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Hintergrund
der Erfindung
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Die
ostmotische Aufnahme von Wasser ist die treibende Kraft bei der
Expansion von Pflanzenzellen. Wenn Wasser in die Zelle eintritt,
expandiert der Protoplast, wird aber durch die Zellwand zurückgehalten.
Darüber
hinaus bildet ein steifer Komplex von Cellulosemikrofibrillenpolymeren,
welcher in eine klebstoffartige Matrix von Pektinen, Hemicellulosen
und Proteinen eingebettet ist, einen Teil dieser Wand in reifen
Zellen. Man hat lange gedacht, daß ein „die Wand lockernder" Faktor vorhanden
sein muss, welcher die mechanischen Eigenschaften einer unreifen
Zellwand ändert
und es ihr gestattet, einen Prozess der Verlängerung zu vollziehen. McQueen-Mason
et al., Plant Cell Bnd. 4, S. 1425–1433 (1992) untersuchten die
Regulation der Erweitung von Pflanzenzellen durch die Verwendung
einer Rekonstitutionsvorgehensweise. Die Autoren haben festgestellt,
dass ein roher Proteinextrakt aus den Zellwänden wachsender Gurkensetzlinge
die Fähigkeit
besitzt, die Ausdehnung isolierter Zellwände zu induzieren. Die sequentielle
HPLC-Fraktionierung des aktiven Wandextraktes enthüllte zwei
Proteine mit den Molekulargewichten von 29 und 30 kDa, welche mit
der Aktivität
assoziiert sind. Jedes Protein alleine konnte eine Ausdehnung der
Zellwand ohne nachweisbaren hydrolytischen Abbau der Wand induzieren
und schien eine „Säurewachstums"-Antwort von isolierten
Wänden
zu vermitteln und könnte
die Ausdehnung der Pflanzenzellwand durch einen neuartigen biochemischen
Mechanismus katalysieren.
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Shcherban
et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Bnd. 92 S. 9245–9249 (1995)
isolierten cDNAs, welche für
diese zwei Gurkenproteine kodieren, und verglichen sie mit anonymen
exprimierten Sequenzkennungen (expressed sequence tags) von verschiedenartigen
Quellen. Die Expansin-cDNA von Reis und Arabidopsis wurden aus diesen
Sammlungen identifiziert und zeigten mindestens vier verschiedene
cDNAs für
Expansin in Reis und sechs verschiedene cDNAs für Expansin in Arabidopsis.
Die Autoren schlossen daraus, daß Expansin in seiner Größe und Sequenz
in einem hohen Maße
konserviert ist (60–87%
Aminosäureidentität und 75–95% Ähnlichkeit
zwischen jedwedem paarweisem Vergleich), und dass die Multigenfamilie
vor der evolutionären
Divergenz zwischen Monokotyledonen und Dikotyledonen gebildet wurde.
Shcherban et al., stellen fest, daß die hohe Konservierung dieser
Multigenfamilie anzeigt, daß der
Mechanismus, durch welchen Expansin die Zellwandausdehnung vorantreibt,
sehr wenig Variation in der Proteinstruktur erlaubt.
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Wang
et al., Biotech. Lett. Bnd. 16, Nr. 9, S. 955–958 (1994) haben zwei Proteine
in einer chinesischen medizinischen Gurke festgstellt, Trichosanthes
kirilowii, welche den Proteinen S1 und S2, welche die zellwandexpandierenden
Eigenschaften aufweisen, ähnlich
zu sein scheinen. Ähnliche
Proteine wurden ebenfalls in wachsenden Tomatenblättern (Keller
et al., The Plant Journal, Bnd. 8, Nr. 6, S. 795–802 (1995)) und in den Koleoptilwänden von
Hafer (Li et al., Planta Bnd. 191, S. 349–356 (1993)) gefunden.
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Cosgrove
et al., J. Exp. Botany, Bnd. 45, Sonderausgabe, S. 1711–1719 (1994)
schlugen vor, daß kooperative
Wechselwirkungen zwischen den Expansin-Proteinen und Pectinasen
und Cellulasen auftreten könnten,
worin die Enzyme die Matrix derart modifizieren, dass andere Mechanismen
der Zellwandexpansion wirksamer sein könnten. Fry, Current Biology,
Bnd. 4, Nr. 9 (1994) schlägt
vor, daß bei
der Auflockerung von Zellwänden
es unwahrscheinlich erscheint, daß das Expansin die Cellulose-Cellulose-Bindungen
aufbricht, da die Mikrofibrillen während des Wachstums intakt
bleiben. Daher lassen die Autoren die beobachteten Brüche von
Wasserstoffbindungen in Filterpapier als ein Nebenproblem beiseite
und schlagen vor, daß Expansine
die intermikrofibrillären
Fasern verlängern
könnten,
indem sie bewirken, daß Hemicelluloseketten
sich von Cellulosemikrofibrillen ablösen, um eine Verlängerung
zu gestatten.
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Trotz
der Pionierarbeit, die zuvor auf dem Gebiet der Zellwandausdehnung
und ihrer Ursachen verrichtet wurde, steckt die Arbeit, welche mit
der Nützlichkeit
und Funktionsfähigkeit
von Expansinen verknüpft ist,
immer noch in ihren Kinderschuhen. Darüber hinaus stammten die Quellen
von Expansin bisher immer exklusiv von Pflanzen, für welche
die Expressionssysteme für
eine Produktion im großen
Maßstab
nicht optimal sein könnten.
Entsprechendermaßen
wäre es
wertvoll, eine leichte Quelle für
Expansin-artiges Material zu haben, welches in großen Mengen
aus Organismen hergestellt werden könnte, welche etablierte Produzenten von
biologischen Materialien mit einem hohen Durchsatz sind, wie Pilze,
Bakterien und andere gut charakterisierte Mikroorganismen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein isoliertes Swollenin-Protein, welches von einem
Pilz oder einem Bakterium stammt, bereit gestellt, wie in den Ansprüchen definiert.
Bevorzugtermaßen
stammt das Swollenin von einem filamentösen Pilz, mehr zu bevorzugen
von einem filamentösen
Pilz wie Trichoderma spp., Humicola spp., Neurospora spp., Aspergillus
spp., Fusarium spp., Penicillium spp. oder Gliocladium spp. und
am meisten zu bevorzugen von Trichoderma spp.. In einer besonders
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfaßt
das Swollenin eine Sequenz gemäß der SEQ.
ID Nr.: 2, hat mindestens 70% Sequenzindentität mit der Sequenz, welche in
der SEQ. ID Nr.: 2 bereit gestellt wird und worin das Swollenin weiter
die Fähigkeit
hat, Filterpapier zu schwächen
und/oder Baumwollfasern zu quellen.
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In
einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird eine DNA bereit gestellt, welche für ein Swollenin-Protein
aus einem Pilz oder einem Bakterium kodiert. Bevorzugtermaßen stammt
die DNA von einem filamentösen
Pilz wie Trichoderma spp., Humicola spp., Neurospora spp., Aspergillus
spp., Fusarium spp., Penicillium spp. oder Gliocladium spp.. Ebenfalls
bevorzugtermaßen
umfasst die DNA die Sequenz gemäß der SEQ.
ID Nr.: 1. Alternativ hat die DNA mindestens 70% Sequenzidentität mit der
Sequenz gemäß der SEQ.
ID Nr.: 1 und worin diese DNA für
ein Swollenin-Protein kodiert, welches die Fähigkeit hat, Filterpapier zu
schwächen
und/oder Baumwollfasern zu quellen. In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung hybridisiert die DNA mit einer DNA, welche ganz oder
zum Teil die Sequenz hat, welche in der SEQ. ID Nr.: 1 bereit gestellt
wird.
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Vektoren,
welche solche DNA umfassen, Wirtszellen, welche mit solchen Vektoren
transformiert wurden und Fermentationsnährlösungen, welche durch solche
transformierten Wirtszellen produziert wurden, liegen ebenfalls
innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
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In
einer noch weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereit gestellt, Swollenin-Protein
zu produzieren, umfassend die Schritte von (a) Erhalten einer Wirtszelle,
welche mit einem Vektor transformiert worden ist, umfassend eine
Swollenin-Protein kodierende DNA, wobei die DNA aus einem Pilz oder
einem Bakterium isoliert wird; (b) Kultivieren der Wirtszelle unter
Bedingungen, welche für
die Expression und gegebenenfalls die Sekretion des Swollenin-Proteins
geeignet sind; und (c) Gewinnung der Fermentationsnährlösung, welche
das Swollenin-Protein enthält.
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Da
Pilze und Bakterien nicht im allgemeinen eine Zellulose enthaltende
Zellwand haben und keinesfalls dafür bekannt sind, daß sie die
Größe über die
selben Mechanismen wie höhere
Pflanzen steigern, ist die Feststellung der Anmelder, daß diese
Mikroorganismen Proteine mit expansinartigen Eigenschaften, herstellen
nicht durch vorherige Arbeit, welche mit den Expansinen von Pflanzen
verknüpft
ist, nahe gelegt worden. Daher ist die Feststellung, daß der cellulolytische
Pilz Trichoderma spp. ein expansinartiges Protein herstellt, unerwartet.
Es ist jedoch offensichtlich, daß die mikrobielle Klasse von
Proteinen von denjenigen, die bisher in Pflanzen entdeckt wurden,
abweicht. Zum Beispiel legt das Vorhandensein eines Bereiches auf
dem mikrobiellen Swollenin-Protein, welches hierin beschrieben wird,
das der Cellulosebindenden Domäne
von cellulolytischen Enzymen des Pilzes entspricht, nahe, daß dieses
Protein sezerniert wird, um gemeinsam mit den natürlicherweise
sezernierten Cellulasen und Hemicellulasen zu wirken, um die Hydrolyse
der cellulosehaltigen Biomasse in der Umgebung zu erleichtern. In
konsistenter Weise mit diesem Vorschlag hat man festgestellt, daß das Swollenin-Gen
von Trichoderma reesei exprimiert wird, wenn der Pilz auf Cellulose
als der einzigen Kohlenstoffquelle wachsen gelassen wurde, aber
nicht wenn die Kohlenstoffquelle für das Wachstum Glucose war.
Dieses Muster der Regulation der Genexpression ist ähnlich zu
demjenigen, welches für
viele der Cellulose- und Hemicellulose-Gene beobachtet wurde. Diese unerwarteten
Befunde führten
zu dem Schluss, daß Cellulose
oder Hemicellulose abbauende Mikroorganismen, einschließlich von
Bakterien, Hefe und Pilzen ebenfalls solche Swollenin-Proteine produzieren
würden.
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Entsprechendermaßen ist
es ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, daß die Swollenine, welche hierin bereitgestellt
werden, eine Nützlichkeit
in vielen Anwendungen haben können,
für welche
Cellulase augenblicklich verwendet wird, zum Beispiel für das Reinigen
von Textilien (Waschmitteldetergenzien und Vorwaschzusammensetzungen),
die Modifizierung von Textilien (das Enthaaren, die Wiederherstellung
der Farbe, das Grauverhindern), das Steinwaschen von Denim, die
Umwandlung von Biomasse zu Glucose und die Verbesserung des Nährwertes
von Futtermitteln für
Tiere. Ähnlich
wird es betrachtet, daß ein
Vorteil der vorliegenden Erfindung darin liegt, daß Swollenine
einen synergistischen oder einen additiven Effekt in Kombination
mit anderen Enzymen haben können,
insbesondere mit Cellulasen wie Endoglucanasen. In anderen Fällen ist
es möglich,
daß Swollenine
eine schädigende
Wirkung in einer Anwendung haben könnten; zum Beispiel können sie
einen übermäßigen Verlust
der Haltbarkeit von Textilien verursachen, wenn sie als eine Nebenaktivität in einer
Endoglucanase vorhanden sind, welche durch die Fermentation eines
Mikroorganismus hergestellt wird, und welcher für das Reinigen von Textilien
oder die Modifizierung verwendet wird. In einem solchen Fall kann die
Entfernung des Swollenins aus einem Cellulaseprodukt von Vorteil
sein und kann durchgeführt
werden durch das biochemische Entfernen des Produktes aus der resultierenden
Cellulasemischung, durch Gentechnologie, um dessen Expression zu
verhindern oder das Gen zu inaktivieren, oder durch die Zugabe eines
chemischen Inhibitors zu der Zusammensetzung, welche das Swollenin
umfaßt.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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Die 1 erläutert
die Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr.: 1) und die vorausgesagt entsprechende
Aminosäuresequenz
(SEQ ID Nr.: 2) von einem cDNA-Klon welcher von einer RNA von Trichoderma
reesei (longibrachiatum) nach dem Wachstum auf einer gemischten
Kohlenstoffquelle erhalten wurde.
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Die 2 erläutert einen
Vergleich der Konsensusaminosäuresequenz
für Expansin-Proteine
von Pflanzen (SEQ ID Nr.: 3) und der Sequenz des Swollenins (SEQ
ID Nr.: 4), die hierin beschrieben wurde, welcher die Bereiche der
Aminosäurehomologie
zeigt.
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Die 3 erläutert das
Ergebnis des Northern-Blottens von RNA-Proben, hergestellt aus Trichoderma reesei
(longibrachiatum)-Mycel, welches auf verschiedenen Kohlenstoffquellen
gewachsen ist, und welche mit cDNA von Swollenin sondiert wurden.
Spur 1: Cellulose, Spur 2: Glucose, Spur 3: Sorbitol, Spur 4 Sorbitol-Kultur
induziert durch Sophorose.
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Die 4 erläutert
einen Vergleich von neun bekannten Expansin-Aminosäuresequenzen
von Pflanzen (SEQ ID Nr.: 5–13)
welche die extensive Homologie zeigen, welche bei Pflanzenexpansinen
vorhanden ist.
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Die 5 zeigt
die Plasmidkarte für
pGAPT-exp.
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Die 6 erläutert die
Ergebnisse eines SDS-PAGE-Gellaufs von Kulturüberständen und Kontrollen. Transformanten
von Aspergillus, welche das Swollenin von T. reesei produzieren,
haben eine Bande, welche oberhalb der 66 kDa Markerbande läuft und
diese Bande fehlt auf den Spuren der Negativkontrolle (Aspergillus Stamm
vor der Transformation).
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Definitionen
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„Swollenin" bedeutet ein Protein
oder ein Polypeptid oder eine Domäne eines Proteins oder eines
Polypeptids von mikrobiellem Ursprung stammend, d. h. von Pilzen
oder Bakterien, welches die Fähigkeit
hat, das Schwächen
von Filterpapier und das Quellen von Baumwollfasern zu erleichtern
ohne eine cellulolytische Aktivität zu haben, d. h. eine katalytische
Aktivität,
welche das Aufbrechen einzelner Cellulosestränge in kleinere Monomere (Glucose)
oder Oligomere (Polysaccharide) einschließt. Während es nützlich ist, Swollenine in einer
lockeren Weise in den Begriffen der Expansin-Proteine zu definieren,
welche in McQueen- Mason
et al., Plant Cell, Bnd. 4, S. 1425–1433 (1992) beschrieben werden,
ist es ebenfalls offensichtlich, daß mikrobielle Swollenine bestimmte
Eigenschaften haben, zum Beispiel sind mikrobielle Swollenine viel
größere Proteine als
Expansive von Pflanzen und haben ein niedriges Maß an Sequenzidentität mit Expansinen
von Pflanzen. Darüber
hinaus existieren bestimmte mikrobielle Swollenin-Proteine in Verbindung
mit einer cellulosebindenden Domäne
und können
weiter in Verbindung mit einer katalytischen Cellulasedomäne existieren.
Zum Beispiel besitzt das hierin gezeigte Swollenin-Protein, das
von Trichoderma reesei stammt, eine cellulosebindende Domäne.
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Es
wird hierin erwogen, daß Swollenine
von mikrobiellem Ursprung stammen können und insbesondere von Pilzen
oder von Bakterien stammen können.
In einer spezifischen Weise wird betrachtet, daß Mikroorganismen, welche cellulolytische
Fähigkeiten
haben, ausgezeichnete Quellen von Swollenin-Protein sein werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stammt
das Swollenin von Trichoderma spp., insbesondere Trichoderma reesei
(longibrachiatum). Ebenfalls bevorzugtermaßen stammt das Swollenin und/oder
die DNA, welche für
ein Swollenin kodiert, gemäß der vorliegenden
Erfindung von einem Pilz wie Absidia spp.; Acremonium spp.; Agaricus
spp.; Anaeromyces spp.; Aspergillus spp., einschließlich von
A. auculeatus, A. awamori, A. flavus, A. foetidus, A. fumaricus,
A. fumigatus, A. nidulans, A. niger, A. oryzae, A. terreus und A.
versicolor, Aeurobasidium spp.;, Cephalosporum spp.; Chaetomium
spp.; Coprinus spp.; Dactyllum spp.; Fusarium spp., einschließlich von
F. conglomerans, F. decemcellulare, F. javanicum, F lini, F. oxysporum
und F. solani; Gliocladium spp.; Humicola spp., einschließlich von
H. insolens und H. lanuginosa; Mucor spp.; Neurospora spp., einschließlich von
N. crassa und N. sitophil.; Neocallimastix spp.; Orpinomyces spp.;
Penicillium spp.; Phanerochaete spp.; Phlebia spp.; Piromyces spp.;
Pseudomonas spp.; Rhizopus spp.; Schizophyllum spp.; Trametes spp.;
Trichoderma spp., einschließlich
von T. reesei, T. reesei (longibrachiatum) und T. viride; und Zygorhynchus
spp.. In einer ähnlichen
Weise stellt man sich vor, daß ein
Swollenin und/oder eine DNA, welche für ein Swollenin kodiert, wie
hierin beschrieben, in cellulolytischen Bakterien gefunden werden
kann wie Bacillus spp.; Cellulomonas spp.; Clostridium spp.; Myceliophthora
spp.; Thermomonospora spp.; Streptomyces spp., einschließlich von
S. olivochromogenes; in einer spezifischen Weise Fasern abbauende
ruminale (ruminal) Bakterien wie Fibrobacter succinogenes; und in
Hefe, einschließlich
von Candida torresii; C. parapsllosis; C. sake; C. zeylanoides;
Pichia minuta; Rhodotorula glutinis; R. mucilaginosa; und Sporobolomyces
holsaticus.
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Bevorzugtermaßen werden
Swollenin-Proteine gemäß der vorliegenden
Erfindung isoliert oder gereinigt. Mit Reinigung oder Isolation
meint man, daß das
Swollenin-Protein aus seinem natürlichen
Zustand verändert
wird, mittels des Trennens des Swollenins von einigen oder allen
der natürlich
auftretenden Bestandteile, mit welchen es in der Natur assoziiert
ist. Dies kann erreicht werden durch Techniken, welche im Fachbereich
der Trenntechniken bekannt sind, wie Ionenaustauschchromatographie,
Affinitätschromatographie, hydrophobe
Trennung, Dialyse, Proteasebehandlung, Ammoniumsulfatpräzipitation
oder eine andere Protein-Salz-Präzipitation,
Zentrifugation, Größenausschlußchromatographie,
Filtration, Mikrofiltration, Gelelektrophorese oder Trennung auf
einem Gradienten, um ganze Zellen, Zellschrott, Verunreinigungen,
fremdes Protein oder unerwünschte
Enzyme in der Endzusammensetzung zu entfernen. Es ist weiter möglich, dann
Bestandteile zu dem Swollenin hinzuzugeben, das die Zusammensetzung
enthält,
welche für
zusätzlichen
Nutzen sorgen, zum Beispiel Aktivierungsmittel, Anti-Inhibitionsmittel,
wünschenswerte
Ionen, Verbindungen, um den pH oder andere Enzyme, wie Cellulase
zu kontrollieren.
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Die
Hybridisierung wird hierin verwendet, um zu analysieren, ob ein
gegebenes Fragment oder Gen dem hierin beschriebenen Swollenin entspricht
und daher in den Umfang der vorliegenden Erfindung fällt. Der Hybridisierungsassay
ist im wesentlichen wie folgt: genomische DNA von einer bestimmten
Zielquelle wird fragmentiert durch den Verdau mit einem (bzw.) Restriktionsenzym(en),
z. B. EcoRI, HindIII, BamHI, ClaI, KpnI, MluI, SpeI, BglII, NcoI,
XbaI, XhoI und XmaI (geliefert von New England Biolabs, Inc., Beverly,
MA und Boehringer Mannheim) gemäß den Anleitungen
des Herstellers. Mit den Proben wird dann eine Elektrophorese über ein
Agarosegel (wie z. B. 0,7% Agarose) durchgeführt, so daß die Trennung der DNA-Fragmente
durch die Größe visualisiert
werden kann. Das Gel kann kurz in destilliertem H2O
gereinigt und nachfolgend in einer geeigneten Lösung depuriniert werden (wie
zum Beispiel 0,25 M HCl) unter sanftem Schütteln, gefolgt von einer Denaturierung
während
30 min. (in z. B. 0,4 M NaOH). Ein Renaturierungsschritt kann eingeschlossen
werden in welchem das Gel in 1,5 M NaCl, 1 M Tris, pH 7,0 unter
sanftem Schütteln
für 30
min. plaziert wird. Die DNA sollte dann auf eine in geeignetem Maße positiv
geladene Membran transferiert werden, z. B. die Maximum Strength
Nytran Plus Membran (Schleicher & Schuell,
Keene, N. H.), unter Verwendung einer Transferlösung (wie zum Beispiel 6 × SSC (900
mM NaCl, 90 mM Trinatriumcitrat). Nachdem der Transfer vollständig durchgeführt wurde,
im allgemeinen nach etwa 2 Stunden oder mehr, wird die Membran gereinigt
und bei Raumtemperatur luftgetrocknet, nachdem eine Reinigungslösung (wie
zum Beispiel 2 × SSC
[2 × SSC
= 300 mM NaCl, 30 mM Trinatriumcitrat]) verwendet wurde. Die DNA
sollte dann mit der Membran durch entweder UV-Kreuzvernetzung oder
Backen in einem Ofen unter Verwendung von Temperaturen, welche vom
Hersteller der Membran empfohlen werden, kreuzvernetzt werden. Die
Membran sollte dann vorhybridisiert werden (während etwa 2 Stunden oder mehr)
in einer geeigneten Vorhybridisierungslösung (wie zum Beispiel einer wäßrigen Lösung, welche
pro 100 ml enthält:
30–50
ml Formamid, 25 ml 20 × SSPE
(1 × SSPE
= 0,18 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM NaH2PO4, pH 7.7), 2,5 ml von 20%igem SDS, 1 ml
von 10 mg/ml gescherter Heringsspermien-DNA).
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Eine
aus der Sequenz in der 1 genommene
DNA-Sonde sollte durch Elektrophorese auf einem Agarosegel isoliert
werden, das Fragment aus dem Gel ausgeschnitten und aus der ausgeschnittenen
Agarose wiedergewonnen. Dieses gereinigte Fragment der DNA wird
dann markiert (unter Verwendung von z. B.: dem Megaprime Markierungssystems
gemäß den Anweisungen
des Herstellers, um 32P in die DNA zu inkorporieren
(Amersham International plc. Buckinghamshire, England)). Die markierte
Sonde wird denaturiert durch das Erwärmen auf 95°C während 5 min. und sofort zu
der vorausstehenden Vorhybridisierungslösung, welche die Membran enthält, hinzugegeben.
Die Hybridisierungsreaktion sollte eine geeignete Zeit voranschreiten
und unter geeigneten Bedingungen, zum Beispiel während 18 Stunden bei 37°C unter sanftem Schütteln. Die
Membran wird gereinigt (zum Beispiel in 2 × SSC/0,3% SDS) und dann mit
einer geeigneten Waschlösung
unter leichtem Schütteln
gewaschen. Die gewünschte
Stringenz wird ein Ausdruck der Bedingungen sein, unter welchen
die Membran (Filter) gewaschen wird.
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In
einer spezifischen Weise wird die Stringenz einer gegebenen Reaktion
(d. h. das Ausmaß an
Homologie, welches für
eine erfolgreiche Hybridisierung notwendig ist) von den Waschbedingungen
abhängen, welchen
der Filter des Southern-Blots nach der Hybridisierung unterzogen
wird. „Niederstringente" Bedingungen wie
hierin definiert, werden das Waschen eines Filters eines Southern-Blots
mit einer Lösung
von 0,2 × SSC/0,1%
SDS bei 20°C
während
15 min. umfassen, „Standardstringenz"-Bedingungen umfassen
einen weiteren Waschschritt, umfassend das Waschen des Filters des
Southern-Blots ein zweites Mal mit einer Lösung von 0,2 × SSC/0,1%
SDS bei 37°C
während
30 min.
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„Cellulase" ist eine gut klassifizierte
Kategorie von Enzymen im Fachbereich und schließt Enzyme ein, die in der Lage
sind, Cellulosepolymere zu kürzeren
Oligomeren und/oder Glucose zu hydrolysieren. Verbreitete Beispiele
für Cellulaseenzyme
schließen
Exo-Cellobiohydrolasen
und Endoglucanasen ein und sind von vielen Spezies cellulolytischer
Organismen erhältlich,
insbesondere einschließlich
von Pilzen und Bakterien.
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„Hemicellulase" ist ebenfalls eine
gut klassifizierte Kategorie von Enzymen im Fachbereich und schließt Enzyme
ein, welche in der Lage sind, Hemicellulosepolymere zu kürzeren Oligomeren
zu hydrolysieren. Häufige
Beispiele für
Hemicellulasen schließen
Xylanase und Mannanase ein.
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„Cellulose
enthaltende Materialien" bedeutet
Materialien, welche ein Cellulosepolymer als einen ihrer Bestandteile
umfassen. Cellulose wird daher genähte oder ungenähte Textilien
einschließen
oder andere Artikel, welche aus reiner Baumwolle oder aus Baumwollmischungen
gemacht sind, einschließlich
von gewobenen Baumwolltextilien, gestrickter Baumwolle, blauem Jeansstoff
aus Baumwolle, Baumwollgarn und dergleichen oder Mischungen davon,
einschließlich
von einer oder mehreren Fasern, die nicht aus Baumwolle sind, einschließlich von
synthetischen Fasern wie Polyamidfasern (zum Beispiel Nylon 6 und
Nylon 66), Acrylfasern (zum Beispiel Polyacrylonitrilfasern), und
Polyesterfasern (zum Beispiel Polyethylenterephthalat), Polyvinylalkoholfasern
(zum Beispiel Vinylon), Polyvinylchloridfasern, Polyvinylidenchloridfasern,
Polyurethanfasern, Polyharnstofffasern und Aramidfasern. „Cellulose" bedeutet weiter
jedwede Baumwolle oder Nicht-Baumwolle, enthaltend eine cellulosehaltige
Textilie oder Baumwolle oder Nicht-Baumwolle, enthaltend eine Cellulosemischung
einschließlich
von natürlichen
Cellulosederivaten und von Menschenhand hergestellten Cellulosederivaten
(wie Jute, Flachs, Ramie, Rayon, TENCEL®).
Eingeschlossen unter dem Oberbegriff der von Menschenhand hergestellten
Cellulose-Derivate
sind wiederaufbereitete Textilien, die im Fachbereich gut bekannt
sind, wie Rayon. Andere von Menschenhand hergestellte Cellulosederivate
schließen
chemisch modifizierte Cellulosefasern ein (z. B. Cellulose, die
mit Acetat derivatisiert wurde) und Lösemittelgesponnene (solvent-spun) Cellulosefasern.
Natürlich
ist innerhalb der Definition von Cellulose enthaltenden Textilien
jedwede Bekleidung oder Garn, welches aus solchen Materialien gemacht
wird, eingeschlossen. In einer ähnlichen
Weise schließt „Cellulose
enthaltende Textilie" Textilfasern,
welche aus solchen Materialien gemacht sind, ein. Zusätzlich schließen die
Cellulose umfassenden Materialien Holz, Zellstoff und andere auf
Pflanzen basierende Faser (d. h. Gräser, Futtermittel, Saaten,
Bäume,
Maishülsen),
Papier, Pappe, Spanplatte, Nahrungsmittelfasern und Nicht-Nahrungsmittelfasern
ein.
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„Expressionsvektor" bedeutet ein DNA-Konstrukt,
umfassend eine DNA-Sequenz, welche operabel mit einer geeigneten
Kontrollsequenz verbunden ist, die in der Lage ist, die Expression
der DNA in einem geeigneten Wirt zu bewirken. Solche Kontrollsequenzen
können
einen Promotor einschließen,
um Transkription zu bewirken, eine optionale Operatorsequenz, um
die Transkription zu kontrollieren, eine Sequenz, welche für geeignete
Ribosomenbindungsstellen auf der mRNA kodiert, und Sequenzen, welche
die Termination der Transkription und Translation kontrollieren.
Verschiedenartige Zelltypen werden bevorzugtermaßen mit unterschiedlichen Expressionsvektoren
verwendet. Ein bevorzugter Promotor für Vektoren, welche in Bacillus
subtilis verwendet werden, ist der AprE-Promotor; ein bevorzugter
Promotor welcher in E. coli verwendet wird, ist der Lac-Promotor,
ein bevorzugter Promotor, welcher in Saccharomyces cerevisiae verwendet
wird ist PGK1, ein bevorzugter Promotor, der in Aspergillus niger
verwendet wird ist glaA, und ein bevorzugter Promotor für Trichoderma
reesei (longibrachiatum) ist cbhl. Der Vektor kann ein Plasmid sein,
ein Phagenpartikel oder einfach ein mögliches genomisches Insert.
Wenn er einmal in einen geeigneten Wirt transformiert ist, kann
der Vektor replizieren und unabhängig
vom Wirtsgenom funktionieren oder kann unter geeigneten Bedingungen
in das Genom selbst integrieren. In der vorliegenden Beschreibung
werden Plasmid und Vektor manchmal in einer autauschbaren Weise
verwendet. Die Erfindung ist jedoch so gedacht, andere Formen von
Expressionsvektoren einzuschließen,
welche den gleichen Funktionen dienen und welche im Fachbereich
bekannt sind oder bekannt werden. Daher kann eine weite Vielfalt
von Wirts/Expressionsvektor-Kombinationen für die Expression der DNA-Sequenzen
dieser Erfindung verwendet werden. Nützliche Expressionsvektoren
können zum
Beispiel aus Segmenten von chromosomalen, nicht-chromosomalen und
synthetischen DNA-Sequenzen bestehen, wie verschiedenartigen bekannten
Derivaten von SV40, und bekannten bakteriellen Plasmiden, z. B.
Plasmiden von E. coli einschließlich
von colE1, pCR1, pBR322, pMb9, pUC19 und ihren Derivaten, Plasmiden
mit einem weiteren Wirtsbereich, z. B. RP4, Phagen-DNAs, z. B. die zahlreichen
Derivate von dem Phagen λ,
z. B. NM989 und anderen DNA-Phagen,
z. B. M13 und filamentösen
einzelsträngigen
DNA-Phagen, Hefeplasmiden, wie das 2 μ Plasmid oder Derivate davon,
Vektoren, die in eukaryotischen Zellen nützlich sind, wie Vektoren,
die in Tierzellen nützlich
sind, und Vektoren die aus Kombinationen von Plasmid- und Phagen-DNAs stammen,
wie die Plasmide, welche modifiziert worden sind, um Phagen-DNA oder andere Expressionskontrollsequenzen
zu verwenden. Expressionstechniken, welche die Expressionsvektoren
der vorliegenden Erfindung verwenden, sind im Fachbereich bekannt
und werden allgemein beschrieben, zum Beispiel in Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Ausg., Cold Spring Harbour
Press (1989). Oftmals werden solche Expressionsvektoren, welche
die DNA-Sequenzen der Erfindung einschließen, in einen einzelligen Wirt durch
eine direkte Insertion in das Genom einer bestimmten Spezies durch
ein Integrationsereignis transformiert (siehe z. B. Bennett & Lasure, More
Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego, S. 70–76 (1991)
und die darin zitierten Artikel, welche die gerichtete genomische
Insertion in Pilzen als den Wirten beschreiben, sind hierin durch
den Bezug darauf mit einbezogen).
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„Wirtsstamm" oder „Wirtszelle" bedeutet einen geeigneten
Wirt für
einen Expressionsvektor, umfassend DNA gemäß der vorliegenden Erfindung.
Wirtszellen, welche in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind
im allgemeinen prokaryotische oder eukaryotische Wirte, einschließlich von
jedweden transformierbaren Mikroorganismen, in welchen eine Expression
erreicht werden kann. In einer spezifischem Weise können Wirtsstämme sein
Bacillus subtilis, Escherichia coli, Trichoderma reesei (longibrachiatum),
Saccharomyces cerevisiae oder Aspergillus niger. Wirtszellen werden
transformiert oder transfiziert mit Vektoren, die unter Verwendung
rekombinanter DNA-Techniken konstruiert wurden. Solche transformierten Wirtszellen
sind in der Lage sowohl Vektoren zu replizieren, welche für Swollenin
kodieren und seine Varianten (Mutanten) oder welche das gewünschte Peptidprodukt
exprimieren. In einer bevorzugten Ausführungsform gemäß der vorliegenden
Erfindung, bedeutet „Wirtszelle" sowohl die Zellen
und Protoplasten, welche von den Zellen von Trichoderma sp. kreiert
wurden.
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„Signalsequenz" bedeutet eine Sequenz
von Aminosäuren,
welche an den N-terminalen Anteil eines Proteins gebunden ist, welcher
die Sezernierung der reifen Form des Proteins aus der Zelle heraus
erleichtert. Diese Definition einer Signalsequenz ist eine funktionelle.
Der reifen Form des extrazellulären
Proteins fehlt die Signalsequenz, welche während des Sezernierungsprozesses
weg geschnitten wird.
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„DNA-Konstrukt" oder „Vektor" (hierin austauschbar
verwendet) bedeutet eine Nukleotidsequenz, welche eine oder mehrere
DNA-Fragmente oder Fragmente von DNA-Varianten umfaßt, welche
für jedwede
der vorausstehend beschriebenen neuartigen Swollenine oder Derivate
davon kodiert.
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„In funktioneller
Weise angeheftet an" bedeutet,
daß eine
regulatorische Region, wie ein Promotor, ein Terminator, ein Sezernierungssignal
oder ein Enhancer-Bereich an ein strukturelles Gen angeheftet ist,
und die Expression dieses Gens kontrolliert.
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Herstellung
von Swollenin
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft die Expression, die Reinigung und/oder
die Isolation und Verwendung von Swolleninen und Derivaten von Swolleninen.
Diese Swollenine werden bevorzugtermaßen hergestellt durch rekombinante
Verfahren. Die Swollenin-Proteine für die Verwendung in der vorliegenden
Erfindung können
jedoch durch andere im Fachbereich bekannte Mittel wie die Reinigung
von natürlichen
Isolaten erhalten werden.
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Eine
bevorzugte Weise für
die Herstellung von Swollenin gemäß der vorliegenden Erfindung
umfaßt das
Transformieren von Trichoderma sp. als einer Wirtszelle mit einem
DNA-Konstrukt, umfassend
mindestens ein Fragment von DNA, welches für einen Anteil oder das gesamte
des Swollenins kodiert, in einer funktionellen Weise angeheftet
an einen Promotor. Die transformierte Wirtszelle läßt man dann
unter Bedingungen wachsen, so daß das gewünschte Protein exprimiert wird.
Nachfolgend wird das gewünschte
Proteinprodukt im wesentlichen zur Homogenität gereinigt.
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Bevorzugtermaßen umfaßt der Mikroorganismus,
der transformiert werden soll, einen Stamm, welcher von Trichoderma
spp. oder Aspergillus spp. abgeleitet ist. Mehr zu bevorzugen umfaßt der Stamm
T. reesei (longibrachiatum), welcher nützlich ist für das Erhalten
von überexprimiertem
Protein oder Aspergillus niger var. awamori. Zum Beispiel RL-P37,
beschrieben von Sheir-Neiss et al., in Appl. Microbiol. Biotechnology,
20 (1984) S. 46–53,
ist dafür
bekannt, erhöhte
Mengen an Cellulaseenzymen zu sezernieren. Funktionelle Äquivalente
von RL-P37 schließen
den Trichoderma reesei (longibrachiatum) Stamm RUT-C30 (ATCC Nr. 56
765) und den Stamm QM9414 (ATCC Nr. 26 921) ein. Ein anderes Beispiel
schließt überproduzierende
Mutanten ein, wie beschrieben in Ward et al., in Appl. Microbiol.
Biotechnology 39: 738–743
(1993). Man erwägt,
daß diese
Stämme
ebenfalls nützlich
für die Überexpression
von Trichoderm spp.-Swollenin seien.
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Wo
es gewünscht
wird, das Swollenin-Protein in der Abwesenheit von einer cellulolytischen
Aktivität zu
erhalten, ist es nützlich,
zum Beispiel einen Trichoderma-Wirtszellstamm zu erhalten, bei welchem
eines oder mehrere Cellulasegene vor der Einführung eines DNA-Konstruktes oder
Plasmids, welches das DNA-Fragment, welches für das Swollenin kodiert, enthält, deletiert
wurden Solche Stämme
können
hergestellt werden durch die Verfahren, die in dem USP Nr. 5 246
853 und der WO 92/06 209 offenbart wurden, wobei diese Offenbarungen
durch den Bezug darauf mit einbezogen sind. Durch das Exprimieren
eines Swollenins in einem Wirtsmikroorganismus, welchem eines oder
mehrere Cellulasegene fehlen, werden die Identifikation und die
nachfolgenden Reinigungsverfahren vereinfacht. Jedwedes Gen von
Trichoderma sp., welches kloniert worden ist, kann deletiert werden,
zum Beispiel die Gene cbhl, cbh2, egl1 und egl3, sowie diejenigen, welche
für EGIII-
und/oder das EGV-Protein kodieren (siehe z. B. USP Nr. 5 475 101
bzw. WO 94/28 117).
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Eine
Gendeletion kann erreicht werden durch das Einfügen einer Form des gewünschten
Gens, das deletiert oder disruptiert werden soll in ein Plasmid,
durch Verfahren, welche im Fachbereich bekannt sind. Das Deletionsplasmid
wird dann an einer bzw. an geeigneten Restriktionsenzymschnittstelle(n)
geschnitten, innerhalb des Bereiches, der für das gewünschte Gen kodiert, und dann
wird die für
das Gen kodierende Sequenz oder ein Teil davon durch einen selektierbaren
Marker ersetzt. Flankierende DNA-Sequenzen des Locus des Gens, das
deletiert oder disruptiert werden soll, können, bevorzugtermaßen zwischen
etwa 0,5 bis 2,0 kb, auf jeder Seite des selektierbaren Markergens
verbleiben. Ein geeignetes Deletionsplasmid wird im allgemeinen einzigartige
Restriktionsenzymschnittstellen darin haben, um es zu ermöglichen,
daß das
Fragment, welches das deletierte Gen enthält einschließlich von
flankierenden DNA-Sequenzen und dem selektierbaren Markergen, als
ein einzelnes lineares Stück
entfernt wird.
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Ein
selektierbarer Marker muß so
gewählt
werden, daß er
den Nachweis des transformierten Pilzes ermöglicht. Jedwedes selektierbare
Markergen, welches in dem ausgewählten
Mikroorganismus exprimiert wird, wird geeignet sein. Zum Beispiel
wird für
Trichoderma sp. der selektierbare Marker so gewählt, daß das Vorhandensein des selektierbaren
Markers in den Transformanten nicht in einer signifikanten Weise
einen Einfluß auf
die Eigenschaften von diesem haben wird. Ein solcher selektierbarer
Marker kann ein Gen sein, welches für ein nachweisbares Produkt
kodiert. Zum Beispiel kann eine funktionelle Kopie eines Gens von
Trichoderma sp. verwendet werden, welches, falls es in dem Wirtsstamm
fehlt, darin resultiert, daß der
Wirtsstamm einen auxotrophen Phänotyp
zeigt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird ein pyr4– derivatisierter
Stamm von Trichoderma sp. transformiert mit einem funktionellen
pyr4-Gen, welches auf diese Weise für einen selektierbaren Marker
für die Transformation
sorgt. Ein pyr4– derivatisierter Stamm
kann erhalten werden durch die Selektion von Stämmen von Trichoderma sp., welche
resistent gegenüber
Fluor-Orotsäure
(FOA) sind. Das pyr4-Gen kodiert für Orotidin-5'-monophosphatdecarboxylase,
ein Enzym, welches für
die Biosynthese von Uridin erforderlich ist. Stämme mit einem intakten pyr4-Gen
wachsen in einem Medium, welchem Uridin fehlt, sind aber sensitiv
gegenüber
von Fluor-Orotsäure.
Es ist möglich
pyr4– derivatisierte
Stämme
zu selektieren, welchen ein funktionelles Orotidin-monophosphatdecarboxylaseenzym
fehlt, und welche Uridin für
das Wachstum nötig
haben, durch das Selektieren auf FOA-Resistenz. Unter Verwendung
des FOA-Selektionsverfahrens, ist es ebenfalls möglich, Uridin erfordernde Stämme zu erhalten,
welchen eine funktionelle Orotat-pyrophosphoribosyltransferase fehlt.
Es ist möglich,
diese Zellen mit einer funktionellen Kopie des Gens, das für dieses
Enzym kodiert, zu transformieren (Berges und Barreau, 1991, Curr.
Genet. 19 S. 359–365).
Die Selektion auf derivatisierte Stämme wird leicht durchgeführt unter
Verwendung des FOA-Resistenzverfahrens,
auf das vorausstehend Bezug genommen wird, und auf diese Weise wird
das pyr4-Gen bevorzugtermaßen
als ein selektierbarer Marker verwendet.
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Um
pyr4– Trichoderma
sp. zu transformieren, so daß diesen
die Fähigkeit
fehlt, eines oder mehrere Cellulasegene zu exprimieren, wird dann
ein einzelnes DNA-Fragment, welches ein disruptiertes oder deletiertes
Cellulasegen umfaßt,
aus dem Deletionsplasmid isoliert und verwendet, um einen geeigneten
pyr– Trichoderma
Wirt zu transformieren. Die Transformanten werden dann identifiziert
und selektiert, basierend auf ihrer Fähigkeit, das pyr4-Genprodukt
zu exprimieren und auf diese Weise die Uridin-Auxotrophie des Wirtsstammes zu
komplementieren. Eine Southern-Blot-Analyse wird dann an den resultierenden
Transformanten durchgeführt,
um ein doppeltes Überkreuzungsintegationsereignis
zu identifizieren und zu bestätigen,
welches einen Teil oder das Gesamte des kodierenden Bereiches der
genomischen Kopie des Gens, das deletiert werden soll, durch die
selektierbaren Marker pyr4 ersetzt.
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Obwohl
die spezifischen Plasmidvektoren, welche vorausstehend beschrieben
wurden, sich auf die Herstellung von pyr– Transformanten
beziehen, ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Vektoren
beschränkt.
Verschiedenartige Gene können
deletiert und ersetzt werden in dem Trichoderma sp. Stamm unter Verwendung
der vorausstehenden Verfahren. Zusätzlich können jedwede verfügbaren selektierbaren
Marker verwendet werden, wie vorausstehend diskutiert. Tatsächlich kann
jedwedes Gen von Trichoderma sp., welches kloniert und auf diese
Weise identifiziert worden ist, aus dem Genom unter Verwendung der
vorausstehend beschriebenen Strategie deletiert werden.
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Wie
vorausstehend festgestellt, sind die verwendeten Wirtsstämme Derivate
von Trichoderma sp., welchen das Gen fehlt, oder welche ein nicht-funktionelles
Gen oder Gene haben, welche den ausgewählten selektierbaren Markern
entsprechen. Falls zum Beispiel der selektierbare Marker pyr4 ausgewählt wird,
dann wird ein spezifischer pyr4– derivatisierter
Stamm als ein Empfänger
in dem Tranformationsverfahren gewählt. In einer ähnlichen
Weise können
selektierbare Marker, welche Gene von Trichoderma sp. umfassen,
die äquivalent
sind zu den Genen amds, argB, trpC, niaD von Aspergillus nidulans
verwendet werden. Der entsprechende Empfängerstamm muß daher
ein Derivatstamm sein wie argB–, trpC– bzw.
niaD–.
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Die
DNA, welche für
das Swollenin-Protein kodiert, wird dann für eine Insertion in einen geeigneten Mikroorganismus
hergestellt. Gemäß der vorliegenden
Erfindung umfaßt
die DNA, die für
ein Swollenin-Enzym kodiert, die gesamte DNA, die notwendig ist,
um für
ein Protein zu kodieren, welches eine funktionelle Swollenin-Aktivität hat. Entsprechend
kann die DNA von jedweder mikrobiellen Quelle abstammen, welche
Swollenin produziert, unter der Voraussetzung, daß das Gen
den Methoden folgend, die hierin beschrieben sind, identifiziert
und isoliert werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform
kodiert die DNA für
ein Swollenin-Protein, daß von
Trichoderma sp. stammt und mehr zu bevorzugen, von Trichoderma reesei
(longibrachiatum).
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Das
DNA-Fragment oder das Fragment der varianten DNA, welches für das Swollenin
oder das Derivat kodiert, kann in einer funktionellen Weise an eine
Promotorsequenz von Pilzen angeheftet sein, zum Beispiel dem Promotor
von dem cbhl oder ebl1 Gen.
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Es
wird ebenfalls betrachtet, daß mehr
als eine Kopie von der DNA, welche für ein Swollenin kodiert, in
den Stamm rekombiniert werden kann, um eine Überexpression zu erleichtern.
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Die
DNA, die für
das Swollenin kodiert, kann hergestellt werden durch die Konstruktion
eines Expressionsvektors, welcher die DNA trägt, welche für die trunkierte
Cellulase kodiert. Der Expressionsvektor, welcher das eingefügte DNA-Fragment
trägt,
welches für
das Swollenin kodiert, kann jedweder Vektor sein, welcher in der
Lage ist, autonom in einem gegebenen Wirtsorganismus zu replizieren,
oder in die DNA des Wirts zu integrieren, typischerweise ein Plasmid.
In bevorzugten Ausführungsformen
werden zwei Arten von Expressionsvektoren zum Erhalt der Expression
von Genen betrachtet. Die erste enthält DNA-Sequenzen, in welchen der
Promotor, der für
das Gen kodierende Bereich und die Terminatorsequenz alle von dem
Gen stammen, das exprimiert werden soll. Eine Trunkierung des Gens
kann erhalten werden, durch das Deletieren unerwünschter DNA-Sequenzen (z. B.
die für
unerwünschte
Domänen
kodieren) um die Domäne,
welche exprimiert werden soll, unter der Kontrolle ihrer eigenen
Transkriptions- und Translations-regulatorischen Sequenzen zu lassen.
Ein selektierbarer Marker ist ebenfalls auf dem Vektor enthalten,
was die Selektion auf eine Integration in den Wirt von multiplen
Kopien der neuartigen Gensequenzen gestattet.
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Die
zweite Art eines Expressionsvektors wird zuvor zusammengesetzt und
enthält
Sequenzen, welche für
eine Transkription auf hohem Niveau erforderlich sind, und einen
selektierbaren Marker. Es wird erwogen, daß der kodierende Bereich für ein Gen
oder einen Teil davon in diesen Expressionsvektor für einen
allgemeinen Zweck so eingefügt
werden kann, daß er
unter der transkriptionellen Kontrolle der Expressionskassetten der
Promotor- und Terminatorsequenzen ist. Zum Beispiel ist pTEX ein
solcher Expressionsvektor für
einen allgemeinen Zweck. Gene oder Teile davon können stromabwärts von
dem starken cbhl-Promotor
eingefügt werden.
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In
dem Vektor sollte die DNA-Sequenz, welche für das Swollenin-Protein der
vorliegenden Erfindung kodiert, in einer oparablen Weise mit den
Transkriptions- und Translationssequenzen verknüpft sein, d. h. einer geeigneten
Promotorsequenz und Signalsequenz im Leserahmen mit dem Strukturgen.
Der Promotor kann jedwede DNA-Sequenz sein, welche eine Transkriptionsaktivität in der
Wirtszelle zeigt, und kann von Genen stammen, welche für Proteine
kodieren, entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle. Das
Signalpeptid sorgt für
die extrazelluläre
Produktion des Swollenins oder von Derivaten davon. Die DNA, welche
für die
Signalsequenz kodiert, ist bevorzugtermaßen diejenige, welche natürlicherweise
mit dem Gen, das exprimiert werden soll, assoziiert ist, die Signalsequenz
wird jedoch von jedweder geeigneten Quelle, zum Beispiel von Exocellobiohydrolasen
oder einer Endoglucanase von Trichoderma in der vorliegenden Erfindung
in Betracht gezogen.
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Die
Verfahren, die verwendet wurden, um die DNA-Sequenzen, die für die Swollenine
der vorliegenden Erfindung kodieren, mit dem Promotor zu ligieren
und für
die Insertion in geeignete Vektoren, sind im Fachbereich gut bekannt.
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Der
vorausstehend beschriebene DNA-Vektor oder das -Konstrukt können in
die Wirtszelle in Übereinstimmung
mit bekannten Verfahren eingeführt
werden, wie der Transformation, der Transfektion, der Mikroinjektion,
der Mikroporation, biolistischem Beschuß und dergleichen.
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In
dem bevorzugten Transformationsverfahren muß in Betracht gezogen werden,
daß die
Permeabilität
der Zellwand gegenüber
von DNA in Trichoderma sp. sehr niedrig ist. Entsprechend ist die
Aufnahme der gewünschten
DNA-Sequenz, des Gens oder des Genfragmentes bestenfalls minimal.
Es gibt eine Anzahl von Verfahren, um die Permeabilität der Zellwand
von Trichoderma sp. in dem Derivatstamm zu erhöhen (d. h. das Fehlen eines
funktionellen Gens entsprechend dem verwendeten selektierbaren Marker)
vor dem Transformationsverfahren.
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Das
bevorzugte Verfahren in der vorliegenden Erfindung, um Trichoderma
sp. für
eine Transformation zu präparieren,
schließt
die Präparation
von Protoplasten aus Pilzmycel ein. Das Mycel kann aus gekeimten vegetativen
Sporen erhalten werden. Das Mycel wird mit einem Enzym behandelt,
welches die Zellwand verdaut, was in Protoplasten resultiert. Die
Protoplasten werden dann durch das Vorhandensein eines osmotischen
Stabilisators in dem Suspensionsmedium geschützt. Diese Stabilisatoren schließen Sorbitol,
Mannitol, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat und dergleichen ein. Gewöhnlich variiert
die Konzentration dieser Stabilisatoren zwischen 0,8 M und bis zu
1,2 M. Es wird bevorzugt etwa eine 1,2 M Lösung von Sorbitol in dem Suspensionsmedium
zu verwenden.
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Die
Aufnahme von DNA in den Wirtsstamm von Trichoderma sp. ist abhängig von
der Calziumionenkonzentration. Im allgemeinen wird etwa zwischen
10 mM CaCl2 und 50 mM CaCl2 in
einer Aufnahmelösung verwendet.
Neben der Notwendigkeit des Calziumions in der Aufnahmelösung, sind
andere Posten, die im allgemeinen eingeschlossen sind, ein pufferndes
System wie TE-Puffer (10 mM Tris, pH 7,4; 1 mM EDTA) oder 10 mM
MOPS-Puffer, pH 6,0 (Morpholinpropansulfonsäure) und Polyethylenglycol
(PEG). Man glaubt, daß das Polyethylenglycol
so wirkt, daß es
die Zellmembranen fusioniert und auf diese Weise den Inhaltstoffen
des Mediums gestattet, in das Cytoplasma des Trichoderma sp. Stammes überführt zu werden,
und die Plasmid-DNA wird zu dem Nukleus transferiert. Diese Fusion
hinterläßt häufig multiple
Kopien der Plasmid-DNA, angeordnet im Tandem in dem Chomosom des
Wirtes.
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Gewöhnlich wird
eine Suspension, welche die Trichoderma sp. Protoplasten oder Zellen
enthält,
welche einer Permeabilitätsbehandlung
unterzogen wurden, in einer Dichte von 108 bis
zu 109/ml, bevorzugtermaßen 2 × 108/ml,
werden in der Transformation verwendet. Ein Volumen von 100 Mikroliter
dieser Protoplasten oder Zellen in einer geeigneten Lösung (z.
B. 1,2 M Sorbitol, 50 mM CaCl2) wird mit
der gewünschten
DNA gemischt. Im allgemeinen wird eine hohe Konzentration PEG zu
der Aufnahmelösung
hinzugegeben. Von 0,1 bis 1 Volumen von 25%-igem PEG 4000 kann zu
der Protoplastensuspension hinzu gegeben werden. Es wird jedoch
bevorzugt, etwa 0,25 Volumen zu der Protoplastensuspension hinzu
zu geben. Zusatzstoffe wie Dimethylsulfoxid, Heparin, Spermidin,
Kaliumchlorid und dergleichen können
ebenfalls zu der Aufnahmelösung
hinzu gegeben werden und bei der Transformation helfen.
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Im
allgemeinen wird die Mischung dann bei etwa 0°C während einer Periode, die zwischen
10 und 30 min liegt, inkubiert. Zusätzliches PEG wird dann zu der
Mischung zugegeben, um die Aufnahme des gewünschten Gens oder der DNA-Sequenz
weiter zu erhöhen.
Das 25%-ige PEG 4000 wird im allgemeinen in Volumina von 5 bis 15-fach
des Volumens der Transformationsmischung zugegeben; jedoch können größere und
kleinere Volumina geeignet sein. Das 25%-ige PEG 4000 ist bevorzugtermaßen etwa
10 mal das Volumen der Transformationsmischung. Nachdem das PEG
zugegeben wurde, wird die Transformationsmischung bei Raumtemperatur
vor der Zugabe einer Sorbitol- und CaCl2-Lösung inkubiert.
Die Protoplastensuspension wird dann weiter zu geschmolzenen Aliquots
eines Wachstumsmediums zugegeben. Dieses Wachstumsmedium gestattet
nur das Wachstum der Transformanten. Jedwedes Wachstumsmedium kann
in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, welches geeignet
ist, die gewünschten
Transformanten wachsen zu lassen. Falls jedoch Pyr+ Transformanten
selektiert werden, wird es bevorzugt, ein Wachstumsmedium zu verwenden,
welches kein Uridin enthält.
Die nachfolgenden Kolonien werden transferiert und auf einem Wachstumsmedium, welches
von Uridin depletiert ist, gereinigt.
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In
diesem Stadium können
stabile Transformanten von instabilen Transformanten durch ihre
schnellere Wachstumsrate und die Bildung kreisförmiger Kolonien mit einem glatten
anstelle eines ausgefransten Randes auf dem festen Kulturmedium,
dem Uridin fehlt, unterschieden werden. Zusätzlich kann in einigen Fällen ein
weiterer Stabilitätstest
gemacht werden, indem die Transformanten auf einem festen Nicht-Selektivmedium (d.
h. Uridin enthaltend) gemacht werden, indem Sporen von diesem Kulturmedium
geerntet werden und der Prozentsatz dieser Sporen bestimmt wird,
welcher nachfolgend auf Selektivmedium, dem Uridin fehlt, keimen und
wachsen wird.
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In
einer besonderen Ausführungsform
des vorausstehenden Verfahrens werden das Swollenin oder Derivate
davon in einer aktiven Form aus der Wirtszelle nach dem Wachstum
in Flüssigmedium
entweder als ein Ergebnis des geeigneten posttranslationalen Prozessierens
des neuen Swollenins oder von Derivaten davon geerntet.
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Die
exprimierten Swollenine werden aus dem Medium durch konventionelle
Verfahren, einschließlich der
Separation der Zellen aus dem Medium durch Zentrifugation, Filtration
und Präzipitation
der Proteine in dem Überstand
oder dem Filtrat mit einem Salz, zum Beispiel mit Ammoniumsulfat
wiedergewonnen. Zusätzlich
können
chromatographische Verfahren, wie Ionenaustauschchromatographie
oder Affinitätschromatographie
verwendet werden. Antikörper
(polyklonale oder monoklonale) können
gegen die natürlichen
gereinigten Swollenine erzeugt werden oder synthetische Peptide
können
von Anteilen des Swollenin-Moleküls
hergestellt werden, und dafür
verwendet werden, polyklonale Antikörper zu erzeugen.
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Beispiel 1
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Trichoderma reesei (longibrachiatum)
cDNA
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Für ein neuartiges Swollenin
kodierender Klon
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Die 1 zeigt die Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr.:
1) und die vorausgesagte entsprechende Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 2)
von einem cDNA Klon, welcher aus einer cDNA-Bibliothek, die aus der RNA von Trichoderma
reesei (longibrachiatum) nach dem Wachstum auf einer gemischten
Kohlenstoffquelle hergestellt wurde, wie beschrieben von Saloheimo
et al., 1994, Molec. Microbiol. 13: 219–228. Die cDNA zeigte die folgenden
Charakteristika, welche helfen, um das Gen zu beschreiben:
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Ein
offener Leserahmen von 1482 nt wurde identifiziert, und das kodierte
Protein wurde abgeleitet.
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Die
ersten 18 Aminosäuren
des vorausgesagten Proteins haben die folgenden Eigenschaften, die
für eine
Sezernierungssignalsequenz und eine Signalschnittstelle erwartet
werden. Es gibt eine positiv geladene Aminosäure (Lysin) nahe am aminoterminalen
Methionin, auf welche eine Sequenz hydrophober Aminosäuren folgt
und eine offensichtliche Signal-Peptidaseschnittstelle, folgend
auf die Aminosäure
Ile18. Der vorausgesagte N-Terminus des reifen Swollenins könnte daher
Gln-Gln sein. In einer ähnlichen
Weise haben viele von den reifen Cellulasen, die von Trichoderma
hergestellt werden, ein Glutamin am N-Terminus (z. B., CBHI, CBHII,
EGI, EGII und EGIII) und sowohl EGI als auch EGII beginnen mit einem
Paar von Glutaminresten, was den Schluß bestärkt, daß dies der N-Terminus ist.
Es wird daher vorausgesagt, daß das
reife Protein eine Länge
von 475 Aminosäuren
hat und ein Molekulargewicht von etwa 49,5 kDa, was irgend eine
mögliche
Glycosylierung oder andere Modifikation nicht einschließt, und
einen berechneten pI von etwa 4,6, basierend auf der Aminosäurezusammensetzung.
Es gibt drei mögliche
N-verknüpfte
Glycosylierungsstellen (mit der Konsensusaminosäuresequenz von N-X-S/T) an
den Asparaginen 160, 336 und 406. Die Reste 4 bis 39 der vorausgesagten
reifen Proteinsequenz haben eine enge Ähnlichkeit mit den Cellulose
bindenden Domänen
(CBD) von Cellulasen, die von Trichoderma hergestellt wurden und
anderen Cellulasen von Pilzen (58% Identität mit dem CBD von CBHII von
Trichoderma). CBD sind ebenfalls assoziiert mit einigen nicht-cellulolytischen
extrazellulären
Pilzenzymen wie Acetylxylanesterase und Mannanase von Trichoderma
reesei (longibrachiatum) und eine ähnliche Identität wird zwischen
der Swollenin CBD und diesen CBD gezeigt.
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Auf
die CBD des vorausgesagten Proteins von Trichoderma folgt ein Bereich
(von dem Rest 41 bis etwa dem Rest 86), welcher reich ist an Ser-,
Thr-, Gly- und Pro-Resten, und welcher eine ähnliche Funktionalität mit der
Linker oder Gelenkregion teilen sollte, welche in Trichoderma vorhanden
ist und anderen Cellulasen von Pilzen, und welcher das CBD mit der
katalytischen Domäne
verknüpft.
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Bereiche
der Ähnlichkeit
werden beobachtet zwischen der vorausgesagten Aminosäuresequenz
(SEQ ID Nr.: 2) von dem Swollenin von Trichoderma in der 1 und bekannten Sequenzen von Expansinen
höherer
Pflanzen. Die 2 zeigt die Gleichrichtung zwischen
einem Teil des vorausgesagten Proteins von Trichoderma und einer
Konsensussequenz (SEQ ID Nr.: 3), welche von neun Expansinen von
Pflanzen durch Shcherban et al., supra abgeleitet ist. Diese Sequenzen
wurden gleichgerichtet unter Verwendung des Jotun Hein-Algorithmus
innerhalb des Lasergene Softwarepakets (DNASTAR Inc.) und eine 36%-ige Ähnlichkeit wurde
zwischen den zwei Aminosäuresequenzen
berechnet. Von den 322 Aminosäuren
der Swolleninsequenz von Trichoderma, welche in dieser Gleichrichtung
verwendet wurde, sind 70 oder 21,7% identisch mit der Konsensussequenz
von höheren
Pflanzen.
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Bereiche
der Ähnlichkeit
können
ebenfalls zwischen dem Swollenin von Trichoderma reesei (longibrachiatum)
und dem menschlichen Protein Titin beobachtet werden, welches reich
ist an Wiederholungen bzw. Repeats von Fibronectin-Typ. Die Homologie
wurde in einer Ähnlichkeitssuche
mit den Proteinsequenzdatenbanken nachgewiesen, ausgeführt mit
dem Programm BLAST (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 215: 403–410) und
die Gleichrichtungen, die als Beispiele gezeigt werden, wurden mit
dem Programm geschaffen. Die Bereiche von Titin, welche homolog
sind mit dem Swollenin von T. reesei, sind Teile der Repeats vom
Fibronectin-Typ. Fibronectin-Repeats hat man in einigen bakteriellen Kohlenhydrat
modifizierenden Enzymen gefunden (Little et al., 1994, J. Mol. Evol.,
39: 631–643)
aber nicht in irgendeinem Protein von Pilzen. Eine BLAST-Suche enthüllt keine Ähnlichkeit
mit den Expansinen von Pflanzen und Proteinen, welche einen Fibronectin-Repeat enthalten.
-
-
Das
Swollenin Gen von Trichoderma reesei (longibrachiatum) wurde exprimiert,
wenn man den Pilz auf Cellulose als der einzigen Kohlenstoffquelle
wachsen ließ,
aber nicht wenn er auf Glucose als der einzigen Kohlenstoffquelle
wachsen gelassen wurde.
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Um
die Regulation der Expression des Swollenin-Gens in Trichoderma
zu untersuchen, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Der
Trichoderma reesei (longibrachiatum) Stamm QM9414 wurde in Schüttlerflaschen
(28°C, 200
U/min) in einem Minimalmedium (Penttilä et al., 1987 Gene 61: 155–164), 5%
oder 2% Cellulose enthaltend, während
drei Tagen wachsen gelassen. Um auf die Induktion durch Sophorose
zu testen, ließ man
den Stamm in einem Minimalmedium mit 2% Sorbitol während drei
Tagen wachsen, und Sophorose wurde bis zur Endkonzentration von
1 mM zugegeben. Die Kultur wurde weitere 10 Stunden fortgesetzt,
und dieselbe Menge an Sophorose wurde zugegeben. Die Kultivierung
wurde 5 Stunden nach der zweiten Zugabe beendet. Eine Kultur von
87 Stunden in 2% Sorbitol wurde ausgeführt ohne die Zugabe von Sophorose
als eine Kontrolle. Nach den Kulturen wurde das Mycel durch eine
Filtration mit einem Glasfaserfilter geerntet, mit 0,9% NaCl gewaschen
und eingefroren. Die Gesamt-RNA wurde aus den Mycel-Proben gemäß Chirgwin
et al., (1979, Biochem. J. 18: 5294–5299) isoliert. RNA-Proben
von 5 μg
wurden mit Glyoxal behandelt und auf einem 1%-igen Agarosegel in
10 mM Na-Phosphat-Puffer, pH 7, laufen gelassen. Das Kapillar-Blotten
auf eine Hybond N Nylon-Membran (Amersham) wurde durchgeführt gemäß den Anleitungen
des Herstellers. Die Hybridisierungssonde wurde hergestellt durch
das Verdauen des Plasmids der cDNA-Bibliothek, welches die cDNA
von Swollenin trug, mit EcoRI und XhoI, das Laufen lassen des verdauten
Plasmids auf einem 0,8%-igen Agarosegel und das Isolieren des cDNA-Fragmentes
aus dem Gel mit dem Quiaquick Gelextraktions-Kit (Quiagen). Die
Sonde wurde mit 32P-dCTP unter Verwendung
des Random Primed DNA Markierungs-Kits (Boehringer Mannheim) markiert.
Die Hybridisierung war eine während
24 Stunden bei 42°C
in 50% Formamid, 10% Dextransulfat, 1% SDS, 1 M NaCl, 125 μg/ml Heringsspermien-DNA.
Der Filter wurde bei 42°C
in 5 × SSPE
15 Minuten lang gewaschen, in 1 × SSPE, 0,1%SDS 2 × 15 min
und in 0,1 × SSPE,
0,1% SDS 2 × 15 Minuten
bei Raumtemperatur. (1 × SSPE
ist 0,18 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM NaH2PO4, pH 7,7). Die Ergebnisse dieses Experiments
sind in der 3 gezeigt. Keine mRNA von Swollenin
wurde nach dem Wachstum auf Glucose beobachtet und sehr wenig wurde
nach dem Wachstum auf Sorbitol beobachtet. Im Gegensatz dazu wurden
hohe Niveaus an mRNA von Swollenin nach dem Wachstum auf Cellulose
oder nach der Zugabe von Sophorose zu einer unter Sorbitol gewachsenen
Kultur beobachtet.
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Beispiel 2
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Herstellung eines klonierten,
für Trichoderma
Swollenin kodierenden DNA-Moleküls
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Das
folgende wird bereitgestellt als ein Verfahren zur Herstellung eines
Klons, welcher ein gesamtes in dem Beispiel 2 beschriebenes Swollenin-Gen
umfaßt.
In diesem Beispiel werden genomische DNA oder cDNA-Klone von Trichoderma
abgeleitet und unter Verwendung des folgenden Verfahrens hergestellt.
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Die
nachstehend gezeigten Oligonukleotide werden synthetisiert:
-
-
Das
Oligonukleotid EXP-A enthält
eine Erkennungsstelle für
das Restriktionsenzym BglII nahe dem 5'-Ende gefolgt von der DNA-Sequenz von
dem nt, bzw. Nukleotid 425 bis nt 445 der SEQ. ID Nr.: 1. Das Oligonukleotid
EXP-B enthält
eine Erkennungsstelle für
XbaI nahe dem 5'-Ende,
gefolgt von dem reversen Komplement der DNA-Sequenz von nt 1471
bis nt 1490 der SEQ ID Nr.: 1.
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Eine
Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde durchgeführt unter Verwendung der Oligonukleotide EXP-A
und EXP-B als den Primern und genomischer Gesamt-DNA, die aus dem
Trichoderma reesei Stamm QM6a (ATCC 13631) isoliert worden war als
der Matrize. Das DNA-Polymeraseenzym (Pwo Polymerase), der Puffer
und die verwendete Deoxynukleotidmischung wurden von Boehringer
Mannheim geliefert. Die folgenden Bedingungen wurden für die PCR
verwendet; Schritt 1, 1 min. bei 94°C; Schritt 2, 40 s. bei 92°C; Schritt 3,
1 min. bei 50°C;
Schritt 4, 2 min. bei 72°C;
die Schritte 2, 3 und 4 wurden 29 Mal wiederholt; Schritt 5,5 min. bei
72°C.
-
Das
DNA-Hauptprodukt der PCR war ein Fragment von etwa 1,3 kb wie durch
eine Agarosegelelektrophorese abgeschätzt. Das PCR-Produkt wurde
mit BglII und XbaI verdaut, und das DNA-Fragment von 1,3 kb wurde
aus einem Agarose-Elektrophorese-Gel gereinigt. Dieses DNA-Fragment
wurde mit pSL1180 (Pharmacia) ligiert, welches mit BglII und XbaI
verdaut worden war. Das resultierende Plasmid wurde als pSLexpPCR
bezeichnet. Die Sequenzanalyse der DNA bestätigte, daß das Insert von 1,3 kb in
pSLexpPCR dem erwarteten Fragment des Swollenin-Gens von Trichoderma
entsprach. Die DNA-Sequenz enthüllte
das Vorhandensein von drei Introns innerhalb dieses 1,3 kb Fragmentes
an den Positionen, welche denen zwischen nt 575 und nt 576 zwischen
nt 791 und nt 792 und zwischen nt 969 und nt 970 der SEQ ID Nr.:
1 entsprechen.
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Das
Plasmid oder das Insert von 1,3 kb, das es enthält, kann nun als eine Hybridisierungssonde
verwendet werden, um es zu gestatten, daß das gesamte Swollenin-Gen
von jedweder genomischen DNA oder cDNA-Bibliothek von Interesse
kloniert werden kann. Die Swollenin kodierende DNA innerhalb des
pSLexpPCR schließt
nicht diejenigen Bereiche ein, welche der CBD oder der Linker- (Gelenk-)
Region entsprechen. Daher würde
vom Entwurf her erwartet werden, daß es mit anderen Swollenin-DNA-Sequenzen,
nicht aber mit CBD kodierenden Sequenzen, welche ein Teil von anderen
Nicht-Swollenin-Genen sein können,
hybridisiert.
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Die
genomische Gesamt-DNA von dem T. reesei (longibrachiatum) Stamm
QM6a wurde getrennt mit einer Vielzahl von verschiedenen Restriktionsendonukleasen
verdaut und einer Agarosegelelektrophorese unterzogen. Die DNA wurde
nachfolgend auf einen Nytran (S & S)
Membranfilter geblottet und mit dem BglII-XbaI-DNA-Fragment von
1,3 kb sondiert, welches aus dem pSLexpPCR isoliert und mit 32P mit dem Megaprimesystem zur randomisierten
Markierung, geliefert von Amersham, markiert worden war. Eine Hybridisierung
mit der Sonde wurde bei einer mittleren Stringenz in einem Puffer,
welcher 30% Formamid, 5 × SSPE, 0,5%-SDS
enthielt, bei 38°C
durchgeführt.
Der Membranfilter wurde nachfolgend bei einer mittleren Stringenz in
2 × SSC,
0,1% SDS bei 55°C
gewaschen, bevor er einem Röntgenfilm
exponiert wurde. Die Ergebnisse zeigten an, daß die genomische Kopie des
Swollenin-Gens von T. reesei auf einem BglII-Fragment von etwa 4,5
kb sitzt oder auf einem XbaI-Fragment von etwa 5,5 kb.
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Mit
dem gegebenen, exemplarisch dargestellten Swollenin-Gen, wie vorausstehend
bereit gestellt, wäre
es Routine für
einen Fachmann, das Swollenin-Gen von Trichoderma reesei aus genomischer
DNA oder aus cDNA-Bibliotheken durch eine Kolonienhybridisierung
unter Verwendung des in pSLexpPCR eingefügten PCR-Fragmentes als einer
Sonde, zu klonieren.
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Beispiel 3
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Klonieren der genomischen
Kopie des Swollenins von T.REESEI und Expression davon in A. NIGER VAR.AWAMORI
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Die
genomische Kopie von Swollenin aus T. reesei wurde durch PCR kloniert.
Die Matrizen-DNA stammte
aus T. reesei RutC-30 (ATCC 56765) und die den 5'- und 3'-Enden der für Swollenin kodierenden Region
entsprechenden Primer wurden als GCI-PVS-055 (gcg cag atc tca gca
atg gct ggt aag ctt atc ctc g) und als GCI-PVS-056 (gcg ctc tag
atc aat tct ggc taa act gca cac c) bezeichnet.
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Das
durch eine PCR amplifizierte Fragment wurde mit BglII und XbaI verdaut
und in einen BglII-XbaI-geöffneten
pGAPT-PT kloniert, was in pGAPT-expC resultierte. Die Sequenzierung
des Inserts enthüllte,
daß die
chromosomale Kopie des Swollenin-Gens 5 Introns hat.
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Die
chromosomale Kopie des Swollenin-Gens (d. h. pGAPT-expC) wurde in
Aspergillus transformiert und die Transformanten wurden überprüft, wie
vorausstehend für
die cDNA beschrieben.
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Beispiel 4
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Verfahren zur Isolierung
von DNA-Sequenzen, welche Swollenin in Mikroorganismen kodieren
-
Das
allgemeine Verfahren in den Beispielen 2 und 3 kann angepaßt werden
in Verbindung mit bekannten Verfahren, um Klone zu erhalten, welche
Gene von Swollenin oder vom Swollenin-Typ aus anderen Pilzen und
Bakterien umfassen. Das Plasmid pSLexpPCR oder das isolierte DNA-Insert
von 1,3 kb, welches für
einen Teil des Swollenin-Gens kodiert (Beispiel 2) können markiert
werden, so wie es der Kernbereich des Swollenins (Beispiel 3) kann.
Diese DNA-Sonde kann dann verwendet werden, um mit genomischer DNA
oder mit cDNA von anderen Pilzen oder Bakterien zu hybridisieren.
Sequenzen, die für
Expansine von höheren
Pflanzen publiziert wurden, zeigen ein sehr hohes Ausmaß an Aminosäureidentität (siehe
z. B. 4, wo unterstrichene Segmente
die Bereiche hoher Homologie anzeigen). Ein Vergleich der abgeleiteten
Aminosäuresequenz
des Swollenins von Trichoderma mit den bekannten Aminosäuresequenzen
von Expansinen höherer Pflanzen
identifiziert bestimmte konservierte Regionen von Aminosäuren zwischen
den Swolleninen und den Expansinen von Pflanzen. Diese konservierten
Bereiche sorgen für
die Basis, degenerierte Primer zur Verwendung in einer PCR-Amplifikation
von DNA von anderen Mikroorganismen, welche für Swollenin kodiert, zu entwerfen.
Solche Verfahren sind im Fachbereich im allgemeinen bekannt und
werden als Routine betrachtet (siehe z. B. McPherson et al., PCR
A Practical Approach, S. 171–186
(1991)). Auf konservierte Bereiche, welche den Aminosäuren 192–200 und
366–371
der SEQ. ID Nr.: 2 entsprechen, wird verwiesen als in besonderer Weise
nützlich
für diesen
Zweck (siehe ebenfalls die hervorgehobenen Segmente der 2,
obwohl andere konservierte Bereiche verwendet werden können).
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Die
Sequenz an den Aminosäureresten
192–200
der SEQ. ID Nr.: 2 TSGGACGFG (SEQ. ID Nr.: 14) ist in einem hohen
Ausmaß homolog
zu der entsprechenden Sequenz in der Konsensussequenz von Expansin von
Pflanzen TMGGACGYG (SEQ. ID Nr.: 15) (nummerierte Positionen 19–27 in der 4). Auf diesem Homologiebereich basierend,
wäre es
möglich,
degenerierte Oligonukleotide zu synthetisieren, welche alle möglichen
DNA-Sequenzen umfassen, welche für
einen Teil oder das Gesamte der Aminosäuresequenz T(M/S)GGACG(Y/F)G
kodieren (siehe z. B. McPherson et al., supra S. 174).
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Die
Sequenz an den Aminosäureresten
366–371
der SEQ ID NO: 2, YRRVQC (SEQ. ID Nr.: 16) ist in hohem Maße homolog
zu der entsprechenden Sequenz in den Konsensussequenzen von Pflanzenexpansin YRRVPC
(SEQ ID Nr.: 17) und FRRVPC (SEQ ID NO: 18) (nummerierte Positionen
127–132
in der 4). Auf diesem Homologiebereich
basierend, wäre
es ebenfalls möglich
degenerierte Oligonukleotide zu synthetisieren, um alle möglichen
DNA-Sequenzen einzuschließen,
welche für
einen Teil oder das Gesamte der Aminosäuresequenz (F/Y)RRV(P/QC kodieren.
Die von dieser Aminosäuresequenz
abgeleiteten Oligonukleotide würden
in Verbindung mit denjenigen, die von den vorausstehend erwähnten Aminosäuresequenzen
stammen, als Primer für
PCR Routineexperimente unter Verwendung von genomischer DNA verwendet.
Genomische DNA oder cDNA könnte
dann leicht von jedwedem Mikroorganismus erhalten und als eine Matrize
in solchen PCR-Experimenten verwendet werden. Auf diese Weise wäre es möglich, Gene
zu klonieren, welche Swollenine von einer Vielfalt von Mikroorganismen
kodieren.
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Beispiel 5
-
Heterologes
Hybridisierungsverfahren zur Isolation von Swollenin kodierenden
Sequenzen aus anderen Mikroorganismen
-
Die
genomische DNA von verschiedenen Mikroorganismen wurde mit Hind3
verdaut und auf einem 1,0%-igen Agarosegel laufen gelassen. Das
Gel wurde depuriniert, denaturiert und geblottet und die Membran wurde,
wie auf der Seite 6 beschrieben, UV-kreuzvernetzt. Die Vorhybridisierung,
die Hybridisierung, das Markieren der Sonde und der Nachweis wurden
durchgeführt
unter Verwendung des DIG/GeniusTM Systems
von Boehringer Mannheim.
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Die
Sonde entsprach der Sequenz, welche für den Kernbereich des Swollenins
von T. reesei kodiert. Der originale cDNA Subklon (Beispiel 1) wurde
mit Nco1 und EcoR1 verdaut, was in einem DNA-Fragment von 312 bp,
bzw. Basenpaaren resultierte, welches mit DIG-dUTP (Dioxigenin-dUTP) über randomisiert
geprimtes Markieren gemäß den Anleitungen
des Herstellers (Boehringer Mannheim) führte.
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Die
Membran wurde vorhybridisiert und hybridisiert in 5 × SSC–0,1% N-Lauroylsarcosin-0,02% SDS–1% GeniusTM Blocking Reagenz bei 45°C. Der Hybridisierung
(über Nacht)
folgten zwei Mal Waschen während
10 min. in 6 × SSC
bei Raumtemperatur und zwei mal 5 min. Waschen in 6 × SSC bei
45°C. Der Nachweis
mit einem anti-DIG-alkalische-Phosphatase-Konjugat
und die Visualisierung mit einem Chemiluminiszenzsubstrat CSPD® wurden
durchgeführt
gemäß den Anleitungen
des Herstellers.
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Die
Ergebnisse von diesem Experiment zeigten an, daß mindestens die folgenden
Spezies zusätzlich zu
T. reesei mit der Sonde hybridisieren: Trichoderma koningii, Hypocrea
lenta und Hypocrea schweinitzii. In diesem Verdau mit Hind3 hatten
T. reesei und T koningii eine Bande von über 5 kb, welche mit dem Swollenin-Gen
von T. reesei hybridisierte. Bei H. schzweinitzii hatte die Bande,
welche hybridisierte, eine Größe von 3,7
kb und für
H. lenta etwa 3,3 kb. Dieses Verfahren und Variationen davon (verschiedene
Hybridisierungs- und Waschbedingungen) können verwendet werden, um Gene
von jedwedem Organismus nachzuweisen, welche für Swollenin kodieren.
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Beispiel 6
-
Herstellung eines Klons
von Saccharomyces cerevisiae zur Expression von Swollenin von T.
reesei
-
Während des
Verlaufs, die in dem Beispiel 1 erwähnte cDNA von Trichoderma reesei
zu erhalten, wurde ein Klon von Saccharomyces cerevisiae erhalten,
welcher ein Expressionsplasmid enthielt, in welchem die cDNA-Sequenz
der SEQ. ID Nr.: 1 eingefügt
war zwischen dem PGKI-Promotor von S. cerevisiae und der Terminator-Region
in dem Plasmid pAJ401 (Saloheimo et al., 1994, Molec. Microbiol.,
Bnd. 13, S. 219–228 (1994)),
gemäß dem von
Margolles-Clark et al., (Appl. Environ. Microbiol. 62: 3840–3846, 1996)
beschriebenen Verfahren. Kurz gesagt, wurde die cDNA von T. reesei
mit dem EcoRI-XhoI-geschnittenen Plasmid pAJ401 ligiert. Das Plasmid
pAJ401 wurde abgeleitet von dem Plasmid pFL60 (Minet und Lacroute,
Curr. Genet. Bnd. 18, S. 287–291
(1990) durch das Verändern
der zwei Klonierungsstellen EcoRI und XhoI, zwischen dem PGK-Promotor
und -Terminator von Hefe in der umgekehrten Orientierung unter Verwendung
spezifischer Linker. Die Transformation des E. coli Stammes JS4
durch Elektroporation (Bio-Rad) gemäß der Anleitung des Herstellers
ergibt eine Bibliothek von 1,3 × 106 unabhängigen
Klonen. Einer dieser Klone enthielt pAJ401 mit der cDNA mit der
SEQ. ID Nr.: 1 eingefügt
zwischen den EcoRI- und XhoI-Stellen und wurde nachfolgend in den
S. cerevisiae Stamm DBY746 transformiert. Ein zweiter Hefeklon wurde
erhalten, welcher pAJ401 ohne die cDNA-Sequenz der SEQ. ID Nr.:
1 enthielt, zur Verwendung als eine Kontrolle in den Beispielen
5 und 6.
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Die
zwei Hefeklone, ein Kontrollklon und ein Klon, welcher die cDNA-Sequenz
von T. reesei (longibrachiatum) Swollenin enthielt, wurden 2–3 Tage
lang in Fermentern kultiviert. Entweder wurden Chemap CMF mini 1
Liter- oder Biolafitte 14 l-Fermenter verwendet. Das Kulturmedium
war synthetisches Vollmedium ohne Uracil (Sherman 1991, Methods
Enzymol. 194, 3–21).
Der pH wurde auf 5,0 gehalten, die Belüftungsrate war 1 l/min für die kleineren
Fermenter und 8 l/min für
die größeren Fermenter,
und die Schüttelrate
war 300–600 U/min.
Auf die Fermentierung folgend, wurden die Zellen durch eine Zentrifugation
entfernt, und der Überstand wurde
50–100-fach
konzentriert.
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Beispiel
-
Expression der Swollenin
cDNA von T. reesei in Aspergillus niger var. awamori
-
Herstellung des Aspergillus-Expressionsvektors
-
Die
Konstruktion des Aspergillus-Expressionsvektors für die Expression
der Swollenin cDNA von T. reesei bestand aus drei Schritten: (1)
die PCR-Amplifizierung der Swollenin cDNA und deren Subklonierung
in pSP73-Hind3 (d. h. die HindIII Schnittstelle wurde eliminiert),
(2) das Austauschen des mittleren Teils des PCR abgeleiteten Swollenin-Gens
durch das ursprüngliche
Swollenin-Gen aus dem cDNA-Subklon, um Fehler, welche aus der PCR-Amplifizierung stammten,
zu eliminieren, (3) Subklonieren des Swollenin-Inserts in einen
Aspergillus-Expressionsvektor pGAPT-PT für die Expression unter dem
A. niger var. awamori glaA-Promotor (Glucoamylase).
-
1. PCR-Amplifizierung
der Swollenin cDNA
-
Die
Primer ExAspBgl2 (CATTAGATCTCAGCAATGGCTGGTAAGCTTATCCTC) und ExAspXbal (CGACTCTAGAAGGATTAGTTCTGGCTAAACTGCACACC)
wurden für
die Amplifizierung der kodierenden Region der cDNA von T. reesei
Swollenin durch PCR verwendet (Vektor aus dem Beispiel 1).
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ExAspBgl2
hat eine BglII Klonierungsschnittstelle, auf welche die 5 letzten
Nukleotide der glaA- (Glucoamylase) Promotorsequenz folgen, welche
der Translationsstartstelle (ATG) vorausgehen. Dem ATG in ExAspBgl2
folgt ein 19-mer, welches der Swollenin-Signalsequenz entspricht. ExAspXbal
hat eine XbaI Klonierungsstelle, ein STOP-Kodon und eine Sequenz,
welche für
die letzten 7 Kodons des Swollenin-Gens kodiert.
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Das
durch PCR amplifizierte Swollenin-Fragment von 1,5 kb wurde mit
BglII und XbaI verdaut und in den mit BglII-XbaI geöffneten
Vektor pSP73-Hind3 ligiert. Vor diesem Klonierungsschritt wurde
in pSP73 (Promega) zunächst
die HindIII Stelle deletiert. Dies wurde durchgeführt, indem
der Vektor (pSP73) mit HindIII geöffnet wurde und die vorstehenden
Enden mit T4-Polymerase (mit dNTPs) aufgefüllt wurden, bevor der Vektor zurückligiert
wurde. Dieser Vektor wurde als pSP73-Hind3 bezeichnet.
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pSP73-Hind3,
welcher das 1,5 kb Insert von Swollenin trug, wurde als pPCRAexp
bezeichnet.
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2. Ersetzen der durch
PCR amplifizierten Sequenz durch die Original-Sequenz
-
pPCRAexp
wurde mit HindIII und BstEII verdaut. HindIII schneidet die Swollenin
kodierende Sequenz innerhalb der Signalsequenz und BstEII ist nahe
am Ende der Swollenin kodierenden Sequenz. Das HindIII-BstEII Swollenin-Fragment
von 1,4 kb aus pPCRAexp wurde verworfen und durch das HindIII-BstEII
Swollenin-Fragment von 1,4 kb aus dem ursprünglichen Swollenin-cDNA Subklon
(Beispiel 1) ersetzt. Der resultierende Vektor wurde als pWTAexp
bezeichnet.
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3. Klonieren in den Expressionsvektor
-
pWTAexp
wurde mit BglII und XbaI verdaut, was zu einem 1,5 kb Swollenin-Insert
führte
mit einem vollständigen
kodierenden Bereich, dem 5 Nukleotide der glaA-Promotor-Sequenz
vorausgingen, und der durch Klonierungsstellen flankiert war, welche
eine Ligation zwischen dem glaA-Promotor und den Terminator-Sequenzen
in einem Aspergillus-Expressionsvektor pGAPT-PG (nachfolgend beschrieben)
ermöglichte. Das
Insert und die Vektorsequenzen wurden ligiert und der resultierende
Vektor wurde als pGAPT-exp (6,5 kb) bezeichnet. Dies ist der Vektor
für die
Expression der Swollenin cDNA von T. reesei in A. niger.
-
Der
Expressionsvektor pGAPT-PG (5,1 kb), der für die Konstruktion von pGAPT-exp
verwendet wurde, besteht aus einem SpeI-BglII Fragment von 1,1 kb
von einer glaA-Promotorsequenz
von A. niger var. awamori, einem 0,2 kb Fragment von der glaA-Terminatorsequenz
von A. niger und einem pyrG-Marker-Gen von 1,6 kb von A. nidulans
in dem pUC18 Rückgrat.
Das glaA-Terminator-Fragment folgt auf die glaA-Promotorsequenz und
ist von dieser durch multiple Klonierungsstellen getrennt, welche
für das
Einfügen
von Sequenzen, die exprimiert werden sollen, verwendet werden kann.
-
Das
3'-Ende der glaA-Promotorsequenz,
d. h. der Sequenz, welche der Translationsstartstelle des Swollenin-Gens
in pGAPT-exp vorausgeht, wurde konstruiert (multiple Klonierungsstellen)
und hat die folgende Sequenz, welche an einer XmnI Stelle in dem
glaA-Promotor startet:
in welchem das ATG am Ende
das Start-Kodon für
die Swollenin cDNA ist.
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Die
Umgebungssequenz des STOP-Kodons folgt (beginnend von dem „TAA"-Stop Kodon-konstruiert aus dem
ursprünglichen „TGA"-Stop-Kodon in Swollenin):
gezeigt bis zu der BstEII
Stelle (GGTGACC) in der glaA-Terminatorsequenz.
-
Transformation
von pGAPT-exp in Aspergillus
-
pGAPT-exp
wurde in den Stamm A. niger var. awamori dgr246p2 transferiert,
beschrieben in Ward et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 738–743 (1993).
Die Transformation von Aspergillus folgt dem selben grundsätzlichen
Verfahren wie für
Trichoderma auf den Seiten 13–15
beschrieben. Das Transformationsverfahren für A. niger var. awamori dgr246p2
wird ebenfalls beschrieben in Ward et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:
738–743
(1993).
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Die
Transformanten wurden auf ihre Fähigkeit
hin selektiert, auf Minimalmedium ohne Uridin zu wachsen. Die nicht
transformierten Zellen erfordern Uridin für das Wachstum.
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Überprüfen der
Transformanten
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Die
Aspergillus-Transformanten wurden in 50 ml Flüssigmedium in 250 ml Schüttlerflaschen
während 5–11 Tagen
kultiviert, wie in Ward et al., Bio/Technology 8: 435–440 (1990)
beschrieben. Das Komplexmedium enthielt 15% Maltose, um den glaA-Promotor
zu induzieren und dadurch die Expression des Swollenin-Gens voranzutreiben.
Die Kulturüberstände ließ man auf
SDS-PAGE-Gelen laufen. Aspergillus Transformanten, die das Swollenin
von T. reesei produzierten, hatten eine Bande, welche oberhalb von
der Marker Bande von 66 kDa lief, und diese Bande fehlte auf den
Spuren der Negativkontrolle (Aspergillus Stamm vor der Transformation)
(6).
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Beispiel 8
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Wirkung der
Behandlung mit Trichoderma reesei Swollenin auf die Cellulosestruktur
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Kreisförmige Whatman
Nr. 3 Filterpapiere wurden in Streifen geschnitten, welche 2 × 7 cm maßen. Der verwendete
Puffer war 50 mM Natriumacetat, pH 5. Die Filterpapierstreifen ließ man sich
mindestens 30 min. bei Raumtemperatur in Lösungen vollsaugen, welche aus
Wasser, Puffer, 8 M Harnstoff in Puffer oder Nährmedium, welches von Hefeklonen,
die das Swollenin-Gen von T. reesei enthielten, oder einem Kontrollhefeklon,
welcher kein Swollenin von T. reesei produziert, in Puffer (Verdünnungen
lagen in dem Bereich von 1 ml des Nährmediums in 7 ml Puffer bis
zu 4 ml des Nährmediums
in 4 ml Puffer).
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Ein
Thwing-Albert-Zugfester wurde auf eine Testgeschwindigkeit von 0,10
cm/min. gesetzt und die Zugarbeit über einen Bereich von 0 bis
50 Pfund (lbs) gemessen. Jeder Streifen des Filterpapiers wurde
zwischen den Klammern plaziert und die Spitzenlast wurde gemessen.
Die Ergebnisse dieses Experimentes quantifizieren das Ausmaß an Belastung,
welches gehalten werden kann bevor das Papier zerreißt. Zwei
oder drei Streifen wurden für
jeden Probentyp gemessen. Die Ergebnisse aus verschiedenen unterschiedlichen
Experimenten werden nachstehend in den Tabellen 1 und 2 gegeben.
-
-
-
Wie
erwartet, konnten die Streifen, welche mit 8 M Harnstoff behandelt
worden waren, von dem bekannt ist, daß es die Wasserstoffbindungswechselwirkungen
zerreißt,
keine so hohe Last halten, ohne zu brechen, wie die Streifen, welche
nur mit Puffer behandelt wurden. In beiden Experimenten haben die
Streifen, welche mit dem Swollenin-Nährmedium behandelt wurden,
eine signifikant niedrigere maximale Last (etwa 15%) als die Streifen,
welche mit dem Kontroll-Nährmedium
behandelt wurden. Der einzige Unterschied zwischen diesen beiden
Nährmedien
besteht darin, daß das
eine aus der Fermentation des Hefestammes, welcher das Swollenin-Gen
von T. reesei enthält,
stammt, während
der Kontrollstamm dieses Gen nicht enthält. Diese Ergebnisse zeigen,
daß es
eine Komponente in dem Swollenin-Nährmedium
gibt, welche Filterpapier schwächt.
-
Beispiel 9
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Behandlung
von Baumwollfasern mit Swollenin
-
Die
in dem Beispiel 4 vorausstehend beschriebenen Hefeklone wurden unter
den spezifisch angegebenen Bedingungen wachsen gelassen, und das
Fermentations-Nährmedium
wurde von fremdem Zellmaterial und Abfall getrennt. Ein Kontrollklon
von Hefe, welcher das Expressionsplasmid enthielt, aber ohne die
eingefügte,
für Swollenin
kodierende cDNA-Sequenz,
wurde ebenfalls unter den selben Bedingungen wachsen gelassen, und
das Fermentations-Nährmedium
wurde durch das Entfernen des fremden Zellmaterials und Abfalls isoliert.
Die Kulturüberstände von
zwei Fermentationen, wobei eine die mit dem Swollenin-Gen transformierte Hefe
enthielt und eine die Hefe als eine Kontrolle enthielt, welche ohne
das Swollenin-Gen transformiert worden war, wurden etwa 50-fach
konzentriert und wurden verwendet, um die Wirkungen des Inkubierens
von T. reesei Swollenin mit Baumwollfasern zu bestimmen. Die Wirkungen
der zwei Überstände wurden
weiter verglichen mit der Cellobiohydrolase I (CBHI) von T. reesei.
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Merzerisierte
Baumwollfasern wurden in Puffer suspendiert (50 mM Natriumacetat,
pH 5,0), welcher Überstand
von den Hefefermentationen (Verdünnung
1 : 4) und CBHI (Dosierung 5 μg/g)
enthielt. Nach einer Inkubation während 240 min. bei 25°C wurden
die suspendierten Fasern abfiltriert, und die Menge reduzierenden
Zuckers, der in die Filtrate freigesetzt worden war, wurde durch
das Verfahren von Sumner und Somers (1944) bestimmt. Die Fasern
wurden einmal mit Puffer gespült
und dann in destilliertem Wasser mit Glaskügelchen suspendiert vor einer
Ultrabeschallung während
einer Minute unter Verwendung eines Sondenspitzensonicators (probe
tip sonicator, Vibra Cell Sonics and Materials, Inc.). Die Fasern
wurden dann gefärbt
und mittels Lichtmikroskopie visualisiert, um grobe Wirkungen auf
ihre Struktur zu bestimmen. Das Filtrat der Kontrollbehandlung und
das Filtrat, welches von dem Hefestamm stammte, der das Swollenin-Gen
enthielt, zeigte keinerlei hydrolytische Aktivität, d. h. keine reduzierenden
Zucker wurden aus den Baumwollfasern freigesetzt. Im Gegensatz dazu
setzte CBHI alleine 0,08% reduzierende Zucker (vom ursprünglichen
Trockengewicht) frei. Vor der Beschallung konnte kein Unterschied
zwischen den Fasern, welche mit dem Überstand aus dem Kontrollhefestamm
gegenüber
den Fasern, welche mit dem Überstand
aus dem Hefestamm, welcher das Swollenin-Gen enthielt, unterschieden
werden. Nach der Beschallung jedoch waren gequollene und desorganisierte Bereiche
in den Fasern offensichtlich, welche mit dem Überstand von der Hefe, welche
das Swollenin-Gen enthielt, behandelt worden waren, die in den Fasern,
welche mit dem Überstand
behandelt worden waren, der aus dem Kontrollhefestamm erhalten worden
war, nicht vorhanden waren (5). CBHI
alleine verursachte ein leichtes Spleißen auf den Fasern aber keine
geöffneten
und gequollenen Bereiche wurden beobachtet, welches typische Effekte
für den Überstand
aus der Hefe waren, welche das Swollenin-Gen enthielt.