JPH01291795A - プロリン残基特異的ペプチダーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はプロリン残基特異的ペプチダーゼ（以下プロリ
ンペプチダーゼという）の新規な製造法に関する。

〔従来の技術〕

プロリンペプチダーゼはペプチド鎖中のプロリン残基の
カルボキシル側のペプチド結合を特異的に認証し、切断
するペプチダーゼであり、プロリンゴミ／ペプチダーゼ
（ＥＣ！　３．４．１１．５）、ジペプチジルペプチダ
ーゼ■（ｘｃ　３．４．１．４．５）、プロリンエンド
ペプチダーゼ（Ｉｃｃ　３．４．２１．２６　）等が動
物、植物、細菌等から採取されている。

ペプチド鎖中のある特定のアミノ酸残基を認識し、特異
的ζこペプチド結合を切断Ｔる酵業は蛋白質の一次構造
解析に２いても非常に有用であり、その需要は今後増大
Ｔると考えられる。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は上記現状にかんがみてなされたものであり、動
物、植物、細菌以外の給源より前記３種類のプロリンペ
プチダーゼを製造Ｔる方法を提供することを目的とする
〇 〔課題を解決するための゛手段〕 本発明を概説すれば、本発明はプロリンペプチダーゼの
製造方法に関し、プロリンペプチダーゼ生産能を有する
担子菌の子実体または菌糸体を含有する培養物よりプロ
リンペプチダーゼを製造することを特徴とする特 不発明番こ便用する担子菌は公知の担子菌を利用でき、
こｎらにはシメジｋｊ４　（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ　）
に属する菌、例えばシャカシメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕ
ｍａｉｎｅｒａａｏｓｎａ　）　ｉハラタケＰＡ（Ａｇ
ｒｉｃｕｓ　）　ｌこ属する菌、例えばツクリタケ（Ａ
ｇｒｉｏｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ）ｉチチタケ属（Ｌａ
ｃｔａｒｉｕｅ　）に属する菌、例えばヒロハチチタケ
（Ｌａｃｔａｒｉｕ８ｈｙｇｒｏｐｈｏｒｏｉｉｅｓ　
）ｉベニタケ属（Ｒｕ５ｓｕｌａ　）　ｌこ属する菌、
例えばヤプレベニタケ（Ｒｕ５ｓｕｌａ　１ｅｐｉｄａ
　）ｉキシメジ属（Ｔｒｉａｏｌｏｍａ　）に属する菌
、例えばマツタケ（Ｔｒｉｃｏｌｏｍａ　ｍａｔａｕｔ
ａｋｅ　）　；　　スギタケ属（Ｆｈｏｌｉｏｔａ）に
属する菌、例えはナメ：＋　（Ｐｈｏｌｉｏｔａ　ｎａ
ｍｓｋｏ　）ｉエノキタケ属（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）
　ｉこ属する菌、例えばエノキタケ（Ｆｌａｍｍｕ：Ｌ
ｉｎａ　ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ　）　ｉイボタケ属（５ａ
ｒｃｏｄｏｎ　）に属する菌、例えはツウタケ（５ａｒ
ｃｏｄｏｎ　ａｓｐｒａｔｕｓ　）　；ヌメ１」イグチ
属（Ｓｕｉｌｌｕｓ　）に属する菌、例えばアミタケ（
Ｓｕ土１１ｕｓｂｏｖ１ｎｕｓ　）があり、これらの属
に属する担子菌で本発明のプロリンペプチダーゼ生産能
を有する菌であれば丁べて使用することができる。

本発明によるプロリンペプチダーゼは担子菌子実体から
も、菌糸体を含有する培養物からも採取できる。

本発明に用いる子実体は、食用きのことして市販されて
いる物を用いるのが簡便であるが、人工裁培法の確立し
ている担子菌については、市販種菌を入手し、子実体を
人工的に形成させ用いるのも良い。

菌糸体を含む培養物よりプロリンペプチダーゼを採取す
る場合は、入手した子実体より菌糸体を純粋分離し用い
れば良いが、市販の種菌を用い培養するのが簡便である
。培養は通常固体培養方法でも、液体培養方法でも実施
できる。

固体培養法とは寒天、ゼラチン、澱粉、鋸屑、木材、パ
ルプ、麦芽、米糠、大豆粉、その他の公知の固体培地あ
るいはそれらを適宜組合せた固体培地による培養法であ
り、液体培養法とは下記の栄養成分を含んだ液体培地に
よる静置、振トウ、通気８よび撹拌培養のことである。

液体培養のため培地番こ加える栄養源は使用する菌株が
利用し得るものであればよく、炭素源としては例えばデ
ンプン、グルコース、シュークロース、マルトース、ラ
クトース、デキストリン、糖を等が利用でき、窒素源と
しては酵母エキス、ペプトン、コーンステイープリカー
、大豆粉、脱脂大豆、小麦フスマ等が適当である。その
他にリン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜
鉛塩等の無陶塩類を加えてもよく、更にはビタミン類、
生長因子を加えてもよ０゜担子菌を培養するζこ当１こ
り、プロリンペプチダーゼの生産量は培養条件により変
動するが、一般には培養温度は１５〜３５℃、培地のｐ
Ｈ４〜７が良く、培養時間は３〜３０日間である。

培養条件は使用する菌種、培地組成等に応じ、プロリン
ペプチダーゼが最大になるように設定するのは当然であ
る。

子実体、または菌糸体を含む培養物はホモジナイズ、超
音波処理、ガラスピーズ（こよる振動破壊、凍結融解等
の方法で破砕さｎ１可溶化された酵素は、遠心分離、沖
過等で採取される力５、その調製方法は特（こ限定はな
い。

プロリンペプチダーゼ活性の測定に２いて、プロリンエ
ンドペプチダーゼ活性は、Ｎ−ベンジルオキシカルボニ
ルグリシルプロリル−β−ナフチルアミドを基質とし、
ジペブチジルヘフチダーゼ活性はグリシルプロリル−β
−ナフチルアミドを基質とし、プロリンイミノペプチダ
ーゼ活性はプロリル−β−ナフチルアミドを基質とした
。具体的にはｐＨ７，０の２０ｍＭのトリス−塩酸バッ
ファー（１３ｍｅに０．１−の上記酵素溶液を混合し、
３７℃で３分間プレインキユベートシ、次いで４０重量
％ジオキサンに５ｍＭの濃度で溶解した基質Ｑ、１ｍｆ
’を添加し、酵素反応を開始する。１０分間反応後１０
％トリトンＸ−１００含−’ＮＩＭ酢酸バッファーにＯ
０１重址％濃度で溶解したファストガーネットＧＢＯ塩
Ｑ、　５　ｍｅを添加し反応を停止する。反応液の５５
０ｎｍの吸光度を測定し、１分間に１メＭのβ−ナフチ
ルアミンを遊離させる酵素力価をそれぞれの酵素の一単
位（Ｕ）とする。

各酵素活性は子実体、菌糸体を含む培養物をホモジナイ
ズし、そのホモジネートを遠心分離した遠心上澄液を用
いてそれぞれ測定することができる。遠心上澄液中の各
酵素、または前記の方法で可溶化された各酵素は硫安塩
析、透析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル沖過等
の一般的蛋白質精製方法で精製することができる。

〔実施例〕

次に本発明の実施例を示すが、これら実施例は何等本発
明方法を限定するものではない。文中％は他に特記せぬ
限り重量％である。

実施例　１ シャカシメジ（市販品）子実体傘部を洗浄し、細断した
後その中１１を２０ｍＭ）’Ｊスー塩さバッファー２ｒ
ｎｌ中でホモジナイズし、その後遠心分離してその上澄
液中のプロリンエンドペプチダーゼ、ジペプチジルペプ
チダーゼ、プロリンイミノペプチダーゼ活性を測定した
。また同様の処理を市販のツクリタケ、マツタケ、ヒロ
ハチチタケ、ヤプレベニタケ、ナメコ、エノキタケ、コ
ウタケ、アミタケの子実体番こついても行い、各々につ
いてプロリンペプチダーゼ活性を測定した。結果を第１
表に示す。第１表に示すように各子実体中にそｎぞれプ
ロリンペプチダーゼが存在Ｔる。

第１衣担子菌子実体傘部中乃プロリンペプチダーゼ実施
例　２ グルツース２％、酵母エキス０．３％、ヘフトン１％、
ＫＨ２ＰＯ４０，３％、ＭｇＳＯ４”　７　Ｈｌｏ　　
０．１％の組成の培地１００ｒｎｌを５００　ｔｎｅ容
の三角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間殺菌した
後冷却し、これにツクリタケ（市販種菌：森本養菌園製
）を接種し、２５℃で１６日間、毎分１００回転で振ト
ウ培養した。菌糸体を含む培養液をホモジナイズし、そ
の遠心分離した上澄液の酵素活性を測定した。この上澄
液には１．０４Ｕ　／　ｍｅのプロリンエンドペプチダ
ーゼ活性が測定された。

実施例　３ 市販シャカシメジ子実体２８０２を洗浄、細断後２０ｍ
Ｍトリス−塩酸バッファー５６０　ｍｅ中でホモジナイ
ズし、そのホモジネートを遠心分離し、その上澄液８０
０ｒｎＩ！を得た。次に遠心上澄液に硫安を添加して４
０％飽和硫安溶液とし、共雑物質を沈澱させ除去した後
、再び硫安を添加、８０％飽和硫安溶液とした後、析出
する硫安沈澱を得た。沈澱を少量のバッファーに溶解）
セファデックスＧ−２５を用いて脱塩後、ＤＥＡＥ−ト
ヨパールカラム（２，５Ｘ　３０　ｃｍ）に吸着させた
後、０．５　Ｍ　　ＮａＯ４グラデイエンドで浴出させ
た０浴出酵素画分中の酵素は８０％飽和硫安で塩析させ
た。沈澱は再び小量のバッファーに溶解後、セファデッ
クスＧ−２５で脱塩し、ＤＥＡＥ−セファデックスカラ
ム（２，５Ｘ　３０　ｃｍ　）に吸着させた後、０．５
　Ｍ　　ＮａＣ６グラデイエンドで溶出させた。活性画
分をアミコン１０を用いた超遠心処理で濃縮した後セフ
ァデックスＧ−２５で脱塩した。脱塩した酵素画分をハ
イドロキシアパタイトカラム（１，８Ｘ１０ＣＩＩ＋）
に吸着させた後５ｍＭから５００ｍＭのリン酸バッファ
ー（ｐＨ７，０）でグラデイエンド溶出を行った。活性
画分ヲ超遠心濃縮後、ＤＥＡＥ　−５ＦＷカラム（０，
７５Ｘ　７．５　ａｍ　）を用いた高速液体クロマトグ
ラ７−を行った。溶出液は２０ｍＭ）、リスー塩酸バッ
ファ＝　（１）Ｈ７，Ｏ）でＮＩＬＣｔでグラデイエン
ド溶出とし、流速０．７　ｍｅ　／　＝、１８℃で行っ
た。精製工程を第２表に示す。第２表に示すようにプロ
リンエンドペプチダーゼは約１８００倍に精製された。

Ｌ発明の効果〕 以上詳細に説明したように、不発明番こより蛋白質工学
的試薬として有用なプロリンペプチ々。

−ゼの製造法が新た（こ提供さｎた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、シメジ属、ハラタケ属、チチタケ属、ベニタケ属、
   キシメジ属、スギタケ属、エノキタケ属、イボタケ属ま
   たはヌメリイグチ属に属するプロリン残基特異的ペプチ
   ダーゼ生産能を有する担子菌の子実体または菌糸体を含
   有する培養物よりプロリン残基特異的ペプチダーゼを採
   取することを特徴とするプロリン残基特異的ペプチダー
   ゼの製造方法。