-24
Filing date: 1991-10-22
Publication date: 2004-11-18
Anticipated expiration: 2011-10-23
Also published as: AU8600491A; CN1068047C; GR3019035T3; EP0482879B2; DK0482879T3; ES2081442T5; PT99322A; EP0482879A3; BR9104613A; NZ240305A; CA2054030C; DE69115843T2; CA2281956C; DE69115843D1; DK0482879T4; CA2054030A1; ATE132194T1; JPH04166085A; IE913714A1; PT99322B

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz, welche ein Proteasemolekül kodiert, das in den Aminosäuresequenzen von Polypeptiden die Peptidbindung an den Carboxytermini der Glutaminsäurereste spezifisch spaltet, Verfahren zur Herstellung der Protease aus Bakterien der Gattung Bacillus, einen Expressionsvektor, der die DNA-Sequenz enthält, eine Transformante, erhalten durch Einführung des Expressionsvektors in einen Wirt, und ein Verfahren zur Herstellung der Protease mit Hilfe der Transformante.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Von der V8-Protease aus dem V8-Stamm von Staphylococcus aureus weiß man, dass dieses Enzym auf Proteine (d. h. Polypeptide) einwirkt und dort spezifisch die Peptidbindung am Carboxyterminus von Glutaminsäure (Glu)-Resten spaltet (Gabriel R. Drapeau et al., J. Biol. Chem. 247, 20, 6720–6726, 1972). Dieses Enzym ist als eine Serinprotease klassifiziert. C. Carmona et al. haben die für dieses Enzym kodierende DNA-Sequenz kloniert (Nucl. Acids Res., 15, 6757, 1987).
Auch bekannt ist ein ähnliches Enzym, nämlich eine für saure Aminosäurereste spezifische Endopeptidase, die aus dem Actinomyzeten-Bakterium Streptomyces griseus stammt (Norio Yoshida et al, J. Biochem. 104, 3, 451–456, 1988). Ferner bekannt ist eine aus Bacillus subtilis stammende Endopeptidase, die für Glutaminsäurereste spezifisch ist (Takuro Niidome, Norio Yoshida, Fusahiro Ogata, Akio Ito und Kosaku Noda, J. Biochem. 108, 965–970, 1990); Abstracts der 62. General Conference der Japan Biochemical Society).
Die vorgenannten Enzyme sind geeignet, wenn die Proteine für eine Proteinstrukturanalyse an den genannten Stellen etc. Spezifisch gespalten werden sollen, oder im Anschluß an rekombinante DNA-Techniken, wenn das gewünschte Protein durch Spalten aus einem bestimmten Fusionsprotein erhalten werden soll. Im letzteren Fall kann das gewünschte Protein, wenn es beispielsweise als Fusionsprotein erhalten wurde, in dem das gewünschte Protein mit einem anderen Protein über einen Glutaminsäurerest verknüpft ist, durch Spalten mit einem solchen Enzym ausgeschnitten werden. Daher wäre die Bereitstellung weiterer Proteasen mit diesem Typ enzymatischer Aktivität, zusätzlich zu den oben genannten, äußerst vorteilhaft.
WO 91/13553 und WO 91/13554 offenbaren jeweils Proteasen, die eine Aminosäuresequenz von Serin an Position +1 bis zu Glutamin an Position +222 von SEQ ID NO: 1 enthält.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der erste Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung einer DNA-Sequenz, die ein Proteasemolekül kodiert, das eine Aminosäuresequenz von Serin an Position +1 bis Glutamin an Position +222 der SEQ ID NO: 1 enthält und das in Polypeptiden die Peptidbondung an den Carboxytermini der Glutaminsäurereste spaltet, wobei die DNA-Sequenz eine Basensequenz der SEQ ID NO: 1 vom Thyminrest an der Position 605 bis zum Adeninrest an der Position 1270 besitzt.
Der zweite Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung einer Protease, die eine Aminosäuresequenz von Serin an Position +1 bis Glutamin an Position +222 der SEQ ID NO: 1 enthält, umfassend:

(i) Isolieren einer DNA-Sequenz, welche die Protease kodiert aus einem Bacillus lichenformis-Stamm ATCC 14580;
(ii) Konstruieren eines Expressionsvektors, der die DNA-Sequenz enthält;
(iii) Transformieren eines Wirts mit dem Expressionsvektor und Gewinnen eines Transformanten; und
(iv) Kultivieren des Transformanten in einem Kulturmedium und Gewinnen der erzeugten Protease aus dem Kulturmedium.

Die o. g. Protease, welche die erörterten und zahlreiche weitere Nachteile und Mängel des Stands der Technik überwindet, stammt aus Bacillus licheniformis. Die Protease spaltet in Polypeptiden an den Carboxytermini der Glutaminsäureresten die Peptidbindungen und sie enthält eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 von Serin an Position +1 bis Glutamin an Position +222.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammt die Protease aus Bacillus licheniformis ATCC Nr. 14580.
In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt die Protease folgende Eigenschaften:

(1) Optimaler pH-Wert: ungefähr 8,0, und
(2) Stabiler pH-Bereich: pH-Wert 6,5–8,5 bei 25°C.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Protease eine Aminosäuresequenz von Serin an Position +1 bis Glutamin an Position +222 der SEQ ID NO: 1 und spaltet in Polypeptiden an den Carboxytermini von Glutaminsäureresten die Peptidbindungen.
Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz kodiert für die oben genannte Protease.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die DNA-Sequenz die Basensequenz der SEQ ID NO: 1 vom Thyminrest an Position 605 bis zum Adenosinrest an Position 1270.
In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert die DNA-Sequenz eine Protease, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 von N-Formylmethionin an Position –94 bis Glutamin an Position +222 enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die DNA-Sequenz die Basensequenz der SEQ ID NO: 1 vom Thyminrest an Position 323 bis zum Adenosinrest an Position 1270.
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor enthält die oben genannte DNA-Sequenz.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Expressionsvektor in Bakterien der Gattung Bacillus exprimierbar.
Die erfindungsgemäße Transformante ist erhältlich durch Einführen des oben genannten Expressionsvektors in einen Wirt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Wirt ein Stamm der Gattung Bacillus.
Der Fachmann sieht selbstverständlich vielfältige weitere Modifikationen und kann diese leicht ausgeführen, ohne vom Bereich und der Idee der Erfindung abzuweichen. Der Schutzumfang der nachstehenden Ansprüche wird somit nicht durch die Beschreibung beschränkt, sondern die Ansprüche sind vielmehr so auszulegen, dass sie alle patentfähigen und neuen Merkmale der Erfindung abdecken, einschließlich der Merkmale, die von einem Fachmann, an den sich die vorliegende Erfindung wendet, als Äquivalente angesehen werden.
Die hier beschriebene Erfindung löst somit folgende Aufgaben:

(1) Die Bereitstellung einer Protease mit einer Enzymaktivität für die spezifische Spaltung von Polypeptiden an den Carboxytermini der Glutaminsäurereste; und
(2) Die Bereitstellung einer für die Protease kodierenden DNA-Sequenz, eines die DNA-Sequenz enthaltenden Expressionsvektors, einer durch Einführung des Expressionsvektors in einem Wirt erhaltenen Transformante, und eines Verfahrens zur Herstellung der Protease mit Hilfe der Transformante.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Es wird nun eingehend die Erfindung und ihre zahlreichen Ziele und Vorteile für den Fachmann mit Bezug auf die nachstehenden Zeichnungen beschrieben. Es zeigt:
1-1 bis 1-3 die DNA-Sequenz der erfindungsgemäßen Protease und die aus der DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz;
2 eine Schemazeichnung von der Konstruktion des erfindungsgemäßen Expressionsvektors pHY300BLtt;
3 eine Schemazeichnung von dem zur Konstruktion des erfindungsgemäßen Expressionsvektors pHY300BLtt verwendeten Shuttle-Vektors pHY300PLKtt.
4 eine Kurve von der Elution des erfindungsgemäßen Enzyms von einer Affinitätssäule in dem Verfahren zur Extraktion und Reinigung des Enzyms aus dem Medium, in dem Bacillus licheniformis ATCC Nr. 14580 kultiviert wurde.
BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Erfinder haben zahlreiche Untersuchungen durchgeführt mit dem Ziel, eine Protease aus einem anderen Mikroorganismen als dem o. g. Staphylococcus aureus etc. zu erhalten, welche eine Enzymwirkung besitzt, mit der in Peptiden an den Carboxytermini von Glutaminsäureresten gespalten werden kann. Die Erfinder habe im Ergebnis dieser Arbeiten eine Protease aufgefunden, die aus Bacillus licheniformis ATCC Nr. 14580 stammt und die oben genannte Eigenschaft besitzt.
Zudem haben die vorliegenden Erfinder auch eine für diese Protease kodierende DNA-Sequenz und einen die DNA-Sequenz enthaltenden Expressionsvektor sowie eine durch Einführung des Expressionsvektors in einen Wirt erhaltene Transformante gefunden, und sie haben ein Verfahren zur Herstellung dieser Protease unter Verwendung der Transformante entwickelt, wodurch die vorliegende Erfindung vollendet wurde.
Die Protease (nachfolgend bezeichnet mit BLase) wird von Bakterien der Gattung Bacillus, insbesondere von Bacillus licheniformis ATCC Nr. 14580 produziert. Dieser Stamm ist bei der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich.
I. Kulturbedingungen
Für die Kultivierung des zuvor genannten bakteriellen Stammes ist kein spezielles Medium erforderlich, und jedes der zahlreichen herkömmlichen Typen von Kulturmedium ist für diesen Zweck geeignet. Beispielsweise kann ein Medium verwendet werden, welches Glucose, Sojabohnenmehl, Fleischextrakt, Maisquellwasser und die verschiedenen anorganischen Salze etc. enthält. Der geeignete pH-Wert des Mediums liegt zwischen 5 und 9, vorzugsweise bei ungefähr 7,0, die geeignete Temperatur des Mediums liegt zwischen 15 und 50°C, vorzugsweise bei ungefähr 28°C, und die Bakterien werden z. B. unter Rühren oder Schütteln für eine Zeitdauer von ungefähr 36 Stunden aerob kultiviert. Das Enzym BLase wurde in erster Linie extrazellulär sekretiert.
Gewinnung des Enzyms
Es können bekannte Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Enzymen angewendet werden, entweder allein oder in Kombination, um das vorliegende Enzym aus der zuvor genannten Kulturbrühe zu gewinnen und aufzureinigen. Beispielsweise kann die Kulturbrühe einer Filterpressung, einer Ultrafiltration, und einer zentrifugalen Trennung unterworfen werden, wodurch ein zellfreies flüssiges Konzentrat erhalten wird. Das Enzym kann anschließend aus diesem Konzentrat durch ein geeignetes Verfahren der Reinigung erhalten werden. Beispielsweise kann das zuvor genannte Konzentrat zuerst einer vorläufigen Reinigung durch Ionenaustauschchramatographie und anschließend einer Chromatographie mit S-Sepharose sowie schließlich einer Affinitätschromatagraphie unterworfen werden, wodurch das vorliegende Enzym erhalten wird. In dem nachfolgend dargestellten Beispiel 1 wurde durch diesen Verfahrenstyp eine Enzymprobe mit einer Aktivität von 1,9 × 10³ bis 2,4 × 10³ U/mg erhalten (bestimmt anhand des nachfolgend zur Messung der enzymatischen Aktivität beschriebenen Verfahrens). Diese Enzymprobe wurde zur Bestimmung der nachfolgend beschriebenen Enzymeigenschaften verwendet.
III. Verfahren zur Messung der enzymatischen Aktivität
Z-Phe Leu Glu-pNA (wobei Z eine Carbobenzoxygruppe und pNA eine p-Nitroanilingruppe sind), was als Substrat verwendet wird, wird in 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5, enthaltend 2 mM Calciumchlorid und 2% DNF) so gelöst, daß die Endkonzentration des Substrats 0,2 mM beträgt. Dieser Mischung wird eine Enzymlösung zugegeben, und es wird eine Umsetzung für eine Dauer von 10 Minuten bei 37°C durchgeführt, wonach sich die Messung der Absorption des durch die enzymatische Reaktion in die Flüssigkeit freigesetzten p-Nitroanilins bei 410 nm anschließt. Die bei einer Absorption von 1,0 vorhandene enzymatische Aktivität wird als 1 Einheit (U) definiert.
IV. Enzymeigenschaften
Die enzymatischen Eigenschaften und proteinchemischen Eigenschaften der BLase sind wie folgt:
(1) Enzymatische Wirkung und Substratspezifität

(i) Die in Tabelle 1 dargestellten synthetischen Substrate wurden hergestellt, und jedes von ihnen wurde in 50 ml Tris-HCl (pH-Wert 7,5, enthaltend 2 mM Calciumchlorid und Dimethylfarmamid (DMF) oder Dimethylsulfoxid (DMSO) in den in Tabelle 1 angegebenen Verhältnissen gelöst), um die in der Tabelle 1 angegebene Konzentration zu erhalten. Anschließend wurde das vorliegende Enzym dieser Lösung zugegeben, und es erfolgte eine Umsetzung bei 25°C. Die Absorption des durch die enzymatische Reaktion in die Flüssigkeit freigesetzten p-Nitroanilins bei 410 nm wurde gemessen, und die aus 1 mg des Substrats pro Minute freigesetzte Menge (nMol) an p-Nitroanilin wurde berechnet. Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
(ii) Als Proteinsubstrat wurde eine oxidierte Insulin B-Kette ausgewählt, und die Wirkungen des vorliegenden Enzyms und der von Staphylococcus aureus abgeleiteten V8-Protease auf dieses Substrat wurden anhand der folgenden Vorgehensweisen verglichen. Zunächst wurde die oxidierte Insulin B-Kette in 50 mM Ammoniumbicarbonat (pH-Wert 7,8) gelöst, und das vorliegende Enzym oder die zuvor genannte V8-Protease wurde zugegeben, um ein Verhältnis zwischen Enzym und Substrat von 1/100 (Gew./Gew.) zu erhalten, und es erfolgte eine Umsetzung über einen vorgeschriebenen Zeitraum. Die Reaktionsmischung wurde anschließend einer HPLC zugeführt unter Verwendung einer mit Vydac Protein C₄ (300 Angström) gepackten Säule von 4,6 × 250 mm, welche unter einem linearen Acetonitrilgradienten von 0–50% in 0,1% TFA eluiert wurde, wobei die Konzentration an Acetonitril um 1,67% pro Minute erhöht wurde. Eine Peptidkartierung ergab bei Verwendung des einen oder anderen Enzyms, daß die Peptidbindungen an den Carboxy-Termini der Glutaminsäurereste gespalten waren, und daß die Produkte der durch die beiden Enzyme induzierten enzymatischen Hydrolyse identisch waren.

Demgemäß zeigten die Ergebnisse der zuvor genannten Analysen (i) und (ii), daß das vorliegende Enzym Peptidbindungen an den Carboxy-Termini von Glutaminsäureresten spaltet und tatsächlich eine für Glutaminsäure spezifische Endopeptidaae ist.
(2) Optimaler pH-Wert und stabiler pH-Bereich
Z-Phe Leu Glu-pNA als Substrat wurde in 50 mM Tris-HCL enthaltend 10% DMF und 2 mM Calciumchlorid gelöst. Anschließend wurde das vorliegende Enzym dieser Mischung zugegeben, und eine Umsetzung erfolgte 15 Minuten lang bei 37°C, wonach die Absorption des durch die enzymatische Umsetzung in die Flüssigkeit freigesetzten p-Nitroanilins bei 410 nm gemessen wurde. Die vorgenannte Umsetzung wurde bei verschiedenen pH-Werten durchgeführt, und die Ergebnisse ergaben, daß der für die enzymatische Aktivität optimale pH-Wert 8,0 beträgt.
Anschließend beließ man das vorliegende Enzym 24 Stunden lang bei 25°C bei verschiedenen pH-Werten, und in jedem Fall gestattete man dem Enzym nach dieser Behandlung die Umsetzung mit einem Substrat in Übereinstimmung mit den im Zusammenhang mit dem oben beschriebenen Verfahren zur Messung der enzymatischen Aktivität beschriebenen Vorgehensweisen. Die Ergebnisse zeigen, daß der stabile pH-Bereich des vorliegenden Enzyme bei etwa 4,0–10,0 liegt. Innerhalb eines pH-Bereichs von 6,5–8,5 verbleibt die enzymatische Aktivität bei 100%, und innerhalb von pH-Bereichen von mehr als 4,0 bis weniger als 6,5, und von mehr als 8,5 bis 10,0 wird die enzymatische Aktivität bei 80–100% gehalten.
(3) Thermische Stabilität
Das vorliegende Enzym wurde 15 Minuten lang bei verschiedenen Temperaturen in einer Pufferlösung gehalten, die 2 mM Calciumchlorid bei pH-Wert 7,8 enthielt. In jedem Fall gestattete man dem Enzym nach dieser Behandlung die Vernetzung mit einem Substrat in Übereinstimmung mit den im Zusammenhang mit dem oben beschriebenen Verfahren zur Messung der enzymatischen Aktivität beschriebenen Vorgehensweisen. Die Ergebnisse zeigten, daß das vorliegende Enzym unter den vorgenannten Bedingungen bei Temperaturen bis zu 60°C stabil ist. Wenn das vorliegende Enzym in ähnlicher Weise in Lösungen gehalten wurde, die kein Calciumchlorid enthielten, war es bei Temperaturen bis zu 50°C stabil.
(4) Effekt von Inhibitoren
Das vorliegende Enzym wird durch Diisopropylfluorophosphat (DFP) vollständig inhibiert. Diese Tatsache zeigt, daß das vorliegende Enzym als Serinprotease klassifiziert ist.
Das vorliegende Enzym wird auch durch Z-Phe Leu Glu CH₂Cl vollständig inhibiert. Diese Tatsache zeigt, daß das vorliegende Enzym eine für Glutaminsäure spezifische Endopeptidase ist.
Das vorliegende Enzym wird durch EDTA partiell inhibiert, wobei die maximale Inhibierungsrate ungefähr 72% beträgt. Dieser inhibierende Effekt von EDTA wird durch Zugabe von Metallionen in niedrigen Konzentrationen (10^–4 bis 10^–3 M Calcium- oder Magnesiumionen etc.) vollständig aufgehoben.
Die vorgenannten Tatsachen zeigen, daß das vorliegende Enzym eine typische Serinprotease ist, deren Stabilität mit der Anwesenheit von Metallionen zusammenhängt.
(5) Molekulargewicht
Das Molekulargewicht des vorliegenden Enzyms wurde durch SDS-PAGE unter Verwendung eines 15%igen Gels (1,0 mm) und Rainbow^TM Protein Molecular Weight Marker (Amersham) bestimmt und mit 26000 berechnet. Das Molekulargewicht wurde ferner ausgehend von der Aminosäuresequenz berechnet, die auf der Basis der nachfolgend beschriebenen Analyse der Gensequenzierung bestimmt worden ist, und der auf diese Weise erhaltene Wert betrug 23567 und weicht damit in gewisser Weise von dem mittels SDS-PAGE ermittelten vorgenannten Wert ab. Dennoch stimmten die Ergebnisse der verschiedenen nachfolgend beschriebenen proteinchemischen Analysen (Aminosäurezusammensetzung, aminoterminale Sequenzen, Aminosäurezusammensetzung in der Nähe des Carboxy-Terminus) gut mit der von der DNA-Sequenz abgeleiteten Struktur überein. Dies zeigt, daß das durch SDS-PAGE erhaltene Molekulargewicht den wahren Wert tatsächlich leicht übersteigt.
(6) Isoelektrischer Punkt
Eine Untersuchung des isoelektrischen Punkts des vorliegenden Enzyms unter Anwendung des Pharmacia FAST Systems (Pharmalite, pH-Wert 3,0–10,0) ergab pH-Werte von über 9,0, wobei ein normaler Wert nicht erhalten werden konnte.
(7) Aminosäurezusammensetzung
Unter Verwendung von 4 M Methansulfonsäure (enthaltend 0,2% 3-(2-Aminoethyl)indol) wurde das vorliegende Enzym für die Dauer vorgegebener Zeiträume (24, 48 oder 72 Stunden) bei 110°C hydrolysiert. Die entsprechenden Hydrolysate wurden anschließend einer Aminosäureanalyse zugeführt, wobei das Aminosäureanalysegerät Modell 835 von Hitachi verwendet wurde. Die Ergebnisse dieser Analyse, die hinsichtlich des Abbaus von Aminosäuren während der Hydrolyse korrigiert sind, sind in Tabelle 2 dargestellt. Die auf der. DNA-Sequenz des vorliegenden Enzyms (nachfolgend dargelegt) berechnete Aminosäurenzuammensetzung ist in Tabelle 2 für Vergleichszwecke ebenfalls dargestellt. Die beiden Ergebnisse zeigen deutlich eine gute Obereinstimmung.
Tabelle 2 Aminosäurezusammensetzung
(8) Partielle Aminosäuresequenzen
(i) Aminosäuresequenz nahe dem N-Terminus
Es wurde ein Modell 477A Protein Sequencar (Applied Biosystems) verwendet, um die Aminosäuresequenz des vorliegenden Enzyms in der Nähe des Amino-Terminus zu analysieren. Die verwendeten Enzymproben wurden zuvor mit DFP inhibiert. Die Aminosäuresequenz vom Amino-Terminus des 23. Restes ist in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3
(ii) Aminosäuresequenz nahe dem C-Terminus
Zuvor mit DFP inhibierte Proben des vorliegenden Enzyms wurden einer Reaktion mit Carboxypeptidase A (CPase A) oder Carboxypeptidase Y (CPase Y) ausgesetzt, und die durch diese Reaktionen freigesetzten Mengen an Aminosäuren wurden gemessen mit dem Aminosäureanalysiergerät Modell 835 von Hitachi. Unter Verwendung der zuvor genannten Carboxypeptidasen konnte jedoch die Aminosäuresequenz in der Nähe des Carboxy-Terminus des vorliegenden Enzyms nicht genau bestimmt werden. Dennoch wurde die Anwesenheit von Glutamin, Serin, Alanin und Asparagin in der Nähe des Carboxy-Terminus bestätigt.
V. Bestimmung der für BLase kodierenden DNA Sequenz
Die im Rahmen der Beschreibung der vorliegenden Erfindung verwendete bestimmte Terminologie wird wie folgt definiert.
"Oligonukleotid" bezieht sich auf ein kurzes einzelsträngiges DNA-Molekül. Oligonukleotide können nach bekannten Verfahren chemisch synthetisiert werden. Sofern nicht anders angegeben, werden die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Oligonukleotide chemisch synthetisiert und gereinigt durch Geichromatograghie unter Verwendung von Sephadex G50 und durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einer Umkehrphasen-Silikagel-Säule.
"PCR" ist eine Abkürzung für "Polymerase-Kettenreaktion" und bezieht sich auf ein Verfahren zur enzymatischen Amplifikation einer bestimmten DNA-Region (Saiki et al., Science, 239, 487–497, 1988). Zunächst wird die zu amplifizierende DNA durch thermische Denaturierung in ihre einzelsträngige Form überführt, und Oligonukleotid-Primer (zwei Typen, d. h. Sense- und Antisense-Stränge, wobei jeder eine zur 3'-terminalen Region der einzelsträngigen DNA komplementäre Sequenz aufweist) werden an die Regionen an den entsprechenden 3'-Termini, der einzelaträngigen DNA (d. h. der Template-DNA) anneliert. Anschließend erfolgt die Extension der DNA-Stränge ausgehend von den entsprechenden Primern durch eine Reaktion unter Verwendung von DNA-Polymerase. Durch Wiederholung dieser Reaktionsschritte kann die Target-DNA um einen Faktor von 100000 bis 1000000 amplifiziert werden.
"Southern-Blotting" ist ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein spezifiziertes Gen in einem durch Spaltung mit einem bestimmten Restriktionsenzym erhaltenen DNA-Fragment enthalten ist oder nicht. Das Southern-Blotting wird durchgeführt, indem die zu untersuchende DNA-Probe zunächst mit einem Restriktionsenzym gespalten wird, welches eine bestimmte Basensequenz in Duplex-DNA in spezifischer Weise erkennt und diese DNA an spezifischen Stellen schneidet. Die auf diese Weise erhaltenen Spaltprodukte werden einer 1%igen Agarose-Gelelektrophorese zugeführt, anschließend durch Alkalibehandlung zu einzelsträngiger DNA denaturiert und nachfolgend auf ein Nylonfilter überführt. In einem getrennten Ansatz wird ein Oligonukleotid oder DNA-Fragment, welches einen Teil des fraglichen Gens darstellt, hergestellt und zum Erhalt einer Sonde markiert. Anschließend wird eine Hybridisierung der einzelsträngigen DNA auf dem Nylonfilter mit dieser Sonde durchgeführt, um die Anwesenheit des interessierenden Gens nachzuweisen.
"Ligation" bezieht sich auf die Bildung von Phasphodiesterbindungen zwischen zwei Duplex-DNA-Fragmenten. Bei dieser Technik wird eines der Fragmente zur Vermeidung einer Selbst-Ligation der Duplex-DNA-Fragmente zuvor einer Behandlung zur Dephosphorylierung mittels üblicher Verfahren zugeführt (T. Maniatis et al., "Molecular Cloning", 133–134, 1982). Die Ligation kann mit T4 DNA-Ligase erfolgen unter Anwendung bekannter Pufferlösungen und Reaktionsbedingungen.
"Transformation" bezieht sich auf das Phänomen, durch das der Genotyp einer Zelle (d. h. einer Wirtszelle) durch Einführung von exogenen Genen (DNA) in die besagte Zelle transformiert wird. Eine Zelle, die eine derartige Transformation durchlaufen hat, ist als "Transformante" bekannt und ist charakterisiert durch die Fähigkeit zur Replikation der exogenen DNA entweder als extranukleäre Komponente oder als in die Chromosomen der besagten Zelle integrierte Form.
Als nächstes werden die zur Bestimmung der DNA-Sequenz von BLase der vorliegenden Erfindung angewendeten Verfahrensschritte in der Reihenfolge ihrer Durchführung beschrieben. Diese DNA-Sequenz wurde bestimmt durch Analyse der genomischen DNA des Bacillus licheniformis ATCC Nr. 14580 unter Anwendung einer Kombination von PCR-Analyse, Southern-Blotting, direkten Sequenzierungstechniken etc.
(1) PCR-Analyse der genomischen DNA-Sequenz
Eine für BLase kodierende DNA-Sequenz kann z. B. auf genomischer DNA erhalten werden. Um die DNA zu erhalten, wird die genomische DNA von Bacillus licheniformis ATCC Nr. 14580 zu nächst aus kultivierten Zellen des besagten Stammes anhand üblicher Techniken isoliert (M. Stahl et al., J. Bacteriology, 154, 406–412, 1983). Diese genomische DNA wird als Template-DNA für die PCR-Analyse verwendet. Die zur PCR verwendeten Oligonukleotid-Primer werden mittels herkömmlicher Verfahren auf der Grundlage der Aminosäuresequenz in der Nähe des Amino-Terminus des gereinigten Enzyms, bestimmt im obigen Abschnitt IV unter (8), und/oder der Aminosäuresequenzen der durch partielle Hydrolyse des Enzyms erhaltenen Peptide synthetisiert. Beispielsweise wird das für die Aminosäuresequenz Thr Asn Thr Thr Ala Tyr Pro Tyr kodierende Oligonukleotid, welches mit den vom Amino-Terminus von BLase bestimmten Positionen 12 bis 19 (s. Tabelle 3) korrespondiert, als Sense-Primer BL8 verwendet (dargestellt in SEQ ID NO: 2). Dieses Oligonukleotid ist ein Tricosamer, welches für die Aminosäuresequenz bis zur zweiten Base des Triplett-Kodons für den Tyrosinrest des C-Terminus kodiert.
In einem getrennten Ansatz wird ein anderer Oligonukleotid-Primer synthetisiert auf der Grundlage eines Peptids, welches durch Abbau des gereinigten Enzyms durch Lysylendopeptidase erhalten und anschließend sequenziert wurde, wobei die Sequenz äußerst zuverlässig ist. Wie im folgenden Beispiel 2 beschrieben, wird die Sequenz Gly Tyr Pro Gly Asp Lys (SEQ Id NO: 8) erhalten, und damit wird das zu einem für diese Aminosäuresequenz kodierenden Oligonukleotid komplementäre Octadecamer als Antisense-Primer BL83 verwendet (dargestellt in SEQ ID NO: 3).
Anschließend wird eine PCR durchgeführt unter Verwendung der vorgenannten genomischen DNA, des Sense-Primers BL8 und des Antisense-Primers BL83, wodurch die Target-DNA-Stränge in der genomischen DNA verlängert und amplifiziert werden. Die auf diese Weise erhaltenen PCR-Produkte werden einer Agarose-Gelelektrophorese zugeführt, wodurch ein DNA-Fragment von ungefähr 370 Bp erhalten wird. Dieses DNA-Fragment wird in einen geeigneten Vektor eingefügt, und die Basensequenz des Fragments wird nach Subklonierung anhand der Sanger-Technik bestimmt. Die vorgenannte Aminosäuresequenz Gly Tyr Pro Gly Asp Lys, welche die Basis zur Herstellung des Antisense-Primers BL83 bildete, wurde als diejenige identifiziert, die an den Positionen 131 bis 136 der Aminosäuresequenz von BLase lokalisiert ist.
(2) Analyse von genomischer DNA mittels Southern-Blotting
Die oben unter (1) hergestellte, von Bacillus licheniformis ATCC Nr. 14580 abgeleitete genomische DNA wird mit dem Restriktionsenzym SalI gespalten, und nach Auftrennung durch Agarose-Gelelektrophorese werden die auf diese Weise erhaltenen DNA-Fragmente auf ein Nylonmembranfilter geblottet und unter Anwendung der Southern-Technik analysiert. Die zur Hybridisierung verwendete Sonde ist das oben unter (1) erhaltene BL8-BL83 PCR-Produkt, markiert mit ³²P-dCTP mittels üblicher Verfahren. Das DNA-Fragment, welches eine positive Hybridisierung zu diesem BL8-BL83 Produkt zeigt, wird als Bande erkannt, die mit einer Länge von ungefähr 3,1 kB korrespondiert.
(3) Sequenzierung der genomischen DNA mittels PCR
Die oben unter (1) erhaltene genomische DNA des Bacillus licheniformis ATCC Nr. 14580 wird mit SalI gespalten, und dieses Spaltprodukt wird in einen geeigneten Vektor wie z. B. den Vektor pUC119 eingeführt, und eine PCR wird durchgeführt unter Verwendung eines Teiles der bekannten DNA-Sequenz als Primer. Beispielsweise wird als Sense-Primer RV ein Teil der stromaufwärts der vorgenannten genomischen DNA lokalisierten DNA-Sequenz von pUC119 verwendet (dargestellt in SEQ ID NO: 4), und eine zu einer Sequenz in der Nähe des 3'-Terminus des oben unter (2) analysierten DNA-Fragments von 375 Bp komplementäre DNA-Sequenz wird als Antisense-Primer B125 verwendet (dargestellt in SEQ ID NO: 5).
Durch Anwendung der PCR wird ein DNA-Fragment von ungefähr 1050 Bp erhalten. Die Basensequenz dieses Fragments kann mittels direkter DNA-Sequenzierung bestimmt werden (Gibbs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1919–1923, 1989). Auf diese Weise kann die für BLase kodierende DNA-Sequenz vom Amino-Terminus bis zum mittleren Bereich der Sequenz ermittelt werden.
Als nächstes kann der Teil der Sequenz auf der 3'-Seite der genomischen DNA durch die folgende Vorgehensweise bestimmt werden. Zunächst wird die genomische DNA von Bacillus licheniformis ATCC Nr. 14580 in derselben Weise wie oben dargelegt mit SalI gespalten, und ein Fragment von ungefähr 3,1 kB wird isoliert. Dieses wird in M13mp11 insertiert, wonach sich eine PCR anschließt. Die für diese PCR verwendeten Primer sind partielle Fragmente des oben unter (2) analysierten DNA-Fragments von 375 Bp; einer ist der Sense-Primer B40 (dargestellt in SEQ ID NO: 6), der stromaufwärts des vorgenannten Antisense-Primers B125 lokalisiert ist, und der andere ist der Antisense-Primer M4 (dargestellt in SEQ ID NO: 7), der eine DNA-Sequenz aufweist, die zu einem Teil der DNA-Sequenz von M13mp11 komplementär und stromabwärts der genomischen DNA lokalisiert ist.
Die vorgenannte PCR ergibt ein DNA-Fragment von ungefähr 2,2 kB. Die Basensequenz dieses DNA-Fragments kann durch direkte DNA-Sequenzierung bestimmt werden. Auf diese Weise wird die Basensequenz vom 3'-Terminus bis zum mittleren Bereich der genomischen DNA bestimmt.
Die aus diese Weise bestimmte vollständige DNA-Sequenz von BLase wie auch die von dieser DNA-Sequenz bestimmte Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NO: 1 und 1 dargestellt. Aus der SEQ ID NO: 1 und der 1 ist ersichtlich, daß das für das aus Bacillus licheniformis abgeleitete reife Protein kodierende Gen eine DNA-Sequenz, die für ein Signalpeptid kodiert, das aus den 94 Aminosäureresten vom N-Formylmethioninrest an der Position –94 bis zum Lysinrest an der Position –1 zusammengesetzt ist, und eine DNA-Sequenz enthält, die für das reife Protein kodiert, welches aus den 222 Aminosäureresten vom Serinrest an der Position +1 bis zum Glutaminrest an der Position +222 zusammengesetzt ist. Gewöhnlich kodiert ATG für ein Methionin, aber in diesem Fall scheint TTG (fMet) das Translationsstartkodon zu sein. Im 332 Bp langen Segment der 5'-untranslatierten Region beginnend an der SalI-Spaltstelle gibt es eine Promotorregion, die eine -35-Sequenz, eine Pribnow-Box sowie eine Shine-Dalgarno-Sequenz enthält, welche 9 Basen stromaufwärts des zuvor genannten Translationsstartkodons TTG vorhanden ist. In der 3'-untranslatierten Region ist 8 Basen stromabwärts des Stopkodons TAA eine umgekehrte komplementäre Wiederholung bestehend aus 13 Basenpaaren lokalisiert.
VI. Herstellung von Expressionsvektoren
Wie in 2 dargestellt, wird pHY300BLtt als Beispiel der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren aus dem Shuttle-Vektor pHY300PLKtt erhalten, welcher einen von Bacillus subtilis ATCC Nr. 6051 abgeleiteten Terminator für die alkalische Protease enthält, indem ein in der SEQ ID NO: 3 dargestelltes, für die BLase kodierendes DNA-Fragment (d. h. ein DNA-Fragment, das einen Promotor, eine für ein Signalpeptid kodierende DNA-Sequenz, eine für das reife Peptid von BLase kodierende DNA-Sequenz und einen Terminator enthält) in den Vektor pHY300PLKtt insertiert wird. Wie in 3 dargestellt, wird der vorgenannte Vektor pHY300PLKtt von einem Vektor pHY300PLK erhalten, welcher ein Shuttle-Vektor von E. coli und B. subtilis ist, indem ein von Bacillus subtilis ATCC Nr. 6051 abgeleiteter Terminator für die alkalische Protease in den Vektor pHY300FLK insertiert wird.
Die vorgenannte Vorgehensweise wird nun in der Reihenfolge der beteiligten Verfahrensschritte eingehender erklärt. Zunächst wird die genomische DNA, wie in 3 dargestellt, aus dem Bacillus subtilis ATCC Nr. 6051 durch das Verfahren von M. Stahl et al. (oben) isoliert und als Template-DNA eingesetzt. Anschließend werden ein Fragment, das aus einer DNA-Sequenz, welche mit der Nähe des 5'-Terminus des von Bacillus subtilis I-168 abgeleiteten Terminatorbereichs des Gens für alkalische Protease korrespondiert, und einer hinzugefügten XbaI-Spaltstelle zusammengesetzt ist, und ein Fragment, das zu einer DNA-Sequenz komplementär ist, welche mit der Nähe des 3'-Terminus des Terminatorbereichs korrespondiert, mit einer hinzugefügten HindIII-Spaltstelle, chemisch synthetisiert, und eine PCR wird durchgeführt unter Verwendung dieser Fragmente als Primer. Das auf diese Weise erhaltene DNA-Fragment wird anschließend mit XbaI und HindIII gespalten, wodurch ein in 3 dargestelltes Fragment (1) erhalten wird. Anschließend wird pHY300PLK mit XbaI und HindIII gespalten, wodurch das in 3 dargestellte größere Fragment (2) erhalten wird. Der Shuttle-Vektor pHY300PLKtt, der den von Bacillus subtilis ATCC 6851 abgeleiteten Terminator für die alkalische Protease enthält, wird anschließend durch Ligation dieser Fragmente (1) und (2) hergestellt.
Als nächstes wird genomische DNA aus von Bacillus licheniformis ATCC Mr. 14580 abgeleiteten kultivierten Zellen isoliert und als Template-DNA verwendet, Anschließend werden ein Fragment, das aus einer mit der Nähe des 5'-Terminus dieser Template-DNA korrespondierenden DNA-Sequenz mit einer hinzugefügten EcoRI-Spaltstelle zusammengesetzt ist, und ein Fragment, das zu derjenigen DNA-Sequenz komplementär ist, welche mit dem 3'-Terminus der Template-DNA korrespondiert, mit einer hinzugefügten XbaI-Spaltstelle, synthetisiert und als Sense- bzw. Antisense-Primer verwendet. Unter Verwendung der vorgenannten Template- DNA, des Sense-Primers und des Antisense-Primers wird eine FCR durchgeführt. Anschließend wird das auf diese Weise erhaltene Fragment mit EcoRI und XbaI gespalten, wodurch ein für BLase kodierendes DNA-Fragment (3) erhalten wird (s. 2). Dieses Fragment (3) enthält einen Promotor, eine für ein Signalpeptid kodierende DNA-Sequenz, eine für reife BLase kodierende DNA-Sequenz und einen Terminator. Als nächstes wird der vorgenannte Vektor pHY300PLKtt mit EcoRI und XbaI gespalten, wodurch das größere Fragment (4) erhalten wird. Anschließend wird der erfindungsgemäße Expressionsvektor pHY300BLtt erhalten durch Ligation der vorgenannten Fragmente (3) und (4) (s. 2).
Dieser Expressionsvektor pHY300BLtt enthält, unter der Kontrolle des BLase-Promotors, eine DNA-Sequenz, die für das Signalpeptid vom M-Formylmethioninrest an der Position –94 bis zum Lysinrest an der Position –1 kodiert, sowie eine DNA-Sequenz, die für ein reifes Peptid kodiert, welches vom Serinrest an der Position +1 bis zum Glutaminrest an der Position +222 von BLase reicht, und eine einen Terminator umfassende 3'-untranslatierte Region. Noch weiter stromabwärts befindet sich der von Bacillus subtilis ATCC Nr. 6051 abgeleitete Terminator für die alkalische Protease.
VII. Herstellung von Transformanten und Herstellung von BLase
Der im obigen Abschnitt VI erhaltene Expressionsvektor wird durch übliche Verfahren in geeignete Wirtszellen eingeführt. Beispielsweise kann der vorgenannte Vektor pHY300BLtt durch das Verfahren von J. Spiezen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 44, 1072, 1958) in Bacillus subtilis ISW1214 (Takara Shuzo) eingeführt werden. Die Transformante (Bacillus subtilis pHY300BLtt/ISW1214) wird in irgendeinem für den Wirt geeigneten Medium kultiviert, wodurch die BLase produziert wird. Schließlich wird BLase aus der Kulturbrühe, in der die Transformante kultiviert werden ist, isoliert und unter Anwendung des im obigen Abschnitt II beschriebenen Verfahrens gereinigt.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die spezifischen Beispiele weiter ausgeführt.
Beispiel 1
Bacillus licheniformis ATCC Nr. 14580 wurde 36 Stunden lang bei 28°C in einem Medium mit einem pH-Wert von 7,0 kultiviert, das 2,0% Glucose, 2,0% Sojabohnenmehl, 0,25% Maisquellwasser, 0,5% Ammoniumsulfat, 0,05% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,01% Eisen(II)-sulfat-Heptahydrat und 0,3% Calciumcarbonat enthielt. 95 l der Kulturbrühe wurden mittels Filterpresse filtriert und auf ungefähr 14 l konzentriert durch Anwendung eines Ultrafiltrationsmoduls (Nitto Ultrafiltration Module NTU 2020T P18B (HF); Ausschlußgröße MW 20000) und einer Zentrifuge (4200 UpM, 30 Minuten). Diese konzentrierte zellfreie Brühe wurde mit 2 mM Calciumchlorid auf ungefähr 28 l verdünnt (1,90 ms/cm). Anschließend wurde der pH-Wert der verdünnten zellfreien Brühe durch Zugabe von Salzsäure auf 6,0 eingestellt. Hierzu wurden ungefähr 4 l Amberlite CG-50 gegeben, die mit einem 10 mM Acetatpuffer (pH-Wert 6,0) enthaltend 2 mM Calciumchlorid equilibriert worden waren, und die Mischung wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Der Überstand wurde verworfen, nachdem festgestellt worden war, daß der Überstand keine BLase-Aktivität aufwies. Anschließend wurde das Amberlite CG-50 in eine Glassäule von 14 × 32 cm gepackt. Nach dem Waschen mit ungefähr 10 l 10 mM Acetatpuffer (pH-Wert 6,0) enthaltend 2 mM Calciumchlorid erfolgte die Elution mit 0,5 M Natriumacetatpuffer (pH-Wert 8,5), welcher ebenfalls 2 mM Calciumchlorid enthielt.
Die von dem Amberlite CG-50 eluierten Fraktionen mit BLase-Aktivität wurden vereinigt (das Gesamtvolumen der Fraktionen betrug 2,7 l) und gegen Wasser 48 Stunden lang dialysiert. Das Dialysat wurde mit 2 mM Calciumchlorid auf 8 l verdünnt (2,23 ms/cm), und die Flüssigkeit wurde nach Einstellung des pH-Wertes auf 6,0 an ungefähr 800 ml S-Sepharose adsorbiert, das sich in einer Säule von 5 × 40 cm befand, die zuvor mit einer 2 mM Calciumchlorid enthaltenden 5 mM Acetatpufferlösung (pH-Wert 6,0) equilibriert worden war. Nach dem Waschen mit ungefähr 5 l Pufferlösung mit derselben Zusammensetzung wie derjenigen, die für die oben genannte Equilibrierung eingesetzt worden war, wurde die Säule mit 7 l dieser Pufferlösung unter einem linearen Natriumchlarid-Gradienten von 0–0,2 M eluiert. Die Fraktionen mit BLase-Aktivität wurden vereinigt (das Gesamtvolumen der Fraktionen betrug 900 ml) und über Nacht gegen eine 2 mM wäßrige Lösung von Calciumchlorid dialysiert, wodurch ungefähr 950 ml Dialysat erhalten wurden (0,86 ms/cm). Der pH-Wert dieses Dialysats wurde auf 7,5 eingestellt und es wurde anschließend unverzüglich eine Affinitätschromatographie durchgeführt. Der für diese Affinitätschromatograhie verwendete Träger bestand aus ungefähr 340 ml CH-Sepharose 4B (Phe Leu-D-GluOMe), gepackt in eine Säule von 3 × 48 cm, und equilibriert mit 5 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5) enthaltend 2 mM Calciumchlorid. Mach dem Adsorbieren des vorgenannten Dialysats an diese Säule wurde die Säule mit ungefähr 5 l Pufferlösung derselben Zusammensetzung wie der zur Equilibrierung der Säule verwendeten gewaschen und anschließend mit 3,5 l der Pufferlösung mit derselben Zusammensetzung unter Anwendung eines linearen Natriumchlorid-Gradienten von 0–0,7 M eluiert.
Die BLase-Aktivität einer jeden auf diese Weise erhaltenen Fraktion wurde durch das in Abschnitt III der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen dargestellte Verfahren zur Messung der enzymatischen Aktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt. Die Absorption einer jeden Fraktion bei 280 nm wurde als Index der Proteinkonzentration gemessen, und die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in 4 dargestellt. Diese Figur zeigt, daß die BLase bei einer Konzentration an Natriumchlorid von ungefähr 0,5 M eluiert wurde. Die auf diese Weise erhaltene BLase zeigte in der SDS-PAGE eine einzelne Bande. Auf diese Weise wurden aus 95 l der Kulturbrühe 833,1 mg Enzymmaterial (quantifiziert mit einem Proteinas say-Kit von BioRad) mit eine spezifischen Aktivität von 1,9 × 10³ – 2 × 10³ U/mg erhalten. Die Ausbeute der enzymatischen Aktivität betrug 27,5%.
Beispiel 2
Bestimmung der Basensequenz der für BLase kodierenden DNA
(1) PCR-Analyse der internen Basensequenz von genomischer DNA 100 μg der mit DFP behandelten und gemäß Beispiel 1 erhaltenen gereinigten BLase wurden 150 μl 0,05 M Tris-HCl (pH-Wert 9,0) enthaltend 1 M Harnstoff zugegeben und mit 1 μg Lysylendopeptidase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 5 Stunden lang bei 37°C gespalten. Der resultierende Enzymverdau wurde anschließend isoliert und gereinigt durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer mit TSKgel ODS-120T (4,6 × 250 mm, Tosoh Co. Ltd.) gepackten Säule. Die auf diese Weise erhaltenen Aminosäuresequenzen der gespaltenen Fragmente wurden mit dem Prote.nsequenziergerät Modell 477A (Applied Biosystems) untersucht, wodurch die Aminosäuresequenzen von fünf Typen von Fragmenten bestimmt wurden. Drei dieser Sequenzen sind nachfolgend sowie in den SEQ ID NOS: 8, 9 und 10 angegeben.
Anschließend wurde durch das Verfahren von M. Stahl et al. (oben) genomische DNA aus Bacillus licheniformis ATCC Nr. 14580 isoliert, und die DNA wurde als Template für die PCR-Analyse verwendet. Die für die PCR verwendeten Qligonukleotid-Primer wurden hergestellt auf der Basis bekannter Bereiche der Aminosäuresequenz der von Bacillus licheniformis ATCC Nr. 14580 produzierten BLase. Zunächst wurde ein Oligonukleotid, das für die Aminosäuresequenz beginnend mit der 12. Position und endend mit der 19. Position vom Amino-Terminus des BLase-Moleküls (s. Tabelle 3) kodiert, d. h. Thr Asn Thr Thr Ala Tyr pro Tyr (mit der Ausnahme, daß das Oligonukleotid sich lediglich über die zweite Base des für den Tyrosinrest an dem Carboxy-Terminus des Oligopeptids kodierenden Tripletts erstreckt, d. h. das Oligonukleotid ist ein Tricosamer) chemisch synthetisiert. Dies wurde als Sense-Primer BL8 (dargestellt in SEQ ID NO: 2) verwendet.
Anschließend wurde ein Octadecamer, das zu der DNA-Sequenz komplementär ist, die für ein Aminosäurefragment kodiert, welches ein in dem vorgenannten Lysylendopeptidase-Verdau erhaltenes Produkt ist, und welches eine Aminosäuresequenz mit dem größten Grad an Verläßlichkeit aufweist [d. h. Gly Tyr Pro Gly Asp Lys (dargestellt in SEQ ID NO: 8)], chemisch synthetisiert. Dies wurde als Antisense-Primer BL83 (dargestellt in SEQ ID NO: 3) verwendet.
Unter Verwendung der vorgenannten Template-DNA und der Qligonukleotid-Primer wurde die DNA anhand des PCR-Verfahrens amplifiziert (Saiki et al., Science 239, 487–491, 1989). Ein Teil der amplifizierten Produkte wurde durch eine 1%ige Agarose-Gelelektrophorese analysiert, wodurch die Anwesenheit eines DNA-Fragments von ungefähr 370 Bp bestätigt wurde. Dieses Fragment wurde isoliert und nach Schaffung glatter Enden durch Verwendung des Klenow-Fragments in M13mp11 kloniert, welcher mit SmaI verdaut worden war, und die DNA-Sequenz des Fragments wurde anhand des Verfahrens von Sanger bestimmt (Sanger et al., Proc. Matt. Acad. Sci. USA, 74, 5463–5467, 1977). Auf diese Weise wurde die Basensequenz eines Fragments von 375 Bp bestimmt, und es wurde gefunden, daß die Aminosäuresequenz, die mit BL83 korrespondiert, an den Positionen 131 bis 136 lokalisiert ist. Ferner fand man heraus, daß die vorgenannten Aminosäuresequenzen (II) und (III) an den Positionen 21 bis 25 bzw. 79 bis 86 lokalisiert sind.
(2) Analyse der genomischen DNA mittels Southern-Blotting
Die von Bacillus licheniformis ATCC Nr. 14580 anhand des oben unter (1) beschriebenen Verfahrens erhaltene abgeleitete genomische DNA wurde mit dem Restriktionsenzym SalI gespalten, und nach Abtrennung der Produkte durch 1%ige Agarose-Gelelektrophoress wurden die DNA-Fragmente auf ein Nylon-Membranfilter geblottet und anhand der Southern-Technik analysiert. Die zur Hybridisierung verwendete Sonde war das oben unter (1) erhaltene PCR-Produkt BL8-BL83, welches mit ³²P-dCTP nach üblichen Verfahren markiert worden war. Das DNA-Fragment, welches zu diesem BL8-BL83-Produkt eine positive Hybridisierung zeigte, wurde als eine Sande erkannt, die mit einer Länge von ungefähr 3,1 kB korrespondiert.
(3) Bestimmung der genomischen DNA-Sequenz mittels PCR
Die oben unter (1) erhaltene genomische DNA von Bacillus licheniformis ATCC Nr. 14580 wurde mit SalI verdaut, und die Enden der Fragmente wurden mit T4 DNA-Polymerase glattendig gemacht. Dieses Fragment mit glatten Enden wurde mit einem dephosphorylierten, SmaI-verdauten pUC119-Vektor ligiert. Diese Ligationsreaktion erfolgte unter Verwendung eines handelsüblichen Kits (Takara Shuzo).
Als nächstes wurden der Sense-Primer RV (dargestellt in SEQ ID NO: 4) und der Antisense-Primer B125 (dargestellt in SEQ ID NO: 5) mit den unten angegebenen Basensequenzen chemisch synthetisiert und einem Aliquot der Reaktionsmischung für die vorgenannte Ligationsreaktion zugegeben, wodurch eine PCR-Reaktion ermöglicht wurde.
Der Sense-Primer RV ist ein Teil der DNA-Sequenz von pUC119 und ist stromaufwärts der vorgenannten genomischen DNA lokalisiert, während der Antisense-Primer B125 eine zu einer Sequenz in der Nähe des 3'-Terminus des oben unter (2) analysierten DNA-Fragments von 375 Bp komplementäre DNA-Sequenz ist.
Durch die vorgenannte FCR wurde ein DNA-Fragment von ungefähr 1050 Bp erhalten. Die Basensequenz dieses Fragments wurde anhand der direkten DNA-Sequenzierung bestimmt (Gibbs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1919–1923, 1989). Auf diese Weise wurde die für das vorliegende Enzym kodierende DNA-Sequenz vom 5'-Terminus bis zum mittleren Bereich der Sequenz ermittelt.
Die oben unter (1) erhaltene genomische DNA von Bacillus licheniformis ATCC Nr. 14580 wurde mit SalI gespalten und einer 1%igen Agarose-Gelelektrophorese zugeführt, wodurch ein Fragment von ungefähr 3,1 kB isoliert wurde. Dieses Fragment wurde mit Hilfe des Klenow-Fragments glattendig gemacht und mit dephosphorylierten, mit SmaI gespaltenen Fragmenten von M13mp11 ligiert. Unter Verwendung dieses Ansatzes als Template wurde eine PCR durchgeführt. Die für diese PCR verwendeten Primer waren der Sense-Primer B40 (dargestellt in SEQ ID NO: 6), welcher ein Teil des oben unter (2) analysierten DNA-Fragments von 375 Bp ist (stromaufwärts des vorgenannten Primers B125), und der Antisense-Primer M4 (dargestellt in SEQ ID NO: 7), welcher eine DNA-Sequenz ist, die zu einem Teil der stromabwärts der genomischen DNA von M13mp11 lokalisierten DNA-Sequenz komplementär ist.
Die vorgenannte PCR ergab ein DNA-Fragment von ungefähr 2,2 kB. Die Basensequenz dieses DNA-Fragments wurde anhand der direkten DNA-Sequenzierung bestimmt. Auf diese Weise wurde die Basensequenz vom 3'-Ende bis zum mittleren Bereich der genomischen DNA bestimmt.
Sowohl die auf diese Weise bestimmte vollständige DNA-Sequenz von BLase als auch die aus der DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz sind in der SEQ ID NO: 1 und den 1-1 bis 1-3 dargestellt.
Die DNA-Sequenz von BLase wie auch die zu der besagten DNA-Sequenz hybridisierenden DNA-Sequenzen sind ebenfalls geeignet zur Herstellung einer Protease mit BLase-Aktivität.
Die DNA-Sequenz, welche zu der DNA-Sequenz von BLase hybridisiert, kann beispielsweise anhand des nachfolgenden Verfahrens erhalten werden.
Zahlreiche DNA-Fragmente, z. B. DNA-Fragmente, die von verschiedenen Organismen abgeleitet sind, werden durch Verwendung der Gesamtheit oder eines Teils der DNA-Sequenz von BLase, z. B. eines DNA-Fragments von 1124 Bp, welches sich von A in Position 248 bis zum T in der Position 1371 der SEQ ID NO: 1 erstreckt, als Sonde einem Screening zugeführt. Beispielsweise wird die Southern-Hybridisierung (E. M. Southern, J. Mol. Biol. 98, 503–517, 1975) unter Verwendung der mit ³²P-markierten Sonde und einem Hybridisierungspuffer der folgenden Zusammensetzung angewendet.
Nach Durchführung der Hybridisierung über Nacht bei 65°C wird ein Filter, an das die Sonde hybridisiert werden ist, viermal bei Raumtemperatur mit 2 × SSC, 0,1% SDS gewaschen, wobei jeder Waschgang viermal für 10 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt wurde, wodurch ein DNA-Fragment erhalten wurde, welches etwa 65% Homologie zu der DNA-Sequenz von BLase aufweist. Wenn der Filter einmal 20 Minuten lang bei 50°C gewaschen wird, kann ein DNA-Fragment erhalten werden, welches etwa 80% Homologie zu der DNA-Sequenz von BLase aufweist.
(4) Herstellung eines Expressionsvektors
(4)-1 Herstellung des Shuttle-Vektors pHY300PLKtt
Anhand des Verfahrens von M. Stahl et al. (oben) wurde eine genomische DNA aus Bacillus subtilis ATCC Nr. 6053 isoliert, und diese wurde als Template-DNA eingesetzt. Als nächstes wurden ein aus einer DNA-Sequenz, die mit der Nähe des 5'-Terminus des Terminatorbereichs eines von Bacillus subtilis I-168 abgeleiteten Gens für alkalische Protease (Journal of Bacteriology 158, 411–428, 1984) und einer angefügten XbaI-Spaltstelle zusammengesetztes Fragment (Sense-Primer A, dargestellt in SEQ ID NO: 11), und ein Fragment, welches komplementär zu einer DNA-Sequenz ist, die mit der Nähe des 3'-Terminus des Terminatorbereichs korrespondiert, mit einer angefügten HindIII-Spaltstelle, (Antisense-Primer B, dargestellt in SEQ ID NO: 12), chemisch synthetisiert.
Sense-Primer A
Antisense-Primer B
Anschließend wurde unter Verwendung der vorgenannten Template-DNA und dieser beiden Primer eine PCR durchgeführt. Das auf diese Weise erhaltene DNA-Fragment wurde mit XbaI und HindIII gespalten, wodurch das in 3 dargestellte Fragment (1) erhalten wurde. Als nächstes wurde der Shuttle-Vektor pHY300PLK (Takara Shuzo) mit I und HindIII gespalten, wodurch das größere Fragment (2) erhalten wurde (s. 3). Durch Ligation dieser Fragmente (1) und (2) wurde ein Shuttle-Vektor pHY300PLKtt hergestellt, der den aus Bacillus subtilis ATCC Nr. 6051 abgeleiteten Terminator der alkalischen Protease enthält.
(4)-2 Herstellung des Expressionsvektors pHY300BLtt
Aus kultivierten Zellen von Bacillus licheniformis ATCC Nr. 14580 wurde durch das Verfahren von M. Stahl et al. (oben) eine genomische DNA isoliert und als Template-DNA verwendet. Anschließend wurden ein einzelsträngiges DNA-Fragment, das mit der Mähe des 5'-Terminus dieser Template-DNA korrespondiert und über eine angefügte EcoRI-Spaltstelle verfügt, und ein einzelsträngiges DNA-Fragment, das zu einer DNA-Sequenz kamplementär ist, welche mit dem 3'-Terminus dar Template-DNA korrespondiert, und über eine angefügte XbaI-Spaltstelle verfügt, synthetisiert und als Sense-Primer C (dargestellt in SEQ ID NO: 13) bzw. als Antisense-Primer D (dargestellt in SEQ ID NO: 14) verwendet.
Sense-Primer C
Antisense-Primer D
Unter Verwendung der vorgenannten Template-DNA, des Sense-Primers C und des Antisense-Primers D wurde eine PCR durchgeführt. Anschließend wurde das auf diese Weise erhaltene Fragment mit EcoRI und XbaI gespalten, wodurch ein DNA-Fragment (3) erhalten wurde, das für BLase kodiert (s. 2). Als nächstes wurde der vorgenannte Vektor pHY300PLKtt mit EcoRI und Y gespalten, wodurch das größere Fragment (4) erhalten wurde. Die vorgenannten Fragmente (3) und (4) wurden anschließend mit T4 DNA-Ligase ligiert. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um E. coli K-12 C600 zu transformieren. Die Transformanten wurden auf Ampicillin enthaltendem Agarplattemedium kultiviert, und die gegenüber Ampicillin resistenten Kolonien wurden ausgewählt. Anschließend wurde aus den Zellen der ausgewählten Kolonien Plasmid-DNA isoliert, und die Insertion des vorgenannten DNA-Fragments (3) in der korrekten Orientierung wurde durch die Muster der Restriktionsenzymspaltung bestätigt.
(5) Herstellung von Transformanten und Herstellung von BLase
Der oben unter (4) erhaltene Expressionsvektor pHY300BLtt wurde durch das Verfahren von J. Spizien et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 44, 1072 (1958)) in Bacillus subtilis ISW1214 (Takara Shuzo) eingeführt. Die Bakterien wurden anschließend auf einem Tetracyclin enthaltenden Agarplattenmedium kultiviert, und die gegenüber Tetracyclin resistenten Kolonien wurden ausgewählt, wodurch die gewünschte Transformante erhalten wurde (Bacillus subtilis pHY300BLtt/ISW1214).
Die Transformante wurde in 5 ml LB-Medium (10 g Trypton, 5 q Hefeextrakt und 5 g Natriumchlorid unter Zugabe von Wasser zum Erhalt eines Gesamtvolumens von 1 l; pH-Wert 7,2) transplantiert und 18 Stunden lang bei 37°C im Schüttler kultiviert. Anschließend wurde 1 ml dieser Kulturbrühe zu 10 ml Sc⁺-Medium gegeben, welches 20 Minuten lang in einem Autoklaven bei 120°C sterilisiert wurden war, und die Schüttelkultur wurde bei 28°C durchgeführt.
Zusammensetzung des Sc⁺-Mediums
Wasser wird so zugegeben, daß das Gesamtvolumen 1 l beträgt (pH-Wert 7,0)
Die vorgenannte Kulturbrühe wurde 5 Minuten lang bei 2500 × g zentrifugiert, und der überstand wurde erhalten. Die BLase-Aktivität dieses Überstandes wurde anhand des im Rahmen der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen beschriebenen Verfahrens zur Messung des enzymatischen Aktivität gemessen. Die Ergebnisse dieser Messungen sind in Tabelle 4 dargestellt. Die Menge an Protein pro Liter Kulturbrühe wurde auf der Basis einer angenommenen BLase-spezifischen Aktivität von 2500 U/mg berechnet.
Tabelle 4
Wie bereits ausgeführt, werden durch die vorliegende Erfindung eine DNA, welche eine Protease kodiert, die in spezifischer Weise die Peptidbindungen an den Carboxy-Termini von Glutaminsäureresten in den Aminosäuresequenzen von Polypeptiden spaltet, ein Verfahren zur Herstellung der Protease aus Bakterien der Gattung Bacillus, eine für die Protease kodierende DNA-Sequenz, ein die DNA-Sequenz enthaltender Expressionsvektor, eine durch Einführung des Expressionsvektors in einen Wirt erhaltene Transformante, und ein Verfahren zur Herstellung der Protease unter Verwendung der Transformante bereitgestellt. Dieser Proteasetyp kann für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, wie bei der Proteinanalyse und Spaltung der Peptidketten von Fusionproteinen an gewünschten Stellen, etc.

Claims

DNA-Sequenz, welche ein Proteasemolekül kodiert, das eine Aminosäuresequenz von Serin an Position +1 bis Glutamin an Position +222 der SEQ ID N°. 1 enthält und das in Polypeptiden die Peptidbindung an den Carboxytermini der Glutaminsäurereste spaltet, wobei die DNA-Sequenz eine Basensequenz der SEQ ID N°. 1 vom Thyminrest an Position 605 bis zum Adeninrest an Position 1270 enthält.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz eine Protease kodiert, die eine Aminosäuresequenz der SEQ ID N°. 1 von N-Formylmethionin an Position –94 bis zum Glutamin an Position +222 enthält.
DNA-Sequenz nach Anspruch 2, welche die Basensequenz der SEQ ID N°. 1 vom Thyminrest an Position 323 bis zum Adeninrest an Position 1270 enthält.
Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz von Anspruch 1, 2 oder 3 enthält.
Expressionsvektor nach Anspruch 4, der in Bakterien der Gattung Bazillus exprimierbar ist.
Transformant, erhältlich durch Einführen des Expressionsvektors von Anspruch 4 oder 5 in einen Wirt.
Transformant nach Anspruch 6, wobei der Wirt ein Stamm ist, der zu Gattung Bazillus gehört.
Verfahren zur Herstellung einer Protease, umfassend die Schritte des Kultivierens eines Transformanten gemäß Anspruch 6 oder 7 in einem Kulturmedium und Gewinnen der erzeugten Protease aus dem Kulturmedium.
Verfahren zur Herstellung einer Protease, die eine Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 von Serin an Position +1 bis Glutamin an Position +222 enthält, umfassend (i) das Isolieren einer DNA-Sequenz, welche die Protease kodiert, aus dem Stamm ATCC 14580 von Bazillus licheniformis, (ii) das Konstruieren eines Expressionsvektors, der die DNA-Sequenz enthält, (iii) das Transformieren eines Wirts mit dem Expressionsvektor unter Gewinnung eines Transformanten, und (iv) das Kultivieren des Transformanten in einem Kulturmedium und das Gewinnen der erzeugten Protease aus dem Kulturmedium.
Verfahren nach Anspruch 9 zur Herstellung einer Protease, welche die folgenden Eigenschaften besitzt: (i) ein pH-Optimum von etwa 8,0, und (ii) einen stabilen pH-Bereich von 6,5 bis 8,5 bei 25°C.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die DNA-Sequenz eine Basensequenz der SEQ ID N°. 1 vom Thyminrest an Position 605 bis zum Adeninrest an Position 1270 besitzt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die DNA eine Protease kodiert, welche eine Aminosäuresequenz der SEQ ID N°. 1 von N-Formylmethionin an Position –94 bis Glutamin an Position +222 enthält.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die DNA-Sequenz eine Basensequenz der SEQ ID N°. 1 vom Thyminrest an Position 223 bis zum Adeninrest an Position 1270 enthält.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Expressionsvektor in Bakterien der Gattung Bazillus exprimierbar ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Wirt ein Stamm aus der Gattung Bazillus ist.