DE69107455T2 - Eine ein endoglucanase enzym enthaltende zellulasezubereitung. - Google Patents

Eine ein endoglucanase enzym enthaltende zellulasezubereitung.

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DE69107455T2
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Description

    Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Cellulase-Präparat, das eine einkomponentige Endoglucanase umfaßt, ein Detergens-Additiv, das das Cellulase-Präparat umfaßt, eine Detergens-Zusammensetzung, die das Cellulase-Präparat enthält, sowie Verfahren zur Behandlung von Cellulose enthaltenden textilen Werkstoffen mit dem Cellulase-Präparat.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Es ist dem Fachmann bekannt, daß das wiederholte Waschen von Baumwolle enthaltenden textilen Werkstoffen im allgemeinen eine ausgeprägte, unangenehm rauhe Beschaffenheit des textilen Werkstoffs hervorruft, und es sind auf diesem Fachgebiet bereits mehrere Verfahren vorgeschlagen worden, um dieses Problem zu überwinden. Zum Beispiel lehrt GB 1 368 599 (Unilever Ltd.) die Verwendung von cellulytischen Enzymen zur Verringerung der rauhen Beschaffenheit von Baumwolle enthaltenden textilen Werkstoffen. Außerdem lehrt US 4 435 307 (Novo Industri A/S) die Verwendung eines cellulytischen Enzyms, das aus Humicola insolens abgeleitet ist, sowie einer Fraktion davon, die als ACXI bezeichnet wird, als Detergens- Additiv zur Verringerung der rauhen Beschaffenheit. Weitere Anwendungen für cellulytische Enzyme, die im Stand der Technik genannt werden, beinhalten die Entfernung von Verschmutzungen von textilen Werkstoffen und die Farbklärung von textilen Werkstoffen (vgl. z. B. EP 220 016), die Bereitstellung einer erhöhten Wasserabsorption (JP-B-52-48236) und die Bereitstellung einer lokalisierten Farbvariation, um behandelten textilen Werkstoffen ein "stone-washed" Erscheinungsbild zu geben (EP 307 564). Cellulytische Enzyme können ferner in der Brauereiindustrie zum Abbau von β-Glucanen, in der Backwarenindustrie zur Verbesserung der Eigenschaften von Mehl, bei der Verarbeitung von Papierstoff zur Entfernung von nichtkristallinen Anteilen von Cellulose, wobei auf diese Weise der Anteil an kristalliner Cellulose im Papierstoff erhöht wird, und zur Verbesserung der Entwässerungseigenschaften von Papierstoff sowie in Tiernahrungsmitteln zur Verbesserung der Verdaubarkeit von Glucanen verwendet werden.
  • Die praktische Nutzung von cellulytischen Enzymen ist bis zu einem gewissen Maße durch die Beschaffenheit der bekannten Cellulase-Präparate beeinträchtigt worden, bei denen es sich oftmals um komplexe Gemische handelt. Es ist schwierig, die Herstellung von Multienzymsystemen zu optimieren, und daher ist es schwierig, eine großtechnische, kostengünstige Herstellung von cellulytischen Enzymen aufzubauen, und ihr tatsächlicher Einsatz ist durch Schwierigkeiten beschränkt worden, die sich aus der Notwendigkeit ergeben, recht große Mengen an cellulytischen Enzymen anzuwenden, um die gewünschte Wirkung auf cellulosehaltige textile Werkstoffe zu erzielen.
  • Die Nachteile der bisher vorgeschlagenen Cellulase-Präparate können überwunden werden, indem Präparate verwendet werden, die eine größere Menge an Endoglucanasen enthalten. Ein Cellulase-Präparat, das an Endoglucanase-Aktivität angereichert ist, wird in WO 89/00069 beschrieben.
    • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Es ist nun eine einzelne Endoglucanase-Komponente isoliert worden, die ein günstiges Aktivitätsniveau gegenüber Cellulose enthaltenden Materialien zeigt.
  • Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Cellulase-Präparat, das im wesentlichen aus einer homogenen Endoglucanase-Komponente besteht, die immunoreaktiv mit einem Antikörper ist, der gegen eine hochgereinigte, von Humicola insolens DSM 1800 abgeleitete 43 kD-Endoglucanase erzeugt wurde, oder die homolog zu der 43 kD-Endoglucanase ist.
  • Der Befund, daß diese spezielle Endoglucanase-Komponente von Cellulase vorteilhaft für die Behandlung von Cellulose enthaltenden Materialien ist, ist von beträchtlicher praktischer Bedeutung. Er erlaubt eine kostengünstige Herstellung der Cellulase, z. B. durch Einsatz rekombinanter DNA-Techniken zur Herstellung der aktiven Komponente, und macht eine tatsächliche wirksame Anwendung des Enzyms möglich, indem eine kleinere Menge des Cellulase-Präparats erforderlich ist, um die gewünschte Wirkung bei cellulosehaltigen Materialien hervorzurufen.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Bei dem erfindungsgemäßen Cellulase-Präparat handelt es sich vorteilhafterweise um ein Präparat, bei dem die Endoglucanase-Komponente eine CMC-Endoase-Aktivität von mindestens etwa 50 CMC-Endoase-Einheiten pro mg Gesamtprotein zeigt.
  • Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck "CMC-Endoase- Aktivität" auf die Endoglucanase-Aktivität der Endoglucanase-Komponente, ausgedrückt als ihre fähigkeit, Cellulose zu Glucose, Cellobiose und Triose abzubauen, wie sie durch eine Viskositätsabnahme einer Lösung von Carboxymethylcellulose (CMC) nach Inkubation mit dem erfindungsgemäßen Cellulase-Präparat, wie es nachstehend ausführlich beschrieben wird, bestimmt wird.
  • Die bevorzugten Cellulase-Präparate der Erfindung sind solche Präparate, in denen die Endoglucanase-Komponente eine CMC-Endoase-Aktivität von mindestens etwa 60 und insbesondere von mindestens etwa 90 CMC-Endoase-Einheiten pro mg Gesamtprotein zeigt. Insbesondere zeigt eine bevorzugte Endoglucanase-Komponente eine CMC-Endoase-Aktivität von mindestens 100 CMC-Endoase-Einheiten pro mg Gesamtprotein.
  • Die CMC-Endoase (Endoglucanase)-Aktivität kann aus der Viskositätsabnahme von CMC wie folgt bestimmt werden;
  • Es wird eine Substratlösung hergestellt, die 35 g/l CMC (Hercules 7 LFD) in 0,1 m Tris-Puffer bei pH-Wert 9,0 enthält. Die zu analysierende Enzymprobe wird im gleichen Puffer gelöst.
  • 10 ml Substrat lösung und 0,5 ml Enzymlösung werden gemischt und in ein Viskosimeter (z. B. Haake VT 181, NV-Sensor, 181 U/min), das bei 40 ºC thermostatisiert ist, übertragen.
  • Ablesungen der Viskosität erfolgen sobald wie möglich nach dem Mischen und erneut 30 Minuten später. Die Menge an Enzym, die die Viskosität auf die Hälfte unter diesen Bedingungen verringert, ist als eine Einheit an CMC-Endoase-Aktivität definiert.
  • SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) und isoelektrische Fokussierung mit Markerproteinen in einer dem Fachmann bekannten Weise wurden durchgeführt, um das Molekulargewicht bzw. den isoelektrischen Punkt (pI) der Endoglucanase-Komponente im erfindungsgemäßen Cellulase-Präparat zu bestimmen. Auf diese Weise wurde das Molekulargewicht einer spezifischen Endoglucanase-Komponente zu 43 kD bestimmt. Der isoelektrische Punkt dieser Endoglucanase wurde zu etwa 5,1 bestimmt. Die immunochemische Charakterisierung der Endoglucanase wurde im wesentlichen durchgeführt, wie es in WO 89/00069 beschrieben ist, wobei festgestellt wurde, daß die Endoglucanase immunoreaktiv mit einem Antikörper ist, der gegen eine hochgereinigte 43 kD-Endoglucanase aus Humicola insolens DSM 1800 erzeugt wurde. Die Cellobiohydrolase-Aktivität kann als die Aktivität gegenüber Cellobiose-p-nitrophenyl definiert werden. Die Aktivität wird als uMol Nitrophenyl, das pro Minute bei 37ºC und pH-Wert 7,0 freigesetzt wird, bestimmt. Es wurde festgestellt, daß die vorliegende Endoglucanase Komponente im wesentlichen keine Cellobiohydrolase Aktivität aufweist.
  • Die Endoglucanase-Komponente im erfindungsgemäßen Cellulase-Präparat wurde zunächst durch umfangreiche Reinigungsverfahren, die u. a. eine Umkehrphasen-HPLC-Reinigung eines rohen H. insolens-Cellulasegemisches gemäß US 4 435 307 beinhalteten, isoliert (vgl. nachstehendes Beispiel 1). Dieses Verfahren führte überraschenderweise zur Isolierung einer 43 kD Endoglucanase als einer einzelnen Komponente mit unerwartet günstigen Eigenschaften aufgrund einer überraschend hohen Endoglucanase-Aktivität.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Enzym, das Endoglucanase-Aktivität zeigt (nachstehend als ein "Endoglucanase-Enzym" bezeichnet), wobei das Enzym die Aminosäuresequenz, die in der beigefügten Sequenzliste ID#2 gezeigt ist, aufweist, oder ein Homologes davon ist, das Endoglucanase-Aktivität zeigt. Im vorliegenden Zusammenhang soll der Ausdruck "Homologes" ein Polypeptid bezeichnen, das von einer DNA codiert wird, die mit der gleichen Sonde wie die DNA, die für das Endoglucanase-Enzym mit dieser Aminosäuresequenz codiert, unter bestimmen festgelegten Bedingungen (wie vorheriges Tränken mit 5x SSC und Vorhybridisierung für 1 Stunde bei etwa 40ºC in einer Lösung von 20 % Formamid, 5x Denhardt-Lösung, 50 millimolar Natriumphosphat, pH-Wert: 6,8 und 50 ug denaturierter, beschallter Kalbsthymus-DNA, gefolgt von Hybridisierung in der gleichen Lösung, die mit 100 umolar ATP angereichert ist, für 18 Stunden bei ungefähr 40ºC) hybridisiert. Der Ausdruck soll Derivate der vorstehenden Sequenz umfassen, die durch Addition eines oder mehrerer Aminosäurereste am C- oder N-Terminus oder beiden Enden der nativen Aminosäuresequenz, durch Substitution eines oder mehrerer Aminosäurereste an einer oder mehreren Stellen der nativen Sequenz, durch Deletion eines oder mehrerer Aminosäurereste an einem oder beiden Enden der nativen Aminosäuresequenz oder an einer oder mehreren Stellen innerhalb der nativen Sequenz oder durch Insertion eines oder mehrerer Aminosäurereste an einer oder mehreren Stellen der nativen Sequenz erhalten wird.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Endoglucanase-Enzym kann es sich um ein Enzym handeln, das von Spezies von Humicola, wie Humicola insolens, z. B. Stamm DSM 1800, hinterlegt am 1. Oktober 1991 bei der Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg 1B, D-3300 Braunschweig, BRD, gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für Zwecke von Patentverfahren (der Budapester Vertrag), hergestellt werden kann.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Endoglucanase Enzym, das die Aminosäuresequenz aufweist, die in der bei gefügten Sequenzliste ID#4 gezeigt ist, oder ein Homologes davon (wie es vorstehend definiert wurde), das Endoglucanase-Aktivität zeigt. Bei dem Endoglucanase-Enzym kann es sich um ein Enzym handeln, das durch eine Spezies von Fusarium, wie Fusarium oxysporum, z. B. Stamm DSM 2672, hinterlegt am 6. Juni 1983 bei der Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg 1B, D-3300 Braunschweig, BRD, gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages, gebildet werden kann.
  • Ferner wird es in Betracht gezogen, daß homologe Endoglucanasen aus anderen Mikroorganismen, die cellulolytische Enzyme bilden, z. B. Spezies von Trichoderma, Myceliophthora, Phanerochaete, Schizophyllum, Penicillium, Aspergillus und Geotricum, abgeleitet werden können.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die für ein Endoglucanase-Enzym, wie es vorstehend definiert wurde, oder eine Vorläuferform des Enzyms codiert. Insbesondere weist das DNA-Konstrukt eine DNA-Sequenz auf, wie sie in den beigefügten Sequenzlisten ID#1 oder ID#3 gezeigt ist, oder eine Modifizierung davon. Beispiele für geeignete Modifizierungen der DNA-Sequenz sind Nucleotidsubstitutionen, die nicht zu einer anderen Aminosäuresequenz der Endoulucanase führen, die jedoch der Codonnutzung des Wirtsorganismus entsprechen, in den das DNA-Konstrukt eingeführt wird, oder Nucleotidsubstitutionen, die zu einer anderen Aminosäuresequenz führen und daher möglicherweise zu einer unterschiedlichen Proteinstruktur, was möglicherweise zu einer Endoglucanase-Mutante mit anderen Eigenschaften als das native Enzym führt. Weitere Beispiele für mögliche Modifizierungen sind die Insertion eines oder mehrerer Nucleotide in die Sequenz, die Addition eines oder mehrerer Nucleotide an einem Ende der Sequenz oder die Deletion eines oder mehrerer Nucleotide an einem Ende oder innerhalb der Sequenz.
  • Das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt, das für das Endoglucanase-Enzym codiert, kann synthetisch durch eingeführte Standardverfahren, z. B. das Phosphoamidit-Verfahren, das von S. L. Beaucage und M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters, Bd. 22 (1981), S. 1859-1869 beschrieben wird, oder das Verfahren, das von Matthes et al., EMBO Journal, Bd. 3 (1984), S. 801-805 beschrieben wird, hergestellt werden. Gemäß dem Phosphoamidit-Verfahren werden Oligonucleotide synthetisiert, und zwar z. B. in einem DNA-Syntheseautomaten, gereinigt, anelliert, ligiert und in geeignete Vektoren cloniert.
  • Ein DNA-Konstrukt, das fur das Endoglucanase-Enzym oder einen Vorlaufer davon codiert, kann z. B. isoliert werden, indem eine cDNA-Bibliothek oder genomische Bibliothek eines Cellulase-bildenden Mikroorganismus, wie Humicola insolens DSM 1800, aufgestellt wird und diese auf positive Clone nach herkömmlichen Verfahren, wie Hybridisierung unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die auf der Basis der vollständigen oder partiellen Aminosäuresequenz der Endoglucanase synthetisiert wurden, gemäß Standardtechniken abgesucht wird (vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor, 1989), oder indem Clone selektiert werden, die die entsprechende Enzymaktivität (d. h. CMC-Endoase-Aktivität, wie sie vorstehend definiert wurde) exprimieren, oder indem Clone selektiert werden, die ein Protein bilden, das reaktiv mit einem Antikörper gegen eine native Cellulase (Endoglucanase) ist.
  • Schließlich kann das DNA-Konstrukt einen gemischten synthetischen und genomischen, gemischten synthetischen und cDNA- oder gemischten genomischen und cDNA-Ursprung aufweisen, indem Fragmente synthetischen, genomischen oder cDNA-Ursprungs (was geeignet ist), wobei die Fragmente verschiedenen Teilen des gesamten DNA-Konstrukts entsprechen, gemäß Standardtechniken ligiert werden. Das DNA-Konstrukt kann auch durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung spezifischer Primer hergestellt werden, wie es z. B. in US 4 683 202 oder R. K. Saiki et al., Science, Bd. 239 (1988), S. 487-491 beschrieben ist.
  • Die Erfindung betrifft ferner einen rekombinanten Expressionsvektor, in den das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt inseriert ist. Dabei kann es sich um einen beliebigen Vektor handeln, der zweckmäßigerweise rekombinanten DNA-Verfahren unterworfen werden kann, und die Wahl des Vektors hängt oftmals von der Wirtszelle, in die er eingeführt werden soll, ab. Bei dem Vektor kann es sich also um einen sich autonom replizierenden Vektor handeln, d. h. einen Vektor, der als extrachromosomale Einheit existiert, wobei dessen Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, z. B. ein Plasmid. Alternativ dazu kann es sich bei dem Vektor um einen Vektor handeln, der beim Einführen in eine Wirtszelle in das Wirtszellgenom integriert wird und zusammen mit dem Chromosom/den Chromosomen, in das/die er integriert worden ist, repliziert wird.
  • In dem Vektor sollte die DNA-Sequenz, die für die Endoglucanase codiert, in Funktion mit einem geeigneten Promotor und einer geeigneten Terminatorsequenz verknüpft sein. Bei dem Promotor kann es sich um eine beliebige DNA-Sequenz handeln, die eine transkriptionale Aktivität in der gewählten Wirtszelle zeigt und die von Genen abgeleitet sein kann, die für Proteine codieren, die homolog oder heterolog in bezug auf die Wirtszelle sind. Die Verfahren, um die DNA-Sequenzen, die für die Endoglucanase, den Promotor und den Terminator codieren, zu ligieren und sie in geeignete Vektoren zu inserieren, sind dem fachmann bekannt (vgl. z. B. Sambrook et al., a.a.0.).
  • Die Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die mit dem DNA-Konstrukt oder dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformiert ist. Die Wirtszelle kann z. B. zu einer Spezies von Aspergillus, insbesondere Asperqillus oryzae oder Aspergillus niger, gehören. Pilzzellen können nach einem Verfahren transformiert werden, das die Protoplastenbildung und die Transformation der Protoplasten, gefolgt von einer Regeneration der Zellwand in einer als solchen bekannten Weise, beinhaltet. Die Verwendung von Aspergillus als Wirtsorganismus wird in EP 238 033 (Novo Industri A/S) beschrieben, deren Inhalt durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird. Die Wirtszelle kann auch eine Hefezelle, z. B. ein Stamm von Saccharomyces cerevisiae, sein.
  • Alternativ dazu kann es sich bei dem Wirtsorganismus um ein Bacterium handeln, insbesondere um Stämme von Streptomyces und Bacillus sowie E. coli. Die Transformation der bakteriellen Zellen kann gemäß herkömmlicher Verfahren erfolgen, wie es z. B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989 beschrieben wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Endoglucanase-Enzyms, wobei das Verfahren das Züchten einer Wirtszelle, wie sie vorstehend beschrieben wurde, in einem geeigneten Kulturmedium unter Bedingungen, die die Expression des Endoglucanase-Enzyms erlauben, und die Gewinnung des Endoglucanase-Enzyms aus der Kultur umfaßt. Bei dem zum Züchten der transformierten Wirtszellen verwendeten Medium kann es sich um ein beliebiges herkömmliches Medium handeln, das sich zum Züchten der fraglichen Wirtszellen eignet. Die exprimierte Endoglucanase kann zweckmäßigerweise in das Kulturmedium abgesondert und daraus nach bekannten Verfahren unter Einschluß der Abtrennung der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Ausfällen proteinartiger Komponenten aus dem Medium mittels eines Salzes, wie Ammoniumsulfat, gefolgt von chromatographischen Verfahren, wie Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder dergl., gewonnen werden.
  • Durch Anwendung rekombinanter DNA-Techniken, wie es vorstehend angegeben wurde, Techniken der Proteinreinigung, Techniken der Fermentation und Mutation oder anderer Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, ist es möglich, Endoglucanasen von hoher Reinheit bereitzustellen.
  • Das erfindungsgemäße Cellulase-Präparat oder Endoglucanase-Enzym kann zweckmäßigerweise zu Cellulose enthaltenden textilen Werkstoffen zusammen mit anderen Detergens-Materialien während des Einweichens, Waschens oder Spülens gegeben werden. Dementsprechend betrifft die Erfindung gemäß einem weiteren Aspekt ein Detergens-Additiv, das das erfindungsgemäße Cellulase-Präparat oder Endoglucanase-Enzym umfaßt. Das Detergens-Additiv kann zweckmäßigerweise in Form eines nicht-staubenden Granulats, einer stabilisierten Flüssigkeit oder eines geschützten Enzyms vorliegen. Nicht-staubende Granulate können z. B. gemäß US 4 106 991 und 4 661 452 (beide Novo Industri A/S) hergestellt werden, und sie können wahlweise nach Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, beschichtet werden. Flüssige Enzym-Präparate können z. B. durch Zugabe eines Polyols, wie Propylenglykol, eines Zuckers oder Zuckeralkohols, von Milchsäure oder Borsäure gemäß eingeführter Verfahren stabilisiert werden. Weitere Enzymstabilisatoren sind dem Fachmann bekannt. Geschützte Enzyme können gemäß dem in EP 238 216 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
  • Das Detergens-Additiv kann zweckmäßigerweise 1 bis 500, vorzugsweise 5 bis 250 und insbesondere 10 bis 100 mg Enzymprotein pro g Additiv enthalten. Es ist darauf hinzuweisen, daß das Detergens-Additiv ferner ein oder mehrere weitere Enzyme, wie eine Protease, Lipase, Peroxidase oder Amylase, die herkömmlicherweise Detergens-Additiven einverleibt werden, enthalten kann.
  • Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß eine erhöhte Lagerstabilität des Endoglucanase-Enzyms erzielt wird, wenn es sich bei der Protease um eine Protease handelt, die einen höheren Grad an Spezifität als Bacillus lentus-Serinprotease aufweist (für den vorliegenden Zweck ist eine Protease mit einem höheren Grad an Spezifität als B. lentus-Serinprotease eine Protease, die Humaninsulin zu weniger Komponenten als B. lentus-Serinprotease unter den folgenden Bedingungen abbaut: 0,5 ml einer 1 mg/ml-Lösung von Humaninsulin in B- und R-Puffer, pH-Wert: 9,5, wird mit 75 ul Enzymlösung von 0,6 CPU [vgl. Novo Nordisk Analysis Methods Nr. AF 228/1] pro 1 l für 120 Minuten bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wird mit 50 ul 1 n HCl abgebrochen). Beispiele für derartige Proteasen sind Subtilisin Novo oder Varianten davon (z. B. eine Variante, die in US 4 914 031 beschrieben wird), eine Protease, die aus Nocardia dassonvillei NRRL 18133 (beschrieben in WO 88/03947) abgeleitet werden kann, eine Serinprotease, die spezifisch für Glutaminsäure und Asparaginsäure ist und von Bacillus licheniformis gebildet werden kann (diese Protease wird ausführlich in der gleichzeitig anhängigen internationalen Patentanmeldung PCT/DK91/00067 beschrieben) oder eine Trypsin-ähnliche Protease, die durch Fusarium sp. DSM 2672 (diese Protease wird ausführlich in WO 89/06270 beschrieben) gebildet werden kann.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Detergens-Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße Cellulase-Präparat oder Endoglucanase-Enzym umfaßt.
  • Die erfindungsgemäßen Detergens-Zusammensetzungen umfassen zusätzlich oberflächenaktive Mittel, bei denen es sich um Mittel vom anionischen, nicht-ionischen, kationischen, amphoteren oder zwitterionischen Typ sowie um Gemische dieser Klassen von oberflächenaktiven Mitteln handeln kann. Typische Beispiele für anionische oberflächenaktive Mittel sind lineare Alkylbenzolsulfonate (LAS), α-Olefinsulfonate (AOS), Alkoholethoxysulfate (AES) und Alkalimetallsalze natürlicher Fettsäuren. Es wurde jedoch festgestellt, daß die Endoglucanase in Gegenwart von anionischen Detergentien weniger stabil ist, und daß sie andererseits in Gegenwart von nicht-ionischen Detergentien oder bestimmten polymeren Verbindungen, wie Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglykol oder Polyvinylalkohol, stabiler ist. Dementsprechend kann die Detergenszusammensetzung eine geringe Konzentration an anionischem Detergens und/oder eine bestimmte an nicht-ionischem Detergens oder stabilisierendem Polymerem, wie es vorstehend angegeben wurde, enthalten.
  • Die erfindungsgemäßen Detergens-Zusammensetzungen können bestimmte weitere Detergens-Bestandteile, die dem Fachmann bekannt sind, z. B. Gerüststoffe, Bleichmittel, Bleichaktivatoren, Korrosionsschutzmittel, Maskiermittel, Mittel gegen eine Wiederablagerung von Schmutz, Parfume, Enzymstabilisatoren und dergl., enthalten.
  • Die erfindungsgemäße Detergens-Zusammensetzung kann in einer beliebigen zweckmäßigen Form, z. B. als Pulver oder Flüssigkeit, formuliert werden. Das Enzym kann in einem flüssigen Detergens stabilisiert werden, indem Enzymstabilisatoren, wie sie vorstehend angegeben wurden, einverleibt werden. Üblicherweise beträgt der pH-Wert einer Lösung der erfindungsgemäßen Detergens-Zusammensetzung 7 bis 12 und in einigen Fällen 7,0 bis 10,5. Weitere Detergens-Enzyme, wie Proteasen, Lipasen oder Amylasen, können den erfindungsgemäßen Detergens-Zusammensetzungen entweder getrennt oder in einem kombinierten Additiv, wie es vorstehend beschrieben wurde, einverleibt werden.
  • Die Wirkungen hinsichtlich Weichmachung, Schmutzentfernung und Farbklärung, die mittels des erfindungsgemäßen Cellulase-Präparats erzielt werden können, erfordern im allgemeinen eine Konzentration der Cellulase-Zubereitung in der Waschlösung von 0,0001 bis 100, vorzugsweise 0,0005 bis 60 und insbesondere 0,01 bis 20 mg Enzymprotein pro Liter. Die erfindungsgemäße Detergens-Zusammensetzung wird typischerweise in Konzentrationen von 0,5 bis 20 g/l in der Waschlösung eingesetzt. Im allgemeinen ist es besonders zweckmäßig, sie als Detergens-Additiv in Mengen von 0,1 bis 5 % (Gew./Gew.) oder vorzugsweise in Mengen von 0,2 bis 2 % der Detergens-Zusammensetzung zuzugeben.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verringerung der Geschwindigkeit, mit der Cellulose enthaltende textile Werkstoffe rauh werden oder zur Verringerung der rauhen Beschaffenheit von Cellulose enthaltenden textilen Werkstoffen, wobei das Verfahren die Behandlung von Cellulose enthaltenden textilen Werkstoffen mit einem Cellulase-Präparat oder Endoglucanase-Enzym, wie es vorstehend beschrieben wurde, umfaßt. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren, das für eine Farbklärung von gefärbten, Cellulose enthaltenden textilen Werkstoffen sorgt, wobei das Verfahren die Behandlung der Cellulose enthaltenden textilen Werkstoffe mit einem Cellulase-Präparat oder einer Endoglucanase umfaßt, und ein Verfahren, um für eine lokalisierte Variation der Farbe von gefärbten, Cellulose enthaltenden textilen Werkstoffen zu sorgen, wobei das Verfahren die Behandlung der gefärbten, Cellulose enthaltenden textilen Werkstoffe mit einem erfindungsgemäßen Cellulase-Präparat oder einer erfindungsgemäßen Endoglucanase umfaßt. Die erfindungsgemäßen Verfahren können durch Behandlung von Cellulose enthaltenden textilen Werkstoffen während des Waschens ausgeführt werden. Gegebenenfalls kann die Behandlung der textilen Werkstoffe jedoch auch während des Einweichens oder Spülens oder einfach durch Zugabe des Cellulase-Präparats oder des Endoglucanase-Enzyms zu Wasser, in dem sich die textilen Werkstoffe befinden oder in das sie eingetaucht werden, ausgeführt werden.
  • Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß die Entwässerungseigenschaften von Papierstoff wesentlich durch Behandlung mit der erfindungsgemäßen Endoglucanase verbessert werden können, und zwar ohne irgendeinen wesentlichen gleichzeitigen Verlust an Festigkeit. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ferner ein Verfahren zur Verbesserung der Entwässerungseigenschaften von Papierstoff, wobei das Verfahren die Behandlung des Papierstoffs mit einem Cellulase-Präparat oder einem Endoglucanase- Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt. Beispiele für Faserbreie, die nach diesem Verfahren behandelt werden können, sind Faserbrei als Altpapier, Faserbrei aus einem Recycling unterworfener Pappe, Kraft-Faserbrei, Sulfit-Faserbrei oder thermomechanischer Faserbrei und andere ergiebige Faserbreie.
  • Die vorliegende Erfindung wird ausführlicher mit Bezug auf gegenwärtig bevorzugte Ausführungsformen in den nachstehenden Beispielen beschrieben, die den Schutzumfang der Erfindung in keiner Weise beschränken sollen.
    • Beispiele Beispiel 1 Isolierung einer 43 kD-Endoglucanase aus Huaicola insolens 1. Herstellung eines Kaninchen-Antikörpers, der reaktiv mit einer 43 kD-Endoglucanase ist, die durch Reinigung aus einem Humicola insolens-Cellulasegemisch erhalten wurde
  • Eine Cellulase wurde hergestellt, indem Humicola insolens DSM 1800 gezüchtet wurde, wie es US 4 435 307, Beispiel 6, beschrieben wird. Die rohe Cellulase wurde aus der Kulturbrühe durch Filtration über Kieselgur, Ultrafiltration und Gefriertrocknen des Retentats erhalten (vgl. Beispiele 1 und 6 von US 4 435 307).
  • Die rohe Cellulase wurde gereinigt, wie es in WO 89/09259 beschrieben ist, was zu einer Fraktion F1P1C2 führte, die für die Immunisierung von Mäusen verwendet wurde. Die Immunisierung wurde 5 mal in zweiwöchentlichen Intervallen jeweils unter Verwendung von 25 ug Protein unter Einschluß von Freund-Adjuvans durchgeführt.
  • Hybridomzellinien wurden erhalten, wie es in Ed Harlow und David Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, beschrieben ist. Das Verfahren kann kurz wie folgt beschrieben werden:
  • Nach der Blutentnahme aus den Mäusen und dem Nachweis, daß das Mäuseserum mit Proteinen, die in der F1P1C2-Fraktion vorhanden sind, reagiert, wurde die Milz entfernt und homogenisiert und anschließend mit PEG und Fox-River-Myelomzellen von Hyclone, Utah, USA, gemischt.
  • Die Hybridome wurden gemäß dem eingeführten HAT-Absuchverfahren selektiert.
  • Die erneut clonierten Hybridomzellinien wurden stabilisiert. Die Antikörper, die von diesen Zellinien hergestellt wurden, wurden im Hinblick auf ihre Zugehörigkeit zur IgG1-Unterklasse unter Verwendung eines handelsüblichen Reagenssatzes zur Typisierung von monoclonalen Mäuseantikörpern von Serotec, Oxford, England, abgesucht und selektiert. Positive Antikörper wurden anschließend auf Reaktivität mit F1P1C2 in einem herkömmlichen ELISA-Test untersucht, was zur Selektion von F4, F15 und F41 führte, da sie alle eine sehr gute ELISA-Reaktion zeigten, jedoch festgestellt wurde, daß sie eine unterschiedliche Reaktion beim Immunoblotten unter Verwendung von roher H. insolens-DSM 1800-Cellulase bei SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blot, zeigten, was darauf hinwies, daß sie verschiedene Epitope erkannten.
  • Die drei Antikörper wurden in großen Mengen in Ascites-Flüssigkeit von CRBF&sub1;-Mäusen hergestellt. Das Mäuse-Gammaglobulin wurde aus Ascites- Flüssigkeit durch Protein A-Reinigung unter Verwendung von Protein A, gekoppelt an Sepharose (Kem. En. Tek., Kopenhagen, Dänemark) gereinigt.
  • Die verschiedenen monoclonalen Gammaglobuline wurden auf ihre Reaktion in einem Sandwich-ELISA-Test unter Verwendung jedes monoclonalen Antikörpers als Einfangantikörper, verschiedener HPLC-fraktionen von Celluzym als Antigen und eines Kaninchen-Antikörpers, der gegen Endoglucanase B aus Celluzym erzeugt worden war, als Nachweisantikörper untersucht.
  • Um die Bindung im ELISA-Test sichtbar zu machen, wurde ein Schweine- Antikörper gegen Kaninchen-IgG, der kovalent an eine Peroxidase von Dakopatts (Kopenhagen, Dänemark) gekuppelt war, verwendet und mit OPD (1,2- Phenylendiamin-dihydrochlorid)/H&sub2;O&sub2; sichtbar gemacht.
  • Die stärkste Reaktion im ELISA-Test wurde mit dem monoclonalen Antikörper F41 erzielt, der daher in den Immunoaffinitäts-Reinigungsstufen verwendet wurde.
  • Das gereinigte Mäuse-Gammaglobulin F41 wurde an 43 g CNBr-aktivierte Sepharose 4B gekuppelt, wie es vom Hersteller (Pharmacia, Schweden) beschrieben wird, gefolgt von Waschen.
    • 2. Immunoaffinitäts-Reinigung der 43 kD-Endoglucanase aus einem H. insolens-Cellulasegemisch
  • Das H. insolens-Cellulasegemisch (wie vorstehend beschrieben) wurde auf 3 % Trockenmasse verdünnt, und der pH-Wert wurde auf 3,5 in 15 Minuten bei 4ºC eingestellt. Der Niederschlag wurde durch Filtration nach Einstellung des pH-Werts auf 7,5 entfernt. Anschließend wurde Natriumsulfat zugegeben, um das aktive Enzym auszufällen, und dies erfolgte bei 40ºC (260 g pro kg bei pH-Wert 5,5). Der Niederschlag wurde in Wasser gelöst und filtriert. Die Säurebehandlung wurde wiederholt. Schließlich wurde das Produkt filtriert und durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Polyvinylsulfonat-Membran mit einer Molekulargewichtsgrenze von 10 000 eingeengt.
  • Das Cellulase-Produkt wurde dann auf 3 % Trockenmasse verdünnt, und der pH-Wert wurde auf 9,0 eingestellt. Das Produkt wurde einer Anionenaustauschchromatographie über eine DEAE-Sepharose-Säule unterworfen, wie es vom Hersteller (Pharmacia, Schweden) empfohlen wird.
  • Das proteasefreie Cellulase-Produkt wurde auf eine F41-Gammaglobulin-gekuppelte Sepharose-Säule, die vorstehend beschrieben wurde, bei einem pH-Wert von 8,0 in den Natriumphosphatpuffer aufgetragen.
  • Nach dem Auftragen wurde die Säule mit dem gleichen Puffer mit einem Gehalt an 0,5 in Natriumchlorid gewaschen. Die Säule wurde dann mit 0,1 m Natriumacetatpuffer mit einem Gehalt an 0,5 m Natriumchlorid, pH-Wert: 4,5, gewaschen, und danach wurde die Säule mit 5 millimolar Natriumacetatpuffer, pH-Wert 4,5, gewaschen. Schließlich wurde die 43 kD-Endoglucanase mit 0,1 m Citronensäure eluiert.
  • Gesamtausbeute: 25 mg mit einer Endoglucanase-Aktivität von 1563 CMC-Endoase-Einheiten.
  • Das eluierte Protein wandert als eine Bande bei der SDS-PAGE mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 43 kD und einem pI-Wert nach isoelektrischer Fokussierung von etwa 5,0 bis 5,2.
  • Inaktives Protein wurde durch Umkehrphasenreinigung entfernt.
  • Inaktives und aktives Protein wurden durch HPLC unter Verwendung eines Gradienten von 2-Propanol getrennt. Inaktives Protein wird bei etwa 25 % 2-Propanol eluiert, und die aktive 43 kD-Endoglucanase wird bei 30 % 2-Propanol eluiert, wobei die aktive Endoglucanase durch eine CMC-Kongorot-Klärungszone nachweisbar ist.
  • Auf diese Weise wurden insgesamt 0,78 mg aktives Protein mit 122 CMC-Endoase-Einheiten gewonnen. Dieses Verfahren wurde 30 mal wiederholt.
  • Die 43 kD-Endoglucanase wurde gewonnen, indem sie zuerst zur Entfernung von TFA und Propanol gefriergetrocknet und dann in Phosphatpuffer gelöst wurde.
  • Die Endoglucanase-Aktivität des gereinigten Materials betrug 156 CMC-Endoase-Einheiten pro mg Protein, und die Gesamtausbeute unter Einschluß des Gefriertrockens betrug 65 5 der Endoglucanase-Aktivität
  • Das auf diese Weise erhaltene 43 kD-Enzym wurde zur Immunisierung von Kaninchen gemäß dem Verfahren, das von N. Axelsen et al. in: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23, beschrieben wird, verwendet. Gereinigte Immunglobuline wurden aus den Antiseren durch Ammoniumsulfatfällung und anschließende Dialyse und Ionenaustauschchromatographie über DEAE-Sephadex in an sich bekannter Weise gewonnen. Die Bindung von gereinigtem Immunglobulin an die Endoglucanase wurde bestimmt, und das Kaninchen-Immunglobulin AS 169 wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt.
    • 3. Charakterisierung der 43 kD-Endoglucanase
  • Aminosäurezusammensetzung: Unter Anwendung einer vollständigen Hydrolyse wurde die folgende Aminosäurezusammensetzung gemäß Aminosäureanalyse erhalten:
  • Asp 17
  • Asn 15
  • Thr 25
  • Ser 29
  • Glu 6
  • Gln 13
  • Pro 21
  • Gly 32
  • Ala 23
  • Cys 20
  • Val 14
  • Met 1
  • Ile 7
  • Leu 8
  • Tyr 6
  • Phe 15
  • Lys 9
  • His 2
  • Trp 9
  • Arg 12
  • Das Molekulargewicht des nicht-glycosylierten Proteins wurde zu 30 069 auf der Basis der Aminosäurezusammensetzung bestimmt. Die Glycosylierung wurde durch Messung zu
  • Galactose 10
  • Mannose 28 bestimmt, was einem Molekulargewicht von 6840 entspricht und zu einem gesamten Molekulargewicht der Endoglucanase von 36 900 (± 2400) führt. Der Extinktionskoeffizient pro Mol wurde wie folgt bestimmt:
  • Tryptophan 9 mal 5690
  • Tyrosin 6 mal 1280
  • Cystein 20 mal 120
  • Gesamt 61 290 pro Mol
  • Ein Extinktionskoeffizient von 1,66 bei 280 nm entspricht 1 mg Protein pro ml (Literatur: S. C. Gill und P. Hippel, Anal. Biochemistry, Bd. 182 (1989), S. 312-326).
  • Die Aminosäuresequenz wurde mit einem Applied Biosystems 475A Protein Sequenator unter Anwendung des Edman-Abbaus bestimmt. Nur eine Sequenz zeigte die Reinheit des Proteins. Die Aminosäuresequenz ist in der beigefügten Sequenzliste ID#2 gezeigt.
    • Enzymeigenschaften
  • Das Enzym ist zwischen pH-Wert 3 und 9,5 stabil.
  • Das Enzym baut nicht hochkristalline Cellulose oder das Substrat Cellobiose-β-p-nitrophenyl (Cellobiohydrolase-Substrat) ab, es baut jedoch amorphe Cellulose hauptsächlich zu Cellobiose, Cellotriose und Cellotetraose ab, was zeigt, daß das Enzym zur Herstellung von Cellodextrinen aus unlöslicher amorpher Cellulose verwendet werden kann.
  • Das Enzym ist aktiv zwischen pH-Wert 6,0 und 10,0 mit einer maximalen Aktivität bei etwa 50ºC.
    • Beispiel 2 Clonierung und Expression der 43 kD-Endoglucanase in Aspergillus oryzae Partielle cDNA
  • Eine cDNA-Bibliothek wurde aus mRNA des Stamms DSM 1800 von Humicola insolens (Kaplan et al., Biochem. J., Bd. 183 (1979), S. 181-184) gemäß dem Verfahren von Okayama und Berg (Mol. Cell. Biol., Bd. 2 (1982), S. 161-170) hergestellt. Diese Bibliothek wurde durch Hybridisierung mit radioaktiv markierten Oligonucleotiden an Filter mit immobilisierter DNA aus den Rekombinanten abgesucht (Gergen et al., Nucleic Acids Res., Bd. 7 (1979), S. 2115-2136). Die Oligonucleotidsonden wurden auf der Basis der Aminosäuresequenzen von tryptischen Fragmenten der gereinigten 43 kD-Endoglucanase hergestellt. Es wurde festgestellt, daß eine Kolonie an drei Sonden hybridisierte (NOR 1251, 2048 und 2050), und diese Kolonie wurde isoliert. Die Sequenz zeigte, daß die inserierte, 680 bp umfassende cDNA für die 181-C-terminalen Aminosäuren des 43 kD-Proteins und die 3'- nicht-translatierte mRNA codierte. Ein 237 bp langes Pvul-XhoI-fragment aus diesem Clon wurde zur Untersuchung eines Northern-Blots (wie es in Sambrook et al., a.a.O., S. 7.40-7.42 und S. 7.46-7.48 beschrieben wird) mit H. insolens-mRNA verwendet, und es wurde gezeigt, daß die gesamte 43 kD-mRNA eine Länge von ca. 1100 bp aufweist. Das gleiche 237 bp umfassende Fragment wurde zur Untersuchung einer genomischen Bibliothek aus dem gleichen Stamm verwendet.
    • Genomischer Clon
  • Eine genomische Bibliothek des Stamms DSM 1800 von Humicola insolens wurde aus der gesamten DNA hergestellt, die nach dem Verfahren von Yelton (M. M. Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81 (1984), S. 1470- 1474) gewonnen und partiell mit Sau 3A verdaut wurde. Fragmente, die größer als 4 kb waren, wurden aus einem Agarosegel isoliert und in pBR 322, das mit BamHI verdaut und dephosphoryliert worden war, ligiert. Die Ligationsprodukte wurden in E. coli MC1000 (Casadaban und Cohen, J. Mol. Biol., Bd. 138 (1980), S. 179-207) transformiert, die nach herkömmlichen Verfahren r&supmin;m&spplus; gemacht worden waren. 40 000 Rekombinanten wurden mit dem 237 bp umfassenden partiellen PvuI-XhoI-cDNA-Fragment, das im Abschnitt "Partielle cDNA" beschrieben wurde, abgesucht. Zwei Kolonien, die die gesamte 43 kD-Endoglucanase-Sequenz enthielten, wurden ausgewählt, und das Gen wurde nach dem Didesoxy-Verfahren unter Verwendung des Sequenase - Reagenssatzes (United States Biochemical Corporation) gemäß der Anleitung des Herstellers sequenziert. Die Sequenz war identisch zu der Sequenz des Vollängen-cDNA-Gens (vgl. den nachstehenden Abschnitt "Vollängen-cDNA"), mit Ausnahme eines Introns in dem genomischen Gen.
  • Das genomische Gen wurde nach dem PCR-Verfahren unter Verwendung eines Perkin-Elmer-Cetus DNA Amplification System gemäß der Anleitung des Herstellers amplifiziert. Für das 5'-Ende des Gens wurde der Primer NOR 2378 verwendet. Dieser Primer ist ein 25-mer, das zum 5'-nicht-translatierten Ende des Gens mit Ausnahme des Austausches eines C gegen T, was eine BclI-Stelle erzeugt, paßt. Für das 3'-Ende des Gens wurde der Primer in NOR 2389 verwendet. Dieser Primer ist ein 26-mer, von dem 21 Basen zum 3'-nicht-translatierten Teil des Gens passen, wobei 5 Basen am 5'-Ende des Primers eine SalI-Stelle komplettieren.
  • Der Aspergillus-Expressionsvektor pToC 68 wurde aus dem Plasmid p775 (dessen Konstruktion in EP 238 023 beschrieben wird) durch Insertion der folgenden Linker konstruiert:
  • Die Konstruktion von pToC ist in der beigefügten Fig. 1 gezeigt. Das vorstehend erhalten PCR-Fragment wurde mit BclI und SalI verdaut und in pToC 68, das mit BamHI und Xhol verdaut worden war, inseriert. Das Insert des erhaltenen Plasmids (pCaHj 109) wurde sequenziert, und es wurde gezeigt, daß es identisch zum ursprünglichen Clon war.
    • Vollängen-cDNA
  • Der erste cDNA-Strang wurde ausgehend von einem spezifischen Primer innerhalb der bekannten Sequenz (NOR 2153) synthetisiert, und die Synthese des zweiten Strangs erfolgte nach dem Verfahren, das von Gubler und Hoffman, Gene, Bd. 25 (1983), S. 263-269 beschrieben wurde. Die Sequenz des genomischen Gens ermöglichte es, einen PCR-Primer zu entwerfen, der den 5'-Teil der mRNA erfaßte und gleichzeitig eine BamHI-Stelle unmittelbar vor dem ATG-Startcodon einführte (NOR 2334). Unter Verwendung dieses Primers am 5'-Ende und erneut von NOR 2153 am 3'-Ende wurde die PCR für das doppelsträngige cDNA-Produkt durchgeführt. Der codierende Teil voller Länge der PCR-cDNA wurde dann durch Clonieren des 5'-BamHI-PvuI-Fragments aus der PCR-Reaktion zusammen mit dem 3'-PvuI-Eco 0109, aufgefüllt mit Klenow-Polymerase, um stumpfe Enden zu erzielen, in den mit BamHI-NruI geschnittenen Aspergillus-Expressionsvektor pToC 68 konstruiert (Fig. 1), und die Sequenz der inserierten DNA wurde überprüft (pSX 320) (vgl. Fig. 2). Die Sequenz der Vollängen-cDNA ist in der beigefügten Sequenzliste ID#1 gezeigt. Verwendete Oligonucleotid-Primer:
  • Nomenklatur:
  • Y: Pyrimidin (C+T)
  • R: Purin (A+G)
  • N: Alle vier Basen
  • Verstärkt: Veränderungen oder Insertionen, bezogen auf die ursprüngliche Sequenz.
  • Unterstrichen: Restriktionsstellen, die durch PCR eingeführt wurden.
    • Expression der 43 kD-Endoglucanase
  • Das Plasmid pSX 320 wurde in Asperqillus oryzae A1560-T40, ein Protease-Mangelderivat von A. oryzae IFO 4177, bei Selektion auf Acetamid durch Cotransformation mit pToC 90, das das amdS-Gen von A. nidulans als ein 2,7 kb umfassendes XbaI-Fragment (Corrick et al., Gene, Bd. 53 (1987), S. 63-71) auf einem pUC 19-Vektor (Vannisch-Perron et al., Gene, Bd. 33 (1985), S. 103-119) enthielt, transformiert. Die Transformation wurde durchgeführt, wie es in der veröffentlichten EP-Patentanmeldung 238 O&sub2;3 beschrieben ist. Eine Anzahl von Transformanten wurde dann auf Coexpression der 43 kD-Endoglucanase abgesucht. Transformanten wurden durch SDS-PAGE (S. 3) und CMC-Endoglucanase-Aktivität bewertet.
  • Das Plasmid, das das genomische Gen enthielt (pCaHj 109), wurde nach dem gleichen Verfahren in Aspergillus oryzae A1560-T40 transformiert. Die Bewertung der Transformanten zeigte, daß der Grad der Expression ähnlich zu dem der cDNA-Transformanten war.
  • Die gereinigte 43 kD-Endoglucanase wurde auf ihre N-terminale Sequenz und den Kohlenhydratgehalt analysiert. Es wurde gezeigt, daß die N- terminale Aminosäuresequenz identisch zu der der durch HPLC gereinigten 43 kD-Endoglucanase war. Der Kohlenhydratgehalt unterscheidet sich von dem den HPLC-gereinigten 43 kD-Enzyms, wobei das rekombinante Enzym 10 ± 8 Galactose-Zucker pro Mol anstelle von Glucose enthält.
    • Beispiel 3 Isolierung von genomischer DNA aus Fusarium oxysporum
  • Eine gefriergetrocknete Kultur von Fusarium oxysporum wurde mit Phosphatpuffer rekonstituiert, 5 mal auf jede von 5 FOX-Mediumplatten (6 % Hefeextrakt; 1,5 % K&sub2;HPO&sub4;; 0,75 % MgSO&sub4; 7H&sub2;O; 22,5 % Glucose; 1,5 % Agar; pH-Wert: 5,6) aufgetragen und bei 37ºC inkubiert. Nach 6 Tagen der Inkubation wurden die Kolonien von den Platten in 15 ml 0,001 % Tween-80 abgeschabt, was zu einer dicken und trüben Suspension führte.
  • Vier 1 l fassende Kolben, die jeweils 300 ml flüssiges FOX-Medium enthielten, wurden mit 2 ml der Sporensuspension angeimpft und bei 30ºC und 240 U/min inkubiert. Am 4. Tag der Inkubation wurden die Kulturen durch vier Schichten von steriler Gaze filtriert und mit sterilem Wasser gewaschen. Die Mycelien wurden auf Whatman-Filterpapier getrocknet, in flüssigem Stickstoff eingefroren, zu feinem Pulver in einem kalten Mörser zerkleinert und zu 75 ml frischem Lysepuffer (10 millimolar Tris-HCl, pH- Wert: 7,4; 1 % SDS; 50 millimolar EDTA; 100 ul DEPC) gegeben. Die gründlich gemischte Suspension wurde 1 Stunde in einem Wasserbad bei 65ºC inkubiert und anschließend 10 Minuten bei 4000 U/min und 5 ºC in einer Arbeitsplatz-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und mit EtOH gefällt. Nach 1 Stunde auf Eis wurde die Lösung 20 Minuten bei 19 000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und mit Isopropanol gefällt. Nach einer Zentrifugation für 10 Minuten bei 10 000 U/min wurde der Überstand dekantiert, und die Pellets ließ man trocknen.
  • 1 ml TER-Lösung (10 millimolar Tris-HCl, pH-Wert: 7,4; 1 millimolar EDTA 2000 100 ug RNAseA) wurden in jedes Röhrchen gegeben, und die Röhrchen wurden 2 Tage bei 4ºC gelagert. Der Inhalt der Röhrchen wurde dann vereinigt und 30 Minuten in ein Wasserbad bei 65ºC gegeben, um nicht-gelöste DNA zu suspendieren. Die Lösung wurde 2 mal mit Phenol/CHCl&sub3;/Isoamylalkohol und 2 mal mit CHCl&sub3;/Isoamylalkohol extrahiert und anschließend mit Ethanol gefällt. Man ließ das Pellet sich absetzen, und das EtOH wurde entfernt. 70 % EtOH wurden zugegeben, und die DNA wurde über Nacht bei -20ºC gelagert. Nach Dekantieren und Trocknen wurde 1 ml TER zugegeben, und die DNA wurde durch Inkubieren der Röhrchen fur 1 Stunde bei 65ºC gelöst. Die Praparation ergab 1,5 mg genomische DNA.
    • Clonierung der 43 kD-Endoglucanase aus Fusarium oxysporum
  • Um das Fusarium-Homologe der Humicola- 43 kD-Cellulase zu isolieren, wurde eine PCR-Reaktion durchgeführt (wie es in US 4 683 195 und US 4 683 202 beschrieben ist) und cloniert. Dieses Produkt wurde dann sequenziert, und Primer, die als Sonden für die Bibliothek und für die PCR- Amplifizierung verwendet werden sollten, wurden konstruiert. Diese Oligonucleotide wurden verwendet, um den entsprechenden Clon aus einer cDNA- Bibliothek zu isolieren.
  • Die PCR wurde verwendet, um cDNA partieller Länge und genomische Fragmente des 43 kD-Homologen zu isolieren. Sieben verschiedene Kombinationen von hochgradig degenerierten Oligonucleotiden (vgl. die nachstehende Tabelle) wurden bei den PCR-Reaktionen mit cDNA oder genomischer DNA als Matrizen verwendet. Nur eine Kombination ergab partielle Clone des Fusarium- 43 kD-Homologen. Zwei getrennte Sätze von PCR-Bedingungen wurden für jedes Oligonucleotidpaar gewählt; der erste Satz wurde festgelegt, um sehr wenig Produkt, jedoch mit sehr hoher Spezifität, zu erhalten. Verschiedene Faktoren stellten die Spezifität bei diesem Satz von 28 Zyklen sicher: Die Anellierungstemperatur von 65 ºC war sehr hoch für diese Oligonucleotide; die Zeit bei der Anellierungstemperatur wurde auf nur 30 Sekunden festgelegt; 20 Picomol jedes degenerierten Primergemisches wurden pro 100 ul Reaktionslösung verwendet. Die verwendeten Oligonucleotide enthielten nur eine degenerierte Region ohne ein "Clonierungselement"; eine Einheit Amplitaq -Polymerase (Perkin-Elmer-Cetus) wurde pro 100 ul Reaktionslösung verwendet; und EDTA wurde zu den Reaktionsröhrchen am Ende der abschließenden 10-minütigen Inkubation bei 72ºC gegeben, um eine Erweiterung von nicht-passenden Primern bei den Kühltemperaturen nach den PCR-Zyklen zu verhindern. Es war nicht zu erwarten, daß Produkte des ersten Satzes von Zyklen durch Ethidiumbromid-Anfärbung bei der Agarosegel-Elektrophorese sichtbar sein würden, und zwar aufgrund des niedrigen Wirkungsgrades der Amplifizierung, der zur Sicherstellung der hohen Spezifität erforderlich war. Der zweite Satz von Amplifikationen wurde jedoch durchgeführt, um die Produkte aus dem ersten Satz in wirksamer Weise zu amplifizieren. Faktoren, um dies sicherzustellen, umfassen: Verringerung der Anellierungstemperatur auf 55ºC; Verlängerung der Anellierungszeit auf 1 Minute; Erhöhung der Menge an Oligonucleotiden auf 100 Picomol jedes Gemisches pro 100 ul Reaktionslösung; Verwendung eines anderen Satzes von Oligonucleotiden, die ein "Prime"-Clonierungselement zusammen mit dem degenerierten Abschnitt umfassen (was die Schmelztemperatur dramatisch erhöht) und Verwendung von 2,5 Einheiten Amplitaq- Polymerase pro 100 ul Reaktionslösung.
  • Die PCR-Ansätze wurden durchgeführt, wie es von Perkin-Elmer-Cetus empfohlen wird. Ein Stammgemisch wurde für jede von zwei DNA-Quellen, nämlich genomische DNA und cDNA, angesetzt. Dies bestand aus 1x PCR-Puffer (10 millimolar Tris/HCl, pH-Wert: 8,3; 50 millimolar KCl; 1,5 millimolar MgCl&sub2;; 0,1 % Gelatine; Perkin-Elmer-Cetus), 0,2 millimolar Desoxynucleotiden (Ultrapure dNTP, 100 millimolare Lösung, Pharmacia), 1 Einheit Amplitaq -Polymerase (Perkin-Elmer-Cetus) und 0,5 ug genomische DNA oder 50 ng cDNA pro 100 ul Reaktionsgemischvolumen und entionisiertem Wasser, um das Volumen auf 98 ul pro 100 ul Reaktionslösung zu bringen. Zu markierten, 0,5 ml fassenden Röhrchen (Eppendorf) wurden 20 Picomol (1 ul bei einer Konzentration von 20 Picomol/ul) der einzelnen Oligonucleotidgemische (vgl. nachstehende Tabelle) gegeben. Diese wurden in einen Perkin-Elmer-Cetus-Temperaturwechsler bei 75ºC zusammen mit den Stammgemischen und leichtem Mineralöl (ebenfalls in den 0,5 ml fassenden Röhrchen) gegeben. 98 ul des entsprechenden Stammgemisches und 55 ul leichtes Mineralöl wurden in die einzelnen Röhrchen zusammen mit den Oligonucleotiden gegeben. Die Reaktionen wurden dann in einem "step-cycle file" gestartet (vgl. nachstehende Aufstellung für die Parameter). Am Ende der abschließenden Inkubation bei 72ºC wurden 50 ul einer 10 millimolaren EDTA-Lösung bei pH-Wert 8,0 zu jedem Röhrchen gegeben, und es erfolgte eine weitere 5-minütige Inkubation bei 72ºC. Tabelle von Oligonucleotidpaaren, die bei der PCR für das 43 kD- Homologe verwendet wurden: Reaktion cDNA genomisch Oligonucleotide für ersten Satz Oligonucleotide für zweiten Satz, degeneriert nur mit "Prime" erwartete Größe in degenerierten Basenpaaren Anmerkung. Vgl. die Oligonucleotid Tabelle fur Oligonucleotid Sequenzen
  • Die Bedingungen für die PCR im "step-cycle file" waren: Satz min sec
  • Nach dem ersten Satz von PCR-Zyklen wurde die DNA aus dem Reaktionsgemisch durch Fällung mit Isopropylalkohol zur Verwendung im zweiten Satz von Zyklen gereinigt. Der größte Teil des leichten Mineralöls wurde oben von jeder Probe vor der Überführung der Probe in ein neues markiertes Röhrchen entfernt. Jedes Röhrchen wurde dann mit einem gleichen Volumen an PCI (49 % Phenol: 40 % Chloroform: 2 % Isoamylalkohol) und dann mit einem gleichen Volumen an Chloroform extrahiert. DNA wurde aus den Reaktionslösungen durch Zugabe von 75 ul 7,5 in Ammoniumacetat, 1 ul Glycogen und 226 ul Isopropylalkohol gefällt. Die Pellets wurden in 20 ul entionisiertem Wasser resuspendiert. 2 ul jeder Suspension wurden in markierte Röhrchen für die zweite Runde der PCR-Amplifizierungen zusammen mit 100 Picomol (5 ul bei einer Konzentration von 20 Picomol/ul) jedes neuen Primergemisches (vgl. vorstehende Tabelle) gegeben. Das Stammgemisch wurde hergestellt, wie es vorstehend beschrieben wurde, mit der Ausnahme, daß genomische und cDNA-Matrizen weggelassen wurden und die erhöhten Oligonucleotid- und DNA-Volumina in den Reaktionsröhrchen durch Verringerung des Volumens an zugegebenem Wasser ausgeglichen wurden. Die Reaktionen und Zyklen wurden durchgeführt, wie es vorstehend beschrieben wurde (vgl. die vorstehende Tabelle).
  • Nachdem die 28 Zyklen abgeschlossen waren, wurde das leichte Mineralöl oben von den Proben entfernt, und die PCR-Gemische wurden in neue Röhrchen überführt. 10 ul jeder Probe wurden auf Parafilm aufgetragen und bei 45ºC für ungefähr 5 Minuten inkubiert, so daß das Volumen der Probe abnahm und der Parafilm restliches leichtes Mineralöl absorbierte. Die Tropfen wurden dann mit 2 ul 6x Aufgabefarbstoff vereinigt und einer Elektrophorese auf einem 1 %-igen Agarosegel (Seakem GTGR, FMC, Rockland, ME) unterworfen. Es wurde eine einzelne Bande von ungefähr 550 Basenpaaren im Reaktionsgemisch Nr. 2, wo die Matrize cDNA war, gefunden. Eine Bande von ungefähr 620 Basenpaaren wurde in Reaktionsgemisch Nr. 12 gefunden, wo die Matrize genomische DNA war. Bei diesen Reaktionen waren die Oligonucleotide ZC3486 und ZC3561 (Tabelle 1) Primer. Dies war sehr nahe zu dem 510 Basenpaar umfassenden PCR-Produkt, das durch den Vergleich mit der Humicola 43 kD-Sequenz vorhergesagt wurde. Die Synthese eines größeren Produkts bei der Reaktion mit der genomischen Matrize hat ihre Ursache im Vorhandensein eines Introns innerhalb dieser Region. Die Agarose, die diese beiden Banden enthielt, wurde ausgeschnitten, und DNA wurde unter Verwendung eines Prep-A-Gene -Reagenssatzes (BioRad) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. DNA wurde mit 50 ul entionisiertem Wasser eluiert und mit 5 ul 3 m Natriumacetat, 1 ul Glycogen und 140 ul Ethanol gefällt. Das DNA-Pellet wurde getrocknet und in einem Volumen von 7 ul TE (10 millimolar Tris-HCl, pH-Wert: 8,0; 1 millimolar EDTA) resuspendiert.
  • Die PCR-Fragmente wurden in den Vektor pBS sk-' cloniert, der konstruiert wurde, indem zuerst pBluescript II sk- (Stratagene, La Jolla, CA) mit EcoRI verdaut und das geschnittene Plasmid aus 0,8 % Seaplaque GTG -Agarose (FMC) mit einem Prep-A-Gene -Reagenssatz (BioRad) gemäß den Angaben des Herstellers gereinigt wurde. Die Oligonucleotide ZC1773 und ZC1774 (Tabelle 1) wurden durch Mischen von zwei Picomol jedes 0ligonucleotids, Erhöhung des Reaktionsvolumens auf 4 ul mit entionisiertem Wasser, anschließende Zugabe von 0,5 ul Anellierpuffer (200 millimolar Tris-HCl, pH-Wert: 7,6; 50 millimolar MgCl&sub2;), Erhöhung der Temperatur auf 65ºC für 30 Sekunden und langsames Abkühlen auf 20ºC in 20 Minuten in einem Perkin-Elmer-Cetus-PCR-Temperaturwechsler anelliert. Die Oligonucleotide wurden dann in den mit EcoRI verdauten pBluescript-Vektor durch Mischen von 5,5 ul entionisiertem Wasser, 2 ul anellierte Oligonucleotide, 1 ul einer Verdünnung des verdauten Vektors von 1:3 in entionisiertem Wasser, 1 ul 10x T4 DNA-Ligasepuffer (Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) und 0,5 T4-DNA-Ligase (Gibco-BRL) und Inkubieren des Gemisches bei 16ºC für 2,5 Stunden ligiert. Das Ligationsgemisch wurde anschließend auf ein Volumen von 100 ul mit entionisiertem Wasser gebracht und mit PCI und Chloroform extrahiert. Um den Elektroporations-Wirkungsgrad zu erhöhen, wurde die DNA dann mit 50 ul Ammoniumacetat, 1 ul Glycogen und 151 ul Isopropanol gefällt. 1 ul einer erneut hergestellten Suspension von 10 ul in entionisiertem Wasser wurden dann durch Elektroporation in E. coli DH10 B Elektromax Zellen (Gibco BRL) unter Anwendung der Anweisungen des Herstellers in einer Bio Rad Elektroporationsvorrichtung gebracht. Unmittelbar nach der Elektroporation wurde 1 ml 2x YT-Brühe (pro Liter: 16 g Trypton, 10 g Hefeextrakt, 10 g NaCl) in die Kuvette gegeben und gemischt. Verschiedene Verdunnungen wurden auf 100 mm LB Platten (pro Liter. 10 g Trypton, 8 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 14,5 g Agar) mit 100 ug/ml Ampicillin plattiert und mit 100 ul an 20 mg/ml X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid; Sigma, St. Louis, MO) in Dimethylformamid und 20 ul an 1 m IPTG (Sigma) überschichtet. Nach Wachstum über Nacht wurden verschiedene blaue und weiße Kolonien durch PCR auf kleine Inserts unter Verwendung der Oligonucleotide ZC3424 (reverser Bluescript-Primer) und ZC3425 (T7-Promotor-Primer) (Tabelle 1) analysiert, indem man den vorstehend angegebenen Bedingungen für das Absuchen von bakteriellen Plaques folgte. Nach einer anfänglichen Denaturierung bei 94ºC für 1 Minute 45 Sekunden wurden 30 Zyklen bei 94ºC für 45 Sekunden, 40ºC für 30 Sekunden und 72ºC für 1 Minute durchgeführt. Bei Agarosegel-Elektrophorese der PCR-Produkte wurde eine blaue Kolonie, die zu einer PCR-Bande führte, die konsistent mit einem kleinen Insert in der pBlusescript-Clonierungsregion war, für die DNA-Reinigung ausgewählt und über Nacht in einer 100 ml umfassenden flüssigen Kultur in TB (pro Liter: 12 g Trypton, 24 g Hefeextrakt, 4 ml Glycerin, Autoklave. Anschließende Zugabe von 100 ml 0,17 in KH&sub2;PO&sub4;, 0,72 in K&sub2;HPO&sub4;; Sambrook et al., Molecular Cloning, 2. Auflage, 1989, A.2) mit 150 ug/ml Ampicillin gezüchtet. DNA wurde durch alkalische Lyse und PEG-Fällung isoliert (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2. Auflage, 1.38-1.41, 1989). Die Sequenzanalyse zeigte, daß das korrekte Oligonucleotid inseriert war, während das β-Galactosidasegen, das in pBluescript-Vektoren vorhanden ist, im Rahmen mit dem Promotor blieb. 50 ug der DNA-Zubereitung wurde mit EcoRI verdaut, mit PCI und Chloroform extrahiert und mit Natriumacetat und Ethanol gefällt. Das DNA-Pellet wurde in 50 ul entionisiertem Wasser resuspendiert. Verdautes pBS sk-' wurde mit T4-DNA-Polymerase (Gibco-BRL) durch Zugabe von 50 ul 10x T4-DNA-Polymerase-Puffer (0,33 in Tris-Acetat; pH-Wert: 8,0; 0,66 in Kaliumacetat; 0,1 in Magnesiumacetat; 5 millimolar Dithiothreit; 5 millimolar BSA (New England Biolabs); 260 ul entionisiertes Wasser, 40 ul 1 millimolar dTTP (Ultrapure , Pharmacia) und 40 ul T4-DNA-Polymerase (1 U/ul) (Gibco-BRL) zu 20 ul an 1 mg/ml Vektor-DNA zuruckgeschnitten. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei 12ºC und anschließend 10 Minuten bei 75ºC inkubiert. Um die DNA für die Verwendung bei Ligation herzustellen, erfolgte eine Extraktion mit PCI und Chloroform und eine Fallung mit Natriumacetat und Ethanol. Das Pellet wurde in 200 ul entionisiertem Wasser resus pendiert, was zu einer Konzentration von 0,1 ug/ul führte.
  • Um die PCR Produkte des 43 kD Homologen fur die Insertion in den zu rückgeschnittenen Vektor pBS sk-' vorzubereiten, wurden sie mit T4-DNA- Polymerase (Gibco-BRL) in Reaktionsvolumina von 10 ul unter Einschluß von dATP anstelle von dTTP zurückgeschnitten. Die erhaltenen DNA-Lösungen wurden mit PCI und Chloroform extrahiert und mit Natriumacetat, Glycogen und Ethanol gefällt. Die DNA-Pellets wurden in 15 ul entionisiertem Wasser resuspendiert. DNA-Proben von 7,5 ul wurden in 0,1 ug geschnittenes pBS sk-' (0,1 ug/ul) mit 1 ul 10x Ligasepuffer (Boehringer Mannheim) und 0,5 ul T4-DNA-Ligase (Boehringer-Mannheim) ligiert. Die Ligationsgemische wurden dann auf ein Volumen von 150 ul mit entionisiertem Wasser gebracht und mit PCI und Chloroform extrahiert. Um den Elektroporations-Wirkungsgrad zu erhöhen, wurde die DNA dann mit 15 ul Natriumacetat, 1 ul Glycogen und 166 ul Isopropanol gefällt. 1 ul einer 10 ul Suspension in entionisiertem Wasser wurde durch Elektroporation in E. coli DH10-B-Elektromax-Zellen (BRL) unter Verwendung einer Bio-Rad-Elektroporationsvorrichtung gemäß den Anweisungen des Herstellers gebracht. Unmittelbar nach der Elektroporation wurde 1 ml SOB-Brühe (pro Liter: 20 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 ml 1 in NaCl, 2,5 ml 1 m KCl. Autoklavieren, dann Zugabe von 10 ml 1 in MgCl&sub2; und 10 ml 1 m MgSO&sub4;) in die Küvette gegeben, und das Zellgemisch wurde in ein 100 mm-Röhrchen überführt und 1 Stunde bei 37ºC unter Belüftung inkubiert. Verschiedene Verdünnungen wurden auf 100 mm-LB-Platten mit einem Gehalt an 100 ug/ml Ampicillin plattiert und mit 100 ul 20 mg/ml X-Gal (Sigma) in Dimethylformamid und 20 ul 1 m IPTG (Sigma) überschichtet. Drei weiße Kolonien jeder der beiden Transformationen (cDNA und genomisch) wurden zum Sequenzieren aufgenommen. Die Sequenzanalyse zeigte, daß die Inserts hochgradig homolog zur Humicola 43-kD-Cellulase waren. Das genomische Insert war identisch zur cDNA mit Ausnahme des Vorhandenseins eines Introns. Zwei 42-mere Oligonucleotide ZC3709 und ZC3710 (Tabelle 1) wurden aus der Sequenz für die Verwendung als Bibliothekssonden und PCR-Primer entworfen. Die Oligonucleotide stammten von entgegengesetzten Enden des PCR-Produkts und wurden so entworfen, daß sie mit entgegengesetzten Strangen der DNA hybridisierten, so daß sie als Primer in einer PCR Reaktion zur Untersuchung moglicher Clone beim Absu chen der Bibliothek verwendet werden konnten.
    • Konstruktion einer cDNA-Bibliothek von Fusarium oxysporum
  • Fusarium oxysporum wurde durch Fermentation gezuchtet, und Proben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten zur RNA-Extraktion und Cellulase-Aktivitäts Analyse entnommen. Die Aktivitats Analyse umfaßte einen Assay auf die gesamte Cellulase-Aktivitat sowie einen Assay auf die Farbklarung. Aus Proben von Fusarium oxysporum, die eine maximale Farbklärung zeigten, wurde die gesamte RNA extrahiert, woraus Poly(A)+RNA isoliert wurde.
  • Um eine cDNA-Bibliothek von Fusarium oxysporum aufzustellen, wurde ein Erststrang-cDNA in zwei Reaktionen synthetisiert, und zwar einer mit radioaktiv markiertem dATP und einer ohne radioaktiv markiertes dATP. Ein 2,5x Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur durch Mischen der nachstehenden Reagentien in der angegebenen Reihenfolge hergestellt: 10 ul 5x reverse Transkriptase-Puffer (Gibco-BRL, Gaithersburg, Maryland), 2,5 ul 200 millimolar Dithiothreit (frisch hergestellt oder aus einer bei -70ºC gelagerten Stammlösung) und 2,5 ul eines Gemisches, das 10 millimolar jedes Desoxynucleotidtriphosphats (dATP, dGTP, dTTP und 5-Methyl-dCTP, bezogen von Pharmacia LKB Biotechnology, Alameda, CA) enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde auf zwei Röhrchen von 7,5 ul aufgeteilt. 1,3 ul an 10 uCi/ul ³²P-α-dATP (Amersham, Arlington Heights, IL) wurden zu einem Röhrchen gegeben, und 1,3 ul Wasser zum anderen. 7 ul jedes Gemisches wurden in Röhrchen für die endgültige Reaktion gegeben. In einem getrennten Röhrchen wurden 5 ug Fusarium oxysporum-Poly(A)&spplus; RNA in 14 ul an 5 millimolar Tris-HCl, pH-Wert: 7,4, 50 umolar EDTA mit 2 ul an 1 ug/ul Erststrangprimer (ZC2938 GACAGAGCACAGAATTCACTAGTGAGCTCT&sub1;&sub5;) gemischt. Das RNA- Primer-Gemisch wurde 4 Minuten auf 65ºC erwärmt, in Eiswasser abgekühlt und kurz in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. 8 ul des RNA-Primer-Gemisches wurden in die Röhrchen für die endgültige Reaktion gegeben. 5 ul an 200 U/ul reverse Transkriptase Superscript (Gibco-BRL) wurden in jedes Röhrchen gegeben. Nach leichtem Schütteln wurden die Röhrchen 30 Minuten bei 45ºC inkubiert. 8 ul an 10 millimolar Tris-HCl, pH-Wert: 7,4, 1 millimolar EDTA wurden in jedes Röhrchen gegeben, und die Proben wurden einer Vortex-Behandlung unterzogen und kurz zentrifugiert. 3 ul wurden aus jedem Röhrchen entnommen, um die Zählrate, die durch TCA-Fällung einverleibt wurde, und die gesamten Zählraten der Reaktionslösungen zu bestimmen. Eine Probe von 2 ul aus jedem Röhren wurde durch Gelelektrophorese analysiert. Der Rest jeder Probe wurde mit Ethanol in Gegenwart von Austerglycogen gefällt. Die Nucleinsäuren wurden durch Zentrifugation pelletiert, und die Pellets wurden mit 80 % Ethanol gewaschen. Anschließend an das Waschen mit Ethanol wurden die Proben 10 Minuten an der Luft getrocknet. Die Synthese des ersten Strangs ergab 1,6 ug an Fusarium oxysporum-cDNA, eine 33 %-ige Umsetzung von Poly(A)+RNA in DNA.
  • Die Synthese des zweiten cDNA-Strangs wurde mit dem RNA-DNA-Hybrid aus den Reaktionen fur den ersten Strang unter Bedingungen durchgeführt, die die Nutzung des ersten Strangs als Primer für die Synthese des zweiten Strangs unter Bildung von Haarnadel-DNA förderten. Die Erststrangprodukte aus jeder der beiden Erststrangreaktionen wurden in 71 ul Wasser resuspendiert. Die nachstehenden Reagentien wurden bei Raumtemperatur zu den Reaktionsröhrchen gegeben: 20 ul an 5x Zweitstrangpuffer (100 millimolar Tris, pH-Wert: 7,4; 450 millimolar KCl; 23 millimolar MgCl&sub2; und 50 millimolar (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;), 3 ul an 5 millimolar β-NAD und ul eines Desoxynucleotidtriphosphat-Gemisches mit jedem bei 10 millimolar. 1 ul an α³²P- dATP wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben, bei dem nicht-markiertes dATP für die Synthese des ersten Strangs eingesetzt wurde, während in das Röhrchen, bei dem markiertes dATP für die Synthese des ersten Strangs eingesetzt worden war, 1 ul Wasser gegeben wurde. In jedes Röhrchen wurden dann 0,6 ul an 7 U/ul E. coli-DNA-Ligase (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN), 3,1 ul an 8 U/ul E. coli-DNA-Polymerase I (Amersham) und 1 ul an 2 U/ul RNase H (Gibco-BRL) gegeben. Die Reaktionslösungen wurden 2 Stunden bei 16ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden 2 ul aus jeder Reaktionslösung verwendet, um die mit TCA ausfällbaren Zählraten und die Gesamtzählraten der Reaktionslösungen zu bestimmen, und 2 ul aus jeder Reaktionslösung wurden durch Gelelektrophorese analysiert. Zum Rest jeder Probe wurden 2 ul an 2,5 ug/pl Austerglycogen, 5 ul an 0,5 EDTA und 200 ul an 10 millimolar Tris-HCl, pH-Wert: 7,4, 1 millimolar EDTA gegeben. Die Proben wurden mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Isopropanol gefällt. Nach Zentrifugation wurden die Pellets mit 100 ul 80 % Ethanol gewaschen und an der Luft getrocknet. Die Ausbeute an doppelsträngiger cDNA betrug bei jeder der Reaktionen ungefähr 2,5 ug.
  • Eine Behandlung mit Mungobohnen-Nuclease wurde durchgeführt, um die einzelsträngige DNA der Haarnadel zu schneiden. Jedes cDNA-Pellet wurde in 15 ul Wasser resuspendiert, und 2,5 ul an 10x Mungobohnen-Puffer (0,3 m NaAc, pH-Wert: 4,6; 3 m NaCl und 10 millimolar ZnSO&sub4;), 2,5 ul an 10 millimolar DTT, 2,5 ul an 50 % Glycerin und 2,5 ul an 10 U/ul Mungobohnen-Nuclease (New England Biolabs, Beverly, MA) wurden in jedes Röhrchen gegeben. Die Reaktionslosungen wurden 30 Minuten bei 30ºC inkubiert, und 75 ul an 10 millimolar Tris-HCl, pH-Wert: 7,4 und 1 millimolar EDTA wurden in jedes Rohrchen gegeben. Anteile von 2 ul wurden durch alkalische Agarosegelanalyse analysiert. 100 ul an 1 m Tris-HCl, pH-Wert. 7,4 wurden in jedes Röhrchen gegeben, und die Proben wurden 2 mal mit Phenol-Chloroform extrahiert.Die DNA wurde mit Isopropanol gefällt und durch Zentrifugation pelletiert. Nach der Zentrifugation wurde das DNA-Pellet mit 80 % Ethanol gewaschen und an der Luft getrocknet. Die Ausbeute betrug etwa 2 ug an DNA für jede der beiden Reaktionen.
  • Die cDNA-Enden wurden durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase stumpf gemacht. DNA aus beiden Proben wurde nach erneutem Suspendieren in einem Gesamtvolumen von 24 ul Wasser kombiniert. 4 ul an 10x T4-Puffer (330 millimolar Tris-Acetat, pH-Wert: 7,9; 670 millimolar KAc; 100 millimolar MgAc und 1 mg/ml Gelatine), 4 ul 1 millimolar dNTP, 4 ul 50 millimolar DTT und 4 ul an 1 U/ul T4-DNA-Polymerase (Boehringer-Mannheim) wurden zu der DNA gegeben. Die Proben wurden 1 Stunde bei 15ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden 160 ul an 10 millimolar Tris-HCl, pH-Wert: 7,4, 1 millimolar EDTA zugegeben, und die Probe wurde mit Phenol-Chloroform extrahiert. Die DNA wurde mit Isopropanol gefällt und durch Zentrifugation pelletiert. Nach der Zentrifugation wurde die DNA mit 80 % Ethanol gewaschen und an der Luft getrocknet.
  • Nach dem erneuten Suspendieren der DNA in 6,5 ul Wasser wurden EcoRI-Adapter an die stumpf gemachte DNA addiert. 1 ul an 1 ug/ul EcoRI- Adapter (Invitrogen, San Diego, CA, Kat. Nr. N409-20), 1 ul an 10x Ligasepuffer (0,5 m Tris, pH-Wert: 7,8 und 50 millimolar MgCl&sub2;), 0,5 ul an 10 millimolar ATP, 0,5 ul an 100 millimolar DTT und 1 ul an 1 U/ul T4- DNA-Ligase (Boehringer-Mannheim) wurden zu der DNA gegeben. Nachdem die Probe über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert worden war, wurde die Ligase durch Erwärmen auf 65ºC für 15 Minuten denaturiert.
  • Die SstI-Clonierungsstelle, die vom Erststrangprimer codiert wurde, wurde einem Verdau mit der SstI-Endonuclease ausgesetzt. 33 ul Wasser, 5 ul an 10x SstI-Puffer (0,5 in Tris, pH-Wert: 8,0; 0,1 m MgCl&sub2; und 0,5 m NaCl) und 2 ul an 5 U/ul SstI wurden zu der DNA gegeben, und die Proben wurden 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. 150 ul an 10 millimolar Tris-HCl, pH-Wert: 7,4, 1 millimolar EDTA wurden zugegeben, und die Proben wurden mit Phenol-Chloroform extrahiert, und die DNA wurde mit Isopropanol gefällt.
  • Die cDNA wurde einer Chromatographie über eine Sepharose CL 2B-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology) zur Größenselektion der cDNA und zur Entfernung freier Adapter unterworfen. Eine Säule von 1,1 ml mit Sepharose CL 2B wurde in eine 1 ml Kunststoff-Wegwerfpipette gegossen, und die Säule wurde mit 50 Säulenvolumina an Puffer (10 millimolar Tris, pH-Wert: 7,4 und 1 millimolar EDTA) gewaschen. Die Probe wurde aufgetragen, Fraktionen von 1 Tropfen wurden gesammelt, und die DNA in dem Hohlraumvolumen wurde vereinigt. Die fraktionierte DNA wurde mit Isopropanol gefällt. Nach Zentrifugation wurde die DNA mit 80 % Ethanol gewaschen und an der Luft getrocknet.
  • Eine cDNA-Bibliothek von Fusarium oxysporum wurde aufgestellt, indem die cDNA an den Vektor pYcDE8' (vgl. W0 90/10698) ligiert wurde, der mit EcoRI und SstI verdaut worden war. 390 ng Vektor wurden an 400 ng cDNA in 80 ul Ligationsreaktionslösung mit einem Gehalt an 8 ul 10x Ligasepuffer, 4 ul millimolar ATP, 4 ul 200 millimolar DTT und 1 Einheit T4-DNA-Ligase (Boehringer-Mannheim) ligiert. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur wurden 5 ug Austerglycogen und 120 ul an 10 millimolar Tris-HCl und 1 millimolar EDTA zugegeben, und die Probe wurde mit Phenol-Chloroform extrahiert. Die DNA wurde mit Ethanol gefällt und zentrifugiert, und das DNA-Pellet wurde mit 80 % Ethanol gewaschen. Nach Trocknen an der Luft wurde die DNA in 3 ul Wasser resuspendiert. 38 ul Elektroporations-kompetente DH10B-Zellen (Gibco-BRL) wurden zu der DNA gegeben, und die Elektroporation wurde mit einem Bio-Rad Gene Pulser (Modell #1652076) und Bio-Rad Pulse Controller (Modell #1652098) in einer Elektroporationseinheit (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) abgeschlossen. 4 ml SOC (Hanahan, J. Mol. Biol., Bd. 166 (1983), S. 557-580) wurden zu den der Elektroporation unterzogenen Zellen gegeben, und 400 ul der Zellsuspension wurden auf jeder von 10 150 mm-LB-Ampicillin-Platten ausgestrichen. Nach einer Inkubation über Nacht wurden 10 ml LB-amp-Medium zu jeder Platte gegeben, und die Zellen wurden in das Medium abgeschabt. Glycerin-Stammlösungen und Plasmidzubereitungen wurden von jeder Platte hergestellt. Es wurde festgestellt, daß der Bibliothekshintergrund (Vektor ohne Insert) ungefähr 1 % betrug, und zwar durch Ligation des Vektors ohne Insert und Titrieren der Anzahl der Clone nach der Elektroporation.
  • Um Vollängen-cDNA-Clone des 43 kD-Homologen zu isolieren, wurde eine Bibliothek von 1,1 Millionen Clonen auf 150 mm-LB-Platten mit 100 ug/ml Ampicillin plattiert. 100 000 Clone wurden aus Glycerin-Stammlösungen auf jede von 10 Platten pl attiert, und 20 000 Clone wurden auf jede von 5 Platten ausplattiert. Material wurde doppelt entnommen, wie es vorstehend beschrieben wurde. Vorhybridisierung, Hybridisierung und Waschen wurden ebenfalls durchgefuhrt, wie es vorstehend beschrieben wurde. Zwei endmar kierte 42-mere Oligonucleotide, namlich ZC3709 und ZC3710 (die fur das 43 kD Homologe spezifisch sind), wurden fur die Hybridisierung verwendet. Filter wurden einmal 20 Minuten mit TMACL bei 77ºC gewaschen. 22 Flecken, die sich auf doppelten Filtern zeigten, wurden festgestellt. Entsprechende Bereiche auf den Platten wurden mit dem großen Ende einer Pipette in 1 ml 1x PCR-Puffer aufgenommen. Diese isolierten Analysen durch PCR erfolgten mit 2 Sätzen von Oligonucleotiden für jede Isolierung. Ein Satz enthielt zwei 43 kD-spezifische Oligonucleotide, die als Hybridisierungssonden verwendet wurden, und der andere enthielt ein 43 kD-spezifisches Oligonucleotid, nämlich ZC3709, und ein vektorspezifisches Oligonucleotid, nämlich ZC3634. Eine PCR wurde wie vorstehend gemäß der Perkin-Elmer-Cetus-Anleitungen durchgeführt. 20 Picomol jedes Primers und 5 ul der Zellsuspension wurden in jedem Reaktionsgemisch von 50 ul verwendet. Nach einer anfänglichen Denaturierung bei 94ºC für 1 Minute 30 Sekunden wurden 30 Zyklen von 1 Minute bei 94ºC und 2 Minuten bei 72ºC durchgeführt, wobei die abschließende Erweiterungszeit 10 Minuten bei 72C betrug. Die Ergebnisse zeigten, daß 17 der 22 die beiden 43 kD-spezifischen Oligonucleotid-Erkennungsstellen enthielten. Die restlichen 5 Clone enthielten eine der beiden Stellen, ZC3709, durch PCR mit dem vektorspezifischen Primer wurde jedoch gezeigt, daß sie verkürzt und nicht lang genug waren, um die andere Stelle zu enthalten. Die 9 längsten Clone wurden für die Einzelkolonie-Isolierung durch eine weitere Stufe des Absuchens ausgewählt. 5 10-fache Verdünnungen von jedem wurden ausplattiert und verarbeitet, wie es vorstehend für den ersten Satz von entnommenen Materialien beschrieben wurde. Alle 9 wiesen Signale auf Autoradiogrammen der zweiten Stufe des Absuchens auf. Die Kolonien waren recht dicht angeordnet, so daß wenige getrennte Kolonien im Bereich des radioaktiven Signals einzelne Kolonien waren, die auf 150 mm-LB-Platten mit 70 ul/ml Ampicillin isoliert wurden. Diese wurden durch PCR auf Homologe der 43 kD- Endoglucanase mit den Oligonucleotiden ZC3709 und ZC3710, wie es vorstehend für die erste Stufe des Absuchens beschrieben worden war, untersucht, mit Ausnahme, daß die Kolonien mit einem Zahnstocher in 25 ul Stammgemisch aufgenommen wurden. Banden der erwarteten Größe wurden für 7 der 9 Clone erhalten. Kulturen davon wurden in 20 ml "Terrific Broth" mit 150 ug/ml Ampicillin angesetzt. DNA wurde durch alkalische Lyse und PEG- Fällung wie zuvor isoliert.
    • DNA-Sequenzanalyse
  • Die cDNAs wurden im Hefeexpressionsvektor pYCDE8' sequenziert. Die Didesoxy-Kettenabbruch-Methode (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), S. 5463-5467) unter Verwendung von ³&sup5;S-dATP von New England Nuclear (vgl. M. D. Biggin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 80 (1983), S. 3963-3965) wurde für alle Sequenzierreaktionen angewandt. Die Reaktionen wurden durch modifizierte T7 DNA Polymerase von Pharmacia (vgl. S. Tabor und C. C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), S. 4767-4771) katalysiert, und als Primer wurden ein Oligonucleotid, das komplementär zum ADH1-Promotor (ZC996: ATT GTT CTC GTT CCC TTT CTT) war, ein Oligonucleotid, das komplementär zum CYC1-Terminator (ZC3635: TGT ACG CAT GTA ACA TTA) war, oder Oligonucleotide, die komplementär zur fraglichen DNA waren, verwendet. Doppelsträngige Matrizen wurden mit NaOH denaturiert (E. Y. Chen und P. H. Seeburg, DNA, Bd. 4 (1985), S. 165-170), und zwar vor der Hybridisierung mit einem Sequenzier-Oligonucleotid. Oligonucleotide wurden mit einem Applied Biosystems Modell 380A-DNA-Syntheseautomaten synthetisiert. Die Oligonucleotide, die für die Sequenzierreaktionen verwendet wurden, sind in der nachstehenden Oligonucleotid-Tabelle angegeben: Tabelle 1 Oligonucleotide für die PCR für das 43 kD-Homologe: Oligonucleotide für die Clonierung des 43 kD-Homologen: pYCDE8'-Vektor-Oligonucleotide: 1-Terminator 1-Promotor Spezifische Sequenzierprimer für das 43 kD-Homologe:
    • Beispiel 4 Farbklärtest
  • Die Humicola 43 kD-Endoglucanase (ein Gemisch aus 30 Reinigungsansätzen) wurde in einem Farbklärtest mit dem H. insolens-Cellulase-Präparat, das in US 4 435 307, Beispiel 6, beschrieben ist, verglichen.
  • Alte, getragene, schwarze Baumwolltücher wurden als Testmaterial verwendet. Der Klärtest wurde in einem "Terg-O-tometer" durchgeführt, wobei 3 wiederholte Waschgänge durchgeführt wurden. Zwischen den Waschgängen wurden die Tücher über Nacht getrocknet.
    • Bedingungen
  • 2 g/l Flüssigdetergens bei 40ºC für 30 Minuten und einer Wasserhärte von 90 dH. Die Größe der Tücher betrug 10x15 cm, und es waren zwei Tücher in jedem Becherglas.
  • Die Zusammensetzung des Detergens war wie folgt
  • 10 % anionisches oberflächenaktives Mittel (Nansa 1169/p)
  • 15 % nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel (Berol 160)
  • 10 % Ethanol
  • 5 % Triethanolamin
  • 60 % Wasser
  • pH-Wert mit HCl auf 8,0 eingestellt.
    • Dosierung
  • Die beiden Enzyme wurden mit 63 und 125 CMC-Endoase-Einheiten/l dosiert.
    • Ergebnisse
  • Die Ergebnisse wurden von einer Gruppe von 22 Personen bewertet, die die Tücher auf einer Skala von 1 bis 7 Punkten einstuften. Je höher die Bewertung, um so stärker war die erzielte farbklärung. Enzyme CMC-Endoase/l Protein mg/l PSU* kein Enzym H. insolens Cellulase-Gemisch Erfindung * PSU = Panel-Bewertungseinheiten
  • Es wird gezeigt, daß die 43 kD-Endoglucanase eine etwa 30-fach bessere Leistungsfähigkeit als das H. insolens-Cellulase-Gemisch nach dem Stand der Technik und eine etwa 6-fach bessere Leistungsfähigkeit als das Cellulase-Präparat gemäß WO 89/09259 aufweist.
    • Beispiel 5 Stabilität der Humicola- 43 kD-Endoglucanase in Gegenwart von Proteasen
  • Die Lagerstabilität der 43 kD-Endoglucanase in Flüssigdetergentien in Gegenwart von verschiedenen Proteasen wurde unter den folgenden Bedingungen bestimmt:
    • Enzyme
  • 43 kD-Endoglucanase der Erfindung
  • Glu/Asp-spezifische B. licheniformis-Serinprotease
  • Trypsin-ähnliche Fusarium sp. DSM 2672-Protease
  • B. lentus-Serinprotease
  • Subtilisin Novo
    • Detergens
  • Handelsübliches flüssiges US-Detergens ohne Trübungsmittel, Parfum oder Enzyme (abgesehen von denen, die im Versuch zugegeben wurden). ± 1 % (Gew./Gew.) Borsäure als Enzymstabilisator.
    • Dosierung
  • Endoglucanase: 12 CMCU/g Detergens
  • Proteasen: 0,2 mg/g Detergens
    • Inkubation
  • 7 Tage bei 35ºC
    • Restaktivität
  • Die Restaktivität der Endoglucanase nach 7 Tagen der Inkubation mit den entsprechenden Proteasen wurde als ihre CMCase-Aktivität (CMCU) bestimmt.
  • Die CMCase-Aktivität wurde wie folgt bestimmt:
  • Eine Substrat lösung von 30 g/l CMC (Hercules 7 LFD) in entionisiertem Wasser wurde hergestellt. Die Enzyinprobe, die untersucht werden sollte, wurde in 0,01 m Phosphatpuffer, pH-Wert: 7,5 gelöst. 1,0 ml der Enzymlösung und 2,0 ml 0,1 m Phosphatpuffer, pH-Wert: 7,5, wurden in einem Teströhrchen gemischt, und eine Enzymreaktion wurde durch Zugabe von 1,0 ml der Substratlösung in das Teströhrchen eingeleitet. Das Gemisch wurde 20 Minuten bei 40ºC inkubiert. Danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 2,0 ml 0,125 m Trinatriumphosphat 12H&sub2;O abgebrochen. Eine Blindprobe wurde ohne Inkubation hergestellt.
  • 2,0 ml einer Hexacyanoferrat(III)-Lösung (1,60 g Kaliumhexacyanoferrat(III) und 14,0 g Trinatriumphosphat.12H&sub2;O in 1 l entionisiertem Wasser> wurde zur Testprobe sowie zur Blindprobe, gegeben unmittelbar gefolgt von Eintauchen in kochendes Wasser und Inkubation für 10 Minuten. Nach der Inkubation wurden die Proben mit Leitungswasser gekühlt. Die Extinktion bei 420 nm wurde gemessen, und eine Eichkurve wurde mit Glucoselösung aufgestellt.
  • 1 CMCase-Einheit (CMCU) ist als die Menge an Enzym definiert, die unter den vorstehend angegebenen Bedingungen eine Menge an reduzierenden Kohlenhydraten bildet, die 1 uMol Glucose pro Minute entspricht.
    • Ergebnisse
  • Die Lagerstabilität der erfindungsgemäßen Endoglucanase wurde als ihre Restaktivität (in CMCU, %) unter den vorstehend angegebenen Bedingungen bestimmt. Protease Restaktivität (%) + Borsäure - Borsäure Glu/Asp-spezifisch Trypsin-ähnlich B. lentus-Serin Subtilisin Novo
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß die Lagerstabilität der erfindungsgemäßen Endoglucanase in flüssigen Detergentien verbessert wird, wenn eine Protease mit einem höheren Grad an Spezifität als Savinase der Detergenszusammensetzung einverleibt wird.
    • Beispiel 6 Verwendung von Humicola- 43 kD-Endoglucanase, um für eine lokalisierte Variation der Farbe von textilen Denim-Werkstoffen zu sorgen
  • Denim-Jeans wurden einer Behandlung mit der 43 kD-Endoglucanase in einem 12 kg "Wascator" FL120-Waschextraktor im Hinblick auf eine lokalisierte Variation der Oberflächenfarbe der Jeans, die ungefähr einem "stone-washed" Erscheinungsbild entsprach, unterworfen.
  • 4 Paare von Jeans wurden pro Maschinenbeladung verwendet. Die experimentellen Bedingungen waren wie folgt.
    • Entschlichtung
  • 40 l Wasser
  • 100 ml B. amyloliquefaciens-Amylase*, 120 L
  • 70 g KH&sub2;PO&sub4;
  • 30 g Na&sub2;HPO&sub4;
  • 55ºC
  • 10 Minuten
  • pH-Wert: 6,8
  • *erhältlich von Novo Nordisk A/S.
  • Dem Entschlichtungsverfahren folgte eine Entwässerung.
    • Scheuern
  • 40 l Wasser
  • 120 g H. insolens-Cellulase-Gemisch oder x g 43 kD-Endoglucanase
  • 70 g KH&sub2;PO&sub4;
  • 30 g Na&sub2;HPO&sub4;
  • 55ºC
  • 75 Minuten
  • pH-Wert: 6,6
  • Dem Scheuerverfahren folgten Entwässerung, Spülen, Nachwaschen und Spülen.
  • Die Ergebnisse wurden bewertet, indem das visuelle Erscheinungsbild der Jeans beurteilt wurde.
  • Es wurden verschiedene Dosierungen der 43 kD-Endoglucanase verwendet, um einen Scheuergrad zu erzielen, der äquivalent zu dem war, der mit 120 g H. insolens-Cellulase-Gemisch erzielt wurde. Ein derartiger äquivalenter Grad wurde mit 1,0 bis 1,25 g 43 kD-Endoglucanase erzielt. Messungen der Reißfestigkeit der behandelten Kleidungsstücke zeigten keinen wesentlichen Unterschied zwischen den beiden Enzymbehandlungen.
    • Beispiel 7 Verwendung der Humicola 43 kD-Endoglucanase zur Entfernung von Faserstückchen von der Oberfläche von textilen Werkstoffen
  • Gewebe aus 100 % Baumwolle wurden mit der 43 kD-Endoglucanase in einem 12 kg "Wascator" FL120-Waschextraktor im Hinblick auf die Untersuchung der Fähigkeit des Enzyms behandelt, neuen textilen Werkstoffen einen höheren Grad an Weichheit zu verleihen.
  • Die experimentellen Bedingungen waren wie folgt.
    • Textiler Werkstoff
  • Gewebe aus 100 % Baumwolle wurden von Nordisk Textil erhalten, und zwar gebleicht (NT2116-b) oder ungebleicht (NT2116-ub). 400 g textiler Werkstoff wurden pro Maschinenladung verwendet.
    • Entschlichtung
  • 40 l Wasser
  • 200 ml B. amyloliquefaciens-Ainylase, 120 L
  • 60 g KH&sub2;PO&sub4;
  • 20 g Na&sub2;HPO&sub4;
  • 60ºC
  • 10 Minuten
  • pH-Wert: 6,4
  • Dem Entschlichtungsverfahren folgte eine Entwässerung.
    • Hauptwaschgang
  • 40 l Wasser
  • 0-600 g H. insolens-Cellulase-Gemisch oder x g 43 kD-Endoglucanase
  • 60 g KH&sub2;PO&sub4;
  • 40 g Na&sub2;HPO&sub4;
  • 60ºC
  • 60 Minuten
  • pH-Wert: 6,7
  • Der Scheuerstufe folgte eine Entwässerung.
    • Nachwaschen
  • 40 l Wasser
  • 40 g Na&sub2;CO&sub3;
  • 10 g Berol 08
  • 80ºC
  • 15 Minuten
  • pH-Wert: 10,1
  • Dem Nachwaschen folgte ein Spülen.
  • Drei verschiedene Konzentrationen der 43 kD-Endoglucanase wurden im Hauptwaschgang zugegeben.
  • Der Gewichtsverlust der Proben des textilen Werkstoffs wurde vor und nach der Behandlung gemessen. Der Gewichtsverlust wird als % ausgedrückt und auf den entschlichteten textilen Werkstoff bezogen.
  • Die Dicke des textilen Werkstoffs wurde mittels einer Dickenmeßvorrichtung L&W Typ 22/1 gemessen. 2 Tücher des textilen Werkstoffs (10x6 cm) wurden vermessen, und 5 Messungen in um wurden für jedes Tuch aufgezeichnet. Das Tuch wurde bei einem Druck von 98,07 kPa vermessen. Die verbliebene Dicke wird in % in bezug zum entschlichteten textilen Werkstoff ausgedrückt.
  • Die Festigkeit des textilen Werkstoffs wurde mittels einer Reißtestvorrichtung (Elmendorf 09) gemessen. 6 Tücher (10x6 cm) wurden in Kettenrichtung geschnitten, und 6 Tücher (10x6 cm) wurden in Schußrichtung geschnitten. Die Reißfestigkeit wurde in mN gemäß ASTM D 1424 gemessen. Die Festigkeit der enzymbehandelten textilen Werkstoffe wird in % in bezug auf den entschlichteten textilen Werkstoff ausgedrückt.
  • Die Steifigkeit des textilen Werkstoffs wurde mittels eines King Fabric Stiffness Tester gemessen. 4 Tücher (10x20 cm; 10 cm in Kettenrichtung) werden aus dem textilen Werkstoff ausgeschnitten, und jedes Tuch wird Rücken an Rücken (10x10 cm) gefaltet und auf einem Tisch angeordnet, der in der Mitte mit einem offenen Ring versehen ist. Ein Kolben drückt den textilen Werkstoff unter Anwendung einer bestimmten Kraft, die in g ausgedrückt wird, durch den Ring. Die Bestimmung erfolgt gemäß dem Kreisbiegetestverfahren ASTM D 4032. Die verbliebene Steifigkeit des textilen Werkstoffs wird in % in bezug auf den entschlichteten textilen Werkstoff ausgedrückt.
  • Die Ergebnisse dieser Tests sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt: Enzymdosierung EUG/l Gewichtserlust % verbliebene Dicke % verbliebene Festigkeit % verbliebene Steifigkeit %
    • Beispiel 8 Verwendung der Humicola- 43 kD-Endoglucanase zur Behandlung von Papierfaserbrei
  • Die 43 kD-Endoglucanase wurde zur Behandlung von mehreren Typen von Papierfaserbrei im Hinblick auf die Untersuchung der Wirkung des Enzyms auf die Faserbrei-Entwässerung verwendet.
  • Die experimentellen Bedingungen waren wie folgt.
    • Faserbreie
  • 1. Altpapier-Gemisch: bestand zu 33 % aus Zeitungspapier, 33 % aus Zeitschriften und 33 % aus Computerpapier. Mit und ohne Chemikalien zum Deinken (WPC bzw. WP).
  • 2. Einem Recycling unterworfene Kartonbehälter (RCC).
  • 3. Gebleichter Kraft-Faserbrei: hergestellt aus Kiefer (BK).
  • 4. Ungebleichter thermomechanischer Faserbrei: hergestellt aus Nadelbäumen (TMP).
    • Bestimmung der Cellulase-Aktivität (CEVU)
  • Eine Substratlösung mit einem Gehalt an 33,3 g/l CMC (Hercules 7 LFD) in Tris-Puffer, pH-Wert: 9,0, wird hergestellt. Die Enzymprobe, die untersucht werden soll, wird im gleichen Puffer gelöst. 10 ml Substratlösung und 0,5 ml Enzymlösung werden gemischt und in ein Viskosimeter (Haake VT 181, NV Sensor, 181 U/min), das bei 40ºC thermostatisiert ist, übertragen. 1 Cellulase-Viskositätseinheit (CEVU) ist in Novo Nordisk Analytical Method Nr. AF 253 (erhältlich von Novo Nordisk) definiert.
    • Bestimmung der Faserbrei-Entwässerung (Schopper-Riegler)
  • Die Schopper-Riegler-Zahl (SR) wird gemäß dem ISO-Standard 5267 (Teil 1) für einen homogenen Faserbrei mit einer Konsistenz von 2 g/l bestimmt. Man läßt ein bekanntes Volumen an Faserbrei durch ein Metallsieb in einen Trichter ablaufen. Der Trichter ist mit einem axialen Loch und einem seitlichen Loch versehen. Das Volumen des Filtrats, das durch das seitliche Loch tritt, wird in einem Gefäß, das in Schopper-Riegler-Einheiten eingeteilt ist, gemessen.
    • Enzymatische Behandlung
  • Ein Präparat der 43 kD-Endoglucanase wurde auf 7 CEVU/ml verdünnt und zu jedem der vorstehend angegebenen Faserbreie gegeben (50 g DS, Konsistenz: 3 %) Die Enzymdosierung betrug 2400 CEVU/kg trockener Faserbrei. Die enzymatische Behandlung wurde bei einem pH-Wert von 7,5 und bei 40ºC unter leichtem Rühren für 60 Minuten durchgeführt. Eine Probe wurde nach 30 Minuten entnommen, um den Fortschritt der Reaktion zu überwachen. Nach 60 Minuten wurde der Faserbrei auf eine Konsistenz von 0,5 % mit kaltem Wasser (+4ºC) verdünnt, um die Reaktion abzubrechen.
  • Die Entwässerung des nassen Faserbreis wurde bestimmt, wie es vorstehend beschrieben wurde, und durch Schopper-Riegler-Werte (SR) bewertet. Die Entwässerungszeit (DT) unter Vakuum wurde ebenfalls bestimmt.
  • Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt. Altpapier + Chemikalien Kontrolle Enzym SR (3 %) Entwässerungszeit (s) 150 g/m² Masse g/m² Volumen cm³/g Reißlänge, m Bruchindex Altpapier Altpapier Kontrolle Enzym SR (3 %) Entwässerungszeit (s) 150 g/m² Masse g/m² Volumen cm³/g Reißlänge, m Bruchindex Altpapier Einem Recycling unterworfene Pappbehälter Kontrolle Enzym SR (3 %) Entwässerungszeit (s) 150 g/m² Masse g/m² Volumen cm³/g Reißlänge, m Bruchindex Altpapier Kraft-Faserbrei Kontrolle Enzym SR (3 %) Entwässerungszeit (s) 150 g/m² Masse g/m² Volumen cm³/g Reißlänge, m Bruchindex Altpapier TPM Kontrolle Enzym SR (3 %) Entwässerungszeit (s) 150 g/m² Masse g/m² Volumen cm³/g Reißlänge, m Bruchindex Altpapier
  • Tabelle 3: Ergebnisse der Messungen von Entwässerung und Festigkeit Kontrollversuche. Die gleichen Bedingungen wie bei der Enzymbehandlung.
  • Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die Behandlung mit der 43 kD- Endoglucanase zu einer wesentlichen Abnahme der SR-Werte führt und die Entwässerung von Faserbreien, die bei der Papierherstellung verwendet werden, wesentlich verbessert.
  • Papierblätter wurden aus den verschiedenen Faserbreien auf einer Rapid-Köthen-Vorrichtung hergestellt und auf ihre Festigkeit gemäß der verschiedenen Parameter (unter Einschluß der Reißlänge) vermessen. Es wurde keine Verringerung der Festigkeitseigenschaften aufgrund der Enzymeinwirkung beobachtet.
    • SEQUENZPROTOKOLL (1) ALLGEMEINE ANGABEN:
  • (i) ANMELDER:
  • Novo Nordisk A/S, N N
  • (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Ein Cellulase-Präparat
  • (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4
  • (iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
  • (A) ADRESSAT: Novo Nordisk A/S, Patentabteilung
  • (B) STASSE: Novo Alle
  • (C) ORT: Bagsvaerd
  • (E) LAND: Dänemark
  • (F) POSTLEITZAHL: DK-2880
  • (v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
  • (A) DATENTRÄGER: Diskette
  • (B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25
  • (vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
  • (A) ANMELDENUMMER:
  • (B) ANMELDETAG:
  • (C) KLASSIFIKATION:
  • (viii) ANGABEN ÜBER DEN ANWALT/VERTRETER:
  • (A) NAME: Thalsoe-Madsen, Birgit
  • (ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
  • (A) TELEFON: +4544448888
  • (B) TELEFAX: +4544493256
  • (C) TELEX: 37304
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
  • i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 1060 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKULTYP: cDNA
  • (iii) HYPOTHETISCH: nein
  • (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
  • (A) ORGANISMUS: Humicola insolens
  • (B) STAMM: DSM 1800
  • (ix) MERKMAL
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: reifes Peptid
  • (B) Lage: 73. .927
  • (ix) MERKMAL.
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Signalpeptid
  • (B) Lage: 10..72
  • (ix) MERKMAL
    • (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
  • (B) Lage: 10..927 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 305 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
    • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3: (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 1473 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
  • (iii) HYPOTHETISCH: nein
  • (iv) ANTI-SENSE: nein
  • (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
  • (A) ORGANISMUS: Fusarium oxysporum
  • (B) STAMM: DSM 2672
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL CDS
  • (B) LÄGE: 97..1224 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
    • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 376 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

Claims (31)

1. Cellulase-Präparat, bestehend im wesentlichen aus einer homogenen Endoglucanase-Komponente, die zwischen pH-Wert 6,0 und 10,0 aktiv ist und die immunoreaktiv ist mit einem Antikörper gegen eine hochgereinigte, von Humicola insolens, DSM 1800, abgeleitete 43 kD-Endoglucanase oder die ein Derivat dieser 43 kD-Endoglucanase ist.
2. Cellulase-Präparat nach Anspruch 1, wobei die Endoglucanase-Komponente eine Endoglucanase-Aktivität von mindestens 50 CMC-Endoase-Einheiten/mg Protein aufweist.
3. Cellulase-Präparat nach Anspruch 2, wobei die Endoglucanase-Komponente eine Endoglucanase-Aktivität von mindestens 60 CMC-Endoase-Einheiten/mg Gesamtprotein, insbesondere mindestens 90 CMC-Endoase-Einheiten/mg Gesamtprotein und vorzugsweise mindestens 100 CMC-Endoase-Einheiten/mg Gesamtprotein aufweist.
4. Cellulase-Präparat nach Anspruch 1, wobei die Endoglucanase-Komponente im wesentlichen keine Cellobiohydrolase- Aktivität aufweist.
5. Cellulase-Präparat nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die Endoglucanase-Komponente einen isoelektrischen Punkt von etwa 5,1 aufweist.
6. Enzym mit Endoglucanase-Aktivität, wobei das Enzym die in der beigefügten Sequenzliste ID-Nr. 2 aufgeführte Aminosäuresequenz aufweist, oder ein Derivat davon mit Endoglucanase-Aktivität.
7. Endoglucanase-Enzym nach Anspruch 6, das von einer Spezies von Humicola, z.B. Humicola insolens, gebildet werden kann.
8. Enzym mit Endoglucanase-Aktivität, wobei das Enzym die in der beigefügten Sequenzliste ID-Nr. 4 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist oder ein Derivat davon mit Endoglucanase-Aktivität.
9. Endoglucanase-Enzym nach Anspruch 8, das durch eine Spezies von Fusarium, z.B. Fusarium oxysporum, gebildet werden kann.
10. DNA-Konstrukt, umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein Endoglucanase-Enzym nach einem der Ansprüche 6-9 kodiert.
11. DNA-Konstrukt nach Anspruch 10, wobei die DNA-Sequenz den Angaben in den beigefügten Sequenzlisten ID-Nr. 1 oder ID-Nr. 3 oder einer Modifikation davon entspricht.
12. Expressionsvektor, der eine inserierte DNA-Sequenz nach Anspruch 10 oder 11 trägt.
13. Zelle, die mit einem DNA-Konstrukt nach Anspruch 10 oder 11 oder mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 12 transformiert ist.
14. Zelle nach Anspruch 13, bei der es sich um eine Pilzzelle, die beispielsweise zu einem Stamm von Trichoderma oder Aspergillus, insbesondere Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger, gehört, oder um eine Hefezelle handelt, die beispielsweise zu einem Stamm von Hansenula oder Saccharomyces, z.B. Saccharomyces cerevisiae gehört.
15. Verfahren zur Herstellung eines Endoglucanase-Enzyms gemäß der Definition in einem der Ansprüche 6-9, wobei das Verfahren das Züchten einer Zelle gemäß Anspruch 13 oder 14 in einem geeigneten Kulturmedium unter Bedingungen, die die Expression des Endoglucanase-Enzyms ermöglichen, und das Gewinnen des Endoglucanase-Enzyms aus der Kultur umfaßt.
16. Detergens-Additiv, enthaltend ein Cellulase-Präparat nach einem der Ansprüche 1-5 oder ein Endoglucanase-Enzym nach einem der Ansprüche 6-9, vorzugsweise in Form eines staubfreien Granulats, einer stabilisierten Flüssigkeit oder eines geschützten Enzyms.
17. Detergens-Additiv nach Anspruch 16, das 1-500, vorzugsweise 5-250 und insbesondere 10-100 mg Enzymprotein pro Gramm Additiv enthält.
18. Detergens-Additiv nach Anspruch 16, das zusätzlich ein weiteres Enzym enthält, wie eine Protease, bipase, Peroxidase und/oder Amylase.
19. Detergens-Additiv nach Anspruch 18, wobei es sich bei der Protease um eine Protease handelt, die eine höhere Spezifität als Bacillus lentus-Serin-Protease aufweist.
20. Detergens-Additiv nach Anspruch 19, wobei es sich bei der Protease um Subtilisin-Novo oder um eine Variante davon, eine von Nocardia dassonvillei NRRL 18133 ableitbare Protease, eine für Glutamin- und Asparagin-Säure spezifische Serin-Protease, die durch Bacillus licheniformis gebildet werden kann, oder eine trypsinähnliche Protease, die durch Fusarium sp DSM 2672 gebildet werden kann, handelt.
21. Detergens-Zusammensetzung, enthaltend ein Cellulase- Präparat nach einem der Ansprüche 1-5 oder ein Endoglucanase- Enzym nach einem der Ansprüche 6-9.
22. Detergens-Zusammensetzung nach Anspruch 21, die zusätzlich ein weiteres Enzym, z.B. eine Protease, Lipase, Peroxidase und/oder Amylase enthält.
23. Detergens-Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei es sich bei der Protease um eine Protease handelt, die eine höhere Spezifität als Bacillus lentus-Serin-Protease aufweist.
24. Detergens-Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei es sich bei der Protease um Subtilisin-Novo oder um eine Variante davon, eine von Nocardia dassonvillei NRRL 18133 ableitbare Protease, eine für Glutamin- und Asparagin-Säure spezifische Serin-Protease, die durch Bacillus licheniformis gebildet werden kann, oder eine trypsinähnliche Protease, die durch Fusarium sp DSM 2672 gebildet werden kann, handelt.
25. Detergens-Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei das Cellulase-Präparat oder das Endoglucanase-Enzvm in einer Konzentration enthalten ist, die 0,01-100, vorzugsweise 0,05- 60 und insbesondere 0,1-20 mg Enzymprotein pro Liter Waschlösung entspricht.
26. Detergens-Zusammensetzung, enthaltend ein Detergens- Additiv nach einem der Ansprüche 16-20.
27. Verfahren zur Verringerung der Geschwindigkeit, mit der Cellulose enthaltende textile Werkstoffe hart werden, oder zur Verminderung der Härte von Cellulose enthaltenden textilen Werkstoffen, wobei das Verfahren die Behandlung der Cellulose enthaltenden textilen Werkstoffe mit einem Cellulase-Präparat nach einem der Ansprüche 1-5 oder einem Endoglucanase-Enzvm nach einem der Ansprüche 6-9 umfaßt.
28. Verfahren zur Erzielung einer Farbklärung von gefärbten, Cellulose enthaltenden textilen Werkstoffen, wobei das Verfahren die Behandlung von gefärbten, Baumwolle enthaltenden textilen Werkstoffen mit einem Cellulase-Präparat nach einem der Ansprüche 1-5 oder einem Endoglucanase-Enzym nach einem der Ansprüche 6-9 umfaßt.
29. Verfahren zur Erzielung einer lokalisierten Farbvariation von gefärbten, Cellulose enthaltenden textilen Werkstoffen, wobei das Verfahren die Behandlung von gefärbten, Baumwolle enthaltenden textilen Werkstoffe mit einem Cellulase-Präparat nach einem der Ansprüche 1-5 oder einem Endoglucanase-Enzym nach einem der Ansprüche 6-9 umfaßt.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 27, 28 oder 29, wobei die Behandlung der textilen Werkstoffe mit dem Cellulase-Präparat während des Einweichens, Waschens oder Spülens der textilen Werkstoffe durchgeführt wird.
31. Verfahren zur Verbesserung der Entwässerungseigenschaften von Papierstoff, wobei das Verfahren die Behandlung von Papierstoff mit einem Cellulase-Präparat nach einem der Ansprüche 1-5 oder einem Endoglucanase-Enzym nach einem der Ansprüche 6-9 umfaßt.
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