JP5239159B2 - タンパク分解活性を有するキノコ抽出物の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、キノコからタンパク分解活性を有する抽出液を抽出し、タンパク分解活性を有する抽出物を製造する技術に関する。詳細には、食品分野で使用できる、タンパク分解活性が良好で、菌の汚染、着色やキノコ特有の臭いの問題がないキノコ抽出物の製造方法に関する。
キノコ類は我が国において食物として広く浸透しているが、その含有する多糖類の薬効に注目され、抗腫瘍作用、免疫増強作用等について研究が盛んに行われている。多糖類は一般には、熱水にて抽出し、これを減圧にて濃縮した後、有機溶媒による沈殿工程、透析工程による低分子物質の除去及び脂溶性有機溶媒による不純物の抽出、除去工程を組み合わせ抽出されている（例えば、特許文献１）。
このような多糖類を含むキノコエキスは、もちろんそれ自身に、抗腫瘍作用、免疫増強作用等の効果があり、このようなキノコエキスの製造方法として、水または熱水抽出物にアルコールを加えて不溶物質を除きこれを噴霧乾燥する方法（特許文献２）、キノコと食塩を摂食させエキスを抽出する方法（特許文献３）が開示されている。
最近、マイタケにタンパク質を分解する酵素が存在することが明らかになり注目されている（特許文献４）。また、タンパク質分解酵素は他のキノコにも存在し、その特異的な効果が確認されている（特許文献５）。このような現状の下、タンパク分解活性を有するキノコからの抽出物の効率的な製造方法の開発が望まれている。
特開昭４１−３３８７３号公報
特開平１１−７５７６８号公報
特開平２００４−２４８５３１号公報
特開平２００２−７８４８６号公報
特願２００５−２００２７７号
このような多糖類を含むキノコエキスは、もちろんそれ自身に、抗腫瘍作用、免疫増強作用等の効果があり、このようなキノコエキスの製造方法として、水または熱水抽出物にアルコールを加えて不溶物質を除きこれを噴霧乾燥する方法（特許文献２）、キノコと食塩を摂食させエキスを抽出する方法（特許文献３）が開示されている。
最近、マイタケにタンパク質を分解する酵素が存在することが明らかになり注目されている（特許文献４）。また、タンパク質分解酵素は他のキノコにも存在し、その特異的な効果が確認されている（特許文献５）。このような現状の下、タンパク分解活性を有するキノコからの抽出物の効率的な製造方法の開発が望まれている。
しかし、キノコからタンパク分解活性を有する抽出物を製造する際に、酵素は多糖類とは異なり、化学安定性に乏しいことが問題となる。酵素を熱水やアルコールで抽出すると酵素が失活し、タンパク分解活性を有するキノコからの抽出物を製造できなくなる。また、キノコには多くの生菌が付着しており、熱、アルコール、塩などで処理しなければ、その抽出物において菌が増殖してしまうことがあるが、このような処理は酵素を失活させる。
菌を除去する方法として、除菌フィルターの使用は知られているが、キノコの抽出エキスには多糖類等が含まれていることから、そのままフィルターに通過させると目詰まりにより、生産効率が下がる。
また、キノコの抽出エキスは着色し、またキノコ臭を有する場合があるので、食品等の分野において、着色、臭いが商品価値を低下させ、これをそのまま使用できない場合がある。
さらに、キノコからタンパク分解活性を有する抽出物におけるタンパク分解活性の主体はタンパク分解酵素であるが、その性質上、相互作用によって自己失活し、抽出物におけるタンパク分解活性を長期間に維持することが難しくなる。
菌を除去する方法として、除菌フィルターの使用は知られているが、キノコの抽出エキスには多糖類等が含まれていることから、そのままフィルターに通過させると目詰まりにより、生産効率が下がる。
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さらに、キノコからタンパク分解活性を有する抽出物におけるタンパク分解活性の主体はタンパク分解酵素であるが、その性質上、相互作用によって自己失活し、抽出物におけるタンパク分解活性を長期間に維持することが難しくなる。
本発明は、下記の発明である。
（１）下記の工程１〜３を含む、タンパク分解活性を有するキノコ抽出物の製造方法。
工程１：キノコから、ＰＨ５〜７及び塩濃度１０〜３００ｍＭの緩衝液でキノコ抽出物を抽出する工程。
工程２：前記工程で抽出した抽出液を、珪藻土を濾過助剤に使用して濾過する工程。
工程３：前記工程で濾過した抽出液を、孔径０．２５〜０．８μｍのフィルターに通過させ除菌する工程。
（１）下記の工程１〜３を含む、タンパク分解活性を有するキノコ抽出物の製造方法。
工程１：キノコから、ＰＨ５〜７及び塩濃度１０〜３００ｍＭの緩衝液でキノコ抽出物を抽出する工程。
工程２：前記工程で抽出した抽出液を、珪藻土を濾過助剤に使用して濾過する工程。
工程３：前記工程で濾過した抽出液を、孔径０．２５〜０．８μｍのフィルターに通過させ除菌する工程。
（２）下記の工程１〜４を含む、タンパク分解活性を有するキノコ抽出物の製造方法。
工程１：キノコから、ＰＨ５〜７及び塩濃度１０〜３００ｍＭの緩衝液でキノコ抽出物を抽出する工程。
工程２：前記工程で抽出した抽出液を、珪藻土を濾過助剤に使用して濾過する工程。
工程３：前記工程で濾過した抽出液を、孔径０．２５〜０．８μｍのフィルターに通過させ除菌する工程。
工程４：前記工程でフィルターを通過させた抽出液に賦形剤を添加し乾燥する工程。
工程１：キノコから、ＰＨ５〜７及び塩濃度１０〜３００ｍＭの緩衝液でキノコ抽出物を抽出する工程。
工程２：前記工程で抽出した抽出液を、珪藻土を濾過助剤に使用して濾過する工程。
工程３：前記工程で濾過した抽出液を、孔径０．２５〜０．８μｍのフィルターに通過させ除菌する工程。
工程４：前記工程でフィルターを通過させた抽出液に賦形剤を添加し乾燥する工程。
本発明のタンパク分解活性を有するキノコ抽出物の製造方法によれば、タンパク分解活性を有するキノコ抽出物を生産効率よく製造できる。抽出物のタンパク分解活性は高く、除菌されており菌を含まない。着色が殆どなく、キノコ臭が除かれていることから、食品用途の使用に適する。
さらに、本発明のタンパク分解活性を有するキノコ抽出物に賦形剤を添加し凍結乾燥すると、タンパク分解活性を有する粉体で長期間に渡りタンパク分解活性を有するキノコ抽出物を含む粉末を製造することができる。粉末にすると操作性が向上し、食品等の分野での使用が容易になる。
さらに、本発明のタンパク分解活性を有するキノコ抽出物に賦形剤を添加し凍結乾燥すると、タンパク分解活性を有する粉体で長期間に渡りタンパク分解活性を有するキノコ抽出物を含む粉末を製造することができる。粉末にすると操作性が向上し、食品等の分野での使用が容易になる。
（キノコ）
本発明において、キノコ抽出物の製造に用いるキノコとしては、例えば、しいたけ、エノキタケ、ブナシメジ（シメジ）、ホンシメジ、マイタケ、なめこ、ヤマブシタケ、マツタケ、エリンギ、マッシュルーム、ショーロ、タモギタケ、ヒラタケ、アワビタケ、キクラゲ等のキノコが挙げられる。これらのキノコの中でも、ホンシメジ、ブナシメジおよびエノキタケなどハラタケ目キシメジ科に属するキノコは、マイタケ、ホウキタケなどヒダナシタケ目 多孔菌科などに属するキノコに比べ、タンパク質をする活性を有する酵素を有するので、食肉加工等の食品分野での使用には適している。
本発明において、キノコ抽出物の製造に用いるキノコとしては、例えば、しいたけ、エノキタケ、ブナシメジ（シメジ）、ホンシメジ、マイタケ、なめこ、ヤマブシタケ、マツタケ、エリンギ、マッシュルーム、ショーロ、タモギタケ、ヒラタケ、アワビタケ、キクラゲ等のキノコが挙げられる。これらのキノコの中でも、ホンシメジ、ブナシメジおよびエノキタケなどハラタケ目キシメジ科に属するキノコは、マイタケ、ホウキタケなどヒダナシタケ目 多孔菌科などに属するキノコに比べ、タンパク質をする活性を有する酵素を有するので、食肉加工等の食品分野での使用には適している。
本発明においては、きのこの全体を用いてもよく、一部分のみを用いてもよい。例えば椎茸の場合、従来廃棄されていた「柄」の部分のみでも利用が可能である。
種、原産国、収穫時期等は限定されず、適度にタンパク質分解酵素が存在していれば、キノコの子実体及び菌糸体いずれも使用することができる。
最近ではブナシメジ、エノキタケ及びマイタケの子実体が人工栽培されており、容易に入手できるので、本発明における原料として好適である。タンパク質分解酵素は子実体に多く含まれており、子実体の使用が経済的には適している。キノコは採取したての生のもの、半乾燥品、乾燥品いずれも使用しうる。半乾燥品、乾燥品においては、凍結乾燥品など熱風で乾燥されていない製品の使用が好ましい。これらの子実体をそのまま用いてもよく、ペーストあるいはエキスなどの加工物も使用しうる。生のものを液体窒素あるいはドライアイスを用いて凍結粉砕したもの、カッターミルやフードプロセッサー等で粉砕したものも使用できる。
種、原産国、収穫時期等は限定されず、適度にタンパク質分解酵素が存在していれば、キノコの子実体及び菌糸体いずれも使用することができる。
最近ではブナシメジ、エノキタケ及びマイタケの子実体が人工栽培されており、容易に入手できるので、本発明における原料として好適である。タンパク質分解酵素は子実体に多く含まれており、子実体の使用が経済的には適している。キノコは採取したての生のもの、半乾燥品、乾燥品いずれも使用しうる。半乾燥品、乾燥品においては、凍結乾燥品など熱風で乾燥されていない製品の使用が好ましい。これらの子実体をそのまま用いてもよく、ペーストあるいはエキスなどの加工物も使用しうる。生のものを液体窒素あるいはドライアイスを用いて凍結粉砕したもの、カッターミルやフードプロセッサー等で粉砕したものも使用できる。
（工程１）
本発明においては、キノコ抽出物は、ＰＨ５〜７及び塩濃度１０〜３００ｍＭの緩衝液を用いて抽出する。工程１でのキノコ抽出液は、そのままで、工程２〜４において原料として使用できる。いずれの工程においても液温は３〜２０℃であることが好ましい。液温が３０℃を超えるとタンパク分解酵素が失活することがあるので好ましくない。
本発明で使用する緩衝液はＰＨ５〜７及び塩濃度１０〜３００ｍＭの緩衝液である。このＰＨの範囲から外れるに従い緩衝液のもつ緩衝能が低くなり、有効な緩衝作用が得られないため、好ましくない。
さらに塩濃度が１０ｍＭ未満の場合、有効な緩衝能の領域よりも小さくため、タンパク質の安定化させることが難しい。一方、３００ｍＭを超える高濃度では、逆に塩による悪影響を受けるおそれがあり、好ましくない。
本発明に使用するこのような緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、グリシン緩衝液挙げることができるが、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液は、広域なＰＨ領域さ緩衝能力を有するため使用に適している。塩濃度の調整は、各塩の適正量分を緩衝液に溶解させることにより調整することができる。
緩衝液の調整には、クエン酸、クエン酸三ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リンゴ酸、リンゴ酸Ｎａ、グリシン等が使用できる。
緩衝液の使用量は、抽出効率および抽出工程での使用のし易さの観点で、キノコに対して質量１００部当り、１００〜５００質量部であることが好ましい。
本発明においては、キノコ抽出物は、ＰＨ５〜７及び塩濃度１０〜３００ｍＭの緩衝液を用いて抽出する。工程１でのキノコ抽出液は、そのままで、工程２〜４において原料として使用できる。いずれの工程においても液温は３〜２０℃であることが好ましい。液温が３０℃を超えるとタンパク分解酵素が失活することがあるので好ましくない。
本発明で使用する緩衝液はＰＨ５〜７及び塩濃度１０〜３００ｍＭの緩衝液である。このＰＨの範囲から外れるに従い緩衝液のもつ緩衝能が低くなり、有効な緩衝作用が得られないため、好ましくない。
さらに塩濃度が１０ｍＭ未満の場合、有効な緩衝能の領域よりも小さくため、タンパク質の安定化させることが難しい。一方、３００ｍＭを超える高濃度では、逆に塩による悪影響を受けるおそれがあり、好ましくない。
本発明に使用するこのような緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、グリシン緩衝液挙げることができるが、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液は、広域なＰＨ領域さ緩衝能力を有するため使用に適している。塩濃度の調整は、各塩の適正量分を緩衝液に溶解させることにより調整することができる。
緩衝液の調整には、クエン酸、クエン酸三ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リンゴ酸、リンゴ酸Ｎａ、グリシン等が使用できる。
緩衝液の使用量は、抽出効率および抽出工程での使用のし易さの観点で、キノコに対して質量１００部当り、１００〜５００質量部であることが好ましい。
好ましい抽出方法は、以下のとおりである。
まず、キノコの子実体を上記の緩衝液で均質化処理を行う。処理にはミキサーを使用するが、酵素の失活が起こらないような条件であれば、ミキサーの種類、攪拌・混合手法、時間等は特に限定されない。攪拌・混合の時間は、例えば家庭用のミキサーを用いた場合、一般的には、１〜１０分間程度が適しており、温度制御が可能なミキサーを用いれば、２０℃以下に保持するとよい。
キノコの子実体を１ｍｍ幅にスライスし、これを上記の緩衝液に浸して、２時間放置しても効率よくキノコ抽出物を抽出することができる。
抽出液は、そのままに工程２に使用してもよいが、固液分離により固体部を除いて使用してもよい。固液分離には、遠心分離等の公知の手段を採用することができる。遠心分離を行う場合の条件は、相対遠心加速度２０００〜１００００×ｇで３〜３０分間が適当であり、冷却高速遠心分離機を用いて、４０００〜８０００×ｇで５〜２０分間遠心分離を行うのが好ましい。また、固体部を除くために濾過しても構わない。
まず、キノコの子実体を上記の緩衝液で均質化処理を行う。処理にはミキサーを使用するが、酵素の失活が起こらないような条件であれば、ミキサーの種類、攪拌・混合手法、時間等は特に限定されない。攪拌・混合の時間は、例えば家庭用のミキサーを用いた場合、一般的には、１〜１０分間程度が適しており、温度制御が可能なミキサーを用いれば、２０℃以下に保持するとよい。
キノコの子実体を１ｍｍ幅にスライスし、これを上記の緩衝液に浸して、２時間放置しても効率よくキノコ抽出物を抽出することができる。
抽出液は、そのままに工程２に使用してもよいが、固液分離により固体部を除いて使用してもよい。固液分離には、遠心分離等の公知の手段を採用することができる。遠心分離を行う場合の条件は、相対遠心加速度２０００〜１００００×ｇで３〜３０分間が適当であり、冷却高速遠心分離機を用いて、４０００〜８０００×ｇで５〜２０分間遠心分離を行うのが好ましい。また、固体部を除くために濾過しても構わない。
（工程２）
工程１で製造される抽出液には、キノコの可食部部分および石づき部分等に付着した菌類が含まれている。菌等を除くには、加熱処理、アルコール処理をおこなうことが多いが、タンパク分解酵素はこれらの処理により失活しやすく、本発明においては工程３において、フィルターの使用による除菌工程にて除菌する。
しかし、工程１での抽出液を直接に、工程３にて除菌すると目詰まりが生じ、生産効率が悪くなる。また、工程３を通過する抽出液は着色しており、キノコ特有の臭いがする。
本発明は、工程１と工程３の間において工程２を導入し、工程１で抽出した抽出液を、珪藻土を濾過助剤に使用して濾過することにより、これらの問題を同時に解決する。
工程１で製造される抽出液には、キノコの可食部部分および石づき部分等に付着した菌類が含まれている。菌等を除くには、加熱処理、アルコール処理をおこなうことが多いが、タンパク分解酵素はこれらの処理により失活しやすく、本発明においては工程３において、フィルターの使用による除菌工程にて除菌する。
しかし、工程１での抽出液を直接に、工程３にて除菌すると目詰まりが生じ、生産効率が悪くなる。また、工程３を通過する抽出液は着色しており、キノコ特有の臭いがする。
本発明は、工程１と工程３の間において工程２を導入し、工程１で抽出した抽出液を、珪藻土を濾過助剤に使用して濾過することにより、これらの問題を同時に解決する。
本発明において、使用する珪藻土は藻類の化石からなる堆積物である。例えば、珪藻土としてハイフロスパーセル、セルピュア、ラヂオライト、セライト等の製品名で販売されている製品を使用できる。
濾過助剤として珪藻土を使用する方法は、抽出液に珪藻土を混合しこれを濾過するボディーフィード法、また濾過助剤スラリーを循環し、濾材の表面に珪藻土の薄い被膜を形成し、抽出液を濾過させるプレコート法のいずれも採用できるが、本発明においてはプレコート法が、濾過材の目詰まり防止と清澄度の高い処理液を得ることができるので適している。
珪藻土の使用量は、ボディーフィード法では、抽出液１００質量部に対して０．５〜５質量部が適している。
プレコートに要する珪藻土の使用量は、ろ材の単位面積当り０．５〜２．０ｋｇ/ｍ２が好ましい。
プレコート法の前に、ボディーフィード法により工程１での抽出液を濾過することもできる。ボディーフィード法の濾過助剤として珪藻土、パーライト、活性炭、セルロース等が挙げられる。ろ過性能を上げるためには、本発明においてはセルロースの使用が適している。
この際のセルロースの使用量は工程１での抽出液１００質量部に対して、セルロース０．５〜５質量部を混合することが好ましい。セルロースとしては、ＫＣフロック、ソルカフロック、アルボセル、ファイブラセル等が挙げられる。
ろ材としては、ろ布、ろ紙が挙げられるが、カートリッジ式フィルターが好ましい。材質は、セルロースアセテート/ポリエステル、ポリエーテルサルホン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリビニールアルコール／ポリプロピレン、ポリビニールアルコール、ポリオレフィン繊維、コットン等が挙げられる。
濾過工程において、減圧濾過、０．０５ＭＰａ〜１．０ＭＰａの圧力での加圧濾過をしてもよい。
工程２において、工程１での抽出液をそのまま使用できるが、さらに緩衝液を加え、希釈しても構わない。
工程２において、濾過後のキノコ抽出物を含む抽出液は、脱色され、キノコ臭が軽減された抽出液となる。
濾過助剤として珪藻土を使用する方法は、抽出液に珪藻土を混合しこれを濾過するボディーフィード法、また濾過助剤スラリーを循環し、濾材の表面に珪藻土の薄い被膜を形成し、抽出液を濾過させるプレコート法のいずれも採用できるが、本発明においてはプレコート法が、濾過材の目詰まり防止と清澄度の高い処理液を得ることができるので適している。
珪藻土の使用量は、ボディーフィード法では、抽出液１００質量部に対して０．５〜５質量部が適している。
プレコートに要する珪藻土の使用量は、ろ材の単位面積当り０．５〜２．０ｋｇ/ｍ２が好ましい。
プレコート法の前に、ボディーフィード法により工程１での抽出液を濾過することもできる。ボディーフィード法の濾過助剤として珪藻土、パーライト、活性炭、セルロース等が挙げられる。ろ過性能を上げるためには、本発明においてはセルロースの使用が適している。
この際のセルロースの使用量は工程１での抽出液１００質量部に対して、セルロース０．５〜５質量部を混合することが好ましい。セルロースとしては、ＫＣフロック、ソルカフロック、アルボセル、ファイブラセル等が挙げられる。
ろ材としては、ろ布、ろ紙が挙げられるが、カートリッジ式フィルターが好ましい。材質は、セルロースアセテート/ポリエステル、ポリエーテルサルホン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリビニールアルコール／ポリプロピレン、ポリビニールアルコール、ポリオレフィン繊維、コットン等が挙げられる。
濾過工程において、減圧濾過、０．０５ＭＰａ〜１．０ＭＰａの圧力での加圧濾過をしてもよい。
工程２において、工程１での抽出液をそのまま使用できるが、さらに緩衝液を加え、希釈しても構わない。
工程２において、濾過後のキノコ抽出物を含む抽出液は、脱色され、キノコ臭が軽減された抽出液となる。
（工程３）
工程３において、フィルターに求める濾過孔径や除菌性能から、工程２での濾過後のキノコ抽出物を含む抽出液を、孔径０．２５〜０．８μｍのフィルターに通過させ除菌する。
０．２５μｍ未満のフィルターを使用すると濾過効率の作業性に影響し、０．８μｍを超えるフィルターに通過させても十分な除菌を行うことができない。
フィルターの材質としては、が好ましい。市販されている除菌フィルターとしては、ビバシュアＩＩ（商品名：キュノ（株）製、３０インチの円筒型カートリッジタイプ）などが挙げられる。
工程４において製造されるキノコ抽出物を含む抽出液は、その用途にもよるが、１０単位/ｇ以上のタンパク分解活性を有することが好ましい。
工程３において、フィルターに求める濾過孔径や除菌性能から、工程２での濾過後のキノコ抽出物を含む抽出液を、孔径０．２５〜０．８μｍのフィルターに通過させ除菌する。
０．２５μｍ未満のフィルターを使用すると濾過効率の作業性に影響し、０．８μｍを超えるフィルターに通過させても十分な除菌を行うことができない。
フィルターの材質としては、が好ましい。市販されている除菌フィルターとしては、ビバシュアＩＩ（商品名：キュノ（株）製、３０インチの円筒型カートリッジタイプ）などが挙げられる。
工程４において製造されるキノコ抽出物を含む抽出液は、その用途にもよるが、１０単位/ｇ以上のタンパク分解活性を有することが好ましい。
（工程４）
工程３により得られるキノコ抽出物を含む抽出液において、タンパク分解活性の主体はタンパク分解酵素であるが、その性質上、相互作用によって自己失活し、抽出物におけるタンパク分解活性を長期間に維持することが難しくなる
本発明で、抽出液に賦形剤を添加して乾燥し粉末化すると、長時間に保存することができる。賦形剤として乳糖、マルトオリゴ糖、デキストリン等の糖質類が好ましい。粉末化する際は、賦形剤を添加した酵素液を乾燥した後、粉砕用ブレンダーを使用して粉末化することが好ましい。乾燥方法は、減圧乾燥等が挙げられ、酵素が失活しないように低温で乾燥する必要がある。このため、凍結乾燥が好ましい。凍結乾燥の温度は、−３℃〜−４０℃、特に−２０℃付近が好ましい。
賦形剤の使用量は、キノコ抽出物１００質量部に対して２０〜４０質量部が好ましい。
賦形剤としては、デキストリンが好ましい。
工程４により製造される粉末は、その用途にもよるが、３０〜３００単位/ｇのタンパク分解活性を有することが好ましい。
工程３により得られるキノコ抽出物を含む抽出液において、タンパク分解活性の主体はタンパク分解酵素であるが、その性質上、相互作用によって自己失活し、抽出物におけるタンパク分解活性を長期間に維持することが難しくなる
本発明で、抽出液に賦形剤を添加して乾燥し粉末化すると、長時間に保存することができる。賦形剤として乳糖、マルトオリゴ糖、デキストリン等の糖質類が好ましい。粉末化する際は、賦形剤を添加した酵素液を乾燥した後、粉砕用ブレンダーを使用して粉末化することが好ましい。乾燥方法は、減圧乾燥等が挙げられ、酵素が失活しないように低温で乾燥する必要がある。このため、凍結乾燥が好ましい。凍結乾燥の温度は、−３℃〜−４０℃、特に−２０℃付近が好ましい。
賦形剤の使用量は、キノコ抽出物１００質量部に対して２０〜４０質量部が好ましい。
賦形剤としては、デキストリンが好ましい。
工程４により製造される粉末は、その用途にもよるが、３０〜３００単位/ｇのタンパク分解活性を有することが好ましい。
本発明について、実施例を用いて以下に説明する。
なお、各例におけるタンパク質分解酵素活性の測定は次の方法で行った。
（活性測定法）
０．６質量％カゼイン溶液（ＰＨ６．０）５ｍｌに試験（酵素）溶液１ｍｌを混合し、３８℃、６０分反応させた後、４００ｍＭトリクロロ酢酸溶液５ｍｌを加え攪拌し３８℃、３０分間放置後、上清２ｍｌを０．５５Ｍ炭酸ナトリウム溶液５ｍｌに加えさらに２倍希釈したフェノール試薬を１ｍｌ添加攪拌後、３８℃、３０分間放置し、６６０ｎｍの吸光度を測定する。上記の測定条件下で１秒間に１ｍｏｌのチロシンに相当する吸光度を増加させる酵素量を、酵素活性１単位（１ｕｎｉｔ）と定義する。
キノコ由来のタンパク質分解酵素活性を有する抽出物を粉末化した場合は、粉末を約１ｇ精密に秤り、２質量％塩化カリウム溶液５０ｍｌを加え攪拌溶解し、適宜希釈した液を試験溶液とし、活性を測定した。
なお、各例におけるタンパク質分解酵素活性の測定は次の方法で行った。
（活性測定法）
０．６質量％カゼイン溶液（ＰＨ６．０）５ｍｌに試験（酵素）溶液１ｍｌを混合し、３８℃、６０分反応させた後、４００ｍＭトリクロロ酢酸溶液５ｍｌを加え攪拌し３８℃、３０分間放置後、上清２ｍｌを０．５５Ｍ炭酸ナトリウム溶液５ｍｌに加えさらに２倍希釈したフェノール試薬を１ｍｌ添加攪拌後、３８℃、３０分間放置し、６６０ｎｍの吸光度を測定する。上記の測定条件下で１秒間に１ｍｏｌのチロシンに相当する吸光度を増加させる酵素量を、酵素活性１単位（１ｕｎｉｔ）と定義する。
キノコ由来のタンパク質分解酵素活性を有する抽出物を粉末化した場合は、粉末を約１ｇ精密に秤り、２質量％塩化カリウム溶液５０ｍｌを加え攪拌溶解し、適宜希釈した液を試験溶液とし、活性を測定した。
参考例
（安定ＰＨ）
ブナシメジ（雪国まいたけ（株））の子実体５００ｇをフードプロセッサーで粉砕したものに、各ＰＨを調整した１０００ｍｌの緩衝液を加え、攪拌しながら２時間抽出した。緩衝液として５０ｍＭのＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ＰＨ１．０〜３．０）、Ｃｉｔｒａｔｅ−ＮａＯＨ（ＰＨ３．０〜５．５）、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＮａＯＨ（ＰＨ５．５〜７．５）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ７．５〜９．０）、Ｇｌｙｃｉｎｅ-ＮａＯＨ（ＰＨ９．０〜１０．５）を使用した。各ＰＨで抽出した抽出液の上清液を上記の活性測定法に基づき、本発明のタンパク質分解酵素に及ぼすＰＨの影響を調べた。結果を図１に示した。図１により、本酵素は上記処理条件下においてＰＨ５〜７までのＰＨ領域で安定であることが分かる。
（安定ＰＨ）
ブナシメジ（雪国まいたけ（株））の子実体５００ｇをフードプロセッサーで粉砕したものに、各ＰＨを調整した１０００ｍｌの緩衝液を加え、攪拌しながら２時間抽出した。緩衝液として５０ｍＭのＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ＰＨ１．０〜３．０）、Ｃｉｔｒａｔｅ−ＮａＯＨ（ＰＨ３．０〜５．５）、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＮａＯＨ（ＰＨ５．５〜７．５）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ７．５〜９．０）、Ｇｌｙｃｉｎｅ-ＮａＯＨ（ＰＨ９．０〜１０．５）を使用した。各ＰＨで抽出した抽出液の上清液を上記の活性測定法に基づき、本発明のタンパク質分解酵素に及ぼすＰＨの影響を調べた。結果を図１に示した。図１により、本酵素は上記処理条件下においてＰＨ５〜７までのＰＨ領域で安定であることが分かる。
（緩衝液の最適濃度）
クエン酸およびクエン酸三ナトリウムからなるクエン酸緩衝液を１０ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、３００ｍＭ、５００ｍＭ（すべてＰＨ６．０に設定）になるように調整した。ブナシメジ（雪国まいたけ（株））の子実体５００ｇをフードプロセッサーで粉砕したものに、各濃度の１０００ｍｌの緩衝液を加え、攪拌しながら２時間抽出した。こうして得られた抽出液の上清液を上記の酵素活性に基づき測定した。図２により、本酵素は上記処理条件下において塩濃度１０〜３００ｍＭの緩衝液で安定であることが分かる。
クエン酸およびクエン酸三ナトリウムからなるクエン酸緩衝液を１０ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、３００ｍＭ、５００ｍＭ（すべてＰＨ６．０に設定）になるように調整した。ブナシメジ（雪国まいたけ（株））の子実体５００ｇをフードプロセッサーで粉砕したものに、各濃度の１０００ｍｌの緩衝液を加え、攪拌しながら２時間抽出した。こうして得られた抽出液の上清液を上記の酵素活性に基づき測定した。図２により、本酵素は上記処理条件下において塩濃度１０〜３００ｍＭの緩衝液で安定であることが分かる。
実施例１
クエン酸およびクエン酸三ナトリウムからなる５０ｍＭクエン酸緩衝液（ＰＨ６．０）を調整した。ブナシメジ（雪国まいたけ（株））の子実体５００ｇを１ｍｍ幅にスライスし、これを１０００ｍｌのクエン酸緩衝液に浸して、２時間攪拌し抽出した。
こうして得られた抽出液を２５ｇの珪藻土（ハイフロスパーセル）でプレコートしたフィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過し、その濾液１０ｍｌを除菌フィルター（孔径０．４５μｍ、ポリエーテルサルホン製）を通過した抽出液について、酵素活性を測定した。結果を表１に示す。
クエン酸およびクエン酸三ナトリウムからなる５０ｍＭクエン酸緩衝液（ＰＨ６．０）を調整した。ブナシメジ（雪国まいたけ（株））の子実体５００ｇを１ｍｍ幅にスライスし、これを１０００ｍｌのクエン酸緩衝液に浸して、２時間攪拌し抽出した。
こうして得られた抽出液を２５ｇの珪藻土（ハイフロスパーセル）でプレコートしたフィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過し、その濾液１０ｍｌを除菌フィルター（孔径０．４５μｍ、ポリエーテルサルホン製）を通過した抽出液について、酵素活性を測定した。結果を表１に示す。
実施例２
マイタケ（雪国まいたけ（株））の子実体５００ｇを１ｍｍ幅にスライスし、これを１０００ｍｌのクエン酸緩衝液に浸して、２時間攪拌し抽出した。
こうして得られた抽出液を２５ｇの珪藻土（ハイフロスパーセル）でプレコートしたフィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過し、その濾液１０ｍｌを除菌フィルター（孔径０．４５μｍ、ポリエーテルサルホン製）を通過した抽出液について、酵素活性を測定した。結果を表１に示す。
マイタケ（雪国まいたけ（株））の子実体５００ｇを１ｍｍ幅にスライスし、これを１０００ｍｌのクエン酸緩衝液に浸して、２時間攪拌し抽出した。
こうして得られた抽出液を２５ｇの珪藻土（ハイフロスパーセル）でプレコートしたフィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過し、その濾液１０ｍｌを除菌フィルター（孔径０．４５μｍ、ポリエーテルサルホン製）を通過した抽出液について、酵素活性を測定した。結果を表１に示す。
比較例１
ブナシメジ（雪国まいたけ（株））の子実体５００ｇを１ｍｍ幅にスライスし、これを１０００ｍｌの水に浸して、２時間攪拌し抽出した。
こうして得られた抽出液を２５ｇの珪藻土（ハイフロスパーセル）でプレコートしたフィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過し、その濾液１０ｍｌを除菌フィルター（孔径０．４５μｍ、ポリエーテルサルホン製）を通過した抽出液について、酵素活性を測定した。結果を表１に示す。
ブナシメジ（雪国まいたけ（株））の子実体５００ｇを１ｍｍ幅にスライスし、これを１０００ｍｌの水に浸して、２時間攪拌し抽出した。
こうして得られた抽出液を２５ｇの珪藻土（ハイフロスパーセル）でプレコートしたフィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過し、その濾液１０ｍｌを除菌フィルター（孔径０．４５μｍ、ポリエーテルサルホン製）を通過した抽出液について、酵素活性を測定した。結果を表１に示す。
比較例２
マイタケ（雪国まいたけ（株））の子実体５００ｇを１ｍｍ幅にスライスし、これを１０００ｍｌの水に浸して、２時間攪拌し抽出した。
こうして得られた抽出液を２５ｇの珪藻土（ハイフロスパーセル）でプレコートしたフィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過し、その濾液１０ｍｌを除菌フィルター（孔径０．４５μｍ、ポリエーテルサルホン製）を通過した抽出液について、酵素活性を測定した。結果を表１に示す。
マイタケ（雪国まいたけ（株））の子実体５００ｇを１ｍｍ幅にスライスし、これを１０００ｍｌの水に浸して、２時間攪拌し抽出した。
こうして得られた抽出液を２５ｇの珪藻土（ハイフロスパーセル）でプレコートしたフィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過し、その濾液１０ｍｌを除菌フィルター（孔径０．４５μｍ、ポリエーテルサルホン製）を通過した抽出液について、酵素活性を測定した。結果を表１に示す。
表１の実施例及び比較例を対比すると、本発明において緩衝剤を含まない条件（水）で抽出すると酵素活性が低下することがわかる。
実施例３
実施例１と同様の方法でクエン酸緩衝液に浸して、ブナシメジから抽出物を抽出した。この抽出液１００質量部に対して、珪藻土（ハイフロスーパーセル）を１質量部添加し、ボディーフィードにより、フィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過し、助剤の濾過性能を評価した。次に、その濾液１０ｍｌをシリンジに入れ、除菌フィルター（孔径０．４５μｍ、ポリエーテルサルホン製）を通過させたときの濾過性を評価した。また、この工程の脱色及びキノコ臭に対する効果を評価した。結果を表２に示す。
実施例１と同様の方法でクエン酸緩衝液に浸して、ブナシメジから抽出物を抽出した。この抽出液１００質量部に対して、珪藻土（ハイフロスーパーセル）を１質量部添加し、ボディーフィードにより、フィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過し、助剤の濾過性能を評価した。次に、その濾液１０ｍｌをシリンジに入れ、除菌フィルター（孔径０．４５μｍ、ポリエーテルサルホン製）を通過させたときの濾過性を評価した。また、この工程の脱色及びキノコ臭に対する効果を評価した。結果を表２に示す。
比較例３
実施例１と同様の方法でクエン酸緩衝液に浸して、ブナシメジから抽出物を抽出した。この抽出液１００質量部に対して、セルロース（ＫＣクロックＷ−１００）を１質量部添加し、ボディーフィードにより、フィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過し、その濾液１０ｍｌをシリンジに入れ、除菌フィルター（孔径０．４５μｍ、ポリエーテルサルホン製）に通過させ、実施例３と同様に評価した。結果を表２に示す。
実施例１と同様の方法でクエン酸緩衝液に浸して、ブナシメジから抽出物を抽出した。この抽出液１００質量部に対して、セルロース（ＫＣクロックＷ−１００）を１質量部添加し、ボディーフィードにより、フィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過し、その濾液１０ｍｌをシリンジに入れ、除菌フィルター（孔径０．４５μｍ、ポリエーテルサルホン製）に通過させ、実施例３と同様に評価した。結果を表２に示す。
実施例４
ブナシメジ（雪国まいたけ（株））の子実体５００ｇを１ｍｍ幅にスライスし、これを１０００ｍｌのクエン酸緩衝液に浸して、２時間攪拌し抽出した。
こうして得られた抽出液を２５ｇの珪藻土（ハイフロスパーセル）でプレコートしたフィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過し、その濾液１０ｍｌをシリンジに入れ、除菌フィルター（孔径０．４５μｍ、ポリエーテルサルホン製）を通過させ、実施例３と同様に評価した。結果を表２に示す。
ブナシメジ（雪国まいたけ（株））の子実体５００ｇを１ｍｍ幅にスライスし、これを１０００ｍｌのクエン酸緩衝液に浸して、２時間攪拌し抽出した。
こうして得られた抽出液を２５ｇの珪藻土（ハイフロスパーセル）でプレコートしたフィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過し、その濾液１０ｍｌをシリンジに入れ、除菌フィルター（孔径０．４５μｍ、ポリエーテルサルホン製）を通過させ、実施例３と同様に評価した。結果を表２に示す。
実施例５
実施例１と同様の方法でクエン酸緩衝液に浸して、ブナシメジから抽出物を抽出した。この抽出液１００質量部に対して、珪藻土（ハイフロスーパーセル）を１質量部添加し、ボディーフィードにより、フィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過した。得られた濾液を２５ｇの珪藻土（ハイフロスパーセル）でプレコートしたフィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過し、その濾過液１０ｍｌをシリンジに入れ、除菌フィルター（孔径０．４５μｍ、ポリエーテルサルホン製）を通過させ、実施例３と同様に評価した。結果を表２に示す。
実施例１と同様の方法でクエン酸緩衝液に浸して、ブナシメジから抽出物を抽出した。この抽出液１００質量部に対して、珪藻土（ハイフロスーパーセル）を１質量部添加し、ボディーフィードにより、フィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過した。得られた濾液を２５ｇの珪藻土（ハイフロスパーセル）でプレコートしたフィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過し、その濾過液１０ｍｌをシリンジに入れ、除菌フィルター（孔径０．４５μｍ、ポリエーテルサルホン製）を通過させ、実施例３と同様に評価した。結果を表２に示す。
比較例４
実施例１と同様の方法でクエン酸緩衝液に浸して、ブナシメジから抽出物を抽出した。この抽出液をフィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過した。次に、その濾液１０ｍｌをシリンジに入れ、除菌フィルター（孔径０．４５μｍ、ポリエーテルサルホン製）を通過させたときの濾過性を評価した。また、この工程の脱色及びキノコ臭に対する効果を評価した。結果を表２に示す。
実施例１と同様の方法でクエン酸緩衝液に浸して、ブナシメジから抽出物を抽出した。この抽出液をフィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過した。次に、その濾液１０ｍｌをシリンジに入れ、除菌フィルター（孔径０．４５μｍ、ポリエーテルサルホン製）を通過させたときの濾過性を評価した。また、この工程の脱色及びキノコ臭に対する効果を評価した。結果を表２に示す。
濾過性能：
◎ 全体量が迅速に濾過できる。
○ 濾過速度が遅くなるが良好に濾過できる。
△ やや目詰るが濾過できる。
× 目詰る。
除菌フィルターの濾過性：
◎ 抵抗なく濾過できる。
○ やや抵抗あり。
△ 抵抗あるが濾過できる。
× 濾過できず。
脱色性（濾液の色）：
◎ 殆ど着色なし。
○ やや着色。
△ 薄い茶色。
× 濃い茶色。
脱臭性（キノコ臭）：
◎ 臭いが殆どなし。
○ 臭いがややある。
△ 臭いがある。
× 臭いが強い。
◎ 全体量が迅速に濾過できる。
○ 濾過速度が遅くなるが良好に濾過できる。
△ やや目詰るが濾過できる。
× 目詰る。
除菌フィルターの濾過性：
◎ 抵抗なく濾過できる。
○ やや抵抗あり。
△ 抵抗あるが濾過できる。
× 濾過できず。
脱色性（濾液の色）：
◎ 殆ど着色なし。
○ やや着色。
△ 薄い茶色。
× 濃い茶色。
脱臭性（キノコ臭）：
◎ 臭いが殆どなし。
○ 臭いがややある。
△ 臭いがある。
× 臭いが強い。
表２より、濾過助剤として珪藻土を使用すると、濾過性能を向上させ、その後の除菌フィルターの通過時の抵抗を軽減でき、抽出液の脱色及び脱臭ができることがわかる。
セルロースおよび珪藻土の濾過助剤を併用させることにより、効果を高めることができることがわかった。
セルロースおよび珪藻土の濾過助剤を併用させることにより、効果を高めることができることがわかった。
実施例６
実施例１で珪藻土でプレコートしたフィルターを用いて濾過した濾液に対して、フィルター処理の前後の酵素活性と一般生菌数を測定した。結果を表３に示す。
実施例１で珪藻土でプレコートしたフィルターを用いて濾過した濾液に対して、フィルター処理の前後の酵素活性と一般生菌数を測定した。結果を表３に示す。
除菌フィルター処理しても、酵素活性の低下が見られず、問題はなかった。またフィルター処理することで、十分に除菌することができた。
実施例７
クエン酸およびクエン酸三ナトリウムからなる５０ｍＭクエン酸緩衝液（ＰＨ６．０）を調整した。ブナシメジ（雪国まいたけ（株））の子実体１ｋｇを１ｍｍ幅にスライスし、これを１００００ｍｌのクエン酸緩衝液に浸して、２時間攪拌し抽出した。
この抽出液１００質量部に対して、珪藻土（ハイフロスーパーセル）を１質量部添加し、ボディーフィードにより、フィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過した。得られた濾液を２５ｇの珪藻土（ハイフロスパーセル）でプレコートしたフィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過した。
濾液を除菌フィルター（３０インチ円筒型カートリッジタイプ、孔径０．４５〜０．８μｍ、キュノ（株）製、商品名：ビバシュアII）を通過させ抽出液を作製した。この抽出液１ｋｇに対してデキストリン（松谷化学工業（株）製、商品名：パインデックス♯２）を３００ｇ添加した後、−２０℃にて凍結乾燥を２日間行い、キノコ抽出物を含む粉末を作製した。このタンパク質分解酵素を含む粉末について、２０℃の保存条件において３カ月後の安定性について調べた。結果を表４に示す。
クエン酸およびクエン酸三ナトリウムからなる５０ｍＭクエン酸緩衝液（ＰＨ６．０）を調整した。ブナシメジ（雪国まいたけ（株））の子実体１ｋｇを１ｍｍ幅にスライスし、これを１００００ｍｌのクエン酸緩衝液に浸して、２時間攪拌し抽出した。
この抽出液１００質量部に対して、珪藻土（ハイフロスーパーセル）を１質量部添加し、ボディーフィードにより、フィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過した。得られた濾液を２５ｇの珪藻土（ハイフロスパーセル）でプレコートしたフィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過した。
濾液を除菌フィルター（３０インチ円筒型カートリッジタイプ、孔径０．４５〜０．８μｍ、キュノ（株）製、商品名：ビバシュアII）を通過させ抽出液を作製した。この抽出液１ｋｇに対してデキストリン（松谷化学工業（株）製、商品名：パインデックス♯２）を３００ｇ添加した後、−２０℃にて凍結乾燥を２日間行い、キノコ抽出物を含む粉末を作製した。このタンパク質分解酵素を含む粉末について、２０℃の保存条件において３カ月後の安定性について調べた。結果を表４に示す。
実施例８
クエン酸およびクエン酸三ナトリウムからなる５０ｍＭクエン酸緩衝液（ＰＨ６．０）を調整した。マイタケ（雪国まいたけ（株））の子実体１ｋｇを１ｍｍ幅にスライスし、これを１００００ｍｌのクエン酸緩衝液に浸して、２時間攪拌し抽出した。
この抽出液１００質量部に対して、珪藻土（ハイフロスーパーセル）を１質量部添加し、ボディーフィードにより、フィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過した。得られた濾液を２５ｇの珪藻土（ハイフロスパーセル）でプレコートしたフィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過した。
濾液を除菌フィルター（３０インチ円筒型カートリッジタイプ、孔径０．４５〜０．８μｍ、キュノ（株）製、商品名：ビバシュアII）を通過させ抽出液を作製した。この抽出液１ｋｇに対してデキストリン（松谷化学工業（株）製、商品名：パインデックス♯２）を３００ｇ添加した後、−２０℃にて凍結乾燥を２日間行い、キノコ抽出物を含む粉末を作製した。このタンパク質分解酵素を含む粉末について、２０℃の保存条件において３カ月後の安定性について調べた。結果を表４に示す。
クエン酸およびクエン酸三ナトリウムからなる５０ｍＭクエン酸緩衝液（ＰＨ６．０）を調整した。マイタケ（雪国まいたけ（株））の子実体１ｋｇを１ｍｍ幅にスライスし、これを１００００ｍｌのクエン酸緩衝液に浸して、２時間攪拌し抽出した。
この抽出液１００質量部に対して、珪藻土（ハイフロスーパーセル）を１質量部添加し、ボディーフィードにより、フィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過した。得られた濾液を２５ｇの珪藻土（ハイフロスパーセル）でプレコートしたフィルター（東洋濾紙Ｎｏ２、直径１８．５ｃｍ）を用いて減圧濾過した。
濾液を除菌フィルター（３０インチ円筒型カートリッジタイプ、孔径０．４５〜０．８μｍ、キュノ（株）製、商品名：ビバシュアII）を通過させ抽出液を作製した。この抽出液１ｋｇに対してデキストリン（松谷化学工業（株）製、商品名：パインデックス♯２）を３００ｇ添加した後、−２０℃にて凍結乾燥を２日間行い、キノコ抽出物を含む粉末を作製した。このタンパク質分解酵素を含む粉末について、２０℃の保存条件において３カ月後の安定性について調べた。結果を表４に示す。
図４の結果より、ブナシメジおよびマイタケともに、本発明の抽出物の含む粉体は、３ヶ月経過後も酵素活性が低下せず安定性の高いことが分かる。
Claims (2)
- 下記の工程１〜３を含む、タンパク分解活性を有するキノコ抽出物の製造方法。
工程１：キノコから、ＰＨ５〜７及び塩濃度１０〜３００ｍＭの緩衝液でキノコ抽出物を抽出する工程。
工程２：前記工程で抽出した抽出液を、珪藻土を濾過助剤に使用して濾過する工程。
工程３：前記工程で濾過した抽出液を、孔径０．２５〜０．８μｍのフィルターに通過させ除菌する工程。 - 下記の工程１〜４を含む、タンパク分解活性を有するキノコ抽出物を含む粉末の製造方法。
工程１：キノコから、ＰＨ５〜７及び塩濃度１０〜３００ｍＭの緩衝液でキノコ抽出物を抽出する工程。
工程２：前記工程で抽出した抽出液を、珪藻土を濾過助剤に使用して濾過する工程。
工程３：前記工程で濾過した抽出液を、孔径０．２５〜０．８μｍのフィルターに通過させ除菌する工程。
工程４：前記工程でフィルターを通過させた抽出液に賦形剤を添加し乾燥する工程。
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