DE69736606T2

DE69736606T2 - Cellulase und Cellulase-Präperation, die dieselbe enthält

Info

Publication number: DE69736606T2
Application number: DE69736606T
Authority: DE
Inventors: Kouichirou Sakado-shi MURASHIMA; Tatsuki Odawara-shi MORIYA; Toru Sakado-shi HAMAYA; Jinichiro Sakado-shi KOGA; Naomi Odawara-shi SUMIDA; Kaoru Odawara-shi AOYAGI; Takeshi Odawara-shi MURAKAMI; Toshiaki Sakado-shi KONO
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1996-07-24
Filing date: 1997-07-24
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2017-07-25
Also published as: DE69736606D1; CN1154721C; AU3634797A; WO1998003640A1; ATE338111T1; CN1230988A; US6159720A; EP0959128A4; EP0959128B1; EP0959128A1

Description

[Hintergrund der Erfindung]
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Cellulase und eine Cellulase-Präparation, die dieselbe enthält, wie auch auf eine Entfernung von Flor von cellulosehaltigen Fasern, ein Verfahren zur Reduzierung cellulosehaltiger Fasern und ein Verfahren zur Entfärbung von Denim-gefärbten cellulosehaltigen Fasern durch Verwendung der Cellulase oder Cellulase-Präparation.
Stand der Technik
Cellulosehaltige Fasern werden mit Cellulase behandelt, um diesen Fasern gewünschte Eigenschaften zu verleihen. In der Faserindustrie beispielsweise wird eine Behandlung unter Verwendung von Cellulase durchgeführt, um die Textur und das Aussehen von cellulosehaltigen Fasern zu verbessern und um Denim-gefärbten, cellulosehaltigen Fasern das Aussehen, "stone-washed" zu sein, zu geben.
Zusätzlich hat Tencel, eine reproduzierte Cellulosefaser, d.h. Cellulose aus Holzmasse, die gelöst in einem organischen Lösungsmittel gesponnen wurde, in den letzten Jahren durch Eigenschaften, wie hohe Festigkeit, Wasser-Aufnahmekapazität und dergleichen, sowie durch ihr Herstellungsverfahren, das sehr geringe Umweltkontamination verursacht, die Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Da allerdings während des Herstellungsverfahrens von Tencel Flor erzeugt wird, hat Tencel einen niedrigen Produktwert als Faser, wenn sie so belassen wird, wie sie ist. Daher wurden Verfahren zur Entfernung von Flor, der während des Herstellungsverfahrens gebildet wurde, durch Verwendung von Cellulase vorgeschlagen.
Derzeit werden Cellulasen, die in erster Linie aus Trichoderma-Species und Humicola-Species von Holzfäule-Pilzen stammen, zur Behandlung von cellulosehaltigen Fasern verwendet. Unter den derzeitigen Bedingungen ist jedoch eine große Menge an Cellulase erforderlich, um den gewünschten Effekt bei den Fasern zu zeigen.
Es ist wahrscheinlich, dass die Kosten dieses Verfahrens reduziert werden könnten, wenn es möglich wäre, die Textur und das Aussehen von cellulosehaltigen Fasern zu verbessern, Denim-gefärbten, cellulosehaltigen Fasern das Aussehen "stone-washed" zu geben und Flor von Tencel zu entfernen, indem hochaktive Cellulose in kleinerer Menge als die herkömmliche Menge verwendet wird.
Darüber hinaus wird in WO 91/17243 (japanische Offenlegungsschrift Nr. 5-509223) für ein Beispiel einer Cellulase, die aus Humicola stammt, gezeigt, dass das Endoglucanasegen mit 43 kD aus Humicola insolens DSM1800-Stamm isoliert wurde und dass seine Basensequenz bestimmt wurde.
[Zusammenfassung der Erfindung]
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nun aus Humicola insolens eine neue hochaktive Cellulase und ihr Gen isoliert, die in äußerst vorteilhafter Weise in der Behandlung verschiedener cellulosehaltiger Fasern verwendet werden kann. Die vorliegende Erfindung basiert auf diesen Feststellungen.
Demnach besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung einer neuen Cellulase und ihres Gens.
Darüber hinaus besteht eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Entfernung von Flor von cellulosehaltigen Fasern unter Verwendung einer neuen Cellulase, eines Verfahren zur Reduzierung cellulosehaltiger Fasern und eines Verfahrens zur Entfärbung von Denim-gefärbten, cellulosehaltigen Fasern.
Die neue Cellulase gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Protein, das eine Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, oder eine Sequenz von Position 1 bis Position 284 der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, umfasst.
Außerdem wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Entfernung von Flor von cellulosehaltigen Fasern, ein Verfahren zur Reduzierung cellulosehaltiger Fasern und ein Verfahren zur Entfärbung von Denim-gefärbten, cellulosehaltigen Fasern, das den Schritt des Inkontaktbringens des Proteins oder modifizierten Proteins der vorliegenden Erfindung mit den Denim-gefärbten, cellulosehaltigen Fasern umfasst, bereitgestellt.
[Detaillierte Beschreibung der Erfindung]
Mikroorganismus-Hinterlegung
Der Stamm E. coli JM109, der durch das Plasmid pNCE4Sal (siehe Beispiel A5) transformiert war, das das Cellulasegen gemäß der Erfindung enthielt, wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Ministry of International Trade and Industry (1-1-3 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) unter der Eingangsnummer FERM BP-5976 (ursprüngliche Hinterlegung: FERM P-15732, Datum der ursprünglichen Hinterlegung: 12. Juli 1996) hinterlegt.
Cellulase und ihr Gen
Das Cellulaseenzym gemäß der Erfindung ist ein Protein, das eine Sequenz von Position 1 bis Position 284 der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz hat.
Außerdem wird ein Protein offenbart, das die gesamte Aminosäuresequenz von Position –21 bis Position –1 von SEQ ID NO: 1 am N-Terminus des obigen Proteins hat. Die Aminosäuresequenz von Position –21 bis Position –1 von SEQ ID NO: 1 wird als Signalpeptid angesehen.
Die Sequenz von Position 1 bis Position 284 der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, wird nachfolgend als Cellulase NCE4 bezeichnet und ihr Gen wird als Cellulase-NCE4-Gen bezeichnet.
Die Cellulase gemäß der vorliegenden Erfindung hat eine hohe Aktivität und ermöglicht daher die gewünschten Effekte in verschiedenen Verwendungen, sogar in geringen Mengen. Beispielsweise zeigt NCE4 gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu roher Cellulase, die aus einer Kulturflüssigkeit von Humicola insolens hergestellt wurde, äquivalente Florentfernungseffekte an Cellulosefasern bei einer Proteinmasse von etwa 1/100 derjenigen der rohen Cellulase, äquivalente Entfärbungseffekte bei Denim-gefärbter, cellulosehaltiger Faser bei einer Proteinmasse von etwa 1/25 und äquivalente Reduzierungseffekte für Cellulosefasern bei einer Proteinmasse von etwa 1/5. Dementsprechend kann sie für eine effizientere und wirtschaftlichere Behandlung von Cellulosefasern eingesetzt werden.
Nach einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine DNA-Sequenz bereitgestellt, die für die Aminosäuresequenz des obigen Proteins codiert. Eine typische Sequenz der DNA-Sequenz hat einen Teil der Basensequenz oder die gesamte Basensequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist.
Die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Basensequenz hat ein offenes Leseraster, beginnend am ATG in Positionen 118 bis 120 und endend am TAA in Positionen 1089 bis 1091. Außerdem entspricht die Basensequenz von Position 171 bis Position 173 dem reifen Protein, das aus 284 Resten besteht. Darüber hinaus wurde das Vorliegen eines Introns in der Basensequenz von SEQ ID NO: 2 bestätigt (siehe Beispiel A7).
Wenn die Aminosäuresequenz eines Proteins gegeben ist, wird die DNA-Sequenz, die für diese Sequenz codiert, einfach definiert, und es können verschiedene Basensequenzen, die für einen Teil der Aminosäuresequenz oder die gesamte Aminosäuresequenz codieren, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, ausgewählt werden. Demnach bezieht sich eine DNA-Sequenz, die für einen Teil der Aminosäuresequenz oder die ganze Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID NO: 1 gemäß der Erfindung gezeigt ist, auf eine Sequenz, die zusätzlich zu der ganzen Basensequenz oder einem Teil der Basensequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, keine degenerierten Codons hat, die für dieselben Aminosäuren in einer Basensequenz codieren.
Die DNA gemäß der vorliegenden Erfindung kann natürlichen Ursprungs sein oder kann vollständig synthetisiert sein. Außerdem kann sie auch unter Verwendung eines Teils aus DNA natürlichen Ursprungs synthetisiert sein. Typische Verfahren zum Erhalt von DNA umfassen ein Verfahren zum Erhalt der DNA aus einer Humicola insolens-Chromosomen-Bibliothek oder -cDNA-Bibliothek, die routinemäßig auf dem Gebiet der Gentechnologie verwendet werden; ein Beispiel dafür umfasst ein Screening unter Verwendung einer geeigneten DNA-Sonde, die auf der Basis von Information über eine partielle Aminosäuresequenz hergestellt wurde. Außerdem kann die DNA auch aus dem oben beschriebenen hinterlegten Mikroorganismus erhalten werden.
Expressionsvektor und transformierter Mikroorganismus
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Expressionsvektor bereitgestellt, der die DNA-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Zustand enthält, der die Replikation der DNA-Sequenz innerhalb eines Wirtsorganismus und auch die Expression eines Proteins, das durch die DNA-Sequenz codiert wird, ermöglicht. Darüber hinaus wird erfindungsgemäß ein Mikroorganismus bereitgestellt, der durch den Expressionsvektor transformiert ist. Es gibt keine besonderen Beschränkungen bei diesem Wirtsvektorsystem, und es können Systeme verwendet werden, die E. coli, Actinomycetes, Hefe oder Schimmelpilze verwenden, wie auch Fusionierter Protein-Expressionssysteme mit anderen Proteinen, die diese Mikroorganismen verwenden. Verfahren, die routinemäßig auf dem Gebiet der Gentechnologie eingesetzt werden, können für das Verfahren und die Methode zum Konstruieren des Vektors gemäß der Erfindung eingesetzt werden.
Der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung kann zusätzlich zu den DNA-Sequenzen der Erfindung eine DNA-Sequenz, die die Expression eines gewünschten Proteins kontrolliert oder einen selektierbaren Marker, um die Einführung des Vektors in ei nen Wirt und die Expression des gewünschten Proteins sicherzustellen, enthalten. Da die Basensequenz von SEQ ID NO: 2 als eine angesehen wird, die eine regulatorische Sequenz enthält, kann die Verwendung dieser Basensequenz vorteilhaft sein. Außerdem kann der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung DNA-Sequenzen, die für Cellulase codieren, in einer repetitiven Form (Tandem) enthalten. Der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung, der die DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung enthält, kann nach Routinemethoden konstruiert werden. Außerdem kann eine Transformation eines Mikroorganismus durch den Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung entsprechend Verfahren, die routinemäßig auf dem Fachgebiet verwendet werden, durchgeführt werden.
Die Transformante der vorliegenden Erfindung kann in einem geeigneten Medium kultiviert werden. Das Protein gemäß der Erfindung kann aus dieser Kultur isoliert werden. Somit wird gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Proteins der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Das Kultivieren der Transformanten und seine Bedingungen können grundsätzlich ähnlich denen des verwendeten Mikroorganismus sein. Außerdem können Isolierung und Reinigung des neuen Proteins gemäß der Erfindung aus der Kultur nach Routinemethoden durchgeführt werden.
Cellulaseanwendungen/Cellulasepräparation
Die Cellulase gemäß der vorliegenden Erfindung wird in verschiedenen Anwendungen in ihrer ursprünglichen Form oder als Cellulasepräparation eingesetzt. Sie wird insbesondere verwendet, um Cellulosefasern gewünschte Eigenschaften zu verleihen. Spezifischer wird sie zur Entfernung von Flor von cellulosehaltigen Fasern, zur Durchführung einer Gewichtsreduzierungsbehandlung und zur Durchführung einer Entfärbungsbehandlung von Denim-gefärbten, cellulosehaltigen Fasern verwendet.
Eine Cellulasepräparation kann hergestellt werden, indem die Cellulase gemäß der Erfindung mit Ingredienzien, die im Allgemeinen in Cellulasepräparationen enthalten sind, z.B. Exzipienzien (z.B. Lactose, Natriumchlorid, Sorbit), oberflächenaktive Mittel und Antiseptika, vermischt wird.
Ein Verfahren zur Entfernung von Flor von cellulosehaltigen Fasern, ein Verfahren zur Reduzierung der cellulosehaltigen Fasern und ein Verfahren zur Entfärbung Denim-gefärbter, cellulosehaltiger Fasern unter Verwendung der Cellulase oder Cellulasepräparation gemäß der vorliegenden Erfindung kann durchgeführt werden, indem die Cellulase der vorliegenden Erfindung mit cellulosehaltigen Fasern in Kontakt gebracht wird.
Obgleich Kontakttemperatur, die Menge an Cellulase und andere Bedingungen in Abhängigkeit von verschiedenen Bedingungen in einem System, z.B. bei Florentfernung von cellulosehaltigen Fasern, gewählt werden können, kann eine Behandlung bei etwa 50 bis 60°C unter Verwendung von Cellulase bei einer Proteinkonzentration von 5 bis 50 mg/Liter durchgeführt werden. In dem Verfahren zur Reduzierung cellulosehaltiger Fasern kann eine Behandlung bei etwa 50 bis 60°C unter Verwendung von Cellulase bei einer Proteinkonzentration von 100 bis 300 mg/Liter durchgeführt werden. Darüber hinaus kann in Verfahren zur Entfärbung von Denim-gefärbten, cellulosehaltigen Fasern eine Behandlung bei etwa 50 bis 60°C unter Verwendung von Cellulase bei einer Proteinkonzentration von 2 bis 10 mg/Liter durchgeführt werden.
[Beispiele]
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele, die die Erfindung nicht beschränken sollen, weiter erläutert.
Beispiel A1: Isolierung und Reinigung eines Ingrediens, das Tencel-Flor-Entfernungsaktivität hat, aus Humicola insolens
Humicola insolens MN200-1 wurde bei 37°C in (N)-Medium (5,0 % Avicel, 2,0 % Hefeextrakt, 0,1 % Polypepton, 0,03 % Calciumchlorid, 0,03 % Magnesiumsulfat, pH 6,8) kultiviert. Nach 7 Tagen Kultivieren wurden die Mikroorganismen durch Zentrifugieren der resultierenden Kulturflüssigkeit bei 7.000 U/min für 20 Minuten entfernt, und der Kulturüberstand wurde als rohe Cellulasepräparation verwendet.
Diese rohe Cellulasepräparation wurde auf hydrophobe Chromatographie aufgebracht (Phenyl-Sepharose High-Performance 16/100, Pharmacia-Biotech) und durch Elution mit wässrigem Ammoniumsulfat über einen Konzentrationsgradienten von 1 bis 0 M in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert. Da kräftige Tencel-Flor-Entfernungsaktivität in der Fraktion beobachtet wurde, die während eines Konzentrationsgradienten von 0,1 bis 0 M erhalten wurde, wurde diese Fraktion wiederum auf hydrophobe Chromatographie aufgebracht (Phenyl-Sepharose High-Performance 16/100) und mit wässrigem Ammoniumsulfat über einen Konzentrationsgradienten von 0,4 bis 0 M in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert, worauf eine Entfernung der aktiven Fraktion folgte.
Dann wurde diese Fraktion auf Umkehrphasenchromatographie (Source 15 ISO, Pharmacia-Biotech) aufgetragen und durch Elution mit wässrigem Ammoniumsulfat über einen Konzentrationsgradienten von 1 bis 0 M in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) fraktioniert.
Da bei der Fraktion, die bei einer Konzentration von 0 M erhalten wurde, beobachtet wurde, dass sie starke Tencel-Flor-Entfernungsaktivität aufwies, wurde diese Fraktion weiter auf Umkehrphasenchromatographie (Source 15 PHE, Pharmacia-Biotech) aufgebracht, mit wässrigem Ammoniumsulfat über einen Konzentrationsgradienten von 1 bis 0 M in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert und die Fraktion, die starke Tencel-Flor-Entfernungsaktivität aufwies, wurde als gereinigtes Enzym NCE4 isoliert. Dieses NCE4 wies eine einzelne Bande bei einem Molekulargewicht von 43 kDa in SDS-PAGE auf.
Beispiel A2: Partielle Aminosäuresequenz von Cellulase NCE4
(1) Identifizierung von N-terminalen Aminosäureresten
Säulenchromatographie (Säule: RESOURCE (Handelsbezeichnung) RPC 3 ml, 5 bis 60 % Acetonitrilgradient, enthaltend 0,1 % TFA) wurde mit einem FPLC-System (Pharmacia-Biotech) durchgeführt, worauf die Entfernung des Hauptpeaks folgte, um die N-terminale Aminosäuresequenz des in Beispiel 1 gereinigten Proteins zu bestimmen.
Nach Lyophilisierung der obigen Fraktion wurde sie in einer kleinen Menge an Wasser gelöst, gefolgt von einer Elektrophorese unter Verwendung von 8 % Gel SDS-PAGE Mini (TEFCO). Nach elektrischer Übertragung des Proteins auf PVDF-Membran (Millipore) unter Verwendung eines Multiphore II-Elektrophoresesystems (Pharmacia-Biotech) und Färben mit Coomassie-Brilliant-Blau R-250 (Nakalai tesque) wurde die Membran entfernt, mit Wasser gewaschen und luftgetrocknet. Der Teil, an dem das Protein mit einem Molekulargewicht von 43 kDa geblottet war, wurde ausgeschnitten und zu dem Modell 492-Protein Sequenzer (Perkin-Elmer) übertragen, um 15 Reste der N-terminalen Aminosäuresequenz zu bestimmen. Die resultierende Sequenz war wie unten gezeigt.
N-terminale Aminosäuresequenz: Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-(Cys)-(Cys)-Lys-Pro-Ser (15 Reste)
(2) Peptidkartierung
Nach Lyophilisierung des durch FPLC in (1) oben gereinigten Proteins wurde es in 100 mM Ammoniumbicarbonatpuffer (pH 8,0) aufgelöst. Etwa 1/20 mol Volumen Trypsin (Promega), bezogen auf die Proteinmenge, wurde zugesetzt und für 48 Stunden bei 37°C reagieren gelassen. Säulenchromatographie (Säule: C8 220 × 2,1 mm, 0,1 % TFA, 0 % Acetonitril bis 0,085 % TFA, 35 % Acetonitril-Gradient) wurde an diesem Auflösungsprodukt mit dem Modell 172μ-Präparatives HPLC-System (Perkin-Elmer) durchgeführt, um drei Typen an Peptiden zu erhalten. Die Aminosäuresequenzen der resultierenden Peptid fagmente wurden unter Verwendung des obigen Proteinsequenzers bestimmt. Die Resultate waren wie unten gezeigt.
TP-1: Tyr-Gly-Gly-Ile-Ser-Ser (6 Reste)
TP-2: Phe-Pro-Asp-Ala-Leu-Lys (6 Reste)
TV-3: Phe-Asp-Trp-Phe-Lys-Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Ser-Phe- Ser-Phe-Arg (15 Reste)
Da die N-terminale Aminosäuresequenz und Aminosäuresequenzen, die durch Peptidkartierung erhalten wurden, Homologie mit der Aminosäuresequenz der 43 kDa-Endoglucanase aufweisen, welche von Humicola insolens DSM1800 erhalten wurde, angegeben in WO 91/17243 (offengelegte japanische Patentveröffentlichung Nr. 5-509223), wurde dieses Protein vehement als ein Cellulasetyp vorgeschlagen.
Wenn die obigen Sequenzen außerdem mit den Sequenzen verglichen wurden, die in Protein Identification Resource (PIR), R44.0, März 1995 registriert sind, oder mit denen, die in SWISS-PROT R31.0, März 1995 registriert sind, so waren die obigen Sequenzen, obgleich sie mit einigen registrierten Sequenzen Homologie zeigten, nicht identisch, was klar anzeigt, dass das hierin erhaltene Protein ein neues Protein ist.
Beispiel A3: Konstruktion einer Genom-DNA-Bibliothek
Die Isolierung von Genom-DNA wurde gemäß dem Verfahren von Horiuchi et al. (Hiroyuki Horiuchi et al., J. Bacteriol., 170: 272-278, 1988) durchgeführt.
Zunächst wurde Humicola insolens MN200-1 in dem obigen (N)-Medium bei 37°C kultiviert. Nach 2-tägiger Kultur wurden die Mikroorganismen durch Zentrifugation (3.500 U/min, 10 Minuten) gesammelt. Die resultierenden Mikroorganismen wurden mit Phenol, Proteinase K und Ribonuclease A behandelt, gefolgt von einer Polyethylenglykol-(PEG)-Präzipitation unter Erhalt von genomischer DNA.
Dann wurde Humicola insolens-Genom-DNA mit Sau3A I verdaut und nach Bestätigung eines partiellen Verdaus innerhalb eines Bereichs von 9 bis 23 kbp durch Agarosegelelektrophorese wurden die DNA-Fragmente durch Ethanolpräzipitation gesammelt. Die DNA-Fragmente wurden dann an einen Phagenvektor und den BamHI-Arm eines EMBL3-Klonierungskits (Stratagene) unter Verwendung von T4-Ligase (Toyobo Co., Ltd.) ligiert. Nachdem dies einer Ethanolpräzipitation unterworfen worden war, wurde das Präzipitat in TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA)-Puffer gelöst.
Die gesamte Menge des ligierten Gemisches wurde in einen lambda-Kopf gepackt, wobei "Package"-Komponenten, die gefroren waren, wie es in dem Verfahren von Hohn, B. beschrieben ist (Hohn, B., Methods Enzymol., 68: 299-309, 1979) und der Giga-Pack II-Packaging Kit (Stratagene) verwendet wurden; danach wurde der resultierende Phage in E. coli-Stamm LE392 infiziert. Das Zielgen wurde dann unter Verwendung der 5 × 104-Phagenbibliothek, die aus diesem Verfahren resultierte, kloniert.
Beispiel A4: Herstellung einer langkettigen Sonde durch PCR
Eine lange Sonde, die durch PCR amplifiziert wurde, wurde unter Verwendung der gesamten DNA von Humicola insolens als Matrize hergestellt und diese wurde als DNA-Sonde verwendet.
DNA, die den Aminosäuren, die mit einem Sternchen am N-Terminus und in Peptid-TP-3 gekennzeichnet sind, wurde für jeden der Primer synthetisiert. Die Sequenzen der hergestellten synthetischen Oligonucleotide waren wie unten gezeigt.
NCE4N1: 5'-GCXGA(CT)GGXAA(AG)TC(AGCT)AC-3' (17mer)
NCE4N2: 5'-GCXGA(CT)GGXAA(AG)AG(CT)AC-3' (17mer)
NCE4C: 5'-CXGC(AG)TT(CT)TT(AG)AACCA(AG)TC-3' (19mer)
(X: Inosin)
PCR-Reaktionen wurden unter den folgenden Bedingungen durchgeführt. Zunächst wurden zwei Röhrchenpaare mit 1 μM jedes der Primer NCE4N1 und NCE4C, zugesetzt zu 1 μg Humicola insolens-Genom-DNA, und 1 μM jedes der Primer NCE4N2 und NCE4C, zugesetzt zu 1 μg Humicola insolens-Genom-DNA, vorbereitet und dann einer thermischen Denaturierung für 5 Minuten bei 95°C in Gegenwart von dNTP unterworfen. Später wurde Taq-Polymerase (rekombinantes Taq, Takara Shuzo) zugesetzt, um zu amplifizieren, und zwar durch Wiederholung von 25 Zyklen unter den Reaktionsbedingungen von 94°C für 1 Minute, 45°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten. Als Resultat wurden etwa 750 bp DNA nur im Fall der Verwendung der Primer NCE4N1 und NCE4C amplifiziert. Diese wurde als Sonde in folgendem Screening eingesetzt.
Beispiel A5: Klonierung des Cellulasekomponente-NCE4-Gens
(1) Screening durch Plaque-Hybridisierung
100 ng des etwa 750 bp DNA-Fragments, das durch PCR amplifiziert worden war, wurden im Voraus durch ein ECL Direct DNA/RNA-Markierungsdetektionssystem (Amersham) markiert.
Die Phagenplaque, die nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt worden war, wurde auf High-Bond N + Nylon-Transfermembran (Amersham) übertragen und wurde nach Denaturierung mit 0,4 N Natriumhydroxid mit 5-fach konzentriertem SSC (15 mM Trinatriumcitrat, 150 mM Natriumchlorid) gewaschen und getrocknet, um die DNA zu fixieren. Nach Vorhybridisierung (42°C) für 1 Stunde entsprechend dem Verfahren des Kits wurde die vorher markierte Sonde zugesetzt, wonach eine Hybridisierung für 4 Stunden (42°C) durchgeführt wurde. Ein Waschen der Markierung wurde entsprechend den Verfahren des obigen Kits durchgeführt. Zu Beginn wurde ein Waschen zweimal für 20 Minuten bei 42°C durchgeführt, wobei 0,5-fach konzentriertes SSC, das 0,4 % SDS und 6 M Harnstoff enthielt, verwendet wurde, worauf ein zweimaliges Waschen für 5 Minuten bei Raumtemperatur unter Verwendung von 2-fach konzentriertem SSC folgte.
Nach Eintauchen der Nylonmembran, von der die Sonde über 1 Minute in die Detektionslösung gewaschen worden war, wurde diese auf Hyper-Film ECL (Amersham) fotosensibilisiert, um vier positive Klone zu erhalten.
(2) Herstellung von Phagen-DNA
E. coli LE392 wurde mit einem Phagen infiziert, die Phagenpartikel wurden acht Stunden später gesammelt und nach Behandlung mit Proteinase K und Phenol gemäß dem Verfahren von Grossberger (Grossberger, D., Nucleic Acids Res. 15, 6737, 1987) wurde die Phagen-DNA durch Ethanolpräzipitation abgetrennt.
(3) Subklonierung des Zielgens
Vier Typen an Phagen-DNA wurden durch SalI verdaut und auf Agarosegelelektrophorese aufgetragen.
DNA wurde durch das Verfahren von Southern (Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98: 503-517, 1975) auf eine Nylonmembran übertragen und unter Verwendung einer Sonde mit etwa 750 bp unter denselben Bedingungen wie bei der Plaque-Hybridisierung von (1) oben hybridisiert, gefolgt von einer Detektion des 5,2 kbp-DNA-Fragments, das das Zielgen ent hält. Als Resultat wurde festgestellt, dass die vier Typen an Phagen-DNA SalI-Fragmente derselben Größe haben.
Dieses 5,2 kbp-DNA-Fragment wurde unter Verwendung des Sephaglass Band Prep Kits (Pharmacia-Biotech) abgetrennt, gefolgt von einer Subklonierung zu der SalI-Stelle von Plasmid pUC119 unter Verwendung von E. coli JM109. Das resultierende Plasmid wurde als pNCE4Sal bezeichnet.
Beispiel A6: Bestimmung der Basensequenz
(1) Basensequenzanalyse der Genom-DNA
Eine Bestimmung der Basensequenz wurde in der unten beschriebenen Art durchgeführt.
Der A.L.F.-DNA-Sequenzer II (Pharmacia-Biotech) wurde als Basensequenzanalysator verwendet. Acrylamidträger, der als Ready-Mix Gel (Pharmacia-Biotech) oder Hydrolink Long Ranger (FMC) zu erhalten ist, wurde als Sequenzierungsgel eingesetzt. Reagenzien mit A.L.F.-Qualität (Pharmacia-Biotech) wurden als die verschiedenen Reagenzien eingesetzt, die für die Gelpräparation verwendet wurden (N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin, Harnstoff, Ammoniumpersulfat). Der Auto-Read-Sequenzierungskit (Pharmacia-Biotech) wurde für die Basensequenz-Decodierungsreaktion eingesetzt. Gelpräparationsbedingungen, Reaktionsbedingungen und Migrationsbedingungen wurden eingestellt, indem auf die Details jedes Instruktionshandbuchs Bezug genommen wurde.
Nach Alkali-Denaturierung von pNCE4Sal mit 10 μg 2 M Natriumhydroxid, um es als Matrizen-DNA zu verwenden, wurde es mit dem universellen Primer, der mit dem Auto-Read-Sequenzierungskit bereitgestellt wurde, einem Annealing unterworfen, um eine Verlängerungsreaktion durchzuführen. Nach Sequenzierung des Reaktionsproduktes mit dem Sequenzer wurde eine 546 bp-Basensequenz sequenziert. Basierend auf diesem Resultat wurde ein FITC-markierter Sequenzierungsprimer in der Form von MNEG01 hergestellt, mit pNCE4Sal umgesetzt, gefolgt von einer weiteren Sequenzierung. Der folgende Primer wurde dann auf der Basis des Resultats, das erhalten wurde, hergestellt, wonach die gesamte Länge von NCE4 als Resultat des Vorgehens unter Decodieren decodiert wurde. Die hergestellten FITC-markierten Sequenzierungsprimer waren wie unten angegeben.
(2) Basensequenz-Bestimmung
FITC-markierte Sequenzierungsprimer-DNA in Form von MNEG-05 bis MNEG-08 wurde auf der Basis der Resultate von (1) oben synthetisiert. Die hergestellten FITC-markierten Sequenzierungsprimer waren wie unten angegeben.
Diese Primer wurden mit pNCE4Sal unter Verwendung des Auto-Read-Sequenzierungskits umgesetzt. Zu allererst wurden 10 μg Plasmid durch Alkali denaturiert, mit jedem Primer angelagert und mit T7-Polymerase reagieren gelassen. Als Resultat konnte eine 1257 bp-Basensequenz im SalI-Fragment bestimmt werden. Diese Sequenz war wie in SEQ ID NO: 3 gezeigt.
Beispiel A7: Intron-Bestimmung
Eine Intron-Bestimmung wurde durchgeführt, indem mRNA aus Humicola insolens MN200-1 hergestellt wurde, cDNA unter Verwendung reverser Transkriptase synthetisiert wurde und diese mit der Genombasensequenz verglichen wurde, um dieselbe Region zu identifizieren.
(1) Isolierung von Gesamt-RNA
Humicola insolens MN200-1 wurde für 2 Tage in Cellulase-induzierendem Medium und vorzugsweise dem vorstehend genannten (N)-Medium kultiviert, gefolgt von einem Sammeln der Mikroorganismen durch Zentrifugation (3.500 U/min, 10 Minuten). 2 g der obigen Mikroorganismen wurden mit sterilem Wasser gewaschen und mit einem Mischer (Nihon Seiki, Homogenizer AM-3) zerkleinert, während sie mit flüssigem Stickstoff gefroren wurden. Die zerkleinerten Mikroorganismen wurden dann in 10 ml denaturierender Lösung suspendiert, die 4 M Guanidinthiocyanat (4 M Guanidinthiocyanat, 25 mM Trinatriumcitrat, 0,5 % Natrium-N-laurylsarcosinat, 0,1 M Mercaptoethanol) enthielt. Nach Rühren für mehrere Minuten bei Raumtemperatur wurde die Suspension mit 1 ml 2 M Natriumacetat (pH 4,5) neutralisiert und zusätzlich nach Zusatz von 10 ml TE-gesättigtem Phenol gerührt. 2 ml Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) wurden zugesetzt und nach gutem Rühren wurden die Mikroorganismuskomponenten, die mit Phenol denaturiert worden waren, durch Zentrifugation (3.500 U/min, 10 Minuten) entfernt. Die obere Schicht (wässrige Schicht) wurde abgesaugt und Nucleinsäuren wurden mit 10 ml Isopropanol präzipitiert. Das resultierende Präzipitat wurde dann zentrifugiert (3.500 U/min, 10 Minuten), um die Nucleinsäuren zu isolieren, wonach das Präzipitat mit 70 % Ethanol-Wasser durch zusätzliche Zentrifugation gewaschen wurde.
Nach Auflösen dieses Präzipitats in 3,5 ml TE wurden 880 μl 10 M Lithiumchlorid-Lösung zu der Lösung gegeben, worauf sich ein Kühlen für 2 Stunden bei 5°C und Zentrifugation (12.000 U/min, 10 Minuten) zur Gewinnung des Präzipitats anschloss. Dieses Präzipitat wurde mit 70 % Ethanol gewaschen und als Gesamt-RNA-Fraktion verwendet. Die gewonnene Menge war 2,7 mg, und die Ausbeute war 0,14 %.
(2) Präparation von Poly-A-Tail + RNA (= mRNA)
Eine Präparation von mRNA wurde unter Verwendung eines mRNA-Reinigungskits (Pharmacia-Biotech) durchgeführt.
Zuerst wurde 1 mg der in (1) oben hergestellten Gesamt-RNA in 1 ml Elutionspuffer gelöst, gefolgt von einer thermischen Denaturierungsbehandlung für 10 Minuten bei 65°C. Nach schnellem Kühlen in Eis wurden 0,2 ml Probenpuffer zugesetzt. Die ganze Menge dieser RNA-Lösung wurde in eine Oligo(dT)-Cellulosesäule geladen und nach dreimaligem Waschen der Säule mit Puffer mit hohem Salzgehalt und dreimaligem Waschen mit Puffer mit niedrigem Salzgehalt wurde mit Elutionspuffer, der auf 65°C erwärmt war, eluiert. Dieses Säulenverfahren wurde zweimal wiederholt und das resultierende Produkt wurde als die mRNA-Fraktion verwendet. Die gewonnene Menge war 19,2 μg, die Ausbeute war 2 %.
(3) Synthese von cDNA
Die Synthese von cDNA wurde unter Verwendung eines zeitsparenden cDNA-Synthesekits (Pharmacia-Biotech) durchgeführt.
5 μg mRNA wurden in 20 μl Probenpuffer gelöst. Nach thermischer Denaturierung für 10 Minuten bei 65°C wurden die Dithiothreitol-Lösung und Oligo(dT)-Primer zu der ersten Strangsynthesemischung gegeben und für 1 Stunde bei 37°C reagieren gelassen. Dann wurde diese ganze Menge zu einer zweiten Strangmischung gegeben und für 30 Minuten bei 12°C und dann für 1 Stunde bei 22°C reagieren gelassen, das resultierende Produkt wurde als cDNA verwendet.
(4) PCR-Amplifikation von Cellulase-NCE4-cDNA
Unter Verwendung von 1 μg der synthetisierten cDNA als Matrize wurde nur die Ziel-cDNA durch PCR amplifiziert. Oligonucleotidprimer, die die unten angegebenen Sequenzen haben, wurden zur Verwendung als Primer der N- und C-Termini hergestellt.
NCE4-CN: 5'-ATGCGTTCCTCCCCTCTCCTCCGCTCCGCC-3' (30mer)
NCE4-CC: 5'-TACAGGCACTGATGGTACCAGTCATTAATC-3' (30mer)
Die PCR-Reaktion wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt. 1 μM jedes der Primer wurde zu 1 μg Humicola insolens-cDNA gegeben, worauf eine thermische Denaturierung für 10 Minuten bei 94°C in Gegenwart von dNTP folgte. Dann wurde Taq-Polymerase (rekombinantes Taq, Takara Shuzo) zugegeben, um durch Wiederholung von 30 Zyklen unter Reaktionsbedingungen 94°C für 1 Minute, 50°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten zu amplifizieren. Als Resultat einer Durchführung einer Agarosegelelektrophorese wurde festgestellt, dass das amplifizierte Fragment eine Größe von 0,9 kbp hatte. Dieses wurde dann durch Ethanolpräzipitation konzentriert und unter Verwendung eines pT7 blue-T-Vektor-Kits (Novagen) kloniert. Dieses Plasmid wurde pCNCE4 genannt.
(5) Analyse der cDNA-Basensequenz
Die Sequenzierungsreaktion wurde unter Verwendung eines Auto-Read-Sequenzierungskits in der gleichen Weise wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Das Plasmid pCNCE4 wurde Alkali-denaturiert mit 2 M Natriumhydroxid und mit Ethanol präzipitiert. Dieses einzelsträngige Plasmid wurde als Matrize eingesetzt und mit T7-Polymerase reagieren gelassen. Die Sequenz wurde bestimmt, indem Reaktionen unter Verwendung der obigen synthetischen Primer MNEG01, MNEG02, MNEG03, MNEG04, MNEG05, MNEG06, MNEG07 und MNEG08 wie auch des mit dem Kit bereitgestellten universellen Primers und Umkehrprimers durchgeführt wurden.
Als Resultat lag ein einzelnes 56 bp-Intron vor. Die nicht-translatierte Initiationssequenz, seine Stoppsequenz und die regulatorische Sequenz innerhalb des Introns in der Sequenz von SEQ ID NO: 3 sind wie unten gezeigt (die Zahlen geben die Sequenzpositionsnummern von SEQ ID NO: 3 an).
Intron: 453-458, 506-508, 491-497
Beispiel A8: Beurteilung der Florentfernungsaktivität von NCE4 bei cellulosehaltigen Fasern
Vorgefärbter Tencel-Stoff (Courtauls) wurde unter Verwendung einer großen Waschmaschine unter Zugabe oberflächenaktiven Mittels und eines Kautschukballs aufgeraut ("napped"). Tencel, bei dem als Resultat dieser Behandlung Flor gebildet worden war, wurde durch Cellulasebehandlung unter den folgenden Bedingungen von Flor befreit, gefolgt von einer Berechnung der Proteinkonzentration an Cellulase, die erforderlich ist, um den Flor vollständig zu entfernen.
Testmaschine: 20 kg Waschmaschine (Sanyo, Vollautomatische Waschmaschine SCW5101)
Badverhältnis: 1:20
Erwärmung: 55°C
Zeit: 60 Minuten
pH: 7 (10 mM Phosphatpuffer)
Zusätzlich zu Cellulaseenzymflüssigkeit wurden Kautschukbälle in einer Menge, die grob das Zweifache des Gewichts des Stoffs war, zu der Behandlungsflüssigkeit gegeben. Tabelle 1

*: Die Menge an Protein wurde unter Verwendung eines Protein-Assay-Kits (Biorad) und Rinderserumalbumin als Standard quantitativ bestimmt.

Auf der Basis der Resultate wurde bestimmt, dass NCE4 fähig ist, einen gleichen Grad der Tencel-Florentfernung bei einer Proteinkonzentration von 1/100 der von roher Cellulasepräparation zu zeigen.
Beispiel A9: Beurteilung der Entfärbungsaktivität von NCE4 auf Denim-gefärbte, cellulosehaltige Fasern
Von Stärke befreite 12-Unzen-Blue Jeans wurden unter den unten beschriebenen Bedingungen entfärbt.
Testmaschine: 20 kg Waschmaschine (Sanyo, Vollautomatische Waschmaschine SCW5101)
Badverhältnis: 1:50
Erwärmung: 55°C
Zeit: 60 Minuten
pH: 7 (10 mM Phosphatpuffer).
Zusätzlich zu der Cellulaseenzymflüssigkeit wurden Kautschukbälle in einer Menge von grob dem Zweifachen des Gewichts des Stoffs zu der Behandlungsflüssigkeit gegeben.
Eine Entfärbung wurde durch Messung des L-Werts (Helligkeit) eines Lab-Index-Systems unter Verwendung eines Color Analyzer Topscan Modell TC-1800MK2 vom Farbdifferenztyp (Tokyo Denshoku) bestimmt. Unter Darstellung der Steigerung des L-Werts bezüglich einer Kontrolle (Zunahme der Helligkeit) als ΔL-Wert, wurden die ΔL-Werte von fünf Punkten für jede Testfläche, die auf Entfärbung beurteilt wurde, gemessen (n = 5), und der Mittelwert von drei Punkten nach Eliminierung des Maximum- und Minimumwerts wurden verwendet. Die Proteinkonzentration an Cellulase, die zur Entfärbung zu einem Level von ΔL = 7 erforderlich ist, wurde errechnet.
Tabelle 2
Basierend auf diesen Resultaten wurde festgestellt, dass NCE4 fähig ist, einen gleichen Grad der Entfärbung von Denim-gefärbten Blue Jeans bei einer Proteinkonzentration von 1/25 derjenigen von roher Cellulasepräparation zu zeigen.
Beispiel A10: Beurteilung der Gewicht-reduzierenden Aktivität von NCE4 auf cellulosehaltige Fasern
Eine Enzymbehandlung wurde an Cupra, recycelten Cellulosefasern (Asahi Chemical Industry, 15 cm lang × 10 cm breit) durchgeführt, für welche das absolute Trockengewicht im Voraus gemessen worden war, unter den unten angegebenen Bedingungen durchgeführt.
Testgerät: Waschbeständigkeitstest-Gerät L-12 (Daiei Scientific Instruments)
Badverhältnis: 1:50
Erwärmung: 55°C
Zeit: 60 Minuten
pH: 7 (40 mM Phosphatpuffer)
Zusätzlich zu Cellulaseenzymflüssigkeit wurden Edelstahl-Kugeln (bereitgestellt von Daiei Scientific Instruments) zu der Behandlungsflüssigkeit gegeben. Nach Enzymbehandlung wurden die Fasern getrocknet, das absolute Trockengewicht der Cupra-Fasern wurde gemessen und das Gewichtsreduzierungsverhältnis im Vergleich zu vor der Enzymbehandlung wurde gemessen. Die Proteinkonzentration an Cellulase, die zur Erzeugung eines Gewichtsreduzierungsverhältnisses von 8 % erforderlich war, wurde errechnet.
Tabelle 3
Basierend auf diesen Resultaten wurde festgestellt, dass NCE4 fähig ist, einen gleichen Grad der Gewichtsreduzierung bei Bearbeitung von Cupra-Fasern mit einer Proteinkonzentration von 1/5 der von roher Cellulasepräparation zu zeigen.
Beispiel B1: Konstruktion von Plasmid pMKD01
(1) Konstruktion von Plasmid pUC118BN
Nach Spaltung von 1 μg pUC118-DNA mit BamHI wurde das Restriktionsenzym durch Behandlung mit Phenol inaktiviert. Dieses wurde dann einer Ethanolpräzipitation unterworfen und in einer geringen Menge an TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA) gelöst. Die Enden dieser DNA wurden mit einem DNA-Verzweigungskit (Takara Shuzo) geglättet. Dieser wurde außerdem mit einem DNA-Ligationskit (Takara Shuzo) ligiert und selbst schließen gelassen. Das resultierende ligierte Gemisch wurde in E. coli-kompetente Zellen JM109 (Takara Shuzo) transformiert. Solche Transformanten, die fähig waren, auf LB-Agarmedium (1 % Polypepton, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % NaCl, 1,5 % Agar), das 100 μg/ml Ampicillin, 1 mM IPTG und 0,004 % X-gal enthielt, zu wachsen, die auch weiße Kolonien zeigten, wurden selektiert und zusätzlich über Nacht bei 37°C in LB-Medium (1 % Polypepton, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % NaCl), das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus der resultierenden Kulturflüssigkeit unter Verwendung von alkalischem SDS gewonnen. Diese Plasmid-DNA wurde mit BamHI gespalten und in 0,8 % Agarosegelelektrophorese eingesetzt, gefolgt von Selektion von Plasmid-DNA, in welcher die BamHI-Stelle von pUC118-DNA zerstört war. Diese Plasmid-DNA wurde als pUC118BN bezeichnet.
(2) Konstruktion von Plasmid pUC118BSN
1 μg pUC118BN-DNA wurde mit SphI verdaut und Plasmid-DNA wurde erhalten, in welcher die SphI-Stelle von pUC118BN nach demselben Verfahren wie oben beschrieben zerstört worden war. Diese Plasmid-DNA wurde als pUC118BSN bezeichnet.
(3) Konstruktion von Plasmid pM21
A) Isolierung von Cellulase-NCE2-Gen
Das Cellulase-NCE2-Gen, das aus Humicola insolens nach dem in der offengelegten japanischen Patentveröffentlichung Nr. 8-126492 beschriebenen Verfahren erhalten worden war und ein PstI-XbaI-Fragment mit einer Gesamtlänge von 3,4 kbp, das eine 1,4 kb-DNA-Sequenz stromaufwärts und eine 0,5 kb-DNA-Sequenz stromabwärts als seine Promotor- und Terminatorregionen hat, wurden in die PstI-XbaI-Stelle des früheren pUC118BSN ligiert. Die resultierende Plasmid-DNA wurde als pUC118BSN-PX bezeichnet.
B) Ortsspezifische Mutagenesereaktion von Plasmid pUC118BSN-PX
BamHI-Stellen wurden durch ortsspezifische Mutation wie unten beschrieben stromabwärts des N-Terminus und unmittelbar stromabwärts vom Stoppcodon des NCE2-Gens eingeführt. E. coli-JM109-Stamm wurde durch Plasmid pUC118BSN-PX transformiert und danach zusätzlich mit Helferphage M13K07 infiziert, eine Kultur wurde für 16 bis 20 Stunden bei 37°C in 30 ml 2 × YT-Flüssigmedium (1,6 % Bactotrypton, 0,8 % Hefeextrakt, 0,5 % NaCl), das Ampicillin und Kanamycin bei Konzentrationen von 150 μg/ml bzw. 70 μg/ml enthielt, durchgeführt. Aus dem Kulturüberstand wurde einzelsträngige DNA von M13 (ssDNA) gewonnen. Unter Verwendung dieser ssDNA und von zwei Typen synthetischer Oligonucleotide wurde eine ortsspezifische Mutagenesereaktion mit dem Sculpture In Vitro Mutagenesis System (Amersham) durchgeführt. Die Sequenzen der hergestellten synthetischen Oligonucleotidprimer sind wie unten angegeben.
MNC-02 5'-GAGCGCCAGAACTGTGGATCCACTTGGTGAGCAATG-3' (36mer)
MNC-03 5'-TCCGCCGTTCTGAGCGGATCCAGGCGTTTGGCGCG-3' (35mer)
Das Gemisch der ortsspezifisch mutierten DNA wurde in E. coli TG1 eingeführt und die resultierende Transformante wurde in LB-Medium (1 % Polypepton, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % NaCl), das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, kultiviert, gefolgt von Gewinnung von Plasmid-DNA. Die Plasmid-DNA wurde mit BamHI verdaut und einer 0,8 % Agarose gelelektrophorese unterzogen, gefolgt von Selektion von Plasmid-DNA, in der BamHI-Stellen an zwei Orten in Plasmid pUC118BSN-PX eingeführt waren. Diese Plasmid-DNA wurde als pM21 bezeichnet.
(4) Isolierung des Cellulase-NCE3-Gens
Das Cellobiohydrolasegen (NCE3), das aus Humicola insolens stammt, wurde durch PCR auf der Basis der Sequenz des bekannten Cellobiohydrolasegens, das aus Humicola grisea stammt (de Oliviera Alzevedo, M. et al., J. General Microbiol., 136: 2569-2576, 1990), isoliert.
A) Isolierung von Genom-DNA
Genom-DNA von Humicola insolens MN200-1 wurde durch das vorher in Beispiel A3 beschriebene Verfahren erhalten.
B) Amplifikation des Cellulase NCE3-Gens durch PCR
Das NCE3-Gen von Humicola insolens wurde durch PCR auf der Basis der Sequenz des Cellobiohydrolasegens aus Humicola grisea isoliert. Jeder Primer wurde im Voraus in einer Form konstruiert, die eine BamHI-Stelle enthielt, so dass das PCR-Produkt, das NCE3 enthielt, fähig war, in Linie mit dem Raster an die BamHI-Stelle von Plasmid pM21 ligiert zu werden. Synthetische Olignucleotide, die die unten gezeigten Sequenzen haben, wurden zur Verwendung als Primer hergestellt.
MKA-05: 5'-GCCGCCCAGCAGGCGGGATCCCTCACCACCGAGAGG-3' (36mer)
MKA-06: 5'-TGATCGTCGAGTCAGGGATCCAGAATTTACAGGCAC-3' (36mer)
Die PCR-Reaktion wurde nach dem folgenden Verfahren entsprechend der LA PCR Kit Vers. 2 (Takara Shuzo) durchgeführt. Zunächst wurden 1 μM jedes Primers, 400 μM dNTP und 2,5 U LA-Taq-Polymerase zu 1 μg der Humicola insolens-Genom-DNA, die durch das oben beschriebene Verfahren erhalten worden war, gegeben, gefolgt von einer Amplifikation durch 30 Wiederholungszyklen unter den Reaktionsbedingungen 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten. Als Resultat von 0,8 % Agarosegelelektrophorese wurde eine Amplifikation von 1,6 kbp DNA bestätigt. Dieses 1,6 kbp-DNA-Fragment wurde unter Verwendung eines Sephaglass Band Prep Kit (Pharmacia-Biotech) isoliert und dann an pT7 blue-T-Vektor-Kit (Novagen) ligiert. Diese Plasmid-DNA wurde als pK21 bezeichnet.
(5) Konstruktion von Plasmid pKM04
Plasmid pK21-DNA wurde mit BamHI verdaut und ein 1,6 kbp-DNA-Segment wurde isoliert. Dann wurde Plasmid pM21-DNA mit BamHI verdaut, wonach das Restriktionsenzym durch 10-minütige Behandlung bei 70°C inaktiviert wurde. Dieses wurde mit alkalischer Kälberphosphatase (Takara Shuzo) dephosphatiert und durch 0,8 % Agarosegelelektrophorese abgetrennt, gefolgt von der Isolierung eines 5,2 kbp-DNA-Fragments. Das 1,6 kbp-DNA-Fragment, das aus pK21 stammte, und das 5,2 kbp-DNA-Fragment, das aus pM21 stammte, wurden ligiert, um Plasmid-pKM04 zu erhalten.
(6) Konstruktion von Plasmid pMKD01
Zuerst wurde ein Gen hergestellt, das die Expression des Destomycin-resistenten Gens, das in der offengelegten japanischen Patentveröffentlichung Nr. 59-175889 beschrieben ist, in Humicola insolens erlaubt, wobei der Promotor und Terminator des trp C-Gens, das aus Aspargillus nidulans stammt und das nach bekannten Verfahren erhalten wird, verwendet werden (Mullaney, E. J. et al., Mol. Gen. Genet., 199: 37-45, 1985). Dieses Gen wurde in die XbaI-Stelle von Plasmid pKM04 eingeführt, um Plasmid pMKD01 herzustellen.
Beispiel B2: Transformation von Humicola insolens durch Plasmid pMKD01
(1) Herstellung eines hochkonzentrierten, gereinigten Standards von Plasmid pMKD01
Zunächst wurde hochkonzentrierter gereinigter Standard von pMKD01 hergestellt, um Plasmid pMKD01 in Humicola insolens einzuführen. Nach Einführung von pMKD01 in E. coli JM109 wurde dieses über Nacht bei 37°C in 100 ml LB-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, kultiviert. Die resultierende Kulturflüssigkeit wurde unter Verwendung eines Flexiprep Kit (Pharmacia-Biotech) gereinigt, wodurch 1 μg/μl pMKD01-Plasmid-DNA erhalten wurde.
(2) Transformation von Humicola insolens
Humicola insolens MN200-1 wurde bei 37°C in (S)-Medium kultiviert, wonach die Mikroorganismen durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 3.000 U/min 24 Stunden später gesammelt wurden. Hier bestand die Zusammensetzung des (S)-Mediums aus Zusätzen von Glucose (3,0 %), aber Weglassen von Avicel aus dem vorstehend erwähnten (N)-Medium. Die resultierenden Mikroorganismen wurden mit 0,5 M Saccharose gewaschen und in 10 ml protoplastischer Enzymlösung suspendiert, filtriert mit 0,45 μm-Filter (5 mg/ml Novozyme 234 (NLI), 5 mg/ml Cellulase Onozuka R-10 (Yakult), 0,5 M Saccharose). Die Mycelien wurden in Protoplasten umgewandelt, indem für 60 bis 90 Minuten bei 30°C geschüttelt wur de. Nach Filtrieren dieser Suspension wurden die Protoplasten durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 2.500 U/min gewonnen und dann mit SUTC-Puffer (0,5 M Saccharose, 10 mM Calciumchlorid, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5)) gewaschen.
Protoplasten, die in der obigen Weise hergestellt worden waren, wurden in 1 ml SUTC-Puffer suspendiert, gefolgt vom Zusatz von 10 μg DNA (TE)-Lösung (10 μl) zu 100 μl dieser Suspension und ungestörtem Stehenlassen für 5 Minuten in Eis. Dann wurden 400 μl PEG-Lösung (60 % PEG4000, 10 mM Calciumchlorid, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5)) zugesetzt und nach ungestörtem Stehenlassen für 20 Minuten in Eis wurden 10 ml SUTC-Puffer zugesetzt, gefolgt von einer 10-minütigen Zentrifugation bei 2.500 U/min. Nach Suspendieren der gesammelten Protoplasten in 1 ml SUTC-Puffer wurden sie erneut für 5 Minuten bei 4.000 U/min zentrifugiert und schließlich in 100 μl SUTC-Puffer suspendiert.
Protoplasten, die der obigen Behandlung unterzogen worden waren, wurden mit YMG-Weichagar über YMG-Medium, das 200 μg/ml Hygromycin B enthielt (1 % Glucose, 0,4 % Hefeextrakt, 0,2 % Malzextrakt, 1 % Agar (pH 6,8)), geschichtet und nach Kultivierung für 5 Tage bei 37°C wurden die gebildeten Kolonien als Transformanten eingesetzt.
(3) Kultivierung von pMKD01-transformierten Stämmen und Beurteilung durch SDS-PAGE
Plasmid pMKD01 wurde wie vorher beschrieben in Humicola insolens MN200-1 eingeführt, gefolgt von Selektion von 50 Stämmen, die Resistenz gegen Hygromycin aufweisen. Diese wurden für 5 Tage bei 37°C in (N)-Medium kultiviert. Als der resultierende Kulturüberstand durch SDS-PAGE analysiert wurde, war bei 5 Klonen von pMKD01-transformierten Stämmen die Proteinbande, die als NCE3 bestimmt wurde, 3-4-fach höher als bei dem Elternstamm.
(4) Identifizierung von N-terminalen Aminosäureresten von rekombinantem NCE3
Um zu bestätigen, dass die in großen Mengen exprimierte Proteinbande von dem NCE3-Gen stammte, was auf Resultaten von SDS-PAGE basiert, wurde die N-terminale Aminosäuresequenz dieses Proteins bestimmt. Zunächst wurde eine Säulenchromatographie mit den Kulturüberständen durchgeführt, die aus dem Elternstamm und NCE3-Hoch-Expressionsstämmen erhalten wurden, wobei ein FPLC-System gemäß dem Verfahren des vorstehend beschriebenen Beispiels A2 verwendet wurde, worauf ein Vergleich der Hauptpeaks folgte. Der Peak, der bei den NCE3-Hoch-Expressionsstämmen besonders erhöht war, wurde entfernt und lyophilisiert. Dieses wurde in einer geringen Wassermenge gelöst, gefolgt von Elektrophorese unter Verwendung von 8 % Gel SDS-PAGE Mini (Difco). Das Protein wurde dann elektrisch auf eine PVDF-Membran entsprechend dem Verfahren von Beispiel A2 oben transferiert, und nach Färbung mit Coomassie-Brilliant-Blau R-250 wurde die Membran entfernt und mit Wasser gewaschen. Ein Teil, in dem ein Protein mit einem Molekulargewicht von 66 kD geblottet war, wurde aus dieser Membran ausgeschnitten und dann wurden die modifizierten N-terminalen Reste aus dem geblotteten Protein nach dem Verfahren von Podell, D. N. et al. (Podell, D. N., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 81: 176, 1978) entfernt. Zu allererst wurde das Zielprotein ausgeschnitten und nach Inkubieren für 30 Minuten bei 37°C in einer kleinen Menge an 0,5 % Polyvinylpyrrolidon (Molekulargewicht: 40.000, Sigma)/100 mM Essigsäure-Lösung, wurde gut mit Wasser gewaschen. Dann wurden die modifizierten N-terminalen Reste durch Pfu-Pyroglutamataminopeptidase (Takara Shuzo) entfernt, mit Wasser gewaschen und luftgetrocknet. Dieses wurde dann auf einen Modell 492-Protein-Sequencer angewendet, um 15 Reste der N-terminalen Aminosäuresequenz zu bestimmen. Die resultierende Sequenz ist unten gezeigt.
N-terminale Aminosäuresequenz: Asn-Cys-Gly-Ser-Leu-Thr-Thr-Glu-Arg-His-Pro-Ser-Leu-Ser-Trp (15 Reste)
Diese N-terminale Aminosäuresequenz stimmte mit der Cellulase-NCE2- und -NCE3-fusioniertes Protein-Aminosäuresequenz überein, die auf der Basensequenz von Plasmid pMKD01 bestimmt wurde.
(5) FPLC-Evaluierung von pMKD01-transformierten Stämmen
Wie vorstehend beschrieben wurde, wurde Säulenchromatographie unter Verwendung eines FPLC-Systems durchgeführt, um die Kulturüberstände der fünf Klone, von denen durch SDS-PAGE bestätigt worden war, dass sie große Mengen an NCE3 exprimieren, weiter zu quantifizieren. Die Bedingungen waren dieselben wie in (4) oben. Der NCE3-Peak wurde entfernt und lyophilisiert und das Gewicht wurde gemessen und die Produktivität wurde zwischen Hoch-Expressionsstämmen und dem Elternstamm verglichen. Die Resultate waren wie in der Tabelle unten gezeigt. Tabelle 4

* Produktivität bezieht sich auf die Menge, die pro 1 Liter Kulturflüssigkeit produziert wird. Beispiel B3: Konstruktion von Plasmid pEGD01

Plasmid pMKD01 wurde mit BamHI verdaut und das Restriktionsenzym wurde durch Wärmebehandlung bei 70°C inaktiviert, wonach es dephosphatiert wurde, um ein 8,2 kbp-DNA-Fragment zu isolieren.
Dann wurde das NCE4-Gen durch PCR, basierend auf der Sequenz des NCE4-Gens, das aus Humicola insolens stammte, das in den obigen Beispielen A1 bis A7 erhalten worden war, amplifiziert. Dieses PCR-Produkt, das NCE4 enthielt, war vorab in einer Form konzipiert worden, in welcher jeder Primer eine BamHI-Stelle enthielt, so dass es ligiert werden konnte, während das Raster mit dem 8,2 kbp-BamHI-Fragment des obigen Plasmids pMKD01 angeordnet wurde. Zur Verwendung als Primer wurden synthetische Oligonucleotide mit den unten gezeigten Sequenzen hergestellt.
NCE4-N: 5'-CCGGTGTTGGCCGGATCCGCTGATGGCAAG-3' (30mer)
NCE4-C: 5'-TAAGGCCCTCAAGGATCCCTGCGTCTACAG-3' (30mer)
Die PCR-Reaktion wurde wie folgt durchgeführt. 1 μM jedes Primers, 400 μM dNTP und 2,5 U Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) wurden zu 1 μg Humicola insolens-Genom-DNA gegeben, und ein 0,8 kbp-DNA-Fragment wurde amplifiziert, indem 25 Zyklen der Reaktionsbedingungen, bestehend aus 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten, wiederholt wurden. Dieses 0,8 kbp-DNA-Fragment wurde gewonnen und an das obige 8,2 kbp-BamHI-Fragment von pMKD01 ligiert. Diese Plasmid-DNA wurde als pEGD01 bezeichnet.
Beispiel B4: Expression von Plasmid pEGD01
(1) Transformation von Humicola insolens durch Plasmid pEGD01
Transformation von Humicola insolens MN200-1 durch Plasmid pEGD01 wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel B2 durchgeführt. Zuerst wurde ein hochkonzentrierter und gereinigter Standard von pEGD01 hergestellt, um 1 μg/μl pEGD01-Plasmid-DNA zu erhalten. Humicola insolens MN200-1 wurde transformiert, wobei 10 μl dieser pEGD01-Lösung verwendet wurden, gefolgt von Selektion von 50 Transformantenstämmen, die Resistenz gegen Hygromycin aufweisen. Diese wurden für 5 Tage bei 37°C in (N)-Medium kultiviert. Als der resultierende Kulturüberstand durch SDS-PAGE analysiert wurde, war die Proteinbande, die als NCE4 bestimmt worden war, in den 10 Klonen der Stämme, die durch pEGD01 transformiert waren, 10-16-fach höher als im Elternstamm.
(2) Identifizierung der N-terminalen Aminosäurereste von rekombinantem NCE4
Um auf der Basis der Resultate von SDS-PAGE zu bestätigten, dass die in großen Mengen exprimierter Proteinbande von dem NCE4-Gen stammte, wurde die N-terminale Aminosäuresequenz dieses Proteins bestimmt. Zuerst wurde Säulenchromatographie mit den Kulturüberständen durchgeführt, welche von dem Elternstamm und NCE4-Hoch-Expressionsstämmen erhalten worden waren, unter Verwendung eines FPLC-Systems, gefolgt von einem Vergleich der Hauptpeaks. Die Bedingungen waren dieselben wie im obigen Beispiel B2. Der Peak, der in den NCE4-Hoch-Expressionsstämmen besonders erhöht war, wurde entfernt und lyophilisiert. Dies wurde in einer kleinen Wassermenge aufgelöst. Nach Entfernung der modifizierten N-terminalen Reste nach dem Verfahren von Beispiel B2 wurde die N-terminale Aminosäuresequenz unter Verwendung des obigen Proteinsequenzers bestimmt. Als Resultat wurden zwei Typen an N-terminalen Aminosäuresequenzen in einem Verhältnis von etwa 7:3 erhalten. Die resultierenden Sequenzen waren wie unten gezeigt. Dann wurde die N-terminale Aminosäuresequenz unter Verwendung desselben Protein-Sequenzers ohne Entfernung des modifizierten N-Terminus bestimmt. Als Resultat wurde nur Aminosäuresequenz 1 erhalten, wie sie unten gezeigt ist.
N-terminale Aminosäuresequenz 1: Val-Val-Glu-Glu-Arg-Gln-Asn-Cys-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp (20 Reste)
N-terminale Aminosäuresequenz 2: Asn-(Cys)-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-(Cys)-(Cys)-Lys-Pro-Ser-(Cys) (20 Reste)
Diese N-terminalen Aminosäuresequenzen stimmten mit der Cellulase-NCE2- und -NCE4-fusioniertes Protein-Aminosäuresequenz überein, die aus der Basensequenz von Plasmid pEGD01 bestimmt worden war. Da zwei Typen an N-terminalen Aminosäuresequenzen erhalten worden waren, wurde klar gezeigt, dass, wenn die Signalsequenz dieses fusionierten Proteins gespalten wird, es an einer Vielzahl von Stellen prozessiert wird.
(3) FPLC-Evaluierung von pEGD01-transformierten Stämmen
Wie vorstehend beschrieben worden war, wurden Säulenchromatographie unter Verwendung eines FPLC-Systems durchgeführt, um die Kulturüberstände der fünf Klone, von denen durch SDS-PAGE gezeigt worden war, dass sie große Mengen an NCE4 exprimieren, zu quantifizieren, und der NCE4-Peak wurde entfernt. Dieser wurde dann lyophilisiert und das Gewicht desselben wurde gemessen und die Produktivität wurde zwischen Hoch- Expressionsstämmen und dem Elternstamm verglichen. Solche Resultate waren wie in der Tabelle unten gezeigt. Tabelle 5

* Produktivität bezieht sich auf die Menge, die pro 1 Liter Kulturflüssigkeit produziert wird. Beispiel B5: Konstruktion von Plasmid pIED02

(1) Konstruktion von Plasmid pID01
Plasmid pEGD01 wurde mit HindIII und BamHI verdaut, und es wurde ein 7,2 kbp-DNA-Fragment isoliert.
Dann wurde der Teil der DNA, der für die Promotor- und Signalsequenzen des NCE1-Gens codiert, durch PCR auf der Basis der Sequenz des NCE1-Gens, das aus Humicola insolens stammt und mit dem in der offengelegten japanischen Patentveröffentlichung Nr. 8-56663 beschriebenen Verfahren erhalten wird, amplifiziert. Dieses PCR-Produkt, das den NCEI-Promotor und Signalsequenz enthält, wurde vorab in einer Form konzipiert, in welcher jeder Primer eine HindIII- und BamHI-Stelle enthält, so dass es an das 7,2 kbp HindIII- bis BamHI-Fragment des obigen Plasmids pEGD01 ligiert werden kann. Zur Verwendung als Primer wurden synthetische Oligonucleotide hergestellt, die die unten gezeigten Sequenzen haben.
PNCE1-N: 5'-GTCATGAAGCTTCATTAAGGTACGTATGCAAC-3' (32mer)
PNCE1-C: 5'-GGTGATGGATCCGGCCTGCTGGGCAGCGACGC-3' (32mer)
Die PCR-Reaktion wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel B3 durchgeführt. 1 μM jedes Primers, 400 μM dNTP und 2,5 U Pfu-DNA-Polymerase wurden zu 1 μg Humicola insolens-Genom-DNA gegeben, und ein 1,5 kbp-DNA-Fragment wurde amplifiziert, indem 23 Zyklen folgender Reaktionsbedingungen, bestehend aus 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 4 Minuten, wiederholt wurden. Dieses 1,5 kbp-DNA-Fragment wurde isoliert, indem das PCR-Produkt mit HindIII und BamHI verdaut wurde. Es wurde dann an das obige 7,2 kbp-HindIII- bis -BamHI-Fragment von pEGD01 ligiert. Diese Plasmid-DNA wurde als pID01 bezeichnet.
(2) Konstruktion von Plasmid pIED02
Plasmid pID01 wurde mit BamHI verdaut, und das Restriktionsenzym wurde durch Wärmebehandlung bei 70°C inaktiviert, wonach es dephosphatiert wurde, um ein 8,6 kbp-DNA-Fragment zu gewinnen. Nach Verdau des Plasmids pEGD01 mit BamHI wurde ein 0,8 kbp-DNA-Fragment isoliert, das das NCE4-Gen enthielt. Die zwei Fragmente wurden unter Erhalt von Plasmid pIED02 ligiert.
Beispiel B6: Expression von Plasmid pIED02
(1) Transformation von Humicola insolens durch Plasmid pIED02
Die Transformation von Humicola insolens MN200-1 durch Plasmid pIED02 wurde nach dem Verfahren von Beispiel B2 durchgeführt. Zunächst wurde ein hochkonzentrierter und gereinigter Standard von pIED02 hergestellt, wodurch 1 μg/μl pIED02-Plasmid-DNA erhalten wurde. Humicola insolens MN200-1 wurde unter Verwendung von 10 μl dieser pIED02-Lösung transformiert, worauf eine Selektion von 50 Transformantenstämmen, die Resistenz gegenüber Hygromycin aufweisen, folgte. Diese wurden für 5 Tage bei 37°C in (N)-Medium kultiviert. Als der resultierende Kulturüberstand durch SDS-PAGE analysiert wurde, war die Proteinbande, die als NCE4 bestimmt worden war, bei fünf Klonen, der durch pIED02 transformierten Stämme, 5-10-fach höher als im Elternstamm.
(2) Identifizierung von N-terminalen Aminosäureresten von rekombinantem NCE4
Um auf der Basis der Resultate von SDS-PAGE zu bestätigen, dass die in großen Mengen exprimierte Proteinbande von dem NCE4-Gen stammte, wurde die N-terminale Aminosäuresequenz dieses Proteins bestimmt. Zunächst wurde nach dem Verfahren von Beispiel B2 eine Säulenchromatographie in den Kulturüberständen durchgeführt, die von dem Elternstamm und den NCE4-Hoch-Expressionsstämmen erhalten worden waren; danach wurde der NCE4-Peak entfernt und lyophilisiert. Dieser wurde in einer geringen Wassermenge gelöst. Nach Entfernung der modifizierten N-terminalen Reste nach dem Verfahren von Beispiel B2 wurden 15 Reste der N-terminalen Aminosäuresequenz unter Verwendung des obigen Proteinsequenzers bestimmt. Die resultierende Sequenz war wie unten gezeigt.
N-terminale Aminosäuresequenz: Gln-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-(Cys) (15 Reste)
Die N-terminale Aminosäuresequenz stimmte mit der Cellulase-NCE1- und NCE4-fusioniertes Protein-Aminosäuresequenz überein, die aus der Basensequenz von Plasmid pIED02 bestimmt worden war.
(3) FPLC-Evaluierung von pIED02-transformierten Stämmen
Wie vorher beschrieben wurde, wurde eine Säulenchromatographie unter Verwendung eines FPLC-Systems durchgeführt, um die Kulturüberstände der fünf Klone, von denen durch SDS-PAGE bestätigt war, dass sie große Mengen an NCE4 exprimieren, weiter zu quantifizieren; dann wurde der NCE4-Peak entfernt. Dieser wurde dann lyophilisiert, und das Gewicht wurde gemessen und die Produktivität wurde zwischen Hoch-Expressionsstämmen und dem Elternstamm verglichen. Die Resultate waren wie in der Tabelle unten gezeigt. Tabelle 6

* Produktivität bezieht sich auf die Menge, die pro 1 Liter Kulturflüssigkeit produziert wurde.

SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Protein, umfassend eine in SEQ ID No. 1 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Sequenz von Position 1 bis Position 284 der in SEQ ID No. 1 dargestellten Aminosäuresequenz.
DNA-Sequenz, die für das Protein nach Anspruch 1 codiert.
DNA-Sequenz nach Anspruch 2, wobei die DNA-Sequenz die in SEQ ID No. 2 dargestellte Basensequenz umfasst.
DNA-Sequenz nach Anspruch 3, die eine Basensequenz von Position 118 bis Position 1088 der in SEQ ID No. 2 dargestellten Basensequenz hat.
Vektor, umfassend die DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 2 bis 4.
Wirtszelle, die durch den Vektor nach Anspruch 5 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1, umfassend die Schritte Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 6 unter Erhalt einer Kultur und Sammeln des Proteins nach Anspruch 1 aus der Kultur.
Cellulase-Präperation, die ein Protein nach Anspruch 1 umfasst.
Verfahren zur Entfernung von Flor von cellulosehaltigen Fasern, wobei das Verfahren In-Kontakt-Bringen des Proteins nach Anspruch 1 oder der Cellulase-Präperation nach Anspruch 8 mit cellulosehaltigen Fasern umfasst.
Verfahren zum Entfärben von Denim-gefärbten, cellulosehaltigen Fasern, wobei das Verfahren In-Kontakt-Bringen des Proteins nach Anspruch 1 oder der Cellulase-Präperation nach Anspruch 8 mit Denim-gefärbten, cellulosehaltigen Fasern umfasst.
Verfahren zur Reduzierung cellulosehaltiger Fasern, wobei das Verfahren In-Kontakt-Bringen des Proteins nach Anspruch 1 oder der Cellulase-Präperation nach Anspruch 8 mit cellulosehaltigen Fasern umfasst.
Verwendung des Proteins nach Anspruch 1 oder der Cellulase-Präperation nach Anspruch 8 zur Entfernung von Flor von cellulosehaltigen Fasern.
Verwendung des Proteins nach Anspruch 1 oder der Cellulase-Präperation nach Anspruch 8 zur Entfärbung von Denim-gefärbten, cellulosehaltigen Fasern.
Verwendung des Proteins nach Anspruch 1 oder der Cellulase-Präperation nach Anspruch 8 zur Reduzierung cellulosehaltiger Fasern.