JPS61187787A - ポリペプチド製品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な微生物的に誘導されたα−ガラクトシ
ダーゼ製品に関する。新規な酵素はα−ガラクマンナン
ガラクトシダーゼと命名された。 〔発明の背景〕 Ｄ−ガラクト−Ｄ−マンナンは、幾つかの豆果の種子の
内乳に見出される貯蔵炭水化物である〇ガラクトマンナ
ンは、β−Ｄ（１−４）−マンナンポリマー骨格からな
り、これに種々の量の単一（１−６）−α−Ｄ−ガラク
トピラノシル基が結合したものである。 ガラクトマンナンは、食品、動物のえさの成分として、
更に化粧、医薬および他の工業的用途に用いられる。典
形的には、ガラクトマンナンはキサンタンゴム、カラゲ
ナンゴム、寒天およびアガロースの如きポリマーをガラ
クトマンナンに添加することにより、インターアクティ
ブ　ゲル（１ｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ　ｇｅｌ）の製造に
用いられる。この相互作用は、後にゲル化能として言及
されている◎しかるに、もしもガラクトマンナン中のガ
ラクトースとマンナンとの割合が非常に高い場合、ゲル
は著るしく又は全熱形成されず、これは以下にゲル化能
不良又はゲル化能なしとして言及されるロゲル化能不曳
又はゲル化能なしの問題は、例えばルセルネ（１ｕｃｅ
ｒｎｅ　）種子α−ガラクトシダーゼの如き植物から回
収されたα−グラクトシダーゼを用いてガラクトマンナ
ンからガラクトピラノシル基の幾〈つかを除去するとと
くより解決できる（　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒａｇ、
　Ｌユ（１９７９）、２１２、および９２（１９８１）
、２６９を参照）。また、植物から回収された他のα−
ガラクトシダーゼは比較的活性を有する例えば、米国特
許４，３３２，８９４を参照。しかし、植物から回収さ
れたα−ガラクトシダーゼは比較的に高価である。 満足なインターアクティブゲル形成をなさせめる十分に
低含量のガラクトピラノシル基を有するガラクトマンナ
ンを製造するためＩＣは、例えばグアガラクトマンナン
の如き、ガラクトマンナンから少なくとも約１０％Ｃ重
量／重量）のガラクトース含量を放出することが必要で
ある口重発明中のガラクトマンナンから放出されるガラ
クトースのパーセントは、特に言及しない限りガラクト
マンナン出発物質中のガラクトース含量に基づいている
。 ガラクトースとマンナンとの所望の低割合を有するガラ
クトマンナンの製造するために、ガラクトピラノシル基
の酵素的除去を、高含量のガラクトマンナンを有する反
応媒質中で行うことができる＾好ましくは、反応媒質中
のガラクトマンナンの含量＆１２〜Ｏチ（重量／重量）
、好ましくｕ８〜５（１（重量／重量）の範囲内である
ロヨーロヴパ特許出願第８４２００３０４．８参照。し
かし、ガラクトピラノシル基の酵素的除去もまた２チガ
ラクトマンナン以下を含有する培化中で好都合に行うこ
とができるロ アヌペルギルス　ニーガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎ
％ｇｅｒ　）由来のα−ガラクトシダーゼがグア粉およ
びロキュスト　ビーン　ガム（１ｏｃｕｓｔ　　ｂｅａ
ｎｇａｍ　）を水解するが報告され几（Ｊ、　Ｂａｅｔ
ｅｒｊｏｌ−１２９（１９７７）、８５０以降、および
Ｊ、　Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｍ、’２２４　（１９６９）、２９７５以降参照
）りこの結果は、先ずガラクトマンナンのマンナン骨格
を分裂させ次いでこれによりα−ガラクトシダーゼの攻
撃を麿さしめる、エンド−β−マンナンナーゼの実質的
量で汚染されたアスペルギルスニーガーを用いることに
帰因した。公知のアスペルギルスニーガーから得られる
ガラクトマンナンはゲル化能不良又はゲル化能なしであ
る０ヨーロツパ特許出願８４２００３０４．８の７頁の
下部にはアスペルギルスニーゴーα−ガラクトシダーゼ
がβ−マンナナーゼですでに解重合されたグアガラクト
マンナンを水解することが述べられているりβ−マンナ
ンナーゼは大抵のＷ＊から生産される酵素である。β−
マンナンナーゼけβ−Ｄ−（１−４）−マンナン結合を
分解するり Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２４５　（１９７０）
　、　７８６中には、モティエレラ　ビナモアーα−ガ
ラクトシダーゼは豆果種のガラクトマンナンからのＤ−
ガラクトースを水解しないことが報告されている内また
。バクテリオデスオパトウスからのα−ガラクトシダー
ゼＸおよびα−ガラクトシダーゼＩは、完全なグアゴム
からガラクトース残留物を除去することができなかった
（　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１６１（１９８５
）、５００参照）。 数種の他の微生物α−グルコシダーゼは当業者に公知で
あるう本発明者らはＡｐｐｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。 Ｍｉａｒｏｂｉｏｌ、　１８　（１９８２）　１頁以降
に掲げられているものを含めて大部分の雑菌＋Ｌｍから
選ばれた約２００種の異なるＩｉ類および細菌の菌株を
、α−ガラクトシダーゼ生産に対しスクリーニング試験
したう全てのこれらの試験は、もしもマンナン骨格が分
解しない場合、ガラクトマンナンからＤ−ガラクトピラ
ノシル基を分裂させ得ないことが見出された。 〔発明の目的〕 本発明の目的は、マンナン骨格を実質的に分解すること
なく、ガラクトマンナンから相当量のガラクトースを分
裂させ得る微生物のα−グラクトシダーゼを提供するこ
とにある。新規α−ガラクトシダーゼＦｉ、本発明中α
−ガラクトマンナンガラクトシダーゼと呼ばれる。それ
らの作用はガラクトマンナンのゲル化能を改良する。 本発明の第二の目的は、殆ど又は全くエンド−β−マン
ナンナーゼを含有しないα−ガラクトマンナンガラクト
シダーゼ製品を提供することにある０ マンナン骨格の実質的分解はゲル化能を破崩する＾ 本発明の別の目的は、微生物α−ガラクトマンナンガラ
クトシダーゼを提供することにあり、これは相当して高
濃度のガラクトマンナンを含有する反応培質中改良され
たゲル化能を有するガラクトマンナンを製造することが
できる口このような微生物源α−ガラクトマンナンガラ
クトシダーゼは幾つかの理由が存する。第一に、それら
は植物から回収されるα−ガラクトシダーゼとして余り
高価でない。第二Ｋ、比較的高含量のガラクトマンナン
を含む反応培質を用いることも経済的条件から重要であ
る。 〔発明の詳細な説明〕 今や驚くべきことに、幾つかのペニシリウム種がα−ガ
ラクトマンナンガラクトシダーゼ酵素を生産することが
見出された。本発明扛この新規な酵素、その製法および
その使用方法に関する１以下余白 〔発明の詳細な 説明のα−ガラクトマンナンガラクトシダーゼ製品は、
これまで知られているα−ガラクトシダーゼとは同じで
ないう公知のα−ガラクトシダーゼと本発明のα−ガラ
クトマンナンガラクトシダーゼとの差ｎは、特に免疫化
学的試験により更に特性の違いにより明らかにすること
が出来る、本発明のα−ガラクトマンナンガラクトシダ
ーゼ製品は、比較的高含量のガラクトマンナンを含有す
る反応媒質中で、実質的にマンナン骨格を分解すること
なく、グア、ガムの如きガラクトマンナンから１，６−
α−り一結合ガラクトピラノシル残基を分解出来るう好
ましくは、本発明のα−ガラクトマンナンガラクトシダ
ーゼ製品は、以下に説明する活性試験に従い、ＧＡＬＵ
ｍす０．ＯＩＥＭＡＮＵ以下、好ましくは０．００１Ｅ
ＭＡＮＵ以下の測定エンド−β−マンナナーゼ活性を実
質的に有しない。これ等の数値は実験に基づいている。 何故ならそれ等は目的生成物からエンド−β−マンナナ
ーゼを除去する為広範囲の精製手順を含み；数値は、所
望のゲル化能を有するガラクトマンナンを製造する為α
−ガラクトマンナンガラクトシダーゼの使用を許容する
のに必要なエンド−β−マンナナーゼ含祉の減少程度を
表わす。例９で説明する如く精製されたα−ガラクトマ
ンナンガラクトシダーゼ製品は、所望のゲル化能を有す
るガラクトマンナンを得る為適したものであった。 酵素の特性は次の通りである：分子１１Ｖｉ５５，００
０〜６７．０００である。最適ｐＨは４〜６の範囲内に
ある。ｐＩ値は約４，３であるう最適温度は５５℃（短
い時間）であり及び５０℃（長時間）である。 詳しくは例１０参照。 本発明のα−ガラクトマンナンガラクトシダーゼ製品を
用い、非常に弱いゲルから強いゲルまでの範囲の種々の
程度を有するゲルを形成する能力を有するガラクトマン
ナンが、ガラクトピラノシル基が分裂される程度を適当
に選択するごとにより形成される。ガラクトピラノシル
基が分裂される程贋Ｖよ、本発明のα−ガラクトマンナ
ンガラクトシダーゼ製品を用いてガラクトマンナンを処
理する時間を調節することＫより、更に本発明のα−ガ
ラクトマンナンガラクトシダーゼ製品濃度を適当に選ぶ
ことＫより制御出来る０本発明のα−ガラクトマンナン
ガラクトシダーゼ製品はガラクトマンナンを基準に少な
（とも１０チ（重量／重量）を分解出来る。本発明の幾
つかの好ましいα−ガラクトマンナンガラクトシダーゼ
製品は、実質的にマンナン骨格を分解することなく、２
０％（重量／重責）更には５０％（ｌｉ量／重量）のガ
ラクトースをガラクトマンナンから分裂させ得る。 かくして、インキュベージ１ンは、例えば生成ガラクト
マンナン中のガラクトース含量が最初のガラクトース含
量の１〜５０チ（重ｉｋ／重禁）、特ＩＣＡＯ〜２５％
（重ｆ＋：／重量）罠達した時停止し得る。何故なら、
本発明のα−ガラクトマンナンガラクトシダーゼ製品は
本質的にエンド−β−マンナナーゼ活性を有さす、実質
的にマンナン骨格を分解することなくガラクトマンナン
からガラクトピラノシル残基を分裂出来る。このことは
一方では、少なくともｓｏ、ｏｏｏ、好ましくは少なぐ
と４，５００，０００、最も好ましくは少なくとも１．
０００，０００の平均分子量を有し、更に一方では所望
のゲル化能を有するガラクトマンナンを調製出来ること
を意味する。換言すれば、低分子量を有するガラクトマ
ンナンは非常に低い或いは全くゲル化能を示さない。 本発明のα−ガラクトマンナンガラクトシダーゼ製品に
よりガラクトマンナンを処理することは、好ましくは少
なくとも１壬（重量／重量）、好ましくは少なくとも２
チ（重量／重量）、最も好ましくは少なくとも３０％（
重量／重量）のガラクトマンナンを含有する反応媒質中
で好ましく行われる。多量のガラクトマンナンを含有す
る反応媒質の使用は、経済的条件に対して好ましい。反
応媒質は好ましくは水性である。 最も重要なガラクトマンナンの例は、グアガラクトマン
ナン（シナボシステトラゴノリバス（Ｃｙａｎａｐｏｓ
ｉｇ　　ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｉｂｕａ　）から得られ
る）及びロカスト　ビーム（１ｏｃｕｓｔ　ｂｅａｎ　
）ガム（セーラトニア　シルカ（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ　
　５ｉｌｉｑｕａ）から得られる）である。別の例は、
Ａｄｙ、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ。 Ｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　３５（１９７８）、３
４１頁以降に示される。普通のガラクトマンナンは、約
２０〜５０％（重量／重量）ガラクトース、しばしば約
３５〜４５慢（重量／重量）ガラクトースを含有するう
グアガラクトマンナンは約３５％のガラクトース及び約
６２１のＤ−マンノースを含有し、更に分子量は約１６
Ｘ１０’〜２２Ｘ１０’を有すると考えられている。ロ
キュストビーンガムは約２０〜２５チ（重量／重量）の
ガラクトース並びに約７５〜８０％（重量／重量）のマ
ンノースを含有し、更に約１１　Ｘ　１０’　〜１６　
Ｘ　１０’ノ分子ｔを有すると考えられている。 ガラクトマンナンでゲル化した製品の特別な例は、食品
及び飼料製品１例えばソフトドリンク。 パン製造所のゼリー及びインスタントのチνコレートパ
ディング（Ｆｏｏｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌ、　２７　（１９
７３）。 ２６頁以降参照）及びぺＸト飼料である。 本発明のα−ガラクトマンナンガラクトシダーゼ製品は
、微生物、例えばα−ガラクトマンナンガラクトシダー
ゼ生産菌類又は細菌、好ましくは菌類を表面培養又は液
内培養し、次いで通常の手法による酵素回収により得る
ことが出来る０使用すべき微生物はその選択に対し次の
四つの基準を用い、当業者により選択することが出来る
：１）微生物により生産される酵素はα−ガラクトシダ
ーゼ活性を有さなければならない一下記のｐ−ニトロフ
ェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドに対する活性試験
を参照： ２）微生物により生産される酵素は、下記の例８に記載
し九寒天Ｇを用いるスクリーニング試験により、少なく
とも０．３ｊ’ガラクト一ス／リツトルＸ時間ＸＧＡＬ
Ｕの開始速度を有さなければならない。 ３）微生物により生産される酵素は、ＧＡＬＵ当り０．
０１ＥＭＡＮＵ以下のエンド−β−マンナナーゼ活性を
有さなければならない、下記の活性試験参照。 ４）微生物により生産される酵素は、下記の例１０で記
載する試験方法を用い、ゲルが形成されるようなグアガ
ムのゲル化能を改良することが出来るものでなければな
らなｈつ 表面培養は、同化性窒素源及び炭素源並びに必須の栄養
源を含む半固体培地上で行われる◎液内培養は、同化性
窒素源及び炭素源並びに必須の栄養源を含む発酵培地中
好気性条件下で行われるｎ　ｐＨ値、温度、通気及び攪
拌の如き詳細事項は、当業者により容易に選択出来る。 本発明で例示したα−ガラクトマンナンガラクトシダー
ゼは、周知の種、即ちベニシリウムクリゾゲナム（Ｐｅ
ｎｉｃｌｌｌｉｕｍ　　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　）、
べ二シリウムイスランジカム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ
　　ｉａｌａｎｄｉｃｕｍ）及びペニシリウムノタタム
（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｎｏｔａｔｕｍ）の菌株に
より得られる細胞外酵素であるう例示的な菌株は、それ
ぞれＤＳＭ３２１４．ＤＳＭ３２１５及びＤＳＭ３２１
６である。 回収したα−ガラントマンナンガラクトシダーゼは、そ
のま＼用いることが出来或すは又例えばイオン交換クロ
マトグラフィー法、分別沈殿又はゲル濾過により、特に
エンド−β−マンナナーゼを除去する為精製することが
出来る。好ましくは、本発明のα−ガラクトマンナンガ
ラクトシダーゼ製品は、酵素溶液の活性度において約２
５０ＧＡＬＵ／ｄを超え（これは培養物中にこれまで見
られたものよりもはるかに高いｌｌ１１度である）又は
固体形である場合は２５０ＧＡＬＵ＃を超えるであろう
０α−ガラクトマンナンガラクトシダーゼは、突然変異
した１株からも得ることが出来、その結果はそれ等は微
量のエンド−β−マンナナーゼを生産するか又は全く生
産しない０菌株を突然変異せしめる方法は、当業者によ
り周知であり、例えば紫外線照射及び化学的変態変異誘
発物質を用いる方法であるり 本発明を更に次の実施例により説明するが、本発明はこ
れに制限されるものではない。実施例は幾つかの本発明
の好ましい態様を説明している。 記号ｒＴＭＪは商標であることを示している。 本発明に係るα−ガラクトマンナンガラクトシダーゼ製
品を製造する為、下記の例１〜６に従って得られた製品
は例９で記載した如く更に精製された。 例１〜３で使用する菌株は１９８５年１月にドイツ国ザ
ンムルグホンミクロオルガニズメン（ＤＳＭ）に寄託さ
れた。 菌株の培養 α−ガラクトマンナンガラクトシダーゼ生産菌株を、１
１”Ｍｚり次の成分を含有する軟寒天上で増殖させる：
４．０．９の酵母エキス、］、ＯＪ７の燐酸二水素カリ
ゆム、０．１Ｅの硫酸マグネシウム七水和物、１５．９
のグルコース及び２０ｇのバクトＴＭ（ディフッ　ラボ
ラトリイ、デトロイト、米国）寒天。この物質を１２１
℃で２０分間又は４０分間オートクレイプ処理し１、以
下にＹＰＧと称する〇α−ガラクトシダーゼに対する活
性試験試験の原理け、α−ガラクトシダーゼが無色のｐ
−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下
にｐ−ＮＰＧａｌと称する）を加水分解し、アルカリの
場合黄色であるｐ−ニトロフェノールを生成することで
ある。−α−ガラクトシダーゼ単位（以下ＧＡＬＵと称
する）は、次の標準条件のもとで毎分１μｍｏｌのｐ　
−ＮＰＧａｌを加水分贋する酵素の量である二基質：０
．８０ｍＭのｐ−ＮＰＧａｌ　、　　ｐＨ：　５．５　
（０，０３３３Ｍのアセテート緩衝液）、温度：３７°
Ｃ及び反応時間２１５分り生じた色を、波長４　ｏ　ｓ
　ｎｍで分光光度計により測定する。 更にこの方法の詳細はノボインダストリイ社から１９８
４年１１月２９日付けの小冊子Ａ　Ｆ　２０４／２ＧＢ
に説明している。 エンド−β−マンナナーゼの活性試験 エンド−β−マンナナーゼ活性を、標準としてゲマナー
ゼＴＭ１．５Ｌ（ノボインダストリイ社）を用いロキュ
ストピーンガムの粘度に関する減少効果により測定した
。方法は、ノボインダストリイ社からの１９７５年９月
１６日付けの小冊子ＡＦ１５６／ＩＧＢに説明している
。この小冊子において言及した活性単位はＨＣＵと呼ば
れる。 ゲフナー−１’　１．５　Ｌ　１７）活性は、１，５０
０，０００ＨＣＵ／Ｉである。放出された還元糖の量を
、ソモギイネルソン法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ
、　　１５３　（１９４４）　。 ３７５）を用い更に標準としてマンノースを用いて分析
することにより、ＩＨＣＵは０．０１１ＥＭＡＮＵ　に
対応することが判明し、こ＼においてＩＥＭＡＮＵは５
０℃でかつｐＨ５，０で毎分ロカストビームガムから１
マイクロモルのマンノース当量を放出させるエンド−β
−マンナナーゼ量として定義されるう 〔実施例〕 例１ ａ）酵素の調製 振とりフラスコ用基質を、１リットル当り次の成分で調
製した＝２０ｇのコーンステイープリカー（コーンプロ
ダクト社）、１０．９の硝酸アンモニウム、１０１の燐
酸二水素カリウム、Ｉｇの硫酸マグネシウム七水和物％
１０ＩＩのグアガムエクストラＬＫ（ＮＤＨノルディス
ク　ドクローゲハンデレス社、デンマーク）、０．１．
９のプルロニックＴＭＬ６１（ＢＡＳＦ、ドイツ連邦共
和国）、５ＪＦの炭酸カルシウム及び水道水。ｐＨを６
．５に調節し次いで１２１℃で４０分間殺菌を行った□
１００＊ｉの革質を有する５００ｄのエルレンマイヤ　
フラスコに、ペニシリウム　クリゾゲナム（Ｐｅｎｉｃ
ｉｌｌｉｕｍ　　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　）　Ｄ　Ｓ
　Ｍ　３２１４で予め接種したＹＰＧ軟寒天からの約１
０７個胞子で接種した。フラスコを２３　Ｏｒｐｍ及び
３０℃で３日間又は４日間振とうし、しかる後発酵プロ
スを遠心分離した。α−ガラクトマンナンガラクトシダ
ーゼを有する上澄みを菌糸から分離した。菌糸を捨て次
いで上澄みをα−ガラクトシダーゼに対し分析した。こ
れ等の灸件のもとで菌株は１０ＧＡＬＵ／ｄを与えた。 ｂ）酵素の精製 ＩＥの培養プロスを、直径１１ｃＩＩｔのブフナーロー
ト上ガラス繊維フィルター（ホヮ・ト〜ンＴｌ″イＧＦ
／Ｄ及びＧＦ／Ｆ）で濾過した。濾液を１分子ｔ１０，
０００でカットオフを有するアミコンＴＭホローファイ
バーカートリッジ（ＨＩ　Ｐ　１０　）　ｔ−用い振込
により３５０ｍ１に濃縮し、しかる後濃縮液を、コンダ
クタンスが３ｍ５ｉ（ミリシーメンス）になるまで脱イ
オン水で洗浄したりしかる後、濃縮液を、ＧＲ８１ＰＰ
メンプラン（デダンスケズッケルフアプリ９ケル、デン
マーク）を備えかつ分子量６，０００でカットオフを有
するアミコンＴＭセルを用い５０ｔｘｌＫ濃縮した０得
られたコンセントレートのｐＨを７．０に調節した。 ＤＥＡＥ−トリスアクリルイオン交換カラムを、５０ｍ
Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ７，０）で平衝化させた。（トリ
スはトリス（ヒドロメキシメチル）アミノメタンである
）０２００．／のイオン交換体を、直径５ｃｍのカラム
に詰め更にカラムを毎時間３２０ｍ１の流速を有するよ
うに充填した。ガラスフィルターからの濾液についてイ
オン交換を行い次いで分画を集めた◎α−ガラクトマン
ナンガラクトシダーゼはこのイオン交換体に弱く結合し
次いでトリス緩衝液を洗浄した後又は塩化ナトリウム勾
配法のいずれかにより溶出させた。分画中のα−ガラク
トマンナンガラクトシダーゼの活性証を測定し次いでこ
の活性度を有する蛋白含有フラクシ璽ンを集め次いで濃
縮した。 蛋白を濃縮し次いで低分子量成分を、分子量１０，００
０でカットオフを有するアミコンＴＭホローファイバー
カートリヴジ（ＨＩＰＩＯ）で洗浄したり 得られた１０ｔｊ？の酵素溶液を、α−ガラクトマンナ
ンガラクトシダーゼ及びエンド−β−１ンナナーゼの活
性を測定することにより分析したつ得られた活性度はそ
れぞれ３００ＧＡＬＵ／＊／及び２３ＥＭＡＮＵ／ｍ（
２１００ＨＣＵ／−）であった口 例２ 例１ａで説明したと同じ手順を用いた。但し。 使用した菌株はペニシリウムイスランジカム（Ｐｅｎｉ
ｃｉｌｌｉｕｍ　ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）　Ｄ　Ｓ　Ｍ
　３２１５であった。収量は１７ＧＡＬＵ／−であった
。 例１ｂで記載した手順を用い１．４リツトルの培養ブロ
スを精製

【７、活性度５４０ＧＡＬＵ／ｌＥＡ！及び３
２ＩＭＡＮＵ／５ｕ（２９００ＨＣＵ／ｗ７）を有する
部分精製酵素溶液１８ｓｕを得たう以下余白 例３ 例１ａで記載したと同じ手順を用いたり但し使用した菌
株はペニシリウムノタタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍｎｏ
ｔａｔｕｍ　）　Ｄ　８Ｍ３２１６であッ７’ｊ　Ｏ収
量は４　Ｇ　Ａ　Ｌ　Ｕ　／１ｔｔｌであった。 例１ｂで記載した手順を用い１．１リツトルの培養ブロ
スを精製し、活性度３００ＧＡＬＵ／ＩＩＬｔ及び８Ｅ
ＭＡＮＵ／Ｍｌ！（７００ＨＣＵ／ｇ／）’に有する部
分精製酵素溶液１８ｇｔを得た０ 例４ ａ）酵素の調製 この例は、パイロットプラントの発酵機内での、ベニリ
ジウム　クリゾゲナムによるα−ガラクトマンナンガラ
クトシダーゼの生産を説明する。ｆｌｌ培養物は次の培
地１１７ツトルから成り立ってい九二５０．９の大豆糖
みつ（エルフスオリファプリ９り、デンマーク）、２０
６？の硫酸アンモニウム、１０Ｉの燐酸二水素カリウム
、ＩＥの硫酸マグネシラＡ、５１１の炭酸カルシウム及
び０．５ｇのプルロニック。ｐＨを６．５に調節し次い
で培地を、１２５℃で４０分間３リリトルのエルレンマ
イヤーフラスコ内で殺菌した。１３０℃に冷却後、培地
に、既に３０℃で７日間接種したＹＰＧ軟寒天からのべ
二シリウムクリゾゲナムの胞子で接種した。フラスコを
３０℃で２日間振とうした口８００ｓＬｌのこの種培養
物を％４００Ｉの大豆糖みつ、１６０ｇの硫酸アンモニ
ウム、８０ｇの燐酸二水素カリウム、８Ｉの硫酸マグネ
シウム七水和物、４０．Ｓ’の炭酸カルシウム、３Ｉの
プルロニック及び８リヴトルの容積にし几水を含有する
主発酵機に移した。 ｐＨを６．５に調節し次ｔｎテ培地を１２５℃で１２０
分間殺菌し九１１５チ燐酸１００ｍを別に１２５℃で３
０分間滅菌し次いで発酵中ｐＨを調節する馬用いた。接
種後、通気（８リットル／分）を開始した。５２０〜８
３０　ｒｐｍの速度で攪拌も開始し７ｔｆ、温度を３０
℃の一定に保った。発酵を６５時間維持したがこの時間
においてｐＨは６．７から７．０２に上昇した。しかる
後ダンクを冷却し次いで菌糸を遠心分離により分離した
。上澄み液を分析し次いで活性度３ＧＡＬＵ／ｄを得た
。 ｂ）酵素の精製 １１リツトルの培養ブロスを、１４０ｇの多孔質珪藻土
を用い濾布上で濾過し次いで液体を直径４０ｃｍの磁器
ロートを用いて吸収させたつ振透くよる濃縮を、分子量
１０，０００でカットオフを有するメリボアＴＭペリカ
ンカセットで行った。用いたフィルタータイプは番号Ｐ
ＴＧＣｏｏｏｏｓのポリスルホンであった０これにより
、１１リリトルを１リヴトルに濃縮した。コンダクタン
スが３ｍＳｉ　　以下になるまで脱イオン水で洗浄を行
った。 振とうにより濃縮した溶液を凍結し次いで溶かし、しか
る後ｐＨを７．０に調節した。溶液をガラスフィルター
（ホワヴトマンＴＭＧＦ／ｌ））で濾過した。 しかる後、濾液をＤＥＡＥ−）リスアクリルカラムでイ
オン交換クロマトグラフィーに委ね、続いて例１ｂで記
載し九と同様にアミコンホローファイバーカートリッジ
（ＰＤＰＩＯ）を用いて濃縮した。これにより、活性度
２０ＧＡＬＵ／−及び３ｇＭＡＮＵ／ｒｔｒｌ以下（２
５０ＨＣＵ／ｄ以下）を有する部分精製酵素溶液１６０
ｔ／を得た０例５ この例はパイロットプラント発酵機内でベニシリウムイ
スランジカムによるα−ガラクトマンナンガラクトシダ
ーゼの製造を説明する。 菌種をＹＰＧ寒天斜面上で１週間３０℃で培養した。斜
面からの胞子を、以下の組成の１リツトル培地から成る
種発酵機に接種する為用いた＝２０Ｉｉの；−ンスティ
ープ　リカー、１０ｇの硝酸アンモニウム、１０ＩＩの
燐酸二水素カリウム、５ｇの炭酸カルシウム、２０１の
ラフィノース、１ｇの硫酸マグネシウム七水和物、０．
１ｇのプルロニ・ンク及び】リウトル量までの水道水。 ｐＨを６５に調節した０培地を１２５℃で６０分間殺菌
した０種培養物を３０℃で２日間２３０　ｒｐｍで振と
うした。この種培養物８００ｇ！／を、次の基質８リツ
トルから成る主発酵機に接種する為用い友：１６０Ｉの
コーンステイープ　リカー、８０１の？ｉ［アンモニウ
ム、５ｏＩＩの燐酸二水素カリウム、８Ｉｉの硫酸マグ
ネシウム七水和物、１６０．９のラフィノース、４０１
１の炭酸カルシウム、１ｇのプルロニック及び８リツト
ル量までの水道水。ｐＨを６．５に調節した。培地を１
２５℃で１２０分間殺菌した。温度を３０’ＣＫ下げた
時、種培養物８００ｄで接種したう温度を３０℃に保持
し、６２０　ｒｐｍで攪拌し、圧力を０．５気圧で保持
し、通気は８リットル／分であり更ＫｐＨは６．４５か
ら５．９に降下したｒ、９０時間後１発酵を停止し。 冷却し次いで遠心分離した。上澄み液は７ＧＡＬＵ／ｄ
を含有していた。 例４ｂで記載した手順を用い培養プロス８リタトルを精
製し、活性［６０ＧＡＬＵ／ｄ及び１．４ｇＭＡＮＵ／
５ｔｌ（１３０ＨＣＵ　／ｌＩＬ！　）を有する部分精
製酵素溶液５００ｍ／を得た。 例に の例において、α−ガラクトマンナンガラクトシダーゼ
をペニシリウムノタタムを用いて製造した。菌種をＹＰ
Ｇ寒天斜面上で３０℃で１週間増殖させ九ｎ胞子を、次
の組成を有する基質１１７ツトルに接種する為用いた：
ｚｏ、ｐのコーンステイープ　リカー、１０Ｉの硝酸ア
ンそニウム、ｌＯｙの燐酸二水素力ＩｌｌラムＩＩの硫
酸マグネシウム七水和物、５１のグアガム、２０Ｉのラ
フィノース、５Ｉの炭酸カルシウム、０．１＆のプルロ
ニック及び１リツトル量までの水道水。ｐＨを６．５に
調節し次いで培地を１２５℃で４０分間殺菌した。フラ
スコを２３　Ｏｒｐｍで２日間３０℃で振とうし、しか
る後８００ｗ／を次の基質を含む主発酵機に接種する為
用いた：ｌ６０ｇのコーンステイープ　リカー、８０ｙ
の硝酸アンモニウム、８０ｇの燐酸二水素カリウム、８
ｙの硫酸マグネシウム七水和物、４０．９のグアガム、
４０ｇの炭酸カルシウム、１６０．９のラフィノース、
ＩＩのプルロニック及び８リツトルｉｔでの水道水。ｐ
Ｈを６．５に調節した０８９時間増殖を保持し、この間
ｐＨは６．２５から６．９５に上昇した。通気は８リッ
トル／分であり、圧力は０．５気圧であり攪拌は５２０
〜８３０　ｒｐｍであった。発酵が終了すると、タンク
を冷却し次いでプロスを遠心分離し菌糸を除去し７ｔｎ
上澄み液は１３ＧＡＬＵ／ＷＬｌを有した。 例４ｂで記載した手順を用い７．５リツトルの培養プロ
スを精製し、活性度６６０ＧＡＬＵ／−及び９３　ＥＭ
ＡＮＵ／ｄ（８４００ＨＣＵ／ｗ７　）を有する部分精
製酵素溶液４０ｓｕを得念。 例７ この例は以下にグアＧと称した標準基質の生成を説明す
る。この基質は完全なマンナン骨格を有するガラクトマ
ンナンを攻撃する能力を欠いているα−ガラクトシダー
ゼからα−ガラクトマンナンガラクトシダーゼを区別す
る為好ましく適合している。 １１Ｊ　−７トルの水道水を７５℃に加熱し次いで１０
．９のグア粉を攪拌しながら添加した。１６−のガマナ
ーゼ（Ｇａｍａｎａｇｅ）　１．５　Ｌを添加し次いで
ｐＨを５．０に調節したＤ１９０ｇのグア粉を攪拌しな
がら一時間添加したｎＤ−ガラクトピラノシル基により
保護されていないガラクトマンナンの領域を、これ等の
条件のもとてゲマナーゼに存在するエンド−β−マンナ
ナーゼにより分解させ次いで存在するα−ガラクトマン
ナンガラクトシダーゼを７５℃で熱不活性化した。加水
分解を煮沸により停止した。変性したグアＧを、９６チ
（重ｔ／Ｉｔ）アルコール５００ｄを用いて沈殿するこ
とにより精製し、濾過【７次いで乾燥１．た。収率のグ
アＧ１４０，９であった。 例８ この例は開始速度、即ち標準スクリーン物質、グアＧ（
例７参照）からガラクトースの遊離を説明する。 全ての試験部分精製酵素、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ５，５）中に希釈し次いで、４％（重量／量）
の１度でグアＧと共に３０及び６０分間４５℃でインキ
ュベー）　Ｌ、ｆｃ、ガラクトースの遊離は、ベーリン
ガーマンハイムの簿素的にガラクトースＵＶ法を用いキ
ットで測定した。 得られた結果を第１表に示す 以下、）、ｂ　Ｈ′４ ２１１１表 例番号か　　　試験濃度、　　　開始速度、遊離ガラク
トース１＋４　　　　　０．０２　　　　　　　　　１
４１＋４　　　　　１１．０５　　　　　　　　　１．
３２＋５　　　　　０．０２　　　　　　　　　０．４
２＋５　　　　０．０５　　　　　　　　　０．３３＋
６　　　　０，０２　　　　　　　　　１，２３＋６　
　　　　０．０５　　　　　　　　　１．０υ、０５Ｇ
ＡＬＵ／／の濃度でコーヒー豆α−ガラクトシダーゼ（
シグマ／１６Ｇ８５０７）を試験すると、開始速度は０
，５ｙガラクトース／（す・ントル×時藺ＸＧＡＬＵ）
であった。− ０、０５Ｇ　Ａ　Ｌ　Ｕ／ｌ／（＋）＠［テシグｆｆ　
（４Ｇ　９００７）から得られたアスペルギルスニガー
−α−ガラクトシダーゼを用いると、開始速度はこの試
験において０．５ｙガラクトース／（リットルＸ時間×
ＧＡＬＵ）以下であった。 又次の菌類α−ガラクトシダーゼはこの試験においてグ
アＧからガラクトースを遊離させることは出来なかっ几
：ナスペルギルス　アクレアトクａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
　）　、フオメス　ラングレアトラスペニシリウム　オ
キサリカム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｏｘａｌｉｃｕｍ
）　＊ペニシリウム　シムプリシシマムピクノポラス　
ザングイネウス（Ｐｙｃｎｏｐｒｕａｓａｎｇｕｉｎｅ
ｕｓ）　＋ストブトマイセス　リパニイ（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ　　１ｉｂａｎｉ　）　　、ストレプトマ
イセ及びトリコジルマ　ハルジアナム（Ｔｒｉｃｏｄｅ
ｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ　）　５ 例９ この例はグア粉からガラクトースの遊離を説明する。用
いた酵素は、例４で記載した如く製造したペニシリウム
　クリゾゲナムα−ガラクトマンナンガラクトシダーゼ
であっｆＣ，遊離したガラクトースＵＶ法、ヘーリンガ
ー　マンハイム　キットを用い例８で記載したｐ口〈測
足し次いで遊離したガラクトースのｔを、ガラクトース
粉１．！／当り放出されたガラクトースの■として表わ
す。インキュベージ譚ンを温就詞節機及び気密蓋を備え
た水浴中で行っ之０試験したグア粉を、グア粉１１！轟
り２０ＧＡＬＵの酵素及び４０チ（重ｉ／重景）グア粉
の最終−反を与えるアセテート緩衝液と共に湿潤せしめ
たｎ得られた結果を第１Ｉ表に示す。 以下余白 第菖表 ４５　　４．５　　　８０　　　　　１４０５５　　４
．５　　　８０　　　　　　８０４５　　５．０　　　
８０　　　　　１４０５５　　５．０　　　８０　　　
　　１１０４５５．５　　　９０　　　　　１６０５５
　　５．５　　　９０　　　　　１１０第凰表から明ら
かなように、酵素は５０℃以上のＬｒで長時間安定では
ないり酵素の最適ｐＨは５．０〜５．５である口 酸素の濃縮の効果を、４５℃の温寂、５．０のｐＨ及び
第１ｉ！に示す酵素濃度を用いて１配と同様にインキュ
ページ謬ンすると七により試験し１．た０得られた結果
を８ｇ１表に示す。 以下余白 第璽表 ４　　　　　３８　　　　　　ｇ０ 例１０ この例は例２及び４ないし６で得られた′ａ＃素のアフ
ィニイティ精製を説明する。 例４で得られた部分精製α−ガラクトマンナンガラクト
シダーゼ３０ａｌ！を１次の手順によりエンド−β−マ
ンナナーゼ活性を肩しないまでに精製した：ＡＨ−セノ
・ロースＴＭ（フフルマシア、スウェーデン）に結合し
たガラクトサミン（シグマＡＧＯ５００）１００−を、
緩衝液（５０ｍＭの酢撒ナトリウム（ｐＨ５，０））で
平衝化した口３０ｄの溶液を適用し次いでエンド−β−
マンナナーゼ及びα−ガラクトマンナンガラクトシダー
ゼの一部なカラムに流したｎα−ガラクトマンナンガラ
クトシダーゼを塩化ナトリウム勾配法で溶出させたりエ
ンド−β−マンナナーゼを有しない精製α−ガラクトマ
ンナンガラクトシダーゼは蛋白ＩＥ当り１５ＧＡＬＵの
比活性を有し更にエンド−β−マンナナーゼは検出限界
以下であったつＳＤＳゲル電気泳動によれば主蛋白バン
ドの分子ｉｔは５５，０００〜６０，０００であること
が見い出された（ＳＤＳは硫酸ドデシルナトリウムであ
る）。 最適ｐＨは約５−６であり、最適温度は基質としてＰ　
−ＮＰＧａｌ　Ｋついて約５０℃であり、更にｐＩ（等
電点）は４，３でありた。 例５及び６で得られた他の酵素を同機の手順で精製した
□例６で得られたα−ガラクトマンナンガラクトシダー
ゼは分子量５５，０００〜６０，０００を有し、比活性
は蛋白１ｑ当り７５ＧＡＬＵであり、最適ｐＨは約５〜
６であり、最適温度は恭賀としてｐ−ＮＰＧａｌについ
て約５０℃であり更にｐＩは約４，３であった。 例２及び５で得られたα−ガラクトマンナンガラクトシ
ダーゼは１分子量６２，０００〜６７．０００を有し、
ており更に比活性は蛋白１■当り９０ＧＡＬＵを有した
りこの酵素の最適ｐＨけ約４〜５．５であ一九口ｐＩは
約４．３であったりグア基質を用い全ての三種の酵素に
対し２時間ツイン中ユペーシ嘗ンに対しｆ＃遺温１ｆｔ
１５５℃であり２４時間のインキュページ曹ンに対し５
０℃であったり ４　Ｇ　Ａ　Ｌ　Ｕ　Ｉｃ対応する例４で得られた高精
製酵素量を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５
，０）３ｍｌに溶解し、次いで２ｇのグア粉を添加した
。得られた混合物ｔ−４５℃で２０時間インキコベート
した、しかる後、生成物を乾燥した０１４０ｗ＠のガラ
クトースがこの酵素を用いてのインキエペーシ蓼ン中Ｋ
ＭＭしていたことが見い出された口 以下の例１１で記載するゲル化試験を用い、以下の内容
が観察された口即ち得られた全てのα−ガラクトマンナ
ンガラクトシダーゼ製品は改良されたゲル化能を有する
ガラクトシダーゼを得る為使用することが出来た。 例１１ この例はゲル化能に対する試験を説明する。 ａ）４０ｒａｇのキサンタン（シダｆｆＡＧ１２５３）
を１０−の脱イオン水に懸濁させ次いで材料を溶解する
まで加熱したう同様に第二のグラス内で４０■のロカス
トビームガム（シグマＡＧ　０７５３）を、１０ｓｌの
脱イオン水に懸濁させ次いで材料を溶解するまで加熱し
た０７５℃で２ｄの各々の溶液を、１０−の試験管内で
混合し、しかる後試験管を水浴内で放冷せしめた。１５
分後、試験管を上下に回転させ次いで混合物は流出しな
かった。 ｂ）前記ａ）に記載した試験においてロカストビームガ
ムの代りにグアガム（シグマ４Ｇ　４１２９）を用いる
と、混合物は試験管を上下にした場合流出したＯ Ｃ）上記ａ）で記載した試験のロカストビームガムの代
りに、アスペルギルスニガー−α−ガラクトシダーゼで
既に処理し光グアガムを用いると。 試験管を上下にさせた場合混合物は流出した。 ｄ）上記ａ）で記載した試験におけるロカストビームガ
ムの代りに、本発明に係るα−ガラクトマンナンガラク
トシダーゼをしたグアガムを用いると、ゲルは試験管を
上下にした場合流出しなかつ九０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、微生物α−ガラクトマンナンガラクトシダーゼ。 ２、液体又は固体生成物の形で１ｇ当たり少なくとも約
   ２５０ＧＡＬＵを有しかつ本質的にエンド−β−マンナ
   ナーゼ活性を有しないα−ガラクトマンナンガラクトシ
   ダーゼ製品。 ３、エンド−β−マンナナーゼ活性が１ＧＡＬＵ当たり
   少なくとも約０．００１ＥＭＡＮＵ以下である、特許請
   求の範囲第２項記載のα−ガラクトマンナンガラクトシ
   ダーゼ製品。 ４、ペニシリウムクリゾゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
   ｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウムイスランジ
   カム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｉｓｌａｎｄｉｕｍ）
   およびペニシリウムノタタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ　
   ｎｏｔａｔｕｍ）から成る群から選ばれるα−ガラクト
   マンナンガクトシシダーゼ生産菌株の培養により細胞外
   に生産され、しかる後培養培地から回収されたα−ガラ
   クトマンナンガラクトシダーゼ。 ５、ペニシリウムクリゾゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
   ｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウムイスランジ
   カム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｉｓｌａｎｄｉｕｍ）
   およびペニシリウムノタタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ　
   ｎｏｔａｔｕｍ）から成る群から選ばれるα−ガラクト
   マンナンガクトシシダーゼ生産菌株を液内培養し、しか
   る後培養培地から酵素を回収することを含んでなる、α
   −ガラクトマンナンガラクトシダーゼの調製方法。 ６、グアゴム、ロキュストビーンガム等のガラクトマン
   ナンの変性方法であって、該ガム中少なくとも約１０％
   のガラクトース含量が脱離まで、その１ｇ当たり少なく
   とも約２５０ＧＡＬＵを有し更にＧＡＬＵ当たり約０．
   ０１ＥＭＡＮＵ以下のエンド−β−マンナンナーゼを有
   するα−ガラクトマンナンガラクトシダーゼ製品を用い
   て溶液中の前記ガムを処理し、しかる後処理物を加熱す
   る、前記方法。