DE69826490T2

DE69826490T2 - Trichoderma reesei swollenin protein und dafür kodierende dns sequenz

Info

Publication number: DE69826490T2
Application number: DE69826490T
Authority: DE
Inventors: A. Barbara SWANSON; Michael Ward; Merja Penttilä; Jaakko Pere; Markku Saloheimo
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1997-07-11
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2018-07-10
Also published as: AU744691B2; EP1003871B1; US20020086350A1; WO1999002693A2; WO1999002693A3; US20030104546A1; CA2659180C; CA2295849A1; WO1999002693A8; NZ502277A; EP1003871A2; AU8296398A; CA2659180A1; JP4261044B2; BR9810701A; US6967246B2; ATE277184T1; CN1261571C; US6458928B1; CA2295849C

Description

Hintergrund der Erfindung
Die ostmotische Aufnahme von Wasser ist die treibende Kraft bei der Expansion von Pflanzenzellen. Wenn Wasser in die Zelle eintritt, expandiert der Protoplast, wird aber durch die Zellwand zurückgehalten. Darüber hinaus bildet ein steifer Komplex von Cellulosemikrofibrillenpolymeren, welcher in eine klebstoffartige Matrix von Pektinen, Hemicellulosen und Proteinen eingebettet ist, einen Teil dieser Wand in reifen Zellen. Man hat lange gedacht, daß ein „die Wand lockernder" Faktor vorhanden sein muss, welcher die mechanischen Eigenschaften einer unreifen Zellwand ändert und es ihr gestattet, einen Prozess der Verlängerung zu vollziehen. McQueen-Mason et al., Plant Cell Bnd. 4, S. 1425–1433 (1992) untersuchten die Regulation der Erweitung von Pflanzenzellen durch die Verwendung einer Rekonstitutionsvorgehensweise. Die Autoren haben festgestellt, dass ein roher Proteinextrakt aus den Zellwänden wachsender Gurkensetzlinge die Fähigkeit besitzt, die Ausdehnung isolierter Zellwände zu induzieren. Die sequentielle HPLC-Fraktionierung des aktiven Wandextraktes enthüllte zwei Proteine mit den Molekulargewichten von 29 und 30 kDa, welche mit der Aktivität assoziiert sind. Jedes Protein alleine konnte eine Ausdehnung der Zellwand ohne nachweisbaren hydrolytischen Abbau der Wand induzieren und schien eine „Säurewachstums"-Antwort von isolierten Wänden zu vermitteln und könnte die Ausdehnung der Pflanzenzellwand durch einen neuartigen biochemischen Mechanismus katalysieren.
Shcherban et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Bnd. 92 S. 9245–9249 (1995) isolierten cDNAs, welche für diese zwei Gurkenproteine kodieren, und verglichen sie mit anonymen exprimierten Sequenzkennungen (expressed sequence tags) von verschiedenartigen Quellen. Die Expansin-cDNA von Reis und Arabidopsis wurden aus diesen Sammlungen identifiziert und zeigten mindestens vier verschiedene cDNAs für Expansin in Reis und sechs verschiedene cDNAs für Expansin in Arabidopsis. Die Autoren schlossen daraus, daß Expansin in seiner Größe und Sequenz in einem hohen Maße konserviert ist (60–87% Aminosäureidentität und 75–95% Ähnlichkeit zwischen jedwedem paarweisem Vergleich), und dass die Multigenfamilie vor der evolutionären Divergenz zwischen Monokotyledonen und Dikotyledonen gebildet wurde. Shcherban et al., stellen fest, daß die hohe Konservierung dieser Multigenfamilie anzeigt, daß der Mechanismus, durch welchen Expansin die Zellwandausdehnung vorantreibt, sehr wenig Variation in der Proteinstruktur erlaubt.
Wang et al., Biotech. Lett. Bnd. 16, Nr. 9, S. 955–958 (1994) haben zwei Proteine in einer chinesischen medizinischen Gurke festgstellt, Trichosanthes kirilowii, welche den Proteinen S1 und S2, welche die zellwandexpandierenden Eigenschaften aufweisen, ähnlich zu sein scheinen. Ähnliche Proteine wurden ebenfalls in wachsenden Tomatenblättern (Keller et al., The Plant Journal, Bnd. 8, Nr. 6, S. 795–802 (1995)) und in den Koleoptilwänden von Hafer (Li et al., Planta Bnd. 191, S. 349–356 (1993)) gefunden.
Cosgrove et al., J. Exp. Botany, Bnd. 45, Sonderausgabe, S. 1711–1719 (1994) schlugen vor, daß kooperative Wechselwirkungen zwischen den Expansin-Proteinen und Pectinasen und Cellulasen auftreten könnten, worin die Enzyme die Matrix derart modifizieren, dass andere Mechanismen der Zellwandexpansion wirksamer sein könnten. Fry, Current Biology, Bnd. 4, Nr. 9 (1994) schlägt vor, daß bei der Auflockerung von Zellwänden es unwahrscheinlich erscheint, daß das Expansin die Cellulose-Cellulose-Bindungen aufbricht, da die Mikrofibrillen während des Wachstums intakt bleiben. Daher lassen die Autoren die beobachteten Brüche von Wasserstoffbindungen in Filterpapier als ein Nebenproblem beiseite und schlagen vor, daß Expansine die intermikrofibrillären Fasern verlängern könnten, indem sie bewirken, daß Hemicelluloseketten sich von Cellulosemikrofibrillen ablösen, um eine Verlängerung zu gestatten.
Trotz der Pionierarbeit, die zuvor auf dem Gebiet der Zellwandausdehnung und ihrer Ursachen verrichtet wurde, steckt die Arbeit, welche mit der Nützlichkeit und Funktionsfähigkeit von Expansinen verknüpft ist, immer noch in ihren Kinderschuhen. Darüber hinaus stammten die Quellen von Expansin bisher immer exklusiv von Pflanzen, für welche die Expressionssysteme für eine Produktion im großen Maßstab nicht optimal sein könnten. Entsprechendermaßen wäre es wertvoll, eine leichte Quelle für Expansin-artiges Material zu haben, welches in großen Mengen aus Organismen hergestellt werden könnte, welche etablierte Produzenten von biologischen Materialien mit einem hohen Durchsatz sind, wie Pilze, Bakterien und andere gut charakterisierte Mikroorganismen.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Swollenin-Protein, welches von einem Pilz oder einem Bakterium stammt, bereit gestellt, wie in den Ansprüchen definiert. Bevorzugtermaßen stammt das Swollenin von einem filamentösen Pilz, mehr zu bevorzugen von einem filamentösen Pilz wie Trichoderma spp., Humicola spp., Neurospora spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Penicillium spp. oder Gliocladium spp. und am meisten zu bevorzugen von Trichoderma spp.. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Swollenin eine Sequenz gemäß der SEQ. ID Nr.: 2, hat mindestens 70% Sequenzindentität mit der Sequenz, welche in der SEQ. ID Nr.: 2 bereit gestellt wird und worin das Swollenin weiter die Fähigkeit hat, Filterpapier zu schwächen und/oder Baumwollfasern zu quellen.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine DNA bereit gestellt, welche für ein Swollenin-Protein aus einem Pilz oder einem Bakterium kodiert. Bevorzugtermaßen stammt die DNA von einem filamentösen Pilz wie Trichoderma spp., Humicola spp., Neurospora spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Penicillium spp. oder Gliocladium spp.. Ebenfalls bevorzugtermaßen umfasst die DNA die Sequenz gemäß der SEQ. ID Nr.: 1. Alternativ hat die DNA mindestens 70% Sequenzidentität mit der Sequenz gemäß der SEQ. ID Nr.: 1 und worin diese DNA für ein Swollenin-Protein kodiert, welches die Fähigkeit hat, Filterpapier zu schwächen und/oder Baumwollfasern zu quellen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hybridisiert die DNA mit einer DNA, welche ganz oder zum Teil die Sequenz hat, welche in der SEQ. ID Nr.: 1 bereit gestellt wird.
Vektoren, welche solche DNA umfassen, Wirtszellen, welche mit solchen Vektoren transformiert wurden und Fermentationsnährlösungen, welche durch solche transformierten Wirtszellen produziert wurden, liegen ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
In einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereit gestellt, Swollenin-Protein zu produzieren, umfassend die Schritte von (a) Erhalten einer Wirtszelle, welche mit einem Vektor transformiert worden ist, umfassend eine Swollenin-Protein kodierende DNA, wobei die DNA aus einem Pilz oder einem Bakterium isoliert wird; (b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, welche für die Expression und gegebenenfalls die Sekretion des Swollenin-Proteins geeignet sind; und (c) Gewinnung der Fermentationsnährlösung, welche das Swollenin-Protein enthält.
Da Pilze und Bakterien nicht im allgemeinen eine Zellulose enthaltende Zellwand haben und keinesfalls dafür bekannt sind, daß sie die Größe über die selben Mechanismen wie höhere Pflanzen steigern, ist die Feststellung der Anmelder, daß diese Mikroorganismen Proteine mit expansinartigen Eigenschaften, herstellen nicht durch vorherige Arbeit, welche mit den Expansinen von Pflanzen verknüpft ist, nahe gelegt worden. Daher ist die Feststellung, daß der cellulolytische Pilz Trichoderma spp. ein expansinartiges Protein herstellt, unerwartet. Es ist jedoch offensichtlich, daß die mikrobielle Klasse von Proteinen von denjenigen, die bisher in Pflanzen entdeckt wurden, abweicht. Zum Beispiel legt das Vorhandensein eines Bereiches auf dem mikrobiellen Swollenin-Protein, welches hierin beschrieben wird, das der Cellulosebindenden Domäne von cellulolytischen Enzymen des Pilzes entspricht, nahe, daß dieses Protein sezerniert wird, um gemeinsam mit den natürlicherweise sezernierten Cellulasen und Hemicellulasen zu wirken, um die Hydrolyse der cellulosehaltigen Biomasse in der Umgebung zu erleichtern. In konsistenter Weise mit diesem Vorschlag hat man festgestellt, daß das Swollenin-Gen von Trichoderma reesei exprimiert wird, wenn der Pilz auf Cellulose als der einzigen Kohlenstoffquelle wachsen gelassen wurde, aber nicht wenn die Kohlenstoffquelle für das Wachstum Glucose war. Dieses Muster der Regulation der Genexpression ist ähnlich zu demjenigen, welches für viele der Cellulose- und Hemicellulose-Gene beobachtet wurde. Diese unerwarteten Befunde führten zu dem Schluss, daß Cellulose oder Hemicellulose abbauende Mikroorganismen, einschließlich von Bakterien, Hefe und Pilzen ebenfalls solche Swollenin-Proteine produzieren würden.
Entsprechendermaßen ist es ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, daß die Swollenine, welche hierin bereitgestellt werden, eine Nützlichkeit in vielen Anwendungen haben können, für welche Cellulase augenblicklich verwendet wird, zum Beispiel für das Reinigen von Textilien (Waschmitteldetergenzien und Vorwaschzusammensetzungen), die Modifizierung von Textilien (das Enthaaren, die Wiederherstellung der Farbe, das Grauverhindern), das Steinwaschen von Denim, die Umwandlung von Biomasse zu Glucose und die Verbesserung des Nährwertes von Futtermitteln für Tiere. Ähnlich wird es betrachtet, daß ein Vorteil der vorliegenden Erfindung darin liegt, daß Swollenine einen synergistischen oder einen additiven Effekt in Kombination mit anderen Enzymen haben können, insbesondere mit Cellulasen wie Endoglucanasen. In anderen Fällen ist es möglich, daß Swollenine eine schädigende Wirkung in einer Anwendung haben könnten; zum Beispiel können sie einen übermäßigen Verlust der Haltbarkeit von Textilien verursachen, wenn sie als eine Nebenaktivität in einer Endoglucanase vorhanden sind, welche durch die Fermentation eines Mikroorganismus hergestellt wird, und welcher für das Reinigen von Textilien oder die Modifizierung verwendet wird. In einem solchen Fall kann die Entfernung des Swollenins aus einem Cellulaseprodukt von Vorteil sein und kann durchgeführt werden durch das biochemische Entfernen des Produktes aus der resultierenden Cellulasemischung, durch Gentechnologie, um dessen Expression zu verhindern oder das Gen zu inaktivieren, oder durch die Zugabe eines chemischen Inhibitors zu der Zusammensetzung, welche das Swollenin umfaßt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 erläutert die Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr.: 1) und die vorausgesagt entsprechende Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 2) von einem cDNA-Klon welcher von einer RNA von Trichoderma reesei (longibrachiatum) nach dem Wachstum auf einer gemischten Kohlenstoffquelle erhalten wurde.
Die 2 erläutert einen Vergleich der Konsensusaminosäuresequenz für Expansin-Proteine von Pflanzen (SEQ ID Nr.: 3) und der Sequenz des Swollenins (SEQ ID Nr.: 4), die hierin beschrieben wurde, welcher die Bereiche der Aminosäurehomologie zeigt.
Die 3 erläutert das Ergebnis des Northern-Blottens von RNA-Proben, hergestellt aus Trichoderma reesei (longibrachiatum)-Mycel, welches auf verschiedenen Kohlenstoffquellen gewachsen ist, und welche mit cDNA von Swollenin sondiert wurden. Spur 1: Cellulose, Spur 2: Glucose, Spur 3: Sorbitol, Spur 4 Sorbitol-Kultur induziert durch Sophorose.
Die 4 erläutert einen Vergleich von neun bekannten Expansin-Aminosäuresequenzen von Pflanzen (SEQ ID Nr.: 5–13) welche die extensive Homologie zeigen, welche bei Pflanzenexpansinen vorhanden ist.
Die 5 zeigt die Plasmidkarte für pGAPT-exp.
Die 6 erläutert die Ergebnisse eines SDS-PAGE-Gellaufs von Kulturüberständen und Kontrollen. Transformanten von Aspergillus, welche das Swollenin von T. reesei produzieren, haben eine Bande, welche oberhalb der 66 kDa Markerbande läuft und diese Bande fehlt auf den Spuren der Negativkontrolle (Aspergillus Stamm vor der Transformation).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definitionen
„Swollenin" bedeutet ein Protein oder ein Polypeptid oder eine Domäne eines Proteins oder eines Polypeptids von mikrobiellem Ursprung stammend, d. h. von Pilzen oder Bakterien, welches die Fähigkeit hat, das Schwächen von Filterpapier und das Quellen von Baumwollfasern zu erleichtern ohne eine cellulolytische Aktivität zu haben, d. h. eine katalytische Aktivität, welche das Aufbrechen einzelner Cellulosestränge in kleinere Monomere (Glucose) oder Oligomere (Polysaccharide) einschließt. Während es nützlich ist, Swollenine in einer lockeren Weise in den Begriffen der Expansin-Proteine zu definieren, welche in McQueen- Mason et al., Plant Cell, Bnd. 4, S. 1425–1433 (1992) beschrieben werden, ist es ebenfalls offensichtlich, daß mikrobielle Swollenine bestimmte Eigenschaften haben, zum Beispiel sind mikrobielle Swollenine viel größere Proteine als Expansive von Pflanzen und haben ein niedriges Maß an Sequenzidentität mit Expansinen von Pflanzen. Darüber hinaus existieren bestimmte mikrobielle Swollenin-Proteine in Verbindung mit einer cellulosebindenden Domäne und können weiter in Verbindung mit einer katalytischen Cellulasedomäne existieren. Zum Beispiel besitzt das hierin gezeigte Swollenin-Protein, das von Trichoderma reesei stammt, eine cellulosebindende Domäne.
Es wird hierin erwogen, daß Swollenine von mikrobiellem Ursprung stammen können und insbesondere von Pilzen oder von Bakterien stammen können. In einer spezifischen Weise wird betrachtet, daß Mikroorganismen, welche cellulolytische Fähigkeiten haben, ausgezeichnete Quellen von Swollenin-Protein sein werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stammt das Swollenin von Trichoderma spp., insbesondere Trichoderma reesei (longibrachiatum). Ebenfalls bevorzugtermaßen stammt das Swollenin und/oder die DNA, welche für ein Swollenin kodiert, gemäß der vorliegenden Erfindung von einem Pilz wie Absidia spp.; Acremonium spp.; Agaricus spp.; Anaeromyces spp.; Aspergillus spp., einschließlich von A. auculeatus, A. awamori, A. flavus, A. foetidus, A. fumaricus, A. fumigatus, A. nidulans, A. niger, A. oryzae, A. terreus und A. versicolor, Aeurobasidium spp.;, Cephalosporum spp.; Chaetomium spp.; Coprinus spp.; Dactyllum spp.; Fusarium spp., einschließlich von F. conglomerans, F. decemcellulare, F. javanicum, F lini, F. oxysporum und F. solani; Gliocladium spp.; Humicola spp., einschließlich von H. insolens und H. lanuginosa; Mucor spp.; Neurospora spp., einschließlich von N. crassa und N. sitophil.; Neocallimastix spp.; Orpinomyces spp.; Penicillium spp.; Phanerochaete spp.; Phlebia spp.; Piromyces spp.; Pseudomonas spp.; Rhizopus spp.; Schizophyllum spp.; Trametes spp.; Trichoderma spp., einschließlich von T. reesei, T. reesei (longibrachiatum) und T. viride; und Zygorhynchus spp.. In einer ähnlichen Weise stellt man sich vor, daß ein Swollenin und/oder eine DNA, welche für ein Swollenin kodiert, wie hierin beschrieben, in cellulolytischen Bakterien gefunden werden kann wie Bacillus spp.; Cellulomonas spp.; Clostridium spp.; Myceliophthora spp.; Thermomonospora spp.; Streptomyces spp., einschließlich von S. olivochromogenes; in einer spezifischen Weise Fasern abbauende ruminale (ruminal) Bakterien wie Fibrobacter succinogenes; und in Hefe, einschließlich von Candida torresii; C. parapsllosis; C. sake; C. zeylanoides; Pichia minuta; Rhodotorula glutinis; R. mucilaginosa; und Sporobolomyces holsaticus.
Bevorzugtermaßen werden Swollenin-Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert oder gereinigt. Mit Reinigung oder Isolation meint man, daß das Swollenin-Protein aus seinem natürlichen Zustand verändert wird, mittels des Trennens des Swollenins von einigen oder allen der natürlich auftretenden Bestandteile, mit welchen es in der Natur assoziiert ist. Dies kann erreicht werden durch Techniken, welche im Fachbereich der Trenntechniken bekannt sind, wie Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophobe Trennung, Dialyse, Proteasebehandlung, Ammoniumsulfatpräzipitation oder eine andere Protein-Salz-Präzipitation, Zentrifugation, Größenausschlußchromatographie, Filtration, Mikrofiltration, Gelelektrophorese oder Trennung auf einem Gradienten, um ganze Zellen, Zellschrott, Verunreinigungen, fremdes Protein oder unerwünschte Enzyme in der Endzusammensetzung zu entfernen. Es ist weiter möglich, dann Bestandteile zu dem Swollenin hinzuzugeben, das die Zusammensetzung enthält, welche für zusätzlichen Nutzen sorgen, zum Beispiel Aktivierungsmittel, Anti-Inhibitionsmittel, wünschenswerte Ionen, Verbindungen, um den pH oder andere Enzyme, wie Cellulase zu kontrollieren.
Die Hybridisierung wird hierin verwendet, um zu analysieren, ob ein gegebenes Fragment oder Gen dem hierin beschriebenen Swollenin entspricht und daher in den Umfang der vorliegenden Erfindung fällt. Der Hybridisierungsassay ist im wesentlichen wie folgt: genomische DNA von einer bestimmten Zielquelle wird fragmentiert durch den Verdau mit einem (bzw.) Restriktionsenzym(en), z. B. EcoRI, HindIII, BamHI, ClaI, KpnI, MluI, SpeI, BglII, NcoI, XbaI, XhoI und XmaI (geliefert von New England Biolabs, Inc., Beverly, MA und Boehringer Mannheim) gemäß den Anleitungen des Herstellers. Mit den Proben wird dann eine Elektrophorese über ein Agarosegel (wie z. B. 0,7% Agarose) durchgeführt, so daß die Trennung der DNA-Fragmente durch die Größe visualisiert werden kann. Das Gel kann kurz in destilliertem H₂O gereinigt und nachfolgend in einer geeigneten Lösung depuriniert werden (wie zum Beispiel 0,25 M HCl) unter sanftem Schütteln, gefolgt von einer Denaturierung während 30 min. (in z. B. 0,4 M NaOH). Ein Renaturierungsschritt kann eingeschlossen werden in welchem das Gel in 1,5 M NaCl, 1 M Tris, pH 7,0 unter sanftem Schütteln für 30 min. plaziert wird. Die DNA sollte dann auf eine in geeignetem Maße positiv geladene Membran transferiert werden, z. B. die Maximum Strength Nytran Plus Membran (Schleicher & Schuell, Keene, N. H.), unter Verwendung einer Transferlösung (wie zum Beispiel 6 × SSC (900 mM NaCl, 90 mM Trinatriumcitrat). Nachdem der Transfer vollständig durchgeführt wurde, im allgemeinen nach etwa 2 Stunden oder mehr, wird die Membran gereinigt und bei Raumtemperatur luftgetrocknet, nachdem eine Reinigungslösung (wie zum Beispiel 2 × SSC [2 × SSC = 300 mM NaCl, 30 mM Trinatriumcitrat]) verwendet wurde. Die DNA sollte dann mit der Membran durch entweder UV-Kreuzvernetzung oder Backen in einem Ofen unter Verwendung von Temperaturen, welche vom Hersteller der Membran empfohlen werden, kreuzvernetzt werden. Die Membran sollte dann vorhybridisiert werden (während etwa 2 Stunden oder mehr) in einer geeigneten Vorhybridisierungslösung (wie zum Beispiel einer wäßrigen Lösung, welche pro 100 ml enthält: 30–50 ml Formamid, 25 ml 20 × SSPE (1 × SSPE = 0,18 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM NaH₂PO₄, pH 7.7), 2,5 ml von 20%igem SDS, 1 ml von 10 mg/ml gescherter Heringsspermien-DNA).
Eine aus der Sequenz in der 1 genommene DNA-Sonde sollte durch Elektrophorese auf einem Agarosegel isoliert werden, das Fragment aus dem Gel ausgeschnitten und aus der ausgeschnittenen Agarose wiedergewonnen. Dieses gereinigte Fragment der DNA wird dann markiert (unter Verwendung von z. B.: dem Megaprime Markierungssystems gemäß den Anweisungen des Herstellers, um ³²P in die DNA zu inkorporieren (Amersham International plc. Buckinghamshire, England)). Die markierte Sonde wird denaturiert durch das Erwärmen auf 95°C während 5 min. und sofort zu der vorausstehenden Vorhybridisierungslösung, welche die Membran enthält, hinzugegeben. Die Hybridisierungsreaktion sollte eine geeignete Zeit voranschreiten und unter geeigneten Bedingungen, zum Beispiel während 18 Stunden bei 37°C unter sanftem Schütteln. Die Membran wird gereinigt (zum Beispiel in 2 × SSC/0,3% SDS) und dann mit einer geeigneten Waschlösung unter leichtem Schütteln gewaschen. Die gewünschte Stringenz wird ein Ausdruck der Bedingungen sein, unter welchen die Membran (Filter) gewaschen wird.
In einer spezifischen Weise wird die Stringenz einer gegebenen Reaktion (d. h. das Ausmaß an Homologie, welches für eine erfolgreiche Hybridisierung notwendig ist) von den Waschbedingungen abhängen, welchen der Filter des Southern-Blots nach der Hybridisierung unterzogen wird. „Niederstringente" Bedingungen wie hierin definiert, werden das Waschen eines Filters eines Southern-Blots mit einer Lösung von 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 20°C während 15 min. umfassen, „Standardstringenz"-Bedingungen umfassen einen weiteren Waschschritt, umfassend das Waschen des Filters des Southern-Blots ein zweites Mal mit einer Lösung von 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 37°C während 30 min.
„Cellulase" ist eine gut klassifizierte Kategorie von Enzymen im Fachbereich und schließt Enzyme ein, die in der Lage sind, Cellulosepolymere zu kürzeren Oligomeren und/oder Glucose zu hydrolysieren. Verbreitete Beispiele für Cellulaseenzyme schließen Exo-Cellobiohydrolasen und Endoglucanasen ein und sind von vielen Spezies cellulolytischer Organismen erhältlich, insbesondere einschließlich von Pilzen und Bakterien.
„Hemicellulase" ist ebenfalls eine gut klassifizierte Kategorie von Enzymen im Fachbereich und schließt Enzyme ein, welche in der Lage sind, Hemicellulosepolymere zu kürzeren Oligomeren zu hydrolysieren. Häufige Beispiele für Hemicellulasen schließen Xylanase und Mannanase ein.
„Cellulose enthaltende Materialien" bedeutet Materialien, welche ein Cellulosepolymer als einen ihrer Bestandteile umfassen. Cellulose wird daher genähte oder ungenähte Textilien einschließen oder andere Artikel, welche aus reiner Baumwolle oder aus Baumwollmischungen gemacht sind, einschließlich von gewobenen Baumwolltextilien, gestrickter Baumwolle, blauem Jeansstoff aus Baumwolle, Baumwollgarn und dergleichen oder Mischungen davon, einschließlich von einer oder mehreren Fasern, die nicht aus Baumwolle sind, einschließlich von synthetischen Fasern wie Polyamidfasern (zum Beispiel Nylon 6 und Nylon 66), Acrylfasern (zum Beispiel Polyacrylonitrilfasern), und Polyesterfasern (zum Beispiel Polyethylenterephthalat), Polyvinylalkoholfasern (zum Beispiel Vinylon), Polyvinylchloridfasern, Polyvinylidenchloridfasern, Polyurethanfasern, Polyharnstofffasern und Aramidfasern. „Cellulose" bedeutet weiter jedwede Baumwolle oder Nicht-Baumwolle, enthaltend eine cellulosehaltige Textilie oder Baumwolle oder Nicht-Baumwolle, enthaltend eine Cellulosemischung einschließlich von natürlichen Cellulosederivaten und von Menschenhand hergestellten Cellulosederivaten (wie Jute, Flachs, Ramie, Rayon, TENCEL^®). Eingeschlossen unter dem Oberbegriff der von Menschenhand hergestellten Cellulose-Derivate sind wiederaufbereitete Textilien, die im Fachbereich gut bekannt sind, wie Rayon. Andere von Menschenhand hergestellte Cellulosederivate schließen chemisch modifizierte Cellulosefasern ein (z. B. Cellulose, die mit Acetat derivatisiert wurde) und Lösemittelgesponnene (solvent-spun) Cellulosefasern. Natürlich ist innerhalb der Definition von Cellulose enthaltenden Textilien jedwede Bekleidung oder Garn, welches aus solchen Materialien gemacht wird, eingeschlossen. In einer ähnlichen Weise schließt „Cellulose enthaltende Textilie" Textilfasern, welche aus solchen Materialien gemacht sind, ein. Zusätzlich schließen die Cellulose umfassenden Materialien Holz, Zellstoff und andere auf Pflanzen basierende Faser (d. h. Gräser, Futtermittel, Saaten, Bäume, Maishülsen), Papier, Pappe, Spanplatte, Nahrungsmittelfasern und Nicht-Nahrungsmittelfasern ein.
„Expressionsvektor" bedeutet ein DNA-Konstrukt, umfassend eine DNA-Sequenz, welche operabel mit einer geeigneten Kontrollsequenz verbunden ist, die in der Lage ist, die Expression der DNA in einem geeigneten Wirt zu bewirken. Solche Kontrollsequenzen können einen Promotor einschließen, um Transkription zu bewirken, eine optionale Operatorsequenz, um die Transkription zu kontrollieren, eine Sequenz, welche für geeignete Ribosomenbindungsstellen auf der mRNA kodiert, und Sequenzen, welche die Termination der Transkription und Translation kontrollieren. Verschiedenartige Zelltypen werden bevorzugtermaßen mit unterschiedlichen Expressionsvektoren verwendet. Ein bevorzugter Promotor für Vektoren, welche in Bacillus subtilis verwendet werden, ist der AprE-Promotor; ein bevorzugter Promotor welcher in E. coli verwendet wird, ist der Lac-Promotor, ein bevorzugter Promotor, welcher in Saccharomyces cerevisiae verwendet wird ist PGK1, ein bevorzugter Promotor, der in Aspergillus niger verwendet wird ist glaA, und ein bevorzugter Promotor für Trichoderma reesei (longibrachiatum) ist cbhl. Der Vektor kann ein Plasmid sein, ein Phagenpartikel oder einfach ein mögliches genomisches Insert. Wenn er einmal in einen geeigneten Wirt transformiert ist, kann der Vektor replizieren und unabhängig vom Wirtsgenom funktionieren oder kann unter geeigneten Bedingungen in das Genom selbst integrieren. In der vorliegenden Beschreibung werden Plasmid und Vektor manchmal in einer autauschbaren Weise verwendet. Die Erfindung ist jedoch so gedacht, andere Formen von Expressionsvektoren einzuschließen, welche den gleichen Funktionen dienen und welche im Fachbereich bekannt sind oder bekannt werden. Daher kann eine weite Vielfalt von Wirts/Expressionsvektor-Kombinationen für die Expression der DNA-Sequenzen dieser Erfindung verwendet werden. Nützliche Expressionsvektoren können zum Beispiel aus Segmenten von chromosomalen, nicht-chromosomalen und synthetischen DNA-Sequenzen bestehen, wie verschiedenartigen bekannten Derivaten von SV40, und bekannten bakteriellen Plasmiden, z. B. Plasmiden von E. coli einschließlich von colE1, pCR1, pBR322, pMb9, pUC19 und ihren Derivaten, Plasmiden mit einem weiteren Wirtsbereich, z. B. RP4, Phagen-DNAs, z. B. die zahlreichen Derivate von dem Phagen λ, z. B. NM989 und anderen DNA-Phagen, z. B. M13 und filamentösen einzelsträngigen DNA-Phagen, Hefeplasmiden, wie das 2 μ Plasmid oder Derivate davon, Vektoren, die in eukaryotischen Zellen nützlich sind, wie Vektoren, die in Tierzellen nützlich sind, und Vektoren die aus Kombinationen von Plasmid- und Phagen-DNAs stammen, wie die Plasmide, welche modifiziert worden sind, um Phagen-DNA oder andere Expressionskontrollsequenzen zu verwenden. Expressionstechniken, welche die Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung verwenden, sind im Fachbereich bekannt und werden allgemein beschrieben, zum Beispiel in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Ausg., Cold Spring Harbour Press (1989). Oftmals werden solche Expressionsvektoren, welche die DNA-Sequenzen der Erfindung einschließen, in einen einzelligen Wirt durch eine direkte Insertion in das Genom einer bestimmten Spezies durch ein Integrationsereignis transformiert (siehe z. B. Bennett & Lasure, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego, S. 70–76 (1991) und die darin zitierten Artikel, welche die gerichtete genomische Insertion in Pilzen als den Wirten beschreiben, sind hierin durch den Bezug darauf mit einbezogen).
„Wirtsstamm" oder „Wirtszelle" bedeutet einen geeigneten Wirt für einen Expressionsvektor, umfassend DNA gemäß der vorliegenden Erfindung. Wirtszellen, welche in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind im allgemeinen prokaryotische oder eukaryotische Wirte, einschließlich von jedweden transformierbaren Mikroorganismen, in welchen eine Expression erreicht werden kann. In einer spezifischem Weise können Wirtsstämme sein Bacillus subtilis, Escherichia coli, Trichoderma reesei (longibrachiatum), Saccharomyces cerevisiae oder Aspergillus niger. Wirtszellen werden transformiert oder transfiziert mit Vektoren, die unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken konstruiert wurden. Solche transformierten Wirtszellen sind in der Lage sowohl Vektoren zu replizieren, welche für Swollenin kodieren und seine Varianten (Mutanten) oder welche das gewünschte Peptidprodukt exprimieren. In einer bevorzugten Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung, bedeutet „Wirtszelle" sowohl die Zellen und Protoplasten, welche von den Zellen von Trichoderma sp. kreiert wurden.
„Signalsequenz" bedeutet eine Sequenz von Aminosäuren, welche an den N-terminalen Anteil eines Proteins gebunden ist, welcher die Sezernierung der reifen Form des Proteins aus der Zelle heraus erleichtert. Diese Definition einer Signalsequenz ist eine funktionelle. Der reifen Form des extrazellulären Proteins fehlt die Signalsequenz, welche während des Sezernierungsprozesses weg geschnitten wird.
„DNA-Konstrukt" oder „Vektor" (hierin austauschbar verwendet) bedeutet eine Nukleotidsequenz, welche eine oder mehrere DNA-Fragmente oder Fragmente von DNA-Varianten umfaßt, welche für jedwede der vorausstehend beschriebenen neuartigen Swollenine oder Derivate davon kodiert.
„In funktioneller Weise angeheftet an" bedeutet, daß eine regulatorische Region, wie ein Promotor, ein Terminator, ein Sezernierungssignal oder ein Enhancer-Bereich an ein strukturelles Gen angeheftet ist, und die Expression dieses Gens kontrolliert.
Herstellung von Swollenin
Die vorliegende Erfindung betrifft die Expression, die Reinigung und/oder die Isolation und Verwendung von Swolleninen und Derivaten von Swolleninen. Diese Swollenine werden bevorzugtermaßen hergestellt durch rekombinante Verfahren. Die Swollenin-Proteine für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung können jedoch durch andere im Fachbereich bekannte Mittel wie die Reinigung von natürlichen Isolaten erhalten werden.
Eine bevorzugte Weise für die Herstellung von Swollenin gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt das Transformieren von Trichoderma sp. als einer Wirtszelle mit einem DNA-Konstrukt, umfassend mindestens ein Fragment von DNA, welches für einen Anteil oder das gesamte des Swollenins kodiert, in einer funktionellen Weise angeheftet an einen Promotor. Die transformierte Wirtszelle läßt man dann unter Bedingungen wachsen, so daß das gewünschte Protein exprimiert wird. Nachfolgend wird das gewünschte Proteinprodukt im wesentlichen zur Homogenität gereinigt.
Bevorzugtermaßen umfaßt der Mikroorganismus, der transformiert werden soll, einen Stamm, welcher von Trichoderma spp. oder Aspergillus spp. abgeleitet ist. Mehr zu bevorzugen umfaßt der Stamm T. reesei (longibrachiatum), welcher nützlich ist für das Erhalten von überexprimiertem Protein oder Aspergillus niger var. awamori. Zum Beispiel RL-P37, beschrieben von Sheir-Neiss et al., in Appl. Microbiol. Biotechnology, 20 (1984) S. 46–53, ist dafür bekannt, erhöhte Mengen an Cellulaseenzymen zu sezernieren. Funktionelle Äquivalente von RL-P37 schließen den Trichoderma reesei (longibrachiatum) Stamm RUT-C30 (ATCC Nr. 56 765) und den Stamm QM9414 (ATCC Nr. 26 921) ein. Ein anderes Beispiel schließt überproduzierende Mutanten ein, wie beschrieben in Ward et al., in Appl. Microbiol. Biotechnology 39: 738–743 (1993). Man erwägt, daß diese Stämme ebenfalls nützlich für die Überexpression von Trichoderm spp.-Swollenin seien.
Wo es gewünscht wird, das Swollenin-Protein in der Abwesenheit von einer cellulolytischen Aktivität zu erhalten, ist es nützlich, zum Beispiel einen Trichoderma-Wirtszellstamm zu erhalten, bei welchem eines oder mehrere Cellulasegene vor der Einführung eines DNA-Konstruktes oder Plasmids, welches das DNA-Fragment, welches für das Swollenin kodiert, enthält, deletiert wurden Solche Stämme können hergestellt werden durch die Verfahren, die in dem USP Nr. 5 246 853 und der WO 92/06 209 offenbart wurden, wobei diese Offenbarungen durch den Bezug darauf mit einbezogen sind. Durch das Exprimieren eines Swollenins in einem Wirtsmikroorganismus, welchem eines oder mehrere Cellulasegene fehlen, werden die Identifikation und die nachfolgenden Reinigungsverfahren vereinfacht. Jedwedes Gen von Trichoderma sp., welches kloniert worden ist, kann deletiert werden, zum Beispiel die Gene cbhl, cbh2, egl1 und egl3, sowie diejenigen, welche für EGIII- und/oder das EGV-Protein kodieren (siehe z. B. USP Nr. 5 475 101 bzw. WO 94/28 117).
Eine Gendeletion kann erreicht werden durch das Einfügen einer Form des gewünschten Gens, das deletiert oder disruptiert werden soll in ein Plasmid, durch Verfahren, welche im Fachbereich bekannt sind. Das Deletionsplasmid wird dann an einer bzw. an geeigneten Restriktionsenzymschnittstelle(n) geschnitten, innerhalb des Bereiches, der für das gewünschte Gen kodiert, und dann wird die für das Gen kodierende Sequenz oder ein Teil davon durch einen selektierbaren Marker ersetzt. Flankierende DNA-Sequenzen des Locus des Gens, das deletiert oder disruptiert werden soll, können, bevorzugtermaßen zwischen etwa 0,5 bis 2,0 kb, auf jeder Seite des selektierbaren Markergens verbleiben. Ein geeignetes Deletionsplasmid wird im allgemeinen einzigartige Restriktionsenzymschnittstellen darin haben, um es zu ermöglichen, daß das Fragment, welches das deletierte Gen enthält einschließlich von flankierenden DNA-Sequenzen und dem selektierbaren Markergen, als ein einzelnes lineares Stück entfernt wird.
Ein selektierbarer Marker muß so gewählt werden, daß er den Nachweis des transformierten Pilzes ermöglicht. Jedwedes selektierbare Markergen, welches in dem ausgewählten Mikroorganismus exprimiert wird, wird geeignet sein. Zum Beispiel wird für Trichoderma sp. der selektierbare Marker so gewählt, daß das Vorhandensein des selektierbaren Markers in den Transformanten nicht in einer signifikanten Weise einen Einfluß auf die Eigenschaften von diesem haben wird. Ein solcher selektierbarer Marker kann ein Gen sein, welches für ein nachweisbares Produkt kodiert. Zum Beispiel kann eine funktionelle Kopie eines Gens von Trichoderma sp. verwendet werden, welches, falls es in dem Wirtsstamm fehlt, darin resultiert, daß der Wirtsstamm einen auxotrophen Phänotyp zeigt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein pyr4^– derivatisierter Stamm von Trichoderma sp. transformiert mit einem funktionellen pyr4-Gen, welches auf diese Weise für einen selektierbaren Marker für die Transformation sorgt. Ein pyr4^– derivatisierter Stamm kann erhalten werden durch die Selektion von Stämmen von Trichoderma sp., welche resistent gegenüber Fluor-Orotsäure (FOA) sind. Das pyr4-Gen kodiert für Orotidin-5'-monophosphatdecarboxylase, ein Enzym, welches für die Biosynthese von Uridin erforderlich ist. Stämme mit einem intakten pyr4-Gen wachsen in einem Medium, welchem Uridin fehlt, sind aber sensitiv gegenüber von Fluor-Orotsäure. Es ist möglich pyr4^– derivatisierte Stämme zu selektieren, welchen ein funktionelles Orotidin-monophosphatdecarboxylaseenzym fehlt, und welche Uridin für das Wachstum nötig haben, durch das Selektieren auf FOA-Resistenz. Unter Verwendung des FOA-Selektionsverfahrens, ist es ebenfalls möglich, Uridin erfordernde Stämme zu erhalten, welchen eine funktionelle Orotat-pyrophosphoribosyltransferase fehlt. Es ist möglich, diese Zellen mit einer funktionellen Kopie des Gens, das für dieses Enzym kodiert, zu transformieren (Berges und Barreau, 1991, Curr. Genet. 19 S. 359–365). Die Selektion auf derivatisierte Stämme wird leicht durchgeführt unter Verwendung des FOA-Resistenzverfahrens, auf das vorausstehend Bezug genommen wird, und auf diese Weise wird das pyr4-Gen bevorzugtermaßen als ein selektierbarer Marker verwendet.
Um pyr4^– Trichoderma sp. zu transformieren, so daß diesen die Fähigkeit fehlt, eines oder mehrere Cellulasegene zu exprimieren, wird dann ein einzelnes DNA-Fragment, welches ein disruptiertes oder deletiertes Cellulasegen umfaßt, aus dem Deletionsplasmid isoliert und verwendet, um einen geeigneten pyr^– Trichoderma Wirt zu transformieren. Die Transformanten werden dann identifiziert und selektiert, basierend auf ihrer Fähigkeit, das pyr4-Genprodukt zu exprimieren und auf diese Weise die Uridin-Auxotrophie des Wirtsstammes zu komplementieren. Eine Southern-Blot-Analyse wird dann an den resultierenden Transformanten durchgeführt, um ein doppeltes Überkreuzungsintegationsereignis zu identifizieren und zu bestätigen, welches einen Teil oder das Gesamte des kodierenden Bereiches der genomischen Kopie des Gens, das deletiert werden soll, durch die selektierbaren Marker pyr4 ersetzt.
Obwohl die spezifischen Plasmidvektoren, welche vorausstehend beschrieben wurden, sich auf die Herstellung von pyr^– Transformanten beziehen, ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Vektoren beschränkt. Verschiedenartige Gene können deletiert und ersetzt werden in dem Trichoderma sp. Stamm unter Verwendung der vorausstehenden Verfahren. Zusätzlich können jedwede verfügbaren selektierbaren Marker verwendet werden, wie vorausstehend diskutiert. Tatsächlich kann jedwedes Gen von Trichoderma sp., welches kloniert und auf diese Weise identifiziert worden ist, aus dem Genom unter Verwendung der vorausstehend beschriebenen Strategie deletiert werden.
Wie vorausstehend festgestellt, sind die verwendeten Wirtsstämme Derivate von Trichoderma sp., welchen das Gen fehlt, oder welche ein nicht-funktionelles Gen oder Gene haben, welche den ausgewählten selektierbaren Markern entsprechen. Falls zum Beispiel der selektierbare Marker pyr4 ausgewählt wird, dann wird ein spezifischer pyr4^– derivatisierter Stamm als ein Empfänger in dem Tranformationsverfahren gewählt. In einer ähnlichen Weise können selektierbare Marker, welche Gene von Trichoderma sp. umfassen, die äquivalent sind zu den Genen amds, argB, trpC, niaD von Aspergillus nidulans verwendet werden. Der entsprechende Empfängerstamm muß daher ein Derivatstamm sein wie argB^–, trpC^– bzw. niaD^–.
Die DNA, welche für das Swollenin-Protein kodiert, wird dann für eine Insertion in einen geeigneten Mikroorganismus hergestellt. Gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt die DNA, die für ein Swollenin-Enzym kodiert, die gesamte DNA, die notwendig ist, um für ein Protein zu kodieren, welches eine funktionelle Swollenin-Aktivität hat. Entsprechend kann die DNA von jedweder mikrobiellen Quelle abstammen, welche Swollenin produziert, unter der Voraussetzung, daß das Gen den Methoden folgend, die hierin beschrieben sind, identifiziert und isoliert werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert die DNA für ein Swollenin-Protein, daß von Trichoderma sp. stammt und mehr zu bevorzugen, von Trichoderma reesei (longibrachiatum).
Das DNA-Fragment oder das Fragment der varianten DNA, welches für das Swollenin oder das Derivat kodiert, kann in einer funktionellen Weise an eine Promotorsequenz von Pilzen angeheftet sein, zum Beispiel dem Promotor von dem cbhl oder ebl1 Gen.
Es wird ebenfalls betrachtet, daß mehr als eine Kopie von der DNA, welche für ein Swollenin kodiert, in den Stamm rekombiniert werden kann, um eine Überexpression zu erleichtern.
Die DNA, die für das Swollenin kodiert, kann hergestellt werden durch die Konstruktion eines Expressionsvektors, welcher die DNA trägt, welche für die trunkierte Cellulase kodiert. Der Expressionsvektor, welcher das eingefügte DNA-Fragment trägt, welches für das Swollenin kodiert, kann jedweder Vektor sein, welcher in der Lage ist, autonom in einem gegebenen Wirtsorganismus zu replizieren, oder in die DNA des Wirts zu integrieren, typischerweise ein Plasmid. In bevorzugten Ausführungsformen werden zwei Arten von Expressionsvektoren zum Erhalt der Expression von Genen betrachtet. Die erste enthält DNA-Sequenzen, in welchen der Promotor, der für das Gen kodierende Bereich und die Terminatorsequenz alle von dem Gen stammen, das exprimiert werden soll. Eine Trunkierung des Gens kann erhalten werden, durch das Deletieren unerwünschter DNA-Sequenzen (z. B. die für unerwünschte Domänen kodieren) um die Domäne, welche exprimiert werden soll, unter der Kontrolle ihrer eigenen Transkriptions- und Translations-regulatorischen Sequenzen zu lassen. Ein selektierbarer Marker ist ebenfalls auf dem Vektor enthalten, was die Selektion auf eine Integration in den Wirt von multiplen Kopien der neuartigen Gensequenzen gestattet.
Die zweite Art eines Expressionsvektors wird zuvor zusammengesetzt und enthält Sequenzen, welche für eine Transkription auf hohem Niveau erforderlich sind, und einen selektierbaren Marker. Es wird erwogen, daß der kodierende Bereich für ein Gen oder einen Teil davon in diesen Expressionsvektor für einen allgemeinen Zweck so eingefügt werden kann, daß er unter der transkriptionellen Kontrolle der Expressionskassetten der Promotor- und Terminatorsequenzen ist. Zum Beispiel ist pTEX ein solcher Expressionsvektor für einen allgemeinen Zweck. Gene oder Teile davon können stromabwärts von dem starken cbhl-Promotor eingefügt werden.
In dem Vektor sollte die DNA-Sequenz, welche für das Swollenin-Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, in einer oparablen Weise mit den Transkriptions- und Translationssequenzen verknüpft sein, d. h. einer geeigneten Promotorsequenz und Signalsequenz im Leserahmen mit dem Strukturgen. Der Promotor kann jedwede DNA-Sequenz sein, welche eine Transkriptionsaktivität in der Wirtszelle zeigt, und kann von Genen stammen, welche für Proteine kodieren, entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle. Das Signalpeptid sorgt für die extrazelluläre Produktion des Swollenins oder von Derivaten davon. Die DNA, welche für die Signalsequenz kodiert, ist bevorzugtermaßen diejenige, welche natürlicherweise mit dem Gen, das exprimiert werden soll, assoziiert ist, die Signalsequenz wird jedoch von jedweder geeigneten Quelle, zum Beispiel von Exocellobiohydrolasen oder einer Endoglucanase von Trichoderma in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
Die Verfahren, die verwendet wurden, um die DNA-Sequenzen, die für die Swollenine der vorliegenden Erfindung kodieren, mit dem Promotor zu ligieren und für die Insertion in geeignete Vektoren, sind im Fachbereich gut bekannt.
Der vorausstehend beschriebene DNA-Vektor oder das -Konstrukt können in die Wirtszelle in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren eingeführt werden, wie der Transformation, der Transfektion, der Mikroinjektion, der Mikroporation, biolistischem Beschuß und dergleichen.
In dem bevorzugten Transformationsverfahren muß in Betracht gezogen werden, daß die Permeabilität der Zellwand gegenüber von DNA in Trichoderma sp. sehr niedrig ist. Entsprechend ist die Aufnahme der gewünschten DNA-Sequenz, des Gens oder des Genfragmentes bestenfalls minimal. Es gibt eine Anzahl von Verfahren, um die Permeabilität der Zellwand von Trichoderma sp. in dem Derivatstamm zu erhöhen (d. h. das Fehlen eines funktionellen Gens entsprechend dem verwendeten selektierbaren Marker) vor dem Transformationsverfahren.
Das bevorzugte Verfahren in der vorliegenden Erfindung, um Trichoderma sp. für eine Transformation zu präparieren, schließt die Präparation von Protoplasten aus Pilzmycel ein. Das Mycel kann aus gekeimten vegetativen Sporen erhalten werden. Das Mycel wird mit einem Enzym behandelt, welches die Zellwand verdaut, was in Protoplasten resultiert. Die Protoplasten werden dann durch das Vorhandensein eines osmotischen Stabilisators in dem Suspensionsmedium geschützt. Diese Stabilisatoren schließen Sorbitol, Mannitol, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat und dergleichen ein. Gewöhnlich variiert die Konzentration dieser Stabilisatoren zwischen 0,8 M und bis zu 1,2 M. Es wird bevorzugt etwa eine 1,2 M Lösung von Sorbitol in dem Suspensionsmedium zu verwenden.
Die Aufnahme von DNA in den Wirtsstamm von Trichoderma sp. ist abhängig von der Calziumionenkonzentration. Im allgemeinen wird etwa zwischen 10 mM CaCl₂ und 50 mM CaCl₂ in einer Aufnahmelösung verwendet. Neben der Notwendigkeit des Calziumions in der Aufnahmelösung, sind andere Posten, die im allgemeinen eingeschlossen sind, ein pufferndes System wie TE-Puffer (10 mM Tris, pH 7,4; 1 mM EDTA) oder 10 mM MOPS-Puffer, pH 6,0 (Morpholinpropansulfonsäure) und Polyethylenglycol (PEG). Man glaubt, daß das Polyethylenglycol so wirkt, daß es die Zellmembranen fusioniert und auf diese Weise den Inhaltstoffen des Mediums gestattet, in das Cytoplasma des Trichoderma sp. Stammes überführt zu werden, und die Plasmid-DNA wird zu dem Nukleus transferiert. Diese Fusion hinterläßt häufig multiple Kopien der Plasmid-DNA, angeordnet im Tandem in dem Chomosom des Wirtes.
Gewöhnlich wird eine Suspension, welche die Trichoderma sp. Protoplasten oder Zellen enthält, welche einer Permeabilitätsbehandlung unterzogen wurden, in einer Dichte von 10⁸ bis zu 10⁹/ml, bevorzugtermaßen 2 × 10⁸/ml, werden in der Transformation verwendet. Ein Volumen von 100 Mikroliter dieser Protoplasten oder Zellen in einer geeigneten Lösung (z. B. 1,2 M Sorbitol, 50 mM CaCl₂) wird mit der gewünschten DNA gemischt. Im allgemeinen wird eine hohe Konzentration PEG zu der Aufnahmelösung hinzugegeben. Von 0,1 bis 1 Volumen von 25%-igem PEG 4000 kann zu der Protoplastensuspension hinzu gegeben werden. Es wird jedoch bevorzugt, etwa 0,25 Volumen zu der Protoplastensuspension hinzu zu geben. Zusatzstoffe wie Dimethylsulfoxid, Heparin, Spermidin, Kaliumchlorid und dergleichen können ebenfalls zu der Aufnahmelösung hinzu gegeben werden und bei der Transformation helfen.
Im allgemeinen wird die Mischung dann bei etwa 0°C während einer Periode, die zwischen 10 und 30 min liegt, inkubiert. Zusätzliches PEG wird dann zu der Mischung zugegeben, um die Aufnahme des gewünschten Gens oder der DNA-Sequenz weiter zu erhöhen. Das 25%-ige PEG 4000 wird im allgemeinen in Volumina von 5 bis 15-fach des Volumens der Transformationsmischung zugegeben; jedoch können größere und kleinere Volumina geeignet sein. Das 25%-ige PEG 4000 ist bevorzugtermaßen etwa 10 mal das Volumen der Transformationsmischung. Nachdem das PEG zugegeben wurde, wird die Transformationsmischung bei Raumtemperatur vor der Zugabe einer Sorbitol- und CaCl₂-Lösung inkubiert. Die Protoplastensuspension wird dann weiter zu geschmolzenen Aliquots eines Wachstumsmediums zugegeben. Dieses Wachstumsmedium gestattet nur das Wachstum der Transformanten. Jedwedes Wachstumsmedium kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, welches geeignet ist, die gewünschten Transformanten wachsen zu lassen. Falls jedoch Pyr⁺ Transformanten selektiert werden, wird es bevorzugt, ein Wachstumsmedium zu verwenden, welches kein Uridin enthält. Die nachfolgenden Kolonien werden transferiert und auf einem Wachstumsmedium, welches von Uridin depletiert ist, gereinigt.
In diesem Stadium können stabile Transformanten von instabilen Transformanten durch ihre schnellere Wachstumsrate und die Bildung kreisförmiger Kolonien mit einem glatten anstelle eines ausgefransten Randes auf dem festen Kulturmedium, dem Uridin fehlt, unterschieden werden. Zusätzlich kann in einigen Fällen ein weiterer Stabilitätstest gemacht werden, indem die Transformanten auf einem festen Nicht-Selektivmedium (d. h. Uridin enthaltend) gemacht werden, indem Sporen von diesem Kulturmedium geerntet werden und der Prozentsatz dieser Sporen bestimmt wird, welcher nachfolgend auf Selektivmedium, dem Uridin fehlt, keimen und wachsen wird.
In einer besonderen Ausführungsform des vorausstehenden Verfahrens werden das Swollenin oder Derivate davon in einer aktiven Form aus der Wirtszelle nach dem Wachstum in Flüssigmedium entweder als ein Ergebnis des geeigneten posttranslationalen Prozessierens des neuen Swollenins oder von Derivaten davon geerntet.
Die exprimierten Swollenine werden aus dem Medium durch konventionelle Verfahren, einschließlich der Separation der Zellen aus dem Medium durch Zentrifugation, Filtration und Präzipitation der Proteine in dem Überstand oder dem Filtrat mit einem Salz, zum Beispiel mit Ammoniumsulfat wiedergewonnen. Zusätzlich können chromatographische Verfahren, wie Ionenaustauschchromatographie oder Affinitätschromatographie verwendet werden. Antikörper (polyklonale oder monoklonale) können gegen die natürlichen gereinigten Swollenine erzeugt werden oder synthetische Peptide können von Anteilen des Swollenin-Moleküls hergestellt werden, und dafür verwendet werden, polyklonale Antikörper zu erzeugen.
Beispiel 1
Trichoderma reesei (longibrachiatum) cDNA
Für ein neuartiges Swollenin kodierender Klon
Die 1 zeigt die Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr.: 1) und die vorausgesagte entsprechende Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 2) von einem cDNA Klon, welcher aus einer cDNA-Bibliothek, die aus der RNA von Trichoderma reesei (longibrachiatum) nach dem Wachstum auf einer gemischten Kohlenstoffquelle hergestellt wurde, wie beschrieben von Saloheimo et al., 1994, Molec. Microbiol. 13: 219–228. Die cDNA zeigte die folgenden Charakteristika, welche helfen, um das Gen zu beschreiben:
Ein offener Leserahmen von 1482 nt wurde identifiziert, und das kodierte Protein wurde abgeleitet.
Die ersten 18 Aminosäuren des vorausgesagten Proteins haben die folgenden Eigenschaften, die für eine Sezernierungssignalsequenz und eine Signalschnittstelle erwartet werden. Es gibt eine positiv geladene Aminosäure (Lysin) nahe am aminoterminalen Methionin, auf welche eine Sequenz hydrophober Aminosäuren folgt und eine offensichtliche Signal-Peptidaseschnittstelle, folgend auf die Aminosäure Ile18. Der vorausgesagte N-Terminus des reifen Swollenins könnte daher Gln-Gln sein. In einer ähnlichen Weise haben viele von den reifen Cellulasen, die von Trichoderma hergestellt werden, ein Glutamin am N-Terminus (z. B., CBHI, CBHII, EGI, EGII und EGIII) und sowohl EGI als auch EGII beginnen mit einem Paar von Glutaminresten, was den Schluß bestärkt, daß dies der N-Terminus ist. Es wird daher vorausgesagt, daß das reife Protein eine Länge von 475 Aminosäuren hat und ein Molekulargewicht von etwa 49,5 kDa, was irgend eine mögliche Glycosylierung oder andere Modifikation nicht einschließt, und einen berechneten pI von etwa 4,6, basierend auf der Aminosäurezusammensetzung. Es gibt drei mögliche N-verknüpfte Glycosylierungsstellen (mit der Konsensusaminosäuresequenz von N-X-S/T) an den Asparaginen 160, 336 und 406. Die Reste 4 bis 39 der vorausgesagten reifen Proteinsequenz haben eine enge Ähnlichkeit mit den Cellulose bindenden Domänen (CBD) von Cellulasen, die von Trichoderma hergestellt wurden und anderen Cellulasen von Pilzen (58% Identität mit dem CBD von CBHII von Trichoderma). CBD sind ebenfalls assoziiert mit einigen nicht-cellulolytischen extrazellulären Pilzenzymen wie Acetylxylanesterase und Mannanase von Trichoderma reesei (longibrachiatum) und eine ähnliche Identität wird zwischen der Swollenin CBD und diesen CBD gezeigt.
Auf die CBD des vorausgesagten Proteins von Trichoderma folgt ein Bereich (von dem Rest 41 bis etwa dem Rest 86), welcher reich ist an Ser-, Thr-, Gly- und Pro-Resten, und welcher eine ähnliche Funktionalität mit der Linker oder Gelenkregion teilen sollte, welche in Trichoderma vorhanden ist und anderen Cellulasen von Pilzen, und welcher das CBD mit der katalytischen Domäne verknüpft.
Bereiche der Ähnlichkeit werden beobachtet zwischen der vorausgesagten Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 2) von dem Swollenin von Trichoderma in der 1 und bekannten Sequenzen von Expansinen höherer Pflanzen. Die 2 zeigt die Gleichrichtung zwischen einem Teil des vorausgesagten Proteins von Trichoderma und einer Konsensussequenz (SEQ ID Nr.: 3), welche von neun Expansinen von Pflanzen durch Shcherban et al., supra abgeleitet ist. Diese Sequenzen wurden gleichgerichtet unter Verwendung des Jotun Hein-Algorithmus innerhalb des Lasergene Softwarepakets (DNASTAR Inc.) und eine 36%-ige Ähnlichkeit wurde zwischen den zwei Aminosäuresequenzen berechnet. Von den 322 Aminosäuren der Swolleninsequenz von Trichoderma, welche in dieser Gleichrichtung verwendet wurde, sind 70 oder 21,7% identisch mit der Konsensussequenz von höheren Pflanzen.
Bereiche der Ähnlichkeit können ebenfalls zwischen dem Swollenin von Trichoderma reesei (longibrachiatum) und dem menschlichen Protein Titin beobachtet werden, welches reich ist an Wiederholungen bzw. Repeats von Fibronectin-Typ. Die Homologie wurde in einer Ähnlichkeitssuche mit den Proteinsequenzdatenbanken nachgewiesen, ausgeführt mit dem Programm BLAST (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 215: 403–410) und die Gleichrichtungen, die als Beispiele gezeigt werden, wurden mit dem Programm geschaffen. Die Bereiche von Titin, welche homolog sind mit dem Swollenin von T. reesei, sind Teile der Repeats vom Fibronectin-Typ. Fibronectin-Repeats hat man in einigen bakteriellen Kohlenhydrat modifizierenden Enzymen gefunden (Little et al., 1994, J. Mol. Evol., 39: 631–643) aber nicht in irgendeinem Protein von Pilzen. Eine BLAST-Suche enthüllt keine Ähnlichkeit mit den Expansinen von Pflanzen und Proteinen, welche einen Fibronectin-Repeat enthalten.
Das Swollenin Gen von Trichoderma reesei (longibrachiatum) wurde exprimiert, wenn man den Pilz auf Cellulose als der einzigen Kohlenstoffquelle wachsen ließ, aber nicht wenn er auf Glucose als der einzigen Kohlenstoffquelle wachsen gelassen wurde.
Um die Regulation der Expression des Swollenin-Gens in Trichoderma zu untersuchen, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Der Trichoderma reesei (longibrachiatum) Stamm QM9414 wurde in Schüttlerflaschen (28°C, 200 U/min) in einem Minimalmedium (Penttilä et al., 1987 Gene 61: 155–164), 5% oder 2% Cellulose enthaltend, während drei Tagen wachsen gelassen. Um auf die Induktion durch Sophorose zu testen, ließ man den Stamm in einem Minimalmedium mit 2% Sorbitol während drei Tagen wachsen, und Sophorose wurde bis zur Endkonzentration von 1 mM zugegeben. Die Kultur wurde weitere 10 Stunden fortgesetzt, und dieselbe Menge an Sophorose wurde zugegeben. Die Kultivierung wurde 5 Stunden nach der zweiten Zugabe beendet. Eine Kultur von 87 Stunden in 2% Sorbitol wurde ausgeführt ohne die Zugabe von Sophorose als eine Kontrolle. Nach den Kulturen wurde das Mycel durch eine Filtration mit einem Glasfaserfilter geerntet, mit 0,9% NaCl gewaschen und eingefroren. Die Gesamt-RNA wurde aus den Mycel-Proben gemäß Chirgwin et al., (1979, Biochem. J. 18: 5294–5299) isoliert. RNA-Proben von 5 μg wurden mit Glyoxal behandelt und auf einem 1%-igen Agarosegel in 10 mM Na-Phosphat-Puffer, pH 7, laufen gelassen. Das Kapillar-Blotten auf eine Hybond N Nylon-Membran (Amersham) wurde durchgeführt gemäß den Anleitungen des Herstellers. Die Hybridisierungssonde wurde hergestellt durch das Verdauen des Plasmids der cDNA-Bibliothek, welches die cDNA von Swollenin trug, mit EcoRI und XhoI, das Laufen lassen des verdauten Plasmids auf einem 0,8%-igen Agarosegel und das Isolieren des cDNA-Fragmentes aus dem Gel mit dem Quiaquick Gelextraktions-Kit (Quiagen). Die Sonde wurde mit ³²P-dCTP unter Verwendung des Random Primed DNA Markierungs-Kits (Boehringer Mannheim) markiert. Die Hybridisierung war eine während 24 Stunden bei 42°C in 50% Formamid, 10% Dextransulfat, 1% SDS, 1 M NaCl, 125 μg/ml Heringsspermien-DNA. Der Filter wurde bei 42°C in 5 × SSPE 15 Minuten lang gewaschen, in 1 × SSPE, 0,1%SDS 2 × 15 min und in 0,1 × SSPE, 0,1% SDS 2 × 15 Minuten bei Raumtemperatur. (1 × SSPE ist 0,18 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM NaH₂PO₄, pH 7,7). Die Ergebnisse dieses Experiments sind in der 3 gezeigt. Keine mRNA von Swollenin wurde nach dem Wachstum auf Glucose beobachtet und sehr wenig wurde nach dem Wachstum auf Sorbitol beobachtet. Im Gegensatz dazu wurden hohe Niveaus an mRNA von Swollenin nach dem Wachstum auf Cellulose oder nach der Zugabe von Sophorose zu einer unter Sorbitol gewachsenen Kultur beobachtet.
Beispiel 2
Herstellung eines klonierten, für Trichoderma Swollenin kodierenden DNA-Moleküls
Das folgende wird bereitgestellt als ein Verfahren zur Herstellung eines Klons, welcher ein gesamtes in dem Beispiel 2 beschriebenes Swollenin-Gen umfaßt. In diesem Beispiel werden genomische DNA oder cDNA-Klone von Trichoderma abgeleitet und unter Verwendung des folgenden Verfahrens hergestellt.
Die nachstehend gezeigten Oligonukleotide werden synthetisiert:
Das Oligonukleotid EXP-A enthält eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym BglII nahe dem 5'-Ende gefolgt von der DNA-Sequenz von dem nt, bzw. Nukleotid 425 bis nt 445 der SEQ. ID Nr.: 1. Das Oligonukleotid EXP-B enthält eine Erkennungsstelle für XbaI nahe dem 5'-Ende, gefolgt von dem reversen Komplement der DNA-Sequenz von nt 1471 bis nt 1490 der SEQ ID Nr.: 1.
Eine Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde durchgeführt unter Verwendung der Oligonukleotide EXP-A und EXP-B als den Primern und genomischer Gesamt-DNA, die aus dem Trichoderma reesei Stamm QM6a (ATCC 13631) isoliert worden war als der Matrize. Das DNA-Polymeraseenzym (Pwo Polymerase), der Puffer und die verwendete Deoxynukleotidmischung wurden von Boehringer Mannheim geliefert. Die folgenden Bedingungen wurden für die PCR verwendet; Schritt 1, 1 min. bei 94°C; Schritt 2, 40 s. bei 92°C; Schritt 3, 1 min. bei 50°C; Schritt 4, 2 min. bei 72°C; die Schritte 2, 3 und 4 wurden 29 Mal wiederholt; Schritt 5,5 min. bei 72°C.
Das DNA-Hauptprodukt der PCR war ein Fragment von etwa 1,3 kb wie durch eine Agarosegelelektrophorese abgeschätzt. Das PCR-Produkt wurde mit BglII und XbaI verdaut, und das DNA-Fragment von 1,3 kb wurde aus einem Agarose-Elektrophorese-Gel gereinigt. Dieses DNA-Fragment wurde mit pSL1180 (Pharmacia) ligiert, welches mit BglII und XbaI verdaut worden war. Das resultierende Plasmid wurde als pSLexpPCR bezeichnet. Die Sequenzanalyse der DNA bestätigte, daß das Insert von 1,3 kb in pSLexpPCR dem erwarteten Fragment des Swollenin-Gens von Trichoderma entsprach. Die DNA-Sequenz enthüllte das Vorhandensein von drei Introns innerhalb dieses 1,3 kb Fragmentes an den Positionen, welche denen zwischen nt 575 und nt 576 zwischen nt 791 und nt 792 und zwischen nt 969 und nt 970 der SEQ ID Nr.: 1 entsprechen.
Das Plasmid oder das Insert von 1,3 kb, das es enthält, kann nun als eine Hybridisierungssonde verwendet werden, um es zu gestatten, daß das gesamte Swollenin-Gen von jedweder genomischen DNA oder cDNA-Bibliothek von Interesse kloniert werden kann. Die Swollenin kodierende DNA innerhalb des pSLexpPCR schließt nicht diejenigen Bereiche ein, welche der CBD oder der Linker- (Gelenk-) Region entsprechen. Daher würde vom Entwurf her erwartet werden, daß es mit anderen Swollenin-DNA-Sequenzen, nicht aber mit CBD kodierenden Sequenzen, welche ein Teil von anderen Nicht-Swollenin-Genen sein können, hybridisiert.
Die genomische Gesamt-DNA von dem T. reesei (longibrachiatum) Stamm QM6a wurde getrennt mit einer Vielzahl von verschiedenen Restriktionsendonukleasen verdaut und einer Agarosegelelektrophorese unterzogen. Die DNA wurde nachfolgend auf einen Nytran (S & S) Membranfilter geblottet und mit dem BglII-XbaI-DNA-Fragment von 1,3 kb sondiert, welches aus dem pSLexpPCR isoliert und mit ³²P mit dem Megaprimesystem zur randomisierten Markierung, geliefert von Amersham, markiert worden war. Eine Hybridisierung mit der Sonde wurde bei einer mittleren Stringenz in einem Puffer, welcher 30% Formamid, 5 × SSPE, 0,5%-SDS enthielt, bei 38°C durchgeführt. Der Membranfilter wurde nachfolgend bei einer mittleren Stringenz in 2 × SSC, 0,1% SDS bei 55°C gewaschen, bevor er einem Röntgenfilm exponiert wurde. Die Ergebnisse zeigten an, daß die genomische Kopie des Swollenin-Gens von T. reesei auf einem BglII-Fragment von etwa 4,5 kb sitzt oder auf einem XbaI-Fragment von etwa 5,5 kb.
Mit dem gegebenen, exemplarisch dargestellten Swollenin-Gen, wie vorausstehend bereit gestellt, wäre es Routine für einen Fachmann, das Swollenin-Gen von Trichoderma reesei aus genomischer DNA oder aus cDNA-Bibliotheken durch eine Kolonienhybridisierung unter Verwendung des in pSLexpPCR eingefügten PCR-Fragmentes als einer Sonde, zu klonieren.
Beispiel 3
Klonieren der genomischen Kopie des Swollenins von T.REESEI und Expression davon in A. NIGER VAR.AWAMORI
Die genomische Kopie von Swollenin aus T. reesei wurde durch PCR kloniert. Die Matrizen-DNA stammte aus T. reesei RutC-30 (ATCC 56765) und die den 5'- und 3'-Enden der für Swollenin kodierenden Region entsprechenden Primer wurden als GCI-PVS-055 (gcg cag atc tca gca atg gct ggt aag ctt atc ctc g) und als GCI-PVS-056 (gcg ctc tag atc aat tct ggc taa act gca cac c) bezeichnet.
Das durch eine PCR amplifizierte Fragment wurde mit BglII und XbaI verdaut und in einen BglII-XbaI-geöffneten pGAPT-PT kloniert, was in pGAPT-expC resultierte. Die Sequenzierung des Inserts enthüllte, daß die chromosomale Kopie des Swollenin-Gens 5 Introns hat.
Die chromosomale Kopie des Swollenin-Gens (d. h. pGAPT-expC) wurde in Aspergillus transformiert und die Transformanten wurden überprüft, wie vorausstehend für die cDNA beschrieben.
Beispiel 4
Verfahren zur Isolierung von DNA-Sequenzen, welche Swollenin in Mikroorganismen kodieren
Das allgemeine Verfahren in den Beispielen 2 und 3 kann angepaßt werden in Verbindung mit bekannten Verfahren, um Klone zu erhalten, welche Gene von Swollenin oder vom Swollenin-Typ aus anderen Pilzen und Bakterien umfassen. Das Plasmid pSLexpPCR oder das isolierte DNA-Insert von 1,3 kb, welches für einen Teil des Swollenin-Gens kodiert (Beispiel 2) können markiert werden, so wie es der Kernbereich des Swollenins (Beispiel 3) kann. Diese DNA-Sonde kann dann verwendet werden, um mit genomischer DNA oder mit cDNA von anderen Pilzen oder Bakterien zu hybridisieren. Sequenzen, die für Expansine von höheren Pflanzen publiziert wurden, zeigen ein sehr hohes Ausmaß an Aminosäureidentität (siehe z. B. 4, wo unterstrichene Segmente die Bereiche hoher Homologie anzeigen). Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Swollenins von Trichoderma mit den bekannten Aminosäuresequenzen von Expansinen höherer Pflanzen identifiziert bestimmte konservierte Regionen von Aminosäuren zwischen den Swolleninen und den Expansinen von Pflanzen. Diese konservierten Bereiche sorgen für die Basis, degenerierte Primer zur Verwendung in einer PCR-Amplifikation von DNA von anderen Mikroorganismen, welche für Swollenin kodiert, zu entwerfen. Solche Verfahren sind im Fachbereich im allgemeinen bekannt und werden als Routine betrachtet (siehe z. B. McPherson et al., PCR A Practical Approach, S. 171–186 (1991)). Auf konservierte Bereiche, welche den Aminosäuren 192–200 und 366–371 der SEQ. ID Nr.: 2 entsprechen, wird verwiesen als in besonderer Weise nützlich für diesen Zweck (siehe ebenfalls die hervorgehobenen Segmente der 2, obwohl andere konservierte Bereiche verwendet werden können).
Die Sequenz an den Aminosäureresten 192–200 der SEQ. ID Nr.: 2 TSGGACGFG (SEQ. ID Nr.: 14) ist in einem hohen Ausmaß homolog zu der entsprechenden Sequenz in der Konsensussequenz von Expansin von Pflanzen TMGGACGYG (SEQ. ID Nr.: 15) (nummerierte Positionen 19–27 in der 4). Auf diesem Homologiebereich basierend, wäre es möglich, degenerierte Oligonukleotide zu synthetisieren, welche alle möglichen DNA-Sequenzen umfassen, welche für einen Teil oder das Gesamte der Aminosäuresequenz T(M/S)GGACG(Y/F)G kodieren (siehe z. B. McPherson et al., supra S. 174).
Die Sequenz an den Aminosäureresten 366–371 der SEQ ID NO: 2, YRRVQC (SEQ. ID Nr.: 16) ist in hohem Maße homolog zu der entsprechenden Sequenz in den Konsensussequenzen von Pflanzenexpansin YRRVPC (SEQ ID Nr.: 17) und FRRVPC (SEQ ID NO: 18) (nummerierte Positionen 127–132 in der 4). Auf diesem Homologiebereich basierend, wäre es ebenfalls möglich degenerierte Oligonukleotide zu synthetisieren, um alle möglichen DNA-Sequenzen einzuschließen, welche für einen Teil oder das Gesamte der Aminosäuresequenz (F/Y)RRV(P/QC kodieren. Die von dieser Aminosäuresequenz abgeleiteten Oligonukleotide würden in Verbindung mit denjenigen, die von den vorausstehend erwähnten Aminosäuresequenzen stammen, als Primer für PCR Routineexperimente unter Verwendung von genomischer DNA verwendet. Genomische DNA oder cDNA könnte dann leicht von jedwedem Mikroorganismus erhalten und als eine Matrize in solchen PCR-Experimenten verwendet werden. Auf diese Weise wäre es möglich, Gene zu klonieren, welche Swollenine von einer Vielfalt von Mikroorganismen kodieren.
Beispiel 5
Heterologes Hybridisierungsverfahren zur Isolation von Swollenin kodierenden Sequenzen aus anderen Mikroorganismen
Die genomische DNA von verschiedenen Mikroorganismen wurde mit Hind3 verdaut und auf einem 1,0%-igen Agarosegel laufen gelassen. Das Gel wurde depuriniert, denaturiert und geblottet und die Membran wurde, wie auf der Seite 6 beschrieben, UV-kreuzvernetzt. Die Vorhybridisierung, die Hybridisierung, das Markieren der Sonde und der Nachweis wurden durchgeführt unter Verwendung des DIG/Genius^TM Systems von Boehringer Mannheim.
Die Sonde entsprach der Sequenz, welche für den Kernbereich des Swollenins von T. reesei kodiert. Der originale cDNA Subklon (Beispiel 1) wurde mit Nco1 und EcoR1 verdaut, was in einem DNA-Fragment von 312 bp, bzw. Basenpaaren resultierte, welches mit DIG-dUTP (Dioxigenin-dUTP) über randomisiert geprimtes Markieren gemäß den Anleitungen des Herstellers (Boehringer Mannheim) führte.
Die Membran wurde vorhybridisiert und hybridisiert in 5 × SSC–0,1% N-Lauroylsarcosin-0,02% SDS–1% Genius^TM Blocking Reagenz bei 45°C. Der Hybridisierung (über Nacht) folgten zwei Mal Waschen während 10 min. in 6 × SSC bei Raumtemperatur und zwei mal 5 min. Waschen in 6 × SSC bei 45°C. Der Nachweis mit einem anti-DIG-alkalische-Phosphatase-Konjugat und die Visualisierung mit einem Chemiluminiszenzsubstrat CSPD^® wurden durchgeführt gemäß den Anleitungen des Herstellers.
Die Ergebnisse von diesem Experiment zeigten an, daß mindestens die folgenden Spezies zusätzlich zu T. reesei mit der Sonde hybridisieren: Trichoderma koningii, Hypocrea lenta und Hypocrea schweinitzii. In diesem Verdau mit Hind3 hatten T. reesei und T koningii eine Bande von über 5 kb, welche mit dem Swollenin-Gen von T. reesei hybridisierte. Bei H. schzweinitzii hatte die Bande, welche hybridisierte, eine Größe von 3,7 kb und für H. lenta etwa 3,3 kb. Dieses Verfahren und Variationen davon (verschiedene Hybridisierungs- und Waschbedingungen) können verwendet werden, um Gene von jedwedem Organismus nachzuweisen, welche für Swollenin kodieren.
Beispiel 6
Herstellung eines Klons von Saccharomyces cerevisiae zur Expression von Swollenin von T. reesei
Während des Verlaufs, die in dem Beispiel 1 erwähnte cDNA von Trichoderma reesei zu erhalten, wurde ein Klon von Saccharomyces cerevisiae erhalten, welcher ein Expressionsplasmid enthielt, in welchem die cDNA-Sequenz der SEQ. ID Nr.: 1 eingefügt war zwischen dem PGKI-Promotor von S. cerevisiae und der Terminator-Region in dem Plasmid pAJ401 (Saloheimo et al., 1994, Molec. Microbiol., Bnd. 13, S. 219–228 (1994)), gemäß dem von Margolles-Clark et al., (Appl. Environ. Microbiol. 62: 3840–3846, 1996) beschriebenen Verfahren. Kurz gesagt, wurde die cDNA von T. reesei mit dem EcoRI-XhoI-geschnittenen Plasmid pAJ401 ligiert. Das Plasmid pAJ401 wurde abgeleitet von dem Plasmid pFL60 (Minet und Lacroute, Curr. Genet. Bnd. 18, S. 287–291 (1990) durch das Verändern der zwei Klonierungsstellen EcoRI und XhoI, zwischen dem PGK-Promotor und -Terminator von Hefe in der umgekehrten Orientierung unter Verwendung spezifischer Linker. Die Transformation des E. coli Stammes JS4 durch Elektroporation (Bio-Rad) gemäß der Anleitung des Herstellers ergibt eine Bibliothek von 1,3 × 10⁶ unabhängigen Klonen. Einer dieser Klone enthielt pAJ401 mit der cDNA mit der SEQ. ID Nr.: 1 eingefügt zwischen den EcoRI- und XhoI-Stellen und wurde nachfolgend in den S. cerevisiae Stamm DBY746 transformiert. Ein zweiter Hefeklon wurde erhalten, welcher pAJ401 ohne die cDNA-Sequenz der SEQ. ID Nr.: 1 enthielt, zur Verwendung als eine Kontrolle in den Beispielen 5 und 6.
Die zwei Hefeklone, ein Kontrollklon und ein Klon, welcher die cDNA-Sequenz von T. reesei (longibrachiatum) Swollenin enthielt, wurden 2–3 Tage lang in Fermentern kultiviert. Entweder wurden Chemap CMF mini 1 Liter- oder Biolafitte 14 l-Fermenter verwendet. Das Kulturmedium war synthetisches Vollmedium ohne Uracil (Sherman 1991, Methods Enzymol. 194, 3–21). Der pH wurde auf 5,0 gehalten, die Belüftungsrate war 1 l/min für die kleineren Fermenter und 8 l/min für die größeren Fermenter, und die Schüttelrate war 300–600 U/min. Auf die Fermentierung folgend, wurden die Zellen durch eine Zentrifugation entfernt, und der Überstand wurde 50–100-fach konzentriert.
Beispiel
Expression der Swollenin cDNA von T. reesei in Aspergillus niger var. awamori
Herstellung des Aspergillus-Expressionsvektors
Die Konstruktion des Aspergillus-Expressionsvektors für die Expression der Swollenin cDNA von T. reesei bestand aus drei Schritten: (1) die PCR-Amplifizierung der Swollenin cDNA und deren Subklonierung in pSP73-Hind3 (d. h. die HindIII Schnittstelle wurde eliminiert), (2) das Austauschen des mittleren Teils des PCR abgeleiteten Swollenin-Gens durch das ursprüngliche Swollenin-Gen aus dem cDNA-Subklon, um Fehler, welche aus der PCR-Amplifizierung stammten, zu eliminieren, (3) Subklonieren des Swollenin-Inserts in einen Aspergillus-Expressionsvektor pGAPT-PT für die Expression unter dem A. niger var. awamori glaA-Promotor (Glucoamylase).
1. PCR-Amplifizierung der Swollenin cDNA
Die Primer ExAspBgl2 (CATTAGATCTCAGCAATGGCTGGTAAGCTTATCCTC) und ExAspXbal (CGACTCTAGAAGGATTAGTTCTGGCTAAACTGCACACC) wurden für die Amplifizierung der kodierenden Region der cDNA von T. reesei Swollenin durch PCR verwendet (Vektor aus dem Beispiel 1).
ExAspBgl2 hat eine BglII Klonierungsschnittstelle, auf welche die 5 letzten Nukleotide der glaA- (Glucoamylase) Promotorsequenz folgen, welche der Translationsstartstelle (ATG) vorausgehen. Dem ATG in ExAspBgl2 folgt ein 19-mer, welches der Swollenin-Signalsequenz entspricht. ExAspXbal hat eine XbaI Klonierungsstelle, ein STOP-Kodon und eine Sequenz, welche für die letzten 7 Kodons des Swollenin-Gens kodiert.
Das durch PCR amplifizierte Swollenin-Fragment von 1,5 kb wurde mit BglII und XbaI verdaut und in den mit BglII-XbaI geöffneten Vektor pSP73-Hind3 ligiert. Vor diesem Klonierungsschritt wurde in pSP73 (Promega) zunächst die HindIII Stelle deletiert. Dies wurde durchgeführt, indem der Vektor (pSP73) mit HindIII geöffnet wurde und die vorstehenden Enden mit T4-Polymerase (mit dNTPs) aufgefüllt wurden, bevor der Vektor zurückligiert wurde. Dieser Vektor wurde als pSP73-Hind3 bezeichnet.
pSP73-Hind3, welcher das 1,5 kb Insert von Swollenin trug, wurde als pPCRAexp bezeichnet.
2. Ersetzen der durch PCR amplifizierten Sequenz durch die Original-Sequenz
pPCRAexp wurde mit HindIII und BstEII verdaut. HindIII schneidet die Swollenin kodierende Sequenz innerhalb der Signalsequenz und BstEII ist nahe am Ende der Swollenin kodierenden Sequenz. Das HindIII-BstEII Swollenin-Fragment von 1,4 kb aus pPCRAexp wurde verworfen und durch das HindIII-BstEII Swollenin-Fragment von 1,4 kb aus dem ursprünglichen Swollenin-cDNA Subklon (Beispiel 1) ersetzt. Der resultierende Vektor wurde als pWTAexp bezeichnet.
3. Klonieren in den Expressionsvektor
pWTAexp wurde mit BglII und XbaI verdaut, was zu einem 1,5 kb Swollenin-Insert führte mit einem vollständigen kodierenden Bereich, dem 5 Nukleotide der glaA-Promotor-Sequenz vorausgingen, und der durch Klonierungsstellen flankiert war, welche eine Ligation zwischen dem glaA-Promotor und den Terminator-Sequenzen in einem Aspergillus-Expressionsvektor pGAPT-PG (nachfolgend beschrieben) ermöglichte. Das Insert und die Vektorsequenzen wurden ligiert und der resultierende Vektor wurde als pGAPT-exp (6,5 kb) bezeichnet. Dies ist der Vektor für die Expression der Swollenin cDNA von T. reesei in A. niger.
Der Expressionsvektor pGAPT-PG (5,1 kb), der für die Konstruktion von pGAPT-exp verwendet wurde, besteht aus einem SpeI-BglII Fragment von 1,1 kb von einer glaA-Promotorsequenz von A. niger var. awamori, einem 0,2 kb Fragment von der glaA-Terminatorsequenz von A. niger und einem pyrG-Marker-Gen von 1,6 kb von A. nidulans in dem pUC18 Rückgrat. Das glaA-Terminator-Fragment folgt auf die glaA-Promotorsequenz und ist von dieser durch multiple Klonierungsstellen getrennt, welche für das Einfügen von Sequenzen, die exprimiert werden sollen, verwendet werden kann.
Das 3'-Ende der glaA-Promotorsequenz, d. h. der Sequenz, welche der Translationsstartstelle des Swollenin-Gens in pGAPT-exp vorausgeht, wurde konstruiert (multiple Klonierungsstellen) und hat die folgende Sequenz, welche an einer XmnI Stelle in dem glaA-Promotor startet:
in welchem das ATG am Ende das Start-Kodon für die Swollenin cDNA ist.
Die Umgebungssequenz des STOP-Kodons folgt (beginnend von dem „TAA"-Stop Kodon-konstruiert aus dem ursprünglichen „TGA"-Stop-Kodon in Swollenin):
gezeigt bis zu der BstEII Stelle (GGTGACC) in der glaA-Terminatorsequenz.
Transformation von pGAPT-exp in Aspergillus
pGAPT-exp wurde in den Stamm A. niger var. awamori dgr246p2 transferiert, beschrieben in Ward et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 738–743 (1993). Die Transformation von Aspergillus folgt dem selben grundsätzlichen Verfahren wie für Trichoderma auf den Seiten 13–15 beschrieben. Das Transformationsverfahren für A. niger var. awamori dgr246p2 wird ebenfalls beschrieben in Ward et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 738–743 (1993).
Die Transformanten wurden auf ihre Fähigkeit hin selektiert, auf Minimalmedium ohne Uridin zu wachsen. Die nicht transformierten Zellen erfordern Uridin für das Wachstum.
Überprüfen der Transformanten
Die Aspergillus-Transformanten wurden in 50 ml Flüssigmedium in 250 ml Schüttlerflaschen während 5–11 Tagen kultiviert, wie in Ward et al., Bio/Technology 8: 435–440 (1990) beschrieben. Das Komplexmedium enthielt 15% Maltose, um den glaA-Promotor zu induzieren und dadurch die Expression des Swollenin-Gens voranzutreiben. Die Kulturüberstände ließ man auf SDS-PAGE-Gelen laufen. Aspergillus Transformanten, die das Swollenin von T. reesei produzierten, hatten eine Bande, welche oberhalb von der Marker Bande von 66 kDa lief, und diese Bande fehlte auf den Spuren der Negativkontrolle (Aspergillus Stamm vor der Transformation) (6).
Beispiel 8
Wirkung der Behandlung mit Trichoderma reesei Swollenin auf die Cellulosestruktur
Kreisförmige Whatman Nr. 3 Filterpapiere wurden in Streifen geschnitten, welche 2 × 7 cm maßen. Der verwendete Puffer war 50 mM Natriumacetat, pH 5. Die Filterpapierstreifen ließ man sich mindestens 30 min. bei Raumtemperatur in Lösungen vollsaugen, welche aus Wasser, Puffer, 8 M Harnstoff in Puffer oder Nährmedium, welches von Hefeklonen, die das Swollenin-Gen von T. reesei enthielten, oder einem Kontrollhefeklon, welcher kein Swollenin von T. reesei produziert, in Puffer (Verdünnungen lagen in dem Bereich von 1 ml des Nährmediums in 7 ml Puffer bis zu 4 ml des Nährmediums in 4 ml Puffer).
Ein Thwing-Albert-Zugfester wurde auf eine Testgeschwindigkeit von 0,10 cm/min. gesetzt und die Zugarbeit über einen Bereich von 0 bis 50 Pfund (lbs) gemessen. Jeder Streifen des Filterpapiers wurde zwischen den Klammern plaziert und die Spitzenlast wurde gemessen. Die Ergebnisse dieses Experimentes quantifizieren das Ausmaß an Belastung, welches gehalten werden kann bevor das Papier zerreißt. Zwei oder drei Streifen wurden für jeden Probentyp gemessen. Die Ergebnisse aus verschiedenen unterschiedlichen Experimenten werden nachstehend in den Tabellen 1 und 2 gegeben.
Tabelle 1
Tabelle 2
Wie erwartet, konnten die Streifen, welche mit 8 M Harnstoff behandelt worden waren, von dem bekannt ist, daß es die Wasserstoffbindungswechselwirkungen zerreißt, keine so hohe Last halten, ohne zu brechen, wie die Streifen, welche nur mit Puffer behandelt wurden. In beiden Experimenten haben die Streifen, welche mit dem Swollenin-Nährmedium behandelt wurden, eine signifikant niedrigere maximale Last (etwa 15%) als die Streifen, welche mit dem Kontroll-Nährmedium behandelt wurden. Der einzige Unterschied zwischen diesen beiden Nährmedien besteht darin, daß das eine aus der Fermentation des Hefestammes, welcher das Swollenin-Gen von T. reesei enthält, stammt, während der Kontrollstamm dieses Gen nicht enthält. Diese Ergebnisse zeigen, daß es eine Komponente in dem Swollenin-Nährmedium gibt, welche Filterpapier schwächt.
Beispiel 9
Behandlung von Baumwollfasern mit Swollenin
Die in dem Beispiel 4 vorausstehend beschriebenen Hefeklone wurden unter den spezifisch angegebenen Bedingungen wachsen gelassen, und das Fermentations-Nährmedium wurde von fremdem Zellmaterial und Abfall getrennt. Ein Kontrollklon von Hefe, welcher das Expressionsplasmid enthielt, aber ohne die eingefügte, für Swollenin kodierende cDNA-Sequenz, wurde ebenfalls unter den selben Bedingungen wachsen gelassen, und das Fermentations-Nährmedium wurde durch das Entfernen des fremden Zellmaterials und Abfalls isoliert. Die Kulturüberstände von zwei Fermentationen, wobei eine die mit dem Swollenin-Gen transformierte Hefe enthielt und eine die Hefe als eine Kontrolle enthielt, welche ohne das Swollenin-Gen transformiert worden war, wurden etwa 50-fach konzentriert und wurden verwendet, um die Wirkungen des Inkubierens von T. reesei Swollenin mit Baumwollfasern zu bestimmen. Die Wirkungen der zwei Überstände wurden weiter verglichen mit der Cellobiohydrolase I (CBHI) von T. reesei.
Merzerisierte Baumwollfasern wurden in Puffer suspendiert (50 mM Natriumacetat, pH 5,0), welcher Überstand von den Hefefermentationen (Verdünnung 1 : 4) und CBHI (Dosierung 5 μg/g) enthielt. Nach einer Inkubation während 240 min. bei 25°C wurden die suspendierten Fasern abfiltriert, und die Menge reduzierenden Zuckers, der in die Filtrate freigesetzt worden war, wurde durch das Verfahren von Sumner und Somers (1944) bestimmt. Die Fasern wurden einmal mit Puffer gespült und dann in destilliertem Wasser mit Glaskügelchen suspendiert vor einer Ultrabeschallung während einer Minute unter Verwendung eines Sondenspitzensonicators (probe tip sonicator, Vibra Cell Sonics and Materials, Inc.). Die Fasern wurden dann gefärbt und mittels Lichtmikroskopie visualisiert, um grobe Wirkungen auf ihre Struktur zu bestimmen. Das Filtrat der Kontrollbehandlung und das Filtrat, welches von dem Hefestamm stammte, der das Swollenin-Gen enthielt, zeigte keinerlei hydrolytische Aktivität, d. h. keine reduzierenden Zucker wurden aus den Baumwollfasern freigesetzt. Im Gegensatz dazu setzte CBHI alleine 0,08% reduzierende Zucker (vom ursprünglichen Trockengewicht) frei. Vor der Beschallung konnte kein Unterschied zwischen den Fasern, welche mit dem Überstand aus dem Kontrollhefestamm gegenüber den Fasern, welche mit dem Überstand aus dem Hefestamm, welcher das Swollenin-Gen enthielt, unterschieden werden. Nach der Beschallung jedoch waren gequollene und desorganisierte Bereiche in den Fasern offensichtlich, welche mit dem Überstand von der Hefe, welche das Swollenin-Gen enthielt, behandelt worden waren, die in den Fasern, welche mit dem Überstand behandelt worden waren, der aus dem Kontrollhefestamm erhalten worden war, nicht vorhanden waren (5). CBHI alleine verursachte ein leichtes Spleißen auf den Fasern aber keine geöffneten und gequollenen Bereiche wurden beobachtet, welches typische Effekte für den Überstand aus der Hefe waren, welche das Swollenin-Gen enthielt.

Claims

Isoliertes Swollenin-Protein, abgeleitet aus einer mikrobiellen Quelle, wobei das Swollenin eine Sequenz mit mindestens 70% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr.: 2 angegebenen Sequenz umfasst und wobei das Swollenin ferner die Fähigkeit aufweist, Filterpapier zu schwächen und/oder Baumwollfasern zu quellen.
Swollenin-Protein gemäß Anspruch 1, wobei das Swollenin aus einem Pilz oder Bakterien abgeleitet ist.
Swollenin-Protein gemäß Anspruch 2, wobei der Pilz ein filamentöser Pilz ist.
Swollenin-Protein gemäß Anspruch 3, wobei es sich bei dem filamentösen Pilz um Trichoderma spp., Humicola spp., Neurospora spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Penicillium spp. oder Gliocladium spp. handelt.
Swollenin-Protein gemäß Anspruch 1, wobei das Swollenin eine Sequenz, welche im wesentlichen aus der in SEQ ID Nr.: 2 angegebenen Sequenz besteht, umfasst.
DNA, codierend ein Swollenin-Protein gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5.
DNA nach Anspruch 6, wobei die DNA aus einem Pilz oder Bakterien abgeleitet ist.
DNA gemäß Anspruch 7, wobei der Pilz ein filamentöser Pilz ist.
DNA gemäß Anspruch 8, wobei es sich bei dem filamentösen Pilz um Trichoderma spp., Humicola spp., Neurospora spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Penicillium spp. oder Gliocladium spp. handelt.
DNA gemäß Anspruch 6, wobei die DNA eine Sequenz mit mindestens 70% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr.: 1 angegebenen Sequenz umfasst und die DNA ein Swollenin-Protein codiert, welches die Fähigkeit aufweist, Filterpapier zu schwächen und/oder Baumwollfasern zu quellen.
DNA gemäß Anspruch 6, wobei die DNA mit einer DNA, welche die ganze oder einen Teil der in SEQ ID Nr.: 1 angegebenen Sequenz aufweist, unter Standard-Stringenz-Bedingungen hybridisiert, welche das Waschen eines Filters aus einem Southern-Blot nach der Hybridisierung mit einer Lösung von 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 20°C während 15 Minuten und dann einer Lösung von 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 37°C während 30 Minuten umfassen.
DNA, umfassend die Sequenz gemäß SEQ ID Nr.: 1.
Vektor, umfassend die DNA von Anspruch 6.
Wirtszelle, transformiert mit dem Vektor von Anspruch 13.
Wirtszelle nach Anspruch 14, wobei die Wirtszelle genetisch verändert worden ist, um ein oder mehrere Cellulasegene zu deletieren.
Wirtszelle nach Anspruch 14, wobei die Wirtszelle ein filamentöser Pilz ist.
Wirtszelle nach Anspruch 16, wobei der filamentöse Pilz Trichoderma spp., Humicola spp., Neurospora spp., Aspergillus spp. oder Fusarium spp. ist.
Verfahren zur Herstellung des Swollenin-Proteins von mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend die folgenden Schritte: (a) Erhalten einer Wirtszelle, welche mit einem Vektor transformiert worden ist, umfassend ein Swollenin-Protein codierende DNA, wobei die DNA aus einem Pilz oder Bakterien isoliert wird; (b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Expression und gegebenenfalls Sekretion des Swollenin-Proteins geeignet sind; (c) Gewinnung der Fermentations-Nährlösung, welche das Swollenin-Protein enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei die DNA aus einem filamentösen Pilz abgeleitet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei es sich bei dem filamentösen Pilz um Trichoderma spp., Humicola spp., Neurospora spp., Aspergillus spp., Fusarium spp. oder Gliocladium spp. handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei die DNA eine Sequenz mit mindestens 70% Sequenzidentität zu der in SEQ ID Nr.: 1 angegebenen Sequenz umfasst und wobei die DNA ein Swollenin-Protein codiert, welches die Fähigkeit aufweist, Filterpapier zu schwächen und/oder Baumwollfasern zu quellen.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die DNA mit einer DNA, welche die ganze oder einen Teil der in SEQ ID Nr.: 1 angegebenen Sequenz aufweist, unter Standard-Stringenz-Bedingungen hybridisiert, welche das Waschen eines Filters aus einem Southern-Blot nach der Hybridisierung mit einer Lösung von 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 20°C während 15 Minuten und dann einer Lösung von 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 37°C während 30 Minuten umfassen.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die DNA die Sequenz gemäß SEQ ID Nr.: 1 umfasst.
Verfahren zur Änderung der Eigenschaften eines celluloseartigen Substrats, umfassend das Kontaktieren des celluloseartigen Substrats mit einer Zusammensetzung, umfassend Swollenin-Protein, hergestellt gemäß des Verfahrens in Anspruch 18.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Verfahren das Ändern der Nährstoff-Eigenschaften eines Tierfutters umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Verfahren das Ändern der Eigenschaften eines Gewebes oder eines Garns, umfassend celluloseartige Fasern, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Verfahren das Ändern der Eigenschaften von Holz-Zellstoff oder Derivaten davon während der Herstellung von Papier umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Verfahren das Ändern der Eigenschaften von celluloseartiger Biomasse während ihrer Reduktion zu Glucose umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Verfahren das Ändern der Eigenschaften von celluloseartigen Maishülsenfasern während ihrer Reduktion zu Glucose umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Cellulase-Zusammensetzung, welche frei von dem Swollenin von mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 ist, umfassend: (a) Erhalten eines Mikroorganismus, der Cellulase und Swollenin herstellt; (b) Behandlung des Mikroorganismus in einer solchen Weise, dass die Expression des Swollenin-Proteins zerstört, deletiert und/oder gestört wird; (c) Kultivieren des Mikroorganismus unter geeigneten Bedingungen zum Exprimieren der Cellulase; (d) Auffangen der exprimierten Cellulase, welcher ein Swollenin-Protein fehlt.
Verwendung eines Swollenins nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 als Zusatzstoff zu Tierfutter.
Wäschewaschmittel oder Textil-Behandlungszusammensetzung, umfassend das Swollenin von mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5.